{"paper_id":"8c1b5596-dd22-42d5-b1ae-ef04d9ac6f29","body_text":"1 \n  \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \n \n \n \n \n \nCARLOS VALÉRIO DA ROCHA JUNIOR \n \n \n \n \n \n \n \nPADRÃO DE METILAÇÃO DO RECEPTOR DE \nPROGESTERONA (PGR) EM ENDOMÉTRIO EUTÓPICO \nDE PACIENTES COM INFERTILIDADE RELACIONADA \nÀ ENDOMETRIOSE DURANTE A FASE SECRETORA \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2015 \n\n \n2 \n  \nCARLOS VALÉRIO DA ROCHA JUNIOR \n \n \n \nPadrão de metilação do receptor de progesterona (PGR) em \nendométrio eutópico de pacientes com infertilidade relacionada à \nendometriose durante a fase secretora \n \n \n \nDissertação apresentada ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto para obtenção do \nTítulo de Mestre em Ciências Médicas. \nÁrea de concentração: Ginecologia e \nObstetrícia \n \nOrientador: Professor Doutor Rui Alberto \nFerriani \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2015 \n\n \n3 \n  \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n \n \n     Rocha Junior, Carlos Valério da  \n \nPadrão de metilação do receptor de progesterona (PGR) em \nendométrio eutópico  de pacientes com infertilidade relacionada à \nendometriose durante a fase secretora  \n77 p. il: 30cm.  \n \nDissertação para título de Mestre apresentada à Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia. \n \nOrientador: Rui Alberto Ferriani \n \n1. Endometriose. 2. Infertilidade 3. PGR. 4. PR -B. 5. Metilação. 6.  \nFase Secretora.   \n \n\n \n4 \n  \nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \nPadrão de metilação do receptor de progesterona ( PGR) em \nendométrio eutópico  de pacientes com infertilidade relacionada à \nendometriose durante a fase secretora \n \n \nDissertação apresentada ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto para obtenção do \nTítulo de Mestre em Ciências Médicas. \nÁrea de concentração: Ginecologia e \nObstetrícia \n \nOrientador: Professor Doutor Rui Alberto \nFerriani \n \nBanca examinadora: \nDr. Lisandra Cristina Caetano da Silva   \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP \nAssinatura:........................................................................................................................... \nProf. Dr. Rosana M. dos Reis \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP \nAssinatura:........................................................................................................................... \nProf. Dr. Rui Alberto Ferriani  \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP \nAssinatura:........................................................................................................................... \n\n \n5 \n  \nDedicatória \n \n \n \nAos meus pais, Carlos e Marlene, que sempre acreditaram e investiram no \npoder da educação e em minha capacidade. \n \n \nÀ minha irmã Carla e meu cunhado David pelo apoio. \n \n \nÀ Mateus Anacleto pela cumplicidade e incentivo. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n6 \n  \nAgradecimentos \n \nÁ Deus por ter me trazido ate este lugar e pelas pessoas que encontrei. \n \nAo Prof.º Dr. Rui Alberto Ferriani pela orientação e confiança para a \nexecução deste trabalho. Exemplo de profissional e pessoa que levarei \nsempre comigo. \n \nÁ Drª. Paula Andrea de Albuquerque Sales Navarro pelo aconselhamento \ndurante todas as etapas e pela amizade. \n \nÁ Dr.ª Cristiana Libardi por toda a atenção e ensinamentos que tornaram \npossível a conclusão deste projeto. \n \nÁ Mª. Michele Gomes da Broi pela presença em todos os estágios deste \ntrabalho e da minha vida nos últimos anos. Sua amizade e companheirismo \nforam fundamentais para a realização de tudo. \n \nÁ Dr.ª Juliana Meola pela receptividade, aconselhamento e ensinamentos. \n \n\n \n7 \n  \nAo Dr. Welington de Paula Martins, Drª Stael Porto Leite e aos médicos \nresidentes do departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP pelo \npronto auxilio.  \n \nÁ Cristiana Padovan e Lilian Costa pela amizade e profissionalismo. \n \nÁ todas as enfermeiras e funcionário do departamento de Ginecologia e \nObstetríca da FMRP, especialmente á Océlia de Vasconcelos e Mariza. \n \nAgradeço também a todos os amigos pós-graduandos do departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da FMRP pelo companheirismo, especialmente à \nValéria Aguiar, Vanessa Giorgi, Daiane Bulgarelli e Bruna Gazeto. \n \nAos funcionários do departamento de Genética do Hemocentro de Ribeirão \nPreto, especialmente ao Prof. Dr. Wilson á Greice. \n \nÀs secretárias Ilza e Suelen, pelo auxilio e paciência. \n \n \n \n\n \n8 \n  \nEpígrafe \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Se vai tentar, vá até o fim. \nNão há outra emoção como essa. \nVocê estará sozinho com os deuses e as noites queimarão como fogo. \nFaça, faça, faça. faça, \naté o fim, até o fim. \nVocê cavalgará a vida diretamente para o riso perfeito. \nEssa é a única boa luta que existe.” \n \nCharles Bukowski \n\n \n9 \n  \nResumo \nROCHA JUNIOR, CV. Padrão de metilação do receptor de progesterona ( PGR) em \nendométrio eutópico de pacientes com infertilidade relacionada à endometriose \ndurante a fase secretora  Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de \nSão Paulo, Ribeirão Preto, 2015. \n \nA e ndometriose é uma doença caracterizada pelo crescimento de tecido endometrial \nectópico histologicamente similar ao do endométrio eutópico. Dentre sua \nsintomatologia, encontra-se relatos de infertilidade a qual est á relacionada à diminuição \nda receptividade endometrial e a resistência à progesterona, importante hormônio \nenvolvido no estabelecimento desse processo e na manutenção da gestação . A etiologia \nda endometriose não é bem conhecida, mas estudos sugerem  que essa desordem possa \nestar ligada a mecanismos epigenéticos de regulação da expressão genica, tais como a \nmetilação do DNA.  A receptividade endometrial à progesterona é mediada por \nreceptores (PR-A e PR-B) a qual parece estar suprimida nessas pacientes, possivelmente \npor diminuição ou inatividade destes receptores, o  que poderia ser um mecanismo \nenvolvido na  infertilidade associada à endometriose. Estudos de metilação no gene \ncodificante das isoformas A e B do receptor de progesterona (PGR) mostram que o exon \n1 da isoforma PR -B encontra -se hipermetilado e tem sua expressão silenciada em \npacientes portadoras da doença. Entretanto ainda não foi avaliado o perfil de metilação  \ndeste gene em mulheres inférteis com a doença, o que poderia estar envolvido na \ninfertilidade apresentada por essas pacientes . O objetivo desde estudo foi avaliar o \npadrão de metilação do gene PGR em endométrio eutópico de mulheres com \ninfertilidade relacionada à endometriose  e controles inférteis , durante a fase secretora . \n\n \n10 \n  \nForam realizadas biópsias endometriais de 23 pacientes, divididas em dois grupos: 12 \nmulheres inférteis sem endometriose (C ontrole infértil ) e 11 mulheres inférteis com \nendometriose (En dometriose). Todos os endométrios coletados foram confirmados na \nfase secretora do ciclo através de análise histológica clássica segundo os critérios de \nNoyes. O DNA genômico foi extraído com o QIAamp DNA Mini Kit  e modificado \nutilizando o EpiTec Bissulfite Kit. O padrão de metilação das isoformas PR -A e PR -B \nfoi avaliado pela  técnica HRM (High Resolution  Melting) A aná lise de metilação da   \nisoforma PR-A mostrou que a região analisada encontra-se hipometilada , em que a \nporcentagem de metilaçao  encontrada foi 0%  em ambos os grupos com e sem \nendometriose. No entanto , no grupo com e ndometriose, a isoforma PR-B mostrou-se \nparcialmente metilada na maioria das pacientes com porcentagem de metilaçao de 50% \n(n=8), somente uma paciente apresentou 80% de  metilacão na isoforma B. Para o grupo \nsem endometriose a isoforma PR -B mostrou-se hipometilada (0%). A hipometilação da \nisoforma PR-A sugere que este gene encontrar-se na sua forma ativa, sem alterações em \nsua expressão . No entanto , a hipermetilação da is oforma PR-B nas mulheres com \nendometriose pode estar relacionada com o silenciamento gênico ou redução da sua \nexpressão, sugerindo que a baixa resposta à progesterona nas mulheres com \nendometriose pode estar diretamente ligada à redução do número  de seus r eceptores \nnessas pacientes. \n \nPalavras-chave: Endometriose, Infertilidade, PGR, PR-B,  Metilação, Fase Secretora \n \n \n \n \n\n \n11 \n  \nAbstract \n \nROCHA JUNIOR, CV.  Methylation pattern of progesterone receptor ( PGR) on \neutopic endometrium  of patients with infertility related to endometriosis during \nstage secretory.  Medicine University of Ribeirão Preto, University of São Paulo, \nRibeirão Preto, 2015. \n \nEndometriosis is a disease characterized by ectopic growth of endometrial tissue \nhistologically similar to the eutopic endometrium. Among this symptoms, is infertility \naccounts which is related to decreased endometrial receptivity and resistance to \nprogesterone, important hormone involved in the establishment of this process and the \nmaintenance of pregnancy. The etiology of endometriosis is not well known, but studies \nsuggest that this disorder can be linked to epigenetic mechanisms of regulation of gene \nexpression such as DNA methylation. The endometrial responsiveness to progesterone \nis mediated by receptors (PR-A and PR-B) which seem to be suppressed in these \npatients, possibly reducing or inactivity of these receptors, which could be a mechanism \ninvolved in the infertility associated with endometriosis. Studies in methylation of the \ngene encoding the A and B isoforms of progesterone receptor (PGR) showed that exon \n1 of the PR-B isoform is hypermethylated and silenced have its expression in patients \nwith the disease. However it has not been rated the methylation profile of this gene in \ninfertile women with the disease, which could be involved in the infertility presented by \nthese patients. The goal from study was to evaluate the methylation pattern of the PGR \ngene in eutopic endometrium of women with infertility related to endometriosis and \ninfertile controls during the secretory phase. Endometrial biopsies were performed on \n\n \n12 \n  \n23 patients, divided into two groups: 12 infertile women without endometriosis \n(infertile Control) and 11 infertile women with endometriosis (Endometriosis). All \nendometrium collected were confirmed in the secretory phase of the cycle by classical \nhistological analysis according to the criteria of Noyes. Genomic DNA was extracted \nwith the QIAamp DNA Mini Kit and using the modified EpiTec Bissulfite Kit. The \nmethylation pattern of PR-A and PR-B isoforms was assessed by HRM technique \n(Melting High Resolution) Methylation analysis of PR isoform The analyzed showed \nthat the region is hipometilada, wherein the percentage of methylation was found 0% in \nboth the groups with and without endometriosis. However, in the group with \nendometriosis, the PR-B isoform showed partially methylated in most patients with \nmethylation percentage of 50% (n = 8), only one patient showed methylation in 80% of \nisoform B. In the group without endometriosis the PR-B isoform was shown \nhipometilada (0%). The hypomethylation of PR-A isoform suggests that this gene be in \nits active form, without change in his expression. However, hypermethylation of the \nPR-B isoform in women with endometriosis may be associated with gene silencing or \nreducing the expression, suggesting that the low response to progesterone in women \nwith endometriosis can be directly linked to the reduction of its receptors in these \npatients. \n \nKeywords: Endometriosis, Infertility, PGR, PR-B, methylation, Secretory Phase \n \n \n \n \n \n\n \n13 \n  \nLista de figuras \n \nFigura 1. Mecanismo de metilação do DNA..................................................................24 \n \nFigura 2. Regulação epigenética em ilhas CpG mediada pela metilação do DNA........25 \n \nFigura 3. Esquema representativo do gene PGR............................................................27 \n \nFigura 4. Esquema representativo da localização das regiões promotoras da PR-A e PR-\nB localizadas no gene PGR.............................................................................................29 \n \nFigura 5. Fluxograma da metodologia............................................................................40 \n \nFigura 6. Eletroforese com DNA extraído das biopsias endometriais...........................42 \n \nFigura 7. Eletroforese evidenciando as bandas formadas pelos primers PR-A (100bps) e \nPR-B (200 bps)................................................................................................................43 \n \nFigura 8 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes \nporcentagens de metilação para isoforma PR-A..............................................................44 \n \nFigura 9. Resultado do HRM para isoforma PR-A........................................................44 \n \n\n \n14 \n  \nFigura 10 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes \nporcentagens de metilação para isoforma PR-B..............................................................45 \n \nFigura 11. Resultado do HRM para isoforma PR-B.......................................................45 \n \nFigura 12.  Gráfico comparativo das porcentagens de metilação da isoforma PR -B nos \ngrupo endometriose e controle infértil.............................................................................48 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n15 \n  \nLista de siglas \nDNA – Ácido Desoxiribonucleico  \n \nRNA – Ácido Ribonucleico \n \nIMC – Índice de Massa Corporal \n \nPGR/ PR – Gene que expressa o receptor de progesterona \n \nPR-A – Isoforma A do receptor de progesterona \n \nPR-B – Isoforma B do receptor de progesterona \n \nDNMTs – DNA metil transferases \n \nncRNAs – RNAs não codificadores \n \nVEGF-A – Fator de crescimento vascular endotelial  \n \nLH – Hormônio Luteinizante  \n \nCpG – Citosina – Fosfato – Guanina (Ilha CpG) \n \n\n \n16 \n  \nLista de tabelas e quadros \n \nQuadro 1.  Sequencia dos nucleotídeos iniciadores.......................................................37 \n \nTabela 1.  Datação histológica........................................................................................41 \n \nTabela 2.  Homogeneidade dos grupos avaliados...........................................................42 \n \nTabela 3. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isoformas PR -\nA e PR-B em pacientes inférteis com endometriose.......................................................46 \n \nTabela 4. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isoformas PR -\nA e PR-B em pacientes inférteis sem endometriose (Controle Infértil)..........................47 \n \nTabela 5.  Teste exato de Fisher para avaliação estatística da comparação das \nporcentagens aproximadas de metilação da isoforma PR -B entre pacientes inférteis com \ne sem endometriose.........................................................................................................49 \n \n \n \n \n \n \n\n \n17 \n  \nSumário \n \nIntrodução..........................................................................................................18 \n \nJustificativa........................................................................................................30 \n \nObjetivo..............................................................................................................31 \n \nHipótese.............................................................................................................32 \n \nCasuística e Metodologia...................................................................................33 \n \nResultados.........................................................................................................40 \n \nDiscussão..........................................................................................................49 \n \nConclusão..........................................................................................................54 \n \nReferências Bibliográficas.................................................................................55  \n \n \n \n \n \n \n\n \n18 \n  \n1. Introdução \n \n1.1. Endometriose:  \nA endometriose é uma doença ginecológica benigna caracterizada pela presença \ne crescimento de tecido endometrial ectópico  funcional, que acomete entre 10 a 15% \ndas mulheres no período reprodutivo [1]. O tecido ectópico é histologicamente \nsemelhante ao endométrio de mulheres sem endometriose e ao endométrio eutópico de \nmulheres com a doença . Contudo , estes tecidos podem ser distintos tanto bioquímica \nquanto funcionalmente, incluindo sua receptividade a esteroides, potencial proliferativo \ne invasivo [2]. Em pacientes com a doença, o  tecido endometriótico é comumente \nencontrado na cavidade pélvica, no peritônio pélvico, ovários, septo reto -vaginal, \nbexiga,e, mais raramente, no pericárdio, pleura, fígado, rim, e cérebro [3]. \nA apresentação clínica da endometriose é caracterizada por  dismenorréia, \ndispareunia (dor durante o ato sexual), dor pélvica não cíclica e infertilidade [4]. \nContudo, a endometriose pode se mostrar assintomática em 2 a 22% das mulheres. Já a \nocorrência de endometriose em mulheres com dismenorréia é de 40 a 60%[5].  \nA laparoscopia é o método padrão -ouro para o diagnóstico da doença , mas é \nfortemente sugestiva por meio de  exames ginecológicos, ultra-sonografia transvaginal e \na ressonância magnética [6] e permite que  os implantes peritoneais e ovarianos sejam \nqualificados de acordo com o tipo de lesão ( lesões vermelhas, negras ou brancas). Além \ndisso, para melhor diagnosticar a evolução da doença,  a American So ciety for \nReproductive Medicine  elaborou um sistema de classificação da endometriose em \nquatro está gios mundialmente aceitos: forma mínima (está gio I), leve ( estágio II), \n\n \n19 \n  \nmoderada (estágio III) e severa ( estágio IV), cuja análise se baseia em um sistema de  \nescores unificados considerando a extensão, profundidade e  percentual das lesões , \nassim como a presença, de endometriomas e aderências pélvicas.. \nAlgumas teorias tentam explicar o surgimento da  endometriose. A primeira \ndelas, descrita em 1919 por Meyer, é a teoria da metaplasia celômica , a qual sugere que \no epitélio celômico se transforme por metaplasia em tecid o semelhante ao \nendométrio[8]. Partindo deste pressuposto é possível explicar a endometriose ovariana, \na serosa peritoneal e a endometriose na ausência de menstruação [9]. Porém, esta teoria \nnão explica a presença de endometriose em locais  onde os tecidos não sejam derivados \nde epitélio celômico. Neste caso, se a metaplasia celômica fosse semelhante à \nmetaplasia comum, a frequência de endometriose seria maior com a idade[8]. \nOutra teoria, proposta em 1927 por Sampson, é a teoria da implantação \nmetastática, que procura explicar a endometriose através do refluxo menstrual via tuba \nuterina para dentro da cavidade abdominal , onde algumas célula s conseguem se \nimplantar. Esta é a teoria mais aceita devido a o fato d o fluxo menstrual retrógrado \nocorrer em 90% das mulheres[10], da presença de células epiteliais endometriais viáveis \nno fluido peritoneal [11] e da associação entre fluxo menstrual obstruído e \nendometriose[12]. \nEmbora a teoria de Sampson seja a  mais aceita, somente o refluxo tubário não \nbasta para que a endometriose se estabeleça, pois 90% das mulheres possuem o refluxo \nmenstrual e somente 10 a15% desenvolvem a doença. Dessa forma, para a ocorrência e \nmanutenção da doença devem ocorrer: \n\n \n20 \n  \n1- O escape  do sistema imunológico – onde acredita -se que o \nestabelecimento da doença dependa da capacidade das células endometriais implantadas \nectopicamente neutralizarem a resposta imune[13, 14];  \n2- O mecanismo de adesão – através de integrinas e caderinas, importantes \npara a adesão celular inicial[15]; \n3- O mecanismo de invasão - dependente de metaloproteases da matriz \n(MMP) e de seus inibidores teciduais específicos (TIMPs)[16]; \n4- O mecanismo de apoptose - em mulheres que apresentam endometriose a \nporcentagem de células que passa por apoptose é menor, indicando que algumas células \npodem continuar a exibir atividades fisiológicas fora de seus padrões normais[17];  \n5- Neovascularização - O ambiente peritoneal é altamente angiogênico e o \naumento na atividade e nas quantidades do VEG F-A ( vascular endothelial growth \nfactor) é demonstrado no fluido peritoneal e no endométrio de  mulheres com \nendometriose[18]; \n6- Proliferação das células ectópicas – Acredita-se que a expressão \naberrante de aromatase (enzima que catalisa biossíntese de estrógeno) esteja envolvida \nna patogênese da doença, pois é um estímulo de cres cimento independente do \novário[19, 20]. \n \n1.2. Infertilidade e endometriose: \nA infertilidade está associada à endometriose e ocorre em 30 a 50 % das \nmulheres com esta desordem [21], contudo esta associação não est á completamente \nelucidada[22]. Estudos corroboram a diminuição da fecundidade em portadoras de \nendometriose[23]. Entretanto os mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese, \n\n \n21 \n  \nprincipalmente nos casos de endometriose mínima e leve, na s quais não se observa \nalteração mecânica do trato reprodutivo, ainda não foram esclarecidos[21]. \nAlguns autores sugerem a ocorrência de menores taxas de fertil ização, \nimplantação e gestação em pacientes portadoras de endometriose [24, 25] . Este fato \npoderia ser decorrente do comprometimento da qualidade oocitária e, \nconsequentemente, embr ionária e/ou de defeitos endometriais ou ainda da interação \nentre o endométrio e o embrião [26-28]. Evidências sugerem que defeitos funcionais do \nendométrio possam contribuir com a di minuída fecundidade apresentada por pacientes \ncom esta doença[29].  \nEstudos moleculares sobre a falha de implantação embrionária em pacientes com \nendometriose sugerem a ocorrência de alterações na expressão e tradução de genes do \nendométrio eutópico envolvidos no processo de implantação [30]. Os receptores de \nprogesterona, fatores de transcriçã o, enzimas envolvidas no metabolismo de esteroides, \nentre outros, são genes com expressão aberrante na endometriose durante o período \nfavorável à implantação (janela de implantação) [31]. Entretanto, não há estudos com \ncasuísticas e metodologias adequadas que nos permitam o completo entendimento dos \nmecanismos envolvidos na redução da fecundidade e potencial piora dos resultados dos \nprocedimentos de reprodução assistida  em portadoras de infertilidade relacionada à \nendometriose. \n \n1.2.1. Receptividade Endometrial:  \n A implantação é um processo altamente controlado que envolve a interação \nentre o endométrio e o embrião [32]. O sucesso depende do correto desenvolvimento do \n\n \n22 \n  \nembrião até o estágio de blastocisto e da chegada do embrião em um endométrio \nreceptivo[31, 33, 34]. \nO endométrio humano passa por mudanças histológicas e estruturais ao longo do \nciclo menstrual, que viabilizam a implantação do embrião e o desenvolvimento de uma \ngestação ou, em caso de ciclos sem concepção, a descamação endometria l luminal e sua \nposterior regeneração. Estas alterações cíclicas ocorrem  nas diferentes fases do ciclo, \nproliferativa inicial, média e tardia, secretora inicial, média  e tardia [35] . Contudo, o \nendométrio apenas se torna receptivo 6 -10 dias após o pico de LH da fase secretora \nmédia. [36, 37].  \nDurante este período receptivo do ciclo menstrual, ocorre no tecido eutópico  do \nendométrio uma maior expressão de diversos fatores de crescimento, citocinas, \nmoléculas de adesão e receptores de hormônios, envolvidos diretamente no processo  de \nimplantação embrionária [37]. Irregularidades no controle da expressão gênica, \nincluindo modificações epigenéticas, podem resultar em expressão aberrante de genes \ne/ou proteínas reguladoras do crescimento e diferenciação endometriais.  Os receptores \nhormonais para progesterona são susceptíveis à modulação epigenética por possuírem \nem seus  promotores regiões passíveis de receberem metilação, um dos mecanismos \nepigenéticos a ser detalhado no próximo tópico [32]. \n \n1.3. Epigenética como uma possível causa para a Endometriose: \nUma outra teoria tem sido formada sobre a etiologia da endometriose, soma ndo-\nse aos fatos já conhecidos de que a endometriose seja uma doença hormonal com \nanomalias imunológicas,  esta apresenta -se como uma doença multifatorial com a \nassociação de fatores ambientais e genéticos. . Estudos mostram que alguns genes estão \n\n \n23 \n  \ndesregulados na endometriose e que essas alterações na expressão gênica estariam \nrelacionadas aos mecanismos epigenéticos de controle  como a metilação do DNA, as \nmodificações de histonas e aos RNAs não codificadores[38].  \nO termo epigenética refere-se as alterações estáveis na expressão gênica que não \nsão explicadas por mudanças na sequência de DNA. Os mecanismos epigenéticos atuam \nmodificando a estrutura da cromatina e/ou de um determinado domínio cromossômico \npermitindo a ativação de alguns genes e o sil ênciamento de outros [39, 40] . Dentre os \nmecanismos epigenéticos de controle da expressão gênica estão as modificações de \nhistonas que alteram a estrutura da cromatina pela adição de grupos químicos às  caudas \ndessas proteínas que formam o nucleossomo. Tais modificações podem ser do tipo \nfosforilação, ubiquitinação , metilação e acetilação. Essas modificações geram um \n“código de histonas” que possui importante papel na modulação da transcrição[41, 42]. \nOutro mecanismo epigenético são os RNAs não codificadores (ncRNAs) que ativam ou \nsilenciam genes em um determinado domínio cromossômico ou pela modulação da \nestrutura da cromatina[43].  \nO terceiro mecanismo epigenético de controle da exp ressão genica e o mais \nestudado até o momento é a metilação do DNA que consiste na ligação covalente de um \nradical metil ao carbono 5 de citosinas que precedem uma guanina, estrutura conhecida \ncomo dinucleotídeo CpG (Citosina -fosfato-Guanina), resultando n a conversão de \ncitosina para 5 -metilcitosina na sequencia de DNA [44, 45]  (Figura 1). Esta reação é \nreversível e catalisada pelas enzimas DNMTs (DNA metiltransferase)[45]. \n \n\n \n24 \n  \n \nFigura 1. Mecanismo de metilação do DNA. O radical metil é adicionado ao carbono 5 \nda citosina sob a ação da enzima DNA metiltransferase. Esta ligação é reversível \n[modificado de[45]]. \n \nAs DNMTs  se dividem em duas categorias, de acordo com suas funções \nbiológicas. A primeira categoria diz respeito à manutenção da metilação do DNA, onde \nencontramos a DNMT1,  a metiltransferase mais estudada nos mamíferos e principal \nmetiltransferase. A segunda categoria compreende as enzimas envolvidas na na \nmetilação de novo  do DNA, sendo responsáveis pela estabilização de padrões de \nmetilação do DNA durante o desen volvimento embrionário. Dentro destas c ategorias \nencontramos a DNMT3A e  DNMT3B[45]. Acredita -se que o  aumento da expressão  \ndessas enzimas é pré-requisito para ocorrer a hipermetilação do DNA. Foi demonstrado \nque as três enzimas citadas encontram -se altamente expressas no epitélio de implantes \nendometrióticos quando comparados a um grupo controle sadio ou com tecido \nendometrial eutópico em mulheres com endometriose, sendo que neste último tecido \nsomente o gene DNMT3A é expresso. Com base nestes dados acredita -se que a \nendometriose possa estar relacionada a hipermetilação do DNA [45].  \nA metilação do DNA geralmente está relacionada ao silenciamento gênico ou a \nredução da sua atividade[46, 47] (Figura 2) e, como dito,  nos mamíferos este processo é \n\n\n \n25 \n  \ncatalisado pelas DNMTs [48](Figura 1). O mecanismo de metilação do DNA , somado \naos outros fatores epigenéticos de regulação da expressão gênica , é fundamental para o \ncorreto desenvolvimento de um organismo e  auxilia na manutenção da estabilidade \ngenômica atuando no silenciamento de retrotransposons [10].  \n \n \nFigura 2. Regulação epigenética em ilhas CpG mediada pela metilação do DNA. Na \nausência de metilação nos dinucleotideos CpG a transcrição ocorre normalmente, mas \nquando encontram-se metilado o fator de transcrição não conseg ue se ligar e o gene é \nsilenciado [modificado de 60] \n \nDentre as alterações epigenéticas encontradas em pacientes com endometriose, a \nprimeira evidência foi relatada em  estudos envolvendo o gene  HOXA 10 , gene com \nregiões conservadas de fatores transcricionais durante o desenvolvimento do organismo \ne de importância para a função uterina [45], o qual apresenta -se hipermetilado em \nmulheres com endometriose [58]. Uma segunda evidência é dada através de estudo que \nmostra o promotor da isoforma PR-B do gene PGR B hipermetilado na endometriose. \nEste fato é concomitante com a redução da expressão do PR-B, sugerindo então uma \n\n\n \n26 \n  \nregulação epigenética na expressão e silenciamento da isoforma B [38], entretanto este \nestudo não traz informações a respeito da fertilidade do grupo estudado. \nOutro indí cio relevante da atuação dos mecanismos epigenéticos na \nendometriose é a elevada expressão dos  genes DNMT1, DNMT3A  e DNMT3B em \nmulheres com essa doença [49]. Apesar das células somáticas serem geneticamente \nhomogêneas, o que confere diferenças estruturais e funcionais é um  sistema de \ndiferenciação da expressão gênica que tem in ício durante o desenvolvimento \nembrionário e permanece nas sucessivas mitoses. Essas diferenciações ocorrem devido \naos mecanismos epigenéticos de controle da expressão gênica que conferem a cada \ncélula um fenótipo característico[50, 51]. \nDentre os  genes responsáveis pela expressão dos receptores de esteroides, os \nreceptores de progesterona ( PGR) apresentam uma região de metilacão diferencial em \nsua região promotora, e estudos mostram  que a região promotora da isoforma PR-B, \nmas não a região promotora da isoforma PR-A, encontra-se hipermetilada em pacientes \ncom endometriose quando comparadas a pacientes sem a doença [49]. \n \n1.4. Receptores de Progesterona: \n1.4.1.  Progesterona: \nA progesterona é um hormônio esteroide que atua neutralizando o efeito de \nestimulação do crescimento do estrógeno pela indução da diferenciação glandular e \nestromal do endométrio. Em pacientes com endometriose , o tratamento com \nprogesterona é efetivo n a redução  do cresci mento de tumores endometriais nos  quais \nsão expressos os receptor es de progesterona. Algumas respostas a este hormônio \nesteroide são mediad as por receptores. Entretanto, vários estudos tem mostrado que a \n\n \n27 \n  \nregulação da expressão dos receptores de progesterona é complexa  [52]. A resistência à \nprogesterona é comumente observada em paci entes portadoras de endometriose e este \nfato pode ser atribuído a níveis extremamente baixos de receptores deste hormô nio no \ntecido endometriotico [45]. Contudo não há estudos que confrontem dados de pacientes \ninférteis com endometriose e a diminuição dos receptores. \n \n1.4.2. Receptores de Progesterona: \nO gene PGR, também conhecido como PR, que codifica o receptor de \nprogesterona, é membro da superfamília dos receptores nucl eares e necessário para a \nimplantação embrionária e subsequentemente para a  decidualização. Localizado na \nregião cromossômica 11q22-q23 e com oito exons [56], este gene possui dois diferentes \npromotores e sítios de inicio de tradução no primeiro éxon que produz duas isoformas, \nA e B (Figura 3)[53]. \n \n \nFigura 3. Esquema representativo do gene PGR codificador dos receptores de \nprogesterona PR -A e PR -B evidenciando a localização dos promotores (F1 e F2) e a \nsobreposição que ocorre durante a transcrição das isoform as proteicas [modificado de \n49] \n\n\n \n28 \n  \n \nNos humanos existem duas distintas isoformas do PGR, denominados PR-A e \nPR-B, ambos codificados por um único gene e diferem pois a isoforma PR-B possui 164 \naminoácidos a mais na porção N-terminal.  \nA função do PR-B está relacionada a ativação  transcricional dominante dos \npromotores sensíveis à progesterona,  enquanto o PR-A atua como um repressor \ndominante sobre o PR-B e outros receptores de esteroides (estrogênio, andrógeno, \nreceptores glucocorticóides e mineralocorticoides). Portanto a expressão relativa de PR-\nA/PR-B determina, em partes, a característica c elular de responder à progesterona [54]. \nEmbora sejam expressos pelo mesmo gene, cada uma de suas isoformas possui uma  \nregião promotora distinta [52]. \nNo endométrio, o nível de ambas isoformas aumenta progressivamente durante a \nfase proliferativa , pico imediatamente anterior à ovulação e diminui logo após a \novulação, sugerindo que o estrad iol estimule os níveis de PR [45 ].Contudo, a expressão \nde PR-B é indetectável e a PR-A é notadamente reduzida em tecidos endometrioticos.  \nUm estudo demonstrou que o promotor do gene PR-B  possui uma região rica \nem dinucleotídeos CpG, denominadas ilhas CpG as quais encontram -se hipermetiladas \nem tecidos endometrióticos de pacientes com endometriose em estágios II a IV. Este \nfato é concomitante com a redução da expressão do PR-B, sugerindo então uma \nregulação epigenética na expressão e silenciamento da isoforma PR-B [49] (Figura 4). \n \n\n \n29 \n  \n \n \nFigura 4. Esquema representativo da localização das regiões p romotoras da PR-A e PR-\nB localizadas no gene PGR. Nas caixas em cinza acima temos evidenciado a localização \ndas ilhas CpG nas regiões promotoras [modificado de [45]]. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n30 \n  \n2. Justificativa \n \nA progesterona desempenha  um papel regulador chave no processo de \nimplantação embrionária, mobilizando diversos moduladores moleculares que \nsustentam a nidação embrionária. A insensibilidade à ação da progesterona, entre outros \nfatores, como epigenéticos, está ligada a defeitos no s receptores deste esteróide (PR -A \ne/ou PR-B) no endométrio eutópico de portadoras de endometriose,  podendo  contribuir \ntanto para a patogênese da doença, como para o comprometimento da implantação \nembrionária.  \nVisto que a regulação epigenética desempenh a um papel na estabilização da \nreceptividade do endométrio e subsequentemente na implantação do embrião  e que a  \nmetilação do DNA tem sido diretamente correlacionada com a expressão de genes \nligados à implantação,  acredita-se que a hipermeti lação da região p romotora do gene \nPGR em pacientes com infertilidade associada à endometriose possa interferir na \neficácia da atuação desse hormônio durante a fase secretora do ciclo , o que poderia \njustificar o quadro clínico. \n.  \n \n \n \n \n \n \n\n \n31 \n  \n3. Objetivo \n3.1 Objetivo Geral: \nAvaliar o padrão de metilação do gene que codifica o receptor de progesterona \n(PGR) em tecido endometrial eutópico de  pacientes com  infertilidade relacionada à  \nendometriose durante a fa se secretora d o ciclo menstrual  comparado ao tecido \nendometrial eutópico de mulheres inférteis sem endometriose na mesma fase do ciclo. \n \n3.2 Objetivos Específicos: \n- Verificar o padrão de metilaçao da isoforma PR-A em tecido endometrial de \nmulheres com endometriose e mulheres inférteis sem endometriose \n- Verificar o padrão de metilaçao da isoforma PR-B em tecido endometrial de \nmulheres com endometriose e mulheres inférteis sem endometriose \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n32 \n  \n2. Hipótese \n \nAlterações relacionadas à isoforma PR-B no padrão de metilação podem afetar a \nexpressão do gene PGR durante a fase secretora de pacientes com infertilidade  \nrelacionada à endometriose, já que  esta é a  isoforma efetora da atuação do hor mônio \nprogesterona no interior das células. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n33 \n  \n5. Casuística e Metodologia \n \n5.1 Casuística: \nTrata-se de um  estudo caso controle comparativo de pacientes inférteis com \nendometriose comparadas a mulheres controles inférteis sem endometrio se, realizado \njunto ao Laboratório de Ginecologia - Setor de Reprodução Humana do Departamento \nde Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), \nUniversidade de São Paulo (USP)  e Laboratório de Biologia da Reprodução do \nMultiusuário – FMRP-USP. O estudo foi aprovado pelo  Comitê de Ética em Pesquisa \ndo Hospital das Clínicas FMRP-USP, processo HCRP nº6383/2011. \n \n5.2 -Pacientes: \nForam incluídas pacientes  que preencheram  os critérios de inclus ão \npreestabelecidos e consentira m em participar do estudo após a assinatura do termo de \nconsentimento livre e esclarecido. \nForam incluídas no estudo  23 pacientes, divididas em dois grupos: Controle \ninfértil (12 pacientes) e endometriose (11 pacientes). \nAmostras endometriais de todas as pacientes foram obtidas com uso de Pipel le \nde Cornier durante a fase secretora do ciclo menstrual.  \n \n \n \n \n\n \n34 \n  \n5.3 - Critérios de Inclusão: \n5.3.1 - Grupo controle infértil: \nMulheres com infertilidade por fator masculino e/ou tubário, ciclos menstruais \nregulares, sem endometriose, doença inflamatória pélvica ou outras anormalidades \npélvicas avaliada por laparoscopia diagnóstica, e idade entre 18 e 45 anos. \n \n5.3.2 - Grupo Endometriose: \nMulheres com infertilidade relacionada à endometriose  sem outros fatores de \ninfertilidade, diagnosticada com qualquer estágio da doença durante a videolaparoscopia \ndiagnóstica, segundo os critérios definidos pela American Society for Reproductive \nMedicine (1997), que classifica a doença em quatro estágios: mínima (estádio I), leve \n(estádio II), moderada (estádio III) e grave (estádio IV); ciclos menstruais regulares  e \nidade entre 18 e 45 anos.  \n \n5.4 - Critérios de exclusão: \nObesidade, definida pelo  índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 30 \nKg/m²; presença de doenças sistêmicas tais como: D iabetes mellitus  ou outras \nendocrinopatias, doença cardiovascular, lup us eritematoso sistêmico e outras doenças \nreumatológicas; infecção pelo vírus HIV ou qualquer infecção ativa; tabagismo, \nalcoolismo ou drogadição; uso de medicações hormonais e de antiinflamatórios  \nhormonais e não-hormonais nos três meses anteriores à inclusão no estudo. \n \n \n \n\n \n35 \n  \n5.5 - Coleta e processamento do material: \nForam revisados os prontuários das pacientes que buscaram os serviços de \nReprodução Humana do Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto onde foram \nselecionadas as pacientes que previamente foram submetidas à videolaparoscopia \ndiagnóstica há menos de 2 anos , que atenderam aos critérios de inclusão e exclusão  e \npossuíam ciclos menstruais norma is (intervalos de 24 a 32 dias ± 3 dias; 2 a 7 dias de \nduração e fluxo de até 80 mL por ciclo) . A bi ópsia endometrial foi realizada \nambulatoriamente por médico experiente em data agendada conforme o ciclo individual \nde cada paciente coincidindo com a fase secretora de seus ciclos menstruais . Para a \nconfirmação de que a biópsia endometrial foi  realizada no período secretor, todas as \namostras foram submetidas à análise histológica clássica com coloração hematoxilina -\neosina ( HE) e a determinação da fase se cretora do ciclo menstrual foi  adequada de \nacordo com o resultado da datação endometrial, segundo os critérios de Noyes (Noyes \net al.,1975) realizada por um patologista  experiente. Imediatamente após a coleta, as \namostras de endométrio foram armazenadas a -80Cº imersas em PBS. \n \n5.6 - Extração do DNA: \nAproximadamente 25mg de tecido endométrial foram cortados  e lavados em \nPBS ( Phosphate Buffered Saline ) e armazenados em freezer -80 até a utilização. A \nextração de DNA foi realizada utilizando o QIAamp DNA Mini Kit  (Qiagen, local) \nsegundo recomentações do fabricante. Resumidamente, em cada amostra foram \nadicionados 180 µl de tampão ATL e  20µl de proteinase K, posteriormente col ocados \nem banho-maria a 56ºC até que o tecido estivesse totalmente digerido. Foi acrescido ao \nmaterial 200 µl de tampão AL e 200 µl de etanol absoluto. O material foi transferido \n\n \n36 \n  \npara coluna  e centrifugado, com isso  o DNA se aderiu à membrana da mesma. \nSucessivas lavagens foram feitas com os tampões AW1 e AW2 (500 µl de cada)  para \npurificação d o DNA extraído  e ao final foi realizada a eluição do material genômico \naderido à membrana com água aquecida a 56ºC. O DNA extraído foi mantido congelado \na -20ºC e sua qualidade e integridade foram avaliadas em gel de agarose a 2% corado \ncom GelRed (Biotium). \n \n    5.7 - Modificação por Bissulfito de Sódio: \n A seguinte etapa foi a modificação do material genômico utilizando o reagente  \nbissulfito de sódio. Esta  modificação permite a conversão in vitro  das citosinas não \nmetiladas presentes na moléc ula de DNA em  uracilas para assim ser possível a análise \ndo padrão de metilação pela presença das citosinas metiladas que permaneceram no \nDNA após a modificaçã o. Para tant o, foi utilizado o EpiTec Bissulfite Kit  (Qiagen, \nHilden Germany) . C onforme especificações do fabr icante 1,5 µg de DNA de cada \namostra foram utilizados para a modificação, acrescido s de 85µl de bissulfite mix e 35 \nµl de protect buffer. A mistura foi levada ao termoc iclador onde se dá a modificação do \nDNA obedecendo á ciclagem de 95ºC por 5 minutos, 60ºC por 25 minutos, 95ºC por 5 \nminutos, 60ºC por 85 minutos, 95ºC por 5 minutos, 60ºC por 175 minutos e 20ºC por 5 \nminutos. Ao término da ciclagem, o material presente nos tubos foi  acrescido de 560 µl \nde tampão BL e  levado para colunas onde o DNA, agora já modificado, se prende à \nmembrana presente na coluna e através de sucessivas  centrifugações e lavagens com os \ntampões BW e BD (500  µl cada) purificando o DNA. A eluição do material aderido à \nmembrana foi rea lizada finalmente com 20 µl  do tampão de eluição  EB. O DNA \nmodificado foi estocado à -20º Cº. \n\n \n37 \n  \n5.8 – PCR convencional \nPara confirmarmos que os primers  (quadro 1) estavam se anelando ás regiões \ncorretas foi realizada uma PCR convencional onde foi utilizado 1  µl de DNA \nmodificado, 2,5 µl de tampão, 1,5 µl de MgCL2 (1,5 mM), 0,5 µl de DNTPs (0,2 \nmM) 1 µl de Primer (0,5 µl do Foward e 0,5 µl do Reverse (0,5  µ)), 0,15  µl de \nTaqDNA Polimerase (1,25 u) e 18,35 µl de água totalizando um volume de 25 µl por \nreação. \nA ciclagem no termociclador obedeceu a sequencia de um primeiro estagio a \n95 ºC por 12 minutos, um segundo estagio que se repetiu por 40 vezes de 94ºC por \n30 segundos, 55ºC por 45 segundos, 72 ºC por 1 minutos e um terceiro estagio de 72 \nºC por 8 minutos e 10ºC por 10 minutos. Ao final o produto de PCR foi submetido á \neletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed.  \n \nQuadro 1.  Sequencia dos nucleotídeos iniciadores \nPrimer PR-A Primer PR-B \nFoward 5’-GGTTTTGTTAGGGATAGGATTTTTT-3’ Foward 5’- AGTATGGAGTTAGTAGAAGTT-3’ \nReverse 5’-ACTACCTCCAACACCCCTTATAACT-3’ Reverse 5’-TCACAAGTCCAACACTTAAATAACT-3’ \n \n5.9 –High Resolution Melting (HRM): \nApós a modificação por bissulfito, foi empregada a técnica de High Resolution \nMelting (HRM) onde, a princípio, o DNA é amplificado utilizando a técnica de PCR em \ntempo real (qPCR) . Nesta amplificação, as uracilas presentes na molécula de DNA \nmodificado são copiadas nos novos fragmentos como timina, portanto , onde \ninicialmente no DNA genômico encontrávamos uma citos ina, base nitrogenada \npirimídica, passamos a encontrar uma timina, base nitrogenada púrica.  \n\n \n38 \n  \n Logo em seguida  o fragmento recém sintetizado  passa por um aumento  \nsucessivo e gradual de temperatura até  95 ºC para se observar o ponto de dissociação da \ndupla fita dos fragmentos. A temperatura em que ocorre essa dissociação é chamada de \nponto de dissociação ( melting) e através dela podemos estimar a porcentagem  de \nmetilação do DNA, visto que, quanto maior o número de timinas, mais fácil se dará sua \ndissociação pois se tratando de uma base púrica realiza somente 2 ligações de \nhidrogênio no pareamento com a base  da fita hom óloga de  DNA. Em contrapartida, \nquanto mais citosinas, mais tarde se dará sua dissociação , já que, esta sendo uma base \npirimídica, realiza 3 ligações de hidrogênio, o que torna a fita de DNA mais estável em \nrelação a uma fita rica em timinas e pobre em citosinas [57].  \nPara esta técnica, foram utilizados 2,5 µl de DNA modificado pelo tratamento de \nbissulfito de sódio de cada uma das amostra, 10 µl de MeltDoctor (Applied Biosystems) \ne 1 µl de cada oligonucleotideos iniciadores ( Primers). Os Primers aqui utili zados \nforam baseados nos já descritos por Wu et al. 2006 [49], e expostos no Quadro 1, que se \nanelam nas regiões em que se encontram os promotores das isoformas (Figura 3) e cujas \nsequencias estão dispostas no  quadro 1. Junto às amostras, na mesma placa , foi \nacrescentada uma curva de diluição seriada utilizando DNA metilado proveniente do \nPCR control DNA Set  kit (Quiagen) contendo DNA  a 0%, 20%, 50%, 80% e 100% \nmetilado. A placa contendo todas as amostras e a curva de referência foi levada ao \ntermociclador 77500 FAST (Applied). A reação apresentava um volume total de 20 µl \npor reação que continha 2,5 µl de DNA modificado ou curva de diluiçã o, 10 µl de \nMelthDoctor, 0,5 µl de primer foward (PR -A ou PR -B) à 0,5  µ e 0,5 µl de primer \nreverse (PR-A ou PR-B) à 0,5 µ e 6,5 µl de água. \n \n\n \n39 \n  \n5.10– Dosagem sérica de progesterona: \nNo momento de cada coleta de endométrio, foi também coletado sangue de \ncada uma das pacientes para dosagem sérica do nível de progestero 5.10na, afim de se \nconfirmar a ovulação, confirmando assim que as coletas foram realizadas após a \novulação (progesterona ≥3 ng/ml). A dosagem foi realizada por quimiluminescência \ncom o kit IMMULITE 2000 (Siemens). \nTambém foi avaliada a homogeneidade dos grupos avaliando as variáveis IMC, \nidade, peso, altura e tamanho do ciclo (período compreendido entre o primeiro dia da \nmenstruação e o primeiro dia da menstruação seguinte)  \n \n5.11 – Análise dos Resultados Obtidos por HRM e Análise estatística: \nAs variáveis quantitativas avaliadas foram comparadas entre os grupos utilizando-se \no teste  t-Student. Os dados obtidos pelo HRM foram lidos pelo programa HRM \nSoftware que nos mostra a porcentagem de metila ção encontrada em cada amostra. Para \ncomparação das porcentagens de metilação das isoformas PR -A e PR -B dos grupos \namostrais foi realizado o teste exato de Fisher através do programa SAS 9.0.  O nível se \nsignificância utilizado foi de 5% (P ≤ 0,05) . Um fluxograma contendo a sequê ncia de \ntoda a metodologia descrita está disposto na Figura 5 \n \n \n \n \n \n \n\n \n40 \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 5. Fluxograma da metodologia \n \n \nAnálise de prontuários \nContato com a \npaciente \nColeta do material \nDosagem da progesterona e \ndatação histológica \nExtração de DNA \nModificação por Bissulfito \nde Sódio \nHigh Resolution Melting \nResolution \nAnálise estatística \n1335 analisados \n130 Elegíveis \n25 Aceitaram \n23 Coletadas \nEletroforese \n\n \n41 \n  \n6. Resultados \n \nPara dar inicio aos experimentos que avaliaram o padrão de metilação de cada \numa das isoformas do PGR foi realizada a datação histológica das amostras segundo \nos critérios estabelecidos por Noyes  1975, para confirmação da amostra nos \nparâmetros estabelecidos. O resultado da datação (Tabela 1) confirma que todas as \namostras foram coletadas dentro da fase secretora do período menstrual das pacientes. \n \nTabela 1.  Datação histológica \n \nLegenda \nda \nAmostra \nGrupo Estagio Datação (dia do \nciclo) \nIntervalo do \nciclo (dias) \n2 Endometriose  2 24 28 \n3 Endometriose  1 24 28 \n4 Controle Infértil - 24 28 \n5 Endometriose 3 16 24 \n6 Controle Infértil - 17 28 \n8 Controle Infértil - 21 28 \n9 Controle Infértil - 17 27 \n10 Controle Infértil - 17 29 \n12 Endometriose  1 21 28 \n13 Controle Infértil  15 25 \n14 Endometriose  4 26 28 \n15 Controle Infértil - 15 28 \n17 Controle Infértil - 18 28 \n19 Controle Infértil - 19 28 \n20 Controle Infértil - 24 30 \n21 Controle Infértil - 26 32 \n22 Endometriose  1 23 28 \n25 Endometriose  4 19 30 \n26 Endometriose  3 22 30 \n27 Endometriose  4 23 28 \n28 Endometriose  2 23 28 \n31 Controle Infértil - 24 28 \n32 Endometriose  1 24 28 \n \n\n \n42 \n  \nOs valores de média e desvio padrão das idades, altura, peso, IMC e dia do ciclo \ndas pacientes estão apresentadas na tabela 2 . Não foram observadas diferenças em \nnenhuma características avaliadas entre os grupos com endometriose e controle infértil \n \nTabela 2.  Características quantitativas dos grupos avaliados. \nGrupo Idade \n(Anos) \nAltura \n(Metros) \nPeso \n(KG) \nIMC Tamanho do Ciclo \n(Dias) \nControle Infértil 36,27 1,6 62,03 24,12 27,92 \nEndometriose 35,48 1,64 67,68 25,29 28 \nValor p* 0,67 0,21 0,28 0,55 0,88 \nP*=nível de significância \nApós a confirmação de que as amostras estavam adequadas ao proposto, o DNA \nfoi extraído como descrito anteriormente e uma eletroforese foi realizada  em algumas \namostras para validação da integridade do material genétic o extraído, como mostra a \nFigura 6. O material se mostrou íntegro e apto para dar prosseguimento  aos \nexperimentos. \n  \nFigura 6.  Eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed com DNA extraído \ndas biópsias endometriais . \n\n\n \n43 \n  \n \nApós a amplificação do DNA modificado foi observado que os primers para as \nisoformas se anelavam nas regiões que compreendiam às regiões para as quais foram \ndesenhados devido às bandas formadas de tamanho molecular correspondente como \nmostra a Figura 7. \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 7. Eletroforese evidenciando as bandas formadas pelos primers PR -A \n(100bps) e PR-B (200 bps) \nA curva de diluição  seriada segundo as porcentagens de metilaçã o adicionadas \nestão apresntadas nas figuras 8 e 10, em que pode-se observar a separação das curvas de \nacordo com sua porcentagem de metilação.A analises da porcentagem de metilaçao dos \ngenes PR-A e PR-B estão evidenciada pela técnica HRM estão apresentas nas Figura s 9 \ne 11.  \n200 bps \n100 bps \n\n \n44 \n  \n \nFigura 8 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes \nporcentagens de metilação para isoforma PR-A. \n \n  \nFigura 9.  Resultado do HRM para isoforma PR-A \n \n\n\n \n45 \n  \n \nFigura 10 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes \nporcentagens de metilação para isoforma PR-B. \n \n \nFigura 11.  Resultado do HRM para isoforma PR-B. \n \n \n \n\n\n \n46 \n  \nO observado nas figuras  foi transposto para a Tabelas  3 e 4 para facilitar a \ninterpretação dos resultados. \n \nTabela 3. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isofo rmas PR-\nA e PR-B em pacientes inférteis com endometriose. \nAmostra % aproximada de   \nMetilação (PR-A) \n% aproximada de \nMetilação (PR-B) \n2 0% 50% \n3 0% 0-20% \n5 0% 50% \n12 0% 50% \n14 0% 80% \n22 0% ND \n25 0% 0-20% \n26 0% 50% \n27 0% 50% \n28 0% 50% \n32 0% 50% \n*ND - representa amostra que não mostrou amplificação, portando não sendo lida durante o procedimento \n \nPodemos observar que no grupo endometriose , a isoforma  PR-A encontra -se \nhipometilada com 0% porcentagem de metilaçao , Contudo a isoforma PR-B mostrou-se \nparcialmente metilada na maioria das pacientes com porcentagem de metilaçao de 50% \n(n=8), somente uma paciente apresentou 80% de metilacão na isoforma B. \n \n \n \n\n \n47 \n  \nTabela 4. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isoformas PR -\nA e PR-B em pacientes inférteis sem endometriose (Controle Infértil). \nAmostra % aproximada de \nMetilação (PR-A) \n% aproximada de Metilação \n (PR-B) \n4 0% 0-20% \n6 0% 50% \n8 0% 50% \n9 0% 0-20% \n10 0% 0-20% \n13 0% ND \n15 0% 0-20% \n17 0% 0-20% \n19 0% 0-20% \n20 0% ND \n21 0% ND \n31 0% 0-20% \n*ND representa amostra s que não mostr am amplificação, portan do não sendo lidas durante o \nprocedimento \n \nObservando o resultado obtido no grupo controle , a isoforma PR -A se mostrou \nhipometilada, contudo a isoforma PR-B  mostrou diferentes níveis de metilação também \nneste grupo, porém as porcentagens variando somente na ampliação de 0 a 50%  com a \nmaioria das pacientes com metilação de 0 -20% (n=7) e duas com porcentagem igual a \n50%. A Figura 12 correlaciona os dados obtidos em ambos os grupos . \n \n \n \n\n \n48 \n  \n \nFigura 12. Gráfico comparativo das porcentagens de metilação  da isoforma PR -B nos \ngrupo endometriose e controle infértil \n*ND – Amostras que não mostraram amplificação durante o experimento \n  \nAnalisando a isoforma PR -B, o grupo controle infértil mostrou a maioria das \npacientes com metilação em somente 0-20% das ilhas CpGs do gene. Já no grupo \nendometriose, a maioria das pacientes mostrou metilação em 50% das ilhas CpGs. \n Para quantificar estatisticamente  foi realizado o teste exato de Fisher  para \ncomparação das porcentagens de m etilação entre os grupos pa ra a isoforma e PR-B e o \nresultado está demonstrado na Tabela 5. \n \n \n \n0\n1\n2\n3\n4\n5\n6\n7\n8\n0-20% 50% 80% ND\nNúmero de \nPacientes\nPorcentagem de Metilação\nEndometriose\nControle Infertil\n\n \n49 \n  \nTabela 5.  Teste exato de Fisher  para avaliação estatística da comparação das \nporcentagens aproximadas de metilação da isoforma PR -B entre pacientes inférteis com \ne sem endometriose \nPR-B \nPorcentagem (%) Metilação  \n \nControle Infértil      Endometriose Total  \n0 - 20% 7 2 9 \n77,8% 20,0%   \n50% 2 7 9 \n22,2% 70,0%   \n80% 0 1 1 \n0,0% 10,0%   \nTotal 9 10 19 \nValor p* 0,04   \nP*=nível de significância \n \nA análise estatística nos permite verificar uma diferença significativa (p = 0,04) \nentre os grupos. Confrontando os dados , observamos que no grupo Controle I nfértil a  \nprevalência de pacientes com porcentagem  entre 0 -20% de metilação é  de 77,8% \ncomparando-se com o grupo Endometriose , enquanto que no grupo Endometriose a \nprevalência de  porcentagem de metilação de 50% é  de 70% em relação ao grupo \nControle Infértil. \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n50 \n  \n7. Discussão \n \nA endometriose é um a doença ginecológica que est á vinculada à infertilidade, \ncontudo as relações de causa e efeito não estão plenamente estabelecidas. A resistência \nà progesterona é uma condição apresentada por grande parte das pacientes portadoras de \nendometriose e colabora para a infertilidade apresentada neste grupo [45]. A atuação \ndeste hormônio ocorre através de seus receptores que encontram -se com sua expressão \nsuprimida em pacientes com endometriose[45]. É sabido que a região promotora do PR-\nB encontra-se parcialmente metilada em pacientes com endometriose [49] contudo, \nnenhuma pesquisa objetivou-se em avaliar o perfil epigenético deste gene em pacientes \ninférteis com endometriose  e elucidar seu possível papel no comprometimento da \nreceptividade endometrial e, consequentemente, na infertilidade apresentada por grande \nparte das portadoras da doença . A baixa contagem de receptores de progesterona pode \nser o elo de ligação entre infertilidade e endometriose e a investigaçao  do perfil \nepigenético dos promotores do gene que codificam para os  receptores de progesterona \nse faz importante para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nessa doença.  \nEm nosso trabalho , confrontamos um grupo de pacientes infért eis com \nendometriose a um grupo infértil sem endometriose. Encontramos que , na \nendometriose, o gene PR-B  encontra-se p arcialmente metilado (50%)  na região \nanalisada. Diferentemente, nas pacientes inférteis sem endometriose , observou-se uma \nmenor porcentagem  de metilação  (0-20%) na região analisada do gene  PR-B, o que \nsugere que a doença possa estar afetando diretamente a expressão desta isoforma . O \ngene PR-B, que codifica para a isoforma B,  é um ativador transcricional dominante dos \n\n \n51 \n  \npromotores sensíveis à progesterona  [54]. Sabe-se que a progesterona é o esteroide \npredominante da fase secretora e controla todas as alteraçõ es moleculares que \npromovem o estabelecimento da receptividade endometrial e propiciam a interação \nentre o endométrio e o embrião visando a implantação embrionária  [64]. Sua ação se dá \nem ligações específicas ligante -receptor, que de sencadeiam uma cascata gênica cujos \ntranscritos atuam autocrina, parácrina ou endocrinamente , com consequentes alterações \nhistológicas, moleculares e funcionais  [64]. Já é sabido que a metilação do promotor \nleva à diminuiçao da expressão ou até ao sil enciamento total do gene  [59]. Esta maior \nporcentagem de metilação observada possa estar contribuindo  para as alterações no \nendometriais, e consequentemente afetando a implantação embrionária e  a fertilidade \ndestas pacientes. Ainda, visto que  o grupo controle é constituído por pacien tes inférteis \nsem endometriose, com critérios restritos de elegibilidade, o aumento da porcentagem \nde metilação nas pacientes inférteis com endometriose pode ser atribuído à presença da \ndoença.  \nO estudo de  Wu, et al.  2006 [49] utilizou a técnica Methilation Specific PCR \n(MSP), que analisa a metilação do DNA através da técnica de PCR utilizando primers \nespecíficos para o DNA metilado e outro para o segmento nao metilado , para avaliar a \nmetilação do gene PR-B em amostras de células epiteliais de focos endometrióticos de \npacientes com a doença, tendo  encontrado que a isoforma apresentava bandas de DNA \nmetiladas e não metiladas , sugerindo que a região promotora d o PR-B tem uma \ntendência a estar parcialmente metilada na endometriose, resultado confirmado a través \nde sequenciamento e que vai ao encontro do que observamos em nosso estudo. No \nentanto, o foco destes autores foi avaliar o papel da metilação deste gene na patogenia \nda endometriose e não da infertilidade associada a essa condição , uma vez que inclu iu \n\n \n52 \n  \npacientes com a doença independentemente da presença de infertilidade e avaliou os \nimplantes ectópicos ao invés do endométrio eutópico.   \nO gene PR-A por sua vez,  atua como modulador da transcrição, podendo \nreprimir a atividade transcricional do próprio  PR-B e de outros receptores esteroides \n[49[54]] . Em nosso grupo de estudo o ge ne que expressa esta proteína não mostro u \nsinais de metilação em seu promotor , sugerindo não haver alterações na sua expressão . \nNo estudo de  Wu et al.[49] o gene PR-A também mostrou-se não metilado revelando, \npossivelmente, que na endometriose não há interferência quanto à metilação desse gene. \nEm um trabalho recente, [60] nosso grupo avaliou ultraestruturalmente o \nendométrio eutópico de pacientes inférteis com e sem endometriose mínima/leve \n(também incluídas no presente estudo) durante a janela de implantação , com o objetivo \nde avaliar a presença e o desenvolviment o de pinopodes, estruturas epiteliais que \nparecem ser importantes marcadores ultraestruturais de receptividade endometrial [62] , \napontados como biomarcadores clássicos da janela de implantação no epitélio \nendometrial humano  [63]. O desenvolvim ento destas estruturas est á associado à \nconcentração de progesterona e a  seus receptores [61]. Em uma análise descritiva, f oi \nobservado o predomínio de pinopodes em regressão e menor porcentagem de pinopodes \ndesenvolvidos e em desenvolvimento  em pacientes inférteis co m endometriose  inicial \ncomparadas a um grupo controle infértil , porém, sem endometriose. Isto sugere uma \nassincronia na expressão destas estruturas em pacientes inférteis com endometriose  e \nconsequente interferência na implantação e fertilidade destas pacientes[60].  \nUma vez que o desenvolvimento dos pinopodes est á vinculado à atuação da \nprogesterona através de seus receptores , podemos observar um paralelo interessante \nentre o aumento da metilação da  isoforma PR -B, receptor dominante na atuação da \n\n \n53 \n  \nprogestetona no interior da célula  [54], e o declínio da presença e desenvolvimento de \npinopodes no endométrio eutópico de pacientes inférteis com endometriose[60]. \nA alteração no desenvolvimento de pinopodes num grupo  com amostras  \ntambém incluídas neste estudo corrobora a idéia de que a metilação parcial do promotor \ndo PR-B pode interferir em sua  expressão, acarretando em comprometimento da \nreceptividade endometrial (alterações dos pinopodes)  e consequentemente , d a \nfertilidade da paciente.  \nPara conclusões mais precisas, futuros estudos sobre a expressão do gene PGR, \nem especial do gene que codifica para a isoforma B, o PR-B, em pacientes inférteis com \nendometriose seria importante para confirmar os presentes achados e aprofundar o \nentendimento da metilação deste  gene como um mecanismo envolvido na \netiopatogênese da infertilidade associada à endometriose . C ontudo, os dados aqui \nmostrados indicam que há um importante aumento da metilação da região promotora do \ngene PR-B em pacientes inférteis com endometriose , e no s permitem sugerir que a \nmetilação parcial na região promotora d esse gene possa resultar em  alterações na \nexpressão desse gene e tradução da sua proteína, levando a crer que fatores epigenéticos \npossam estar envolvidos no comprometimento da fertilidade das mulheres com \nendometriose. \n \n \n  \n \n \n \n\n \n54 \n  \n8.Conclusão \n \nConcluímos que  o promotor do gene que expressa o receptor de progesterona \n(isoforma PR -B) encontra -se parcialmente metilado em pacientes inférteis com \nendometriose, de maneira distinta de pacientes com endometriose e sem infertilidade. A \nmetilação parcial deste promotor pode causar alterações na expressão deste gene e \ninfluenciar diretamente a resposta das células  endometriais à progesterona , \nconsequentemente, impactando a implantação embrionária e a fer tilidade desta s \npacientes.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n55 \n  \n9.Referências Bibliográficas \n \n1. Yang, W.C., et al., Serum and endometrial markers.  Best Pract Res Clin Obstet \nGynaecol, 2004. 18(2): p. 305-18. \n2. Nap, A.W., et al., Pathogenesis of endometriosis. Best Pract Res Clin Obstet \nGynaecol, 2004. 18(2): p. 233-44. \n3. Giudice, L.C. and L.C. Kao, Endometriosis. Lancet, 2004. 364(9447): p. 1789 -\n99. \n4. Poliness, A.E., et al., Proteomic approaches in endometriosis research.  \nProteomics, 2004. 4(7): p. 1897-902. \n5. Farquhar, C.M., Extracts from the \"clinical evidence\". Endometriosis.  Bmj, \n2000. 320(7247): p. 1449-52. \n6. Thomas, E.J., Endometriosis, 1995--confusion or sense?  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A \nreceptividade á progesterona encontra -se suprimida nestas pacientes e a regulação da \nexpressão de seus receptores, expressos pelo gene PGR em duas isoformas (PR-A e PR-\nB) pode estar sob modulação epigenética. Este trabalho objetivou avaliar o padrão \nepigenético da região promotora do gene PGR em mulheres inférteis com endometriose \ndurante a fase secretora do cilco menstrual  comparado com mulheres inférteis sem \nendometriose no mesmo período. Metodologia: Biópsias endometriais foram obtidas de \n27 pacientes divididas em dois grupo, endometriose e contre infértil. Sangue de cada \npacientes foi coletado para dosagem sérica de prog esterona. Parte de cada amostra foi \nenviada para avaliação histológica para validação do período menstral.O restante de \ncada biopsia foi utilizada para extração de DNA. O DNA oi extraído com KIT e \n\n \n63 \n  \nposterior a isso foi submetido á tecnica de modificação por  bissulfito de sódio. Ao final \ntodas as amostras de DNA modificado foram utilizadas para a tecninca de High Melting \nResolution (HRM). A análise estatística realizada foi o teste exato de Fisher. \nResultados: A isoforma A não apresentou alteração em sua meti lação sugerindo que na \nendometriose não há interferência quanto á metilação na expressão da isoforma PR -A. \nA isoforma B apresentou-se parcialmente metilada (50% da região promotora) no grupo \nendometriose, o que pode levar á redução da expressão do receptor  afetando a \nfertilidade das pacientes diagnosticadas com endometriose. \n  \nINTRODUÇÃO \n \nEndometriose e infertilidade \nA endometriose é uma doença ginecológica benigna caracterizada pela presença \ne crescimento de tecido endometrial ectópico funcional que acomet e entre 10 a 15% das \nmulheres no período reprodutivo[1].  \nO tecido ectópico é histologicamente semelhante ao endométrio de mulheres \nsem endometriose e ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose.  Contudo \nestes tecidos podem ser distintos tanto bioquímica quanto funcionalmente, incluindo sua \nreceptividade a esteroides, pot encial proliferativo e invasivo [2]. O tecido \nendometriótico é comumente encontrado na cavidade pélvica, no peritônio pélvico, \novários, septo reto -vaginal, pericárdio, pleura, fígado, rim, bexiga,  cérebro e raramente \nem homens[3]. \nA apresentação clínica da endometriose é caracterizada por  dismenorréia, \ndispareunia (dor durante o ato sexual), dor pélvica não cíclica e infertilidade [4]. \n\n \n64 \n  \nContudo a endometriose pode se mostrar assintomática em 2 a 22% das mulheres. Já a \nocorrência de endometriose em mulheres com dismenorréia é de 40 a 60%[5].  \nA laparoscopia é o método padrão -ouro para o diagnóstico da doença , mas é \nfortemente sugestiva por meio de  exames ginecológicos, ultra-sonografia transvaginal e \na ressonância magnética[6]. \nDe acordo com a American Society for Reproductive Medicine , os implantes \nperitoneais e ovarianos podem ser qualificados em lesões vermelhas, negras e brancas. \nAlém disso, para melhor diagnosticar a evolução da doença, esta mesma entidade \nelaborou um sistema de classificação da endometriose em quatro estádios mundialmente \naceitos: forma mínima (estádio I), leve (II), moderada (III) e severa (IV). Esta análise se \nbaseia em um sistema de escores unificados nos quatro estádios, na avaliação percentual \ne volume das lesões. Contudo, este método de classificação, que é feito de acordo com a \nobservação de cada patologista, pouco pode predizer a chance de gravidez após \nterapia[7]. \nAlgumas teorias tentam explicar as causas da endometriose.  A mais aceita delas \nfoi  proposta em 1927 por Sampson, é a teoria da implan tação metastática, que procura \nexplicar a endometriose através do refluxo menstrual via tuba uterina para dentro da \ncavidade abdominal, onde algumas células conseguem se implantar. Esta é a teoria mais \naceita devido ao fato d o fluxo menstrual retrógrado oc orrer em 90% das mulheres [10], \nda presença de células epiteliais endometria is viáveis no fluido peritoneal [11] e da \nassociação entre fluxo menstrual obstruído e endometriose[12]. \nEmbora a teoria de Sampson seja a  mais aceita, somente o refluxo tubário não \nbasta para que a endometriose se estabeleça, pois 90% das mulheres possuem o refluxo \nmenstrual e somente 10 a15% desenvolvem a doença. \n\n \n65 \n  \n A infertilidade está associada à endometriose e ocorre em 30 a 50 % das \nmulheres com esta desordem [21], contudo esta associação não est á completamente \nelucidada[22]. Estudos corroboram a diminuição da fecundidade em portadoras de \nendometriose[23]. Entretanto os mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese, \nprincipalmente nos casos de endometrios e mínima e leve, nas quais não se observa \nalteração mecânica do trato reprodutivo, ainda não foram esclarecidos[21]. \nAlguns autores sugerem a ocorrência de meno res taxas de fertilização, implantação e \ngestação em pacientes portadoras de endometriose [24, 25] . Este fato poderia ser \ndecorrente do comprometimento da qualidade oocitária e, con sequentemente, \nembrionária e/ou de defeitos endometriais ou ainda da interação entre o endométrio e o \nembrião[26-28]. Evidências sugerem que defeitos funcionais do endométrio possam \ncontribuir com a diminuída fecundidade apresentada por pacientes com esta doença[29].  \nEstudos moleculares sobre a falha de implantação emb rionária  em pacientes \ncom endometriose sugerem a ocorrência de alterações na expressão e tradução de genes \ndo endométrio eutópico envolvidos no processo de implantação [30]. Os receptores de \nprogesterona, fatores de transcrição, enzimas envolvidas no metabolismo de esteroides, \nentre outros, são genes com expressão aberrante na endometriose durante o período \nfavorável à implantação (janela de implantação) [31]. Entretanto, não há estudos com \ncasuísticas e metodologias adequadas que nos permitam o completo entendimento dos \nmecanismos envolvidos na redução da fecundidade e potencial piora dos resultados dos \nprocedimentos de reprodução assistida  em portadoras de infertilidade r elacionada à \nendometriose. \n \n \n\n \n66 \n  \nReceptividade endometrial e epigenética \nO endométrio humano passa por mudanças histológicas e estruturais ao longo do \nciclo menstrual, que viabilizam a implantação do embrião e o desenvolvimento de uma \ngestação, contudo, o endométrio apenas se torna receptivo 6 -10 dias após o pico de LH \nda fase secretora média. [36, 37].  \nDurante este período receptivo do ciclo menstrual, ocorre no tecido eutópico do \nendométrio uma maior expressão de diversos fatores de crescimento, citocinas, \nmoléculas de adesão e receptores de hormônios, envolvidos  diretamente no processo de \nimplantação embrionária [37]. Irregularidades no controle da expressão gênica, \nincluindo modificações epigenéticas, podem resultar em expressão aberrante de genes \ne/ou proteínas reguladoras do crescimento e diferenciação e ndometriais. Os receptores \nhormonais para progesterona são susceptíveis à modulação epigenética por possuírem \nem seus promotores regiões passíveis de receberem metilação [32].  \nUma outra teoria tem sido formada sobre a etiologia da endometriose, somando -\nse aos fatos já conhecidos de que a endometriose seja uma doença hormonal com \nanomalias imunológicas, podendo estar relacionada com alterações ambientais e com a \npredisposição genética. Estudos mostram que alguns genes estão desregulados na \nendometriose e qu e essas alterações na expressão gênica estariam relacionadas aos \nmecanismos epigenéticos de controle, como a metilação do DNA [38].  \nEm pacientes com endometriose foi demonstrado que as DNA metil-transferases \n(DNMT) encontram-se superexpressas no epitélio de implantes endometrióticos quando \ncomparados a um grupo controle sadio ou com tecido endometrial eutópico em \nmulheres com endometriose, sendo que neste último teci do somente a DNMT3A está \n\n \n67 \n  \nsuperexpressa. Com base nestes dados acredita -se que a hipermetilação ocorra na \nendometriose[45].  \n \nReceptores de Progesterona \nA progesterona é um hormônio esteroide que atua neutralizando o efeito de \nestimulação do crescimento d o estrógeno pela indução da diferenciação glandular e \nestromal do endométrio. A resistência à progesterona é comumente observada em \npacientes portadoras de endometriose e este fato pode ser atribuído a níveis \nextremamente baixos de receptores deste hormôni o em tecido endometriotico [45], \ncontudo não há estudos que confrontem dados de pacientes inférteis com endometriose \ne a diminuição dos receptores. \nO gene PGR  codifica o receptor de progesterona, é membro da superfamília dos \nreceptores nucleares e necessá rio para a implantação embrionária e subsequentemente \npara a decidualização. Localizado na região cromossômica 11q22 -q23 e com oito exons \n[56], e ste gene possui dois diferentes promotores e sítios de inicio de tradução no \nprimeiro éxon que produz duas isoformas, A e B \nNos humanos existem duas distintas isoformas do receptor de progesterona \ndenominados PR-A e PR-B, ambos codificados por um único gene e diferem entre si \npela isoforma PR-B conter 164 aminoácidos N-terminal.  \nA função do PR-B é ser um ativador transcricional dominante dos promotores \nsensíveis à progesterona, enquanto o PR-A atua como um repressor dominante sobre o \nPR-B e outros receptores de esteroides (estrogênio, andrógeno, receptores \nglucocorticóides e mineralocorticoides).  Portanto a express ão relativa de PR-A/PR-B \ndetermina, em partes, a característica celu lar de responder à progesterona [54]. Embora \n\n \n68 \n  \nsejam expressos pelo mesmo gene, cada uma de suas isoformas possui uma  região \npromotora distinta[52]. \nNo endométrio, o nível de ambas isoformas aumenta progressivamente durante a \nfase proliferativa , pico imediatamente anterior à ovulação e diminui logo após a \novulação, sugerindo que o estradiol estimule os níveis de PR [45].Contudo, a PR -B é \nindetectável e a PR -A é notadamente reduzida em tecidos endometrioticos. A baixa \nrelação PR -A/PR-B tem sido sugerida como um dos possíveis mecanismos de \nresistência à progesterona na endometriose. \nUm estudo demonstrou que o promotor do gene PGR para a isoforma PR-B esta \nhipermetilado em suas ilhas CpG, em tecidos endometrióticos de pacientes com \nendometriose em estágios II a IV. Este fato é concomitante com a redução da expressão \ndo PR-B, sugerindo então uma regulação epigenética na expressão e silenciamento da \nisoforma PR-B [49] \n \nOBJETIVO \nAvaliar o padrão de metilação do receptor de progesterona das isoformas A (PR -\nA) e B (PR -B) do gene ( PGR) em tecido endometrial eutópico de pacientes com \ninfertilidade relacionada à endometriose durante a fase secretora de seu ciclo menstrua l \ncomparado ao tecido endometrial eutópico de mulheres inférteis sem endometriose na \nmesma fase do ciclo. \n \nMETODOLOGIA  \nTrata-se de um estudo caso controle comparativo de pacientes inférteis com \nendometriose comparadas a mulheres controles inférteis sem endometriose.Foram \n\n \n69 \n  \nincluídas pacientes  que preencheram  os critérios de inclus ão preestabelecidos e \nconsentiram em participar do estudo após a assinatura do termo de consentimento livre \ne esclarecido, aplicado na sala de espera do Centro Cirúrgico do Hospit al das Clínicas \nda Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo \n(USP). \nForam avaliadas 23 pacientes, divididas em dois grupos: C ontrole infértil ( 12 \npacientes) e endometriose (11  pacientes).Amostras endometriais de todas as pac ientes \nforam ob tidas com  uso de cureta de Pipel le, após a realização da como parte da \npropedêutica da infertilidade conjugal (controle infértil e infertilidade relacionada à \nendometriose), de acordo com os protocolos assistenciais do Setor de Reprodução \nHumana-DGO-FMRP-USP. \nO estudo foi realizado ju nto ao Laboratório de Ginecologia - Setor de \nReprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP e \nLaboratório de Biologia da Reprodução do Multiusuário – FMRP-USP. \nForam inc luídas para o gr upo controle infértil  mulheres com infertilidade por \nfator masculino e/ou tubário, ciclos menstruais regulares, submetidas à laparoscopia \ndiagnóstica, excluindo a presença de endometriose, doença inflamatória pélvica e outras \nanormalidades pélvicas, e idade entre 18 e 45 anos. \nNo grupo endometriose,  mulheres com infertilidade relacionada à endometriose  \nsem outros fatores de infertilidade, diagnosticada com qualquer estágio da doença \ndurante a videolaparoscopia diagnóstica, segundo os critérios definidos pel a American \nSociety for Reproductive Medicine  (1997), que classifica a doença em quatro estágios:  \nmínima (estádio I), leve (estádio II), moderada (estádio III) e grave (estádio IV); ciclos \nmenstruais regulares e idade entre 18 e 45 anos.  \n\n \n70 \n  \nForam critérios de exclusão Obesidade, definida pelo  índice de massa corporal \n(IMC) maior ou igual a 30 Kg/m²; presença de doenças sistêmicas tais como: D iabetes \nmellitus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, lupus eritematoso sistêmico e \noutras doenças reumatol ógicas; infecção pelo vírus HIV ou qualquer infecção ativa; \ntabagismo, alcoolismo ou drogadição; uso de medicações hormonais e de \nantiinflamatórios hormonais e não -hormonais nos três meses anteriores à inclusão no  \nestudo. \n \nColeta e processamento do material: \nForam revisados os prontuários das pacientes que buscaram os serviços de \nreprodução humana do Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto onde foram selecionadas \nas pacientes que previamente foram submetidas à videolaparoscopia diagnóstica a \nmenos de 2 anos  ou laqueadura tubaria, que atenderam aos critérios de inclusão e \nexclusão e possuíam ciclos menstruais normais (intervalos de 24 a 32 dias ± 3 dias; 2 a \n7 dias de duração e fluxo de até 80 mL por ciclo) . A biopsia endometrial foi realizada \nambulatoriamente por médico experiente em data agendada conforme o ciclo individual \nde cada paciente coincidindo com a fase secretora de seus ciclos menstruais (do 15º ao \n26º dia do ciclo).Para a confirmação de que a biópsia endometrial foi realizada no  \nperíodo secretor, todas as amostras foram submetidas à análise histológica clássica com \ncoloração hematoxilina -eosina ( HE) e a determinação da fase se cretora do ciclo \nmenstrual foi adequada de acordo com o resultado da datação endometrial, segundo os \ncritérios de Noyes (No yes et al.,1975), realizada por um patologista, considerado o \nintervalo de 28 dias como o de um ciclo menstrual ideal. Imediatamente após a coleta, \nas amostras de endométrio foram armazenadas a -80Cº imersas em PBS. \n\n \n71 \n  \nExtração do DNA e Eletroforese: \nA extração de DNA foi realizada utilizando o QIAamp DNA Mini Kit  (Qiagen, \n51304). Pedaços de ate 25mg de cada amostra de endométrio foram cortados e \nacrescidos de proteinase K e seu buffer, posteriormente colocados em banho -maria a \n56ºC até que o tecido estivesse totalmente digerido. O material foi transferido para \ncoluna e centrifugado, com isso o DNA se aderiu à membrana da mesma. Sucessivas \nlavagens foram feitas com as soluções apresentadas pelo kit para purificação do DNA \nextraído e ao final foi realizada a elu ição do material genômico aderido à membrana \ncom água aquecida a 56ºC . O DNA extraído foi mantido congelado a -20ºC. O DNA \nextraído foi então avaliado pela técnica de eletroforese em gel de agarose a 2% para \navaliar sua integridade. \n \nModificação por Bissulfito de Sódio: \n A seguinte etapa foi a modificação do material genomico pela tecninca do \nbissulfito de sódio. Esta modificado permite a conversão in vitro  das citosinas não \nmetiladas presentes na molécula de DNA em uracilas  para assim ser possível a análise \ndo padrão de metilação pela presença das citosinas metiladas que permaneceram no \nDNA após a modificaçã o. Para tanto foi utilizado o  EpiTec Bissulfite Kit  (Qiagen, \nHilden Germany) . C onforme especificações do fabricante 1,5 µg de DNA de c ada \namostra foram utilizados para a modificação, acrescidos de bissulfite mix  e protect \nbuffer, oferecidos pelo fabricante, em tubos para PCR. A mistura foi levada ao \ntermociclador segundo especificações do kit onde se da a modificação do DNA. Ao \ntermino da ciclagem o material presente nos tubos foi levado para colunas onde o DNA, \nagora já modificado, se prende à membrana presente na coluna e através de sucessivas \n\n \n72 \n  \ncentrifugações e lavagens, com buffers oferecidos pelo kit purificando o DNA. A \neluição do mat erial aderido á membrana foi realizada finalmente com o buffer de \neluição fornecido pelo fabricante. O DNA modificado foi estocado á -20º Cº. \n \nHigh Resolution Melting (HRM): \nApós a modificação por bissulfito, foi empregada  a técnica de High Resolution \nMelting (HRM) onde a princípio o DNA passa por  amplificação através de PCR Real \nTime. Nesta amplificação, as uracilas presentes na molécula de DNA modificado são \ncopiadas nos novos fragmentos como timina, portanto onde inicialmente no DNA \ngenômico encontrávamo s uma citosina, base nitrogenada pirimídica, passamos a \nencontrar uma timina, base nitrogenada purica.  \n Logo em seguida este produto de PCR recém sintetizado passa por um aumento \nsucessivo e gradual de temperatura até  95 ºC para se observar o ponto de dissociação da \ndupla fita dos fragmentos. A temperatura em que ocorre essa dissociação é chamada de \nponto de melting e através dela podemos estimar o grau de metilação do DNA.  A \nporcentagem de metilação é estimada na temperatura de dissociação pois, quanto maior \no número de timinas , mais fácil se dará sua dissociação pois se tratando de uma base \npúrica realiza somente 2 ligações de hidrogênio no pareamento com a base da fita \nhomologa de DNA. Ou seja quanto mais timinas encontramos no fragmento de DNA, \nmais ba ixo seu ponto de dissociação. Em contrapartida, quanto mais citosinas, mais \ntarde se dará sua dissociação, já que esta sendo uma base pirimídica realiza 3 ligações \nde hidrogênio, o que torna a fita de DNA mais estável em relação a uma fita rica em \ntiminas e pobre em citosinas [57].  \n\n \n73 \n  \nPara esta técnica foram utilizados 2,5 µl de DNA modificado pelo tratamento de \nbissulfito de sódio de cada uma das amostra, 10 µl de MeltDoctor (Applied Biosystems) \ne 1 µl de cada oligonucleotideos iniciadores (Primers). Os Primers aqui utilizados foram \nbaseados nos já descritos por Wu et al.[49] que se anelam nas regiões em que se \nencontram os promotores das isoformas . Junto às amostras, na mesma placa, foi \nacrescentada uma curva de referência com controles já conhecidos por  estarem 0%, \n20%, 50%, 80% e 100% metilados, pertencentes ao kit  PCR control DNA Set \n(Quiagen). A placa contendo todas as amostras e a curva de referência foi levada ao \ntermociclador 9500 FAST onde ocorre a amplificação do DNA modificado e a leitura \ndo seu ponto de melting. \n \nAnalise dos Resultados Obtidos por HRM e Analise estatística \nOs dados obtidos pelo HRM foram lidos pelo programa HRM Software que nos \nmostra a porcentagem de metilação encontrada em cada amostra. Para comparação das \nporcentagens de meti lação das isoformas PR -A e PR -B dos grupos amostrais foi \nrealizado o teste exato de Fisher \n \nDosagem sérica de progesterona: \nNo momento de cada coleta de endométrio, foi também coletado sangue de cada \numa das pacientes para dosagem sérica do nível de progesterona, afim de se confirmar a \novulação, confirmando assim que as coletas foram realizadas na fase secretora do ciclo \nmenstrual (progesterona ≥3 ng/ml). A dosagem foi realizada por quimiluminescência \ncom o kit IMMULITE 2000 (Siemens). \n \n\n \n74 \n  \nRESULTADOS  \n \n   Após a extração do DNA e validação de sua integridade em eletroforese, a \nmodificação por bissulfito de sódio foi realizada como descrito na metodologia e em \nseguida foi realizada a técnica HRM ( High Resolution Melting ) onde foi avaliada, em \nrelação a uma curva padrão, a porcentagem de metilação das isoformas A e B de cada \namostra. O observado no HRM foi submetido á analise estatística através do teste exato \nde Fisher e esta disposto na Tabela 1 \n \nTabela 1 . Teste exato d e Fisher para avaliação estatística da comparação das \nporcentagens aproximadas de metilação da isoforma PR -B entre pacientes inférteis com \ne sem endometriose \n% aproximada de Metilação  \n(PR-B) Controle Infértil      Endometriose Total \n0 - 20% 7 2 9 \n77,8% 20,0%   \n50% 2 7 9 \n22,2% 70,0%   \n80% 0 1 1 \n0,0% 10,0%   \nTotal 9 10 19 \nValor p 0,04   \n \nA analise estatística nos permite verificar uma diferença significativa (p <  0,05) \nentre os grupos. Confrontando os dados observamos que no grupo Controle Infértil a \nprevalência de pacientes com porcentagem entre 0 -20% de metilação é de 77,8% \ncomparando-se com o grupo Endometriose, enquanto que no grupo Endometriose a \n\n \n75 \n  \nprevalência de porcentagem de metilação de 50% é de 70% em relação ao grupo \nControle Infértil. \n \nDISCUSSÃO \n \nComo visto anteriormente a baixa contagem de receptores de progesterona pode \nser o elo de ligação entre infertilidade e endometriose e para tanto nos propomos a \nestudar o perfil epigenético dos promotores do gene que sintetizam tais receptores \n(isoformas PR-A e PR-B), visando a metilação deste gene. \nA isoforma PR -A do gene PGR atua como modulador transcrição da isoforma \nPR-B além de outros hormônios esteroides [54 ]. Em nosso grupo de estudo o gene que \nexpressa esta proteína não mostrou sinais de metilação em seu promotor, sugerindo não \nhaver alterações na sua expressão quando empregada a técnica de HRM. No estudo de  \nWu, Y., et al.[49] foi realizada a técnica de Me thilation Specific PCR (MSP), que \nanalisa a metilação do DNA através de uma PCR sensível a metilação, em células \nepiteliais de focos endometrióticos. Neste estudo a isoforma PR -A também não mostrou \nsinais de metilação revelando possivelmente que  na endometriose não há interferência \nquanto á metilação na expressão da isoforma PR-A.  \nA isoforma PR-B, ativador transcricional dominante dos promotores sensíveis à \nprogesterona, contudo mostrou -se parcialmente metilada nas pacientes inférteis com \nendometriose com 70% do grupo com 50% de metilação no promotor gene. No grupo \ncontrole infértil a metilação apresentou -se em 0 -20% do promotor do gene em 77,8% \ndas pacientes contidas neste grupo. Já é sabido que a metilação do promotor leva á \ndepressão da expressão ou até ao  silênciamento total do gene[59]. Como o grupo \n\n \n76 \n  \ncontrole é constituído por pacientes inférteis sem endometriose podemos sugerir que o \naumento da metilação pode ser atribuído á presença da endometriose. O estudo de  Wu, \nY., et al.[49] utilizou a técnica MSP também para avaliar a metilação da isoforma PR -B \nnas mesmas amostras de células epiteliais de focos endometrióticos. Foi encontrado que \na isoforma apresentava bandas de DNA metiladas e não metiladas sugerindo fortemente \nque a região promotora da PR -B tem uma tendência á estar parcialmente metilada na \nendometriose, resultado confirmado através de sequenciamento e que vai de encontro \ncom o que observamos em nosso estudo.  \nO trabalho de Da Broi, M.G., et al [60] avaliou ultraestruturalmente o \nendométrio eut ópico de pacientes inférteis com e sem endometriose mínima/leve \ndurante a janela de implantação no mesmo grupo de pacientes aqui analisado. O foco \ndeste estudo foi avaliar a presença e o desenvolvimento de pinopodes, estruturas \nepiteliais responsáveis pela  implantação[61]. O desenvolvimento destas estruturas esta \nassociado à concentração de progesterona e a seus receptores[61]. \n Foi constatado neste estudo o predomínio de pinopodes regredindo e menor \nporcentagem de pinopodes desenvolvidos e em desenvolvimen to em pacientes inférteis \ncom endometriose comparadas a um grupo controle infértil porém sem endometriose. \nIsto sugere uma assincronia na expressão destas estruturas em pacientes inférteis com \nendometriose e consequente interferência na implantação e ferti lidade desta \npacientes[60].  \nUma vez que o desenvolvimento dos pinopodes esta vinculado à atuação da \nprogesterona através de seus receptores, podemos observar um paralelo interessante \nentre o aumento da metilação  da  isoforma PR -B, receptor dominante na atuação da \n\n \n77 \n  \nprogestetona no interior da célula [54], e o declínio da presença e desenvolvimento de \npinopodes no endométrio eutópico de pacientes inférteis com endometriose[60]. \nA alteração no desenvolvimento de pino podes num grupo com amostras \nidênticas ao abordado neste estudo corrobora a idéia de que a metilação parcial do \npromotor da isoforma PR -B foi suficiente para interferir em sua expressão, acarretando \nem uma resposta que afetou diretamente a implantação embr ionária (alterações dos \npinopodes) e consequentemente a fertilidade da paciente.  \nPara conclusões mais precisas, futuros estudos sobre a expressão do gene PGR, em \nespecial da isoforma PR -B, em pacientes inférteis com endometriose seria importante. \nContudo os dados aqui mostrados nos permitem sugerir que há uma importante relação \nentre a metilação da região promotora da isoforma PR -B em pacientes inférteis com \nendometriose e a fertilidade destas pacientes levando a crer que a endometriose possa \nmesmo ser uma  doença causada por fatores epigenéticos e que a metilação parcial na \nregião promotora do gene PGR isoforma PR -B foi suficiente para causar alterações na \nexpressão de sua proteína. \n \nCONCLUSÃO \n \nConcluímos que o promotor do gene que expressa o receptor de pr ogesterona \n(isoforma PR -B) encontra -se parcialmente metilado em pacientes inférteis com \nendometriose. A metilação parcial deste promotor foi suficiente para causar alterações \nna expressão deste gene que influenciaram diretamente á resposta das células à \nprogesterona e consequentemente impactando a implantação embrionária e a fertilidade \ndestas pacientes.","source_license":"CC0","license_restricted":false}