Papel de células com função reguladora da resposta imune na endometriose.

Jank  CC.  Role  of  cells  with  regulatory  function  of  the  immune  system  in  endometriosis.  [Masters thesis (Immunology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de  São Paulo; 2014.  Endometriosis (EDT) is a gynecological disease characterized by the presence of endometrial  cells  out  of  the  uterine  cavity.  Its  origin  is  unknown,  although  it  is  thought  that  EDT  is  a  multifactorial disease. Functional alterations in immune cells in patients with EDT have been  described.  In  this  study,  we  postulated  that  alterations  in  the  frequencies  of  regulatory  T  cells  (Treg),  natural  killer  cells  (NK),  myeloid‐derived  suppressor  cells  (MDSC)  and  dendritic  cells  (DC)  in  the  peritoneum  could  justify  the  reduced  capacity  of  the  immune  system  to  react  to  these  ectopic  endometrial  cells,  allowing  them  to  invade  distant  tissues.  Our  aim  was to quantify Treg, NK, MDSC and DC populations in the peritoneal fluid (PF) and peripheral  blood  (PB)  in  women  with  endometriosis  (EDT,  n=19)  and  control  (CTRL,  n=8),  in  order  to  associate  these  cellular  population  to  the  development  of  the  disease.  Pro  and  anti‐ inflammatory cytokine levels were also assessed. The results indicate higher frequencies of  Treg, MDSC and DC in the PB and an apparent reduction in the frequency of these cells in the  PF of patients with EDT, compared to CTRL. In the PF, the CD11b+ DC population is increased,  and there seems to be a tendency to reduction of the CD11b‐ portion of DC in these patients.  The  cytokine  analysis  indicated  a  reduction  in  the  concentration  of  IL‐12  in  PB  of  patients  with EDT. No differences were found comparing the results of NK cell populations and the  other cytokines evaluated between EDT and CTRL groups. The results indicate an increase in  the  frequency  of  regulatory  cell  populations  in  PB  samples  from  EDT  patients;  however,  these results are not reflected in PF samples.

Endometriosis. Immune response. Regulatory T cells. Natural killer cells. Myeloid‐ derived suppressor cells. Dendritic cells.      LISTA DE FIGURAS    Figura 1 ‐ Estratégia de análise de células T reguladoras (Treg)............................................... 39   Figura 2 ‐ Frequência de células T CD4+ ativadas em amostras de sangue e fluido peritoneal  (FP) de pacientes com endometriose e controles .................................................................. 41  Figura 3 ‐  Frequência de células T CD4+CD25high em amostras de sangue e fluido peritoneal  (FP) de pacientes com endometriose e controles .................................................................. 42  Figura  4 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles ................................................ 43  Figura  5 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles ................................................ 44  Figura 6 ‐ Razão entre a frequência de células T reguladoras (Treg) em amostras de sangue e a  frequência  dessas  em  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose (EDT, n=19), divididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12 )..............................44  Figura 7 ‐ Intensidade de fluorescência média (MFI) do fator de transcrição Foxp3 em células  Treg  de  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  e  controles ................................................................................................................................ 45  Figura 8 ‐ Estratégia de análise de populações de células natural killer (NK)..........................46  Figura  9 ‐   Frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+  em  amostras  de  sangue  (A)  e  fluido  peritoneal  (B)  de  pacientes  com  endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................................................... 48   Figura  10 ‐   Comparação  da  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐  (A),  CD56brightCD16+ (B) ou CD56lowCD16+ (C) entre amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de  pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) .......................................49  Figura  11 ‐   Frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+ positivas para os marcadores CD57 e CD161 em amostras de sangue (A e B) e  fluido  peritoneal  (C  e  D)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)......................................................................................................................................... 50  Figura 12 ‐ Comparação da frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐  (A e B),  CD56brightCD16+ (C e D) e CD56lowCD16+  (E e F) positivas para os marcadores CD57 e CD161  entre  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19) e controles (CTRL, n=8) ................................................................................................ 51  Figura 13 – Estratégia de análise de células supressoras mieloides (MDSC) ......................... 53      Figura  14 ‐   Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e  CD11b+CD33+CD34+   (B)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com  endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................................................... 54  Figura  15 ‐   Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  e  CD11b+CD33+CD34+  em amostras de sangue (A e B) e fluido peritoneal (C e D) de pacientes  com  endometriose  subagrupados  em  estágio  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12)  e  controles  (CTRL,  n=8)......................................................................................................................................... 55  Figura  16 ‐   Comparação  da  frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+ (A) e CD11b+CD33+CD34+ (B) entre amostras de sangue e fluido peritoneal (FP)  de pacientes com endometriose (EDT, n=19), divididas em estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), e  controles (CTRL, n=8) ............................................................................................................. 56  Figura 17 ‐ Estratégia de análise para avaliação de células dendríticas (DC) ........................ 57  Figura 18 ‐ Frequência de células dendríticas (DC) em amostras de sangue e fluido peritoneal  (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas em estágios I/II (n=7) e III/IV  (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) .................................................................... 59  Figura 19 ‐ Frequência de células dendríticas CD33+ (mDC) em amostras de sangue e fluido  peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas em estágios I/II  (n=7) e III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) ................................................ 60  Figura 20 ‐ Distribuição de células CD11b+ e CD11b‐ em células dendríticas CD33+ do sangue e  fluido peritoneal (FP) das pacientes incluídas nesse estudo .................................................. 61  Figura 21 ‐ Frequência de células dendríticas (DC) CD33+ CD11b+ e CD11b‐ em amostras de  sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas  em estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) ...................... 62  Figura  22 ‐   Concentração  de  IL‐6,  TGF‐b  e  IL‐12  no  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e  III/IV,  e  controles  (CTRL)...................................................................................................................................... 65  Figura  23 ‐   Comparação  entre  a  concentração  de  TGF‐β  (A)  e  IL‐12  (B)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT),  subagrupadas em estágios I/II e III/IV .................................................................................... 66  Figura A1 ‐ Frequência de células CD45+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP)  (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 88  Figura  A2  –  Comparação  entre  a  frequência  de  células  CD45+  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)......................................................................................................................................... 89        Figura A3 ‐ Frequência de células CD3+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP)  (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 89  Figura A4 ‐ Comparação entre a frequência de células CD3+ em amostras de sangue e fluido  peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=18/19) e controles (CTRL, n=7)......89  Figura A5 ‐ Frequência de células CD4+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP)  (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 90  Figura A6 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em amostras de sangue e fluido  peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) .......... 90  Figura A7 ‐ Frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue (A) e fluido peritoneal  (FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ...................... 90  Figura A8 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)......................................................................................................................................... 91  Figura A9 ‐ Frequência de populações de células Natural killer (NK) em amostras de sangue e  fluido peritoneal (FP) de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19),  subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ................................................................... 93  Figura A10 ‐ Frequência de populações de células Natural killer (NK) positivas para CD57 em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ....................... 94  Figura  A11 ‐   Frequência  de  populações  de  células  Natural  killer  (NK)  positivas  para  CD161  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ....................... 95  Figura  A12  –  Razão  entre  a  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐  (A),  CD56brightCD16+  (B)  e  CD56lowCD16+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e  frequência  de  células  no  sangue de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em  estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) .............................................................................................. 97  Figura A13 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD57+ (A),  CD56brightCD16+ CD57+ (B) e CD56lowCD16+ CD57+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de  células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ................................................................... 98  Figura  A14 ‐   Razão  entre  a  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐CD161+  (A),  CD56brightCD16+  CD161+  (B)  e  CD56lowCD16+  CD161+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e  frequência  de  células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ............................................... 99      LISTA DE TABELAS    Tabela  1  – Painel  de  anticorpos  utilizados  para  caracterização  das  populações  celulares  de  interesse Treg, NK e MDSC e DC .............................................................................................. 34  Tabela  2 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  linfócitos  estudadas  no  sangue de pacientes com endometriose e controles ............................................................. 40  Tabela  3 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  linfócitos  estudadas  no  fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles ............................................. 40  Tabela  4 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no  sangue de pacientes com endometriose e controles ............................................................. 47  Tabela  5 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no  fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles ............................................. 47  Tabela  6 ‐   Frequências  de  células  supressoras  mieloides  no  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes com endometriose e controles .............................................................................. 54  Tabela 7 ‐ Comparação da frequência de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de  pacientes com endometriose e controles .............................................................................. 58  Tabela  8 ‐   Avaliação  de  citocinas  no  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com  endometriose, divididas em estágios I/II e III/IV, e controles ................................................ 63  Tabela  A1  –  Características  clínicas  das  pacientes  com  endometriose  incluídas  no  estudo..................................................................................................................................... 86  Tabela A2 – Local das lesões nas pacientes com endometriose incluídas nesse estudo........ 87  Tabela A3 ‐ Frequências de populações de linfócitos estudadas no sangue de pacientes com  endometriose estágios I/II e III/IV .......................................................................................... 88  Tabela  A4 ‐   Frequência  de  populações  de  linfócitos  estudadas  no  fluido  peritoneal  de  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  e  III/IV......................................................................................................................................... 88  Tabela  A5 ‐   Comparação  entre  a  razão  de  células  Treg  encontradas  no  FP  pela  frequência  destas no sangue de pacientes com endometriose e controles..............................................91      Tabela  A6  –  Razão  entre  a  frequência  de  linfócitos  T  reguladores  em  amostras  de  FP  pela  frequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV .........91  Tabela  A7  ‐  Frequências  de  populações  de  células  NK  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose I/II e III/IV ........................................................................................................ 92  Tabela A8 ‐ Frequências de populações de células NK no fluido peritoneal de pacientes com  endometriose I/II e III/IV ........................................................................................................ 92  Tabela  A9 ‐   Comparação  entre  a  razão  de  células  NK  encontradas  no  FP  pela  frequência  destas no sangue de pacientes com endometriose e controles ............................................ 96  Tabela A10 ‐ Razão entre a frequência de populações de células NK em amostras de FP pela  frequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV......... 96  Tabela A11 ‐  Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de  pacientes com endometriose I/II e III/IV ................................................................................ 99  Tabela A12 ‐  Frequências de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes  com endometriose estágios I/II e III/IV ................................................................................ 100                                LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS    Ang‐2 – angiopoietina 2  APC – aloficocianina  APC – célula apresentadora de antígeno  APC‐H7 ‐ aloficocianina H7  ARG1 – arginase 1  ASRM – Sociedade Americana para Medicina Reprodutiva  BD – Becton Dickison  CA‐125 – antígeno associado ao câncer 125  CAAE – certificado de apresentação para apreciação ética  CAPPesq ‐ Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa   CBA – cytometric bead array  CCR7 – receptor de quimiocina do tipo C‐C  CD – cluster of differentiation  ‐ agrupamento de diferenciação  CTLA‐4 – antígeno 4 de linfócito T citotóxico  CTRL – controle  DC‐ célula dendrítica  dNK – natural killer decidual  DP – desvio padrão  EDT – endometriose  ELISA – ensaio imunossorvente ligado à enzima  FACS – citometria de fluxo  FITC ‐ isotiocianato de fluoresceína  FMUSP – Faculdade de Medicina da USP  Foxp3 ‐ forkhead box factor p3  FP – fluido peritoneal  G‐CSF – fator estimulador de colônia de granulócitos  HLA‐DR – antígeno leucocitário humano  HRP – horseradish peroxidase  IFN‐γ – interferon gamma  IL – interleucina  iNOS – óxido nítrico sintase induzido      IQR – intervalo interquartil  LB – linfócito B  LC – célula de Langerhans  LT – linfócito T  mDC – célula dendrítica mieloide  MDSC – célula supressora mieloide  MFI – intensidade de fluorescência média  µg/mL – microgramas por mililitro  MMP – metaloproteinase de matriz  mRNA – ácido ribonucleico mensageiro  N ‐ número  NK – natural killer  NKT – natural killer T  NO – óxido nítrico  PBS – tampão fosfato‐salina  pDC – célula dendrítica plasmocitoide  PE – ficoeritrina  PE –Cy7 ‐ ficoeritrina conjugado com cianina 7  PE‐CF594 ‐ ficoeritrina conjugada com CF594  PerCP‐ Cy 5.5 ‐ peridinina de clorofila combinada com cianina  pg/mL – picogramas por mililitro  PlGF – fator de crescimento plaquetário  ROS – espécie reativa de oxigênio  RT‐PCR – PCR em tempo real  TGF‐β – Fator transformador de crescimento β  Th – linfócito T auxiliar  TMB – tetrametilbenzidina  TNF‐α – fator de necrose tumoral α  Tr1 – célula reguladora do tipo 1  Treg – célula T reguladora  uNK – natural killer uterina  USTV – ultrassonografia transvaginal  VEGF – fator de crescimento vascular endotelial       SUMÁRIO    1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 22  1.1 Patogênese ...................................................................................................................... 22  1.2 Endometriose e o Sistema Imunológico ......................................................................... 23  1.2.1 Células T reguladoras ................................................................................................ 25  1.2.2 Células Natural Killer (NK) ......................................................................................... 26  1.2.3 Células supressoras mieloides ................................................................................... 28  1.2.4 Células denríticas ....................................................................................................... 29  2 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 31   3 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 32  3.1  Pacientes ......................................................................................................................... 32  3.2  Obtenção e separação de células ................................................................................... 33  3.3  Análise dos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo.......................... 33  3.4  Marcação intracelular de Foxp3 de células T reguladoras............................................. 34 3.5  Quantificação de citocinas no plasma e fluido peritoneal............................................. 35  3.6  Análises comparativas entre os grupos.......................................................................... 36 4 RESULTAOS ......................................................................................................................... 37 4.1  Dados das Pacientes ....................................................................................................... 37  4.2  Avaliação de células T reguladoras ................................................................................ 38  4.2.1 Análise descritiva das células CD45+, CD3+ e CD4+ no sangue e FP ............................. 40  4.2.2 Análise da população de Treg dentre os LT totais e LT auxiliares no sangue e FP ....... 42  4.3  Células Natural Killer ...................................................................................................... 45  4.4  Células Supressoras Mieloides (MDSC) .......................................................................... 52 4.5  Análise do perfil de células dendríticas .......................................................................... 56  4.6  Quantificação de citocinas pró e anti‐inflamatórias ...................................................... 63 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 67  6 CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 79   REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 80  APÊNDICE – Tabelas e figuras suplementares ....................................................................... 86     22    1 INTRODUÇÃO    O termo endometriose (EDT) refere‐se à doença crônica estabelecida pela presença  de células endometriais fora da cavidade uterina. As células endometriais podem implantar‐ se em órgãos peritoneais (caracterizando a forma superficial/peritoneal da doença), ovários  (definida  como  endometriose  ovariana)  ou  infiltrarem  a  área  retrocervical,  parede  vaginal  posterior,  ureter,  região  retossigmóide  e  bexiga  (endometriose  profunda)  (1,  2).  É  uma  doença ginecológica benigna, estrógeno‐dependente, associada à dor pélvica e infertilidade.  Diferentes  sintomas  são  indicativos  de  endometriose,  porém  nenhum  deles  é  exclusivo  da  doença.  Os  pacientes  podem  ser  assintomáticos  (2,6%)  ou  apresentarem  sintomas  como  dismenorréia  (62,2%),  dor  pélvica  crônica  (13,3%),  infertilidade  (14%)  e  dispareunia  profunda  (2,1%),  além  de  outros  relacionados  à  localização  das  lesões,  como  disfunções  urinárias  e  intestinais,  incluindo  dor  e  sangramento  (3).  Outros  sinais  clínicos  sugestivos de endometriose incluem sensibilidade pélvica, útero retrovertido fixo, frouxidão  dos ligamentos uterossacrais, espessamento dos ligamentos e presença de nódulos (4).  Além disso, existem diferentes estágios de endometriose, e não há correlação desses  com a gravidade dos sintomas ou a evolução da doença; assim, acredita‐se que existem tipos  diferentes  de  endometriose,  cada  qual  com  sua  etiologia  e  consequências  variadas.  Ainda,  há diversidade de quadros clínicos em indivíduos com mesmo estágio de doença.  Diversas análises são utilizadas para auxiliar no diagnóstico de endometriose, entre elas  ultrassonografia  transvaginal  (USTV),  ressonância  magnética,  testes  sanguíneos  para  quantificação  de  CA‐125,  laparoscopia  e  exames  histológicos  das  lesões  (4).  Porém,  a  laparoscopia  ou  laparotomia  é  considerada  “padrão  ouro”  para  o  diagnóstico  de  endometriose, onde os possíveis focos de endometriose são retirados e avaliados por exame  anátomo‐patológico (4).     1.1 Patogênese    Dentre as teorias propostas para a etiopatologia da endometriose, a mais explorada é a  da menstruação retrógrada. De acordo com essa hipótese, durante a menstruação, células  endometriais regridem pelas tubas uterinas e implantam‐se na cavidade peritoneal e ovários  (5).  Curiosamente,  a  menstruação  retrógrada é  extremamente  frequente  em  mulheres  em  23    idade  reprodutiva  (cerca  de  90%)  (6),  entretanto,  a  doença  estabelece‐se  em  apenas  10%  destas (7). Conclui‐se, portanto, que além da ocorrência de menstruação retrógrada, outros  fatores  que  permitem  a  adesão  e  proliferação  dessas  células  fora  da  cavidade  uterina  contribuam  para  a  patogênese  da  endometriose.  Entre  tais  fatores,  alterações  genéticas,  ambientais,  hormonais  e  do  sistema  imune  podem  estar  relacionados  com  o  desenvolvimento da doença (8).  É  sugerido  que  o  efluente  menstrual  contenha  fatores  que  induzem  alterações  no  mesotélio  peritoneal,  e  consequentemente,  proporcionam  sítios  de  aderência  para  as  células  endometriais  (9)  (10).  Após  a  adesão,  há  proliferação  e  invasão  das  células  no  peritônio, o que causa lesões e adesões entre os órgãos, resultando em distorção anatômica,  e, consequentemente, dor. Uma das principais consequências relacionadas à endometriose  é a infertilidade, decorrente principalmente de efeitos tóxicos da reação inflamatória (11).    1.2   Endometriose e o Sistema Imunológico     A  endometriose  apresenta‐se  como  uma  reação  inflamatória,  com  infiltração  de  neutrófilos,  eosinófilos,  mastócitos,  macrófagos,  células  dendríticas,  células  natural  killer  (NK), linfócitos T CD4+ e CD8+ (12‐14).  Na  endometriose,  são  observados  diversos  níveis  de  comprometimento  das  moléculas  que participam do sistema imunológico, variando de alterações quantitativas e qualitativas  das  células,  citocinas  e  quimiocinas  no  microambiente  intraperitoneal.  Entre  essas  alterações,  as  células  NK  e  linfócitos  T  CD8+,  que  exercem  papel  fundamental  na  imunovigilância  e  clearance  de  células,  apresentam  sua  capacidade  citotóxica  bastante  reduzida  em  pacientes  com  endometriose  comparativamente  às  mulheres  sem  a  doença  (14).  Adicionalmente, níveis aumentados de TGF‐β foram observados no fluido peritoneal de  mulheres com endometriose e estão associados, ao menos parcialmente, à angiogênese (9).  Essa citocina pode também contribuir para redução da atividade citotóxica de células NK e a  diminuição  da  retirada  de  células  endometriais  ectópicas,  além  da  geração  de  células  T  reguladoras (Treg).   Quanto às células dendríticas (dendritic cells ‐ DC), observa‐se decréscimo acentuado no  número  de  DC  maduras  durante  a  fase  proliferativa  do  ciclo  menstrual,  e  acréscimo  24    significativo  de  DC  imaturas  durante  todas  as  fases  do  ciclo  (13)  no  endométrio  eutópico.  Além  disso,  há  aumento  da  freqüência  de  DC  imaturas  no  peritônio,  que  é  indicativo  de  recrutamento de células imaturas pelo endométrio ectópico ou pelo ambiente (13), e pode  resultar na menor frequência de apresentação de antígenos a linfócitos T ou na indução de  tolerância  imunológica  nessas  células;  isso  poderia  justificar  parcialmente  a  baixa  resposta  das células do sistema imune contra células endometriais ectópicas.   Ainda, foram observados números aumentados de macrófagos no endométrio eutópico  em  pacientes  com  endometriose  durante  todas  as  fases  do  ciclo  menstrual  (15),  fato  que  colabora  com  a  natureza  inflamatória  da  endometriose.  Apesar  do  número  elevado  de  macrófagos  nessas  pacientes,  estes  apresentam‐se  com  capacidade  fagocítica  reduzida,  prejudicando a remoção de células endometriais ectópicas (16).  Na literatura, os resultados obtidos quanto ao padrão predominante de resposta imune  em  mulheres  com  endometriose  são  bastante  contraditórios.  Foram  observados  níveis  elevados de IL‐4 e IL‐10 na circulação sistêmica (17) e no fluido peritoneal de mulheres com  endometriose  (18).  Apesar  de  altas  concentrações  de  IFN‐γ  também  terem  sido  relatas  no  fluido peritoneal (18), sugere‐se prevalência de resposta Th2 nessas  pacientes. Entretanto,  quando  aspectos  clínicos  da  doença  são  relacionados  com  a  produção  de  citocinas,  há  associação  da  resposta  Th1  com  a  forma  infiltrativa  da  doença,  refletida  pela  maior  produção de TNF‐α e IL‐2 em mulheres com sintomas relacionados à endometriose profunda  (19).  Citocinas  inflamatórias  produzidas  por  células  endometriais  podem  contribuir  para  a  adesão  destas  ao  peritônio.  Macrófagos  peritoneais  estimulam  a  produção  de  metaloproteinases de matriz (MMP), a partir da síntese de IL‐1α, IL‐1β e IL‐8 e proporcionam  a invasão de células ectópicas na matriz extracelular  (20). IL‐8 e TNF‐α em combinação com  TGF‐β  e  fator  de  crescimento  vascular  endotelial  (VEGF)  produzidos  por  macrófagos  estimulam a angiogênese, permitindo que as células endometriais proliferem e permaneçam  em local ectópico (21).  Apesar  de  diversas  alterações  funcionais  em  células  do  sistema  imune  terem  sido  relatadas  em  pacientes  com  endometriose,  não  está  claro  ainda  quais  fatores  são  responsáveis  por  essas  alterações.  O  quadro  geral  da  imunidade  na  endometriose  ainda  expõe diversas lacunas, e devido à heterogeneidade da doença, resultados contrastantes são  relatados na literatura.  25    Esse estudo enfoca no estudo das populações de linfócitos T reguladores, células natural  killer,  células  supressoras  mieloides  e  células  dendríticas,  a  fim  de  avaliar  o  papel  dessas  populações celulares no desenvolvimento da endometriose.    1.2.1 Células T reguladoras    As  células  T  reguladoras  (Treg)  (22)  são  essenciais  para  a  indução  de  tolerância  de  linfócitos autorreativos a antígenos próprios e manutenção da homeostase (23). Compõem 2  a 5% das células CD4+ em humanos e são desenvolvidas continuamente como uma linhagem  T comum no timo, constituindo uma subpopulação distinta de outras células T ou timócito  (24).  São  descritos  dois  subgrupos  de  células  T  reguladoras  (Treg)  que  diferem  entre  si  em  termos de especificidade e de mecanismo de ação: i) as Treg naturais que se desenvolvem e  emergem do timo com função reguladora, e atuam na periferia regulando possíveis reações  autoimunes  potencialmente  patológicas,  e  ii)  as  Treg  induzidas  (Treg  do  tipo  1 ‐  Tr1,  Th3  e  outras)  que  se  desenvolvem  como  consequência  da  ativação  de  linfócitos  T  maduros,  em  condições específicas de exposição antigênica e sob influência de diferentes citocinas.   Os mecanismos reguladores das células Treg incluem a supressão por contato célula a  célula,  que  envolve  o  receptor  inibitório  CTLA‐4  e  a  secreção  de  TGF‐β1,  levando  à  diminuição da expressão da cadeia α do receptor da IL‐2 nas células T alvo. Sua atividade in  vivo parece estar associada com a presença de citocinas como IL‐4, IL‐10 e TGF‐β (25).  Apesar  da  importância  das  células  T  reguladoras  na  manutenção  da  homeostase  e  prevenção  de  doenças  autoimunes,  a  presença  deste  tipo  celular  em  algumas  condições  pode representar um problema. É sugerido que a presença de Treg em infecções parasitárias  e câncer, esteja relacionada à diminuição da resposta imune protetora (26).  Os  estudos  até  hoje  publicados  sobre  os  mecanismos  imunológicos  associados  ao  aparecimento de endometriose indicam que o microambiente gerado pela implantação das  células  endometriais  gere  uma  diminuição  da  resposta  imune  efetora  (13).  Esta  condição  pode  estar  associada  à  presença  de  células  reguladoras  no  peritônio;  nosso  grupo  de  pesquisa observou aumento da frequência de células CD4+CD25+FoxP3+ no fluido peritoneal  de  pacientes  com  endometriose,  em  comparação  com  mulheres  sem  endometriose  (27),  corroborando  estudos  que  reportaram  recrutamento  de  células  Treg  para  o  endométrio  de  mulheres que desenvolvem endometriose (28).  26    O fator de transcrição Foxp3 (Forkhead box p3) é um fator de transcrição altamente  relacionado  à  células  Treg  e  sua  expressão  está  relacionada  à  função  supressora  dessas  células. A descoberta da relação desse fator com as células Treg, no entanto, só ocorreu em  2003 (29). Antes disso, era comum utilizar a co‐expressão de CD4 e CD25 para caracterização  de uma subpopulação de linfócitos T com potencial ação supressora. O marcador CD25, no  entanto, não é específico de células Treg: ele compreende a cadeia α do receptor de IL‐2, que  é composto ainda pelas cadeias β (CD122) e γ (CD132). A expressão da cadeia α na superfície  da célula é induzida pelo fator de transcrição Foxp3 e garante maior afinidade à IL‐2. Sendo  assim,  células  Treg  possuem  maior  expressão  do  CD25  em  sua  superfície  (CD25high)  do  que  células T convencionais (CD25+) e utilizam isso como mecanismo de supressão da resposta  imune  efetora,  visto  que  na  ausência  de  IL‐2  os  linfócitos  T  ativados  não  proliferam.  Um  linfócito T ativado também tem expressão de CD25 em sua superfície, portanto, há de se ter  cautela  ao  utilizar  a  expressão  de  CD25  como  marcador  de  Treg,  buscando  conciliar  a  alta  expressão  de  CD25  com  outros  marcadores,  como  o  Foxp3.  Vários  grupos  sugerem  que  células Treg possuem alta expressão de CD25 e baixa expressão de CD127, e que o conjunto  desses  marcadores  diferem  as  populações  de  células  Treg  das  T  convencionais.  Essa  ideia  é  reforçada pelo achado de que cerca de 90% das células CD25highCD127low são Foxp3+ (30, 31).  O  fator  de  transcrição  Foxp3  mostra‐se  como  o  marcador  mais  específico  de  células  Treg,  entretanto,  a  expressão  transiente  de  Foxp3  é  comum  em  células  T  convencionais  recentemente  ativadas  (32).  Dessa  forma,  sugerimos  que  o  conjunto  de  marcadores  CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+ seja o mais apropriado para a caracterização fenotípica de  células Treg.    1.2.2 Células Natural Killer (NK)    As  células  Natural  Killer  (NK)  estão  entre  as  principais  células  do  sistema  imune  de  vertebrados. Essas células fornecem respostas rápidas para as células infectadas por vírus e  respondem à formação de tumores, começando a atuar cerca de três dias após a infecção.  Sendo assim, desempenham importante papel na resposta inata podendo distinguir células  infectadas  por  vírus  e  células  neoplásicas  das  células  normais.  As  células  NK  reconhecem  células  infectadas  ou  estressadas  através  de  um  balanço  de  sinais  obtidos  de  receptores  ativadores e inibidores, o que culmina na liberação de grânulos e lise da célula‐alvo. Após o  27    surgimento  do  conceito  de  imunovigilância,  diversos  grupos  tem  dado  atenção  especial  às  células  NK.  Conforme  citado  anteriormente,  as  células  NK  apresentam  sua  capacidade  citotóxica  bastante  reduzida  em  pacientes  com  endometriose  comparativamente  às  mulheres sem a doença (14).  As  células  NK  podem  ser  subdivididas  em  diferentes  populações  baseado  na  expressão diferencial de marcadores clássicos de NK, CD56 e CD16. No sangue, mais de 90%  das células NK são CD56dimCD16+, as chamadas NK convencionais, porém observa‐se também  outras células com fenótipo CD56brightCD16+ e CD56brightCD16‐ (33). As células CD56brightCD16‐  compõem apenas 10% das células NK encontradas no sangue, entretanto em alguns tecidos,  como no útero, compreendem 70% das NK, sendo portanto muitas vezes chamadas de NK  uterinas (uNK) ou NK deciduais (dNK) (34).  Como  as  células  NK  CD56dimCD16+  constituem  a  grande  maioria  de  células  NK  no  sangue,  as  outras  populações  de  células  NK  são  pouco  estudadas.  Sugerimos,  no  entanto,  que estas outras populações de células NK tenham funções importantes no sistema imune.  Dado o acúmulo preferencial de células CD56brightCD16‐  no endométrio, é possível que estas  células tenham funções não apenas na manutenção da gravidez, mas também em diversas  doenças  ginecológicas.  Essa  sugestão  é  baseada  na  observação  de  que  a  frequência  de  células CD56brightCD16‐   encontra‐se aumentada no endométrio de mulheres grávidas e não  grávidas  (35).  No  endométrio  de  mulheres  não  grávidas,  o  número  de  NK  CD56brightCD16‐  varia durante as fases do ciclo menstrual, apresentando‐se em menor frequência no início da  fase  proliferativa;   após  a  ovulação  essas  células  proliferam,  atingindo  um  pico  no  final  da  fase secretora (36).  É sugerido que células CD56bright e células CD56dim apresentem funções imunológicas  distintas;  as  primeiras estão  envolvidas  com  a regulação  da  resposta  imune  pela produção  de  citocinas  pró‐inflamatórias  e  as  últimas,  pela  função  citotóxica.  Isso  é  sustentado  por  experimentos  que  mostram  maior  capacidade  de  produção  de  TNF‐α  e  IFN‐γ  por  células  CD56bright  associada  à  diminuição  de  grânulos  citolíticos,  como  perforina  A  e  granzimas,  quando comparadas com células CD56dim (37).  As células NK CD56brightCD16‐  são células produtoras de várias citocinas e fatores de  crescimento  que  modulam  a  resposta  imune,  entre  eles  TNF‐α,  IL‐10,  G‐CSF,  IL‐1  e  IFN‐γ  (38). Expressam, também, altos níveis de mRNA de fatores angiogênicos (VEGF, Ang‐2, PlGF)  na fase secretória do ciclo menstrual (35).  28    Pouco se sabe a respeito das diferentes populações de células NK nas pacientes com  endometriose. Visto a importante função de células NK na imunovigilância e alta capacidade  de  produção  de  citocinas  reguladoras,  mostra‐se  importante  a  investigação  dessas  populações em pacientes com endometriose.    1.2.3 Células supressoras mieloides    As  células  supressoras  mieloides  (myeloid‐derived  suppressor  cells ‐   MDSC)  compreendem um grupo heterogêneo de células definidas por sua origem mieloide, estado  imaturo e capacidade supressora. O principal mecanismo de supressão das MDSC acredita‐ se  ser  por  produção  de  arginase  e  espécies  reativas  de  oxigênio  e  nitrogênio,  os  quais  impedem  a  proliferação  de  linfócitos  T  (39).  As  MDSC  são  amplamente  descritas  em  pacientes com câncer (40).  Em resposta a estímulo antigênico excessivo, a medula óssea é estimulada a produzir  células  mieloides  imaturas,  que,  em  indivíduos  sadios,  rapidamente  se  diferenciam  em  granulócitos  maduros,  macrófagos  ou  DC.  Em  contrapartida,  em  condições  inflamatórias  patológicas  (como  doenças  infecciosas,  câncer,  trauma  e  doenças  autoimunes)  ocorre  um  bloqueio  na  sua  diferenciação  em  células  mieloides  maduras,  o  que  resulta  na  regulação  positiva  de  fatores  imunossupressores  como  arginase‐1  (ARG1)  e  óxido‐nítrico  sintase  induzido  (iNOS),  com  consequente  aumento  na  produção  de  óxido  nítrico  (NO)  e  espécies  reativas de oxigênio (ROS); este processo culmina na expansão dessas células em seu estado  imaturo, as chamadas MDSC (41).   Por  tratar‐se  de  um  grupo  heterogêneo  de  células,  os  marcadores  fenotípicos  descritos  na  literatura  para  caracterizar  as  MDSC  são  bastante  divergentes.  De  um  modo  geral, as MDSC podem ser definidas fenotipicamente por expressarem marcadores comuns a  progenitores  mieloides  (CD33),  ausência  de  marcadores  linhagem‐específicos  e  que  caracterizam células diferenciadas (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56), pela expressão da  molécula de adesão CD11b, além de pouca ou nenhuma apresentação de antígenos (baixa  ou nenhuma expressão de HLA‐DR) (39). Sendo assim, de um modo geral, as MDSCs podem  ser definidas pelo fenótipo Lin1‐HLA‐DR‐CD33+CD11b+, além da avaliação de sua capacidade  supressora.  Ainda,  por  apresentar  fenótipo  variável,  observa‐se  também  tanto  a  presença  quanto a ausência de expressão de CD15, CD34 e outros marcadores.  29    Sua  importância,  em  termos  de  função  no  sistema  imune,  vem  ganhando  destaque  mais recentemente. Foi demonstrado que MDSC suprimem a atividade citotóxica de células  NK  in  vitro  e  in  vivo,  por  inibição  de  perforinas  e  de  modo  dependente  de  contato  celular  (42).  Até  o  momento,  não  existem  na  literatura  estudos  avaliando  a  presença  de  células  supressoras mieloides em amostras de sangue, fluido peritoneal ou lesões endometrióticas  de pacientes com endometriose.     1.2.4 Células Dendríticas (DC)    As  células  dendríticas  (DC)  constituem  uma  ponte  entre  a  imunidade  inata  e  a  imunidade adaptativa; isso porque são consideradas as principais células apresentadoras de  antígenos  (APC).  As  DC  possuem  longas  projeções,  alta  capacidade  fagocítica  e  estão  situadas  nas  principais  portas  de  entrada  de  microrganismos  (pele  e  mucosas  do  trato  respiratório e gastrointestinal); por tal razão, são consideradas sentinelas imunológicas. As  DC captam antígenos protéicos com suas longas projeções e os apresentam aos linfócitos T  (LT)  nos  linfonodos.  Isso  ocorre,  pois  assim  que  fagocita  um  antígeno,  as  DC  passam  a  expressar o CCR7, receptor para quimiocinas produzidas nos linfonodos, o que permite que  elas  migrem  para  o  linfonodo  mais  próximo  e  entrem  em  contato  com  os  linfócitos.  No  processo de migração até o linfonodo regional, as DC amadurecem e adquirem a expressão  de  moléculas  co‐estimuladoras  (como  CD80  e  CD86),  tornando‐se  aptas  a  apresentarem  o  antígeno aos LT. Na ausência desses sinais co‐estimuladores, o LT não é capaz de ser ativado,  tornando‐se  muitas  vezes  anérgico.  A  apresentação  de  antígenos  com  poucos  sinais  estimuladores também pode fazer com que o LT se torne uma célula Treg (43, 44).  As  DC  são  células  com  alta  expressão  de  moléculas  MHC  de  classe  II,  por  isso  são  comumente caracterizadas pela expressão de HLA‐DR. O fenótipo geral para seleção dessas  células por citometria de fluxo consiste na expressão de HLA‐DR e ausência de expressão de  marcadores linhagem específicos (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 e CD56).   A subdivisão de DC em humanos nas diversas subpopulações como as descritas em  camundongos  ainda  não  está  clara  na  literatura.  De  um  modo  geral,  as  DC  do  sangue  são  classificadas como DC mieloides (mDC), Lin‐HLA‐DR+CD11c+, e plasmocitoides (pDC), Lin‐HLA‐ DR+CD11c‐,  devido  a  diferenças  na  origem,  expressão  de  marcadores  e  funções  dessas  30    células. As mDC são a maioria das DC no sangue e tecidos linfoides e não linfoides e podem  ser subdivididas, ainda, em diversas subpopulações (45). Um método simples de distinguir a  população  mieloide  da  plasmocitóide  é  pela  utilização  do  CD33,  marcador  encontrado  apenas em populações de origem mieloide (46‐48).   A redução na frequência de DC ou na capacidade dessas de apresentar antígenos a LT  pode  ser  um  fator  contribuinte  para  o  desenvolvimento  da  endometriose.  Nesse  estudo,  tentaremos  estabelecer  uma  relação  entre  a  frequência  de  DC  e  o  desenvolvimento  da  endometriose.  Três fenótipos foram escolhidos para a caracterização de DC nesse estudo: i) Lin‐HLA‐ DR+, fenótipo mais geral de DC;   ii) Lin‐HLA‐DR+CD33+, fenótipo que seleciona DC mieloides  (mDC); e iii) Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b+  e Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b‐,   fenótipo que investiga a  expressão de CD11b nas mDC, porém pouco utilizado.  O  marcador  Lin1‐  (BD  Biosciences),  aqui  utilizado  na  caracterização  de  MDSC  e  DC  consiste  em  um  conjunto  de  marcadores  linhagem‐específicos  (CD3,  CD14,  CD16,  CD19,  CD20  e  CD56),  todos  conjugados  a  um  mesmo  fluorocromo.  Ao  utilizar  esse  marcador,  podemos  excluir  populações  de  LT,  LB,  monócitos  e  células  NK  utilizando  apenas  um  marcador (ou seja, ocupando apenas um canal de leitura no citômetro).   Baseado nos diversos relatos do desequilíbrio quantitativo e funcional de células imunes  no  microambiente endometrial  como  fator  contribuinte  da progressão  da  endometriose,  a  hipótese  aqui  aventada  é  de  que  o  ambiente  peritoneal  de  pacientes  susceptíveis  esteja  imunorregulado  e  proporcione  a  implantação  e/ou  desenvolvimento  da  endometriose;  nesse  sentido,  essa  imunorregulação  pode  ser  parcialmente  sustentada  por  populações  celulares  de  Treg,  NK,  MDSC  e  DC.  Nesse  estudo,  foi  investigada  a  avaliação  da  frequência  dessas  populações  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com  endometriose,  além  da  análise  do  microambiente  peritoneal  no  qual  essas  células  se  encontram, a partir da produção de citocinas.   31      2 OBJETIVOS    O  principal  objetivo  deste  trabalho  foi  caracterizar  e  quantificar  as  células  T  reguladoras  (Treg),  populações  de  células  natural  killer  (NK),  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  e  células  dendríticas  (DC)  no  sangue  e  no  fluido  peritoneal  de  mulheres  com  endometriose, na tentativa de esclarecer seus papéis na patogênese dessa doença.   Além disso, foi avaliado o microambiente peritoneal no qual essas células se encontram  a partir da produção de citocinas IL‐2, IL‐4, IL‐ 6, IL‐10, IL‐12(p70), IL‐17A, TNF‐α, IFN‐γ e TGF‐ β1, em amostras de sangue e fluido peritoneal das pacientes com endometriose.    32      3 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS    3.1       Pacientes    As  pacientes  incluídas  neste  estudo  estão  em  acompanhamento  no  Setor  de  Endometriose da Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da  Universidade de São Paulo (FMUSP) ou no Hospital Sírio‐Libanês. A seleção das pacientes foi  realizada  sob  a  responsabilidade  dos  médicos  Maurício  Simões  Abrão  e  Sérgio  Podgaec.  Foram  incluídas  no  estudo  mulheres  entre  26  e  51  anos,  com  endometriose  profunda  confirmada  por  análise  histopatológica,  ausência  de  doença  autoimune,  inflamatória  ou  condição  neoplásica  (confirmado  por  exames  médicos  ou  testes  laboratoriais  quando  necessário) e sem uso de terapia hormonal por três meses prévios à cirurgia laparoscópica.   No  grupo  controle,  foram  incluídas  mulheres  entre  32  e  46  anos  submetidas  à  videolaparoscopia  principalmente  para  realização  de  laqueadura,  mas  também  para  realização  de  outros  procedimentos  ginecológicos  (histerectomia,  ooforectomia  ou  miomectomia) ou para diagnóstico de endometriose. Todas as pacientes incluídas no grupo  controle  preencheram  os  mesmos  critérios  de  inclusão  e  exclusão  das  pacientes  com  endometriose, e tiveram diagnóstico de endometriose descartado durante a laparoscopia.  Foram  coletadas  amostras  do  sangue  e  do  fluido  peritoneal  (FP)  de  cada  paciente  com  endometriose  após  o  preenchimento  do  consentimento  informativo  por  escrito.  Na  admissão,  as  pacientes  com  endometriose  responderam  a  um  questionário  padrão  onde  constam  os  antecedentes  pessoais,  enfocando  principalmente  os  sintomas  comuns  relacionados  à  endometriose  e  a  doenças  ginecológicas,  além  de  informações  sobre  antecedentes familiares.   Com  base  nos  achados  cirúrgicos,  as  pacientes  foram  classificadas  em  estágios  de  gravidade  da  doença  de  acordo  com  as  diretrizes  da  Sociedade  Americana  para  Medicina  Reprodutiva (ASRM) (49) onde o estágio I corresponde à endometriose mínima, o estágio II  relativo à endometriose leve, o III, à endometriose moderada e o IV, à endometriose grave.  Nesse  estudo,  as  pacientes  foram  divididas  em  grupos:  a)  pacientes  com  endometriose  estágios  I  e  II  (I/II)  (n=7),  representando  as  mulheres  com  doença  mínima  e  leve;  e  b)  pacientes  com  endometriose  estágios  III  e  IV  (III/IV)  (n=12),  grupo  que  compreende  as  mulheres com doença moderada e grave.  33    O  projeto  foi  aprovado  pelo  Comitê  de  Ética  em  Pesquisa  do  Hospital  Israelita  Albert  Einstein  nº  11/1711  (CAAE  –  0205.0.028.015‐11),  pelo  Comitê  de  Ética  em  Pesquisa  do  Instituto  de  Ciências  Biomédicas  da  Universidade  de  São  Paulo  (registrado  na  Plataforma  Brasil sob CAAE 01461012.2.1001.5467) e pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de  Pesquisa do Hospital das Clínicas da FMUSP (CAPPesq nº 0386/11).    3.2 Obtenção e separação das células     As  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  foram  centrifugadas  a  500  x  g  por  cinco  minutos  em  temperatura  ambiente;  o  sobrenadante  individual  foi  congelado  a ‐ 80ºC  em  alíquotas para a análise de citocinas. O pellet celular do fluido peritoneal foi ressuspendido  em  1  mL  de  tampão  de  lise  1X  (BD  FACS  Lysing  Solution)  enquanto  que  para  o  sangue  foi  utilizada  a  proporção  3:1  (v:v).  As  amostras  foram  incubadas  no  escuro  por  dez  minutos  a  37°C ou até que a lise total das hemácias fosse observada. Em paralelo, parte das amostras  foi reservada para avaliação da viabilidade, com azul de Trypan, e contagem em câmara de  Neubauer  e  contador  automático  Countess  (Invitrogen);  para  essa  análise,  as  hemácias  foram  lisadas,  conforme  descritas  acima,  utilizando‐se  tampão  de  lise  de  hemácias  sem  paraformaldeído (BD Pharm Lyse Lysing Solution).  A  seguir,  as  amostras  foram  centrifugadas  a  500  x  g  por  cinco  minutos  a  temperatura  ambiente,  e  ao  pellet  celular  foi  adicionado  500  µL  de  Tampão  de  FACS  (tampão  fosfato‐ salina (PBS) suplementado com 1% albumina sérica humana e 0,1% azida). As células foram  novamente  centrifugadas  (500  x  g,  cinco  minutos,  temperatura  ambiente),  ressuspendidas  em PBS e utilizadas para as análises descritas a seguir.     3.3 Análise dos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo    As células obtidas do sangue e do fluido peritoneal de mulheres com endometriose e  controles foram marcadas com três diferentes painéis de anticorpos, como mostra a Tabela  1. Para cada um dos painéis, 1 x 106 células por poço foram transferidas para placas fundo V  para  marcação  com  anticorpos  contra  os  marcadores  de  superfície  celular.  Às  células,  foi  adicionada  a  solução  contendo  os  anticorpos  dos  respectivos  painéis  (Tabela  1).  Foram  utilizados, para tanto, anticorpos monoclonais anti‐CD45, CD33, CD34, CD11b, HLA‐DR, Lin1,  34    CD15,  CD3,  CD4,  CD25,  CD127,  LAP,  CD16,  CD56,  CD57,  CD161  e  CD14  conjugados  com  fluorocromo  isotiocianato  de  fluoresceína  [FITC],  ficoeritrina  [PE],  aloficocianina  [APC],  ficoeritrina conjugado com cianina 7 [PE‐Cy7], peridinina de clorofila combinada com cianina  [PerCP‐Cy5.5],  aloficocianina  H7  [APC‐H7]  ou  ficoeritrina  conjugada  com  CF594  [PE‐CF594]  na  concentração  0,5‐1,0 μ g/106  células,  por  30  minutos  em  temperatura  ambiente,  e  ao  abrigo da luz. Após incubação, as amostras foram lavadas, ressuspendidas 300 µL de tampão  de FACS e analisadas em citômetro de fluxo BD LSRFortessa (BD Biosciences). As células do  painel Treg foram então marcadas com o FoxP3, como descrito a seguir.    Tabela  1 ‐   Painel  de  anticorpos  utilizados  para  caracterização  das  populações  celulares  de  interesse Treg, NK e MDSC e DC.  Populações  celulares      Fluorescências  FITC  PE  APC  PE‐Cy7 PE‐CF594  APC‐H7  PerCP‐Cy5.5 Treg  anticorpo  ‐  FoxP3  CD25  CD3  CD4  CD45  CD127  clone  259D/C7  M‐A251  SK7  RPA‐T4  2D1  HIL‐7R‐M21 NK  anticorpo  CD3  CD56  CD161  CD16  CD57  CD45  CD14  clone  HIT3a  B159  DX12  B73.1  NK‐1  2D1  M5E2  MDSC e DC  anticorpo  Lin1  CD11b  CD34  CD33  CD15  CD45  HLA‐DR  clone  NCAM16.2,  MφP9,  L27,  SJ25C1,  3G8, SK7  ICRF44  8G12  P67.6  W6D3  2D1  L243  Treg = linfócito T regulador; NK = célula natural killer; MDSC = célula supressora mieloide; DC = célula dendrítica.    3.4 Marcação intracelular de Foxp3 de células T reguladoras    Para a marcação de FoxP3, e após  as marcações de superfície celular, as células foram  fixadas  e  permeabilizadas  com  tampões  apropriados  para  marcação  intracelular  de  FoxP3  (Human FoxP3 Staining Kit, BD), conforme instrução do fabricante. Resumidamente, foram  adicionados  200 μ L  de  Tampão  A  para  fixar  as  células,  e  incubados  por  dez  minutos,  a  temperatura ambiente, ao abrigo da luz, e então, as células foram centrifugadas por cinco  minutos a 500 x g. Em seguida, as células foram permeabilizadas com 200 μL de Tampão C  (Tampão A + Tampão B – 1:200 v/v) e incubadas por 30 minutos, à temperatura ambiente e  protegidas da luz. Após nova centrifugação (cinco minutos, 500 x g), o anticorpo Foxp3 foi  adicionado ao pellet (0,5‐1,0 μg/106 células) e as células foram novamente incubadas por 30  35    minutos, no escuro. Após incubação, as amostras foram lavadas com 200 μL de tampão de  FACS  e  analisadas  em  citômetro  de  fluxo  BD  LSRFortessa  (BD  Biosciences).  Um  mínimo  de  500 000 eventos foram adquiridos para cada amostra.    3.5 Quantificação de citocinas no plasma e fluido peritoneal    Amostras  de  plasma  e  do  sobrenadante  obtidas  do  fluido  peritoneal  de  mulheres  com  endometriose  foram  aliquotadas  e  armazenadas  a  –80ºC  para  quantificação  de  IL‐ 12(p70)  (BD  OptEIA),  TGF‐β1  (BD  OptEIA)  e  IL‐17A  (BioLegend)  pelo  método  de  ELISA  sandwich.  Resumidamente,  placas  de  96  poços  com  alta  propriedade  de  ligação  (Nunc  Maxisorp)  foram  sensibilizadas  com  100 μ L  de  anticorpo  de  captura  diluído  em  tampão  carbonato de sódio 0,1 M, pH 9,5 numa concentração de 1:250 para IL‐12(p70) e TGF‐ β1 e  1:200 para a IL‐17A. As placas foram mantidas a 4°C por 16‐18h. Após o tempo de incubação,  as  placas  foram  lavadas  três  vezes  com  tampão  de  lavagem  (PBS  e  0,05%  Tween  20)  e  o  bloqueio  de  áreas  não  cobertas  pelo  anticorpo  foi  feito  com  200 μ L  por  poço  de  Tampão  Diluente (PBS com 10% soro fetal bovino) por uma hora em temperatura ambiente. Após a  adição das amostras e padrões recombinantes nas concentrações indicadas pelos kits (100  μL /poço), as placas foram incubadas por duas horas em temperatura ambiente. As placas  foram  então  lavadas  três  vezes  com  tampão  de  lavagem  e  100 μ L  /poço  do  anticorpo  de  detecção (1:250 para o TGF‐ β1 e 1:500 para a IL‐12 (p70) conjugado com estreptavidina e  peroxidase  HRP  (horseradish  peroxidase)  (1:250)  foi  adicionado  por  mais  uma  hora  a  temperatura  ambiente;  para  a  quantificação  de  IL‐17A,  foi  adicionado  100 μ L  /poço  do  anticorpo secundário (1:200) e incubado por 1 hora, e posterior incubação de 100 μL /poço  de avidina‐HRP (1:1000) por 30 minutos. As placas foram novamente lavadas três vezes com  tampão  de  lavagem  e  foi  adicionado  a  cada  poço  100 μ L  de  uma  solução  contendo  o  substrato H2O2 3% (v/v) e tetrametilbenzidina (TMB). Após o aparecimento de cor, a reação  foi interrompida com adição de 50 μL de ácido sulfúrico 2N. A leitura da densidade óptica foi  feita  a  450nm  utilizando‐se  o  equipamento  ELISA  DTX  880  Multimode  Detector  (Beckman  Coulter) e os resultados foram apresentados em pg/mL.   O kit de CBA (cytometric bead array) Th1/Th2 (BD Biosciences) foi utilizado para avaliar  as citocinas IL‐2, IL‐4, IL‐6, IL‐10, TNF‐α e IFN‐γ em alíquotas de plasma e sobrenadante de  fluido  peritoneal  congeladas.  Brevemente,  as  amostras/curvas  foram  incubadas  com  as  36    beads de captura e reagente de detecção por 3 horas, em temperatura ambiente e ao abrigo  da  luz.  Após  o  período  de  incubação,  a  placa  foi  lavada  e  as  amostras  foram  lidas  em  citômetro  de  fluxo  BD  LSRFortessa  (BD  Biosciences).  A  análise  dos  resultados  foi  realizada  utilizando o software FCAP Array versão 3.0. Os resultados foram apresentados em pg/mL.    3.6 Análises comparativas entre os grupos    Testes de normalidade (Kolmogorov‐Smirnov, D’Agostino e Pearson omnibus ou Shapiro‐ Wilk),  além  da  análise  de  coeficientes  de  assimetria  e  achatamento  (skewness  e  kurtosis)  foram  utilizados  para  avaliar  a  distribuição  das  populações  estudadas.  Para  comparações  entre  grupos,  foi  utilizado  o  teste  t  de  Student  não  pareado,  onde  a  distribuição  foi  considerada  normal,  ou  teste  U  de  Mann‐Whitney,  para  dados  com  distribuição  não  considerada normal. Para comparações entre amostras de sangue e fluido peritoneal dentro  de  um  mesmo  grupo,  foi  utilizado  o  teste  t  pareado  ou  teste  de  Wilcoxon,  para  amostras  com  distribuição  normal  e  não  normal,  respectivamente.  As  possíveis  interações  entre  as  amostras  foram  verificadas  pela  análise  de  variância  simples  (ANOVA  unilateral/Kruskal‐ Wallis). O nível de significância estabelecido foi de p<0,05, para todos os testes. As análises  estatísticas foram realizadas pelo software GraphPad Prism 5.0. Os dados são apresentados  como mediana e intervalo interquartil.     37    4 RESULTADOS    4.1        Dados das Pacientes      Foram  incluídas  nesse  estudo  21  pacientes  com  endometriose,  cujo  diagnóstico  foi  confirmado  por  análises  histopatológicas  das  lesões  endometrióticas  após  videolaparoscopia.  Doze  indivíduos  controle,  com  ausência  de  endometriose  comprovada  durante  a  videolaparoscopia,  foram  inicialmente  incluídos;  desses,  dois  indivíduos  foram  excluídos do estudo devido ao uso de contraceptivo oral e duas pacientes com endometriose  foram  excluídas  devido  à  presença  de  neoplasia.  Outros  dois  indivíduos  do  grupo  controle  foram excluídos por número insuficiente de células no fluido peritoneal para marcação por  citometria  de  fluxo.  Ao  todo,  19  pacientes  com  endometriose  (grupo  EDT)  e  8  controles  (grupo  CTRL)  preencheram  os  critérios  de  inclusão  do  estudo.  Os  dados  clínicos  das  pacientes com endometriose incluídas nesse estudo estão resumidos no apêndice (Tabelas  A1 e A2).  A principal queixa relatada pelas pacientes foi dismenorréia, presente em 16 das 19  pacientes com endometriose aqui estudadas. Dispareunia de profundidade foi reportada em  11/19  das  pacientes  e  dor  pélvica  acíclica  em  9/19  pacientes.  Alterações  intestinais  e  urinárias  cíclicas  também  foram  reportadas  em  8/19  e  2/19  pacientes,  respectivamente.  Oito  pacientes  com  endometriose  apresentaram‐se  inférteis.  Segundo  informações  laboratoriais, sete pacientes estavam na fase proliferativa do ciclo menstrual, enquanto nove  estavam  na  fase  secretora.  Ressalta‐se  que  nenhuma  paciente  com  endometriose  incluída  nesse  estudo  fazia  uso  de  terapia  hormonal  por  pelo  menos  três  meses  prévios  à  laparoscopia.  As  lesões  de  endometriose  foram  predominantes  nas  regiões  retrocervical  (13/19),  peritoneal  (14/19)  e  ovários  (11/19).  Também  foram  observadas  lesões  na  porção  retossigmóide  (8/19),  nas  tubas  uterinas  (7/19),  fundo  de  saco  de  Douglas  (5/19),  ureter  (3/19), vagina (3/19), reto (4/19), bexiga (2/19) e no apêndice (2/19) (apêndice – Tabela A2).  Todas as lesões foram confirmadas histologicamente para a presença de estroma e glândula  endometrial.       38        4.2 Avaliação de células T reguladoras     A caracterização das células Treg foi realizada pela análise dos marcadores CD3, CD4, CD25  e CD127 expressos na superfície celular, além da análise intracelular do fator de transcrição  FoxP3. A estratégia utilizada para essa caracterização leva em consideração populações de  células na região dos linfócitos, identificadas por tamanho e granulosidade, e marcação com  o  marcador  de  células  hematopoiéticas  CD45,  seguidas  da  expressão  da  molécula  de  CD3,  que  está  presente  apenas  em  receptores  de  linfócitos  T.  Em  seguida,  a  expressão  do  co‐ receptor de linfócitos T auxiliares, CD4, e a alta expressão da cadeia α do receptor de IL‐2, a  molécula de CD25, foram observadas dentre os linfócitos T CD3+. A seguir, a baixa expressão  da cadeia α do receptor da IL‐7, o CD127, foi verificado dentre as células CD3+CD4+CD25high .  Por  fim,  a  presença  de  marcação  intracelular  para  o  fator  de  transcrição  Foxp3  foi  identificada dentre as células CD3+CD4+CD25highCD127low. Essa estratégia foi utilizada para a  caracterização de T reguladoras oriundas do sangue e do fluido peritoneal de pacientes com  endometriose e está ilustrada na Figura 1.   39                                                                            Figura  1‐  Estratégia  de  análise  de  células  T  reguladoras  (Treg).  Inicialmente,  foram  selecionadas  células  na  região  dos  linfócitos,  separadas  por  tamanho, granulosidade  e  expressão  de  CD45+  (A). Os  linfócitos  T  foram  selecionados pela expressão de CD3 (B). Em seguida, foram selecionadas as células T CD4 com alta expressão  de CD25 (CD4+CD25high) (C), e nesta população foram selecionadas apenas as células com baixa expressão de  CD127 (D). Por fim, foi avaliada a expressão de Foxp3 nessa última população (E).                As  Tabelas  2  e  3  resumem  os  principais  resultados  da  comparação  das  diferentes  populações analisadas por essa estratégia de análise nas amostras de sangue e FP, entre os  grupos  EDT  e  CTRL.  Comparações  entre  os  estágios  de  EDT  podem  ser  encontradas  no  apêndice (Tabelas A3 e A4).          A  B  C  D  E  40      Tabela 2 – Comparação entre as frequências das populações de linfócitos estudadas no sangue de  pacientes com endometriose e controles.  Sangue   CTRL  EDT  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p  LT   2,83 ± 3,37  1,72 (0,17 ‐ 5,59)  5,8 ± 7,5  3,98 (0,73 ‐ 7,43)  p=0,32  LT CD4+  1,43 ± 2,09  0,67 (0,11 ‐ 1,43)  3,4 ± 4,9  1,43 (0,41 ‐ 4,2)  p=0,31  CD4+ em CD3  55,3 ± 20,7  62,4 (47,4 ‐ 65,4)  54,2 ± 14  55,5 (48,8 ‐ 65,6)  p=0,87  CD4+CD25+  20,8 ± 13,07  17,6 (16,7 ‐ 18,9)  19,7 ± 17,9  15,2 (7,4 ‐ 22,8)  p=0,88  CD4+CD25high  2,32 ± 1,18  2,11 (1,27 ‐ 3,62)  3,45 ± 4,24  2,14 (1,07 ‐ 3,96)  p=0,81  Treg em CD3  0,51 ± 0,85  0,22 (0,009 ‐ 0,42) 0,85 ± 1,1  0,37 (0,19 ‐ 1,4)  p=0,33  Treg em CD4  0,79 ± 1,29  0,35 (0,08 ‐ 0,68)  1,47 ± 1,56  0,66 (0,49 ‐ 2,24)  p=0,32  Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão,  IQR  =  intervalo  interquartil,  LT  =  linfócito  T,  Treg  =  linfócito  T  regulador.  Valor  de  p  calculado  pelo  teste  t  de  Student não pareado/Mann Whitney, quando apropriado.      Tabela  3 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  linfoides  estudadas  no  fluido  peritoneal de pacientes com endometriose e controles.  Fluido Peritoneal   CTRL  EDT  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p  LT   1,91 ± 2,56  0,74 (0,27 ‐ 2,98)  5,04 ± 8,44  1,46 (0,28 ‐ 6,63)  p=0,31  LT CD4+  0,62 ± 1,12  0,23 (0,07‐0,59)  1,17 ± 1,76  0,46 (0,11 ‐ 1,36  p=0,38  CD4+ em CD3  27,7 ±  10,6  26,5 (16,7 ‐ 37,6)  29,5 ± 10,7  28,4 (24,1 ‐ 34,6)  p=0,70  CD4+CD25+  6,33 ± 4,58  6,2 (1,79 ‐ 11,3)  5,82 ± 3,85  5,08 (3,04 ‐ 8,19)  p=0,76  CD4+CD25high  1,86 ± 1,57  1,42 (0,7 ‐ 2,55)  1,03 ± 0,87  0,96 (0,24 ‐ 1,38)  p=0,10  Treg em CD3  0,12 ± 0,13  0,058 (0,03 ‐ 0,19) 0,07 ± 0,08  0,06 (0,0007 ‐ 0,1)  p=0,20  Treg em CD4  0,44 ± 0,38  0,335 (0,11 ‐ 0,76) 0,19 ± 0,19  0,19 (0,002 ‐ 0,35)  p=0,04  Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão,  IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito, Treg = linfócito T regulador. Valor de p calculado pelo teste t de Student  não pareado/Mann Whitney, quando apropriado.    4.2.1 Análise descritiva das células CD45+, CD3+ e CD4+no sangue e FP:    Não  foram  encontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  células  hematopoiéticas  (CD45+),  linfócitos  T  (CD3+)  e  LT  auxiliares  (CD3+CD4+),  tanto  no  sangue  quanto  no  FP  de  pacientes  com  endometriose  e  controles.  Conforme  esperado,  amostras  de  sangue  apresentaram  maior  frequência  de  todas  as  populações  citadas  do  que  amostras  de  FP,  tanto  no  grupo  de  pacientes  com  endometriose,  quanto  no  grupo  controle  (apêndice  –  Figuras A1‐A8).   A seguir, analisamos a proporção de células T CD4+ que expressavam o marcador de  ativação CD25. Mais uma vez, não foram observadas diferenças entre os grupos analisados  (Figura 2A, B e C). A frequência de LT CD4+  ativados está aumentada no sangue comparado  41    com amostras de FP de pacientes com endometriose (p=0,0066, Figura D) e CTRL (p=0,0179,  Figura  D);  perfil  semelhante  foi  observado  quando  as  pacientes  do  grupo  EDT  foram  subdivididas em estágios de doença (Figura 2D).     CTRL EDT CTRL EDT 0 20 40 60 80 n.s. n.s. Sangue FP % CD4+CD25+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 n.s. n.s. n.s. % CD4+CD25+ CTRL EDT I/II III/IV 0 5 10 15 20 n.s. n.s. n.s. % CD4+CD25+ CTRL EDT I/II III/IV 0 10 20 30 40 40 60 80 ** sangue FP * *n.s. % CD4+CD25+   Figura 2 – Frequência de células T CD4+ ativadas em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes  com endometriose e controles. (A) Comparação da frequência das células entre pacientes com endometriose  (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) no sangue e FP; (B) Frequência de células no sangue de controles (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  Frequência  de  células  no  FP  de  controles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de  sangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01 e n.s.  = não significativa, pelo teste t não‐pareado (A), ANOVA (B e C) e teste t de Student pareado (D).    A  elevada  expressão  do  CD25  na  superfície  de  LT  CD4+  está  altamente  relacionada  com  as  células  Treg.  Nas  amostras  aqui  avaliadas,  não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  células  CD4+CD25high  entre  pacientes  com  endometriose  e  controles  (Figura  3A‐C). Novamente, as amostras de sangue apresentaram maior frequência dessas células do  que  amostras  do  FP  em  pacientes  do  grupo  EDT  (p=0,0138)  (Figura  3D).  Esse  resultado  se  estendeu apenas para pacientes do grupo III/IV (p=0,0049). Os grupos CTRL e I/II mostraram  frequências semelhantes dessas células entre amostras de sangue e FP.   A  B  C  D  42    CTRL EDT CTRL EDT 0 5 10 15 20 25 n.s. n.s. Sangue FP % CD4+CD25high CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 15 20 n.s. n.s. n.s. % CD4 +CD25high CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 6 n.s. n.s. % CD4+CD25high n.s. CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 15 20 sangue PF *n.s. **n.s. % CD4+CD25high   Figura 3 ‐ Frequência de células T CD4+CD25high em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes  com endometriose e controles. (A) Comparação da frequência das células entre pacientes com endometriose  (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) no sangue e FP; (B) Frequência de células no sangue de controles (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  Frequência  de  células  no  FP  de  controles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de  sangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01 e n.s.  = não significativa, pelo teste de Mann Whitney/ t não‐pareado (A), Kruskal – Wallis (B), ANOVA (C) e Wilcoxon/  teste t de Student pareado (D), conforme a distribuição das amostras.    4.2.2 Análise da população de Treg dentre os LT totais e LT auxiliares no sangue e FP    Visto que praticamente 100% das células T CD4+CD25hiCD127low  são positivas para o  fator  de  transcrição  Foxp3,  normatizamos  os  valores  encontrados  de  células  Foxp3+  pela  frequência de células CD3+ e também de CD4+ para encontrarmos o valor mais fidedigno de  células Treg dentre os linfócitos T totais (LT) e dentre os LT auxiliares das amostras analisadas.   Dentre  os  LT,  as  medianas  da  frequência  de  células  Treg  em  amostras  de  sangue  e  fluido peritoneal são semelhantes entre pacientes com endometriose (em todos os estágios)  e controles (Figura 4A‐C). Embora não haja diferença estatística, nota‐se que a mediana de  Treg no sangue do grupo EDT é superior ao grupo CTRL. Para o FP, as frequências são mais  similares (Figura 4A). Em todos os grupos estudados, a frequência de células Treg é maior no  sangue  do  que  no  FP  (Figura  4D).  Vale  ressaltar  que,  ao  se  comparar  a  frequência  dessas  A  B  C  D  43    células no sangue e a frequência destas no FP, significância estatística só foi atingida para o  grupo EDT (p=0,0009), mesmo quando dividido em estágios (I/II – p=0,031; III/IV – p=0,013)  (Figura 4D).    CTRL EDT CTRL EDT 0.0 0.2 0.4 0.6 1 2 3 4 5 Sangue FP n.s. n.s. % Treg em LT CD3+ CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 2.5 5.0 n.s. n.s. % Treg em LT CD3+ n.s. CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 n.s. n.s. % Treg em LT CD3+ n.s. CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 sangue PF *** *n.s. * % Treg em LT CD3+   Figura  4 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  e  controles.  (A)  Comparação  da  frequência  das  células  entre  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)  no  sangue  e  FP;  (B)  Frequência  de  células  no  sangue  de  controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (C) Frequência de células  no  FP  de  controles  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (D)  Comparação  entre  amostras de sangue e FP de cada grupo. As células Treg são mostradas como porcentagem de células dentre os  linfócitos T CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05,   *** p<0,001 e n.s. = não  significativa, pelo teste de Mann Whitney (A), ANOVA (B e C) e Wilcoxon (D).    Ao  analisarmos  a  frequência  das  células  Treg  na  população  de  células  CD4+,  observamos  uma  redução  destas  em  amostras  de  FP  de  pacientes  com  endometriose  quando comparadas aos controles (p=0,0415) (Figura 5A). Como para a análise da frequência  de  Treg  na  população  de  linfócitos  CD3+,  há  tendência  ao  aumento  de  Treg  no  sangue  de  pacientes  do  grupo  EDT,  embora  sem  significância  estatística.  Mais  uma  vez,  o  grupo  EDT  mostrou  maior  frequência  de  Treg  no  sangue  que  no  FP  (p=0,0009),  mesmo  quando  subdividido em estágios I/II e III/IV (p=0,031 e p=0,013, respectivamente) (Figura 5D).  A  B  C  D  44    CTRL EDT CTRL EDT 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 3.5 5.5 7.5 Sangue FP n.s. * % Treg em LT CD4+ CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 6 7 n.s. n.s. % Treg em LT CD4+ n.s. CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 n.s. n.s. n.s. % Treg em LT CD4+ CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.4 0.8 1.2 1.5 4.0 6.5 sangue FP ** *n.s. * % Treg em LT CD4+   Figura  5 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  e  controles.  (A)  Comparação  da  frequência  das  células  entre  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)  no  sangue  e  FP;  (B)  Frequência  de  células  no  sangue  de  controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (C) Frequência de células  no  FP  de  controles  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (D)  Comparação  entre  amostras de sangue e FP de cada grupo. As células Treg são mostradas como porcentagem de células dentre os  linfócitos  T  CD4+.  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  *p<0,05,  **  p<0,01  e  n.s.  =  não  significativa, pelo teste t não pareado (A), ANOVA (B e C) e t de Student pareado (D).    A razão FP:sangue pode ser indicativo de migração de células do sangue para o fluido  peritoneal. Nessas amostras, a razão mostrou‐se diminuída nas pacientes com endometriose  em todos os estágios, comparadas ao controle (Figura 6 e Tabelas A5 e A6 no apêndice).   CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.4 0.8 1.2 10 15 20 * * * Razão FP:sangue CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 8 9 10 ** * * Razão FP:sangue   Figura  6 ‐  Razão  entre  a  frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  a  frequência  dessas  em  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  divididos  em  estáios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12)  e.  As  células  Treg  são  mostradas  como  porcentagem  de  células  dentre as os linfócitos T CD3+ (A) e CD4+ (B). Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05,  ** p<0,01e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney.  A  B  C  D  A  B  45    Quanto à média de intensidade de fluorescência (MFI) do Foxp3, nenhuma diferença  foi encontrada intragrupos e intergrupos (Figura 7).    CTRL EDT CTRL EDT 0 1000 2000 3000 4000 n. s.n. s. Sangue FP MFI Foxp3 CTRL EDT I/II III/IV 0 500 1000 1500 2000 n.s. n.s. n.s. MFI Foxp3 CTRL EDT I/II III/IV 0 1000 2000 3000 4000 n.s. n.s. n.s. MFI Foxp3 CTRL EDT I/II III/IV 0 1000 2000 3000 4000 sangue PF n.s. n.s. n.s. n.s. MFI Foxp3   Figura 7 – Intensidade de fluorescência média (MFI) do fator de transcrição Foxp3 em células Treg de amostras  de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles. (A) Comparação do MFI entre  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)  no  sangue  e  FP;  (B)  MFI  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  MFI  no  FP  de  controles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de  sangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa,  pelo teste t não pareado (A), ANOVA (B e C) e t de Student pareado (D).    4.3       Células Natural Killer     Para  a  caracterização  das  diversas  populações  de  células  NK  aqui  avaliadas,  foram  selecionadas as células na região dos linfócitos, identificadas por tamanho e granulosidade,  seguidas  da  marcação  com  CD45.  Inicialmente,  foi  feita  a  exclusão  de  linfócitos  T,  células  NKT  e  monócitos  selecionando‐se  células  negativas  para  a  expressão  de  CD3  e  CD14.  Em  seguida,  células  CD45+CD3‐CD14‐  foram  investigadas  para  a  expressão  de  CD16  e  CD56.  Foram  analisadas  células  NK  CD56brightCD16‐,  NK  CD56brightCD16+  e  NK  CD56lowCD16+.  Adicionalmente,  a  expressão  de  dois  marcadores  de  maturação/ativação  de  células  NK,  as  A  B  C  D  46    moléculas CD57 e CD161, também foi abordada. A estratégia realizada para a caracterização  das populações de células NK está ilustrada na Figura 8.                                                                  Figura 8 – Estratégia de análise de populações de células natural killer (NK). Inicialmente, foram selecionadas  células  CD45+  (A).  Dentro  das  células  CD45+,  na  região  dos  linfócitos,  foram  excluídas  as  células  T,  NKT  e  monócitos pela seleção de células CD3‐CD14‐ (B). Em seguida, foram selecionadas as populações de células NK  pela expressão de CD16 e CD56 (C). Em cada população de célula NK foi avaliada a expressão de CD57 (D) e  CD161 (E).                As Tabelas 4 e 5 resumem os principais resultados encontrados da comparação das  diferentes populações de células NK analisadas em amostras de sangue e FP dos grupos EDT  e CTRL. Comparações entre os estágios de EDT podem ser encontradas no apêndice (Tabelas  A7 e A8).  C  D  E  A  B  47    Tabela  4 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no  sangue  de  pacientes com endometriose e controles.  Sangue   CTRL  EDT  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p  CD56brightCD16‐  1,4 ± 0,9  1,4 (0,8 ‐ 1,7)  2,2 ± 1,4  2,1 (1 ‐ 3)  p=0,13  CD56brightCD16+  6, 7 ± 13,8   0,88 (0,29 ‐ 7,8)  1,1 ± 1,2  0,8 (0,6 ‐ 1)  p=0,91  CD56lowCD16+  22,7 ± 15,7   27,3 (4,4 ‐ 36,8)  26,1 ± 17,1   19,9 (12,6 ‐ 42,5)  p=0,63  CD56brightCD16‐CD57+  20,6 ± 21,1  17,5 (0,22 ‐ 43,3)  29,5 ± 25,2  30,7 (4,5 ‐ 49,4)  p=0,38  CD56brightCD16+CD57+  19,5 ± 13,6  16,4 (10,6 ‐ 31,8)  47,6 ± 19,07  48 (32,1 ‐ 60)  p=0,0009 CD56lowCD16+CD57+  33,6 ± 23,5   36,1 (8,3 ‐ 52,8)  52,9 ± 20,2  54,5 (43,5 ‐ 68,4)  p=0,03  CD56brightCD16‐CD161+ 49 ± 26,2  48,4 (43,3 ‐ 59,2)  54,8 ± 27,2  54,4 (31,9 ‐ 82,1)  p=0,61  CD56brightCD16+CD161+ 47,2 ± 35,4  56 (10,7 ‐ 74,4)  70,9 ± 25,6  78,4 (51,1 ‐ 94,2)  p=‐0,06  CD56lowCD16+CD161+  43,7 ± 35,3  59,9 (2,4 ‐ 67,2)  64,8 ± 32,6  68,8 (45,7 ‐ 93,8)  p=0,14  Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR  = intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t pareado/Mann Whitney, conforme apropriado.      Tabela  5 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no  fluido  peritoneal de pacientes com endometriose e controles.  Fluido Peritoneal  CTRL  EDT  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p  CD56brightCD16‐  11,4 ± 14,5  4,5 (1,9 ‐ 19,9)  9,9 ± 13,4  4,4 (1,5 ‐ 12,3)  p=0,7982 CD56brightCD16+  0,32 ± 0,27  0,27 (0,08 ‐ 0,56)  0,54 ± 0,93  0,19 (0,09 ‐ 0,5)  p=0,8316 CD56lowCD16+  10,2 ± 6,8   8,8 (6,4 ‐ 11,9)  10,3 ± 10,4   5,3 (2,4 ‐ 15,9)  p=0,9754 CD56brightCD16‐CD57+  18,9 ± 17,5  14,5 (2,5 ‐ 36,5)  24,9 ± 25,4  15,8 (4,4 ‐ 49,9)  p=0,5423 CD56brightCD16+CD57+  25,7 ± 24,6  29,3 (0 ‐ 41,3)  45,9 ± 34,8  50 (13,2 ‐ 77,8)  p=0,1501 CD56lowCD16+CD57+  33,6 ± 21,7  34,8 (17,9 ‐ 48,7)  49 ± 25,6  57,6 (24,2 ‐ 65,9)  p=0,1513 CD56brightCD16‐CD161+ 69,9 ± 8,84  71,7 (62,7 ‐ 74,5)  62,9 ± 28,8  71,4 (42,8 ‐ 85,3)  p=0,2096 CD56brightCD16+CD161+ 55 ± 39,6  56,9 (11,1 ‐ 95,5)  58 ± 40,4  73,4 (0 ‐ 97,2)  p=0,8629 CD56lowCD16+CD161+  57,6 ± 27,7   66,1 (43 ‐ 78)  65,4 ± 31,7  82,4 (36,9 ‐ 88,2)  p=0,5480 Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR  = intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t pareado/Mann Whitney, conforme apropriado.      A  análise  das  populações  de  NK  CD56brightCD16‐,  NK  CD56brightCD16+  e  NK  CD56lowCD16+  não  mostrou  diferenças  entre  os  grupos  de  pacientes  com  endometriose  e  controles nessa coorte de pacientes (Figura 9).   48    CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+ 0 1 2 3 4 5 5 25 45 65 n.s. n.s. n.s. % de células CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+ 0 1 2 3 4 5 5 25 45 65 EDT CTRL n.s. n.s. n.s. % de células   Figura  9 ‐   Frequência  de  células  Natural  Killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+  em  amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL,  n=8). As células NK são mostradas como porcentagem de células dentre as células CD3‐CD14‐. Dados mostrados  como mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado/ teste de  Mann Whitney, quando apropriado.    Quando comparamos a frequência das populações estudadas em amostras de sangue  e FP dentro dos grupos, é possível observar uma maior frequência de células CD56brightCD16‐  no FP que no sangue de controles (p=0,023) e de pacientes com endometriose (p=0,0058),  que  se  mantém   em  pacientes  do  estágio  I/II  (p=0,046).  O  grupo  de  EDT  III/IV  não  atingiu  significância  estatística  para  esse  parâmetro  (p=0,052),  embora  mostrasse,  também,  uma  tendência à maior frequência dessas células no FP do que no sangue (Figura 10A).   As  outras  duas  populações  de  células  NK  estudadas,  células  CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+, entretanto, estão presentes em maior frequência no sangue do que no FP em  todos  os  grupos  analisados.  A  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  mostrou‐se  significantemente  aumentada  apenas  no  sangue  de  pacientes  com  EDT  I/II  (p=0,034)  comparado  ao  FP.  Não  foram  encontradas  diferenças  significativas  quanto  à  frequência  dessas  células  nas  pacientes  dos  grupos  EDT  (p=0,055),  EDT  III/IV  (p=0,4238)  e  CTRL  (p=0,0781)  (Figura  10B).  A  análise  das  células  NK  CD56lowCD16+  mostrou  diferenças  significativas  entre  a  frequência  dessas  células  no  sangue  e  FP  de  todos  os  grupos  (EDT:  p=0,003; EDT I/II: p=0,005; EDT III/IV: p=0,021; e CTRL: p=0,039) (Figura 10C).    A  B  49    CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 10 10 30 50 70 *** * n.s. % CD56brightCD16- CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 10 20 30 40 n.s.n.s.n.s. * % CD56brightCD16+ CTRL EDT I/II III/IV 0 10 20 30 40 50 60 70 FP Sangue **** ** * % CD56low CD16+   Figura 10 – Comparação da frequência de células Natural Killer (NK) CD56brightCD16‐ (A), CD56brightCD16+ (B) ou  CD56lowCD16+  (C)  entre  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  NK  são  mostradas  como  porcentagem  de  células  dentre  as  células  CD3‐CD14‐.  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV (n=12),  endometriose moderada/grave;  *p<0,05,  **  p<0,01,  *** p<0,001  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste t de Student pareado (A e C) ou pelo teste de Mann Whitney (B).    A  análise  da  expressão  do  marcador  CD57  nas  células  NK  estudadas  revelou  diferenças na frequência de células CD57+ entre o grupo de pacientes com endometriose e  controles (Figura 11A e C). A frequência de células NK CD56brightCD16+ que expressam  CD57  mostrou‐se  elevada  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  as  pacientes  do  grupo  CTRL  (p=0,0009),  inclusive  quando  as  pacientes  do  grupo  EDT  foram  subdivididas  em  estágios  de  doença  (p=0,0045).  Um  aumento  na  frequência  de  células  CD57+ nas células NK CD56lowCD16+ também foi constatado no sangue de pacientes com EDT  (p=0,039). Não foram observadas diferenças entre a frequência de células CD57+ em células  NK CD56brightCD16‐ presentes no sangue de pacientes com EDT e CTRL, ou na frequência de  células NK CD56brightCD16‐, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ no FP.  A análise da frequência de células positivas para o marcador CD161 nas populações  de células NK estudadas não mostrou diferenças em amostras de sangue e FP comparando‐ se o grupo de pacientes com endometriose e controles (Figura 11 B e D).  A  B  C  50    CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+ 0 20 40 60 80 100 n.s. *** * % CD57+ CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+ 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. EDT CTRL % CD161+   CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+ 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD57+ CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+ 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD161+   Figura 11 ‐ Frequência de células Natural Killer (NK) CD56brightCD16‐, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ positivas  para os marcadores CD57 e CD161 em amostras de sangue (A e B) e fluido peritoneal (C e D) de pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil. *p<0,05, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado.    Não  foram  encontradas  diferenças  quanto  à  expressão  do  marcador  CD57  entre  as  amostras  de  sangue  e  FP  de  cada  grupo  em  nenhuma  população  de  célula  NK  estudada  (Figura 12 A, C e E).   As células CD56brightCD16‐CD161+ apresentaram‐se em maior frequência no FP que no  sangue de pacientes do grupo controle (p=0,036). Embora fosse observada maior frequência  de células CD161+ no FP comparado com o sangue dos grupos EDT e III/IV, a diferença não  foi significativa (Figura 12B). Curiosamente, a situação parece estar invertida em pacientes  do grupo I/II, nas quais as células CD161+  encontram‐se mais frequentes no sangue que no  FP.  Um  quadro  contrário  é  visto  nas  células  CD56brightCD16+,  as  quais  apresentaram  maior  frequência de células CD161+ no sangue que no FP; dado significante apenas para o grupo de  pacientes  I/II  (p=0,0487)  (Figura  12D).  Não  foram  encontradas  diferenças  significativas  quanto à frequência de células CD56brightCD16+CD161+  nas pacientes dos grupos EDT, III/IV e  CTRL. Diferentemente do padrão observado no restante dos grupos, as pacientes do grupo  III/IV aparentam ter mais células CD56brightCD16+CD161+ no FP, comparado ao sangue (Figura  A  B  C  D  51    12F). A expressão de CD161 nas células CD56lowCD16+ também não mostrou diferenças entre  as amostras e entre os grupos.     CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 n.s. n.s. n.s. n.s. % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 sangue PF n.s. n.s. n.s.* % CD161+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s.n.s.n.s.n.s. % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s.*n.s.n.s. sangue FP % CD161+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s.n.s.n.s.n.s. % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s.n.s.n.s.n.s. sangue FP % CD161+   Figura 12 ‐ Comparação da frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐ (A e B), CD56brightCD16+ (C  e D) e CD56lowCD16+  (E e F) positivas para os marcadores CD57 e CD161 entre amostras de sangue e fluido  peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). Dados mostrados como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose  moderada/grave; *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.    Não foram encontradas diferenças entre a razão de células presentes no FP e células  no  sangue de  nenhuma  das  populações  estudadas  (apêndice –  Tabelas  A9  e  A10 e  Figuras  A12‐A14).      A  B  C  D  E  F  52    4.4       Células Supressoras Mieloides (MDSC)    A estratégia para a caracterização de MDSC a partir dos marcadores de superfície foi  realizada  como  segue:  foi  selecionada  a  população  celular  positiva  para  CD45,  que  corresponde  às  células  hematopoiéticas,  seguida  da  exclusão  de  populações  com  fenótipo  de  linfócitos  T  e  B,  células  NK  e  NKT,  monócitos  e  células  apresentadoras  de  antígenos,  a  partir da seleção de células Lin1‐HLA‐DR‐. Em seguida, dentre as células CD45+Lin1‐HLA‐DR‐,  foram selecionadas as células que expressam as moléculas CD11b e CD33. Essas células são  aqui referidas como MDSC. Na sequência, foi avaliada a expressão dos marcadores CD15 e  de CD34 na superfície das células MDSC. A estratégia realizada para a caracterização dessas  células está ilustrada na Figura 13.  Como  a  presença  de  células  MDSC  ainda  não  foi  avaliada  em  pacientes  com  endometriose,  e  para  comprovação  de  que  a  estratégia  de  caracterização  dessas  células  pode também ser aplicada para as amostras de fluido peritoneal e sangue dessas pacientes,  iniciamos a identificação e caracterização de células com fenótipo Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+  em  amostras  de  medula  óssea  de  pacientes  com  mieloma  múltiplo  (n=2);  esses  pacientes,  sabidamente,  possuem  altas  frequências  dessas  células  no  sangue  comparados  com  indivíduos  saudáveis  (50).  Após  a  comprovação  da  identificação  de  MDSC  (Lin1‐HLA‐DR‐ CD11b+CD33+)  em  pacientes  com  mieloma  múltiplo,  utilizou‐se  a  mesma  estratégia  para  a  identificação destas células em pacientes com endometriose.     53                                                          Figura 13 ‐  Estratégia de análise de células supressoras mieloides (MDSC). Inicialmente, foram selecionadas  células CD45+ (A). Dentro das células CD45+, foram selecionadas as células HLA‐DR‐Lin1‐ (B). Em seguida, foram  selecionadas as células CD11b+CD33+ (C) e nesta população, foi avaliada a expressão de CD15 e CD34 (D).                Devido  à  heterogeneidade  de  populações  de  MDSC,  analisamos  as  células  supressoras  mieloides  de  quatro  fenótipos  distintos:  CD11b+CD33+,  CD11b+CD33+CD34+,  CD11b+CD33+C15+ e CD11b+CD33+CD34+CD15+. A frequência de células CD11b+CD33+C15+ e  CD11b+CD33+CD34+CD15+  foi  extremamente  baixa  nas  amostras  das  pacientes  incluídas  nesse estudo e não foram comprovadas diferenças entre os grupos (EDT versus CTRL ou I/II e  III/IV versus CTRL), ou entre amostras estudadas (sangue versus FP em cada grupo) (dados  não  mostrados).  Por  esta  razão,  estas  populações  não  serão  abordadas  nesse  texto.  A  comparação  entre  média  e  mediana  das  frequências  de  MDSC  CD11b+CD33+e  CD11b+CD33+CD34+  no  sangue  e  FP  de  pacientes  com  endometriose  e  controles  está  resumida  na  Tabela  6.  Comparações  entre  os  estágios  de  EDT  podem  ser  encontradas  no  apêndice (Tabela A11).          A  B  C  D  54      Tabela 6 ‐ Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de pacientes  com endometriose e controles.  CTRL  EDT    População  Média ± DP  Mediana (IQR) Média ± DP  Mediana (IQR)  p  CD11b+CD33+  (sangue)  0,09 ± 0,09  0,7 (0 ‐ 0,18)  0,24 ± 0,19  0,19 (0,11 ‐ 0,4)  p=0,0624 CD11b+CD33+CD34+  (sangue)  0,037 ± 0,054  0,02 (0‐ 0,06)  0,142 ± 0,137  0,11 (0,05 ‐ 0,22)  p=0,0417 CD11b+CD33+    (FP)  0,4 ± 0,74  0,13 (0,04 ‐ 0,26) 0,1 ± 0,1  0,07 (0,02 ‐ 0,16)  p=0,3693 CD11b+CD33+CD34+   (FP)  0,146 ± 0,325  0,01 (0,01 ‐ 0,08) 0,055 ± 0,063  0,03 (0‐ 0,09)  p=0,7049 Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  CTL=controle,  EDT=  endometriose,  DP  =  desvio  padrão,  IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. Valor de p calculado pelo teste de Mann Whitney.    Os  resultados  encontrados  quanto  às  células  MDSC  CD11b+CD33+e  CD11b+CD33+CD34+ foram bastante semelhantes. Ambas as populações estudadas parecem  estar  mais  frequentes  em  amostras  de  sangue  de  pacientes  com  endometriose  do  que  de  controles.  No  entanto,  esse  dado  só  foi  confirmado  para  a  população  CD11b+CD33+CD34+  (p=0,04).  No  FP,  há  tendência  a  menor  frequência  de  células  CD11b+CD33+  em  pacientes  com  EDT,  embora  a  diferença  não  seja  significante  (p=0,36)  (Figura  14).  Quanto  às  células  CD11b+CD33+CD34+, a frequência de células é extremamente baixa no FP, com mediana de  0% para o grupo CTRL (Tabela 6).   CTRL EDT CTRL EDT 0.00 0.25 0.50 0.75 1.5 2.0 2.5 n.s. n.s. Sangue FP % CD11b+CD33+ CTRL EDT CTRL EDT 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.8 1.0 * n.s. Sangue FP % CD11b+CD33+CD34+   Figura  14 ‐  Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e  CD11b+CD33+CD34+ (B)  em amostras de sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL,  n=8). As células MDSC são mostradas como porcentagem de células dentre os leucócitos totais (CD45+). Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  *p<0,05,  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  de  Mann  Whitney.    Ao  dividirmos  o  grupo  EDT  de  acordo  com  o  estagiamento  da  doença,  observamos  em  ambas  as  populações  de  MDSC  um  aumento  na  frequência  de  células  no  sangue  de  A  B  55    pacientes  com  EDT  I/II,  comparadas  com  controles  (Figura  15).  Não  há  diferenças  comparando‐se amostras de sangue de pacientes do grupo III/IV com controles, ou entre a  frequência das populações de MDSC em amostras de FP de pacientes dos grupos I/II e III/IV,  comparados com controles. Entretanto, é possível constatar uma diferença na frequência de  células CD11b+CD33+  entre os pacientes do grupo I/II e III/IV; o grupo III/IV tem frequência  muito menor (p=0,009) de células do que o I/II, cuja frequência é semelhante ao grupo CTRL.  Para a população CD11b+CD33+CD34+, a frequência do grupo I/II permanece maior do que os  outros  grupos,  entretanto,  o  grupo  CTRL  tem  frequência  reduzida,  mais  próxima  ao  grupo  III/IV (Figura 15).  CTRL I/II III/IV 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 n.s.* n.s. % CD11b+CD33+ CTRL I/II III/IV 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 n.s. n.s.* % CD11b+CD33+CD34+ CTRL I/II III/IV 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 1.5 2.0 2.5 ** n.s. n.s. % CD11b+CD33+ CTRL I/II III/IV 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.8 1.0 n.s. n.s.n.s. % CD11b+CD33+CD34+   Figura  15 ‐   Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  e  CD11b+CD33+CD34+  em  amostras  de  sangue  (A  e  B)  e  fluido  peritoneal  (C  e  D)  de  pacientes  com  endometriose  subagrupados  em  estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), e controles (CTRL, n=8). As células MDSC são mostradas como porcentagem  de  células  dentre  os  leucócitos  totais  (CD45+).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  *p<0,05, ** p<0,01,  e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney.    A comparação de amostras de sangue e FP entre os grupos mostrou maior frequência  de MDSC CD11b+CD33+ e CD11b+CD33+CD34+ no sangue do que no FP dos grupos EDT e III/IV  (p=0,0038  e  p=0,0033  para  o  grupo  EDT,  respectivamente,  e  p=0,024  e  p=0,0007  para  o  grupo  III/IV,  respectivamente).  O  grupo  I/II  não  apresentou  diferenças  significativas  entre  amostras  de  sangue  e  FP,  apesar  de  haver  uma  tendência  na  observação  de  maior  C  A  B  D  56    frequência  células  no  sangue,  principalmente  para  a  população  CD11b+CD33+(p=0,07).  O  grupo CTRL também não mostrou diferenças entre as amostras, entretanto, há tendência a  maior frequência de células CD11b+CD33+ no FP que no sangue (p=0,09) (Figura 16).  CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.2 0.4 0.6 1.5 2.0 2.5 **n.s. * n.s. sangue FP % CD11b+CD33+ CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.8 1.0 sangue FP n.s. ** ** n.s. % CD11b+CD33+CD34+   Figura  16 ‐   Comparação  da  frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e  CD11b+CD33+CD34+  (B)  entre  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  divididas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12),  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  MDSC  são  mostradas como porcentagem de células dentre os leucócitos totais (CD45+). Dados mostrados como mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose  moderada/grave;  *p<0,05, ** p<0,01e n.s. = não significativa, pelo teste de Wilcoxon.    Não foi possível calcular a razão de células no FP pela razão de células no sangue das  pacientes devido ao grande número de pacientes com 0% de MDSC no sangue.    4.5       Análise do perfil de células dendríticas    Utilizando  o  mesmo  painel  de  caracterização  de  MDSC,  as  células  dendríticas  (DC)  HLA‐DR+Lin1‐ foram selecionadas. Foi avaliada também a frequência de DC que expressam os  marcadores CD11b e CD33 (Figura 17).     A  B  57      Figura 17 ‐  Estratégia de análise para avaliação de células dendríticas (DC). Inicialmente, foram selecionadas  células CD45+ (A). Dentro das células CD45+, foram selecionadas as células HLA‐DR+Lin1‐, que correspondem às  células dendríticas (B) e nesta população, foi avaliada a expressão de CD11b e CD33 (C).             Foram  analisados  o  fenótipo  geral de  células  dendríticas  (Lin‐HLA‐DR‐),  a  frequência  de  DC  mieloides  (CD33+)  e  a  frequência  de  DC  mieloides  positivas  e  negativas  para  o  marcador CD11b. A comparação entre média e mediana das frequências de populações de  DC no sangue e FP de pacientes com endometriose e controles está resumida na Tabela 7. As  comparações  entre  a  frequência  das  populações  de  DC  entre  pacientes  EDT  de  diferentes  estágios podem ser encontradas no apêndice (Tabela A12).                     A  B  C  58    Tabela 7 – Comparação da frequência de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de  pacientes com endometriose e controles.  CTRL  EDT    População  Média ± DP  Mediana (IQR) Média ± DP  Mediana (IQR)  p  DC   (sangue)  0,14 ± 0,07  0,14 (0,09 ‐ 0,22) 0,6 ± 1,16  0,39 (0,19 ‐ 0,44)  p=0,016 DC   (FP)  7,22 ± 5,44  6,1 (1,7 ‐ 14)  4,95 ± 5,4  1,08 (0,08 ‐ 9,9)  p=0,148 DC CD33+    (sangue)  34,6 ± 22,3  37,6 (13,1 ‐ 49,9) 43,7 ± 34,5  29,4 (10,1 ‐ 75,6)  p=0,5  DC CD33+    (FP)  73,9 ± 35,6  91,3 (49,8 ‐ 94,8) 58,6 ± 37,4  71,5 (16,9 ‐ 87,7)  p=0,334 DC CD33+CD11b+   (sangue)  1,47 ± 1,85  1,08 (0 ‐ 2,12)  1,74 ± 2,3  1 (0,39 ‐ 2,35  p=0,785 DC CD33+CD11b+   (FP)  79,8 ± 24,7   89 (83,4 ‐ 90,7)  42,7 ± 34,7  51,4 (0,05 ‐ 72,5)  p=0,01  DC CD33+CD11b‐   (sangue)  37,9 ± 19,4  38,9 (25,2 ‐ 53,1) 42,1 ± 34  29,4 (10,1 ‐ 74,5)  p=0,778 DC CD33+CD11b‐   (FP)  4,6 ± 3,9  3,6 (2,9 ‐ 4,3)  19,1 ± 21,4  10,9 (1,4 ‐ 30,7)  p=0,092 Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  CTL=controle,  EDT=  endometriose,  DC  =  célula  dendrítica,  DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. Valor de p calculado pelo teste t de Student  não pareado/Mann Whitney, quando apropriado.    A  frequência  de  DC  (Lin‐HLA‐DR‐)  está  aumentada  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose, comparadas com controles (p= 0,01). Quando as pacientes do grupo EDT são  subdivididas em estágios de doença I/II e III/IV, essa diferença é mantida apenas no grupo  III/IV  (Figura  18A).  Não  foram  encontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  DC  no  FP  de  pacientes com endometriose (em todos os estágios) e controles (Figura 18B).  Comparando‐se a frequência de Lin‐HLA‐DR‐ em amostras de sangue e FP dentro dos  grupos,  observamos  maior  frequência  em  amostras  de  FP  de  pacientes  do  grupo  EDT  (p=0,03)  e  em  controles  (p=0,01)  (Figura  18C).  Apesar  de  haver  uma  tendência  à  maior  frequência de DC no FP que no sangue de pacientes dos grupos I/II e III/IV, a diferença não  foi significativa (p=0,57 e p=0,05, respectivamente).  A razão existente entre a frequência de DC no FP pela frequência destas no sangue  de  cada  paciente  é  menor  em  pacientes  com  endometriose  que  em  controles  (p=0,01).  Comparando‐se  os  grupos  de  endometriose  com  controles,  o  grupo  I/II  mostrou  redução  significante da razão FP:sangue (p=0,03) (Figura 18D).    59    CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4 5 6 * n.s. * % DC CTRL EDT I/II III/IV 0 5 10 15 n.s. n.s. n.s. % DC CTRL EDT I/II III/IV 0 3 6 9 12 15 sangue PF ** n.s. n.s. % DC CTRL EDT I/II III/IV 0 50 100 150 * * n.s. Razão FP:sangue   Figura  18 ‐   Frequência  de  células  dendríticas  (DC)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subagrupadas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12),  comparadas  com controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A) e FP (B) dos grupos estudados, a  comparação  entre  as  frequências  em  amostras  de  sangue  e  FP  (C)  e  a razão  existente  entre  a  frequência  de  células no FP pela frequência de células no sangue de cada indivíduo (D). As células DC são mostradas como  porcentagem  de  células  dentre  os  leucócitos  totais  (CD45+).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil. I/II (n=7), endometriose mínima/leve; III/IV (n=12), endometriose moderada/grave; *p<0,05 e n.s.  = não significativa, pelos testes de Mann Whitney (A, B e D) e Wilcoxon (C).    Não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  mDC  entre  pacientes  com  endometriose (todos os estágios) e controles em amostras de sangue ou FP (Figura 19A e B).  Assim como o que ocorre para DC, a frequência de mDC é maior no FP do que no sangue dos  vários  grupos  (Figura  19C).  Essa  diferença  foi  significante  apenas  para  o  grupo  CTRL  (p=0,006)  (Figura  19D).  A  avaliação  da  razão  entre  a  frequência  de  mDC  no  FP  pela  frequência  de  células  no  sangue  não  mostrou  diferenças  entre  os  grupos  (dados  não  mostrados).  A  B  C  D  60    CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % DC CD33+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % DC CD33+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 sangue PF n.s.** n.s. n.s. % DC CD33+ CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 8 12 16 20 24 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue   Figura 19 ‐ Frequência de células dendríticas CD33+ (mDC) em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subagrupadas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12),  comparadas  com controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A) e FP (B) dos grupos estudados, a  comparação  entre  as  frequências  em  amostras  de  sangue  e  FP  (C)  e  a razão  existente  entre  a  frequência  de  células no FP pela frequência de células no sangue de cada indivíduo (D). As células DC CD33+ são mostradas  como  porcentagem  de  células  dentre  as  DC  (Lin‐HLA‐DR‐).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose  moderada/grave;  **  p<0,01  e  n.s. = não significativa, pelos testes t de Student não pareado (A, B e D) e (C).    A seguir, analisamos a frequência de DC CD33+CD11b+ e CD33+CD11b‐. Ao investigar a  distribuição  de  DC  CD33+  CD11b+  e  CD11b‐,  percebemos  que  o  padrão  de  distribuição  é  diferente  em  amostras  de  sangue  e  FP;  enquanto  no  sangue  a  grande  maioria  de  mDC  é  CD11b‐, no FP, a maioria torna‐se CD11b+ (Figura 20A).  A  B  C  D  61    sangue FP 0 20 40 60 80 100 CD11b+ CD11b- % CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 CD11b+ CD11b- % CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 CD11b+ CD11b- %   Figura  20 ‐   Distribuição  de  células  CD11b+  e  CD11b‐  em  células  dendríticas  CD33+  do  sangue  e  fluido  peritoneal (FP) das pacientes com endometriose e controle. Estão mostradas a média da frequência de células  de cada população de todos os grupos estudados, calculadas dentro do total de células dendríticas CD33+(A),  além da distribuição das populações em amostras de sangue (B) e FP (C) dentro de cada grupo de pacientes.  CTRL=controle  (n=8),  EDT  =  endometriose  (n=12),  I/II  =  endometriose  leve/moderada  (n=7),  III/IV  =  endometriose moderada/grave (n=12).    A análise da Figura 20 já indica que não há grande diferenças entre os grupos quanto  às populações CD11b+ e CD11b‐ no sangue, mesmo quando o grupo EDT é dividido de acordo  com  o  estagiamento.  A  frequência  de  células  CD33+CD11b+  no  FP,  no  entanto,  foi  significativamente  menor  em  pacientes  com  EDT,  comparadas  com  controles  (p=0,01)  (Figura 21D). A subdivisão das pacientes de acordo com o estagiamento da doença também  revelou  menor  frequência  de  DC  no  FP,  comparadas  com  controles  (p=0,02  e  p=0,04  para  estágios I/II e III/IV, respectivamente). Quanto à população CD33+CD11b‐, apesar de não ter  sido  comprovada  significância  estatística,  há  um  visível  aumento  na  frequência  dessas  células no FP de pacientes com endometriose, comparadas com controles (EDT: p=0,09, I/II:  p=0,05, III/IV: p=0,16) (Figura 21D).  A comparação entre a frequência dessas células em amostras de sangue e FP indica  que as DC CD33+CD11b+ estão muito mais frequentes em amostras de FP do que de sangue,  em  todos  os  grupos  (EDT:  p=0,0001,  I/II:  p=0,01,  III/IV:  p=0,004  e  CTRL:  p=0,0001)  (Figura  21E).  Conforme  já  mostrado  na  Figura  20,  o  oposto  é  visto  para  as  células  CD33+CD11b‐,  muito  mais  frequentes  em  amostras  de  sangue  do  que  FP  (EDT:  p=0,01,  I/II:  p=0,37,  III/IV:  p=0,03 e CTRL: p=0,008) (Figura 21F).  A  B  C  62    Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à razão dessas células no  FP e no sangue (dados não mostrados).  CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 10 n.s. n.s. n.s. % DC CD33+CD11b+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % DC CD33+CD11b- CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 ** * * % DC CD33+CD11b+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 n.s. n.s. n.s. % DC CD33+CD11b- CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 sangue PF *** ***** * % DC CD33+CD11b+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 sangue PF * *** n.s. % DC CD33+CD11b-   Figura  21 ‐  Frequência de  células dendríticas  (DC)  CD33+  CD11b+  e  CD11b‐  em  amostras  de sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subagrupadas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A e B) e FP (C  e D) dos grupos estudados e a comparação entre as frequências em amostras de sangue e FP (E e F). Os dados  são mostrados como frequência de DC CD11b+ e CD11b‐ é mostrada como frequência de células dendríticas Lin‐ HLA‐DR‐. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II (n=7), endometriose mínima/leve; III/IV  (n=12), endometriose moderada/grave; *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelos testes t  de Student não pareado (A, B e D) e pareado (C).          A  B  C  D  E  F  63    4.6 Quantificação de citocinas pró e anti‐inflamatórias     A quantificação das citocinas IL‐2, IL‐4. IL‐6, IL‐10, IL‐12, IL‐17, TNF‐α, IFN‐γ e TGF‐β  foi  investigada  em  amostras  de  sangue  e  FP  de  pacientes  com  e  sem  endometriose.  Os  resultados estão resumidos na Tabela 8.  Tabela 8 – Avaliação de citocinas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose, divididas em  estágios I/II e III/IV, e controles.        CTRL  EDT  I/II  III/IV  Citocina  (pg/mL)  Amostra  N  Mediana (IQR)  N  Mediana  (IQR)  N  Mediana  (IQR)  N  Mediana (IQR)  IL‐2  FP ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15  sg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  IL‐4  FP ‐   < 15  1  18,59 ‐   < 15  1  18,59  sg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  TNF‐α  FP ‐   < 15  1  22 ‐   < 15  1  22  sg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  IFN‐γ  FP ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15  sg  2  18 (15‐22)  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  IL‐10  FP  2  22 (20‐25)  6  30(21‐158)  3  24 (23‐264)  3  37(18‐123)  sg  ‐  < 17  ‐  < 17  ‐  < 17  ‐  < 17  IL‐6  FP  7  43(40‐117)  15  52(43‐138)  5  94 (44‐573)  10  52(41‐ 136)  sg  1  20  ‐  < 16  ‐  < 16  ‐  < 16  IL‐17  FP  2  13 (9‐17)  2  70 (9‐131)  2  70 (9‐131) ‐   < 4  sg  4  14 (8,5‐25)  3  15 (10‐24)  1  15  2  17 (10‐24)  TGF‐β  FP  6  815 (450‐2947)  15  849 (652‐ 1561)  6  1097 (684‐ 1753)  9  800 (522‐1832)  sg  8  1425 (565‐2358)  16  1529 (895‐ 4655)  4  3165 (1005‐ 5931)  12  1529 (804‐2533)  IL‐12  FP  6  185 (105‐551)  17  201 (58‐368)  6  148 (37‐295)  11  201 (66‐466)  sg  8  3924 (684‐8286)  19  987 (491‐ 1833)  7  856 (645‐ 1050)  12  1172 (468‐4119)  CTRL  =  controle,  EDT  =  endometriose;  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave,  N  =  número amostral, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal.    Os  níveis  das  citocinas  anti‐inflamatórias  IL‐4  e  IL‐10,  além  da  citocina  pró‐ inflamatória  TNF‐α,  estavam  abaixo  do  limite  de  detecção  do  método  em  amostras  de  sangue das pacientes estudadas. Não foi possível quantificar a IL‐2 em nenhuma amostra de  sangue ou FP estudadas, pois todas as quantificações estavam abaixo dos níveis de detecção  do kit.  Foi  possível  quantificar  TNF‐α  e  IL‐4  no  FP  de  apenas  uma  paciente  com  endometriose  (uma  paciente  com  EDT  estágio  IV),  pois  todas  as  quantificações  dos  outros  pacientes estavam abaixo do limite de detecção do kit.  64    A  quantificação  de  IL‐10  foi  possível  apenas  no  FP  de  8  pacientes:  3  pacientes  com  endometriose  I/II,  3  com  EDT  III/IV  e  2  controles,  visto  que  as  demais  estavam  abaixo  dos  níveis  de  detecção  do  kit.  Apenas  duas  pacientes  com  endometriose  I/II  e  duas  controles  apresentaram  níveis  de  IL‐17A  no  FP.  No  sangue,  essa  citocina  foi  detectada  em  quatro  mulheres do grupo EDT, duas do grupo III/IV e uma com EDT I/II. A citocina pró‐inflamatória  IFN‐γ foi detectada apenas em amostras de sangue de duas pacientes do grupo CTRL. Para o  restante das amostras, as citocinas supracitadas estavam abaixo dos níveis de detecção do  método utilizado.  A citocina IL‐6 foi detectada no FP de quase todas as pacientes incluídas no estudo.  Não  foram  encontradas  diferenças  significativas  na  quantificação  dessa  citocina  entre  os  diferentes grupos (Figura 22A). Todas as amostras de sangue estavam abaixo dos níveis de  detecção de IL‐6 do kit.  A  concentração  de  TGF‐β  foi  similar  entre  os  grupos  estudados.  No  sangue,  a  mediana foi de 1425 pg/mL (565 – 2358) para o grupo CTRL e 1529 pg/mL (895 – 4655) para  o grupo EDT. A mediana do grupo I/II foi um pouco mais alta do que os outros grupos (3165  pg/mL), entretanto, devido ao reduzido n e variação entre as amostras (IQR: 1005 – 5931,  n=4),  não  pode  ser  considerado.  No  FP,  as  medianas  também  foram  próximas:  815  pg/mL  (450 – 2947) para o grupo CTRL e 849 pg/mL (652 – 1561) para o grupo EDT. Mais uma vez, a  mediana  do  grupo  I/II  mostrou‐se  mais  elevada:  1097  pg/mL  (684  –  1753),  porém  sem  diferença estatística (Figura 22B e C).  A avaliação da citocina IL‐12 mostrou diferenças apenas comparando‐se amostras de  sangue  de  pacientes  com  endometriose  I/II  com  controles  (p=0,03)  (Figura  22D).  Embora  esta  citocina  esteja  presente  em  menor  concentração  no  sangue  de  pacientes  dos  grupos  EDT  e  III/IV  do  que  em  controles,  esta  diferença  não  foi  estatisticamente  significante.  Não  foram  encontradas  diferenças  na  concentração  de  IL‐12  entre  amostras  de  FP  entre  os  diversos grupos (Figura 22E).  65    CTRL EDT I/II III/IV 0 50 100 150 200 200 600 1000 n.s. n.s. n.s. IL- 6 (pg/mL)   CTRL EDT I/II III/IV 0 1000 2000 3000 3000 6000 9000 n.s. n.s. n.s. TGF-β (pg/mL) CTRL EDT I/II III/IV 0 500 1000 1500 2000 2500 3500 5500 n.s. n.s. n.s. TGF-β (pg/mL) CTRL EDT I/II III/IV 0 1000 2000 2000 7000 12000 15000 30000 n.s. * n.s. IL-12 (pg/mL) CTRL EDT I/II III/IV 0 200 400 600 800 1000 n.s. n.s. n.s. IL-12 (pg/mL)   Figura  22 ‐   Concentração  de  IL‐6,  TGF‐β  e  IL‐12  no  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e  III/IV,  e  controles  (CTRL).  Mostradas  estão  as  concentrações de IL‐6 no FP (A), TGF‐β no sangue e no FP (B e C) e IL‐12 no sangue no FP (D e E) das pacientes  incluídas no estudo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II, endometriose mínima/leve;  III/IV, endometriose moderada/grave; *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney.    Quando  comparamos  a  concentração  de  TGF‐β  e  IL‐12  entre  amostras  de  sangue  e  FP, é possível notar uma tendência a maior concentração dessas citocinas no sangue do que  no  FP  de  todos  os  grupos.  Para  TGF‐β,  essa  diferença  é  significativa  apenas  no  grupo  EDT  (p=0,0081) (Figura 23A). Já para IL‐12, a diferença mostra‐se significativa para o grupo EDT  (p=0,0003),  I/II  (p=0,03)  e  III/IV  (p=0,001).  No  grupo  controle,  apesar  de  haver  uma  maior  A  B  C  D  E  66    concentração  dessas  citocinas  no  sangue  do  que  no  FP,  essa  diferença  não  é  significativa  (TGF‐β p=0,8 e IL‐12 p=0,09) (Figura 23B).    CTRL EDT I/II III/IV 0 2000 4000 6000 8000 sangue PF **n.s. n.s. n.s. TGF-β (pg/mL)   CTRL EDT I/II III/IV 0 200 400 600 600 1600 1600 11600 21600 31600 sangue PF *** ***n.s. * IL-12 (pg/mL)   Figura  23 ‐   Comparação  entre  a  concentração  de  TGF‐β  (A)  e  IL‐12  (B)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e  III/IV.  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II,  endometriose  mínima/leve;  III/IV,  endometriose  moderada/grave;  *p<0,05,  **  p<0,01,  ***  p<0,001  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  de  Wilcoxon.  A  B  67    5           DISCUSSÃO    Diversos relatos mostram que a função de várias células do sistema imune encontra‐ se alterada em mulheres com endometriose  (13). Visto que a endometriose é uma doença  ginecológica que acomete aproximadamente 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva,  e que as limita em diversas dimensões, há grande interesse no estudo da doença e, assim, na  busca  de  tratamentos  menos  invasivos  para  essas  pacientes.  Nesse  estudo,  a  hipótese  aventada  é  de  que  a  presença  de  células  com  propriedades  imunorreguladoras  no  microambiente  peritoneal  seja,  pelo  menos  parcialmente,  responsável  pela  redução  da  capacidade  das  células  imunes  de  reagir  contra  as  células  endometriais,  permitindo  sua  implantação  e  permanência  em  locais  ectópico.  Assim,  aqui  foi  investigada  a  presença  e  a  quantificação  das  células  Treg,  NK,  MDSC  e  DC  no  microambiente  peritoneal  e  sangue  de  mulheres  com  endometriose  profunda,  além  da  avaliação  de  citocinas  pró  e  anti‐ inflamatórias.   Foram  incluídas  nesse  estudo  mulheres  entre  26  e  51  anos  com  endometriose  profunda, ausência de doença autoimune, inflamatória ou condição neoplásica (confirmado  por  exames  médicos  e/ou  testes  laboratoriais,  quando  necessário)  e  sem  uso  de  terapia  hormonal por pelo menos três meses prévios ao estudo.   Esse estudo contou com amostras de 19 pacientes, com diagnóstico de endometriose  profunda  confirmada  por  videolaparoscopia  e  análise  histológica  das  lesões,  e  8  controles.  Das 19 pacientes, sete foram classificadas com endometriose mínima/leve (estágio I/II) e 12  foram classificadas como tendo a forma moderada/grave da doença (estágios III e IV).   Como  o  volume  de  FP  e  a  contagem  de  células  difere  entre  pacientes,  iniciamos  o  estudo com uma avaliação geral das populações de leucócitos (CD45+), linfócitos T (CD3+), LT  CD4+  e  LT  CD4+  ativados  (CD25+),  para  confirmar  se  a  distribuição  dessas  células  seria  diferente entre as pacientes com endometriose e em comparação com controles. Não foram  encontradas diferenças entre amostras de sangue e FP de pacientes com endometriose (em  diversos  estágios)  e  controles.  Conforme  esperado,  as  populações  citadas  foram  mais  frequentes em amostras de sangue do que de FP.  No  presente  estudo,  foi  analisada  a  frequência  de  células  Treg  CD45+CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+  comparadas  ao  quadro  geral  de  LT  (frequência  dentre as células CD3+) e comparadas aos LT CD4+ em amostras de sangue e FP de pacientes  68    com endometriose e controles. O único resultado que mostrou diferença entre a frequência  destas células nas pacientes do grupo EDT e do grupo CTRL foi ao se comparar a frequência  destas  no  conjunto  de  LT  CD4+  no  FP;  as  pacientes  com  EDT  mostraram  uma  redução  na  frequência  dessas  células  no  FP,  quando  comparadas  às  controles  (Figura  5A).  Até  o  momento, poucos grupos de pesquisa investigaram células T reguladoras em pacientes com  endometriose  por  meio  de  técnicas  com  alta eficácia  para  identificação  e  quantificação  de  populações celulares como a citometria de fluxo multiparamétrica, e, dentre esses, poucos  avaliaram essas células em amostras de fluido peritoneal. Entre esses relatos, foi observado  aumento  de  células  Foxp3+  no  endométrio  eutópico  de  mulheres  com  endometriose  peritoneal  e  ovariana  durante  a  fase  secretora  do  ciclo  menstrual,  comparadas  com  controles; essas análises foram feitas por imunohistoquímica (51). Ainda, foi mostrado que o  número  de  células  CD4+CD25+Foxp3+  está  aumentado  no  endométrio  ectópico  (endometrioma ovariano) quando comparadas com controles (52). Os relatos quantitativos  de  células  Treg  já  realizadas  em  amostras  de  fluido  peritoneal  (27),  incluindo  um  estudo  anterior do nosso grupo de pesquisa, mostraram que há maior frequência dessas células no  FP  de  pacientes  com  EDT  do  que  em  amostras  de  controles.  O  estudo  de  Podgaec  e  colaboradores (2012) (27) analisou a expressão de Foxp3 por PCR em tempo real (RT‐PCR)  dentre as células CD4+CD25high previamente separadas por citômetro de fluxo, além de não  utilizarem o marcador CD127. A RT‐ PCR reflete o quanto um determinado gene está sendo  expresso  em  uma  célula  (ou  conjunto  de  células).  Desse  modo,  o  estudo  citado  anteriormente afirma maior expressão do fator de transcrição Foxp3 dentre um conjunto de  células potencialmente Treg (CD4+CD25high), entretanto, não quantifica quantas células desse  conjunto  expressam  esse  fator.  Portanto,  não  se  pode  afirmar  se  houve  aumento  na  frequência  de  células  Treg  ou  se  as  células  Treg  que  existem  no  FP  das  pacientes  com  endometriose  estão  expressando  mais  Foxp3,  o  que  poderia  estar  relacionado  com  maior  função  supressora  dessas  células;  esse  pode  ser  um  dos  motivos  da  não  concordância  dos  dados  obtidos  nesse  estudo  com  os  anteriormente  observados  por  nosso  grupo.  O  único  estudo publicado até o momento que investiga concomitantemente a frequência de células  Treg  no  fluido  peritoneal  e  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose  utilizando  uma  abordagem  bastante  similar  para  caracterização  fenotípica  ao  presente  estudo,  foi  o  de  Olkowska – Truchanowicz et al. (2013) (53). Apesar de não analisarem a expressão de CD127  e de sua coorte consistir de pacientes com cistos ovarianos, foi encontrada maior frequência  69    de  células  Treg  no  FP  de  pacientes  com  EDT,  comparadas  com  controles,  corroborando  o  estudo de Podgaec et al. (2012) (27). Além disso, os autores encontraram uma redução na  frequência  dessas  células  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  controles. Apesar de não ter sido comprovada a significância estatística no presente estudo,  os dados apontam para uma tendência ao aumento na frequência de células Treg no sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  as  controles.  O  estudo  de  Olkowska  –  Truchanowicz et al. (2013) (53) mostra, também, um aumento na frequência de células Treg  dentre os LT auxiliares CD4+ em amostras de FP de pacientes com endometriose. Em nosso  estudo,  a  frequência  de  células  Treg  dentre  as  células  CD4+  mostra‐se  reduzida  no  FP  de  pacientes com EDT (p=0,04, Figura 5A). O número amostral do referido estudo é semelhante  ao nosso, com apenas alguns controles a mais (EDT=17 e CTRL=15), portanto não podemos  atribuir  as  diferenças  encontradas  ao  pequeno  número  amostral.  É  possível  que  haja  diferença  na  distribuição  de  células  imunes  entre  pacientes  com  tipos  distintos  de  endometriose;  enquanto  o  trabalho  de  Olkowska  –  Truchanowicz  e  colaboradores  (2013)  (53) foca em estudar a frequência das células Treg em pacientes com cistos endometrióticos  ovarianos,  o  presente  trabalho  estuda  a  frequência  dessas  células  em  pacientes  com  endometriose profunda, um tipo geralmente mais agressivo de doença.   O  fato  dos  dados  obtidos  no  presente  estudo  discordarem  dos  previamente  observados  pode  estar  relacionado  com  a  origem  da  amostra,  o  tipo  de  endometriose  estudada  (ovariana,  e  não  profunda),  com  o  pequeno  número  amostral  aqui  incluído,  as  características  individuais  das  pacientes,  além  das  diferentes  estratégias  de  caracterização  da população.   Sabendo  que  LT  ativados  também  expressam  CD25  e  tem  expressão  transiente  de  Foxp3,  acreditamos  que  o  conjunto  de  marcadores  utilizados  aqui  seja  o  mais  apropriado  para detecção de células Treg.   A menor frequência de Treg no FP de pacientes com endometriose observada nesse  estudo, particularmente em estágios mais leves de doença, é um dado bastante intrigante e  diverge  de  nossa  hipótese  inicial,  de  que  células  com  propriedades  imunorreguladoras  estariam  presentes  no  microambiente  peritoneal  e  que  esse  quadro  seria  prejudicial  às  pacientes,  levando‐as  a  desenvolverem  a  doença.  Se  esta  hipótese  estivesse  correta,  esperaríamos  encontrar  maior  frequência  de  células  Treg  no  FP  de  pacientes  com  endometriose, principalmente de estágios III/IV, do que controles. O que observamos nessa  70    coorte,  entretanto,  é  uma  redução  na  frequência  dessas  células  no  FP  de  pacientes  com  endometriose. Essa redução é ainda mais aparente em pacientes com EDT I/II. Esses dados  sugerem então que essas células estejam no microambiente peritoneal para proteger contra  possíveis  danos  causados  por  células  endometrióticas,  e  que  na  ausência  ou  redução  da  frequência  dessas  células,  a  doença  pode  se  desenvolver.  Células  endometriais  ectópicas  liberam  vários  fatores  que  permitem  o  desenvolvimento  da  endometriose.  Um  quadro  oposto  é  observado  no  sangue;  uma  maior  frequência  de  Treg  em  pacientes  do  grupo  I/II,  seguida por III/IV e controles. O fato dos dados obtidos nesse estudo mostrarem tendência à  maior  frequência  de  células  Treg  no  sangue  de  pacientes  com  EDT,  indica  que,  por  algum  motivo, mais células estão sendo produzidas. Os dados de FP mostram que essas não estão  se  acumulando  no  FP.  É  possível,  também,  que  as  células  estejam  infiltrando  as  lesões  de  endometriose, e por isso apresentem‐se em frequências menores no FP que no sangue. De  fato, de acordo com Berbic e Fraser (2011) (54), muitas populações de células imunes, entre  elas  células  NK,  DC  e  células  Treg  são  recrutadas  para  o  centro  de  lesões  endometrióticas.  Assim, seu número é reduzido significantemente no peritônio adjacente e distante (54).  A  razão  entre  a  frequência  de  Treg  no  FP  pela  frequência  de  células  no  sangue  também é reduzida em pacientes com EDT.  Outra população de células com propriedade imunoreguladora que poderia participar  no  desenvolvimento  e  progressão  da  endometriose  são  as  células  NK  CD56brightCD16‐.  A  população  CD56brightCD16‐  compõe  10%  do  repertório  de  células  NK  e  secreta  citocinas  (como  IFN‐γ,  GM‐CSF,  IL‐10  e  IL‐13)  que  regulam  as  células  do  sistema  imune  (55),  sendo,  por isso, chamada de NK imunoreguladora. Como são predominantes no útero, essas células  são  também  chamadas  de  NK  uterinas,  NK  deciduais  ou  NK  endometriais.  As  NK  CD56lowCD16+ representam a maioria (90%) das células NK na periferia e tem como principal  mecanismo de ação a citotoxicidade celular, sendo, portanto, chamadas de NK citotóxicas ou  NK  convencionais.  Já  as  células  NK  CD56brightCD16+  são  as  células  NK  menos  estudadas  e  estão presentes em pequena frequência no sangue e menor ainda no FP (Figura 9).  Não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  nenhuma  população  de  NK  citada  acima  entre  pacientes  com  EDT  e  CTRL,  em  amostras  de  FP  e  sangue,  mesmo  dividindo os pacientes com EDT em estágios I/II e III/IV. A maioria dos relatos existentes na  literatura  até  o  momento  tem  como  objeto  de  estudo  as  células  NK  convencionais,  CD56lowCD16+,  e  esses  dados  mostram‐se  contrastantes.  Um  estudo  recente,  liderado  por  71    Dias  Jr.  (56),  encontrou  maior  frequência  de  células  NK  CD3‐CD56+CD16+  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  quando  comparadas  com  controles  (média  15,3%  versus  10,6%). Essa diferença foi ainda maior comparando‐se pacientes com endometriose estágios  III/IV  com  controles  (19,8%  versus  10,6%),  razão  pela  qual  os  autores  sugerem  utilizar  a  frequência  de  NK  no  sangue  como  marcador  diagnóstico  de  endometriose  severa.  No  presente  estudo,  a  porcentagem  média  de  células  NK  CD56lowCD16+  foi  maior   que  a  encontrada por Dias Jr. et al. (2012) (56) (26,11%), entretanto as pacientes do grupo EDT I/II  apresentaram médias semelhantes às do grupo III/IV (28,7% versus 24,6%). As pacientes do  grupo controle também mostraram frequência de células NK elevada (22,7%), comparando  com  controles  de  Dias  Jr.  et  al.  (2012)  (56),  o  que  pode  explicar  por  que  não  houve  diferenças  significativas  entre  o  grupo  EDT  e  CTRL  (médias  26,11%  versus  22,7%).  Vale  lembrar que o número de pacientes incluídas nesse estudo é consideravelmente menor do  que o de Dias Jr. et al. (2012) (56).  Em  outros  estudos,  no  entanto,  foi  observado  um  quadro  divergente  do  reportado  por  Dias  Jr.  et  al.  (2012)  (56).  Em  um  estudo  multicêntrico  canadense,  não  foram  encontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  células  CD3‐CD56+,  CD56+CD16+  ou  CD56+CD16‐ em pacientes com endometriose e controles (57). Comparando‐se pacientes de  estágio I/II e III/IV com controles, Provinciali et al. (1995) (58) mostrou não haver diferenças  na  frequência  e  número  absoluto  de  células  NK  CD16+  ou  CD56+  em  amostras  de  sangue  entre  os  grupos.  Um  estudo  mais  antigo  (59)  utilizou  os  marcadores  CD16  e  CD56  para  identificar  células  NK  no  FP  de  pacientes  com  EDT  e  também  observou  frequências  semelhantes entre amostras de pacientes com e sem a doença. Recentemente, o estudo de  Funamizu e colaboradores (2014) (60) investigou a frequência de células NK CD56+CD16+, NK  CD56brightCD16+  e  NK  CD56dimCD16+  no  FP  de  pacientes  com  endometriose  e  também  não  encontrou  diferenças  significativas  entre  as  amostras  de  pacientes  com  endometriose  e  controles.   Até  o  momento,  não  existem  na  literatura  relatos  do  estudo  de  células  NK  CD56brightCD16‐ em pacientes com endometriose.  Sabendo  que  as  células  CD56lowCD16+  são  a  maioria  no  sangue,  e  que  as  NK  CD56brightCD16‐  são  minoria  no  sangue,  porém  maioria  no  FP,  esperávamos  encontrar  diferenças  entre  a  frequência  das  populações  entre  amostras  de  sangue  e  FP.  Conforme  esperado, a frequência de células CD56lowCD16+ e CD56brightCD16+ foi maior em amostras de  72    sangue que de FP (Figura 10), enquanto a frequência de células CD56brightCD16‐ foi maior em  amostras de FP do que de sangue.  A seguir, decidimos avaliar a expressão de CD57 e CD161, marcadores relacionados à  maturação e ativação de células NK, em cada população de células. Existem três hipóteses  que  relacionam  a  origem  das  subpopulações  de  células  NK  e  o  surgimento  de  marcadores  clássicos  como  CD56,  CD16  e  CD57.  A  primeira  hipótese  sugere  que  as  subpopulações  possuem  fenótipos  e  funções  distintas  devido  a  suas  origens  partirem  de  precursores  diferentes; a segunda sugere que as células partem de um mesmo precursor, porém exposto  a  estímulos  distintos  e  por  tal  razão  são  tão  diferentes  (61).  De  acordo  com  a  terceira  hipótese,  as  células  CD56brightCD16‐  seriam  células  imaturas  que,  conforme  vão  amadurecendo,  ganham  a  expressão  do  CD16  e  consequente  função  citotóxica  (62).  Um  ponto interessante dessa teoria é que o auge de maturação da célula NK seria atingido com  a  expressão  do  marcador  CD57.  Portanto,  durante  a  maturação,  células  CD56brightCD16‐  passariam  por  fases  intermediárias  (CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+)  até  o  estágio  final  de  maturação (células CD56+CD16+CD57+) (63).   Assim,  de  acordo  com  a  terceira  hipótese,  o  esperado  seria  que  células  imaturas  CD56brightCD16‐  tivessem  menor  expressão  de  marcadores  de  maturação  como  CD57  que  células mais maduras, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+. Realmente, foi possível observar um  aumento  na  frequência  de  células  positivas  para  o  CD57  de  acordo  com  a  maturação  das  células, de células CD56brightCD16‐ a células CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+, o qual mostrou‐ se significante apenas comparando as pacientes com EDT (dados não apresentados).  A  frequência  de  células  NK  maduras  (CD57+)  está  aumentada  nas  células  NK  CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ do sangue de pacientes com endometriose comparadas com  controles.   É verdade que a expressão de CD57 é crescente da população CD56brightCD16‐ para a  CD56brightCD16+  e  mais  ainda  para  a  CD56lowCD16+,  observação  que  vem  de  acordo  com  a  teoria da maturação. O CD57 em células NK parece estar mais associado a estágios finais de  maturação das células e não ao quadro não‐funcional da senescência propriamente dita. Em  células NK, o CD57 é um marcador de células mais maduras, e podem ter sido submetidas a  mais  divisões,  resultante  de  respostas  a  patógenos  e  citocinas  (63).  Tendo  isso  em  vista,  é  possível que o aumento da expressão de CD57 observado em pacientes com endometriose  73    seja resultante da estimulação constante de células NK por células endometriais ectópicas e  os produtos liberados por elas.   De acordo com Lopez – Vergès et al. (2010), as células NK CD57+ parecem proliferar  menos  e  apresentam  maior  eficiência  na  citólise  induzida  por  CD16.  Para  eles,  as  células  CD57+  seriam  células  mais  especializadas,  com  menor  produção  de  citocinas,  porém  mais  eficientes  na  lise  de  células  alvo  (63).  É  curioso  termos  encontrado  um  aumento  na  frequência  de  células  NK  CD57+  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  visto  que  é  descrita  menor  capacidade  citotóxica  de  células  NK  nessas  pacientes  (64).  A  hipótese  que  sugerimos então, é que apesar de estar tendo estimulação antigênica excessiva pelas células  endometriais  ectópicas,  o  que  faz  as  células  se  dividirem  mais  e  expressarem  CD57,  é  possível  que,  por  algum  motivo,  o  reconhecimento  dessas  células  pelas  células  NK  esteja  deficiente. A investigação de receptores inibitórios e seus ligantes em células NK e no tecido  endometrial  poderia  esclarecer  se  a  capacidade  de  reconhecimento  está  reduzida  nas  pacientes  com  endometriose.  Ainda,  é  possível  que  o  microambiente  peritoneal  esteja  contribuindo para a redução no reconhecimento de células NK.  As diversas populações de células NK aqui estudadas parecem ter níveis de ativação  semelhantes, indicados aqui pela expressão de CD161.   A  presença  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC),  até  o  momento,  não  foi  investigada em pacientes com endometriose. As MDSC compõem um grupo heterogêneo de  células,  e  por  tal  razão,  sua  caracterização  baseada  em  marcadores  expressos  em  sua  superfície se torna bastante complexa. Por isso, iniciamos a investigação de MDSC de quatro  fenótipos:  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+,  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+CD34+,  Lin1‐HLA‐DR‐ CD11b+CD33+C15+  e  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+CD34+CD15+.  A  frequência  de  células  CD11b+CD33+C15+  e  CD11b+CD33+CD34+CD15+  foi  extremamente  baixa  nas  amostras  das  pacientes incluídas nesse estudo e não foram comprovadas diferenças entre os grupos (EDT  versus CTRL ou I/II e III/IV versus CTRL), ou entre amostras estudadas (sangue versus FP em  cada  grupo).  Por  esta  razão,  focamos  na  avaliação  de  MDSC  CD11b+CD33+e  CD11b+CD33+CD34+.   Os  dados  mostram  que  ambas  as  populações  são  mais  frequentes  em  amostras  de  sangue  de  pacientes  com  endometriose  do  que  de  controles  (Figura  14)  e  que,  principalmente para as MDSC CD11b+CD33+  há tendência a menor frequência de células no  FP  de  pacientes  com  endometriose  que  controles.  Conforme  citado  anteriormente,  em  74    pacientes com diversos tipos de tumores, há um aumento de frequência de MDSC no sangue  e também no ambiente tumoral. A maior frequência de MDSC no sangue de pacientes com  endometriose (particularmente da população CD11b+CD33+CD34+) indica maior produção de  células  imaturas  pela  medula  óssea.  No  entanto,  esperávamos  encontrar  um  aumento,  também no FP dessas pacientes, e não uma tendência à diminuição na frequência de células.  Uma  hipótese  a  ser  levantada  a  partir  das  observações  do  FP  é  que,  assim  como  ocorre  em  tumores  sólidos,  e  assim  como  o  que  foi  sugerido  para  Treg,  as  células  MDSC  podem ter sido recrutadas para o local da lesão e terem infiltrado o(s) tecido(s). Assim, sua  frequência  não  estaria  aumentada  no  microambiente  (FP).  Entretanto,  para  chegar  a  tal  conclusão,  há  necessidade  de  investigação  das  populações  celulares  infiltrantes  nas  lesões  endometriais, em paralelo às amostras de fluido peritoneal e de sangue das pacientes.  Assim como o que ocorre com as células Treg, as MDSC parecem ser mais frequentes  em  amostras  de  sangue  de  pacientes  do  grupo  I/II  do  que  de  III/IV  e  CTRL.  Em  tumores  sólidos,  a  frequência  de  MDSC  tende  a  aumentar  conforme  o  estágio  da  doença,  tanto  no  sangue quanto no próprio tumor. Vale ressaltar, no entanto, que os estágios I, II, III e IV de  endometriose  não  são  progressivos,  ou  seja,  uma  paciente  com  endometriose  I  não  necessariamente  evolui  para  o  estágio  II,  e  assim  por  diante.  Apesar  dos  estágios  III/IV  estarem geralmente associados com quadros mais graves de doença, existem pacientes com  endometriose  severa  que  sequer  sentem  dor  ou  apresentam  sintomas,  infertilidade  ou  qualquer  manifestação.  Com  isso,  surge  a  hipótese  que  estes  sejam  tipos  diferentes  de  endometriose, com manifestações clínicas, cirúrgicas e até mesmo imunológicas distintas. É  possível  que  a  endometriose  I/II  seja  um  tipo  mais  inflamatório,  e  por  este  ou  outros  motivos, induza maior produção de MDSC.  Ainda,  considerando  a  hipótese  de  que  as  MDSC  estejam  infiltrando  nas  lesões  endometrióticas e por isso não tem frequência aumentada no FP, podemos considerar que  se as pacientes do grupo III/IV apresentam menor frequência de células no FP, é possível que  nestas  pacientes,  as  células  poderiam  estar  infiltrando  mais  nas  lesões.  Neste  cenário,  a  endometriose  estaria  induzindo  a  produção  de  MDSC  na  medula  óssea,  o  que  faria  sua  frequência  aumentar  no  sangue,  e  estas  células  seriam  recrutadas  para  o  microambiente  peritoneal.  Nesse  local,  as  MDSC  de  pacientes  com  endometriose  moderada/grave  infiltrariam a lesão com mais facilidade, possivelmente atraídas por mais estímulos que em  pacientes  com  endometriose  mínima/leve,  o  que  poderia  explicar  a  menor  frequência  75    dessas no FP. A maior frequência de MDSC no FP de pacientes do grupo I/II poderia indicar  que estas células foram atraídas para o local, porém ainda não infiltraram a lesão.  Ainda, a frequência de células dendríticas (DC) foi avaliada nessa coorte de pacientes.  Três  fenótipos  foram  escolhidos  para  a  caracterização  de  DC:  um  fenótipo  mais  geral,  Lin‐ HLA‐DR+, um fenótipo que seleciona DC mieloides (mDC), Lin‐HLA‐DR+CD33+, e um fenótipo  pouco  utilizado  para  DC,  que  investiga  a  expressão  de  CD11b  nas  mDC,  o  Lin‐HLA‐ DR+CD33+CD11b+ e Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b‐.  A subdivisão de DC em humanos nas diversas subpopulações ainda não está clara na  literatura. De um modo geral, as DC do sangue são classificadas como DC mieloides (mDC),  Lin‐HLA‐DR+CD11c+,  e  plasmocitóides  (pDC),  Lin‐HLA‐DR+CD11c‐,  devido  a  diferenças  na  origem, expressão de marcadores e funções dessas células. As mDC são a maioria das DC no  sangue  e  tecidos  linfoides  e  não  linfoides  e  podem  ser  subdivididas,  ainda,  em  diversas  subpopulações (45).   Embora  não  seja  usual  na  caracterização  de  DC,  seria  lógico  supor  que  mDC  tem  a  expressão  de  marcadores  que  indiquem  sua  origem  mieloide,  como  o  CD33.  Inclusive,  diversos relatos indicam que as DC CD11c+HLA‐DR+ comumente utilizadas em experimentos,  sejam estas DC isoladas do sangue ou derivadas de monócitos, são de fato CD33+ (46‐48).   Dessa  forma,  analisamos  a  frequência  geral  de  DC  e  a  frequência  de  mDC  em  pacientes com endometriose. Em nosso estudo, a frequência de DC mostrou‐se aumentada  no sangue de pacientes com endometriose, comparadas às controles (Figura 18). Em todos  os grupos, a frequência de DC foi maior no FP do que no sangue. Em concordância com esses  dados,  a  razão  entre  a  frequência  de  células  no  FP  pela  frequência  de  células  no  sangue  também foi menor em pacientes com endometriose.  Apesar  de  não  termos  encontrado  diferenças  significativas  na  frequência  dessas  células  no  FP  entre  os  grupos,  há  uma  tendência  à  redução  na  frequência  de  DC  em  pacientes com EDT (comparadas com controles), principalmente no grupo I/II (Figura 18B).   Ao analisarmos a porção de DC CD33+, também não vemos diferenças entre amostras  de pacientes com endometriose e controles. Assim como o que ocorre para as DC gerais, a  frequência  de  mDC  parece  ser  maior  em  amostras  de  FP  do  que  em  amostras  de  sangue  (Figura 19).  Dentre as mDC, foi possível observar uma população CD11b+ e uma CD11b‐. É comum  a exclusão do CD11b das análises de DC, principalmente a fim de excluir contaminações por  76    monócitos  da  população  de  DC.  No  entanto,  já  foi  mostrado  que  o  CD11b  é  expresso  em  diversas  populações  de  DC  (65).  Patterson  et  al.  (2005)  mostra  que  até  50%  das  DC  do  sangue  (Lin‐DR+CD1c+CD11c+)  são  CD11b+,  e  esse  número  aumenta  em  cultura  com  IL‐4  e  GM‐CSF  (66).  Esse  grupo  isolou,  a  partir  de  DC  CD1c+  do  sangue,  duas  populações  fenotipicamente  semelhantes,  uma  CD11b+  e  outra  CD11b‐.  Após  cultura  com  estímulos  inespecíficos (IL‐4 e GM‐CSF), a população CD11b‐ passou a expressar altos níveis de MHC II  e  moléculas  co‐estimuladoras  (CD80,  CD83  e  CD86),  sendo  portanto  chamadas  de  células  maduras.  As  células  CD11b+,  no  entanto,  passaram  a  expressar  CD1a  e  DC‐SIGN,  permaneceram negativas para CD80 e CD83, tem baixa expressão de CD86 e eram negativas  para CCR7, indicando que não estão maduras para migrar para linfonodos. As células CD11b+  apresentaram níveis de endocitose superiores ao das células CD11b‐, outro indicativo de que  estas células são de fato imaturas. Trata‐se de uma população de DC imaturas, distintas de  monócitos ou precursores de células de Langerhans e DC dérmicas (66).   Apesar de não utilizarmos marcadores mais específicos de DC nesse trabalho, como  CD11c  e  CD1c,  é  possível  que  as  DC  CD33+CD11b+  aqui  encontradas  sejam  a  população  imatura citada por Patterson e colaboradores (2005) (66).  Em nossas amostras, uma média de 95% das DC CD33+ do sangue são CD11b‐. No FP,  essa frequência cai para menos de 30%, sendo mais de 70% das células CD11b+ (Figura 20).  Considerando  a  hipótese  de  que  as  DC  CD11b+  seriam  células  imaturas,  é  possível   propor  que  no  FP  há  um  acúmulo  de  DC  imaturas,  enquanto  no  sangue,  predominem  as  DC  maduras.  Comparando‐se  amostras  de  pacientes  com  endometriose  com  amostras  de  controles, no entanto, vemos menor frequência de células CD11b+ no FP de pacientes com  endometriose. Além disso, apesar de não haver diferenças significantes, há uma tendência a  maior  frequência  de  CD11b‐  no  FP  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  controles (Figura 21). Em outras palavras, no FP de pacientes com endometriose, há menos  DC imaturas (CD11b+) e mais DC maduras (CD11b‐), quando comparadas com controles.  Há  apenas  um  relato  na  literatura  que  investiga  a  presença  de  DC  em  amostras  de  pacientes com endometriose (13). Nesse estudo, os autores avaliam o estado de maturação  de DC no endométrio tópico e ectópico de pacientes com endometriose, através da análise  dos  marcadores  CD1a  e  CD83  por  imunohistoquímica.  Os  dados  mostram  que  há  mais  DC  imaturas (CD1a+) e menos células maduras (CD83+) nas lesões endometrióticas e endométrio  eutópico  de  pacientes  com  endometriose.  Apesar  da  aparente  contradição  dos  presentes  77    achados, vale citar que, assim como citado para células Treg e MDSC, a frequência de células  no  FP  não  necessariamente  reflete  a  frequência  de  células  nas  lesões.  Desse  modo,  é  possível que mais DC imaturas (CD1a+) estejam infiltrando as lesões, o que poderia significar  redução de sua frequência no FP. Ainda, vale lembrar que o CD1a é um marcador presente  em  DC  dérmicas  e  LC.  Dessa  forma,  é  possível  que  as  DC  descritas  por  (13)  sejam  DC  teciduais.   Estudos  recentes  abordaram  a  importância  de  DC  na  endometriose  por  meio  da  depleção  destas  em  um  modelo  murino  da  doença.  Os  trabalhos,  no  entanto,  mostram  resultados contrastantes. De acordo com Pencovich et al. (2013) a depleção de DC CD11c+  levou a lesões endometrióticas menores, o que indica que o desenvolvimento das lesões é  dependente  de  DC  (67).  Para  eles,  as  DC  promoveriam  vascularização  e  crescimento  das  lesões. Já o trabalho de Stanic et al. (2014) (68) mostra que ao depletar DC, utilizando um  modelo  semelhante  ao  de  Pencovich  et  al.  (2013)  (67),  as  lesões  endometrióticas  são  maiores. O grupo mostra, ainda, que sem DC, a expressão de CD69 diminui nos LT, e conclui  que  as  DC  seriam  responsáveis  por  ativar  LT  e  impedir  a  formação,  ou  crescimento,  das  lesões.  Seja qual for o papel das DC na endometriose, é indiscutível que sua participação é  essencial  para  o  resultado  final  da  doença.  Estudos  posteriores  focando  as  diferentes  subpopulações  de  DC  e  moléculas  co‐estimuladoras  deverão  ser  feitos  em  pacientes  com  endometriose para estabelecer a função destas no desenvolvimento da doença.  Além  da  avaliação  das  populações  celulares,  a  análise  das  citocinas  presentes  no  microambiente  é  um  indicativo  do  seu  perfil  anti  e  pró‐inflamatório,  e  reflexo  das  células  presentes  nesse  local.  Uma  condição  com  perfil  direcionado  para  citocinas  inflamatórias,  com  a  presença  de  IL‐12,  IFN‐γ,  IL‐2  e  TNF‐α,  por  exemplo,  poderia  indicar  uma  resposta  imune  efetora  aguda,  com  recrutamento  e  ativação  de  células  da  circulação  e  tecidos  adjacentes, além da tentativa de eliminação do agente agressor. Se a eliminação do agente  agressor  não  for  efetiva,  as  células  recrutadas  e  ativadas  no  ambiente  podem  ser  responsáveis  por  causar  danos  teciduais.  Já  em  uma  condição  onde  a  concentração  de  citocinas  anti‐inflamatórias,  como  TGF‐β  e  IL‐10,  está  aumentada  em  relação  às  citocinas  pró‐inflamatórias, poderia indicar que está ocorrendo supressão da resposta imune efetora.   Nesse estudo, foi possível dosar efetivamente apenas a concentração de IL‐12(p70),  TGF‐β1  e  IL‐6;  o  restante  das  citocinas  estavam  abaixo  dos  níveis  de  detecção  do  método  78    utilizado.  Foi  possível  quantificar  os  níveis  de  IL‐2,  IL‐4,  TNF‐α,  IFN‐γ  e  IL‐10  apenas  em  alguns  indivíduos  (tabela  7);  no  restante  das  amostras,  a  concentração  dessas  citocinas  estava abaixo dos limites mínimos de detecção do CBA.     No presente estudo, as frequências de IL‐6, TGF‐β1 e IL‐12 foram semelhantes entre  as  amostras  analisadas.  A  concentração  de  IL‐12,  no  entanto,  parece  estar  diminuída  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose  I/II,  comparadas  com  o  grupo  CTRL  (Figura  17D).  Esse  mesmo  padrão  é  observado  nos  grupos  EDT  e  III/IV,  apesar  do  resultado  não  atingir  significância  estatística.  A  IL‐12  é  uma  citocina  liberada  por  principalmente  por  DC  e  macrófagos  e  ativa  células  NK  e  LT  do  tipo  Th1.  A  redução  na  concentração  de  IL‐12  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose  poderia  indicar  defeitos  na  ativação  de  células  imunes  efetoras,  como  macrófagos,  células  NK  e  LT,  por  sua  vez  contribuindo  para  a  permanência de lesões endometrióticas em locais ectópicos.  Em  uma  doença  onde  antígenos  endometriais  viáveis  escapam  a  imunovigilância,  é  provável que alterações em populações de células imunorreguladoras, como as populações  aqui  estudadas,  estejam  ligadas  à  patogênese  e  progressão  da  doença.  Os  resultados  aqui  mostrados  sugerem  que  populações  imunorreguladoras  estão  alteradas  em  pacientes  com  endometriose. A maior frequência de células Treg, MDSC e DC no sangue de pacientes com  endometriose (comparadas com controles) indica que o quadro gerado pela endometriose  esteja induzindo maior produção dessas células em pacientes com a doença que indivíduos  controle. Ainda, a regulação aqui sugerida parece ser a nível sistêmico e não local, visto que  os  níveis  dessas  populações  não  estão  aumentados  no  FP  das  pacientes.  A  investigação  dessas  populações  celulares  nas  lesões  de  endometriose  é  extremamente  importante  na  tentativa  de  entender  se  a  reduzida  frequência  dessas  células  em  amostras  de  FP  é  mascarada pela infiltração das células nas lesões ou se estas células simplesmente não estão  sendo recrutadas para o microambiente.  79    6          CONCLUSÕES    Em  uma  doença  onde  antígenos  endometriais  viáveis  escapam  a  imunovigilância,  é  provável que alterações em populações de células imunorreguladoras, como as populações  aqui estudadas, estejam ligadas à patogênese e progressão da doença.  Nossos  dados  sustentam  a  hipótese inicial  de  que antígenos  endometriais  viáveis  escapam  a  imunovigilância   em  parte  devido  a  alterações  em  populações  de  células  imunorreguladoras,  como  as  populações  de  Treg,  MDSC  e  DC aqui  estudadas,  e  que  estas  estejam ligadas à patogênese e progressão da doença.  Entre os achados, destacam‐se:    ‐  Há  maior  frequência  de  Treg,  MDSC  e  DC  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas com controles;     ‐ No FP, há uma tendência à redução da frequência de Treg, MDSC e DC em pacientes com  endometriose;     ‐  Não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  das  populações  de  células  NK  entre  pacientes com endometriose e controles, tanto no sangue quanto no FP;    ‐  As  células  NK  de  amostras  de  sangue  de  pacientes  com  endometriose  possuem  maior  expressão  do  antígeno  CD57  em  sua  superfície  do  que  controles,  o  que  pode  estar  relacionado a células em estágio final de maturação;       ‐   A  concentração  de  IL‐12  foi  reduzida  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose  versus  controles;  não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  IL‐6  e  TGF‐β  entre  as  amostras de pacientes com EDT e controles;     ‐  Não  foi  possível  quantificar  as  citocinas  IL‐2,  IL‐4,  IL‐10,  IFN‐γ,  TNF‐α  no  sangue  e  FP  de  pacientes  com  EDT  e  controles,  devido  aos  níveis  destas  estarem  abaixo  dos  níveis  detectáveis pelo kit.  80    REFERÊNCIAS*    1.  Kyama  CM,  Debrock  S,  Mwenda  JM,  D'Hooghe  TM.  Potential  involvement  of  the  immune system in the development of endometriosis. Reprod Biol Endocrinol. 2003;1:123.    2.  Giudice LC, Kao LC. Endometriosis. Lancet. 2004;364(9447):1789‐99.    3.  Bellelis P, Dias JA, Jr., Podgaec S, Gonzales M, Baracat EC, Abrao MS. Epidemiological  and  clinical   aspects  of  pelvic  endometriosis‐a  case  series.  Rev  Assoc  Med  Bras.  2010;56(4):467‐71.    4.  Kennedy S, Bergqvist A, Chapron C, D'Hooghe T, Dunselman G, Greb R, et al. ESHRE  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Fase do ciclo  EAD DPA  Disp.  profunda  EAD  AIC  EAD  AUC  EAD  Dismeno.  Infert.  Estágio  ASRM  1  43  21  Secretora  4  4  6  0  8  não  I  2  26  19  Secretora  4  7  4  0  8  ST  II  3  35  24  ND  6  6  7  2  9  ST  IV  4  38  27  Secretora  0  4  4  0  8  2ª  IV  5  41  21  Secretora  0  0  0  0  0  ST  II  6  29  31  Secretora  6  7  7  0  9  1ª  III  7  51  27  Proliferativa 0  0  0  0  5  ST  I  8  37  27   Secretora  3  3  0  0  5  não  III  9  43  23  ND  7  ?  7  0  8  ST  IV  10  29  22  Proliferativa 0  8  9  3  10  1ª  IV  11  40  22  Proliferativa 8  7  0  0  9  não   IV  12  36  21  Secretora  7  0  0  0  10  1ª  II  13  37  30  Proliferativa 6  5  5  0  8  1ª   II  14  37  27  Secretora  0  0  0  0  9  ST  I  15  44  24  Proliferativa 0  7  0  0  0  1ª  IV  16  32  ND  IV  17  36  22  Secretora  0  0  0  0  7  1ª  III  18  38  21  Proliferativa  0  8  0  0  4  1ª  III  19  40  23  Proliferativa  0  0  0  0  3  ST  IV  IMC  =  Índice  de  Massa  Corpórea,  Fase  secretora:  1º  ao  13  dia  do  ciclo,  Fase  Proliferativa:  15°  ao  30º.  EAD:  Escala  Analógica  de  Dor  (leve=0‐2;  moderada=3‐7;  intensa=8‐10),  DPA:  dor  pélvia  acíclica,  disp.  profunda:  dispareunia  profunda,  AIC:  alterações  intestinais  cíclicas,  AUC:  alterações  urinárias  cíclicas,  Infert:  infertilidade,  1ª:  infertilidade  primária,  2ª:  infertilidade  secundária,  ST:  sem  tentativa  de  engravidar,  ND:  não  disponível,  ASRM:  Sociedade  Americana para Medicina Reprodutiva.  87    Tabela A2 – Local das lesões nas pacientes com endometriose incluídas nesse estudo.  Paciente  Local da Doença  Peritônio  Ovário  Trompa  Bexiga  Ureter  Retossig.  Retrocervical  Vagina  Apêndice  Fundo  de saco Reto  1  X  X  X   2  X  X  X  X  3  X  X  X  4  X  X  X  X  5  X  X  6  X  X  X  X  X  7  X  X  8  X  9  X  X   X  X  X  10  X   X   X  X   X  11  X  X   X   x  X  X  12  X   X   X  X  13  X  X  14  X  15  X  X   X   X  X  16  X  X   X   X  X  X  17  X  X   18  X  X   X  X  X  19  X   X   X  X  X  X  X   Retossig=retossigmóide.  88    Tabela A3 ‐ Frequências de populações de linfócitos estudadas no sangue de pacientes com endometriose  estágios I/II e III/IV.  Sangue   I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR)  LT   10 ± 11  7,34 (2 ‐ 20)  3,4 ± 3  3 (0,63 ‐ 5,76)  LT CD4+  6,36 ± 7,17  4,2 (1,26 ‐ 12,2)  1,7 ± 1,64  0,82 (0,39 ‐ 3,19)  CD4+ em CD3  59 ± 9,7  60 (55 ‐ 65)  51 ± 15,7  51 (47 ‐ 63)  CD4+CD25+  25 ± 10  18 (6 ‐ 22)  22 ± 21  14 (9 ‐ 23)  CD4+CD25high  2,8 ± 2,7  1,9 (0,9 ‐ 4,5)  3,8 ± 5  2,6 (1 ‐ 3,7)  Treg em CD3  1,4 ± 1,6  0,87 (0,37 ‐ 2,29)  0,56 ± 0,65  0,31 (0,18 ‐ 0,92)  Treg em CD4  2,16 ± 2,21  1,36 (0,6 ‐ 3,65)  1,16 ± 1,07  0,65 (0,31 ‐ 1,95)  Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador.       Tabela A4 ‐ Frequência de populações de linfócitos estudadas no fluido peritoneal de pacientes com  endometriose estágios I/II e III/IV.  Fluido peritoneal  I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  LT   8 ± 12,4  1,5 (0,28 ‐ 16,52)  3,1 ± 4,2  1,38 (0,28 ‐ 6,17)  LT CD4+  1,94 ± 2,58  0,43 (0,13 ‐ 5,62)  0,67 ± 0,75  0,5 (0,07 ‐ 1,3)  CD4+ em CD3  32 ± 13  29 (24 ‐ 34)  27 ± 9  26 (22 ‐ 32)  CD4+CD25+  5,9 ± 4,7  4,8 (3,2 ‐ 7,8)  5,7 ± 3,4  5,1 (2,4 ‐ 9,3)  CD4+CD25high  1 ± 0,92  0,97 (0,07 ‐ 1,68)  1 ± 0,8  0,96 (0,3 ‐ 1,3)  Treg em CD3  0,06 ± 0,08  0,04 (0,002 ‐ 0,11)  0,07 ± 0,08  0,06 (0 ‐ 0,11)  Treg em CD4  0,16 ± 0,15  0,14 (0,009 ‐ 0,32)  0,22 ± 0,22  0,26 (0 ‐ 0,36)  Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador.      CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD45 CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD45   Figura A1 ‐ Frequência de células CD45+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil. I/II – endometriose mínima/leve (n=7); III/IV = endometriose moderada/grave (n=12);   n.s. = não  significativa, pelo teste t de Student não‐pareado.    A  B  89    CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 sangue FP n.s. n.s.** % CD45   Figura A2 – Comparação entre a frequência de células CD45+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  –  endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste t  de Student pareado.      CTRL EDT I/II III/IV 0 5 10 15 20 25 30 35 n.s. n.s. n.s. % CD3+ CTRL EDT I/II III/IV 0 5 10 15 20 25 30 35 n.s. n.s. n.s. % CD3+   Figura A3 ‐  Frequência de células CD3+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes  com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). As células CD3+  foram calculadas como porcentagem  de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  t  de  Student não‐pareado.  CTRL EDT I/II III/IV 0 5 10 15 20 25 30 35 sangue FP n.s. n.s.n.s.n.s. % CD3+   Figura A4 ‐ Comparação entre a frequência de células CD3+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD3+  foram  calculadas  como  porcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II –  endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste t de Student pareado.      A  B  90    CTRL EDT I/II III/IV 0 5 10 15 20 n.s. n.s. n.s. % CD4+ CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 6 n.s. n.s. n.s. % CD4+   Figura A5 ‐  Frequência de células CD4+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes  com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). As células CD4+  foram calculadas como porcentagem  de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  t  de  Student não‐pareado ou teste de Mann‐Whitney, quando apropriado.      CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 10 15 20 sangue FP n.s. n.s.** % CD4+   Figura A6 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas  como  porcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II –  endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  *p<0,05  e  n.s.  =  não  significativa, pelo teste t de Student pareado ou teste de Wilcoxon, quando apropriado.    CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 n.s. n.s. n.s. % CD4+ em CD3+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 n.s. n.s. n.s. % CD4+ em CD3+   Figura  A7 ‐   Frequência  de  células  CD4+  em  LT  de  amostras  de  sangue  (A)  e  fluido  peritoneal  (FP)  (B)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas  como  porcentagem de células dentre as células CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II –  endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste t de Student não‐pareado.  A  B  A  B  91      CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 sangue FP ** **** * * % CD4+ em CD3+   Figura A8 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue e fluido peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas  como porcentagem de células dentre as células CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil.  I/II – endometriose mínima/leve (n=7); III/IV = endometriose moderada/grave (n=12); *p<0,05, ** p<0,01, ***  p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.      Tabela A5 ‐ Comparação entre a razão de células Treg encontradas no FP pela frequência destas no sangue de  pacientes com endometriose e controles.  Razão FP:sangue  CTRL  EDT  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p  Treg (CD3+)  2,99 ± 6,17  0,6 (0,14 ‐ 4,62)  0,15 ± 0,27  0,01 (0 ‐ 0,18)  p=0,0171  Treg (CD4+)  2,42 ± 3,25  1,25 (0,61 ‐ 3,94)  0,21 ± 0,35  0,017 (0 ‐ 0,35)  p=0,0053  Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR  = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador.      Tabela A6 – Razão entre a frequência de linfócitos T reguladores em amostras de FP pela frequência de  células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV.  Razão FP: sangue  I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR)  Treg em CD3  0,08 ± 0,09  0,07 (0,003 ‐ 0,18)  0,17 ± 0,32  0,01 (0 ‐ 0,27)  Treg em CD4  0,13 ± 0,18  0,016 (0,005 ‐ 0,31)  0,2 ± 0,4  0,009 (0 ‐ 0,44)  Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  FP  =  fluido  peritoneal,  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, Treg = linfócito T regulador.                                92    Tabela A7 ‐ Frequências de populações de células NK no sangue de pacientes com endometriose I/II e III/IV.  Sangue   I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  CD56brightCD16‐  2,06 ± 0,66  2,11 (1,57 ‐ 2,47)  2,34 ± 1,74  1,98 (0,75 ‐ 3,4)  CD56brightCD16+  1,06 ± 0,37  0,88 (0,76 ‐ 1,56)  1,13 ± 1,49  0,68 (0,55 ‐ 0,86)  CD56lowCD16+  28,8 ± 13,6  32,8 (19,5 ‐ 42,5)  24,5 ± 19,3  16,5 (9,6 ‐ 43,5)  CD56brightCD16‐CD57+  33,5 ± 30,5  39,3 (1,4 ‐ 22,9)  27,1 ± 22,6  29,2 (4,9 ‐ 47,6)  CD56brightCD16+CD57+  47,9 ± 17,9  48 (37,6 ‐ 63,6)  47,5 ± 20,5  49,9 (32 ‐ 57,9)  CD56lowCD16+CD57+  47,4 ± 16,8  49 (31 ‐ 63)  56 ± 21,9  60 (45 ‐ 73)  CD56brightCD16‐CD161+  59,5 ± 33,4  63,3 (33,4 ‐ 91,3)  52 ± 24  49,5 (31,4 ‐ 75)  CD56brightCD16+CD161+  78 ± 19  78 (57 ‐ 100)  66 ± 28  71 (50 ‐ 92)  CD56lowCD16+CD161+  74,6 ± 28,2  89,6 (45,7 ‐ 96,3)  59 ± 34,7  65,5 (26,4 ‐ 91,3)  Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.       Tabela A8 ‐ Frequências de populações de células NK no fluido peritoneal de pacientes com endometriose  I/II e III/IV.  Fluido Peritoneal   I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  CD56brightCD16‐  7 ± 6,2  4,8 (2,3 ‐ 12,3)  11,6 ± 16,3  4,2 (1,1 ‐ 19,5)  CD56brightCD16+  0,32 ± 0,36  0,19 (0,04 ‐ 0,49)  0,67 ± 1,13  0,18 (0,09 ‐ 1,04)  CD56lowCD16+  7 ± 5,9  5,3 (0,86 ‐ 10,86)  12,2 ± 12,1  8,6 (2,3 ‐ 22,7)  CD56brightCD16‐CD57+  27,8 ± 23,6  20 (6,4 ‐ 55,5)  23,3 ± 27,3  11,5 (1,6 ‐ 46,5)  CD56brightCD16+CD57+  59,8 ± 36,1  55,5 (35,3 ‐ 100)  37,8 ± 32,7  32,2 (3 ‐60)  CD56lowCD16+CD57+  50,9 ± 26,7  62,6 (16,4 ‐ 66)  47,8 ± 26,1  51,5 (25,5 ‐ 65,7)  CD56brightCD16‐CD161+  54,3 ± 33,3  42,8 (36,7 ‐ 84,2)  67,9 ± 26,1  74,3 (55,5 ‐ 89)  CD56brightCD16+CD161+  42 ± 43  44 (0 ‐ 87)  66 ± 37  81 (38 ‐ 99)  CD56lowCD16+CD161+  64,3 ± 34,8  86,9 (31,9 ‐ 91)  66,1 ± 31,3  81,9 (40,1 ‐ 86,1)  Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.        93    CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 6 7 n.s. n.s. n.s. % CD56bright CD16- CTRL EDT I/II III/IV 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60 n.s. n.s. n.s. % CD56bright CD16- CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 10 35 40 n.s. n.s. n.s. % CD56brightCD16+ CTRL EDT I/II III/IV 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 3.5 4.0 n.s. n.s. n.s. % CD56bright CD16+ CTRL EDT I/II III/IV 0 10 20 30 40 50 60 70 n.s. n.s. n.s. % CD56low CD16+ CTRL EDT I/II III/IV 0 10 20 30 40 n.s. n.s. n.s. % CD56low CD16+   Figura  A9 ‐   Frequência  de  populações  de  células  Natural  killer  (NK)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal (FP) de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio  I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐ em amostras de sangue  dos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK   CD56brightCD16‐  em  amostras  de  FP  dos  diferentes  grupos;  (C)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (D)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  em  amostras  de  FP  dos  diferentes  grupos;  (E)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56lowCD16+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes grupos; (F) Comparação da frequência de células NK CD56lowCD16+ em amostras de FP dos diferentes  grupos. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student  não pareado.    A  B  C  D  E  F  94    CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 *** * ** % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD57+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD57+   Figura  A10 ‐  Frequência  de  populações  de  células  Natural  killer  (NK)  positivas  para  CD57  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐ CD57+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK   CD56brightCD16‐ CD57+  em amostras de FP dos diferentes grupos; (C) Comparação da frequência de células NK  CD56brightCD16+ CD57+ em amostras de sangue dos diferentes grupos; (D) Comparação da frequência de células  NK CD56brightCD16+ CD57+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (E) Comparação da frequência de células  NK  CD56lowCD16+  CD57+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (F)  Comparação  da  frequência  de  células NK CD56lowCD16+ CD57+  em amostras de FP dos diferentes grupos. Dados mostrados como mediana e  intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student   não  pareado.  A  B  C  D  E  F  95    CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD161+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD161+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD161+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD161+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD161+ CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 n.s. n.s. n.s. % CD161+   Figura A11 ‐  Frequência de populações de células Natural killer (NK) positivas para CD161 em amostras de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐ CD161+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK   CD56brightCD16‐ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (C) Comparação da frequência de células NK  CD56brightCD16+  CD161+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (D)  Comparação  da  frequência  de  células NK CD56brightCD16+ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (E) Comparação da frequência de  células NK CD56lowCD16+ CD161+ em amostras de sangue dos diferentes grupos; (F) Comparação da frequência  de células NK CD56lowCD16+ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos. Dados mostrados como mediana  e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado.              A  B  C  D  E  F  96    Tabela A9 ‐ Comparação entre a razão de células NK encontradas no FP pela frequência destas no  sangue de pacientes com endometriose e controles.  Razão FP:sangue  CTRL  EDT  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p  CD56brightCD16‐  10,3 ± 12,6   4,39 (1,65 ‐ 16,6)  6,1 ± 9,5   2,57 (1,05 ‐ 7,35)  p=0,2536 CD56brightCD16+  0,89 ± 1,57   0,31 (0,03 ‐ 0,97)  0,91 ± 1,61   0,22 (0,04 ‐ 0,71)  p=0,9834 CD56lowCD16+  5,3 ± 12,1   0,51 (0,26 ‐ 3,71)  4,2 ± 16,4   0,31 (0,05 ‐ 0,7)  p=0,2536 CD56brightCD16‐CD57+  8,1 ± 26,7   0,38 (0,02 ‐ 3,07)  2,7 ± 6,3   0,52 (0,09 ‐ 1,06)  p=8101  CD56brightCD16+CD57+  1,26 ± 1,57   0,71 (0 ‐ 2,35)  1,07 ± 0,77   1,17 (0,31 ‐ 1,67)  p=0,6660 CD56lowCD16+CD57+  126 ± 355   0,78 (0,51 ‐ 1,02)  5,3 ± 19,1   0,93 (0,51 ‐ 1,25)  p=0,4257 CD56brightCD16‐CD161+ 1,16 ± 0,54   1,2 (0,95 ‐ 1,59)  2,08 ± 3,28   1,08 (0,97 ‐ 1,78)  p=0,6515 CD56brightCD16+CD161+ 2,3 ± 3, 4  0,89 (0 ‐ 5,38)  1,13 ± 1,43  0,91 (0 ‐ 1)  p=0,2164 CD56lowCD16+CD161+  185 ± 519   1 (0,85 ‐ 5,35)  8,4 ± 24,2  0,96 (0,54 ‐ 1,36)  p=0,5239 Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR  = intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t de Student não pareado/Mann Whitney.    Tabela A10 ‐ Razão entre a frequência de populações de células NK em amostras de FP pela frequência  de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV.  Razão FP:sangue   I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  CD56brightCD16‐  3,37 ± 2,53  3,08 (1,05 ‐ 5,81)  7,7 ± 11,6  2,43 (0,81 ‐ 11,34)  CD56brightCD16+  0,37 ± 0,49  0,2 (0,04 ‐ 0,55)  1,2 ± 1,9  0,28 (0,03 ‐ 2,12)  CD56lowCD16+  0,36 ± 0,49  0,22 (0,04 ‐ 0,39)  6,5 ± 20,7  0,56 (0,08 ‐ 0,73)  CD56brightCD16‐CD57+  1,64 ± 2,33  0,74 (0,16 ‐ 3)  11,8 ± 33,5  0,3 (0,005 ‐ 4,47)  CD56brightCD16+CD57+  1,4 ± 0,78  1,47 (1,04 ‐ 2,24)  0,87 ± 0,72  0,86 0,07 ‐ 1,43)  CD56lowCD16+CD57+  1,26 ± 0,93  1,15 (0,51 ‐ 1,89)  7,77 ± 24  0,9 (0,49 ‐ 1,08)  CD56brightCD16‐CD161+  2,75 ± 5,3  0,97 (0,44 ‐ 1,27)  1,69 ± 1,37  1,11 (1,06 ‐ 2,12)  CD56brightCD16+CD161+  0,52 ± 0,49  0,87 (0 ‐ 0,91)  1,48 ± 1,68  0,96 (0,6 ‐ 1,76)  CD56lowCD16+CD161+  1,19 ± 1,08  0,9 (0,54 ‐ 1,2)  12,7 ± 30  1 (0,62 ‐ 4,37)  Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.     97    CTRL EDT I/II III/IV 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 10 30 50 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 30 50 70 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue   Figura A12 – Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐ (A), CD56brightCD16+ (B) e  CD56lowCD16+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e  frequência  de  células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). Dados mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose  moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.    A  B  C  98    CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 10 15 20 100 110 120 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue CTRL EDT I/II III/IV 0 20 40 60 80 100 1000 1005 1010 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue   Figura A13 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD57+ (A), CD56brightCD16+  CD57+ (B) e CD56lowCD16+ CD57+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de células no sangue de controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subdivididos  em  estágio  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.    A  B  C  99    CTRL EDT I/II III/IV 0 1 2 3 4 5 10 15 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue CTRL EDT I/II III/IV 0 2 4 6 8 10 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue CTRL EDT I/II III/IV 0 50 100 150 1000 1500 n.s. n.s. n.s. Razão FP:sangue   Figura A14 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD161+ (A), CD56brightCD16+  CD161+ (B) e CD56lowCD16+CD161+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de células no sangue de controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subdivididos  em  estágio  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.        Tabela A11 ‐ Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de pacientes  com endometriose I/II e III/IV.  I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR)  CD11b+CD33+ (sangue)  0,29 ± 0,17  0,24 (0,18 ‐ 0,52) 0,2 ± 0,2  0,17 (0,01 ‐ 0,36) CD11b+CD33+CD34+ (sangue)  0,17 ± 0,11  0,17 (0,11 ‐ 0,22) 0,12 ± 0,15  0,07 (0,01 ‐ 0,17) CD11b+CD33+  (FP)  0,18 ± 0,13  0,16 (0,06 ‐ 0,31) 0,06 ± 0,05  0,03 (0,02 ‐ 0,1)  CD11b+CD33+CD34+  (FP)  0,1 ± 0,08  0,09 (0,04 ‐ 0,18) 0,02 ± 0,03  0,02 (0 ‐ 0,04)  Valores apresentados como frequência de células (%). I/II = endometriose mínima/leve, III/IV= endometriose  moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal.                    A  B  C  100    Tabela A12 ‐ Frequências de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com  endometriose estágios I/II e III/IV.  I/II  III/IV  População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR)  DC   (sangue)  0,34 ± 0,27  0,21 (0,12 ‐ 0,44)  0,77 ± 1,45  0,39 (0,22 ‐ 0,44)  DC   (FP)  3,6 ± 5,8  0,18 (0,06 ‐ 9,94)  5,7 ± 5,2  6,8 (0,12 ‐ 10,2)  DC CD33+    (sangue)  36,8 ± 47,8  23,3 (10,1 ‐ 64,6)  27,7 ± 38,5  39,4 (8,5 ‐ 91,6)  DC CD33+    (FP)  63 ± 30,2  68,8 (28 ‐ 93,6)  56 ± 42  79,9 (0 ‐ 87,2)  DC CD33+CD11b+   (sangue)  1,35 ± 1,41  1,07 (0 ‐ 2,75)  1,93 ± 2,78  0,93 (0,51 ‐ 1,3)  DC CD33+CD11b+   (FP)  39,7 ± 31,2  37,6 (15 ‐ 63,9)  44,6 ± 38,2  54,9 (0 ‐ 73,8)  DC CD33+CD11b‐   (sangue)  35,5 ± 26,8  21,1 (10,1 ‐ 61,9)  45,9 ± 38,2  36,3 (7,8 ‐ 90,6)  DC CD33+CD11b‐   (FP)  23,4 ± 23,2  11,9 (7,59 ‐ 33,9) 16,4 ± 20,9  9,3 (0 ‐ 26,4)  Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave, DC = célula dendrítica, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal.