{"paper_id":"88b5938f-091a-44af-aab2-58d1a074666c","body_text":"CARINA CALIXTO JANK \n \n \n \n \n \n \n \nPapel de células com função reguladora da resposta imune na endometriose \n \n \n \n \n \n \nDissertação apresentada ao Programa de Pós -\nGraduação em Imunologia do Instituto de Ciências \nBiomédicas da Universidade de São Paulo, para \nobtenção de Título de Mestre em Ciências. \n \n \n \n \n \n \nSão Paulo \n2014 \n\n \n \nCarina Calixto Jank \n \n \n \n \n \n \nPapel de células com função reguladora da resposta imune na endometriose \n \n \n \n \n \n \nDissertação apresentada ao Programa de Pós -\nGraduação em Imunologia do Instituto de \nCiências B iomédicas da Universidade de São \nPaulo, para obtenção de Título de Mestre em \nCiências. \n \nÁrea de concentração: Imunologia \n \nOrientador: Dr. Luiz Vicente Rizzo \n \nVersão original \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSão Paulo \n2014 \n \n\nDADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) \nServiço de Biblioteca e Informação Biomédica do \nInstituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo \n© reprodução total \n \nJank, Carina Calixto. \n    Papel de células com função reguladora da resposta imune na \nendometriose  /  Carina Calixto Jank. -- São Paulo, 2014. \n \n    Orientador: Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo. \n \n    Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo. Instituto de \nCiências Biomédicas. Departamento de Imunologia. Área de \nconcentração: Imunologia. Linha de pesquisa: Imunologia da \nendometriose. \n \n    Versão do título para o inglês: Role of cells with regulatory function of \nthe immune response in endometriosis. \n \n1. Endometriose   2. Resposta imune   3. Célula T reguladora   4. \nCélula natural killer   5. Célula supressora mielóide    6. Célula \ndendrítica    \nI. Rizzo, Prof. Dr. Luiz Vicente   II. Universidade de São Paulo. Instituto \nde Ciências Biomedicas   III. Título. \n \n \n \n    ICB/SBIB054/2014 \n \n\n UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \n INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS \n_____________________________________________________________________________________________________________ \nCandidato(a): Carina Calixto Jank. \nTítulo da Dissertação: Papel de células com função reguladora da resposta imune  \n na endometriose. \nOrientador(a): Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo. \n A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, \n em sessão pública realizada a .............../................./................., considerou \n (  ) Aprovado(a)                (  ) Reprovado(a)  \nExaminador(a): Assinatura: ............................................................................................ \n Nome: ................................................................................................... \n Instituição: ............................................................................................. \nExaminador(a): Assinatura: ............................................................................................ \n Nome: ................................................................................................... \n Instituição: ............................................................................................. \nPresidente: Assinatura: ............................................................................................ \n Nome: .................................................................................................. \n Instituição: ............................................................................................. \n\n\n\n\n\n\n\n \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nÀ minha família, de sangue e de escolha. \n\n \n \nAGRADECIMENTOS \n \n\"Quem  caminha  sozinho  pode  até  chegar  mais  rápido,  mas  aquele  que  vai  acompanhado, \ncom certeza vai mais longe.\" \nGostaria  de  agradecer  primeiramente  a  meus  pais,  por  terem  sempre  me  incentivado  a \nseguir  meus  sonhos,  e  aos  meus  irmãos,  a  melhor  família  que  eu  poderia  pedir.  Amor \nincondicional,  apoio  inquestionável.  Tudo  em  minha  vida  é  reflexo  do  que  vocês  me \nensinaram. Agradeço também à minha avó, a Dona Dolly, que permitiu que eu invadisse sua \nvida ao longo desses anos, e facilitou todo o processo o máximo possível.  \n Ao  meu  noivo,  Danillo.  Não  é  qualquer  um  que  estaria  disposto  a  morar  a  mais  de  mil \nquilômetros de distância da namorada por três anos. Colocar o sonho de outra pessoa acima \nde  sua  própria  felicidade  é  algo  que  só  quem  ama  de  verdade  sabe  fazer.  Sem  o  seu \nincentivo, nada disso seria possível. Só você sabe realmente o quanto esse período foi difícil. \nEra  para  você  que  eu  ligava  quando  nada  mais  fazia  sentido.  Longe  da  minha  zona  de \nconforto,  o  crescimento  pessoal  e  profissional  é  inegável.  Mas,  com  toda  escolha,  temos \nrenúncias. Jamais achei que seria tão difícil, mas estou extremamente feliz por ter passado \npor  tudo  que  passei.  E  mais  feliz  ainda  por  ter  tido  seu  apoio  incondicional  ao  longo  do \ncaminho. \nAos queridos amigos, os de longe e os de perto, os antigos e os novos. \nAo  Professor  Luiz  Vicente  Rizzo,  meu  orientador,  muito  obrigada  pelo  voto  de  confiança. \nQuando me apaixonei pela Imunologia, ainda na faculdade em Campo Grande, pesquisei os \nprincipais orientadores e linhas de pesquisa que eu gostaria de trabalhar. O senhor foi um \ndos únicos a me responder, e com certeza o mais simpático. Admiro muito a sua inteligência \ne ética profissional e sou extremamente grata pela oportunidade de ter trabalhado contigo.  \nÀ querida amiga, Eliana Marengo, um anjo em minha vida. Sua ajuda foi imprescindível para \na execução desse trabalho. Você é extremamente eficiente e competente, e aprendi lições \nque  levarei  para  sempre.  Te  admiro  muito!   Espero  que  se  algum  dia  eu  tiver  alunos,  eu \npossa ser como você, sempre tão dedicada e disposta a ajudar. \nAo “grupo do Rizzo”, amigos que tive o privilégio de conhecer. Andressa, Pedro, Karina, Luiz \ne agora Ana Eduarda, com certeza o melhor grupo de pesquisa que já trabalhei. Mais do que \ncolegas, verdadeiros amigos, que respeito e tenho um carinho muito grande. Obrigada pelas \ndiscussões  imunológicas  e  não‐imunológicas.  O  mestrado  foi  muito  mais  divertido  com \nvocês. Sentirei falta do contato diário!  \nUm obrigada especial à Dra Karina Salmazi, um exemplo de profissional e uma pessoa muito \nquerida.  Adorei  a  oportunidade  de  ter  trabalhado  com  você.  Muito  obrigada  por  todas  as \ndúvidas tiradas e as risadas diárias. Para mim, você é um exemplo de como cientistas devem \nser;  sempre  ansiosa  a  aprender  coisas  novas,  independente  do  título  ou  posição.  Mais \n\n \n \nimportante ainda, sempre disposta a ensinar e compartilhar o que aprendeu. Apenas assim a \nciência evolui. \nAos  demais  colegas  do  Instituto  de  Ensino  e  Pesquisa  do  Hospital  Albert  Einstein.  Muito \nobrigada  por  terem  alegrado  o  meu  dia‐a‐dia  durante  todo  esse  tempo.  Obrigada  pelos \ncafezinhos no meio da  tarde, os bolos e lanches diários, as risadas e palavras de conforto. \nVocês são demais! \nMuito  obrigada  aos  professores  do  Departamento  de  Imunologia  pelos  ensinamentos.  Ser \nprofessor é um verdadeiro dom. São pessoas como vocês, que dedicam a vida para ensinar \njovens  alunos  a  acreditarem  em  si  mesmos  e  superarem  suas  dificuldades,  que  instigam \ncuriosidade e vontade de buscar sempre mais. Só assim o avanço da humanidade torna‐se \npossível. \nAgradeço  também  aos  novos  amigos  do  Instituto  de  Ciências  Biomédicas  que  tive  a \noportunidade de conhecer. Um obrigada especial à Bianca e à Karina, amizades verdadeiras \nque levarei por toda a vida. Nem consigo começar a descrever o carinho que sinto por vocês. \nMuito obrigada por tudo.  \nMuito  obrigada  aos  membros  da  banca  de  qualificação  pelas  sugestões  para  o  trabalho  e \npara os membros da banca de defesa por terem aceitado o convite. \nObrigada  à  Fundação  de  Apoio  à  Pesquisa  do  Estado  de  São  Paulo,  a  Fapesp,  pelo  apoio \nfinanceiro. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Estamos  na  situação  de  uma  criancinha  que  entra  em  uma  imensa \nbiblioteca,  repleta  de  livros  em  muitas  línguas.  A  criança  sabe  que \nalguém  deve  ter  escrito  aqueles  livros,  mas  não  sabe  como.  Não \ncompreende  as  línguas  em  que  foram  escritos.  Tem  uma  pálida \nsuspeita  de  que  a  disposição  dos \nlivros  obedece  a  uma  ordem \nmisteriosa, mas não sabe qual ela é.”  \nAlbert Einstein \n\n \n \nRESUMO \n \nJank  CC.  Papel  de  células  com  função  reguladora  da  resposta  imune  na  endometriose. \n[dissertação  (Mestrado  em  Imunologia)].  São  Paulo:  Instituto  de  Ciências  Biomédicas, \nUniversidade de São Paulo; 2014. \n \nA  endometriose  (EDT)  é  uma  doença  crônica  que  afeta  mulheres  em  idade  reprodutiva, \ncaracterizada  pela  presença  de  tecido  endometrial  ectópico  (fora  da  cavidade  uterina).  A \norigem da doença é desconhecida, entretanto, presume‐se que a EDT é multifatorial. Várias \nalterações  na  função  do  sistema  imune  foram  reportadas  em  pacientes  com  EDT. \nPostulamos que alterações na frequência de células T reguladoras (Treg), natural killer (NK), \nsupressoras  mieloides  (MDSC)  e  dendríticas  (DC)  no  peritônio  justificariam  a  redução  na \ncapacidade  do  sistema  imune  de  reagir  contra  as  células  endometriais,  permitindo  sua \nimplantação e permanência em locais ectópicos. O objetivo deste estudo foi quantificar as \ncélulas Treg, NK, MDSC e DC no fluido peritoneal (FP) e sangue de mulheres com EDT (n=19) e \ncontroles  (CTRL,  n=8),  a  fim  de  associa‐las  ao  desenvolvimento  da  doença.  Os  níveis  de \ncitocinas pró e anti‐inflamatórias também foram avaliados. Os resultados mostram aumento \nna frequência de Treg, MDSC e DC no sangue e aparente redução destas no FP de pacientes \ncom EDT, comparadas com CTRL.  No FP, a população de DC CD11b+  está aumentada, e há \ntendência  à  diminuição  de  DC  CD11b‐  dessas  pacientes.  Quanto  à  analise  de  citocinas, \nobservou‐se apenas diferença entre os grupos para a citocina IL‐12, a qual está reduzida no \nsangue de pacientes do grupo EDT comparadas com CTRL. Não foram observadas diferenças \nquanto  às  células  NK  e  as  outras  citocinas  analisadas.  Os  resultados  indicam  aumento  da \nfrequência de populações reguladoras em amostras de sangue de pacientes EDT, entretanto \nesses resultados não são refletidos no FP.   \nPalavras‐chave: Endometriose. Resposta imune. Células T reguladoras. Células natural killer. \nCélulas supressoras mieloides. Células dendríticas. \n\n \n \nABSTRACT \n \nJank  CC.  Role  of  cells  with  regulatory  function  of  the  immune  system  in  endometriosis. \n[Masters thesis (Immunology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de \nSão Paulo; 2014. \nEndometriosis (EDT) is a gynecological disease characterized by the presence of endometrial \ncells  out  of  the  uterine  cavity.  Its  origin  is  unknown,  although  it  is  thought  that  EDT  is  a \nmultifactorial disease. Functional alterations in immune cells in patients with EDT have been \ndescribed.  In  this  study,  we  postulated  that  alterations  in  the  frequencies  of  regulatory  T \ncells  (Treg),  natural  killer  cells  (NK),  myeloid‐derived  suppressor  cells  (MDSC)  and  dendritic \ncells  (DC)  in  the  peritoneum  could  justify  the  reduced  capacity  of  the  immune  system  to \nreact  to  these  ectopic  endometrial  cells,  allowing  them  to  invade  distant  tissues.  Our  aim \nwas to quantify Treg, NK, MDSC and DC populations in the peritoneal fluid (PF) and peripheral \nblood  (PB)  in  women  with  endometriosis  (EDT,  n=19)  and  control  (CTRL,  n=8),  in  order  to \nassociate  these  cellular  population  to  the  development  of  the  disease.  Pro  and  anti‐\ninflammatory cytokine levels were also assessed. The results indicate higher frequencies of \nTreg, MDSC and DC in the PB and an apparent reduction in the frequency of these cells in the \nPF of patients with EDT, compared to CTRL. In the PF, the CD11b+ DC population is increased, \nand there seems to be a tendency to reduction of the CD11b‐ portion of DC in these patients. \nThe  cytokine  analysis  indicated  a  reduction  in  the  concentration  of  IL‐12  in  PB  of  patients \nwith EDT. No differences were found comparing the results of NK cell populations and the \nother cytokines evaluated between EDT and CTRL groups. The results indicate an increase in \nthe  frequency  of  regulatory  cell  populations  in  PB  samples  from  EDT  patients;  however, \nthese results are not reflected in PF samples. \nKeywords: Endometriosis. Immune response. Regulatory T cells. Natural killer cells. Myeloid‐\nderived suppressor cells. Dendritic cells. \n\n \n \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1 ‐ Estratégia de análise de células T reguladoras (Treg)............................................... 39  \nFigura 2 ‐ Frequência de células T CD4+ ativadas em amostras de sangue e fluido peritoneal \n(FP) de pacientes com endometriose e controles .................................................................. 41 \nFigura 3 ‐  Frequência de células T CD4+CD25high em amostras de sangue e fluido peritoneal \n(FP) de pacientes com endometriose e controles .................................................................. 42 \nFigura  4 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido \nperitoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles ................................................ 43 \nFigura  5 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido \nperitoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles ................................................ 44 \nFigura 6 ‐ Razão entre a frequência de células T reguladoras (Treg) em amostras de sangue e a \nfrequência  dessas  em  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com \nendometriose (EDT, n=19), divididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12 )..............................44 \nFigura 7 ‐ Intensidade de fluorescência média (MFI) do fator de transcrição Foxp3 em células \nTreg  de  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  e \ncontroles ................................................................................................................................ 45 \nFigura 8 ‐ Estratégia de análise de populações de células natural killer (NK)..........................46 \nFigura  9 ‐   Frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e \nCD56lowCD16+  em  amostras  de  sangue  (A)  e  fluido  peritoneal  (B)  de  pacientes  com \nendometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................................................... 48  \nFigura  10 ‐   Comparação  da  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐  (A), \nCD56brightCD16+ (B) ou CD56lowCD16+ (C) entre amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de \npacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) .......................................49 \nFigura  11 ‐   Frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e \nCD56lowCD16+ positivas para os marcadores CD57 e CD161 em amostras de sangue (A e B) e \nfluido  peritoneal  (C  e  D)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL, \nn=8)......................................................................................................................................... 50 \nFigura 12 ‐ Comparação da frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐  (A e B), \nCD56brightCD16+ (C e D) e CD56lowCD16+  (E e F) positivas para os marcadores CD57 e CD161 \nentre  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT, \nn=19) e controles (CTRL, n=8) ................................................................................................ 51 \nFigura 13 – Estratégia de análise de células supressoras mieloides (MDSC) ......................... 53 \n\n \n \nFigura  14 ‐   Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e \nCD11b+CD33+CD34+   (B)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com \nendometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................................................... 54 \nFigura  15 ‐   Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  e \nCD11b+CD33+CD34+  em amostras de sangue (A e B) e fluido peritoneal (C e D) de pacientes \ncom  endometriose  subagrupados  em  estágio  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12)  e  controles  (CTRL, \nn=8)......................................................................................................................................... 55 \nFigura  16 ‐   Comparação  da  frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC) \nCD11b+CD33+ (A) e CD11b+CD33+CD34+ (B) entre amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) \nde pacientes com endometriose (EDT, n=19), divididas em estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), e \ncontroles (CTRL, n=8) ............................................................................................................. 56 \nFigura 17 ‐ Estratégia de análise para avaliação de células dendríticas (DC) ........................ 57 \nFigura 18 ‐ Frequência de células dendríticas (DC) em amostras de sangue e fluido peritoneal \n(FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas em estágios I/II (n=7) e III/IV \n(n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) .................................................................... 59 \nFigura 19 ‐ Frequência de células dendríticas CD33+ (mDC) em amostras de sangue e fluido \nperitoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas em estágios I/II \n(n=7) e III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) ................................................ 60 \nFigura 20 ‐ Distribuição de células CD11b+ e CD11b‐ em células dendríticas CD33+ do sangue e \nfluido peritoneal (FP) das pacientes incluídas nesse estudo .................................................. 61 \nFigura 21 ‐ Frequência de células dendríticas (DC) CD33+ CD11b+ e CD11b‐ em amostras de \nsangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas \nem estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) ...................... 62 \nFigura  22 ‐   Concentração  de  IL‐6,  TGF‐b  e  IL‐12  no  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de \npacientes  com  endometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e  III/IV,  e  controles \n(CTRL)...................................................................................................................................... 65 \nFigura  23 ‐   Comparação  entre  a  concentração  de  TGF‐β  (A)  e  IL‐12  (B)  em  amostras  de \nsangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT), \nsubagrupadas em estágios I/II e III/IV .................................................................................... 66 \nFigura A1 ‐ Frequência de células CD45+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) \n(B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 88 \nFigura  A2  –  Comparação  entre  a  frequência  de  células  CD45+  em  amostras  de  sangue  e \nfluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL, \nn=8)......................................................................................................................................... 89 \n \n\n \n \nFigura A3 ‐ Frequência de células CD3+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) \n(B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 89 \nFigura A4 ‐ Comparação entre a frequência de células CD3+ em amostras de sangue e fluido \nperitoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=18/19) e controles (CTRL, n=7)......89 \nFigura A5 ‐ Frequência de células CD4+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) \n(B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 90 \nFigura A6 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em amostras de sangue e fluido \nperitoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) .......... 90 \nFigura A7 ‐ Frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue (A) e fluido peritoneal \n(FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ...................... 90 \nFigura A8 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue e \nfluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL, \nn=8)......................................................................................................................................... 91 \nFigura A9 ‐ Frequência de populações de células Natural killer (NK) em amostras de sangue e \nfluido peritoneal (FP) de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), \nsubdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ................................................................... 93 \nFigura A10 ‐ Frequência de populações de células Natural killer (NK) positivas para CD57 em \namostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com \nendometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ....................... 94 \nFigura  A11 ‐   Frequência  de  populações  de  células  Natural  killer  (NK)  positivas  para  CD161 \nem  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com \nendometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ....................... 95 \nFigura  A12  –  Razão  entre  a  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐  (A), \nCD56brightCD16+  (B)  e  CD56lowCD16+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e  frequência  de  células  no \nsangue de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em \nestágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) .............................................................................................. 97 \nFigura A13 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD57+ (A), \nCD56brightCD16+ CD57+ (B) e CD56lowCD16+ CD57+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de \ncélulas  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), \nsubdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ................................................................... 98 \nFigura  A14 ‐   Razão  entre  a  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐CD161+ \n(A),  CD56brightCD16+  CD161+  (B)  e  CD56lowCD16+  CD161+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e \nfrequência  de  células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose \n(EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ............................................... 99 \n\n \n \nLISTA DE TABELAS \n \nTabela  1  – Painel  de  anticorpos  utilizados  para  caracterização  das  populações  celulares  de \ninteresse Treg, NK e MDSC e DC .............................................................................................. 34 \nTabela  2 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  linfócitos  estudadas  no \nsangue de pacientes com endometriose e controles ............................................................. 40 \nTabela  3 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  linfócitos  estudadas  no \nfluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles ............................................. 40 \nTabela  4 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no \nsangue de pacientes com endometriose e controles ............................................................. 47 \nTabela  5 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no \nfluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles ............................................. 47 \nTabela  6 ‐   Frequências  de  células  supressoras  mieloides  no  sangue  e  fluido  peritoneal  de \npacientes com endometriose e controles .............................................................................. 54 \nTabela 7 ‐ Comparação da frequência de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de \npacientes com endometriose e controles .............................................................................. 58 \nTabela  8 ‐   Avaliação  de  citocinas  no  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com \nendometriose, divididas em estágios I/II e III/IV, e controles ................................................ 63 \nTabela  A1  –  Características  clínicas  das  pacientes  com  endometriose  incluídas  no \nestudo..................................................................................................................................... 86 \nTabela A2 – Local das lesões nas pacientes com endometriose incluídas nesse estudo........ 87 \nTabela A3 ‐ Frequências de populações de linfócitos estudadas no sangue de pacientes com \nendometriose estágios I/II e III/IV .......................................................................................... 88 \nTabela  A4 ‐   Frequência  de  populações  de  linfócitos  estudadas  no  fluido  peritoneal  de \npacientes  com  endometriose  estágios  I/II  e \nIII/IV......................................................................................................................................... 88 \nTabela  A5 ‐   Comparação  entre  a  razão  de  células  Treg  encontradas  no  FP  pela  frequência \ndestas no sangue de pacientes com endometriose e controles..............................................91 \n\n \n \nTabela  A6  –  Razão  entre  a  frequência  de  linfócitos  T  reguladores  em  amostras  de  FP  pela \nfrequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV .........91 \nTabela  A7  ‐  Frequências  de  populações  de  células  NK  no  sangue  de  pacientes  com \nendometriose I/II e III/IV ........................................................................................................ 92 \nTabela A8 ‐ Frequências de populações de células NK no fluido peritoneal de pacientes com \nendometriose I/II e III/IV ........................................................................................................ 92 \nTabela  A9 ‐   Comparação  entre  a  razão  de  células  NK  encontradas  no  FP  pela  frequência \ndestas no sangue de pacientes com endometriose e controles ............................................ 96 \nTabela A10 ‐ Razão entre a frequência de populações de células NK em amostras de FP pela \nfrequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV......... 96 \nTabela A11 ‐  Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de \npacientes com endometriose I/II e III/IV ................................................................................ 99 \nTabela A12 ‐  Frequências de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes \ncom endometriose estágios I/II e III/IV ................................................................................ 100 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \nLISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS \n \nAng‐2 – angiopoietina 2 \nAPC – aloficocianina \nAPC – célula apresentadora de antígeno \nAPC‐H7 ‐ aloficocianina H7 \nARG1 – arginase 1 \nASRM – Sociedade Americana para Medicina Reprodutiva \nBD – Becton Dickison \nCA‐125 – antígeno associado ao câncer 125 \nCAAE – certificado de apresentação para apreciação ética \nCAPPesq ‐ Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa  \nCBA – cytometric bead array \nCCR7 – receptor de quimiocina do tipo C‐C \nCD – cluster of differentiation  ‐ agrupamento de diferenciação \nCTLA‐4 – antígeno 4 de linfócito T citotóxico \nCTRL – controle \nDC‐ célula dendrítica \ndNK – natural killer decidual \nDP – desvio padrão \nEDT – endometriose \nELISA – ensaio imunossorvente ligado à enzima \nFACS – citometria de fluxo \nFITC ‐ isotiocianato de fluoresceína \nFMUSP – Faculdade de Medicina da USP \nFoxp3 ‐ forkhead box factor p3 \nFP – fluido peritoneal \nG‐CSF – fator estimulador de colônia de granulócitos \nHLA‐DR – antígeno leucocitário humano \nHRP – horseradish peroxidase \nIFN‐γ – interferon gamma \nIL – interleucina \niNOS – óxido nítrico sintase induzido \n\n \n \nIQR – intervalo interquartil \nLB – linfócito B \nLC – célula de Langerhans \nLT – linfócito T \nmDC – célula dendrítica mieloide \nMDSC – célula supressora mieloide \nMFI – intensidade de fluorescência média \nµg/mL – microgramas por mililitro \nMMP – metaloproteinase de matriz \nmRNA – ácido ribonucleico mensageiro \nN ‐ número \nNK – natural killer \nNKT – natural killer T \nNO – óxido nítrico \nPBS – tampão fosfato‐salina \npDC – célula dendrítica plasmocitoide \nPE – ficoeritrina \nPE –Cy7 ‐ ficoeritrina conjugado com cianina 7 \nPE‐CF594 ‐ ficoeritrina conjugada com CF594 \nPerCP‐ Cy 5.5 ‐ peridinina de clorofila combinada com cianina \npg/mL – picogramas por mililitro \nPlGF – fator de crescimento plaquetário \nROS – espécie reativa de oxigênio \nRT‐PCR – PCR em tempo real \nTGF‐β – Fator transformador de crescimento β \nTh – linfócito T auxiliar \nTMB – tetrametilbenzidina \nTNF‐α – fator de necrose tumoral α \nTr1 – célula reguladora do tipo 1 \nTreg – célula T reguladora \nuNK – natural killer uterina \nUSTV – ultrassonografia transvaginal \nVEGF – fator de crescimento vascular endotelial  \n\n \n \nSUMÁRIO \n \n1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 22 \n1.1 Patogênese ...................................................................................................................... 22 \n1.2 Endometriose e o Sistema Imunológico ......................................................................... 23 \n1.2.1 Células T reguladoras ................................................................................................ 25 \n1.2.2 Células Natural Killer (NK) ......................................................................................... 26 \n1.2.3 Células supressoras mieloides ................................................................................... 28 \n1.2.4 Células denríticas ....................................................................................................... 29 \n2 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 31  \n3 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 32 \n3.1  Pacientes ......................................................................................................................... 32 \n3.2  Obtenção e separação de células ................................................................................... 33 \n3.3  Análise dos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo.......................... 33 \n3.4  Marcação intracelular de Foxp3 de células T reguladoras............................................. 34\n3.5  Quantificação de citocinas no plasma e fluido peritoneal............................................. 35 \n3.6  Análises comparativas entre os grupos.......................................................................... 36\n4 RESULTAOS ......................................................................................................................... 37\n4.1  Dados das Pacientes ....................................................................................................... 37 \n4.2  Avaliação de células T reguladoras ................................................................................ 38 \n4.2.1 Análise descritiva das células CD45+, CD3+ e CD4+ no sangue e FP ............................. 40 \n4.2.2 Análise da população de Treg dentre os LT totais e LT auxiliares no sangue e FP ....... 42 \n4.3  Células Natural Killer ...................................................................................................... 45 \n4.4  Células Supressoras Mieloides (MDSC) .......................................................................... 52\n4.5  Análise do perfil de células dendríticas .......................................................................... 56 \n4.6  Quantificação de citocinas pró e anti‐inflamatórias ...................................................... 63\n5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 67 \n6 CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 79  \nREFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 80 \nAPÊNDICE – Tabelas e figuras suplementares ....................................................................... 86  \n \n\n22 \n \n1 INTRODUÇÃO \n \nO termo endometriose (EDT) refere‐se à doença crônica estabelecida pela presença \nde células endometriais fora da cavidade uterina. As células endometriais podem implantar‐\nse em órgãos peritoneais (caracterizando a forma superficial/peritoneal da doença), ovários \n(definida  como  endometriose  ovariana)  ou  infiltrarem  a  área  retrocervical,  parede  vaginal \nposterior,  ureter,  região  retossigmóide  e  bexiga  (endometriose  profunda)  (1,  2).  É  uma \ndoença ginecológica benigna, estrógeno‐dependente, associada à dor pélvica e infertilidade. \nDiferentes  sintomas  são  indicativos  de  endometriose,  porém  nenhum  deles  é \nexclusivo  da  doença.  Os  pacientes  podem  ser  assintomáticos  (2,6%)  ou  apresentarem \nsintomas  como  dismenorréia  (62,2%),  dor  pélvica  crônica  (13,3%),  infertilidade  (14%)  e \ndispareunia  profunda  (2,1%),  além  de  outros  relacionados  à  localização  das  lesões,  como \ndisfunções  urinárias  e  intestinais,  incluindo  dor  e  sangramento  (3).  Outros  sinais  clínicos \nsugestivos de endometriose incluem sensibilidade pélvica, útero retrovertido fixo, frouxidão \ndos ligamentos uterossacrais, espessamento dos ligamentos e presença de nódulos (4). \nAlém disso, existem diferentes estágios de endometriose, e não há correlação desses \ncom a gravidade dos sintomas ou a evolução da doença; assim, acredita‐se que existem tipos \ndiferentes  de  endometriose,  cada  qual  com  sua  etiologia  e  consequências  variadas.  Ainda, \nhá diversidade de quadros clínicos em indivíduos com mesmo estágio de doença. \nDiversas análises são utilizadas para auxiliar no diagnóstico de endometriose, entre elas \nultrassonografia  transvaginal  (USTV),  ressonância  magnética,  testes  sanguíneos  para \nquantificação  de  CA‐125,  laparoscopia  e  exames  histológicos  das  lesões  (4).  Porém,  a \nlaparoscopia  ou  laparotomia  é  considerada  “padrão  ouro”  para  o  diagnóstico  de \nendometriose, onde os possíveis focos de endometriose são retirados e avaliados por exame \nanátomo‐patológico (4).  \n \n1.1 Patogênese \n \nDentre as teorias propostas para a etiopatologia da endometriose, a mais explorada é a \nda menstruação retrógrada. De acordo com essa hipótese, durante a menstruação, células \nendometriais regridem pelas tubas uterinas e implantam‐se na cavidade peritoneal e ovários \n(5).  Curiosamente,  a  menstruação  retrógrada é  extremamente  frequente  em  mulheres  em \n\n23 \n \nidade  reprodutiva  (cerca  de  90%)  (6),  entretanto,  a  doença  estabelece‐se  em  apenas  10% \ndestas (7). Conclui‐se, portanto, que além da ocorrência de menstruação retrógrada, outros \nfatores  que  permitem  a  adesão  e  proliferação  dessas  células  fora  da  cavidade  uterina \ncontribuam  para  a  patogênese  da  endometriose.  Entre  tais  fatores,  alterações  genéticas, \nambientais,  hormonais  e  do  sistema  imune  podem  estar  relacionados  com  o \ndesenvolvimento da doença (8). \nÉ  sugerido  que  o  efluente  menstrual  contenha  fatores  que  induzem  alterações  no \nmesotélio  peritoneal,  e  consequentemente,  proporcionam  sítios  de  aderência  para  as \ncélulas  endometriais  (9)  (10).  Após  a  adesão,  há  proliferação  e  invasão  das  células  no \nperitônio, o que causa lesões e adesões entre os órgãos, resultando em distorção anatômica, \ne, consequentemente, dor. Uma das principais consequências relacionadas à endometriose \né a infertilidade, decorrente principalmente de efeitos tóxicos da reação inflamatória (11). \n \n1.2   Endometriose e o Sistema Imunológico  \n \nA  endometriose  apresenta‐se  como  uma  reação  inflamatória,  com  infiltração  de \nneutrófilos,  eosinófilos,  mastócitos,  macrófagos,  células  dendríticas,  células  natural  killer \n(NK), linfócitos T CD4+ e CD8+ (12‐14). \nNa  endometriose,  são  observados  diversos  níveis  de  comprometimento  das  moléculas \nque participam do sistema imunológico, variando de alterações quantitativas e qualitativas \ndas  células,  citocinas  e  quimiocinas  no  microambiente  intraperitoneal.  Entre  essas \nalterações,  as  células  NK  e  linfócitos  T  CD8+,  que  exercem  papel  fundamental  na \nimunovigilância  e  clearance  de  células,  apresentam  sua  capacidade  citotóxica  bastante \nreduzida  em  pacientes  com  endometriose  comparativamente  às  mulheres  sem  a  doença \n(14). \nAdicionalmente, níveis aumentados de TGF‐β foram observados no fluido peritoneal de \nmulheres com endometriose e estão associados, ao menos parcialmente, à angiogênese (9). \nEssa citocina pode também contribuir para redução da atividade citotóxica de células NK e a \ndiminuição  da  retirada  de  células  endometriais  ectópicas,  além  da  geração  de  células  T \nreguladoras (Treg).  \nQuanto às células dendríticas (dendritic cells ‐ DC), observa‐se decréscimo acentuado no \nnúmero  de  DC  maduras  durante  a  fase  proliferativa  do  ciclo  menstrual,  e  acréscimo \n\n24 \n \nsignificativo  de  DC  imaturas  durante  todas  as  fases  do  ciclo  (13)  no  endométrio  eutópico. \nAlém  disso,  há  aumento  da  freqüência  de  DC  imaturas  no  peritônio,  que  é  indicativo  de \nrecrutamento de células imaturas pelo endométrio ectópico ou pelo ambiente (13), e pode \nresultar na menor frequência de apresentação de antígenos a linfócitos T ou na indução de \ntolerância  imunológica  nessas  células;  isso  poderia  justificar  parcialmente  a  baixa  resposta \ndas células do sistema imune contra células endometriais ectópicas.  \nAinda, foram observados números aumentados de macrófagos no endométrio eutópico \nem  pacientes  com  endometriose  durante  todas  as  fases  do  ciclo  menstrual  (15),  fato  que \ncolabora  com  a  natureza  inflamatória  da  endometriose.  Apesar  do  número  elevado  de \nmacrófagos  nessas  pacientes,  estes  apresentam‐se  com  capacidade  fagocítica  reduzida, \nprejudicando a remoção de células endometriais ectópicas (16). \nNa literatura, os resultados obtidos quanto ao padrão predominante de resposta imune \nem  mulheres  com  endometriose  são  bastante  contraditórios.  Foram  observados  níveis \nelevados de IL‐4 e IL‐10 na circulação sistêmica (17) e no fluido peritoneal de mulheres com \nendometriose  (18).  Apesar  de  altas  concentrações  de  IFN‐γ  também  terem  sido  relatas  no \nfluido peritoneal (18), sugere‐se prevalência de resposta Th2 nessas  pacientes. Entretanto, \nquando  aspectos  clínicos  da  doença  são  relacionados  com  a  produção  de  citocinas,  há \nassociação  da  resposta  Th1  com  a  forma  infiltrativa  da  doença,  refletida  pela  maior \nprodução de TNF‐α e IL‐2 em mulheres com sintomas relacionados à endometriose profunda \n(19). \nCitocinas  inflamatórias  produzidas  por  células  endometriais  podem  contribuir  para  a \nadesão  destas  ao  peritônio.  Macrófagos  peritoneais  estimulam  a  produção  de \nmetaloproteinases de matriz (MMP), a partir da síntese de IL‐1α, IL‐1β e IL‐8 e proporcionam \na invasão de células ectópicas na matriz extracelular  (20). IL‐8 e TNF‐α em combinação com \nTGF‐β  e  fator  de  crescimento  vascular  endotelial  (VEGF)  produzidos  por  macrófagos \nestimulam a angiogênese, permitindo que as células endometriais proliferem e permaneçam \nem local ectópico (21). \nApesar  de  diversas  alterações  funcionais  em  células  do  sistema  imune  terem  sido \nrelatadas  em  pacientes  com  endometriose,  não  está  claro  ainda  quais  fatores  são \nresponsáveis  por  essas  alterações.  O  quadro  geral  da  imunidade  na  endometriose  ainda \nexpõe diversas lacunas, e devido à heterogeneidade da doença, resultados contrastantes são \nrelatados na literatura. \n\n25 \n \nEsse estudo enfoca no estudo das populações de linfócitos T reguladores, células natural \nkiller,  células  supressoras  mieloides  e  células  dendríticas,  a  fim  de  avaliar  o  papel  dessas \npopulações celulares no desenvolvimento da endometriose. \n \n1.2.1 Células T reguladoras \n \nAs  células  T  reguladoras  (Treg)  (22)  são  essenciais  para  a  indução  de  tolerância  de \nlinfócitos autorreativos a antígenos próprios e manutenção da homeostase (23). Compõem 2 \na 5% das células CD4+ em humanos e são desenvolvidas continuamente como uma linhagem \nT comum no timo, constituindo uma subpopulação distinta de outras células T ou timócito \n(24).  São  descritos  dois  subgrupos  de  células  T  reguladoras  (Treg)  que  diferem  entre  si  em \ntermos de especificidade e de mecanismo de ação: i) as Treg naturais que se desenvolvem e \nemergem do timo com função reguladora, e atuam na periferia regulando possíveis reações \nautoimunes  potencialmente  patológicas,  e  ii)  as  Treg  induzidas  (Treg  do  tipo  1 ‐  Tr1,  Th3  e \noutras)  que  se  desenvolvem  como  consequência  da  ativação  de  linfócitos  T  maduros,  em \ncondições específicas de exposição antigênica e sob influência de diferentes citocinas.  \nOs mecanismos reguladores das células Treg incluem a supressão por contato célula a \ncélula,  que  envolve  o  receptor  inibitório  CTLA‐4  e  a  secreção  de  TGF‐β1,  levando  à \ndiminuição da expressão da cadeia α do receptor da IL‐2 nas células T alvo. Sua atividade in \nvivo parece estar associada com a presença de citocinas como IL‐4, IL‐10 e TGF‐β (25). \nApesar  da  importância  das  células  T  reguladoras  na  manutenção  da  homeostase  e \nprevenção  de  doenças  autoimunes,  a  presença  deste  tipo  celular  em  algumas  condições \npode representar um problema. É sugerido que a presença de Treg em infecções parasitárias \ne câncer, esteja relacionada à diminuição da resposta imune protetora (26). \nOs  estudos  até  hoje  publicados  sobre  os  mecanismos  imunológicos  associados  ao \naparecimento de endometriose indicam que o microambiente gerado pela implantação das \ncélulas  endometriais  gere  uma  diminuição  da  resposta  imune  efetora  (13).  Esta  condição \npode  estar  associada  à  presença  de  células  reguladoras  no  peritônio;  nosso  grupo  de \npesquisa observou aumento da frequência de células CD4+CD25+FoxP3+ no fluido peritoneal \nde  pacientes  com  endometriose,  em  comparação  com  mulheres  sem  endometriose  (27), \ncorroborando  estudos  que  reportaram  recrutamento  de  células  Treg  para  o  endométrio  de \nmulheres que desenvolvem endometriose (28). \n\n26 \n \nO fator de transcrição Foxp3 (Forkhead box p3) é um fator de transcrição altamente \nrelacionado  à  células  Treg  e  sua  expressão  está  relacionada  à  função  supressora  dessas \ncélulas. A descoberta da relação desse fator com as células Treg, no entanto, só ocorreu em \n2003 (29). Antes disso, era comum utilizar a co‐expressão de CD4 e CD25 para caracterização \nde uma subpopulação de linfócitos T com potencial ação supressora. O marcador CD25, no \nentanto, não é específico de células Treg: ele compreende a cadeia α do receptor de IL‐2, que \né composto ainda pelas cadeias β (CD122) e γ (CD132). A expressão da cadeia α na superfície \nda célula é induzida pelo fator de transcrição Foxp3 e garante maior afinidade à IL‐2. Sendo \nassim,  células  Treg  possuem  maior  expressão  do  CD25  em  sua  superfície  (CD25high)  do  que \ncélulas T convencionais (CD25+) e utilizam isso como mecanismo de supressão da resposta \nimune  efetora,  visto  que  na  ausência  de  IL‐2  os  linfócitos  T  ativados  não  proliferam.  Um \nlinfócito T ativado também tem expressão de CD25 em sua superfície, portanto, há de se ter \ncautela  ao  utilizar  a  expressão  de  CD25  como  marcador  de  Treg,  buscando  conciliar  a  alta \nexpressão  de  CD25  com  outros  marcadores,  como  o  Foxp3.  Vários  grupos  sugerem  que \ncélulas Treg possuem alta expressão de CD25 e baixa expressão de CD127, e que o conjunto \ndesses  marcadores  diferem  as  populações  de  células  Treg  das  T  convencionais.  Essa  ideia  é \nreforçada pelo achado de que cerca de 90% das células CD25highCD127low são Foxp3+ (30, 31). \nO  fator  de  transcrição  Foxp3  mostra‐se  como  o  marcador  mais  específico  de  células  Treg, \nentretanto,  a  expressão  transiente  de  Foxp3  é  comum  em  células  T  convencionais \nrecentemente  ativadas  (32).  Dessa  forma,  sugerimos  que  o  conjunto  de  marcadores \nCD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+ seja o mais apropriado para a caracterização fenotípica de \ncélulas Treg. \n \n1.2.2 Células Natural Killer (NK) \n \nAs  células  Natural  Killer  (NK)  estão  entre  as  principais  células  do  sistema  imune  de \nvertebrados. Essas células fornecem respostas rápidas para as células infectadas por vírus e \nrespondem à formação de tumores, começando a atuar cerca de três dias após a infecção. \nSendo assim, desempenham importante papel na resposta inata podendo distinguir células \ninfectadas  por  vírus  e  células  neoplásicas  das  células  normais.  As  células  NK  reconhecem \ncélulas  infectadas  ou  estressadas  através  de  um  balanço  de  sinais  obtidos  de  receptores \nativadores e inibidores, o que culmina na liberação de grânulos e lise da célula‐alvo. Após o \n\n27 \n \nsurgimento  do  conceito  de  imunovigilância,  diversos  grupos  tem  dado  atenção  especial  às \ncélulas  NK.  Conforme  citado  anteriormente,  as  células  NK  apresentam  sua  capacidade \ncitotóxica  bastante  reduzida  em  pacientes  com  endometriose  comparativamente  às \nmulheres sem a doença (14). \nAs  células  NK  podem  ser  subdivididas  em  diferentes  populações  baseado  na \nexpressão diferencial de marcadores clássicos de NK, CD56 e CD16. No sangue, mais de 90% \ndas células NK são CD56dimCD16+, as chamadas NK convencionais, porém observa‐se também \noutras células com fenótipo CD56brightCD16+ e CD56brightCD16‐ (33). As células CD56brightCD16‐ \ncompõem apenas 10% das células NK encontradas no sangue, entretanto em alguns tecidos, \ncomo no útero, compreendem 70% das NK, sendo portanto muitas vezes chamadas de NK \nuterinas (uNK) ou NK deciduais (dNK) (34). \nComo  as  células  NK  CD56dimCD16+  constituem  a  grande  maioria  de  células  NK  no \nsangue,  as  outras  populações  de  células  NK  são  pouco  estudadas.  Sugerimos,  no  entanto, \nque estas outras populações de células NK tenham funções importantes no sistema imune. \nDado o acúmulo preferencial de células CD56brightCD16‐  no endométrio, é possível que estas \ncélulas tenham funções não apenas na manutenção da gravidez, mas também em diversas \ndoenças  ginecológicas.  Essa  sugestão  é  baseada  na  observação  de  que  a  frequência  de \ncélulas CD56brightCD16‐   encontra‐se aumentada no endométrio de mulheres grávidas e não \ngrávidas  (35).  No  endométrio  de  mulheres  não  grávidas,  o  número  de  NK  CD56brightCD16‐ \nvaria durante as fases do ciclo menstrual, apresentando‐se em menor frequência no início da \nfase  proliferativa;   após  a  ovulação  essas  células  proliferam,  atingindo  um  pico  no  final  da \nfase secretora (36). \nÉ sugerido que células CD56bright e células CD56dim apresentem funções imunológicas \ndistintas;  as  primeiras estão  envolvidas  com  a regulação  da  resposta  imune  pela produção \nde  citocinas  pró‐inflamatórias  e  as  últimas,  pela  função  citotóxica.  Isso  é  sustentado  por \nexperimentos  que  mostram  maior  capacidade  de  produção  de  TNF‐α  e  IFN‐γ  por  células \nCD56bright  associada  à  diminuição  de  grânulos  citolíticos,  como  perforina  A  e  granzimas, \nquando comparadas com células CD56dim (37). \nAs células NK CD56brightCD16‐  são células produtoras de várias citocinas e fatores de \ncrescimento  que  modulam  a  resposta  imune,  entre  eles  TNF‐α,  IL‐10,  G‐CSF,  IL‐1  e  IFN‐γ \n(38). Expressam, também, altos níveis de mRNA de fatores angiogênicos (VEGF, Ang‐2, PlGF) \nna fase secretória do ciclo menstrual (35). \n\n28 \n \nPouco se sabe a respeito das diferentes populações de células NK nas pacientes com \nendometriose. Visto a importante função de células NK na imunovigilância e alta capacidade \nde  produção  de  citocinas  reguladoras,  mostra‐se  importante  a  investigação  dessas \npopulações em pacientes com endometriose. \n \n1.2.3 Células supressoras mieloides \n \nAs  células  supressoras  mieloides  (myeloid‐derived  suppressor  cells ‐   MDSC) \ncompreendem um grupo heterogêneo de células definidas por sua origem mieloide, estado \nimaturo e capacidade supressora. O principal mecanismo de supressão das MDSC acredita‐\nse  ser  por  produção  de  arginase  e  espécies  reativas  de  oxigênio  e  nitrogênio,  os  quais \nimpedem  a  proliferação  de  linfócitos  T  (39).  As  MDSC  são  amplamente  descritas  em \npacientes com câncer (40). \nEm resposta a estímulo antigênico excessivo, a medula óssea é estimulada a produzir \ncélulas  mieloides  imaturas,  que,  em  indivíduos  sadios,  rapidamente  se  diferenciam  em \ngranulócitos  maduros,  macrófagos  ou  DC.  Em  contrapartida,  em  condições  inflamatórias \npatológicas  (como  doenças  infecciosas,  câncer,  trauma  e  doenças  autoimunes)  ocorre  um \nbloqueio  na  sua  diferenciação  em  células  mieloides  maduras,  o  que  resulta  na  regulação \npositiva  de  fatores  imunossupressores  como  arginase‐1  (ARG1)  e  óxido‐nítrico  sintase \ninduzido  (iNOS),  com  consequente  aumento  na  produção  de  óxido  nítrico  (NO)  e  espécies \nreativas de oxigênio (ROS); este processo culmina na expansão dessas células em seu estado \nimaturo, as chamadas MDSC (41).  \nPor  tratar‐se  de  um  grupo  heterogêneo  de  células,  os  marcadores  fenotípicos \ndescritos  na  literatura  para  caracterizar  as  MDSC  são  bastante  divergentes.  De  um  modo \ngeral, as MDSC podem ser definidas fenotipicamente por expressarem marcadores comuns a \nprogenitores  mieloides  (CD33),  ausência  de  marcadores  linhagem‐específicos  e  que \ncaracterizam células diferenciadas (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56), pela expressão da \nmolécula de adesão CD11b, além de pouca ou nenhuma apresentação de antígenos (baixa \nou nenhuma expressão de HLA‐DR) (39). Sendo assim, de um modo geral, as MDSCs podem \nser definidas pelo fenótipo Lin1‐HLA‐DR‐CD33+CD11b+, além da avaliação de sua capacidade \nsupressora.  Ainda,  por  apresentar  fenótipo  variável,  observa‐se  também  tanto  a  presença \nquanto a ausência de expressão de CD15, CD34 e outros marcadores. \n\n29 \n \nSua  importância,  em  termos  de  função  no  sistema  imune,  vem  ganhando  destaque \nmais recentemente. Foi demonstrado que MDSC suprimem a atividade citotóxica de células \nNK  in  vitro  e  in  vivo,  por  inibição  de  perforinas  e  de  modo  dependente  de  contato  celular \n(42). \nAté  o  momento,  não  existem  na  literatura  estudos  avaliando  a  presença  de  células \nsupressoras mieloides em amostras de sangue, fluido peritoneal ou lesões endometrióticas \nde pacientes com endometriose.  \n \n1.2.4 Células Dendríticas (DC) \n \nAs  células  dendríticas  (DC)  constituem  uma  ponte  entre  a  imunidade  inata  e  a \nimunidade adaptativa; isso porque são consideradas as principais células apresentadoras de \nantígenos  (APC).  As  DC  possuem  longas  projeções,  alta  capacidade  fagocítica  e  estão \nsituadas  nas  principais  portas  de  entrada  de  microrganismos  (pele  e  mucosas  do  trato \nrespiratório e gastrointestinal); por tal razão, são consideradas sentinelas imunológicas. As \nDC captam antígenos protéicos com suas longas projeções e os apresentam aos linfócitos T \n(LT)  nos  linfonodos.  Isso  ocorre,  pois  assim  que  fagocita  um  antígeno,  as  DC  passam  a \nexpressar o CCR7, receptor para quimiocinas produzidas nos linfonodos, o que permite que \nelas  migrem  para  o  linfonodo  mais  próximo  e  entrem  em  contato  com  os  linfócitos.  No \nprocesso de migração até o linfonodo regional, as DC amadurecem e adquirem a expressão \nde  moléculas  co‐estimuladoras  (como  CD80  e  CD86),  tornando‐se  aptas  a  apresentarem  o \nantígeno aos LT. Na ausência desses sinais co‐estimuladores, o LT não é capaz de ser ativado, \ntornando‐se  muitas  vezes  anérgico.  A  apresentação  de  antígenos  com  poucos  sinais \nestimuladores também pode fazer com que o LT se torne uma célula Treg (43, 44). \nAs  DC  são  células  com  alta  expressão  de  moléculas  MHC  de  classe  II,  por  isso  são \ncomumente caracterizadas pela expressão de HLA‐DR. O fenótipo geral para seleção dessas \ncélulas por citometria de fluxo consiste na expressão de HLA‐DR e ausência de expressão de \nmarcadores linhagem específicos (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 e CD56).  \nA subdivisão de DC em humanos nas diversas subpopulações como as descritas em \ncamundongos  ainda  não  está  clara  na  literatura.  De  um  modo  geral,  as  DC  do  sangue  são \nclassificadas como DC mieloides (mDC), Lin‐HLA‐DR+CD11c+, e plasmocitoides (pDC), Lin‐HLA‐\nDR+CD11c‐,  devido  a  diferenças  na  origem,  expressão  de  marcadores  e  funções  dessas \n\n30 \n \ncélulas. As mDC são a maioria das DC no sangue e tecidos linfoides e não linfoides e podem \nser subdivididas, ainda, em diversas subpopulações (45). Um método simples de distinguir a \npopulação  mieloide  da  plasmocitóide  é  pela  utilização  do  CD33,  marcador  encontrado \napenas em populações de origem mieloide (46‐48).  \nA redução na frequência de DC ou na capacidade dessas de apresentar antígenos a LT \npode  ser  um  fator  contribuinte  para  o  desenvolvimento  da  endometriose.  Nesse  estudo, \ntentaremos  estabelecer  uma  relação  entre  a  frequência  de  DC  e  o  desenvolvimento  da \nendometriose. \nTrês fenótipos foram escolhidos para a caracterização de DC nesse estudo: i) Lin‐HLA‐\nDR+, fenótipo mais geral de DC;   ii) Lin‐HLA‐DR+CD33+, fenótipo que seleciona DC mieloides \n(mDC); e iii) Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b+  e Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b‐,   fenótipo que investiga a \nexpressão de CD11b nas mDC, porém pouco utilizado. \nO  marcador  Lin1‐  (BD  Biosciences),  aqui  utilizado  na  caracterização  de  MDSC  e  DC \nconsiste  em  um  conjunto  de  marcadores  linhagem‐específicos  (CD3,  CD14,  CD16,  CD19, \nCD20  e  CD56),  todos  conjugados  a  um  mesmo  fluorocromo.  Ao  utilizar  esse  marcador, \npodemos  excluir  populações  de  LT,  LB,  monócitos  e  células  NK  utilizando  apenas  um \nmarcador (ou seja, ocupando apenas um canal de leitura no citômetro).  \nBaseado nos diversos relatos do desequilíbrio quantitativo e funcional de células imunes \nno  microambiente endometrial  como  fator  contribuinte  da progressão  da  endometriose,  a \nhipótese  aqui  aventada  é  de  que  o  ambiente  peritoneal  de  pacientes  susceptíveis  esteja \nimunorregulado  e  proporcione  a  implantação  e/ou  desenvolvimento  da  endometriose; \nnesse  sentido,  essa  imunorregulação  pode  ser  parcialmente  sustentada  por  populações \ncelulares  de  Treg,  NK,  MDSC  e  DC.  Nesse  estudo,  foi  investigada  a  avaliação  da  frequência \ndessas  populações  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com \nendometriose,  além  da  análise  do  microambiente  peritoneal  no  qual  essas  células  se \nencontram, a partir da produção de citocinas.  \n\n31 \n \n \n2 OBJETIVOS \n \nO  principal  objetivo  deste  trabalho  foi  caracterizar  e  quantificar  as  células  T \nreguladoras  (Treg),  populações  de  células  natural  killer  (NK),  células  supressoras  mieloides \n(MDSC)  e  células  dendríticas  (DC)  no  sangue  e  no  fluido  peritoneal  de  mulheres  com \nendometriose, na tentativa de esclarecer seus papéis na patogênese dessa doença.  \nAlém disso, foi avaliado o microambiente peritoneal no qual essas células se encontram \na partir da produção de citocinas IL‐2, IL‐4, IL‐ 6, IL‐10, IL‐12(p70), IL‐17A, TNF‐α, IFN‐γ e TGF‐\nβ1, em amostras de sangue e fluido peritoneal das pacientes com endometriose. \n \n\n32 \n \n \n3 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS \n \n3.1       Pacientes \n \nAs  pacientes  incluídas  neste  estudo  estão  em  acompanhamento  no  Setor  de \nEndometriose da Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo (FMUSP) ou no Hospital Sírio‐Libanês. A seleção das pacientes foi \nrealizada  sob  a  responsabilidade  dos  médicos  Maurício  Simões  Abrão  e  Sérgio  Podgaec. \nForam  incluídas  no  estudo  mulheres  entre  26  e  51  anos,  com  endometriose  profunda \nconfirmada  por  análise  histopatológica,  ausência  de  doença  autoimune,  inflamatória  ou \ncondição  neoplásica  (confirmado  por  exames  médicos  ou  testes  laboratoriais  quando \nnecessário) e sem uso de terapia hormonal por três meses prévios à cirurgia laparoscópica.  \nNo  grupo  controle,  foram  incluídas  mulheres  entre  32  e  46  anos  submetidas  à \nvideolaparoscopia  principalmente  para  realização  de  laqueadura,  mas  também  para \nrealização  de  outros  procedimentos  ginecológicos  (histerectomia,  ooforectomia  ou \nmiomectomia) ou para diagnóstico de endometriose. Todas as pacientes incluídas no grupo \ncontrole  preencheram  os  mesmos  critérios  de  inclusão  e  exclusão  das  pacientes  com \nendometriose, e tiveram diagnóstico de endometriose descartado durante a laparoscopia. \nForam  coletadas  amostras  do  sangue  e  do  fluido  peritoneal  (FP)  de  cada  paciente \ncom  endometriose  após  o  preenchimento  do  consentimento  informativo  por  escrito.  Na \nadmissão,  as  pacientes  com  endometriose  responderam  a  um  questionário  padrão  onde \nconstam  os  antecedentes  pessoais,  enfocando  principalmente  os  sintomas  comuns \nrelacionados  à  endometriose  e  a  doenças  ginecológicas,  além  de  informações  sobre \nantecedentes familiares.  \nCom  base  nos  achados  cirúrgicos,  as  pacientes  foram  classificadas  em  estágios  de \ngravidade  da  doença  de  acordo  com  as  diretrizes  da  Sociedade  Americana  para  Medicina \nReprodutiva (ASRM) (49) onde o estágio I corresponde à endometriose mínima, o estágio II \nrelativo à endometriose leve, o III, à endometriose moderada e o IV, à endometriose grave. \nNesse  estudo,  as  pacientes  foram  divididas  em  grupos:  a)  pacientes  com  endometriose \nestágios  I  e  II  (I/II)  (n=7),  representando  as  mulheres  com  doença  mínima  e  leve;  e  b) \npacientes  com  endometriose  estágios  III  e  IV  (III/IV)  (n=12),  grupo  que  compreende  as \nmulheres com doença moderada e grave. \n\n33 \n \nO  projeto  foi  aprovado  pelo  Comitê  de  Ética  em  Pesquisa  do  Hospital  Israelita  Albert \nEinstein  nº  11/1711  (CAAE  –  0205.0.028.015‐11),  pelo  Comitê  de  Ética  em  Pesquisa  do \nInstituto  de  Ciências  Biomédicas  da  Universidade  de  São  Paulo  (registrado  na  Plataforma \nBrasil sob CAAE 01461012.2.1001.5467) e pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de \nPesquisa do Hospital das Clínicas da FMUSP (CAPPesq nº 0386/11). \n \n3.2 Obtenção e separação das células  \n \nAs  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  foram  centrifugadas  a  500  x  g  por  cinco \nminutos  em  temperatura  ambiente;  o  sobrenadante  individual  foi  congelado  a ‐ 80ºC  em \nalíquotas para a análise de citocinas. O pellet celular do fluido peritoneal foi ressuspendido \nem  1  mL  de  tampão  de  lise  1X  (BD  FACS  Lysing  Solution)  enquanto  que  para  o  sangue  foi \nutilizada  a  proporção  3:1  (v:v).  As  amostras  foram  incubadas  no  escuro  por  dez  minutos  a \n37°C ou até que a lise total das hemácias fosse observada. Em paralelo, parte das amostras \nfoi reservada para avaliação da viabilidade, com azul de Trypan, e contagem em câmara de \nNeubauer  e  contador  automático  Countess  (Invitrogen);  para  essa  análise,  as  hemácias \nforam  lisadas,  conforme  descritas  acima,  utilizando‐se  tampão  de  lise  de  hemácias  sem \nparaformaldeído (BD Pharm Lyse Lysing Solution). \nA  seguir,  as  amostras  foram  centrifugadas  a  500  x  g  por  cinco  minutos  a  temperatura \nambiente,  e  ao  pellet  celular  foi  adicionado  500  µL  de  Tampão  de  FACS  (tampão  fosfato‐\nsalina (PBS) suplementado com 1% albumina sérica humana e 0,1% azida). As células foram \nnovamente  centrifugadas  (500  x  g,  cinco  minutos,  temperatura  ambiente),  ressuspendidas \nem PBS e utilizadas para as análises descritas a seguir.  \n \n3.3 Análise dos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo \n \nAs células obtidas do sangue e do fluido peritoneal de mulheres com endometriose e \ncontroles foram marcadas com três diferentes painéis de anticorpos, como mostra a Tabela \n1. Para cada um dos painéis, 1 x 106 células por poço foram transferidas para placas fundo V \npara  marcação  com  anticorpos  contra  os  marcadores  de  superfície  celular.  Às  células,  foi \nadicionada  a  solução  contendo  os  anticorpos  dos  respectivos  painéis  (Tabela  1).  Foram \nutilizados, para tanto, anticorpos monoclonais anti‐CD45, CD33, CD34, CD11b, HLA‐DR, Lin1, \n\n34 \n \nCD15,  CD3,  CD4,  CD25,  CD127,  LAP,  CD16,  CD56,  CD57,  CD161  e  CD14  conjugados  com \nfluorocromo  isotiocianato  de  fluoresceína  [FITC],  ficoeritrina  [PE],  aloficocianina  [APC], \nficoeritrina conjugado com cianina 7 [PE‐Cy7], peridinina de clorofila combinada com cianina \n[PerCP‐Cy5.5],  aloficocianina  H7  [APC‐H7]  ou  ficoeritrina  conjugada  com  CF594  [PE‐CF594] \nna  concentração  0,5‐1,0 μ g/106  células,  por  30  minutos  em  temperatura  ambiente,  e  ao \nabrigo da luz. Após incubação, as amostras foram lavadas, ressuspendidas 300 µL de tampão \nde FACS e analisadas em citômetro de fluxo BD LSRFortessa (BD Biosciences). As células do \npainel Treg foram então marcadas com o FoxP3, como descrito a seguir. \n \nTabela  1 ‐   Painel  de  anticorpos  utilizados  para  caracterização  das  populações  celulares  de \ninteresse Treg, NK e MDSC e DC. \nPopulações \ncelulares \n \n \nFluorescências \nFITC  PE  APC  PE‐Cy7 PE‐CF594  APC‐H7  PerCP‐Cy5.5\nTreg \nanticorpo  ‐  FoxP3  CD25  CD3  CD4  CD45  CD127 \nclone  259D/C7  M‐A251  SK7  RPA‐T4  2D1  HIL‐7R‐M21\nNK \nanticorpo  CD3  CD56  CD161  CD16  CD57  CD45  CD14 \nclone  HIT3a  B159  DX12  B73.1  NK‐1  2D1  M5E2 \nMDSC e DC \nanticorpo  Lin1  CD11b  CD34  CD33  CD15  CD45  HLA‐DR \nclone \nNCAM16.2, \nMφP9, \nL27, \nSJ25C1, \n3G8, SK7 \nICRF44  8G12  P67.6  W6D3  2D1  L243 \nTreg = linfócito T regulador; NK = célula natural killer; MDSC = célula supressora mieloide; DC = célula dendrítica. \n \n3.4 Marcação intracelular de Foxp3 de células T reguladoras \n \nPara a marcação de FoxP3, e após  as marcações de superfície celular, as células foram \nfixadas  e  permeabilizadas  com  tampões  apropriados  para  marcação  intracelular  de  FoxP3 \n(Human FoxP3 Staining Kit, BD), conforme instrução do fabricante. Resumidamente, foram \nadicionados  200 μ L  de  Tampão  A  para  fixar  as  células,  e  incubados  por  dez  minutos,  a \ntemperatura ambiente, ao abrigo da luz, e então, as células foram centrifugadas por cinco \nminutos a 500 x g. Em seguida, as células foram permeabilizadas com 200 μL de Tampão C \n(Tampão A + Tampão B – 1:200 v/v) e incubadas por 30 minutos, à temperatura ambiente e \nprotegidas da luz. Após nova centrifugação (cinco minutos, 500 x g), o anticorpo Foxp3 foi \nadicionado ao pellet (0,5‐1,0 μg/106 células) e as células foram novamente incubadas por 30 \n\n35 \n \nminutos, no escuro. Após incubação, as amostras foram lavadas com 200 μL de tampão de \nFACS  e  analisadas  em  citômetro  de  fluxo  BD  LSRFortessa  (BD  Biosciences).  Um  mínimo  de \n500 000 eventos foram adquiridos para cada amostra. \n \n3.5 Quantificação de citocinas no plasma e fluido peritoneal \n \nAmostras  de  plasma  e  do  sobrenadante  obtidas  do  fluido  peritoneal  de  mulheres \ncom  endometriose  foram  aliquotadas  e  armazenadas  a  –80ºC  para  quantificação  de  IL‐\n12(p70)  (BD  OptEIA),  TGF‐β1  (BD  OptEIA)  e  IL‐17A  (BioLegend)  pelo  método  de  ELISA \nsandwich.  Resumidamente,  placas  de  96  poços  com  alta  propriedade  de  ligação  (Nunc \nMaxisorp)  foram  sensibilizadas  com  100 μ L  de  anticorpo  de  captura  diluído  em  tampão \ncarbonato de sódio 0,1 M, pH 9,5 numa concentração de 1:250 para IL‐12(p70) e TGF‐ β1 e \n1:200 para a IL‐17A. As placas foram mantidas a 4°C por 16‐18h. Após o tempo de incubação, \nas  placas  foram  lavadas  três  vezes  com  tampão  de  lavagem  (PBS  e  0,05%  Tween  20)  e  o \nbloqueio  de  áreas  não  cobertas  pelo  anticorpo  foi  feito  com  200 μ L  por  poço  de  Tampão \nDiluente (PBS com 10% soro fetal bovino) por uma hora em temperatura ambiente. Após a \nadição das amostras e padrões recombinantes nas concentrações indicadas pelos kits (100 \nμL /poço), as placas foram incubadas por duas horas em temperatura ambiente. As placas \nforam  então  lavadas  três  vezes  com  tampão  de  lavagem  e  100 μ L  /poço  do  anticorpo  de \ndetecção (1:250 para o TGF‐ β1 e 1:500 para a IL‐12 (p70) conjugado com estreptavidina e \nperoxidase  HRP  (horseradish  peroxidase)  (1:250)  foi  adicionado  por  mais  uma  hora  a \ntemperatura  ambiente;  para  a  quantificação  de  IL‐17A,  foi  adicionado  100 μ L  /poço  do \nanticorpo secundário (1:200) e incubado por 1 hora, e posterior incubação de 100 μL /poço \nde avidina‐HRP (1:1000) por 30 minutos. As placas foram novamente lavadas três vezes com \ntampão  de  lavagem  e  foi  adicionado  a  cada  poço  100 μ L  de  uma  solução  contendo  o \nsubstrato H2O2 3% (v/v) e tetrametilbenzidina (TMB). Após o aparecimento de cor, a reação \nfoi interrompida com adição de 50 μL de ácido sulfúrico 2N. A leitura da densidade óptica foi \nfeita  a  450nm  utilizando‐se  o  equipamento  ELISA  DTX  880  Multimode  Detector  (Beckman \nCoulter) e os resultados foram apresentados em pg/mL.  \nO kit de CBA (cytometric bead array) Th1/Th2 (BD Biosciences) foi utilizado para avaliar \nas citocinas IL‐2, IL‐4, IL‐6, IL‐10, TNF‐α e IFN‐γ em alíquotas de plasma e sobrenadante de \nfluido  peritoneal  congeladas.  Brevemente,  as  amostras/curvas  foram  incubadas  com  as \n\n36 \n \nbeads de captura e reagente de detecção por 3 horas, em temperatura ambiente e ao abrigo \nda  luz.  Após  o  período  de  incubação,  a  placa  foi  lavada  e  as  amostras  foram  lidas  em \ncitômetro  de  fluxo  BD  LSRFortessa  (BD  Biosciences).  A  análise  dos  resultados  foi  realizada \nutilizando o software FCAP Array versão 3.0. Os resultados foram apresentados em pg/mL. \n \n3.6 Análises comparativas entre os grupos \n \nTestes de normalidade (Kolmogorov‐Smirnov, D’Agostino e Pearson omnibus ou Shapiro‐\nWilk),  além  da  análise  de  coeficientes  de  assimetria  e  achatamento  (skewness  e  kurtosis) \nforam  utilizados  para  avaliar  a  distribuição  das  populações  estudadas.  Para  comparações \nentre  grupos,  foi  utilizado  o  teste  t  de  Student  não  pareado,  onde  a  distribuição  foi \nconsiderada  normal,  ou  teste  U  de  Mann‐Whitney,  para  dados  com  distribuição  não \nconsiderada normal. Para comparações entre amostras de sangue e fluido peritoneal dentro \nde  um  mesmo  grupo,  foi  utilizado  o  teste  t  pareado  ou  teste  de  Wilcoxon,  para  amostras \ncom  distribuição  normal  e  não  normal,  respectivamente.  As  possíveis  interações  entre  as \namostras  foram  verificadas  pela  análise  de  variância  simples  (ANOVA  unilateral/Kruskal‐\nWallis). O nível de significância estabelecido foi de p<0,05, para todos os testes. As análises \nestatísticas foram realizadas pelo software GraphPad Prism 5.0. Os dados são apresentados \ncomo mediana e intervalo interquartil.  \n \n\n37 \n \n4 RESULTADOS \n \n4.1        Dados das Pacientes \n \n \nForam  incluídas  nesse  estudo  21  pacientes  com  endometriose,  cujo  diagnóstico  foi \nconfirmado  por  análises  histopatológicas  das  lesões  endometrióticas  após \nvideolaparoscopia.  Doze  indivíduos  controle,  com  ausência  de  endometriose  comprovada \ndurante  a  videolaparoscopia,  foram  inicialmente  incluídos;  desses,  dois  indivíduos  foram \nexcluídos do estudo devido ao uso de contraceptivo oral e duas pacientes com endometriose \nforam  excluídas  devido  à  presença  de  neoplasia.  Outros  dois  indivíduos  do  grupo  controle \nforam excluídos por número insuficiente de células no fluido peritoneal para marcação por \ncitometria  de  fluxo.  Ao  todo,  19  pacientes  com  endometriose  (grupo  EDT)  e  8  controles \n(grupo  CTRL)  preencheram  os  critérios  de  inclusão  do  estudo.  Os  dados  clínicos  das \npacientes com endometriose incluídas nesse estudo estão resumidos no apêndice (Tabelas \nA1 e A2). \nA principal queixa relatada pelas pacientes foi dismenorréia, presente em 16 das 19 \npacientes com endometriose aqui estudadas. Dispareunia de profundidade foi reportada em \n11/19  das  pacientes  e  dor  pélvica  acíclica  em  9/19  pacientes.  Alterações  intestinais  e \nurinárias  cíclicas  também  foram  reportadas  em  8/19  e  2/19  pacientes,  respectivamente. \nOito  pacientes  com  endometriose  apresentaram‐se  inférteis.  Segundo  informações \nlaboratoriais, sete pacientes estavam na fase proliferativa do ciclo menstrual, enquanto nove \nestavam  na  fase  secretora.  Ressalta‐se  que  nenhuma  paciente  com  endometriose  incluída \nnesse  estudo  fazia  uso  de  terapia  hormonal  por  pelo  menos  três  meses  prévios  à \nlaparoscopia. \nAs  lesões  de  endometriose  foram  predominantes  nas  regiões  retrocervical  (13/19), \nperitoneal  (14/19)  e  ovários  (11/19).  Também  foram  observadas  lesões  na  porção \nretossigmóide  (8/19),  nas  tubas  uterinas  (7/19),  fundo  de  saco  de  Douglas  (5/19),  ureter \n(3/19), vagina (3/19), reto (4/19), bexiga (2/19) e no apêndice (2/19) (apêndice – Tabela A2). \nTodas as lesões foram confirmadas histologicamente para a presença de estroma e glândula \nendometrial.  \n \n \n\n38 \n \n \n \n4.2 Avaliação de células T reguladoras  \n \nA caracterização das células Treg foi realizada pela análise dos marcadores CD3, CD4, CD25 \ne CD127 expressos na superfície celular, além da análise intracelular do fator de transcrição \nFoxP3. A estratégia utilizada para essa caracterização leva em consideração populações de \ncélulas na região dos linfócitos, identificadas por tamanho e granulosidade, e marcação com \no  marcador  de  células  hematopoiéticas  CD45,  seguidas  da  expressão  da  molécula  de  CD3, \nque  está  presente  apenas  em  receptores  de  linfócitos  T.  Em  seguida,  a  expressão  do  co‐\nreceptor de linfócitos T auxiliares, CD4, e a alta expressão da cadeia α do receptor de IL‐2, a \nmolécula de CD25, foram observadas dentre os linfócitos T CD3+. A seguir, a baixa expressão \nda cadeia α do receptor da IL‐7, o CD127, foi verificado dentre as células CD3+CD4+CD25high . \nPor  fim,  a  presença  de  marcação  intracelular  para  o  fator  de  transcrição  Foxp3  foi \nidentificada dentre as células CD3+CD4+CD25highCD127low. Essa estratégia foi utilizada para a \ncaracterização de T reguladoras oriundas do sangue e do fluido peritoneal de pacientes com \nendometriose e está ilustrada na Figura 1.  \n\n39 \n \n                                 \n  \n                               \n  \n \nFigura  1‐  Estratégia  de  análise  de  células  T  reguladoras  (Treg).  Inicialmente,  foram  selecionadas  células  na \nregião  dos  linfócitos,  separadas  por  tamanho, granulosidade  e  expressão  de  CD45+  (A). Os  linfócitos  T  foram \nselecionados pela expressão de CD3 (B). Em seguida, foram selecionadas as células T CD4 com alta expressão \nde CD25 (CD4+CD25high) (C), e nesta população foram selecionadas apenas as células com baixa expressão de \nCD127 (D). Por fim, foi avaliada a expressão de Foxp3 nessa última população (E).             \n \nAs  Tabelas  2  e  3  resumem  os  principais  resultados  da  comparação  das  diferentes \npopulações analisadas por essa estratégia de análise nas amostras de sangue e FP, entre os \ngrupos  EDT  e  CTRL.  Comparações  entre  os  estágios  de  EDT  podem  ser  encontradas  no \napêndice (Tabelas A3 e A4). \n \n \n \n \nA  B \nC  D \nE \n\n40 \n \n \nTabela 2 – Comparação entre as frequências das populações de linfócitos estudadas no sangue de \npacientes com endometriose e controles. \nSangue   CTRL  EDT \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p \nLT   2,83 ± 3,37  1,72 (0,17 ‐ 5,59)  5,8 ± 7,5  3,98 (0,73 ‐ 7,43)  p=0,32 \nLT CD4+  1,43 ± 2,09  0,67 (0,11 ‐ 1,43)  3,4 ± 4,9  1,43 (0,41 ‐ 4,2)  p=0,31 \nCD4+ em CD3  55,3 ± 20,7  62,4 (47,4 ‐ 65,4)  54,2 ± 14  55,5 (48,8 ‐ 65,6)  p=0,87 \nCD4+CD25+  20,8 ± 13,07  17,6 (16,7 ‐ 18,9)  19,7 ± 17,9  15,2 (7,4 ‐ 22,8)  p=0,88 \nCD4+CD25high  2,32 ± 1,18  2,11 (1,27 ‐ 3,62)  3,45 ± 4,24  2,14 (1,07 ‐ 3,96)  p=0,81 \nTreg em CD3  0,51 ± 0,85  0,22 (0,009 ‐ 0,42) 0,85 ± 1,1  0,37 (0,19 ‐ 1,4)  p=0,33 \nTreg em CD4  0,79 ± 1,29  0,35 (0,08 ‐ 0,68)  1,47 ± 1,56  0,66 (0,49 ‐ 2,24)  p=0,32 \nValores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, \nIQR  =  intervalo  interquartil,  LT  =  linfócito  T,  Treg  =  linfócito  T  regulador.  Valor  de  p  calculado  pelo  teste  t  de \nStudent não pareado/Mann Whitney, quando apropriado. \n \n \nTabela  3 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  linfoides  estudadas  no  fluido \nperitoneal de pacientes com endometriose e controles. \nFluido Peritoneal   CTRL  EDT \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p \nLT   1,91 ± 2,56  0,74 (0,27 ‐ 2,98)  5,04 ± 8,44  1,46 (0,28 ‐ 6,63)  p=0,31 \nLT CD4+  0,62 ± 1,12  0,23 (0,07‐0,59)  1,17 ± 1,76  0,46 (0,11 ‐ 1,36  p=0,38 \nCD4+ em CD3  27,7 ±  10,6  26,5 (16,7 ‐ 37,6)  29,5 ± 10,7  28,4 (24,1 ‐ 34,6)  p=0,70 \nCD4+CD25+  6,33 ± 4,58  6,2 (1,79 ‐ 11,3)  5,82 ± 3,85  5,08 (3,04 ‐ 8,19)  p=0,76 \nCD4+CD25high  1,86 ± 1,57  1,42 (0,7 ‐ 2,55)  1,03 ± 0,87  0,96 (0,24 ‐ 1,38)  p=0,10 \nTreg em CD3  0,12 ± 0,13  0,058 (0,03 ‐ 0,19) 0,07 ± 0,08  0,06 (0,0007 ‐ 0,1)  p=0,20 \nTreg em CD4  0,44 ± 0,38  0,335 (0,11 ‐ 0,76) 0,19 ± 0,19  0,19 (0,002 ‐ 0,35)  p=0,04 \nValores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, \nIQR = intervalo interquartil, LT = linfócito, Treg = linfócito T regulador. Valor de p calculado pelo teste t de Student \nnão pareado/Mann Whitney, quando apropriado. \n \n4.2.1 Análise descritiva das células CD45+, CD3+ e CD4+no sangue e FP: \n \nNão  foram  encontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  células  hematopoiéticas \n(CD45+),  linfócitos  T  (CD3+)  e  LT  auxiliares  (CD3+CD4+),  tanto  no  sangue  quanto  no  FP  de \npacientes  com  endometriose  e  controles.  Conforme  esperado,  amostras  de  sangue \napresentaram  maior  frequência  de  todas  as  populações  citadas  do  que  amostras  de  FP, \ntanto  no  grupo  de  pacientes  com  endometriose,  quanto  no  grupo  controle  (apêndice  – \nFiguras A1‐A8).  \nA seguir, analisamos a proporção de células T CD4+ que expressavam o marcador de \nativação CD25. Mais uma vez, não foram observadas diferenças entre os grupos analisados \n(Figura 2A, B e C). A frequência de LT CD4+  ativados está aumentada no sangue comparado \n\n41 \n \ncom amostras de FP de pacientes com endometriose (p=0,0066, Figura D) e CTRL (p=0,0179, \nFigura  D);  perfil  semelhante  foi  observado  quando  as  pacientes  do  grupo  EDT  foram \nsubdivididas em estágios de doença (Figura 2D).  \n \nCTRL EDT CTRL EDT\n0\n20\n40\n60\n80 n.s. n.s.\nSangue FP\n% CD4+CD25+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD4+CD25+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n5\n10\n15\n20 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD4+CD25+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n10\n20\n30\n40\n40\n60\n80 **\nsangue\nFP\n* *n.s.\n% CD4+CD25+\n \nFigura 2 – Frequência de células T CD4+ ativadas em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes \ncom endometriose e controles. (A) Comparação da frequência das células entre pacientes com endometriose \n(EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) no sangue e FP; (B) Frequência de células no sangue de controles (CTRL, \nn=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  Frequência  de  células  no  FP  de \ncontroles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de \nsangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01 e n.s. \n= não significativa, pelo teste t não‐pareado (A), ANOVA (B e C) e teste t de Student pareado (D). \n \nA  elevada  expressão  do  CD25  na  superfície  de  LT  CD4+  está  altamente  relacionada \ncom  as  células  Treg.  Nas  amostras  aqui  avaliadas,  não  foram  encontradas  diferenças  na \nfrequência  de  células  CD4+CD25high  entre  pacientes  com  endometriose  e  controles  (Figura \n3A‐C). Novamente, as amostras de sangue apresentaram maior frequência dessas células do \nque  amostras  do  FP  em  pacientes  do  grupo  EDT  (p=0,0138)  (Figura  3D).  Esse  resultado  se \nestendeu apenas para pacientes do grupo III/IV (p=0,0049). Os grupos CTRL e I/II mostraram \nfrequências semelhantes dessas células entre amostras de sangue e FP.  \nA  B \nC  D \n\n42 \n \nCTRL EDT CTRL EDT\n0\n5\n10\n15\n20\n25 n.s. n.s.\nSangue FP\n% CD4+CD25high\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n15\n20\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD4 +CD25high\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n6\nn.s.\nn.s.\n% CD4+CD25high\nn.s.\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n15\n20\nsangue\nPF\n*n.s. **n.s.\n% CD4+CD25high\n \nFigura 3 ‐ Frequência de células T CD4+CD25high em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes \ncom endometriose e controles. (A) Comparação da frequência das células entre pacientes com endometriose \n(EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) no sangue e FP; (B) Frequência de células no sangue de controles (CTRL, \nn=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  Frequência  de  células  no  FP  de \ncontroles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de \nsangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01 e n.s. \n= não significativa, pelo teste de Mann Whitney/ t não‐pareado (A), Kruskal – Wallis (B), ANOVA (C) e Wilcoxon/ \nteste t de Student pareado (D), conforme a distribuição das amostras. \n \n4.2.2 Análise da população de Treg dentre os LT totais e LT auxiliares no sangue e FP \n \nVisto que praticamente 100% das células T CD4+CD25hiCD127low  são positivas para o \nfator  de  transcrição  Foxp3,  normatizamos  os  valores  encontrados  de  células  Foxp3+  pela \nfrequência de células CD3+ e também de CD4+ para encontrarmos o valor mais fidedigno de \ncélulas Treg dentre os linfócitos T totais (LT) e dentre os LT auxiliares das amostras analisadas.  \nDentre  os  LT,  as  medianas  da  frequência  de  células  Treg  em  amostras  de  sangue  e \nfluido peritoneal são semelhantes entre pacientes com endometriose (em todos os estágios) \ne controles (Figura 4A‐C). Embora não haja diferença estatística, nota‐se que a mediana de \nTreg no sangue do grupo EDT é superior ao grupo CTRL. Para o FP, as frequências são mais \nsimilares (Figura 4A). Em todos os grupos estudados, a frequência de células Treg é maior no \nsangue  do  que  no  FP  (Figura  4D).  Vale  ressaltar  que,  ao  se  comparar  a  frequência  dessas \nA  B \nC  D \n\n43 \n \ncélulas no sangue e a frequência destas no FP, significância estatística só foi atingida para o \ngrupo EDT (p=0,0009), mesmo quando dividido em estágios (I/II – p=0,031; III/IV – p=0,013) \n(Figura 4D). \n \nCTRL EDT CTRL EDT\n0.0\n0.2\n0.4\n0.6\n1\n2\n3\n4\n5\nSangue FP\nn.s. n.s.\n% Treg em LT CD3+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n2.5\n2.5\n5.0\nn.s.\nn.s.\n% Treg em LT CD3+\nn.s.\nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.1\n0.2\n0.3\n0.4\n0.5 n.s.\nn.s.\n% Treg em LT CD3+ n.s.\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5\nsangue\nPF\n*** *n.s. *\n% Treg em LT CD3+\n \nFigura  4 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de \npacientes  com  endometriose  e  controles.  (A)  Comparação  da  frequência  das  células  entre  pacientes  com \nendometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)  no  sangue  e  FP;  (B)  Frequência  de  células  no  sangue  de \ncontroles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (C) Frequência de células \nno  FP  de  controles  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (D)  Comparação  entre \namostras de sangue e FP de cada grupo. As células Treg são mostradas como porcentagem de células dentre os \nlinfócitos T CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05,   *** p<0,001 e n.s. = não \nsignificativa, pelo teste de Mann Whitney (A), ANOVA (B e C) e Wilcoxon (D). \n \nAo  analisarmos  a  frequência  das  células  Treg  na  população  de  células  CD4+, \nobservamos  uma  redução  destas  em  amostras  de  FP  de  pacientes  com  endometriose \nquando comparadas aos controles (p=0,0415) (Figura 5A). Como para a análise da frequência \nde  Treg  na  população  de  linfócitos  CD3+,  há  tendência  ao  aumento  de  Treg  no  sangue  de \npacientes  do  grupo  EDT,  embora  sem  significância  estatística.  Mais  uma  vez,  o  grupo  EDT \nmostrou  maior  frequência  de  Treg  no  sangue  que  no  FP  (p=0,0009),  mesmo  quando \nsubdividido em estágios I/II e III/IV (p=0,031 e p=0,013, respectivamente) (Figura 5D). \nA  B \nC  D \n\n44 \n \nCTRL EDT CTRL EDT\n0.0\n0.3\n0.6\n0.9\n1.2\n1.5\n3.5\n5.5\n7.5\nSangue FP\nn.s. *\n% Treg em LT CD4+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n6\n7\nn.s.\nn.s.\n% Treg em LT CD4+\nn.s.\nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.3\n0.6\n0.9\n1.2\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% Treg em LT CD4+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.4\n0.8\n1.2\n1.5\n4.0\n6.5\nsangue\nFP\n** *n.s. *\n% Treg em LT CD4+\n \nFigura  5 ‐   Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de \npacientes  com  endometriose  e  controles.  (A)  Comparação  da  frequência  das  células  entre  pacientes  com \nendometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)  no  sangue  e  FP;  (B)  Frequência  de  células  no  sangue  de \ncontroles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (C) Frequência de células \nno  FP  de  controles  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (D)  Comparação  entre \namostras de sangue e FP de cada grupo. As células Treg são mostradas como porcentagem de células dentre os \nlinfócitos  T  CD4+.  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  *p<0,05,  **  p<0,01  e  n.s.  =  não \nsignificativa, pelo teste t não pareado (A), ANOVA (B e C) e t de Student pareado (D). \n \nA razão FP:sangue pode ser indicativo de migração de células do sangue para o fluido \nperitoneal. Nessas amostras, a razão mostrou‐se diminuída nas pacientes com endometriose \nem todos os estágios, comparadas ao controle (Figura 6 e Tabelas A5 e A6 no apêndice).  \nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.4\n0.8\n1.2\n10\n15\n20\n*\n*\n*\nRazão FP:sangue\nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n2.5\n8\n9\n10\n**\n*\n*\nRazão FP:sangue\n \nFigura  6 ‐  Razão  entre  a  frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  a  frequência \ndessas  em  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), \ndivididos  em  estáios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12)  e.  As  células  Treg  são  mostradas  como  porcentagem  de  células \ndentre as os linfócitos T CD3+ (A) e CD4+ (B). Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, \n** p<0,01e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney. \nA  B \nC  D \nA  B \n\n45 \n \nQuanto à média de intensidade de fluorescência (MFI) do Foxp3, nenhuma diferença \nfoi encontrada intragrupos e intergrupos (Figura 7). \n \nCTRL EDT CTRL EDT\n0\n1000\n2000\n3000\n4000 n. s.n. s.\nSangue FP\nMFI Foxp3\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n500\n1000\n1500\n2000\nn.s.\nn.s.\nn.s.\nMFI Foxp3\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1000\n2000\n3000\n4000\nn.s.\nn.s.\nn.s.\nMFI Foxp3\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1000\n2000\n3000\n4000\nsangue\nPF\nn.s. n.s. n.s. n.s.\nMFI Foxp3\n \nFigura 7 – Intensidade de fluorescência média (MFI) do fator de transcrição Foxp3 em células Treg de amostras \nde sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles. (A) Comparação do MFI entre \npacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)  no  sangue  e  FP;  (B)  MFI  no  sangue  de \ncontroles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  MFI  no  FP  de \ncontroles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de \nsangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, \npelo teste t não pareado (A), ANOVA (B e C) e t de Student pareado (D). \n \n4.3       Células Natural Killer  \n \nPara  a  caracterização  das  diversas  populações  de  células  NK  aqui  avaliadas,  foram \nselecionadas as células na região dos linfócitos, identificadas por tamanho e granulosidade, \nseguidas  da  marcação  com  CD45.  Inicialmente,  foi  feita  a  exclusão  de  linfócitos  T,  células \nNKT  e  monócitos  selecionando‐se  células  negativas  para  a  expressão  de  CD3  e  CD14.  Em \nseguida,  células  CD45+CD3‐CD14‐  foram  investigadas  para  a  expressão  de  CD16  e  CD56. \nForam  analisadas  células  NK  CD56brightCD16‐,  NK  CD56brightCD16+  e  NK  CD56lowCD16+. \nAdicionalmente,  a  expressão  de  dois  marcadores  de  maturação/ativação  de  células  NK,  as \nA  B \nC  D \n\n46 \n \nmoléculas CD57 e CD161, também foi abordada. A estratégia realizada para a caracterização \ndas populações de células NK está ilustrada na Figura 8. \n \n                           \n  \n                           \n  \n \nFigura 8 – Estratégia de análise de populações de células natural killer (NK). Inicialmente, foram selecionadas \ncélulas  CD45+  (A).  Dentro  das  células  CD45+,  na  região  dos  linfócitos,  foram  excluídas  as  células  T,  NKT  e \nmonócitos pela seleção de células CD3‐CD14‐ (B). Em seguida, foram selecionadas as populações de células NK \npela expressão de CD16 e CD56 (C). Em cada população de célula NK foi avaliada a expressão de CD57 (D) e \nCD161 (E).         \n     \nAs Tabelas 4 e 5 resumem os principais resultados encontrados da comparação das \ndiferentes populações de células NK analisadas em amostras de sangue e FP dos grupos EDT \ne CTRL. Comparações entre os estágios de EDT podem ser encontradas no apêndice (Tabelas \nA7 e A8). \nC  D \nE \nA  B \n\n47 \n \nTabela  4 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no  sangue  de \npacientes com endometriose e controles. \nSangue   CTRL  EDT \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p \nCD56brightCD16‐  1,4 ± 0,9  1,4 (0,8 ‐ 1,7)  2,2 ± 1,4  2,1 (1 ‐ 3)  p=0,13 \nCD56brightCD16+  6, 7 ± 13,8   0,88 (0,29 ‐ 7,8)  1,1 ± 1,2  0,8 (0,6 ‐ 1)  p=0,91 \nCD56lowCD16+  22,7 ± 15,7   27,3 (4,4 ‐ 36,8)  26,1 ± 17,1   19,9 (12,6 ‐ 42,5)  p=0,63 \nCD56brightCD16‐CD57+  20,6 ± 21,1  17,5 (0,22 ‐ 43,3)  29,5 ± 25,2  30,7 (4,5 ‐ 49,4)  p=0,38 \nCD56brightCD16+CD57+  19,5 ± 13,6  16,4 (10,6 ‐ 31,8)  47,6 ± 19,07  48 (32,1 ‐ 60)  p=0,0009\nCD56lowCD16+CD57+  33,6 ± 23,5   36,1 (8,3 ‐ 52,8)  52,9 ± 20,2  54,5 (43,5 ‐ 68,4)  p=0,03 \nCD56brightCD16‐CD161+ 49 ± 26,2  48,4 (43,3 ‐ 59,2)  54,8 ± 27,2  54,4 (31,9 ‐ 82,1)  p=0,61 \nCD56brightCD16+CD161+ 47,2 ± 35,4  56 (10,7 ‐ 74,4)  70,9 ± 25,6  78,4 (51,1 ‐ 94,2)  p=‐0,06 \nCD56lowCD16+CD161+  43,7 ± 35,3  59,9 (2,4 ‐ 67,2)  64,8 ± 32,6  68,8 (45,7 ‐ 93,8)  p=0,14 \nValores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR \n= intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t pareado/Mann Whitney, conforme apropriado. \n \n \nTabela  5 ‐   Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no  fluido \nperitoneal de pacientes com endometriose e controles. \nFluido Peritoneal  CTRL  EDT \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p \nCD56brightCD16‐  11,4 ± 14,5  4,5 (1,9 ‐ 19,9)  9,9 ± 13,4  4,4 (1,5 ‐ 12,3)  p=0,7982\nCD56brightCD16+  0,32 ± 0,27  0,27 (0,08 ‐ 0,56)  0,54 ± 0,93  0,19 (0,09 ‐ 0,5)  p=0,8316\nCD56lowCD16+  10,2 ± 6,8   8,8 (6,4 ‐ 11,9)  10,3 ± 10,4   5,3 (2,4 ‐ 15,9)  p=0,9754\nCD56brightCD16‐CD57+  18,9 ± 17,5  14,5 (2,5 ‐ 36,5)  24,9 ± 25,4  15,8 (4,4 ‐ 49,9)  p=0,5423\nCD56brightCD16+CD57+  25,7 ± 24,6  29,3 (0 ‐ 41,3)  45,9 ± 34,8  50 (13,2 ‐ 77,8)  p=0,1501\nCD56lowCD16+CD57+  33,6 ± 21,7  34,8 (17,9 ‐ 48,7)  49 ± 25,6  57,6 (24,2 ‐ 65,9)  p=0,1513\nCD56brightCD16‐CD161+ 69,9 ± 8,84  71,7 (62,7 ‐ 74,5)  62,9 ± 28,8  71,4 (42,8 ‐ 85,3)  p=0,2096\nCD56brightCD16+CD161+ 55 ± 39,6  56,9 (11,1 ‐ 95,5)  58 ± 40,4  73,4 (0 ‐ 97,2)  p=0,8629\nCD56lowCD16+CD161+  57,6 ± 27,7   66,1 (43 ‐ 78)  65,4 ± 31,7  82,4 (36,9 ‐ 88,2)  p=0,5480\nValores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR \n= intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t pareado/Mann Whitney, conforme apropriado. \n \n \nA  análise  das  populações  de  NK  CD56brightCD16‐,  NK  CD56brightCD16+  e  NK \nCD56lowCD16+  não  mostrou  diferenças  entre  os  grupos  de  pacientes  com  endometriose  e \ncontroles nessa coorte de pacientes (Figura 9).  \n\n48 \n \nCD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n5\n25\n45\n65\nn.s. n.s. n.s.\n% de células\nCD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n5\n25\n45\n65\nEDT\nCTRL\nn.s. n.s. n.s.\n% de células\n \nFigura  9 ‐   Frequência  de  células  Natural  Killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+  em \namostras de sangue (A) e fluido peritoneal (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, \nn=8). As células NK são mostradas como porcentagem de células dentre as células CD3‐CD14‐. Dados mostrados \ncomo mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado/ teste de \nMann Whitney, quando apropriado. \n \nQuando comparamos a frequência das populações estudadas em amostras de sangue \ne FP dentro dos grupos, é possível observar uma maior frequência de células CD56brightCD16‐ \nno FP que no sangue de controles (p=0,023) e de pacientes com endometriose (p=0,0058), \nque  se  mantém   em  pacientes  do  estágio  I/II  (p=0,046).  O  grupo  de  EDT  III/IV  não  atingiu \nsignificância  estatística  para  esse  parâmetro  (p=0,052),  embora  mostrasse,  também,  uma \ntendência à maior frequência dessas células no FP do que no sangue (Figura 10A).  \nAs  outras  duas  populações  de  células  NK  estudadas,  células  CD56brightCD16+  e \nCD56lowCD16+, entretanto, estão presentes em maior frequência no sangue do que no FP em \ntodos  os  grupos  analisados.  A  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  mostrou‐se \nsignificantemente  aumentada  apenas  no  sangue  de  pacientes  com  EDT  I/II  (p=0,034) \ncomparado  ao  FP.  Não  foram  encontradas  diferenças  significativas  quanto  à  frequência \ndessas  células  nas  pacientes  dos  grupos  EDT  (p=0,055),  EDT  III/IV  (p=0,4238)  e  CTRL \n(p=0,0781)  (Figura  10B).  A  análise  das  células  NK  CD56lowCD16+  mostrou  diferenças \nsignificativas  entre  a  frequência  dessas  células  no  sangue  e  FP  de  todos  os  grupos  (EDT: \np=0,003; EDT I/II: p=0,005; EDT III/IV: p=0,021; e CTRL: p=0,039) (Figura 10C). \n \nA  B \n\n49 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n10\n10\n30\n50\n70 *** * n.s.\n% CD56brightCD16-\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n10\n20\n30\n40\nn.s.n.s.n.s. *\n% CD56brightCD16+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n10\n20\n30\n40\n50\n60\n70\nFP\nSangue\n**** ** *\n% CD56low CD16+\n \nFigura 10 – Comparação da frequência de células Natural Killer (NK) CD56brightCD16‐ (A), CD56brightCD16+ (B) ou \nCD56lowCD16+  (C)  entre  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT, \nn=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  NK  são  mostradas  como  porcentagem  de  células  dentre  as  células \nCD3‐CD14‐.  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve; \nIII/IV (n=12),  endometriose moderada/grave;  *p<0,05,  **  p<0,01,  *** p<0,001  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo \nteste t de Student pareado (A e C) ou pelo teste de Mann Whitney (B). \n \nA  análise  da  expressão  do  marcador  CD57  nas  células  NK  estudadas  revelou \ndiferenças na frequência de células CD57+ entre o grupo de pacientes com endometriose e \ncontroles (Figura 11A e C). A frequência de células NK CD56brightCD16+ que expressam  CD57 \nmostrou‐se  elevada  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  as \npacientes  do  grupo  CTRL  (p=0,0009),  inclusive  quando  as  pacientes  do  grupo  EDT  foram \nsubdivididas  em  estágios  de  doença  (p=0,0045).  Um  aumento  na  frequência  de  células \nCD57+ nas células NK CD56lowCD16+ também foi constatado no sangue de pacientes com EDT \n(p=0,039). Não foram observadas diferenças entre a frequência de células CD57+ em células \nNK CD56brightCD16‐ presentes no sangue de pacientes com EDT e CTRL, ou na frequência de \ncélulas NK CD56brightCD16‐, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ no FP. \nA análise da frequência de células positivas para o marcador CD161 nas populações \nde células NK estudadas não mostrou diferenças em amostras de sangue e FP comparando‐\nse o grupo de pacientes com endometriose e controles (Figura 11 B e D). \nA  B \nC \n\n50 \n \nCD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s. *** *\n% CD57+\nCD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s. n.s. n.s.\nEDT\nCTRL\n% CD161+\n \nCD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s. n.s. n.s.\n% CD57+\nCD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s. n.s. n.s.\n% CD161+\n \nFigura 11 ‐ Frequência de células Natural Killer (NK) CD56brightCD16‐, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ positivas \npara os marcadores CD57 e CD161 em amostras de sangue (A e B) e fluido peritoneal (C e D) de pacientes \ncom  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo \ninterquartil. *p<0,05, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado. \n \nNão  foram  encontradas  diferenças  quanto  à  expressão  do  marcador  CD57  entre  as \namostras  de  sangue  e  FP  de  cada  grupo  em  nenhuma  população  de  célula  NK  estudada \n(Figura 12 A, C e E).  \nAs células CD56brightCD16‐CD161+ apresentaram‐se em maior frequência no FP que no \nsangue de pacientes do grupo controle (p=0,036). Embora fosse observada maior frequência \nde células CD161+ no FP comparado com o sangue dos grupos EDT e III/IV, a diferença não \nfoi significativa (Figura 12B). Curiosamente, a situação parece estar invertida em pacientes \ndo grupo I/II, nas quais as células CD161+  encontram‐se mais frequentes no sangue que no \nFP.  Um  quadro  contrário  é  visto  nas  células  CD56brightCD16+,  as  quais  apresentaram  maior \nfrequência de células CD161+ no sangue que no FP; dado significante apenas para o grupo de \npacientes  I/II  (p=0,0487)  (Figura  12D).  Não  foram  encontradas  diferenças  significativas \nquanto à frequência de células CD56brightCD16+CD161+  nas pacientes dos grupos EDT, III/IV e \nCTRL. Diferentemente do padrão observado no restante dos grupos, as pacientes do grupo \nIII/IV aparentam ter mais células CD56brightCD16+CD161+ no FP, comparado ao sangue (Figura \nA  B \nC  D \n\n51 \n \n12F). A expressão de CD161 nas células CD56lowCD16+ também não mostrou diferenças entre \nas amostras e entre os grupos.  \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\nn.s. n.s. n.s. n.s.\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nsangue\nPF\nn.s. n.s. n.s.*\n% CD161+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.n.s.n.s.n.s.\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.*n.s.n.s.\nsangue\nFP\n% CD161+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s.n.s.n.s.n.s.\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.n.s.n.s.n.s.\nsangue\nFP\n% CD161+\n \nFigura 12 ‐ Comparação da frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐ (A e B), CD56brightCD16+ (C \ne D) e CD56lowCD16+  (E e F) positivas para os marcadores CD57 e CD161 entre amostras de sangue e fluido \nperitoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). Dados mostrados como \nmediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose \nmoderada/grave; *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado. \n \nNão foram encontradas diferenças entre a razão de células presentes no FP e células \nno  sangue de  nenhuma  das  populações  estudadas  (apêndice –  Tabelas  A9  e  A10 e  Figuras \nA12‐A14). \n \n \nA  B \nC  D \nE  F \n\n52 \n \n4.4       Células Supressoras Mieloides (MDSC) \n \nA estratégia para a caracterização de MDSC a partir dos marcadores de superfície foi \nrealizada  como  segue:  foi  selecionada  a  população  celular  positiva  para  CD45,  que \ncorresponde  às  células  hematopoiéticas,  seguida  da  exclusão  de  populações  com  fenótipo \nde  linfócitos  T  e  B,  células  NK  e  NKT,  monócitos  e  células  apresentadoras  de  antígenos,  a \npartir da seleção de células Lin1‐HLA‐DR‐. Em seguida, dentre as células CD45+Lin1‐HLA‐DR‐, \nforam selecionadas as células que expressam as moléculas CD11b e CD33. Essas células são \naqui referidas como MDSC. Na sequência, foi avaliada a expressão dos marcadores CD15 e \nde CD34 na superfície das células MDSC. A estratégia realizada para a caracterização dessas \ncélulas está ilustrada na Figura 13. \nComo  a  presença  de  células  MDSC  ainda  não  foi  avaliada  em  pacientes  com \nendometriose,  e  para  comprovação  de  que  a  estratégia  de  caracterização  dessas  células \npode também ser aplicada para as amostras de fluido peritoneal e sangue dessas pacientes, \niniciamos a identificação e caracterização de células com fenótipo Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+ \nem  amostras  de  medula  óssea  de  pacientes  com  mieloma  múltiplo  (n=2);  esses  pacientes, \nsabidamente,  possuem  altas  frequências  dessas  células  no  sangue  comparados  com \nindivíduos  saudáveis  (50).  Após  a  comprovação  da  identificação  de  MDSC  (Lin1‐HLA‐DR‐\nCD11b+CD33+)  em  pacientes  com  mieloma  múltiplo,  utilizou‐se  a  mesma  estratégia  para  a \nidentificação destas células em pacientes com endometriose.  \n \n\n53 \n \n                        \n  \n                        \n  \nFigura 13 ‐  Estratégia de análise de células supressoras mieloides (MDSC). Inicialmente, foram selecionadas \ncélulas CD45+ (A). Dentro das células CD45+, foram selecionadas as células HLA‐DR‐Lin1‐ (B). Em seguida, foram \nselecionadas as células CD11b+CD33+ (C) e nesta população, foi avaliada a expressão de CD15 e CD34 (D).             \n \nDevido  à  heterogeneidade  de  populações  de  MDSC,  analisamos  as  células \nsupressoras  mieloides  de  quatro  fenótipos  distintos:  CD11b+CD33+,  CD11b+CD33+CD34+, \nCD11b+CD33+C15+ e CD11b+CD33+CD34+CD15+. A frequência de células CD11b+CD33+C15+ e \nCD11b+CD33+CD34+CD15+  foi  extremamente  baixa  nas  amostras  das  pacientes  incluídas \nnesse estudo e não foram comprovadas diferenças entre os grupos (EDT versus CTRL ou I/II e \nIII/IV versus CTRL), ou entre amostras estudadas (sangue versus FP em cada grupo) (dados \nnão  mostrados).  Por  esta  razão,  estas  populações  não  serão  abordadas  nesse  texto.  A \ncomparação  entre  média  e  mediana  das  frequências  de  MDSC  CD11b+CD33+e \nCD11b+CD33+CD34+  no  sangue  e  FP  de  pacientes  com  endometriose  e  controles  está \nresumida  na  Tabela  6.  Comparações  entre  os  estágios  de  EDT  podem  ser  encontradas  no \napêndice (Tabela A11). \n \n \n \n \nA  B \nC  D \n\n54 \n \n \nTabela 6 ‐ Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de pacientes \ncom endometriose e controles. \nCTRL  EDT   \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR) Média ± DP  Mediana (IQR)  p \nCD11b+CD33+ \n(sangue)  0,09 ± 0,09  0,7 (0 ‐ 0,18)  0,24 ± 0,19  0,19 (0,11 ‐ 0,4)  p=0,0624\nCD11b+CD33+CD34+ \n(sangue)  0,037 ± 0,054  0,02 (0‐ 0,06)  0,142 ± 0,137  0,11 (0,05 ‐ 0,22)  p=0,0417\nCD11b+CD33+   \n(FP)  0,4 ± 0,74  0,13 (0,04 ‐ 0,26) 0,1 ± 0,1  0,07 (0,02 ‐ 0,16)  p=0,3693\nCD11b+CD33+CD34+  \n(FP)  0,146 ± 0,325  0,01 (0,01 ‐ 0,08) 0,055 ± 0,063  0,03 (0‐ 0,09)  p=0,7049\nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  CTL=controle,  EDT=  endometriose,  DP  =  desvio  padrão, \nIQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. Valor de p calculado pelo teste de Mann Whitney. \n \nOs  resultados  encontrados  quanto  às  células  MDSC  CD11b+CD33+e \nCD11b+CD33+CD34+ foram bastante semelhantes. Ambas as populações estudadas parecem \nestar  mais  frequentes  em  amostras  de  sangue  de  pacientes  com  endometriose  do  que  de \ncontroles.  No  entanto,  esse  dado  só  foi  confirmado  para  a  população  CD11b+CD33+CD34+ \n(p=0,04).  No  FP,  há  tendência  a  menor  frequência  de  células  CD11b+CD33+  em  pacientes \ncom  EDT,  embora  a  diferença  não  seja  significante  (p=0,36)  (Figura  14).  Quanto  às  células \nCD11b+CD33+CD34+, a frequência de células é extremamente baixa no FP, com mediana de \n0% para o grupo CTRL (Tabela 6).  \nCTRL EDT CTRL EDT\n0.00\n0.25\n0.50\n0.75\n1.5\n2.0\n2.5 n.s. n.s.\nSangue FP\n% CD11b+CD33+\nCTRL EDT CTRL EDT\n0.0\n0.1\n0.2\n0.3\n0.4\n0.5\n0.8\n1.0 * n.s.\nSangue FP\n% CD11b+CD33+CD34+\n \nFigura  14 ‐  Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e  CD11b+CD33+CD34+ (B) \nem amostras de sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, \nn=8). As células MDSC são mostradas como porcentagem de células dentre os leucócitos totais (CD45+). Dados \nmostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  *p<0,05,  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  de  Mann \nWhitney. \n \nAo  dividirmos  o  grupo  EDT  de  acordo  com  o  estagiamento  da  doença,  observamos \nem  ambas  as  populações  de  MDSC  um  aumento  na  frequência  de  células  no  sangue  de \nA  B \n\n55 \n \npacientes  com  EDT  I/II,  comparadas  com  controles  (Figura  15).  Não  há  diferenças \ncomparando‐se amostras de sangue de pacientes do grupo III/IV com controles, ou entre a \nfrequência das populações de MDSC em amostras de FP de pacientes dos grupos I/II e III/IV, \ncomparados com controles. Entretanto, é possível constatar uma diferença na frequência de \ncélulas CD11b+CD33+  entre os pacientes do grupo I/II e III/IV; o grupo III/IV tem frequência \nmuito menor (p=0,009) de células do que o I/II, cuja frequência é semelhante ao grupo CTRL. \nPara a população CD11b+CD33+CD34+, a frequência do grupo I/II permanece maior do que os \noutros  grupos,  entretanto,  o  grupo  CTRL  tem  frequência  reduzida,  mais  próxima  ao  grupo \nIII/IV (Figura 15). \nCTRL I/II III/IV\n0.0\n0.2\n0.4\n0.6\n0.8 n.s.*\nn.s.\n% CD11b+CD33+\nCTRL I/II III/IV\n0.0\n0.1\n0.2\n0.3\n0.4\n0.5\n0.6\nn.s.\nn.s.*\n% CD11b+CD33+CD34+\nCTRL I/II III/IV\n0.0\n0.1\n0.2\n0.3\n0.4\n1.5\n2.0\n2.5 **\nn.s.\nn.s.\n% CD11b+CD33+\nCTRL I/II III/IV\n0.0\n0.1\n0.2\n0.3\n0.4\n0.5\n0.8\n1.0 n.s.\nn.s.n.s.\n% CD11b+CD33+CD34+\n \nFigura  15 ‐   Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  e  CD11b+CD33+CD34+  em \namostras  de  sangue  (A  e  B)  e  fluido  peritoneal  (C  e  D)  de  pacientes  com  endometriose  subagrupados  em \nestágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), e controles (CTRL, n=8). As células MDSC são mostradas como porcentagem \nde  células  dentre  os  leucócitos  totais  (CD45+).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil. \n*p<0,05, ** p<0,01,  e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney. \n \nA comparação de amostras de sangue e FP entre os grupos mostrou maior frequência \nde MDSC CD11b+CD33+ e CD11b+CD33+CD34+ no sangue do que no FP dos grupos EDT e III/IV \n(p=0,0038  e  p=0,0033  para  o  grupo  EDT,  respectivamente,  e  p=0,024  e  p=0,0007  para  o \ngrupo  III/IV,  respectivamente).  O  grupo  I/II  não  apresentou  diferenças  significativas  entre \namostras  de  sangue  e  FP,  apesar  de  haver  uma  tendência  na  observação  de  maior \nC \nA  B \nD \n\n56 \n \nfrequência  células  no  sangue,  principalmente  para  a  população  CD11b+CD33+(p=0,07).  O \ngrupo CTRL também não mostrou diferenças entre as amostras, entretanto, há tendência a \nmaior frequência de células CD11b+CD33+ no FP que no sangue (p=0,09) (Figura 16). \nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.2\n0.4\n0.6\n1.5\n2.0\n2.5 **n.s. * n.s.\nsangue\nFP\n% CD11b+CD33+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.1\n0.2\n0.3\n0.4\n0.5\n0.8\n1.0\nsangue\nFP\nn.s. ** ** n.s.\n% CD11b+CD33+CD34+\n \nFigura  16 ‐   Comparação  da  frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e \nCD11b+CD33+CD34+  (B)  entre  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose \n(EDT,  n=19),  divididas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12),  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  MDSC  são \nmostradas como porcentagem de células dentre os leucócitos totais (CD45+). Dados mostrados como mediana \ne  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose  moderada/grave; \n*p<0,05, ** p<0,01e n.s. = não significativa, pelo teste de Wilcoxon. \n \nNão foi possível calcular a razão de células no FP pela razão de células no sangue das \npacientes devido ao grande número de pacientes com 0% de MDSC no sangue. \n \n4.5       Análise do perfil de células dendríticas \n \nUtilizando  o  mesmo  painel  de  caracterização  de  MDSC,  as  células  dendríticas  (DC) \nHLA‐DR+Lin1‐ foram selecionadas. Foi avaliada também a frequência de DC que expressam os \nmarcadores CD11b e CD33 (Figura 17).  \n \nA \nB \n\n57 \n \n \nFigura 17 ‐  Estratégia de análise para avaliação de células dendríticas (DC). Inicialmente, foram selecionadas \ncélulas CD45+ (A). Dentro das células CD45+, foram selecionadas as células HLA‐DR+Lin1‐, que correspondem às \ncélulas dendríticas (B) e nesta população, foi avaliada a expressão de CD11b e CD33 (C).        \n \n \nForam  analisados  o  fenótipo  geral de  células  dendríticas  (Lin‐HLA‐DR‐),  a  frequência \nde  DC  mieloides  (CD33+)  e  a  frequência  de  DC  mieloides  positivas  e  negativas  para  o \nmarcador CD11b. A comparação entre média e mediana das frequências de populações de \nDC no sangue e FP de pacientes com endometriose e controles está resumida na Tabela 7. As \ncomparações  entre  a  frequência  das  populações  de  DC  entre  pacientes  EDT  de  diferentes \nestágios podem ser encontradas no apêndice (Tabela A12).  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA  B \nC \n\n58 \n \nTabela 7 – Comparação da frequência de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de \npacientes com endometriose e controles. \nCTRL  EDT   \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR) Média ± DP  Mediana (IQR)  p \nDC  \n(sangue)  0,14 ± 0,07  0,14 (0,09 ‐ 0,22) 0,6 ± 1,16  0,39 (0,19 ‐ 0,44)  p=0,016\nDC  \n(FP)  7,22 ± 5,44  6,1 (1,7 ‐ 14)  4,95 ± 5,4  1,08 (0,08 ‐ 9,9)  p=0,148\nDC CD33+   \n(sangue)  34,6 ± 22,3  37,6 (13,1 ‐ 49,9) 43,7 ± 34,5  29,4 (10,1 ‐ 75,6)  p=0,5 \nDC CD33+  \n (FP)  73,9 ± 35,6  91,3 (49,8 ‐ 94,8) 58,6 ± 37,4  71,5 (16,9 ‐ 87,7)  p=0,334\nDC CD33+CD11b+  \n(sangue)  1,47 ± 1,85  1,08 (0 ‐ 2,12)  1,74 ± 2,3  1 (0,39 ‐ 2,35  p=0,785\nDC CD33+CD11b+  \n(FP)  79,8 ± 24,7   89 (83,4 ‐ 90,7)  42,7 ± 34,7  51,4 (0,05 ‐ 72,5)  p=0,01 \nDC CD33+CD11b‐  \n(sangue)  37,9 ± 19,4  38,9 (25,2 ‐ 53,1) 42,1 ± 34  29,4 (10,1 ‐ 74,5)  p=0,778\nDC CD33+CD11b‐  \n(FP)  4,6 ± 3,9  3,6 (2,9 ‐ 4,3)  19,1 ± 21,4  10,9 (1,4 ‐ 30,7)  p=0,092\nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  CTL=controle,  EDT=  endometriose,  DC  =  célula  dendrítica, \nDP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. Valor de p calculado pelo teste t de Student \nnão pareado/Mann Whitney, quando apropriado. \n \nA  frequência  de  DC  (Lin‐HLA‐DR‐)  está  aumentada  no  sangue  de  pacientes  com \nendometriose, comparadas com controles (p= 0,01). Quando as pacientes do grupo EDT são \nsubdivididas em estágios de doença I/II e III/IV, essa diferença é mantida apenas no grupo \nIII/IV  (Figura  18A).  Não  foram  encontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  DC  no  FP  de \npacientes com endometriose (em todos os estágios) e controles (Figura 18B). \nComparando‐se a frequência de Lin‐HLA‐DR‐ em amostras de sangue e FP dentro dos \ngrupos,  observamos  maior  frequência  em  amostras  de  FP  de  pacientes  do  grupo  EDT \n(p=0,03)  e  em  controles  (p=0,01)  (Figura  18C).  Apesar  de  haver  uma  tendência  à  maior \nfrequência de DC no FP que no sangue de pacientes dos grupos I/II e III/IV, a diferença não \nfoi significativa (p=0,57 e p=0,05, respectivamente). \nA razão existente entre a frequência de DC no FP pela frequência destas no sangue \nde  cada  paciente  é  menor  em  pacientes  com  endometriose  que  em  controles  (p=0,01). \nComparando‐se  os  grupos  de  endometriose  com  controles,  o  grupo  I/II  mostrou  redução \nsignificante da razão FP:sangue (p=0,03) (Figura 18D). \n \n\n59 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.2\n0.4\n0.6\n0.8\n1.0\n4\n5\n6 *\nn.s. *\n% DC\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n5\n10\n15 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% DC\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n3\n6\n9\n12\n15\nsangue\nPF\n** n.s. n.s.\n% DC\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n50\n100\n150 *\n*\nn.s.\nRazão FP:sangue\n \nFigura  18 ‐   Frequência  de  células  dendríticas  (DC)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de \npacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subagrupadas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12),  comparadas \ncom controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A) e FP (B) dos grupos estudados, a \ncomparação  entre  as  frequências  em  amostras  de  sangue  e  FP  (C)  e  a razão  existente  entre  a  frequência  de \ncélulas no FP pela frequência de células no sangue de cada indivíduo (D). As células DC são mostradas como \nporcentagem  de  células  dentre  os  leucócitos  totais  (CD45+).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo \ninterquartil. I/II (n=7), endometriose mínima/leve; III/IV (n=12), endometriose moderada/grave; *p<0,05 e n.s. \n= não significativa, pelos testes de Mann Whitney (A, B e D) e Wilcoxon (C). \n \nNão  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  mDC  entre  pacientes  com \nendometriose (todos os estágios) e controles em amostras de sangue ou FP (Figura 19A e B). \nAssim como o que ocorre para DC, a frequência de mDC é maior no FP do que no sangue dos \nvários  grupos  (Figura  19C).  Essa  diferença  foi  significante  apenas  para  o  grupo  CTRL \n(p=0,006)  (Figura  19D).  A  avaliação  da  razão  entre  a  frequência  de  mDC  no  FP  pela \nfrequência  de  células  no  sangue  não  mostrou  diferenças  entre  os  grupos  (dados  não \nmostrados). \nA  B \nC  D \n\n60 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% DC CD33+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% DC CD33+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nsangue\nPF\nn.s.** n.s. n.s.\n% DC CD33+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n8\n12\n16\n20\n24 n.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\n \nFigura 19 ‐ Frequência de células dendríticas CD33+ (mDC) em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de \npacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subagrupadas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12),  comparadas \ncom controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A) e FP (B) dos grupos estudados, a \ncomparação  entre  as  frequências  em  amostras  de  sangue  e  FP  (C)  e  a razão  existente  entre  a  frequência  de \ncélulas no FP pela frequência de células no sangue de cada indivíduo (D). As células DC CD33+ são mostradas \ncomo  porcentagem  de  células  dentre  as  DC  (Lin‐HLA‐DR‐).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo \ninterquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose  moderada/grave;  **  p<0,01  e \nn.s. = não significativa, pelos testes t de Student não pareado (A, B e D) e (C). \n \nA seguir, analisamos a frequência de DC CD33+CD11b+ e CD33+CD11b‐. Ao investigar a \ndistribuição  de  DC  CD33+  CD11b+  e  CD11b‐,  percebemos  que  o  padrão  de  distribuição  é \ndiferente  em  amostras  de  sangue  e  FP;  enquanto  no  sangue  a  grande  maioria  de  mDC  é \nCD11b‐, no FP, a maioria torna‐se CD11b+ (Figura 20A). \nA  B \nC  D \n\n61 \n \nsangue FP\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nCD11b+\nCD11b-\n%\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nCD11b+\nCD11b-\n%\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nCD11b+\nCD11b-\n%\n \nFigura  20 ‐   Distribuição  de  células  CD11b+  e  CD11b‐  em  células  dendríticas  CD33+  do  sangue  e  fluido \nperitoneal (FP) das pacientes com endometriose e controle. Estão mostradas a média da frequência de células \nde cada população de todos os grupos estudados, calculadas dentro do total de células dendríticas CD33+(A), \nalém da distribuição das populações em amostras de sangue (B) e FP (C) dentro de cada grupo de pacientes. \nCTRL=controle  (n=8),  EDT  =  endometriose  (n=12),  I/II  =  endometriose  leve/moderada  (n=7),  III/IV  = \nendometriose moderada/grave (n=12). \n \nA análise da Figura 20 já indica que não há grande diferenças entre os grupos quanto \nàs populações CD11b+ e CD11b‐ no sangue, mesmo quando o grupo EDT é dividido de acordo \ncom  o  estagiamento.  A  frequência  de  células  CD33+CD11b+  no  FP,  no  entanto,  foi \nsignificativamente  menor  em  pacientes  com  EDT,  comparadas  com  controles  (p=0,01) \n(Figura 21D). A subdivisão das pacientes de acordo com o estagiamento da doença também \nrevelou  menor  frequência  de  DC  no  FP,  comparadas  com  controles  (p=0,02  e  p=0,04  para \nestágios I/II e III/IV, respectivamente). Quanto à população CD33+CD11b‐, apesar de não ter \nsido  comprovada  significância  estatística,  há  um  visível  aumento  na  frequência  dessas \ncélulas no FP de pacientes com endometriose, comparadas com controles (EDT: p=0,09, I/II: \np=0,05, III/IV: p=0,16) (Figura 21D). \nA comparação entre a frequência dessas células em amostras de sangue e FP indica \nque as DC CD33+CD11b+ estão muito mais frequentes em amostras de FP do que de sangue, \nem  todos  os  grupos  (EDT:  p=0,0001,  I/II:  p=0,01,  III/IV:  p=0,004  e  CTRL:  p=0,0001)  (Figura \n21E).  Conforme  já  mostrado  na  Figura  20,  o  oposto  é  visto  para  as  células  CD33+CD11b‐, \nmuito  mais  frequentes  em  amostras  de  sangue  do  que  FP  (EDT:  p=0,01,  I/II:  p=0,37,  III/IV: \np=0,03 e CTRL: p=0,008) (Figura 21F). \nA  B \nC \n\n62 \n \nNão foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à razão dessas células no \nFP e no sangue (dados não mostrados). \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n10 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% DC CD33+CD11b+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% DC CD33+CD11b-\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\n**\n*\n*\n% DC CD33+CD11b+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% DC CD33+CD11b-\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nsangue\nPF\n*** ***** *\n% DC CD33+CD11b+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nsangue\nPF\n* *** n.s.\n% DC CD33+CD11b-\n \nFigura  21 ‐  Frequência de  células dendríticas  (DC)  CD33+  CD11b+  e  CD11b‐  em  amostras  de sangue  e  fluido \nperitoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subagrupadas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV \n(n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A e B) e FP (C \ne D) dos grupos estudados e a comparação entre as frequências em amostras de sangue e FP (E e F). Os dados \nsão mostrados como frequência de DC CD11b+ e CD11b‐ é mostrada como frequência de células dendríticas Lin‐\nHLA‐DR‐. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II (n=7), endometriose mínima/leve; III/IV \n(n=12), endometriose moderada/grave; *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelos testes t \nde Student não pareado (A, B e D) e pareado (C). \n \n \n \n \nA  B \nC  D \nE  F \n\n63 \n \n4.6 Quantificação de citocinas pró e anti‐inflamatórias  \n \nA quantificação das citocinas IL‐2, IL‐4. IL‐6, IL‐10, IL‐12, IL‐17, TNF‐α, IFN‐γ e TGF‐β \nfoi  investigada  em  amostras  de  sangue  e  FP  de  pacientes  com  e  sem  endometriose.  Os \nresultados estão resumidos na Tabela 8. \nTabela 8 – Avaliação de citocinas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose, divididas em \nestágios I/II e III/IV, e controles. \n      CTRL  EDT  I/II  III/IV \nCitocina \n(pg/mL)  Amostra  N  Mediana (IQR)  N  Mediana \n(IQR)  N  Mediana \n(IQR)  N  Mediana (IQR) \nIL‐2 \nFP ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15 \nsg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 \nIL‐4 \nFP ‐   < 15  1  18,59 ‐   < 15  1  18,59 \nsg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 \nTNF‐α \nFP ‐   < 15  1  22 ‐   < 15  1  22 \nsg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 \nIFN‐γ \nFP ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15 ‐   < 15 \nsg  2  18 (15‐22)  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 \nIL‐10  FP  2  22 (20‐25)  6  30(21‐158)  3  24 (23‐264)  3  37(18‐123) \nsg  ‐  < 17  ‐  < 17  ‐  < 17  ‐  < 17 \nIL‐6 \nFP  7  43(40‐117)  15  52(43‐138)  5  94 (44‐573)  10  52(41‐ 136) \nsg  1  20  ‐  < 16  ‐  < 16  ‐  < 16 \nIL‐17 \nFP  2  13 (9‐17)  2  70 (9‐131)  2  70 (9‐131) ‐   < 4 \nsg  4  14 (8,5‐25)  3  15 (10‐24)  1  15  2  17 (10‐24) \nTGF‐β \nFP  6  815 (450‐2947)  15  849 (652‐\n1561)  6  1097 (684‐\n1753)  9  800 (522‐1832) \nsg  8  1425 (565‐2358)  16  1529 (895‐\n4655)  4  3165 (1005‐\n5931)  12  1529 (804‐2533) \nIL‐12 \nFP  6  185 (105‐551)  17  201 (58‐368)  6  148 (37‐295)  11  201 (66‐466) \nsg  8  3924 (684‐8286)  19  987 (491‐\n1833)  7  856 (645‐\n1050)  12  1172 (468‐4119) \nCTRL  =  controle,  EDT  =  endometriose;  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose  moderada/grave,  N  = \nnúmero amostral, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. \n \nOs  níveis  das  citocinas  anti‐inflamatórias  IL‐4  e  IL‐10,  além  da  citocina  pró‐\ninflamatória  TNF‐α,  estavam  abaixo  do  limite  de  detecção  do  método  em  amostras  de \nsangue das pacientes estudadas. Não foi possível quantificar a IL‐2 em nenhuma amostra de \nsangue ou FP estudadas, pois todas as quantificações estavam abaixo dos níveis de detecção \ndo kit. \nFoi  possível  quantificar  TNF‐α  e  IL‐4  no  FP  de  apenas  uma  paciente  com \nendometriose  (uma  paciente  com  EDT  estágio  IV),  pois  todas  as  quantificações  dos  outros \npacientes estavam abaixo do limite de detecção do kit. \n\n64 \n \nA  quantificação  de  IL‐10  foi  possível  apenas  no  FP  de  8  pacientes:  3  pacientes  com \nendometriose  I/II,  3  com  EDT  III/IV  e  2  controles,  visto  que  as  demais  estavam  abaixo  dos \nníveis  de  detecção  do  kit.  Apenas  duas  pacientes  com  endometriose  I/II  e  duas  controles \napresentaram  níveis  de  IL‐17A  no  FP.  No  sangue,  essa  citocina  foi  detectada  em  quatro \nmulheres do grupo EDT, duas do grupo III/IV e uma com EDT I/II. A citocina pró‐inflamatória \nIFN‐γ foi detectada apenas em amostras de sangue de duas pacientes do grupo CTRL. Para o \nrestante das amostras, as citocinas supracitadas estavam abaixo dos níveis de detecção do \nmétodo utilizado. \nA citocina IL‐6 foi detectada no FP de quase todas as pacientes incluídas no estudo. \nNão  foram  encontradas  diferenças  significativas  na  quantificação  dessa  citocina  entre  os \ndiferentes grupos (Figura 22A). Todas as amostras de sangue estavam abaixo dos níveis de \ndetecção de IL‐6 do kit. \nA  concentração  de  TGF‐β  foi  similar  entre  os  grupos  estudados.  No  sangue,  a \nmediana foi de 1425 pg/mL (565 – 2358) para o grupo CTRL e 1529 pg/mL (895 – 4655) para \no grupo EDT. A mediana do grupo I/II foi um pouco mais alta do que os outros grupos (3165 \npg/mL), entretanto, devido ao reduzido n e variação entre as amostras (IQR: 1005 – 5931, \nn=4),  não  pode  ser  considerado.  No  FP,  as  medianas  também  foram  próximas:  815  pg/mL \n(450 – 2947) para o grupo CTRL e 849 pg/mL (652 – 1561) para o grupo EDT. Mais uma vez, a \nmediana  do  grupo  I/II  mostrou‐se  mais  elevada:  1097  pg/mL  (684  –  1753),  porém  sem \ndiferença estatística (Figura 22B e C). \nA avaliação da citocina IL‐12 mostrou diferenças apenas comparando‐se amostras de \nsangue  de  pacientes  com  endometriose  I/II  com  controles  (p=0,03)  (Figura  22D).  Embora \nesta  citocina  esteja  presente  em  menor  concentração  no  sangue  de  pacientes  dos  grupos \nEDT  e  III/IV  do  que  em  controles,  esta  diferença  não  foi  estatisticamente  significante.  Não \nforam  encontradas  diferenças  na  concentração  de  IL‐12  entre  amostras  de  FP  entre  os \ndiversos grupos (Figura 22E). \n\n65 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n50\n100\n150\n200\n200\n600\n1000\nn.s.\nn.s.\nn.s.\nIL- 6 (pg/mL)\n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1000\n2000\n3000\n3000\n6000\n9000 n.s.\nn.s.\nn.s.\nTGF-β (pg/mL)\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n500\n1000\n1500\n2000\n2500\n3500\n5500 n.s.\nn.s.\nn.s.\nTGF-β (pg/mL)\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1000\n2000\n2000\n7000\n12000\n15000\n30000\nn.s. *\nn.s.\nIL-12 (pg/mL)\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n200\n400\n600\n800\n1000 n.s.\nn.s.\nn.s.\nIL-12 (pg/mL)\n \nFigura  22 ‐   Concentração  de  IL‐6,  TGF‐β  e  IL‐12  no  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com \nendometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e  III/IV,  e  controles  (CTRL).  Mostradas  estão  as \nconcentrações de IL‐6 no FP (A), TGF‐β no sangue e no FP (B e C) e IL‐12 no sangue no FP (D e E) das pacientes \nincluídas no estudo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II, endometriose mínima/leve; \nIII/IV, endometriose moderada/grave; *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney. \n \nQuando  comparamos  a  concentração  de  TGF‐β  e  IL‐12  entre  amostras  de  sangue  e \nFP, é possível notar uma tendência a maior concentração dessas citocinas no sangue do que \nno  FP  de  todos  os  grupos.  Para  TGF‐β,  essa  diferença  é  significativa  apenas  no  grupo  EDT \n(p=0,0081) (Figura 23A). Já para IL‐12, a diferença mostra‐se significativa para o grupo EDT \n(p=0,0003),  I/II  (p=0,03)  e  III/IV  (p=0,001).  No  grupo  controle,  apesar  de  haver  uma  maior \nA \nB  C \nD  E \n\n66 \n \nconcentração  dessas  citocinas  no  sangue  do  que  no  FP,  essa  diferença  não  é  significativa \n(TGF‐β p=0,8 e IL‐12 p=0,09) (Figura 23B). \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2000\n4000\n6000\n8000\nsangue\nPF\n**n.s. n.s. n.s.\nTGF-β (pg/mL)\n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n200\n400\n600\n600\n1600\n1600\n11600\n21600\n31600\nsangue\nPF\n*** ***n.s. *\nIL-12 (pg/mL)\n \nFigura  23 ‐   Comparação  entre  a  concentração  de  TGF‐β  (A)  e  IL‐12  (B)  em  amostras  de  sangue  e  fluido \nperitoneal  (FP)  de  controles  (CTRL)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e \nIII/IV.  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II,  endometriose  mínima/leve;  III/IV, \nendometriose  moderada/grave;  *p<0,05,  **  p<0,01,  ***  p<0,001  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  de \nWilcoxon. \nA \nB \n\n67 \n \n5           DISCUSSÃO \n \nDiversos relatos mostram que a função de várias células do sistema imune encontra‐\nse alterada em mulheres com endometriose  (13). Visto que a endometriose é uma doença \nginecológica que acomete aproximadamente 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva, \ne que as limita em diversas dimensões, há grande interesse no estudo da doença e, assim, na \nbusca  de  tratamentos  menos  invasivos  para  essas  pacientes.  Nesse  estudo,  a  hipótese \naventada  é  de  que  a  presença  de  células  com  propriedades  imunorreguladoras  no \nmicroambiente  peritoneal  seja,  pelo  menos  parcialmente,  responsável  pela  redução  da \ncapacidade  das  células  imunes  de  reagir  contra  as  células  endometriais,  permitindo  sua \nimplantação  e  permanência  em  locais  ectópico.  Assim,  aqui  foi  investigada  a  presença  e  a \nquantificação  das  células  Treg,  NK,  MDSC  e  DC  no  microambiente  peritoneal  e  sangue  de \nmulheres  com  endometriose  profunda,  além  da  avaliação  de  citocinas  pró  e  anti‐\ninflamatórias.  \nForam  incluídas  nesse  estudo  mulheres  entre  26  e  51  anos  com  endometriose \nprofunda, ausência de doença autoimune, inflamatória ou condição neoplásica (confirmado \npor  exames  médicos  e/ou  testes  laboratoriais,  quando  necessário)  e  sem  uso  de  terapia \nhormonal por pelo menos três meses prévios ao estudo.  \nEsse estudo contou com amostras de 19 pacientes, com diagnóstico de endometriose \nprofunda  confirmada  por  videolaparoscopia  e  análise  histológica  das  lesões,  e  8  controles. \nDas 19 pacientes, sete foram classificadas com endometriose mínima/leve (estágio I/II) e 12 \nforam classificadas como tendo a forma moderada/grave da doença (estágios III e IV).  \nComo  o  volume  de  FP  e  a  contagem  de  células  difere  entre  pacientes,  iniciamos  o \nestudo com uma avaliação geral das populações de leucócitos (CD45+), linfócitos T (CD3+), LT \nCD4+  e  LT  CD4+  ativados  (CD25+),  para  confirmar  se  a  distribuição  dessas  células  seria \ndiferente entre as pacientes com endometriose e em comparação com controles. Não foram \nencontradas diferenças entre amostras de sangue e FP de pacientes com endometriose (em \ndiversos  estágios)  e  controles.  Conforme  esperado,  as  populações  citadas  foram  mais \nfrequentes em amostras de sangue do que de FP. \nNo  presente  estudo,  foi  analisada  a  frequência  de  células  Treg \nCD45+CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+  comparadas  ao  quadro  geral  de  LT  (frequência \ndentre as células CD3+) e comparadas aos LT CD4+ em amostras de sangue e FP de pacientes \n\n68 \n \ncom endometriose e controles. O único resultado que mostrou diferença entre a frequência \ndestas células nas pacientes do grupo EDT e do grupo CTRL foi ao se comparar a frequência \ndestas  no  conjunto  de  LT  CD4+  no  FP;  as  pacientes  com  EDT  mostraram  uma  redução  na \nfrequência  dessas  células  no  FP,  quando  comparadas  às  controles  (Figura  5A).  Até  o \nmomento, poucos grupos de pesquisa investigaram células T reguladoras em pacientes com \nendometriose  por  meio  de  técnicas  com  alta eficácia  para  identificação  e  quantificação  de \npopulações celulares como a citometria de fluxo multiparamétrica, e, dentre esses, poucos \navaliaram essas células em amostras de fluido peritoneal. Entre esses relatos, foi observado \naumento  de  células  Foxp3+  no  endométrio  eutópico  de  mulheres  com  endometriose \nperitoneal  e  ovariana  durante  a  fase  secretora  do  ciclo  menstrual,  comparadas  com \ncontroles; essas análises foram feitas por imunohistoquímica (51). Ainda, foi mostrado que o \nnúmero  de  células  CD4+CD25+Foxp3+  está  aumentado  no  endométrio  ectópico \n(endometrioma ovariano) quando comparadas com controles (52). Os relatos quantitativos \nde  células  Treg  já  realizadas  em  amostras  de  fluido  peritoneal  (27),  incluindo  um  estudo \nanterior do nosso grupo de pesquisa, mostraram que há maior frequência dessas células no \nFP  de  pacientes  com  EDT  do  que  em  amostras  de  controles.  O  estudo  de  Podgaec  e \ncolaboradores (2012) (27) analisou a expressão de Foxp3 por PCR em tempo real (RT‐PCR) \ndentre as células CD4+CD25high previamente separadas por citômetro de fluxo, além de não \nutilizarem o marcador CD127. A RT‐ PCR reflete o quanto um determinado gene está sendo \nexpresso  em  uma  célula  (ou  conjunto  de  células).  Desse  modo,  o  estudo  citado \nanteriormente afirma maior expressão do fator de transcrição Foxp3 dentre um conjunto de \ncélulas potencialmente Treg (CD4+CD25high), entretanto, não quantifica quantas células desse \nconjunto  expressam  esse  fator.  Portanto,  não  se  pode  afirmar  se  houve  aumento  na \nfrequência  de  células  Treg  ou  se  as  células  Treg  que  existem  no  FP  das  pacientes  com \nendometriose  estão  expressando  mais  Foxp3,  o  que  poderia  estar  relacionado  com  maior \nfunção  supressora  dessas  células;  esse  pode  ser  um  dos  motivos  da  não  concordância  dos \ndados  obtidos  nesse  estudo  com  os  anteriormente  observados  por  nosso  grupo.  O  único \nestudo publicado até o momento que investiga concomitantemente a frequência de células \nTreg  no  fluido  peritoneal  e  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose  utilizando  uma \nabordagem  bastante  similar  para  caracterização  fenotípica  ao  presente  estudo,  foi  o  de \nOlkowska – Truchanowicz et al. (2013) (53). Apesar de não analisarem a expressão de CD127 \ne de sua coorte consistir de pacientes com cistos ovarianos, foi encontrada maior frequência \n\n69 \n \nde  células  Treg  no  FP  de  pacientes  com  EDT,  comparadas  com  controles,  corroborando  o \nestudo de Podgaec et al. (2012) (27). Além disso, os autores encontraram uma redução na \nfrequência  dessas  células  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com \ncontroles. Apesar de não ter sido comprovada a significância estatística no presente estudo, \nos dados apontam para uma tendência ao aumento na frequência de células Treg no sangue \nde  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  as  controles.  O  estudo  de  Olkowska  – \nTruchanowicz et al. (2013) (53) mostra, também, um aumento na frequência de células Treg \ndentre os LT auxiliares CD4+ em amostras de FP de pacientes com endometriose. Em nosso \nestudo,  a  frequência  de  células  Treg  dentre  as  células  CD4+  mostra‐se  reduzida  no  FP  de \npacientes com EDT (p=0,04, Figura 5A). O número amostral do referido estudo é semelhante \nao nosso, com apenas alguns controles a mais (EDT=17 e CTRL=15), portanto não podemos \natribuir  as  diferenças  encontradas  ao  pequeno  número  amostral.  É  possível  que  haja \ndiferença  na  distribuição  de  células  imunes  entre  pacientes  com  tipos  distintos  de \nendometriose;  enquanto  o  trabalho  de  Olkowska  –  Truchanowicz  e  colaboradores  (2013) \n(53) foca em estudar a frequência das células Treg em pacientes com cistos endometrióticos \novarianos,  o  presente  trabalho  estuda  a  frequência  dessas  células  em  pacientes  com \nendometriose profunda, um tipo geralmente mais agressivo de doença.  \nO  fato  dos  dados  obtidos  no  presente  estudo  discordarem  dos  previamente \nobservados  pode  estar  relacionado  com  a  origem  da  amostra,  o  tipo  de  endometriose \nestudada  (ovariana,  e  não  profunda),  com  o  pequeno  número  amostral  aqui  incluído,  as \ncaracterísticas  individuais  das  pacientes,  além  das  diferentes  estratégias  de  caracterização \nda população.  \nSabendo  que  LT  ativados  também  expressam  CD25  e  tem  expressão  transiente  de \nFoxp3,  acreditamos  que  o  conjunto  de  marcadores  utilizados  aqui  seja  o  mais  apropriado \npara detecção de células Treg.  \nA menor frequência de Treg no FP de pacientes com endometriose observada nesse \nestudo, particularmente em estágios mais leves de doença, é um dado bastante intrigante e \ndiverge  de  nossa  hipótese  inicial,  de  que  células  com  propriedades  imunorreguladoras \nestariam  presentes  no  microambiente  peritoneal  e  que  esse  quadro  seria  prejudicial  às \npacientes,  levando‐as  a  desenvolverem  a  doença.  Se  esta  hipótese  estivesse  correta, \nesperaríamos  encontrar  maior  frequência  de  células  Treg  no  FP  de  pacientes  com \nendometriose, principalmente de estágios III/IV, do que controles. O que observamos nessa \n\n70 \n \ncoorte,  entretanto,  é  uma  redução  na  frequência  dessas  células  no  FP  de  pacientes  com \nendometriose. Essa redução é ainda mais aparente em pacientes com EDT I/II. Esses dados \nsugerem então que essas células estejam no microambiente peritoneal para proteger contra \npossíveis  danos  causados  por  células  endometrióticas,  e  que  na  ausência  ou  redução  da \nfrequência  dessas  células,  a  doença  pode  se  desenvolver.  Células  endometriais  ectópicas \nliberam  vários  fatores  que  permitem  o  desenvolvimento  da  endometriose.  Um  quadro \noposto  é  observado  no  sangue;  uma  maior  frequência  de  Treg  em  pacientes  do  grupo  I/II, \nseguida por III/IV e controles. O fato dos dados obtidos nesse estudo mostrarem tendência à \nmaior  frequência  de  células  Treg  no  sangue  de  pacientes  com  EDT,  indica  que,  por  algum \nmotivo, mais células estão sendo produzidas. Os dados de FP mostram que essas não estão \nse  acumulando  no  FP.  É  possível,  também,  que  as  células  estejam  infiltrando  as  lesões  de \nendometriose, e por isso apresentem‐se em frequências menores no FP que no sangue. De \nfato, de acordo com Berbic e Fraser (2011) (54), muitas populações de células imunes, entre \nelas  células  NK,  DC  e  células  Treg  são  recrutadas  para  o  centro  de  lesões  endometrióticas. \nAssim, seu número é reduzido significantemente no peritônio adjacente e distante (54). \nA  razão  entre  a  frequência  de  Treg  no  FP  pela  frequência  de  células  no  sangue \ntambém é reduzida em pacientes com EDT. \nOutra população de células com propriedade imunoreguladora que poderia participar \nno  desenvolvimento  e  progressão  da  endometriose  são  as  células  NK  CD56brightCD16‐.  A \npopulação  CD56brightCD16‐  compõe  10%  do  repertório  de  células  NK  e  secreta  citocinas \n(como  IFN‐γ,  GM‐CSF,  IL‐10  e  IL‐13)  que  regulam  as  células  do  sistema  imune  (55),  sendo, \npor isso, chamada de NK imunoreguladora. Como são predominantes no útero, essas células \nsão  também  chamadas  de  NK  uterinas,  NK  deciduais  ou  NK  endometriais.  As  NK \nCD56lowCD16+ representam a maioria (90%) das células NK na periferia e tem como principal \nmecanismo de ação a citotoxicidade celular, sendo, portanto, chamadas de NK citotóxicas ou \nNK  convencionais.  Já  as  células  NK  CD56brightCD16+  são  as  células  NK  menos  estudadas  e \nestão presentes em pequena frequência no sangue e menor ainda no FP (Figura 9). \nNão  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  nenhuma  população  de  NK \ncitada  acima  entre  pacientes  com  EDT  e  CTRL,  em  amostras  de  FP  e  sangue,  mesmo \ndividindo os pacientes com EDT em estágios I/II e III/IV. A maioria dos relatos existentes na \nliteratura  até  o  momento  tem  como  objeto  de  estudo  as  células  NK  convencionais, \nCD56lowCD16+,  e  esses  dados  mostram‐se  contrastantes.  Um  estudo  recente,  liderado  por \n\n71 \n \nDias  Jr.  (56),  encontrou  maior  frequência  de  células  NK  CD3‐CD56+CD16+  no  sangue  de \npacientes  com  endometriose,  quando  comparadas  com  controles  (média  15,3%  versus \n10,6%). Essa diferença foi ainda maior comparando‐se pacientes com endometriose estágios \nIII/IV  com  controles  (19,8%  versus  10,6%),  razão  pela  qual  os  autores  sugerem  utilizar  a \nfrequência  de  NK  no  sangue  como  marcador  diagnóstico  de  endometriose  severa.  No \npresente  estudo,  a  porcentagem  média  de  células  NK  CD56lowCD16+  foi  maior   que  a \nencontrada por Dias Jr. et al. (2012) (56) (26,11%), entretanto as pacientes do grupo EDT I/II \napresentaram médias semelhantes às do grupo III/IV (28,7% versus 24,6%). As pacientes do \ngrupo controle também mostraram frequência de células NK elevada (22,7%), comparando \ncom  controles  de  Dias  Jr.  et  al.  (2012)  (56),  o  que  pode  explicar  por  que  não  houve \ndiferenças  significativas  entre  o  grupo  EDT  e  CTRL  (médias  26,11%  versus  22,7%).  Vale \nlembrar que o número de pacientes incluídas nesse estudo é consideravelmente menor do \nque o de Dias Jr. et al. (2012) (56). \nEm  outros  estudos,  no  entanto,  foi  observado  um  quadro  divergente  do  reportado \npor  Dias  Jr.  et  al.  (2012)  (56).  Em  um  estudo  multicêntrico  canadense,  não  foram \nencontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  células  CD3‐CD56+,  CD56+CD16+  ou \nCD56+CD16‐ em pacientes com endometriose e controles (57). Comparando‐se pacientes de \nestágio I/II e III/IV com controles, Provinciali et al. (1995) (58) mostrou não haver diferenças \nna  frequência  e  número  absoluto  de  células  NK  CD16+  ou  CD56+  em  amostras  de  sangue \nentre  os  grupos.  Um  estudo  mais  antigo  (59)  utilizou  os  marcadores  CD16  e  CD56  para \nidentificar  células  NK  no  FP  de  pacientes  com  EDT  e  também  observou  frequências \nsemelhantes entre amostras de pacientes com e sem a doença. Recentemente, o estudo de \nFunamizu e colaboradores (2014) (60) investigou a frequência de células NK CD56+CD16+, NK \nCD56brightCD16+  e  NK  CD56dimCD16+  no  FP  de  pacientes  com  endometriose  e  também  não \nencontrou  diferenças  significativas  entre  as  amostras  de  pacientes  com  endometriose  e \ncontroles.  \nAté  o  momento,  não  existem  na  literatura  relatos  do  estudo  de  células  NK \nCD56brightCD16‐ em pacientes com endometriose. \nSabendo  que  as  células  CD56lowCD16+  são  a  maioria  no  sangue,  e  que  as  NK \nCD56brightCD16‐  são  minoria  no  sangue,  porém  maioria  no  FP,  esperávamos  encontrar \ndiferenças  entre  a  frequência  das  populações  entre  amostras  de  sangue  e  FP.  Conforme \nesperado, a frequência de células CD56lowCD16+ e CD56brightCD16+ foi maior em amostras de \n\n72 \n \nsangue que de FP (Figura 10), enquanto a frequência de células CD56brightCD16‐ foi maior em \namostras de FP do que de sangue. \nA seguir, decidimos avaliar a expressão de CD57 e CD161, marcadores relacionados à \nmaturação e ativação de células NK, em cada população de células. Existem três hipóteses \nque  relacionam  a  origem  das  subpopulações  de  células  NK  e  o  surgimento  de  marcadores \nclássicos  como  CD56,  CD16  e  CD57.  A  primeira  hipótese  sugere  que  as  subpopulações \npossuem  fenótipos  e  funções  distintas  devido  a  suas  origens  partirem  de  precursores \ndiferentes; a segunda sugere que as células partem de um mesmo precursor, porém exposto \na  estímulos  distintos  e  por  tal  razão  são  tão  diferentes  (61).  De  acordo  com  a  terceira \nhipótese,  as  células  CD56brightCD16‐  seriam  células  imaturas  que,  conforme  vão \namadurecendo,  ganham  a  expressão  do  CD16  e  consequente  função  citotóxica  (62).  Um \nponto interessante dessa teoria é que o auge de maturação da célula NK seria atingido com \na  expressão  do  marcador  CD57.  Portanto,  durante  a  maturação,  células  CD56brightCD16‐ \npassariam  por  fases  intermediárias  (CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+)  até  o  estágio  final  de \nmaturação (células CD56+CD16+CD57+) (63).  \nAssim,  de  acordo  com  a  terceira  hipótese,  o  esperado  seria  que  células  imaturas \nCD56brightCD16‐  tivessem  menor  expressão  de  marcadores  de  maturação  como  CD57  que \ncélulas mais maduras, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+. Realmente, foi possível observar um \naumento  na  frequência  de  células  positivas  para  o  CD57  de  acordo  com  a  maturação  das \ncélulas, de células CD56brightCD16‐ a células CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+, o qual mostrou‐\nse significante apenas comparando as pacientes com EDT (dados não apresentados). \nA  frequência  de  células  NK  maduras  (CD57+)  está  aumentada  nas  células  NK \nCD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ do sangue de pacientes com endometriose comparadas com \ncontroles.  \nÉ verdade que a expressão de CD57 é crescente da população CD56brightCD16‐ para a \nCD56brightCD16+  e  mais  ainda  para  a  CD56lowCD16+,  observação  que  vem  de  acordo  com  a \nteoria da maturação. O CD57 em células NK parece estar mais associado a estágios finais de \nmaturação das células e não ao quadro não‐funcional da senescência propriamente dita. Em \ncélulas NK, o CD57 é um marcador de células mais maduras, e podem ter sido submetidas a \nmais  divisões,  resultante  de  respostas  a  patógenos  e  citocinas  (63).  Tendo  isso  em  vista,  é \npossível que o aumento da expressão de CD57 observado em pacientes com endometriose \n\n73 \n \nseja resultante da estimulação constante de células NK por células endometriais ectópicas e \nos produtos liberados por elas.  \nDe acordo com Lopez – Vergès et al. (2010), as células NK CD57+ parecem proliferar \nmenos  e  apresentam  maior  eficiência  na  citólise  induzida  por  CD16.  Para  eles,  as  células \nCD57+  seriam  células  mais  especializadas,  com  menor  produção  de  citocinas,  porém  mais \neficientes  na  lise  de  células  alvo  (63).  É  curioso  termos  encontrado  um  aumento  na \nfrequência  de  células  NK  CD57+  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  visto  que  é \ndescrita  menor  capacidade  citotóxica  de  células  NK  nessas  pacientes  (64).  A  hipótese  que \nsugerimos então, é que apesar de estar tendo estimulação antigênica excessiva pelas células \nendometriais  ectópicas,  o  que  faz  as  células  se  dividirem  mais  e  expressarem  CD57,  é \npossível  que,  por  algum  motivo,  o  reconhecimento  dessas  células  pelas  células  NK  esteja \ndeficiente. A investigação de receptores inibitórios e seus ligantes em células NK e no tecido \nendometrial  poderia  esclarecer  se  a  capacidade  de  reconhecimento  está  reduzida  nas \npacientes  com  endometriose.  Ainda,  é  possível  que  o  microambiente  peritoneal  esteja \ncontribuindo para a redução no reconhecimento de células NK. \nAs diversas populações de células NK aqui estudadas parecem ter níveis de ativação \nsemelhantes, indicados aqui pela expressão de CD161.  \nA  presença  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC),  até  o  momento,  não  foi \ninvestigada em pacientes com endometriose. As MDSC compõem um grupo heterogêneo de \ncélulas,  e  por  tal  razão,  sua  caracterização  baseada  em  marcadores  expressos  em  sua \nsuperfície se torna bastante complexa. Por isso, iniciamos a investigação de MDSC de quatro \nfenótipos:  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+,  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+CD34+,  Lin1‐HLA‐DR‐\nCD11b+CD33+C15+  e  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+CD34+CD15+.  A  frequência  de  células \nCD11b+CD33+C15+  e  CD11b+CD33+CD34+CD15+  foi  extremamente  baixa  nas  amostras  das \npacientes incluídas nesse estudo e não foram comprovadas diferenças entre os grupos (EDT \nversus CTRL ou I/II e III/IV versus CTRL), ou entre amostras estudadas (sangue versus FP em \ncada  grupo).  Por  esta  razão,  focamos  na  avaliação  de  MDSC  CD11b+CD33+e \nCD11b+CD33+CD34+.  \nOs  dados  mostram  que  ambas  as  populações  são  mais  frequentes  em  amostras  de \nsangue  de  pacientes  com  endometriose  do  que  de  controles  (Figura  14)  e  que, \nprincipalmente para as MDSC CD11b+CD33+  há tendência a menor frequência de células no \nFP  de  pacientes  com  endometriose  que  controles.  Conforme  citado  anteriormente,  em \n\n74 \n \npacientes com diversos tipos de tumores, há um aumento de frequência de MDSC no sangue \ne também no ambiente tumoral. A maior frequência de MDSC no sangue de pacientes com \nendometriose (particularmente da população CD11b+CD33+CD34+) indica maior produção de \ncélulas  imaturas  pela  medula  óssea.  No  entanto,  esperávamos  encontrar  um  aumento, \ntambém no FP dessas pacientes, e não uma tendência à diminuição na frequência de células. \nUma  hipótese  a  ser  levantada  a  partir  das  observações  do  FP  é  que,  assim  como \nocorre  em  tumores  sólidos,  e  assim  como  o  que  foi  sugerido  para  Treg,  as  células  MDSC \npodem ter sido recrutadas para o local da lesão e terem infiltrado o(s) tecido(s). Assim, sua \nfrequência  não  estaria  aumentada  no  microambiente  (FP).  Entretanto,  para  chegar  a  tal \nconclusão,  há  necessidade  de  investigação  das  populações  celulares  infiltrantes  nas  lesões \nendometriais, em paralelo às amostras de fluido peritoneal e de sangue das pacientes. \nAssim como o que ocorre com as células Treg, as MDSC parecem ser mais frequentes \nem  amostras  de  sangue  de  pacientes  do  grupo  I/II  do  que  de  III/IV  e  CTRL.  Em  tumores \nsólidos,  a  frequência  de  MDSC  tende  a  aumentar  conforme  o  estágio  da  doença,  tanto  no \nsangue quanto no próprio tumor. Vale ressaltar, no entanto, que os estágios I, II, III e IV de \nendometriose  não  são  progressivos,  ou  seja,  uma  paciente  com  endometriose  I  não \nnecessariamente  evolui  para  o  estágio  II,  e  assim  por  diante.  Apesar  dos  estágios  III/IV \nestarem geralmente associados com quadros mais graves de doença, existem pacientes com \nendometriose  severa  que  sequer  sentem  dor  ou  apresentam  sintomas,  infertilidade  ou \nqualquer  manifestação.  Com  isso,  surge  a  hipótese  que  estes  sejam  tipos  diferentes  de \nendometriose, com manifestações clínicas, cirúrgicas e até mesmo imunológicas distintas. É \npossível  que  a  endometriose  I/II  seja  um  tipo  mais  inflamatório,  e  por  este  ou  outros \nmotivos, induza maior produção de MDSC. \nAinda,  considerando  a  hipótese  de  que  as  MDSC  estejam  infiltrando  nas  lesões \nendometrióticas e por isso não tem frequência aumentada no FP, podemos considerar que \nse as pacientes do grupo III/IV apresentam menor frequência de células no FP, é possível que \nnestas  pacientes,  as  células  poderiam  estar  infiltrando  mais  nas  lesões.  Neste  cenário,  a \nendometriose  estaria  induzindo  a  produção  de  MDSC  na  medula  óssea,  o  que  faria  sua \nfrequência  aumentar  no  sangue,  e  estas  células  seriam  recrutadas  para  o  microambiente \nperitoneal.  Nesse  local,  as  MDSC  de  pacientes  com  endometriose  moderada/grave \ninfiltrariam a lesão com mais facilidade, possivelmente atraídas por mais estímulos que em \npacientes  com  endometriose  mínima/leve,  o  que  poderia  explicar  a  menor  frequência \n\n75 \n \ndessas no FP. A maior frequência de MDSC no FP de pacientes do grupo I/II poderia indicar \nque estas células foram atraídas para o local, porém ainda não infiltraram a lesão. \nAinda, a frequência de células dendríticas (DC) foi avaliada nessa coorte de pacientes. \nTrês  fenótipos  foram  escolhidos  para  a  caracterização  de  DC:  um  fenótipo  mais  geral,  Lin‐\nHLA‐DR+, um fenótipo que seleciona DC mieloides (mDC), Lin‐HLA‐DR+CD33+, e um fenótipo \npouco  utilizado  para  DC,  que  investiga  a  expressão  de  CD11b  nas  mDC,  o  Lin‐HLA‐\nDR+CD33+CD11b+ e Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b‐. \nA subdivisão de DC em humanos nas diversas subpopulações ainda não está clara na \nliteratura. De um modo geral, as DC do sangue são classificadas como DC mieloides (mDC), \nLin‐HLA‐DR+CD11c+,  e  plasmocitóides  (pDC),  Lin‐HLA‐DR+CD11c‐,  devido  a  diferenças  na \norigem, expressão de marcadores e funções dessas células. As mDC são a maioria das DC no \nsangue  e  tecidos  linfoides  e  não  linfoides  e  podem  ser  subdivididas,  ainda,  em  diversas \nsubpopulações (45).  \nEmbora  não  seja  usual  na  caracterização  de  DC,  seria  lógico  supor  que  mDC  tem  a \nexpressão  de  marcadores  que  indiquem  sua  origem  mieloide,  como  o  CD33.  Inclusive, \ndiversos relatos indicam que as DC CD11c+HLA‐DR+ comumente utilizadas em experimentos, \nsejam estas DC isoladas do sangue ou derivadas de monócitos, são de fato CD33+ (46‐48).  \nDessa  forma,  analisamos  a  frequência  geral  de  DC  e  a  frequência  de  mDC  em \npacientes com endometriose. Em nosso estudo, a frequência de DC mostrou‐se aumentada \nno sangue de pacientes com endometriose, comparadas às controles (Figura 18). Em todos \nos grupos, a frequência de DC foi maior no FP do que no sangue. Em concordância com esses \ndados,  a  razão  entre  a  frequência  de  células  no  FP  pela  frequência  de  células  no  sangue \ntambém foi menor em pacientes com endometriose. \nApesar  de  não  termos  encontrado  diferenças  significativas  na  frequência  dessas \ncélulas  no  FP  entre  os  grupos,  há  uma  tendência  à  redução  na  frequência  de  DC  em \npacientes com EDT (comparadas com controles), principalmente no grupo I/II (Figura 18B).  \nAo analisarmos a porção de DC CD33+, também não vemos diferenças entre amostras \nde pacientes com endometriose e controles. Assim como o que ocorre para as DC gerais, a \nfrequência  de  mDC  parece  ser  maior  em  amostras  de  FP  do  que  em  amostras  de  sangue \n(Figura 19). \nDentre as mDC, foi possível observar uma população CD11b+ e uma CD11b‐. É comum \na exclusão do CD11b das análises de DC, principalmente a fim de excluir contaminações por \n\n76 \n \nmonócitos  da  população  de  DC.  No  entanto,  já  foi  mostrado  que  o  CD11b  é  expresso  em \ndiversas  populações  de  DC  (65).  Patterson  et  al.  (2005)  mostra  que  até  50%  das  DC  do \nsangue  (Lin‐DR+CD1c+CD11c+)  são  CD11b+,  e  esse  número  aumenta  em  cultura  com  IL‐4  e \nGM‐CSF  (66).  Esse  grupo  isolou,  a  partir  de  DC  CD1c+  do  sangue,  duas  populações \nfenotipicamente  semelhantes,  uma  CD11b+  e  outra  CD11b‐.  Após  cultura  com  estímulos \ninespecíficos (IL‐4 e GM‐CSF), a população CD11b‐ passou a expressar altos níveis de MHC II \ne  moléculas  co‐estimuladoras  (CD80,  CD83  e  CD86),  sendo  portanto  chamadas  de  células \nmaduras.  As  células  CD11b+,  no  entanto,  passaram  a  expressar  CD1a  e  DC‐SIGN, \npermaneceram negativas para CD80 e CD83, tem baixa expressão de CD86 e eram negativas \npara CCR7, indicando que não estão maduras para migrar para linfonodos. As células CD11b+ \napresentaram níveis de endocitose superiores ao das células CD11b‐, outro indicativo de que \nestas células são de fato imaturas. Trata‐se de uma população de DC imaturas, distintas de \nmonócitos ou precursores de células de Langerhans e DC dérmicas (66).  \nApesar de não utilizarmos marcadores mais específicos de DC nesse trabalho, como \nCD11c  e  CD1c,  é  possível  que  as  DC  CD33+CD11b+  aqui  encontradas  sejam  a  população \nimatura citada por Patterson e colaboradores (2005) (66). \nEm nossas amostras, uma média de 95% das DC CD33+ do sangue são CD11b‐. No FP, \nessa frequência cai para menos de 30%, sendo mais de 70% das células CD11b+ (Figura 20). \nConsiderando  a  hipótese  de  que  as  DC  CD11b+  seriam  células  imaturas,  é  possível   propor \nque  no  FP  há  um  acúmulo  de  DC  imaturas,  enquanto  no  sangue,  predominem  as  DC \nmaduras.  Comparando‐se  amostras  de  pacientes  com  endometriose  com  amostras  de \ncontroles, no entanto, vemos menor frequência de células CD11b+ no FP de pacientes com \nendometriose. Além disso, apesar de não haver diferenças significantes, há uma tendência a \nmaior  frequência  de  CD11b‐  no  FP  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com \ncontroles (Figura 21). Em outras palavras, no FP de pacientes com endometriose, há menos \nDC imaturas (CD11b+) e mais DC maduras (CD11b‐), quando comparadas com controles. \nHá  apenas  um  relato  na  literatura  que  investiga  a  presença  de  DC  em  amostras  de \npacientes com endometriose (13). Nesse estudo, os autores avaliam o estado de maturação \nde DC no endométrio tópico e ectópico de pacientes com endometriose, através da análise \ndos  marcadores  CD1a  e  CD83  por  imunohistoquímica.  Os  dados  mostram  que  há  mais  DC \nimaturas (CD1a+) e menos células maduras (CD83+) nas lesões endometrióticas e endométrio \neutópico  de  pacientes  com  endometriose.  Apesar  da  aparente  contradição  dos  presentes \n\n77 \n \nachados, vale citar que, assim como citado para células Treg e MDSC, a frequência de células \nno  FP  não  necessariamente  reflete  a  frequência  de  células  nas  lesões.  Desse  modo,  é \npossível que mais DC imaturas (CD1a+) estejam infiltrando as lesões, o que poderia significar \nredução de sua frequência no FP. Ainda, vale lembrar que o CD1a é um marcador presente \nem  DC  dérmicas  e  LC.  Dessa  forma,  é  possível  que  as  DC  descritas  por  (13)  sejam  DC \nteciduais.  \nEstudos  recentes  abordaram  a  importância  de  DC  na  endometriose  por  meio  da \ndepleção  destas  em  um  modelo  murino  da  doença.  Os  trabalhos,  no  entanto,  mostram \nresultados contrastantes. De acordo com Pencovich et al. (2013) a depleção de DC CD11c+ \nlevou a lesões endometrióticas menores, o que indica que o desenvolvimento das lesões é \ndependente  de  DC  (67).  Para  eles,  as  DC  promoveriam  vascularização  e  crescimento  das \nlesões. Já o trabalho de Stanic et al. (2014) (68) mostra que ao depletar DC, utilizando um \nmodelo  semelhante  ao  de  Pencovich  et  al.  (2013)  (67),  as  lesões  endometrióticas  são \nmaiores. O grupo mostra, ainda, que sem DC, a expressão de CD69 diminui nos LT, e conclui \nque  as  DC  seriam  responsáveis  por  ativar  LT  e  impedir  a  formação,  ou  crescimento,  das \nlesões. \nSeja qual for o papel das DC na endometriose, é indiscutível que sua participação é \nessencial  para  o  resultado  final  da  doença.  Estudos  posteriores  focando  as  diferentes \nsubpopulações  de  DC  e  moléculas  co‐estimuladoras  deverão  ser  feitos  em  pacientes  com \nendometriose para estabelecer a função destas no desenvolvimento da doença. \nAlém  da  avaliação  das  populações  celulares,  a  análise  das  citocinas  presentes  no \nmicroambiente  é  um  indicativo  do  seu  perfil  anti  e  pró‐inflamatório,  e  reflexo  das  células \npresentes  nesse  local.  Uma  condição  com  perfil  direcionado  para  citocinas  inflamatórias, \ncom  a  presença  de  IL‐12,  IFN‐γ,  IL‐2  e  TNF‐α,  por  exemplo,  poderia  indicar  uma  resposta \nimune  efetora  aguda,  com  recrutamento  e  ativação  de  células  da  circulação  e  tecidos \nadjacentes, além da tentativa de eliminação do agente agressor. Se a eliminação do agente \nagressor  não  for  efetiva,  as  células  recrutadas  e  ativadas  no  ambiente  podem  ser \nresponsáveis  por  causar  danos  teciduais.  Já  em  uma  condição  onde  a  concentração  de \ncitocinas  anti‐inflamatórias,  como  TGF‐β  e  IL‐10,  está  aumentada  em  relação  às  citocinas \npró‐inflamatórias, poderia indicar que está ocorrendo supressão da resposta imune efetora.  \nNesse estudo, foi possível dosar efetivamente apenas a concentração de IL‐12(p70), \nTGF‐β1  e  IL‐6;  o  restante  das  citocinas  estavam  abaixo  dos  níveis  de  detecção  do  método \n\n78 \n \nutilizado.  Foi  possível  quantificar  os  níveis  de  IL‐2,  IL‐4,  TNF‐α,  IFN‐γ  e  IL‐10  apenas  em \nalguns  indivíduos  (tabela  7);  no  restante  das  amostras,  a  concentração  dessas  citocinas \nestava abaixo dos limites mínimos de detecção do CBA.    \nNo presente estudo, as frequências de IL‐6, TGF‐β1 e IL‐12 foram semelhantes entre \nas  amostras  analisadas.  A  concentração  de  IL‐12,  no  entanto,  parece  estar  diminuída  no \nsangue  de  pacientes  com  endometriose  I/II,  comparadas  com  o  grupo  CTRL  (Figura  17D). \nEsse  mesmo  padrão  é  observado  nos  grupos  EDT  e  III/IV,  apesar  do  resultado  não  atingir \nsignificância  estatística.  A  IL‐12  é  uma  citocina  liberada  por  principalmente  por  DC  e \nmacrófagos  e  ativa  células  NK  e  LT  do  tipo  Th1.  A  redução  na  concentração  de  IL‐12  no \nsangue  de  pacientes  com  endometriose  poderia  indicar  defeitos  na  ativação  de  células \nimunes  efetoras,  como  macrófagos,  células  NK  e  LT,  por  sua  vez  contribuindo  para  a \npermanência de lesões endometrióticas em locais ectópicos. \nEm  uma  doença  onde  antígenos  endometriais  viáveis  escapam  a  imunovigilância,  é \nprovável que alterações em populações de células imunorreguladoras, como as populações \naqui  estudadas,  estejam  ligadas  à  patogênese  e  progressão  da  doença.  Os  resultados  aqui \nmostrados  sugerem  que  populações  imunorreguladoras  estão  alteradas  em  pacientes  com \nendometriose. A maior frequência de células Treg, MDSC e DC no sangue de pacientes com \nendometriose (comparadas com controles) indica que o quadro gerado pela endometriose \nesteja induzindo maior produção dessas células em pacientes com a doença que indivíduos \ncontrole. Ainda, a regulação aqui sugerida parece ser a nível sistêmico e não local, visto que \nos  níveis  dessas  populações  não  estão  aumentados  no  FP  das  pacientes.  A  investigação \ndessas  populações  celulares  nas  lesões  de  endometriose  é  extremamente  importante  na \ntentativa  de  entender  se  a  reduzida  frequência  dessas  células  em  amostras  de  FP  é \nmascarada pela infiltração das células nas lesões ou se estas células simplesmente não estão \nsendo recrutadas para o microambiente. \n\n79 \n \n6          CONCLUSÕES \n \nEm  uma  doença  onde  antígenos  endometriais  viáveis  escapam  a  imunovigilância,  é \nprovável que alterações em populações de células imunorreguladoras, como as populações \naqui estudadas, estejam ligadas à patogênese e progressão da doença. \nNossos  dados  sustentam  a  hipótese inicial  de  que antígenos  endometriais  viáveis \nescapam  a  imunovigilância   em  parte  devido  a  alterações  em  populações  de  células \nimunorreguladoras,  como  as  populações  de  Treg,  MDSC  e  DC aqui  estudadas,  e  que  estas \nestejam ligadas à patogênese e progressão da doença.  Entre os achados, destacam‐se: \n \n‐  Há  maior  frequência  de  Treg,  MDSC  e  DC  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose, \ncomparadas com controles; \n  \n‐ No FP, há uma tendência à redução da frequência de Treg, MDSC e DC em pacientes com \nendometriose; \n  \n‐  Não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  das  populações  de  células  NK  entre \npacientes com endometriose e controles, tanto no sangue quanto no FP; \n \n‐  As  células  NK  de  amostras  de  sangue  de  pacientes  com  endometriose  possuem  maior \nexpressão  do  antígeno  CD57  em  sua  superfície  do  que  controles,  o  que  pode  estar \nrelacionado a células em estágio final de maturação; \n    \n‐   A  concentração  de  IL‐12  foi  reduzida  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose  versus \ncontroles;  não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  IL‐6  e  TGF‐β  entre  as \namostras de pacientes com EDT e controles; \n  \n‐  Não  foi  possível  quantificar  as  citocinas  IL‐2,  IL‐4,  IL‐10,  IFN‐γ,  TNF‐α  no  sangue  e  FP  de \npacientes  com  EDT  e  controles,  devido  aos  níveis  destas  estarem  abaixo  dos  níveis \ndetectáveis pelo kit. \n\n80 \n \nREFERÊNCIAS* \n \n1.  Kyama  CM,  Debrock  S,  Mwenda  JM,  D'Hooghe  TM.  Potential  involvement  of  the \nimmune system in the development of endometriosis. Reprod Biol Endocrinol. 2003;1:123. \n \n2.  Giudice LC, Kao LC. Endometriosis. Lancet. 2004;364(9447):1789‐99. \n \n3.  Bellelis P, Dias JA, Jr., Podgaec S, Gonzales M, Baracat EC, Abrao MS. Epidemiological \nand  clinical\n  aspects  of  pelvic  endometriosis‐a  case  series.  Rev  Assoc  Med  Bras. \n2010;56(4):467‐71. \n \n4.  Kennedy S, Bergqvist A, Chapron C, D'Hooghe T, Dunselman G, Greb R, et al. ESHRE \nguideline for the diagnosis and treatment of endometriosis. Hum Reprod. 2005;20(10):2698‐\n704. \n \n5.  Sampson  JA.  Metastatic  or  Embolic  Endometriosis,  due  to\n  the  Menstrual \nDissemination of Endometrial Tissue into the Venous Circulation. Am J Pathol. 1927;3(2):93‐\n110 43. \n \n6.  Halme  J,  Hammond  MG,  Hulka  JF,  Raj  SG,  Talbert  LM.  Retrograde  menstruation  in \nhealthy women and in patients with endometriosis. Obstet Gynecol. 1984;64(2):151‐4. \n \n7.  Eskenazi  B,  Warner  ML.  Epidemiology  of  endometriosis.  Obstet\n  Gynecol  Clin  North \nAm. 1997;24(2):235‐58. \n \n8.  Christodoulakos G, Augoulea A, Lambrinoudaki I, Sioulas V, Creatsas G. Pathogenesis \nof endometriosis: the role of defective 'immunosurveillance'. Eur J Contracept Reprod Health \nCare. 2007;12(3):194‐202. \n \n9.  Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Koninckx PR. Transforming growth factor‐beta \nactivity  is  increased  in\n  peritoneal  fluid  from  women  with  endometriosis.  Obstet  Gynecol. \n1994;83(2):287‐92. \n10.  Oral E, Olive DL, Arici A. The peritoneal environment in endometriosis. Hum Reprod \nUpdate. 1996;2(5):385‐98. \n \n11.  de  Ziegler  D,  Borghese  B,  Chapron  C.  Endometriosis  and  infertility:  pathophysiology \nand management. Lancet. 2010;376(9742):730‐8. \n \n12.  Gazvani R, Templeton A. Peritoneal\n environment, cytokines and angiogenesis in the \npathophysiology of endometriosis. Reproduction. 2002;123(2):217‐26. \n                                                             \n* De acordo com: \n  International Committee of Medical Journal Editors. [Internet]. Uniform requirements for manuscripts  \n  submitted to Biomedical Journal: sample references. [updated 2011 Jul 15]. Available from:  \n  http://www.icmje.org \n\n81 \n \n \n13.  Schulke  L,  Berbic  M,  Manconi  F,  Tokushige  N,  Markham  R,  Fraser  IS.  Dendritic  cell \npopulations  in  the  eutopic  and  ectopic  endometrium  of  women  with  endometriosis.  Hum \nReprod. 2009;24(7):1695‐703. \n \n14.  Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M, Koninckx PR. The natural killer \nactivity  of  peritoneal  fluid  lymphocytes  is \ndecreased  in  women  with  endometriosis.  Fertil \nSteril. 1992;58(2):290‐5. \n \n15.  Berbic  M,  Schulke  L,  Markham  R,  Tokushige  N,  Russell  P,  Fraser  IS.  Macrophage \nexpression  in  endometrium  of  women  with  and  without  endometriosis.  Hum  Reprod. \n2009;24(2):325‐32. \n \n16.  Chuang  PC,  Wu  MH,  Shoji  Y,  Tsai  SJ.  Downregulation  of  CD36  results  in \nreduced \nphagocytic  ability  of  peritoneal  macrophages  of  women  with  endometriosis.  J  Pathol. \n2009;219(2):232‐41. \n \n17.  Antsiferova YS, Sotnikova NY, Posiseeva LV, Shor AL. Changes in the T‐helper cytokine \nprofile  and  in  lymphocyte  activation  at  the  systemic  and  local  levels  in  women  with \nendometriosis. Fertil Steril. 2005;84(6):1705‐11. \n \n18.  Podgaec  S,\n  Abrao  MS,  Dias  JA,  Jr.,  Rizzo  LV,  de  Oliveira  RM,  Baracat  EC. \nEndometriosis:  an  inflammatory  disease  with  a  Th2  immune  response  component.  Hum \nReprod. 2007;22(5):1373‐9. \n \n19.  Podgaec  S,  Dias  Junior  JA,  Chapron  C,  Oliveira  RM,  Baracat  EC,  Abrao  MS.  Th1  and \nTh2 ummune responses related to pelvic endometriosis. Rev \nAssoc Med Bras. 2010;56(1):92‐\n8. \n \n20.  Mulayim N, Savlu A, Guzeloglu‐Kayisli O, Kayisli UA, Arici A. Regulation of endometrial \nstromal cell matrix metalloproteinase activity and invasiveness by interleukin‐8. Fertil Steril. \n2004;81 Suppl 1:904‐11. \n21.  Donnez J, Smoes P, Gillerot S, Casanas‐Roux F, Nisolle M. Vascular endothelial growth \nfactor (VEGF) in endometriosis. Hum Reprod. 1998;13(6):1686‐90. \n \n22.  Sakaguchi  S,  Sakaguchi  N,  Asano  M,  Itoh  M,  Toda  M.  Immunologic  self‐tolerance \nmaintained by activated T cells expressing IL‐2 receptor alpha‐chains (CD25). Breakdown of a \nsingle  mechanism  of  self‐tolerance  causes  various  autoimmune  diseases.  J  Immunol. \n1995;155(3):1151‐64.\n \n \n23.  Piccirillo CA, Shevach EM. Naturally‐occurring CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: \ncentral players in the arena of peripheral tolerance. Semin Immunol. 2004;16(2):81‐8. \n \n24.  Itoh M, Takahashi T, Sakaguchi N, Kuniyasu Y, Shimizu J, Otsuka F, et al. Thymus and \nautoimmunity: production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells\n as a key \nfunction  of  the  thymus  in  maintaining  immunologic  self‐tolerance.  J  Immunol. \n1999;162(9):5317‐26. \n\n82 \n \n \n25.  Sakaguchi  S,  Ono  M,  Setoguchi  R,  Yagi  H,  Hori  S,  Fehervari  Z,  et  al.  Foxp3+  CD25+ \nCD4+  natural  regulatory  T  cells  in  dominant  self‐tolerance  and  autoimmune  disease. \nImmunol Rev. 2006;212:8‐27. \n \n26.  Beyer M, Schultze JL. Regulatory T cells in cancer. Blood. 2006;108(3):804‐11. \n \n27.  Podgaec S, Rizzo \nLV, Fernandes LF, Baracat EC, Abrao MS. CD4(+) CD25(high) Foxp3(+) \ncells increased in the peritoneal fluid of patients with endometriosis. Am J Reprod Immunol. \n2012;68(4):301‐8. \n \n28.  Budiu RA, Diaconu I, Chrissluis R, Dricu A, Edwards RP, Vlad AM. A conditional mouse \nmodel  for  human  MUC1‐positive  endometriosis  shows  the  presence\n  of  anti‐MUC1 \nantibodies and Foxp3+ regulatory T cells. Disease models & mechanisms. 2009;2(11‐12):593‐\n603. \n \n29.  Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function \nof CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol. 2003;4(4):330‐6. \n \n30.  Seddiki  N,  Santner‐Nanan  B,  Martinson  J,  Zaunders  J,  Sasson  S,\n  Landay  A,  et  al. \nExpression of interleukin (IL)‐2 and IL‐7 receptors discriminates between human regulatory \nand activated T cells. J Exp Med. 2006;203(7):1693‐700. \n31.  Shen LS, Wang J, Shen DF, Yuan XL, Dong P, Li MX, et al. CD4(+)CD25(+)CD127(low/‐) \nregulatory T cells express Foxp3 and suppress effector T cell proliferation and contribute to \ngastric cancers progression. Clinical immunology. 2009;131(1):109‐18. \n \n32.  Miyao T, Floess S, Setoguchi R, Luche H, Fehling HJ, Waldmann H, et al. Plasticity of \nFoxp3(+)  T  cells  reflects  promiscuous  Foxp3  expression  in  conventional  T  cells  but  not \nreprogramming of regulatory T cells. Immunity. 2012;36(2):262\n‐75. \n \n33.  Nagler A, Lanier LL, Cwirla S, Phillips JH. Comparative studies of human FcRIII‐positive \nand negative natural killer cells. J Immunol. 1989;143(10):3183‐91. \n \n34.  Moffett‐King  A.  Natural  killer  cells  and  pregnancy.  Nature  reviews  Immunology. \n2002;2(9):656‐63. \n \n35.  Li  XF,  Charnock‐Jones  DS,  Zhang  E,  Hiby  S, \nMalik  S,  Day  K,  et  al.  Angiogenic  growth \nfactor  messenger  ribonucleic  acids  in  uterine  natural  killer  cells.  The  Journal  of  clinical \nendocrinology and metabolism. 2001;86(4):1823‐34. \n \n36.  King  A,  Burrows  T,  Verma  S,  Hiby  S,  Loke  YW.  Human  uterine  lymphocytes.  Hum \nReprod Update. 1998;4(5):480‐5. \n \n37.  Jacobs  R,  Hintzen  G, \nKemper  A,  Beul  K,  Kempf  S,  Behrens  G,  et  al.  CD56bright  cells \ndiffer in their KIR repertoire and cytotoxic features from CD56dim NK cells. European journal \nof immunology. 2001;31(10):3121‐7. \n \n\n83 \n \n38.  Jokhi PP, King A, Sharkey AM, Smith SK, Loke YW. Screening for cytokine messenger \nribonucleic  acids  in  purified  human  decidual  lymphocyte  populations  by  the  reverse‐\ntranscriptase polymerase chain reaction. J Immunol. 1994;153(10):4427‐35. \n \n39.  Lechner  MG,  Megiel  C,  Russell  SM,  Bingham  B,  Arger  N,  Woo  T,  et  al.  Functional \ncharacterization\n  of  human  Cd33+  and  Cd11b+  myeloid‐derived  suppressor  cell  subsets \ninduced  from  peripheral  blood  mononuclear  cells  co‐cultured  with  a  diverse  set  of  human \ntumor cell lines. Journal of translational medicine. 2011;9:90. \n \n40.  Goni  O,  Alcaide  P,  Fresno  M.  Immunosuppression  during  acute  Trypanosoma  cruzi \ninfection:  involvement  of  Ly6G  (Gr1(+))CD11b(+  )immature  myeloid  suppressor  cells.  Int \nImmunol. 2002;14(10):1125‐34. \n \n41.  Gabrilovich  DI,  Nagaraj  S.  Myeloid‐derived  suppressor  cells  as  regulators  of  the \nimmune system. Nature reviews Immunology. 2009;9(3):162‐74. \n \n42.  Liu C, Yu S, Kappes J, Wang J, Grizzle WE, Zinn KR, et al. Expansion of spleen myeloid \nsuppressor  cells  represses  NK\n  cell  cytotoxicity  in  tumor‐bearing  host.  Blood. \n2007;109(10):4336‐42. \n \n43.  Bakdash G, Sittig SP, van Dijk T, Figdor CG, de Vries IJ. The nature of activatory and \ntolerogenic dendritic cell‐derived signal II. Frontiers in immunology. 2013;4:53. \n \n44.  Hubo  M,  Trinschek  B,  Kryczanowsky  F,  Tuettenberg  A,  Steinbrink  K,  Jonuleit  H.\n \nCostimulatory  molecules  on  immunogenic  versus  tolerogenic  human  dendritic  cells. \nFrontiers in immunology. 2013;4:82. \n \n45.  MacDonald KP, Munster DJ, Clark GJ, Dzionek A, Schmitz J, Hart DN. Characterization \nof human blood dendritic cell subsets. Blood. 2002;100(13):4512‐20. \n \n46.  Szeberenyi JB, Rothe G, Pallinger E, Orso E, Falus A, Schmitz G. Multi\n‐color analysis of \nmonocyte  and  dendritic  cell  precursor  heterogeneity  in  whole  blood.  Immunobiology. \n2000;202(1):51‐8. \n \n47.  Upham  JW,  Lundahl  J,  Liang  H,  Denburg  JA,  O'Byrne  PM,  Snider  DP.  Simplified \nquantitation of myeloid dendritic cells in peripheral blood using flow cytometry. Cytometry. \n2000;40(1):50‐9. \n \n48.  Ma  L,  Scheers  W,  Vandenberghe  P. \nA  flow  cytometric  method  for  determination  of \nabsolute  counts  of  myeloid  precursor  dendritic  cells  in  peripheral  blood.  Journal  of \nimmunological methods. 2004;285(2):215‐21. \n \n49.  Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: \n1996. Fertil Steril. 1997;67(5):817‐21. \n \n\n84 \n \n50.  Gorgun  GT,  Whitehill  G,  Anderson  JL,  Hideshima  T,  Maguire  C,  Laubach  J,  et  al. \nTumor‐promoting  immune‐suppressive  myeloid‐derived  suppressor  cells  in  the  multiple \nmyeloma microenvironment in humans. Blood. 2013;121(15):2975‐87. \n \n51.  Berbic  M,  Hey‐Cunningham  AJ,  Ng  C,  Tokushige  N,  Ganewatta  S,  Markham  R,  et  al. \nThe role\n of Foxp3+ regulatory T‐cells in endometriosis: a potential controlling mechanism for \na complex, chronic immunological condition. Hum Reprod. 2010;25(4):900‐7. \n \n52.  Basta  P,  Majka  M,  Jozwicki  W,  Lukaszewska  E,  Knafel  A,  Grabiec  M,  et  al.  The \nfrequency of CD25+CD4+ and FOXP3+ regulatory T cells in ectopic endometrium and ectopic \ndecidua. Reprod Biol Endocrinol. 2010;8:116. \n \n53.  Olkowska‐Truchanowicz  J,  Bocian  K,  Maksym  RB,  Bialoszewska  A,  Wlodarczyk  D, \nBaranowski  W,  et  al.  CD4(+)  CD25(+)  FOXP3(+)  regulatory  T  cells  in  peripheral  blood  and \nperitoneal fluid of patients with endometriosis. Hum Reprod. 2013;28(1):119‐24. \n \n54.  Berbic  M,  Fraser  IS.  Regulatory  T  cells  and\n  other  leukocytes  in  the  pathogenesis  of \nendometriosis. Journal of reproductive immunology. 2011;88(2):149‐55. \n \n55.  Cooper  MA,  Fehniger  TA,  Turner  SC,  Chen  KS,  Ghaheri  BA,  Ghayur  T,  et  al.  Human \nnatural  killer  cells:  a  unique  innate  immunoregulatory  role  for  the  CD56(bright)  subset. \nBlood. 2001;97(10):3146‐51. \n \n56.  Dias JA, Jr., Podgaec S,\n de Oliveira RM, Carnevale Marin ML, Baracat EC, Abrao MS. \nPatients  with  endometriosis  of  the  rectosigmoid  have  a  higher  percentage  of  natural  killer \ncells in peripheral blood. J Minim Invasive Gynecol. 2012;19(3):317‐24. \n \n57.  Gagne D, Rivard M, Page M, Shazand K, Hugo P, Gosselin D. Blood leukocyte subsets \nare \nmodulated in patients with endometriosis. Fertil Steril. 2003;80(1):43‐53. \n \n58.  Provinciali  M,  Di  Stefano  G,  Muzzioli  M,  Garzetti  GG,  Ciavattini  A,  Fabris  N. \nRelationship between 17‐beta‐estradiol and prolactin in the regulation of natural killer cell \nactivity  during  progression  of  endometriosis.  Journal  of  endocrinological  investigation. \n1995;18(8):645‐52. \n \n59.  Oosterlynck \nDJ,  Meuleman  C,  Lacquet  FA,  Waer  M,  Koninckx  PR.  Flow  cytometry \nanalysis of lymphocyte subpopulations in peritoneal fluid of women with endometriosis. Am \nJ Reprod Immunol. 1994;31(1):25‐31. \n60.  Funamizu A, Fukui A, Kamoi M, Fuchinoue K, Yokota M, Fukuhara R, et al. Expression \nof  natural  cytotoxicity  receptors  on  peritoneal  fluid  natural  killer  cell  and  cytokine \nproduction by peritoneal fluid natural killer cell in women with endometriosis. Am J Reprod \nImmunol. 2014;71(4):359‐67. \n \n61.  Cooper  MA,  Fehniger  TA,  Caligiuri  MA.  The  biology  of  human  natural  killer‐cell \nsubsets. Trends in immunology. 2001;22(11):633‐40. \n \n\n85 \n \n62.  Chan A, Hong DL, Atzberger A, Kollnberger S, Filer AD, Buckley CD, et al. CD56bright \nhuman NK cells differentiate into CD56dim cells: role of contact with peripheral fibroblasts. J \nImmunol. 2007;179(1):89‐94. \n \n63.  Lopez‐Verges S, Milush JM, Pandey S, York VA, Arakawa‐Hoyt J, Pircher H, et al. CD57\n \ndefines  a  functionally  distinct  population  of  mature  NK  cells  in  the  human  CD56dimCD16+ \nNK‐cell subset. Blood. 2010;116(19):3865‐74. \n \n64.  Oosterlynck  DJ,  Cornillie  FJ,  Waer  M,  Vandeputte  M,  Koninckx  PR.  Women  with \nendometriosis show a defect in natural killer activity resulting in a decreased cytotoxicity to \nautologous endometrium. Fertil Steril. 1991;56(1):45‐51. \n \n65.  Merad M, Sathe P, Helft J, Miller J, Mortha A. The Dendritic Cell Lineage: Ontogeny \nand  Function  of  Dendritic  Cells  and  Their  Subsets  in  the  Steady  State  and  the  Inflamed \nSetting. Annu Rev Immunol. 2013;31:563‐604. \n \n66.  Patterson  S,  Donaghy  H,  Amjadi  P,  Gazzard  B,  Gotch  F,\n  Kelleher  P.  Human  BDCA‐1‐\npositive blood dendritic cells differentiate into phenotypically distinct immature and mature \npopulations in the absence of exogenous maturational stimuli: Differentiation failure in HIV \ninfection. Journal of Immunology. 2005;174(12):8200‐9. \n \n67.  Pencovich  N,  Luk  J,  Hantisteanu  S,  Hornstein  MD,  Fainaru  O.  The  development  of \nendometriosis  in \na  murine  model  is  dependent  on  the  presence  of  dendritic  cells. \nReproductive biomedicine online. 2014. \n \n68.  Stanic  AK,  Kim  M,  Styer  AK,  Rueda  BR.  Dendritic  Cells  Attenuate  the  Early \nEstablishment  of  Endometriosis‐Like  Lesions  in  a  Murine  Model.  Reproductive  sciences. \n2014. \n \n\n86 \n \nAPÊNDICE – Tabelas e figuras suplementares \n \nTabela A1 – Características clínicas das pacientes com endometriose incluídas no estudo. \nPaciente  Idade  IMC  Fase do ciclo  EAD\nDPA \nDisp. \nprofunda \nEAD \nAIC \nEAD \nAUC \nEAD \nDismeno.  Infert.  Estágio \nASRM \n1  43  21  Secretora  4  4  6  0  8  não  I \n2  26  19  Secretora  4  7  4  0  8  ST  II \n3  35  24  ND  6  6  7  2  9  ST  IV \n4  38  27  Secretora  0  4  4  0  8  2ª  IV \n5  41  21  Secretora  0  0  0  0  0  ST  II \n6  29  31  Secretora  6  7  7  0  9  1ª  III \n7  51  27  Proliferativa 0  0  0  0  5  ST  I \n8  37  27   Secretora  3  3  0  0  5  não  III \n9  43  23  ND  7  ?  7  0  8  ST  IV \n10  29  22  Proliferativa 0  8  9  3  10  1ª  IV \n11  40  22  Proliferativa 8  7  0  0  9  não   IV \n12  36  21  Secretora  7  0  0  0  10  1ª  II \n13  37  30  Proliferativa 6  5  5  0  8  1ª   II \n14  37  27  Secretora  0  0  0  0  9  ST  I \n15  44  24  Proliferativa 0  7  0  0  0  1ª  IV \n16  32  ND  IV \n17  36  22  Secretora  0  0  0  0  7  1ª  III \n18  38  21  Proliferativa  0  8  0  0  4  1ª  III \n19  40  23  Proliferativa  0  0  0  0  3  ST  IV \nIMC  =  Índice  de  Massa  Corpórea,  Fase  secretora:  1º  ao  13  dia  do  ciclo,  Fase  Proliferativa:  15°  ao  30º.  EAD:  Escala \nAnalógica  de  Dor  (leve=0‐2;  moderada=3‐7;  intensa=8‐10),  DPA:  dor  pélvia  acíclica,  disp.  profunda:  dispareunia \nprofunda,  AIC:  alterações  intestinais  cíclicas,  AUC:  alterações  urinárias  cíclicas,  Infert:  infertilidade,  1ª:  infertilidade \nprimária,  2ª:  infertilidade  secundária,  ST:  sem  tentativa  de  engravidar,  ND:  não  disponível,  ASRM:  Sociedade \nAmericana para Medicina Reprodutiva. \n\n87 \n \nTabela A2 – Local das lesões nas pacientes com endometriose incluídas nesse estudo. \nPaciente \nLocal da Doença \nPeritônio  Ovário  Trompa  Bexiga  Ureter  Retossig.  Retrocervical  Vagina  Apêndice \nFundo \nde saco Reto \n1  X  X  X  \n2  X  X  X  X \n3  X  X  X \n4  X  X  X  X \n5  X  X \n6  X  X  X  X  X \n7  X  X \n8  X \n9  X  X   X  X  X \n10  X   X   X  X   X \n11  X  X   X   x  X  X \n12  X   X   X  X \n13  X  X \n14  X \n15  X  X   X   X  X \n16  X  X   X   X  X  X \n17  X  X  \n18  X  X   X  X  X \n19  X   X   X  X  X  X  X  \nRetossig=retossigmóide. \n\n88 \n \nTabela A3 ‐ Frequências de populações de linfócitos estudadas no sangue de pacientes com endometriose \nestágios I/II e III/IV. \nSangue   I/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) \nLT   10 ± 11  7,34 (2 ‐ 20)  3,4 ± 3  3 (0,63 ‐ 5,76) \nLT CD4+  6,36 ± 7,17  4,2 (1,26 ‐ 12,2)  1,7 ± 1,64  0,82 (0,39 ‐ 3,19) \nCD4+ em CD3  59 ± 9,7  60 (55 ‐ 65)  51 ± 15,7  51 (47 ‐ 63) \nCD4+CD25+  25 ± 10  18 (6 ‐ 22)  22 ± 21  14 (9 ‐ 23) \nCD4+CD25high  2,8 ± 2,7  1,9 (0,9 ‐ 4,5)  3,8 ± 5  2,6 (1 ‐ 3,7) \nTreg em CD3  1,4 ± 1,6  0,87 (0,37 ‐ 2,29)  0,56 ± 0,65  0,31 (0,18 ‐ 0,92) \nTreg em CD4  2,16 ± 2,21  1,36 (0,6 ‐ 3,65)  1,16 ± 1,07  0,65 (0,31 ‐ 1,95) \nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose \nmoderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador. \n \n  \nTabela A4 ‐ Frequência de populações de linfócitos estudadas no fluido peritoneal de pacientes com \nendometriose estágios I/II e III/IV. \nFluido peritoneal  I/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) \nLT   8 ± 12,4  1,5 (0,28 ‐ 16,52)  3,1 ± 4,2  1,38 (0,28 ‐ 6,17) \nLT CD4+  1,94 ± 2,58  0,43 (0,13 ‐ 5,62)  0,67 ± 0,75  0,5 (0,07 ‐ 1,3) \nCD4+ em CD3  32 ± 13  29 (24 ‐ 34)  27 ± 9  26 (22 ‐ 32) \nCD4+CD25+  5,9 ± 4,7  4,8 (3,2 ‐ 7,8)  5,7 ± 3,4  5,1 (2,4 ‐ 9,3) \nCD4+CD25high  1 ± 0,92  0,97 (0,07 ‐ 1,68)  1 ± 0,8  0,96 (0,3 ‐ 1,3) \nTreg em CD3  0,06 ± 0,08  0,04 (0,002 ‐ 0,11)  0,07 ± 0,08  0,06 (0 ‐ 0,11) \nTreg em CD4  0,16 ± 0,15  0,14 (0,009 ‐ 0,32)  0,22 ± 0,22  0,26 (0 ‐ 0,36) \nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose \nmoderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador. \n \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD45\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD45\n \nFigura A1 ‐ Frequência de células CD45+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes \ncom  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo \ninterquartil. I/II – endometriose mínima/leve (n=7); III/IV = endometriose moderada/grave (n=12);   n.s. = não \nsignificativa, pelo teste t de Student não‐pareado. \n \nA  B \n\n89 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nsangue\nFP\nn.s. n.s.**\n% CD45\n \nFigura A2 – Comparação entre a frequência de células CD45+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) \nde  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e \nintervalo  interquartil.  I/II  –  endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12); \n*p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste t  de Student pareado. \n \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n5\n10\n15\n20\n25\n30\n35 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD3+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n5\n10\n15\n20\n25\n30\n35 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD3+\n \nFigura A3 ‐  Frequência de células CD3+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes \ncom endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). As células CD3+  foram calculadas como porcentagem \nde células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose \nmínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  t  de \nStudent não‐pareado. \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n5\n10\n15\n20\n25\n30\n35\nsangue\nFP\nn.s. n.s.n.s.n.s.\n% CD3+\n \nFigura A4 ‐ Comparação entre a frequência de células CD3+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de \npacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD3+  foram  calculadas  como \nporcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – \nendometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo \nteste t de Student pareado. \n \n \nA  B \n\n90 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n5\n10\n15\n20\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD4+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n6 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD4+\n \nFigura A5 ‐  Frequência de células CD4+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes \ncom endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). As células CD4+  foram calculadas como porcentagem \nde células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose \nmínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  t  de \nStudent não‐pareado ou teste de Mann‐Whitney, quando apropriado. \n \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n10\n15\n20\nsangue\nFP\nn.s. n.s.**\n% CD4+\n \nFigura A6 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de \npacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas  como \nporcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – \nendometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  *p<0,05  e  n.s.  =  não \nsignificativa, pelo teste t de Student pareado ou teste de Wilcoxon, quando apropriado. \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD4+ em CD3+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD4+ em CD3+\n \nFigura  A7 ‐   Frequência  de  células  CD4+  em  LT  de  amostras  de  sangue  (A)  e  fluido  peritoneal  (FP)  (B)  de \npacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas  como \nporcentagem de células dentre as células CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – \nendometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo \nteste t de Student não‐pareado. \nA  B \nA  B \n\n91 \n \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\nsangue\nFP\n** **** * *\n% CD4+ em CD3+\n \nFigura A8 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue e fluido peritoneal \n(FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas \ncomo porcentagem de células dentre as células CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. \nI/II – endometriose mínima/leve (n=7); III/IV = endometriose moderada/grave (n=12); *p<0,05, ** p<0,01, *** \np<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado. \n \n \nTabela A5 ‐ Comparação entre a razão de células Treg encontradas no FP pela frequência destas no sangue de \npacientes com endometriose e controles. \nRazão FP:sangue  CTRL  EDT \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p \nTreg (CD3+)  2,99 ± 6,17  0,6 (0,14 ‐ 4,62)  0,15 ± 0,27  0,01 (0 ‐ 0,18)  p=0,0171 \nTreg (CD4+)  2,42 ± 3,25  1,25 (0,61 ‐ 3,94)  0,21 ± 0,35  0,017 (0 ‐ 0,35)  p=0,0053 \nValores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR \n= intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador. \n \n \nTabela A6 – Razão entre a frequência de linfócitos T reguladores em amostras de FP pela frequência de \ncélulas no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV. \nRazão FP: sangue  I/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) \nTreg em CD3  0,08 ± 0,09  0,07 (0,003 ‐ 0,18)  0,17 ± 0,32  0,01 (0 ‐ 0,27) \nTreg em CD4  0,13 ± 0,18  0,016 (0,005 ‐ 0,31)  0,2 ± 0,4  0,009 (0 ‐ 0,44) \nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  FP  =  fluido  peritoneal,  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV= \nendometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, Treg = linfócito T regulador. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n92 \n \nTabela A7 ‐ Frequências de populações de células NK no sangue de pacientes com endometriose I/II e III/IV. \nSangue   I/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) \nCD56brightCD16‐  2,06 ± 0,66  2,11 (1,57 ‐ 2,47)  2,34 ± 1,74  1,98 (0,75 ‐ 3,4) \nCD56brightCD16+  1,06 ± 0,37  0,88 (0,76 ‐ 1,56)  1,13 ± 1,49  0,68 (0,55 ‐ 0,86) \nCD56lowCD16+  28,8 ± 13,6  32,8 (19,5 ‐ 42,5)  24,5 ± 19,3  16,5 (9,6 ‐ 43,5) \nCD56brightCD16‐CD57+  33,5 ± 30,5  39,3 (1,4 ‐ 22,9)  27,1 ± 22,6  29,2 (4,9 ‐ 47,6) \nCD56brightCD16+CD57+  47,9 ± 17,9  48 (37,6 ‐ 63,6)  47,5 ± 20,5  49,9 (32 ‐ 57,9) \nCD56lowCD16+CD57+  47,4 ± 16,8  49 (31 ‐ 63)  56 ± 21,9  60 (45 ‐ 73) \nCD56brightCD16‐CD161+  59,5 ± 33,4  63,3 (33,4 ‐ 91,3)  52 ± 24  49,5 (31,4 ‐ 75) \nCD56brightCD16+CD161+  78 ± 19  78 (57 ‐ 100)  66 ± 28  71 (50 ‐ 92) \nCD56lowCD16+CD161+  74,6 ± 28,2  89,6 (45,7 ‐ 96,3)  59 ± 34,7  65,5 (26,4 ‐ 91,3) \nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose \nmoderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.  \n \n \nTabela A8 ‐ Frequências de populações de células NK no fluido peritoneal de pacientes com endometriose \nI/II e III/IV. \nFluido Peritoneal   I/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) \nCD56brightCD16‐  7 ± 6,2  4,8 (2,3 ‐ 12,3)  11,6 ± 16,3  4,2 (1,1 ‐ 19,5) \nCD56brightCD16+  0,32 ± 0,36  0,19 (0,04 ‐ 0,49)  0,67 ± 1,13  0,18 (0,09 ‐ 1,04) \nCD56lowCD16+  7 ± 5,9  5,3 (0,86 ‐ 10,86)  12,2 ± 12,1  8,6 (2,3 ‐ 22,7) \nCD56brightCD16‐CD57+  27,8 ± 23,6  20 (6,4 ‐ 55,5)  23,3 ± 27,3  11,5 (1,6 ‐ 46,5) \nCD56brightCD16+CD57+  59,8 ± 36,1  55,5 (35,3 ‐ 100)  37,8 ± 32,7  32,2 (3 ‐60) \nCD56lowCD16+CD57+  50,9 ± 26,7  62,6 (16,4 ‐ 66)  47,8 ± 26,1  51,5 (25,5 ‐ 65,7) \nCD56brightCD16‐CD161+  54,3 ± 33,3  42,8 (36,7 ‐ 84,2)  67,9 ± 26,1  74,3 (55,5 ‐ 89) \nCD56brightCD16+CD161+  42 ± 43  44 (0 ‐ 87)  66 ± 37  81 (38 ‐ 99) \nCD56lowCD16+CD161+  64,3 ± 34,8  86,9 (31,9 ‐ 91)  66,1 ± 31,3  81,9 (40,1 ‐ 86,1) \nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose \nmoderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.  \n \n  \n\n93 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n6\n7 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD56bright CD16-\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n5\n10\n15\n20\n25\n30\n40\n50\n60 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD56bright CD16-\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n10\n35\n40\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD56brightCD16+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n3.0\n3.5\n4.0\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD56bright CD16+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n10\n20\n30\n40\n50\n60\n70 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD56low CD16+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n10\n20\n30\n40 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD56low CD16+\n \nFigura  A9 ‐   Frequência  de  populações  de  células  Natural  killer  (NK)  em  amostras  de  sangue  e  fluido \nperitoneal (FP) de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio \nI/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐ em amostras de sangue \ndos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK   CD56brightCD16‐  em  amostras  de  FP  dos \ndiferentes  grupos;  (C)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  em  amostras  de  sangue  dos \ndiferentes  grupos;  (D)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  em  amostras  de  FP  dos \ndiferentes  grupos;  (E)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56lowCD16+  em  amostras  de  sangue  dos \ndiferentes grupos; (F) Comparação da frequência de células NK CD56lowCD16+ em amostras de FP dos diferentes \ngrupos. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student \nnão pareado. \n \nA  B \nC  D \nE  F \n\n94 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 ***\n*\n**\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD57+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD57+\n \nFigura  A10 ‐  Frequência  de  populações  de  células  Natural  killer  (NK)  positivas  para  CD57  em  amostras  de \nsangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), \nsubdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐\nCD57+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  \nCD56brightCD16‐ CD57+  em amostras de FP dos diferentes grupos; (C) Comparação da frequência de células NK \nCD56brightCD16+ CD57+ em amostras de sangue dos diferentes grupos; (D) Comparação da frequência de células \nNK CD56brightCD16+ CD57+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (E) Comparação da frequência de células \nNK  CD56lowCD16+  CD57+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (F)  Comparação  da  frequência  de \ncélulas NK CD56lowCD16+ CD57+  em amostras de FP dos diferentes grupos. Dados mostrados como mediana e \nintervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student   não \npareado. \nA  B \nC  D \nE  F \n\n95 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD161+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD161+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100 n.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD161+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD161+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD161+\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\nn.s.\nn.s.\nn.s.\n% CD161+\n \nFigura A11 ‐  Frequência de populações de células Natural killer (NK) positivas para CD161 em amostras de \nsangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), \nsubdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐\nCD161+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  \nCD56brightCD16‐ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (C) Comparação da frequência de células NK \nCD56brightCD16+  CD161+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (D)  Comparação  da  frequência  de \ncélulas NK CD56brightCD16+ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (E) Comparação da frequência de \ncélulas NK CD56lowCD16+ CD161+ em amostras de sangue dos diferentes grupos; (F) Comparação da frequência \nde células NK CD56lowCD16+ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos. Dados mostrados como mediana \ne intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado. \n \n \n \n \n \n \nA  B \nC  D \nE  F \n\n96 \n \nTabela A9 ‐ Comparação entre a razão de células NK encontradas no FP pela frequência destas no \nsangue de pacientes com endometriose e controles. \nRazão FP:sangue  CTRL  EDT \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p \nCD56brightCD16‐  10,3 ± 12,6   4,39 (1,65 ‐ 16,6)  6,1 ± 9,5   2,57 (1,05 ‐ 7,35)  p=0,2536\nCD56brightCD16+  0,89 ± 1,57   0,31 (0,03 ‐ 0,97)  0,91 ± 1,61   0,22 (0,04 ‐ 0,71)  p=0,9834\nCD56lowCD16+  5,3 ± 12,1   0,51 (0,26 ‐ 3,71)  4,2 ± 16,4   0,31 (0,05 ‐ 0,7)  p=0,2536\nCD56brightCD16‐CD57+  8,1 ± 26,7   0,38 (0,02 ‐ 3,07)  2,7 ± 6,3   0,52 (0,09 ‐ 1,06)  p=8101 \nCD56brightCD16+CD57+  1,26 ± 1,57   0,71 (0 ‐ 2,35)  1,07 ± 0,77   1,17 (0,31 ‐ 1,67)  p=0,6660\nCD56lowCD16+CD57+  126 ± 355   0,78 (0,51 ‐ 1,02)  5,3 ± 19,1   0,93 (0,51 ‐ 1,25)  p=0,4257\nCD56brightCD16‐CD161+ 1,16 ± 0,54   1,2 (0,95 ‐ 1,59)  2,08 ± 3,28   1,08 (0,97 ‐ 1,78)  p=0,6515\nCD56brightCD16+CD161+ 2,3 ± 3, 4  0,89 (0 ‐ 5,38)  1,13 ± 1,43  0,91 (0 ‐ 1)  p=0,2164\nCD56lowCD16+CD161+  185 ± 519   1 (0,85 ‐ 5,35)  8,4 ± 24,2  0,96 (0,54 ‐ 1,36)  p=0,5239\nValores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR \n= intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t de Student não pareado/Mann Whitney. \n \nTabela A10 ‐ Razão entre a frequência de populações de células NK em amostras de FP pela frequência \nde células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV. \nRazão FP:sangue   I/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) \nCD56brightCD16‐  3,37 ± 2,53  3,08 (1,05 ‐ 5,81)  7,7 ± 11,6  2,43 (0,81 ‐ 11,34) \nCD56brightCD16+  0,37 ± 0,49  0,2 (0,04 ‐ 0,55)  1,2 ± 1,9  0,28 (0,03 ‐ 2,12) \nCD56lowCD16+  0,36 ± 0,49  0,22 (0,04 ‐ 0,39)  6,5 ± 20,7  0,56 (0,08 ‐ 0,73) \nCD56brightCD16‐CD57+  1,64 ± 2,33  0,74 (0,16 ‐ 3)  11,8 ± 33,5  0,3 (0,005 ‐ 4,47) \nCD56brightCD16+CD57+  1,4 ± 0,78  1,47 (1,04 ‐ 2,24)  0,87 ± 0,72  0,86 0,07 ‐ 1,43) \nCD56lowCD16+CD57+  1,26 ± 0,93  1,15 (0,51 ‐ 1,89)  7,77 ± 24  0,9 (0,49 ‐ 1,08) \nCD56brightCD16‐CD161+  2,75 ± 5,3  0,97 (0,44 ‐ 1,27)  1,69 ± 1,37  1,11 (1,06 ‐ 2,12) \nCD56brightCD16+CD161+  0,52 ± 0,49  0,87 (0 ‐ 0,91)  1,48 ± 1,68  0,96 (0,6 ‐ 1,76) \nCD56lowCD16+CD161+  1,19 ± 1,08  0,9 (0,54 ‐ 1,2)  12,7 ± 30  1 (0,62 ‐ 4,37) \nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose \nmoderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.  \n \n\n97 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0.0\n2.5\n5.0\n7.5\n10.0\n10\n30\n50 n.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6 n.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n30\n50\n70\nn.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\n \nFigura A12 – Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐ (A), CD56brightCD16+ (B) e \nCD56lowCD16+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e  frequência  de  células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e \npacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). Dados mostrados \ncomo  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose \nmoderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado. \n \nA  B \nC \n\n98 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n10\n15\n20\n100\n110\n120\nn.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5 n.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n20\n40\n60\n80\n100\n1000\n1005\n1010 n.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\n \nFigura A13 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD57+ (A), CD56brightCD16+ \nCD57+ (B) e CD56lowCD16+ CD57+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de células no sangue de controles \n(CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subdivididos  em  estágio  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12). \nDados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12), \nendometriose moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado. \n \nA  B \nC \n\n99 \n \nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n10\n15\nn.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n2\n4\n6\n8\n10 n.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\nCTRL EDT I/II III/IV\n0\n50\n100\n150\n1000\n1500\nn.s.\nn.s.\nn.s.\nRazão FP:sangue\n \nFigura A14 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD161+ (A), CD56brightCD16+ \nCD161+ (B) e CD56lowCD16+CD161+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de células no sangue de controles \n(CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subdivididos  em  estágio  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12). \nDados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12), \nendometriose moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado. \n \n \n \nTabela A11 ‐ Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de pacientes \ncom endometriose I/II e III/IV. \nI/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) \nCD11b+CD33+ (sangue)  0,29 ± 0,17  0,24 (0,18 ‐ 0,52) 0,2 ± 0,2  0,17 (0,01 ‐ 0,36)\nCD11b+CD33+CD34+ (sangue)  0,17 ± 0,11  0,17 (0,11 ‐ 0,22) 0,12 ± 0,15  0,07 (0,01 ‐ 0,17)\nCD11b+CD33+  (FP)  0,18 ± 0,13  0,16 (0,06 ‐ 0,31) 0,06 ± 0,05  0,03 (0,02 ‐ 0,1) \nCD11b+CD33+CD34+  (FP)  0,1 ± 0,08  0,09 (0,04 ‐ 0,18) 0,02 ± 0,03  0,02 (0 ‐ 0,04) \nValores apresentados como frequência de células (%). I/II = endometriose mínima/leve, III/IV= endometriose \nmoderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA  B \nC \n\n100 \n \nTabela A12 ‐ Frequências de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com \nendometriose estágios I/II e III/IV. \nI/II  III/IV \nPopulação  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) \nDC  \n(sangue)  0,34 ± 0,27  0,21 (0,12 ‐ 0,44)  0,77 ± 1,45  0,39 (0,22 ‐ 0,44) \nDC  \n(FP)  3,6 ± 5,8  0,18 (0,06 ‐ 9,94)  5,7 ± 5,2  6,8 (0,12 ‐ 10,2) \nDC CD33+   \n(sangue)  36,8 ± 47,8  23,3 (10,1 ‐ 64,6)  27,7 ± 38,5  39,4 (8,5 ‐ 91,6) \nDC CD33+  \n (FP)  63 ± 30,2  68,8 (28 ‐ 93,6)  56 ± 42  79,9 (0 ‐ 87,2) \nDC CD33+CD11b+  \n(sangue)  1,35 ± 1,41  1,07 (0 ‐ 2,75)  1,93 ± 2,78  0,93 (0,51 ‐ 1,3) \nDC CD33+CD11b+  \n(FP)  39,7 ± 31,2  37,6 (15 ‐ 63,9)  44,6 ± 38,2  54,9 (0 ‐ 73,8) \nDC CD33+CD11b‐  \n(sangue)  35,5 ± 26,8  21,1 (10,1 ‐ 61,9)  45,9 ± 38,2  36,3 (7,8 ‐ 90,6) \nDC CD33+CD11b‐  \n(FP)  23,4 ± 23,2  11,9 (7,59 ‐ 33,9) 16,4 ± 20,9  9,3 (0 ‐ 26,4) \nValores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose \nmoderada/grave, DC = célula dendrítica, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal.","source_license":"CC0","license_restricted":false}