Effects of simvastatin on the proliferation and apoptosis of human endometrial stromal cells from women with endometriosis

To evaluate the effects of simvastatin on the proliferation and apoptosis of human endometrial cells from women with endometriosis.

Endometrial tissues were obtained from four women with endometriosis. The endometrial stromal cells isolated from tissue were cultured with 0, 2 and 10 μM simvastatin treatments for 48 hours. The proliferation of endometrial stromal cells was inhibited with 2 and 10 μM simvastatin treatments compared to control. The effect of simvastatin on the sub-G1 phase of cell cycle was determined by flow cytometry. The expression of apoptosis related molecule (Bcl-2, Bax and caspase-3) was examined in control and simvastatin treatments using western blot.

The sub-G1 phase was higher in 10 μM simvastatin than in control and 2 μM simvastatin ( P<0.05). This result showed that simvastatin could induce apoptosis of stromal cells. The expression of Bcl-2 was increased in simvastatin treatments slightly ( P<0.05) and the expression of Bax was not different between control and experimental groups. The activation of caspase-3 was significantly higher in 10 μM simvastatin treated group than control and 2 μM simvastatin treated groups ( P<0.05).

Simvastatin induces apoptosis of endometrial stromal cells and inhibits their proliferation. It was considered that simvastatin could potentially be a therapeutic agent for the treatment of endometriosis. Key Words: Endometriosis, Simvastatin, Endometrial stromal cell, Apoptosis 서 론 자궁내막증은 자궁내막 조직이 자궁강 (uterine cavity) 이외의 부위에 존재하는 질환으로 만성 골반통, 불임, 월 경통, 성교통 등 다양한 임상 증상을 유발하여 삶의 질을 저해한다. 1 자궁내막증은 조기진단이 어렵고 수술을 통해 서만 확진이 가능하며, 재발이 잦은 만성 질환으로 재발 방지 및 관리에 어려움이 있다.2,3 따라서 수술적 치료 이 후에도 장기적이고 반복적인 약물 치료가 요구된다. 자궁 내막증의 발병기전에 대해서는 논란의 여지가 많으나 생리 혈의 역류현상으로 인한 이소성 착상설 (ectopic trans- 문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향 - 161 - plantation of endometrial tissue),4 유도설 (induction theory)5 및 체강 화생설 (coelomic metaplasia)6 등으로 설 명되고 있으며, 이들 중 착상설이 가장 설득력이 있는 자 궁내막증의 원인으로 주목받고 있다. 그러나 생리혈의 역 류현상이 거의 모든 여성에서 일어나는 것에 반해 자궁내 막증이 일부여성에서만 발생되는 것은 생리혈의 역류 외에 다른 원인들이 존재할 것임을 시사하고 있다. 발병 기전으로 발표된 여러 가지 원인 중 하나로 Halme 등 7은 자궁내막 세포가 복막에 착상하면 활성화된 염증세포의 축적소견을 보이며, 골반면역세포 중 대식세포 (macrophage)가 동원되어 복강내 싸이토카인의 다단계 (cascade) 분비에 의해 자궁내막증이 발생될 수 있음을 보 고하였다. 다른 원인으로 복강액내 유사분열 작용을 하는 insulin-like growth factor (IGF)가 골반내 이소성 자궁 내막 조직의 성장인자일 수 있으며, 8,9 쥐와 인간의 자궁 조직에서 에스트로겐의 중개자 역할을 하는 것이 보고되 어10,11 생리혈의 역류 외에 다른 요인들이 자궁내막증에 관 여함을 뒷받침하고 있다. Gebel 등12은 자궁내막증 환자의 경우 탈락된 자궁내막의 세포자멸사 (apoptosis) 비율이 유의하게 감소하여 복강으로 유입되는 생존 자궁내막 세포 수가 증가함으로써 자궁내막증이 발병함을 제시하였다. 또 한 Meresman 등 13은 자궁내막증을 가진 환자의 자궁내막 에서 세포자멸사를 억제하는 원발암유전자 (proto-onco- gene)인 Bcl-2가 증가되어있고, Bcl-2의 길항유전자인 Bax는 발현되지 않아 세포자멸사가 감소됨을 보고하였다. 아직도 여러 가지 원인인자들에 대한 보고가 계속되고 있 으나 자궁내막증의 발병 기전은 명확히 밝혀지지 않은 상 태이다. 자궁내막증의 치료는 수술 및 약물요법이 병행되고 있 다. 약물요법은 병변을 위축시키고 통증을 완화시키는데 목적을 두고 있으며, 14 약제로는 경구피임제,15 프로게스틴 제제16 그리고 성선자극호르몬유리호르몬 효능제 (GnRH agonist)17 등이 있다. 경구 피임제는 자궁내막조직의 증식 을 억제하며 세포자멸사를 촉진시키고, 프로게스틴 제제는 자궁내막을 탈락막화 (decidualization) 시키고 자궁내막 조직의 착상과 증식에 중요한 역할을 하는 효소인 matrix metalloproteinase (MMP)의 활성을 억제하는 것으로 보 고되었다. 16 GnRH agonist의 작용기전은 뇌하수체 GnRH 수용체의 탈감작에 의한 하향조절로 폐경과 유사한 저에스 트로겐 상태를 초래하여 무월경을 만들고 자궁내막조직을 위축시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 약제들은 각각의 단점이 있어 부작용 없이 효과적으로 장기간 사용 할 수 없는 실정이다. 경구 피임제는 부정출혈, 구역, 유방 압통, 체중 증가 및 우울증 등이 발생할 수 있고, 프로게스 틴 제제는 안드로겐 효과로 체중증가, 여드름, 유성피부 및 다모증, 변성 등이 생길 수 있으며 여성호르몬 감소로 유방 축소와 성욕 감퇴 등이 발생할 수 있다. GnRH agonist는 폐경 증상과 골 소실을 유발한다. 18 따라서 환자 의 상태에 따라 보다 특이적이고 부작용이 적은 약제에 대 한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 최근에는 statin을 이 용한 치료 연구가 보고되고 있다. Statin은 HMG-CoA 환원효소 억제제 (3-hydroxy-3- methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitor)로 혈 청 콜레스테롤 수치를 낮추어 심장 질환을 치료할 목적으 로 개발된 약제로서 항염증작용과 혈관형성 억제작용이 있 는 것이 알려지면서 자궁내막증 치료 연구에도 이용되기 시작하였다. 19 Esfandiari 등20은 in vitro에서 인간 자궁내 막 조 직 을 배 양 하 였 을 때 statin의 농 도 에 따 라 혈 관 생 성 및 세포증식 억제가 나타남을 보고하였다. 또한 Oktem 등21 은 쥐를 모델로 한 연구에서 statin이 신생혈관형성과 자 궁내막세포의 주위 침윤을 억제함을 보고하였다. Piotrowski 등22도 statin이 in vivo에서 사람의 자궁내막 기질세포의 증식을 억제시킴을 보고하여 statin이 자궁내막증의 치료 제로 이용될 수 있는 가능성을 시사하였다. 본 연구는 statin이 자궁내막증 환자의 자궁내막기질세 포 증식 억제 및 세포자멸사 유발 효과가 있는지에 대해 알아보고자 시행되었다. 연구대상 및 방법 1. 연구대상 본 연구는 부산대학교병원 산부인과에서 골반경 수술을 받은 후 조직학적으로 자궁내막증이 확진된 30~40세 사 이의 여성 4명을 대상으로 하였다. 수술 당시 모든 환자는 생리주기 중 증식기 (proliferative phase)였다. 대한산부회지 제53권 제2호, 2010 - 162 - 2. 실험방법 1) 자궁내막 기질세포의 분리배양 조직의 채취는 전 과정이 무균상태에서 이루어졌으며, 소파술로 채취된 자궁내막조직은 1% anti-biotics/anti- mycotic (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)가 첨가된 Dulbecco 's Modified Eagle's Medium/F12 (DMEM/F12; Gibco BRL) 배양액이 든 conical tube에 담아 수술실에서 실험실로 운반했으며 phosphate buffered saline (PBS; Gibco BRL)로 여러 번 세척하여 남아 있는 혈액을 제거하 였다. 배양 접시에 2~3 mL의 배양액을 담은 후 조직을 넣 고 멸균된 가위를 이용하여 1~2 mm 크기로 잘게 잘랐다. 자른 조직을 용액과 함께 conical tube로 옮겨 0.1% col- lagenase type I (Gibco BRL)과 0.05% DNase (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 처리하여 37 ℃ 항 온수조에서 1시간 30분 동안 교반 배양하였다.23 이후 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL)을 첨가한 배양액 을 첨가하여 효소작용을 정지시키고 100 μM 나일론 망 (BD Falcon: Becton Drive Franklin, Lakes, NJ, USA) 에 통과시켜 걸러낸 후 원심분리하여 상층액을 제거하였 다. 침전세포를 다시 배양액에 풀어 40 μM 나일론 망 (BD Falcon)에 통과시켜 걸러낸 후 아래의 통과액을 원심분리 하였다.24 상층액을 제거하고 가라앉은 침전물인 세포를 10% FBS, 1% antibiotics/antimycotic, 5 μg/mL insulin (Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 DMEM:F12 (1:1) 배양액에 풀어 지름 100 mm의 배양접시 (BD Falcon)에 분주 후 20분간 정치시켰다. 그 후 배양 접시에 부착된 기 질세포만을 남기고 제거 후 새 배양액을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건 배양기에서 24시간 동안 방치한 다음, 2일에 한 번씩 배양액을 교체하며 배양하였다.25 배양된 세포는 vimentin, cytokeratin (Novocastra Laboratories, Bur- lingame, CA, USA)에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 양성 및 음성결과에 따라 97% 이상의 순수한 자궁내막 기질 세포임을 확인한 후 1~3세대 세포만을 실험에 사용하였다. 2) 자궁내막세포 증식 측정법 (MTT assay) 자궁내막 기질세포를 96 -well plate에 1×104 cells/ well로 분주하여 48시간 동안 배양시킨 후, simvastatin 을 농도별로 첨가하고 배양액에서 2일간 배양하여 실험에 사용하였다. MTT (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium Bromid, Sigma, USA) 용 액 을 5 mg/mL 농도로 각 well 당 100μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 형성된 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma)를 각 well 당 100 μL 씩 첨가한 후 formazan 결정이 녹을 수 있도록 진탕하여 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3) Flow cytometry를 이용한 세포자멸사 비교 Simvastatin을 2 및 10 μM 농도로 첨가하여 48시간 배 양한 세포를 1% bovine serum albumin (BSA: Sigma)이 첨가된 PBS로 세척하고, 고정액 (70% ethyl alcohol, 0.5% Tween 20)을 첨가하여 -20 ℃에서 고정시켰다. 이 어 다시 PBS로 세척 후, 10 μg/mL propidium iodide (PI, Sigm a)와 0.1 m g/m L R N ase (Sigm a)를 처 리 하 여 4 ℃에서 빛을 차단하여 30분간 염색하였다. Flow cy- tometry 분석은 CELLFit 프로그램 (Becton-Dickinson, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하였다. 4) Western blot assay Simvastatin을 48시간 동안 처리하여 얻어진 세포를 PB S로 세 척 한 후 lysis buffer (50 m M Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1% NP40, 100 μg/mL PMSF, 2μg/mL aprotinin, 1μg/ mL pepstatin, 10μg/mL leupeptin)을 첨가하여 4℃에서 30분간 방치한 후 13,000 rpm에서 4℃ 10분간 원심분리한 뒤 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio- Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량하였다. 각 실험군에서 50 g의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리 하였고, 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 ploy- vinylidene difuride (PVDF) membrane (Bio-Rad, USA) 으로 electroblotting에 의해 transfer시켰다. M e m b r a n e 을 5 % n o n - f a t d r y m i l k T r i s - b u f f e r e d saline (10mM Tris (pH 7.7), 150mM NaCl) 용액에 1시 간 동안 담궈 비특이적 결합을 방지하기 위한 blocking을 시행하였다. Blocking 후 membrane을 1 : 1000배 희석한 문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향 - 163 - 0 μM simvastatin 2 μM simvastatin 10 μM simvastatin Fig. 1. Representative photograph examined by phase contrast microscopy to assess morphologic changes of human endometrial stromal cells from patients with endometriosis after 48h culture with 2 μM and 10 μM simvastatin (magnification, ×100). 1:1000 anti-bcl-2 (BD science, San Jose, CA, USA), anti-bax (Cell Signaling, MA, USA), β-actin (Sigma) 과 4℃에서 overnight로 반응시킨 후 TBS-T로 10분씩 6 차례 세척하였다. 그 후, TBS-T로 희석한 1 : 5000 Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rab- bit goat IgG antibody (Santa Cruz, CA, USA), Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse goat IgG antibody (Santa Cruz, USA)와 상온에서 1시간 반응시키고 5분씩 6차례 세척하였다. 마지막으로 en- hanced chemiluminescence (ECL) kit (Western blot- ting detection reagents, Amersham- Biosciences)를 이용하여 발색시킨 다음 X-ray 필름에 감광시켜 단백질 발현을 확인하였다. 5) Caspase-3 효소 활성검사 세포에 simvastatin을 48시간 동안 처리한 후 caspase -3/CPP32 Colorimetric Assay kit (Biovision Inc., USA)를 이용하여 그 활성도를 측정하였다. 모든 실험과정 은 caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay kit에서 제공 하는 실험방법에 따라 시행하였으며, 이를 간단히 기술하 면, cell lysis buffer를 이용하여 세포질 단백질만을 분리 하여 정량한 후, 50 g의 단백질을 50μL의 2x reaction buffer와 2μL의 DEVD-pNA 기질을 첨가하여 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, ELISA reader (Molecular Devices, USA)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3. 통계 처리 각각의 결과는 Student's t-test로 통계처리하였으며, P<0.05인 경우를 통계학적 의의가 있는 것으로 판정하 였다. 결 과 1. Simvastatin 처리에 의한 자궁내막 기질세포의 세포형태학적 변화 자궁내막증 환자로부터 채취한 자궁내막조직에서 분리 한 자궁내막 기질세포를 simvastatin을 첨가하지 않은 대 조군과 2 μM과 10 μM의 simvastatin을 각각 첨가한 처리 군으로 나누어 48시간 배양한 후 세포의 형태를 관찰하였 다. 그 결과 대조군에 비해 simvastatin 농도가 높아짐에 따라 자궁내막 기질세포의 밀도가 낮아지고 형태의 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 2. Simvastatin 처리에 의한 자궁내막 기질세포의 증식관찰 자궁내막 기질세포에 simvastatin을 첨가하지 않은 배 지에서 배양한 군을 대조군으로 삼고, simvastatin의 농도 를 달리하여 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM을 각각 첨가한 군을 처리군으로 하여 48시간과 72시간 배양한 후 세포증식 정도를 관찰하였다. Simvastatin 농도가 높아짐 대한산부회지 제53권 제2호, 2010 - 164 - * * ** ** ** ** * ** ** 0 20 40 60 80 100 120 Con. 0.5 1 5 10 50 Simvastatin ( μM) Cell viability (%) 48h 72h 0 0.5 1 5 10 50 † † † † † † Fig. 2. Effect of different concentrations of simvastatin on cell via- bility of endometrial stromal cells from patients with endometriosis after 48h and 72h culture. *P<0.05, †P<0.01 as determined by Student's t-test, difference compared to controls. (a) (b) (c) subG1 subG1 subG1 A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Con. Sim. 2 μm Sim. 10 μm Apoptotic cells (%) * 0 2 10 Simvastatin (μM)B Fig. 3. Cell-cycle analysis of endometrial stromal cells from patients with endometriosis after 48h culture with simvastatin. (A) Flow cytometry of cell cycle arrests with the appearance of subG1 peak; simvastatin 0 μM (a), 2 μM (b), 10 μM (c). (B) Percentage of apoptotic cells. * P<0.05 as determined by Student 's t-test, difference compared to controls. 에 따라, 그리고 처리 시간이 길어짐에 따라 세포의 성장 정도가 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 이러한 결과를 토대로 IC50 (Half maximal inhibitory concen- tration)인 10 μM 농도를 기준으로 삼아 2 μM과 10 μM의 두 농도로 다음 단계의 실험을 수행하였다. 3. Simvastatin 처리에 의한 자궁내막 기질세포의 세포자멸사 유도 자궁내막 기질세포에 simvastatin을 첨가하지 않은 대 조군과 2 μM과 10 μM의 simvastatin을 각각 첨가한 처리 군으로 나누어 48시간 배양한 후 flow cytometry를 통해 세포자멸사로 나타나는 sub-G1기를 측정하였고, 각각 3 회 반복하여 측정하였다. 그 결과, 대조군 (2.6%)에 비해 simvastatin 처리군 (2 μM simvastatin:17.1%, 10 μM simvastatin: 20.2%)에서 sub-G1기가 현저히 증가되어 simvastatin이 세포자멸사를 유도함을 알 수 있었다 (Fig. 3). 4. Bcl-2와 Bax의 발현 변화 세포자멸사에 관여하는 유전자로 알려진 Bcl-2와 Bax 의 발현 정도를 western blot을 통해 조사하였다. 그 결 과, Bcl-2의 발현 정도가 대조군에 비해 simvastatin을 처리한 군에서 전반적으로 감소하는 것으로 나타났고, 반 면에 Bax의 발현 정도에는 큰 변화가 없었다 (Fig. 4A). 두 유전자의 단백질 발현 정도 비율 (Bcl-2/Bax ratio)을 조사해 본 결과 대조군과 2 μM simvastatin을 첨가한 군 에서는 ratio에 큰 변화가 없었으나, 10 μM 첨가군에서는 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 미루어, sim- vastatin은 세포자멸사 억제유전자인 Bcl-2의 발현 억제 에 영향을 미쳐 세포자멸사를 유도하는 것으로 생각된다 (Fig. 4B). 문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향 - 165 - Simvastatin (μM, 48h) 0 2 10 Bcl-2 Bax β-Actin A ** 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Con. Sim. 2 μMS i m . 1 0 μM Bcl-2/Bax ratio Simvastatin (μM) 0 2 10 B * Fig. 4. Protein expression of Bcl-2 and Bax in endometrial stormal cells from patients with endometriosis after 48h culture with simvastatin 0 μM, 2 μM, and 10 μM. (A) Western blot analysis. (B) The ratio of Bcl-2/Bax. * P<0.01 as determined by Student 's t-test, difference compared to controls. * 80 90 100 110 120 Con. Sim. 2 μMS i m . 1 0 μM Caspase 3 activity (%) 0 2 10 Simvastatin (μM) Fig. 5. Effect of simvastatin on the caspase-3 activity on the endometrial stromal cells from patients with endometriosis after 48h culture with simvastatin. *P<0.05 as determined by Student 's t-test, difference compared to controls. 5. Caspase-3 활성도 세포자멸사를 유도하는 것으로 알려진 caspase-3의 효 소 활성을 caspase activity assay kit를 이용하여 조사하 였다. 그 결과, simvastatin을 첨가한 군에서 대조군에 비 해 그 활성도가 증가하였고, 특히 10 μM simvastatin을 첨가한 군에서 caspase-3 효소 활성도가 대조군과 유의한 차이를 보여 ( P<0.05), simvastatin에 의한 세포자멸사 과 정에서 caspase-3 효소의 활성도 증가에 의해 세포자멸사 가 유도됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). 고 찰 자궁내막증은 가장 흔한 부인과 양성질환 중의 하나이 며 가임기 여성의 6~10%가 이 질환을 가지고 있다.26 이 질환은 그 임상 증상이 매우 다양하여 많은 연구에도 불구 하고 아직까지 확실한 원인과 증상의 발현 기전이 명확하 게 밝혀지지 않은 실정이지만, 자궁내막 세포를 포함한 월 경혈이 난관을 통해 역류하여 복강내에 착상한 다음 월경 주기에 따라 증식과 출혈을 반복하면서 자궁내막증을 일으 킨다는 이소성 착상설이 가장 설득력을 얻고 있다. 4 자궁 내막증에 이환된 여성의 정상부위 자궁내막과 정상 여성의 자궁내막은 많은 차이점이 존재하는데, 세포증식, 면역세 포, 접합인자, 단백질 분해효소 및 억제효소, 스테로이드 호르몬, 싸이토카인 등의 생성과 반응성, 유전자의 표현과 단백질 생성에 있어서 차이가 있다고 알려져 있다. 27 이러 한 차이점은 자궁내막 세포가 복강내로 역류되어도 생존하 여 자궁내막증을 발병하게 하는 현상을 설명 가능하게 한 다. 세포자멸사는 모든 다세포 기관에서 발생할 수 있으 며, 세포증식과 세포소실이 균형을 이룸으로써 적절한 세 포의 수를 유지하게 하거나 세포의 분화 및 발달을 조절하 는 기능을 한다. 최근 들어 자궁내막증 환자의 정상부위 자궁내막과 이소성 자궁내막에서의 세포자멸사 과정이 보 고되고 있는데, 정상인의 자궁내막은 세포자멸사를 통하여 자궁내막 기능층의 노화된 세포를 제거함으로써 세포의 항 상성을 유지하지만 자궁내막증 환자의 역류된 자궁내막 세 대한산부회지 제53권 제2호, 2010 - 166 - 포는 세포자멸사 과정이 현저하게 감소되고,121212 선상피세포 에서의 세포자멸사 지수 (apoptotic index)도 감소된다고 보고되고 있다.28 이러한 현상은 자궁내막의 생리주기에서 후기 분비기와 생리기 및 전기 증식기에 걸쳐 나타나는데, 이는 정상 자궁내막의 세포자멸사와는 다른 현상으로 정상 적인 생리주기에서는 후기 분비기와 생리기의 선상피세포 에서 세포자멸사가 많이 관찰되나, 증식기와 초기 분비기 에서는 세포자멸사가 적게 관찰된다. 29,30 현재까지 자궁내막에서의 세포자멸사 과정에 대해서는 알려지지 않은 것이 많으나 Bcl-2는 자궁내막의 선상피세 포와 기질세포에서 증식기에 많이 발현되고 후기 증식기에 최고로 발현되어 세포자멸사 과정을 억제하며, 후기 분비 기와 생리기로 갈수록 발현이 감소된다. 31 Bax는 Bcl-2계 유전자 중 하나이며, 세포자멸사 과정 을 조장하여 Bcl-2에 길항하는 것으로 알려져 있다.32 서 등30은 정상 자궁내막의 생리주기에 따른 Bcl-2 단백질의 분포는 월경주기 전반에 걸쳐 자궁내막 기저층에서 확인되 며, 초기 증식기, 후기 증식기에는 Bcl-2 단백질의 발현이 증가하였고, 후기 분비기에는 자궁내막 기능층에서 Bax 유전자 및 단백질의 발현 비율이 월경주기에 따라 변화하 는 것을 보고하였다. 김 등 33은 초기 증식기 및 후기 증식 기에서 자궁내막증의 정상부위 자궁내막에서 Bcl-2 단백 질의 발현이 현저히 감소되며 세포증식은 증가되어 있는 것을 확인함으로써 비정상적인 세포자연사 과정이 일어남 을 보고하였다. 최근 항산화물질이 자궁내막증 환자의 기질세포 증식을 억제한다는 연구 결과가 발표되고 있어 내인성 항산화효과 (intrinsic antioxidant activity)를 가진 statin에 대한 관 심이 높아지고 있다. 34-36 Statin의 세포증식 억제작용은 HMG-CoA 환원효소를 억제시킴으로써 콜레스테롤 생합 성과정의 중간물질인 프레닐이량체 (isoprenyl: geranyl- geranyl pyrophosphate와 farnesyl pyrophosphate)와 메발로산염을 고갈시켜 세포가 이러한 물질을 이용하는 능 력을 감소시키고, RAS와 RHO와 같은 small GTPases의 활성을 낮추어 성장신호전달경로 (growth-promoting signal transduction pathway)를 방해하여 세포증식을 억제하는 것으로 보고되었다. 34-37 또한 NADPH 산화제에 의해 활성산소 생성에 필수적인 RAC의 활성을 억제시키고 직접적인 항산화작용을 하여 세포증식을 억제시키는 것으 로 보고되었다.38 Statin과 자궁내막 기질세포 증식에 관 한 논문이 발표되고 있는데, Piotrowski 등22은 인간 자궁 내막 기질세포의 배양 시 statin의 농도가 증가할수록 세 포증식 억제효과가 크고, 콜레스테롤이나 메발로산염을 첨 가하면 세포증식이 재개되는 것을 관찰하여 statin의 세포 증식 억제효과를 역설적으로 보고하였다. Esfandiari 등 20 은 인간 자궁내막 조직을 fibrin matrix에서 2주간 배양하 였을 때 혈관형성을 확인하였고, 5 μM과 10 μM의 statin 을 배양액에 첨가하였을 때 혈관이 형성되지 않았으며 세 포증식이 억제되고, 1 μM의 statin을 첨가하였을 경우 혈 관형성은 억제되었으나 세포증식의 억제효과는 없었다고 보고하였다. 본 연구에서도 인간 자궁내막 기질세포에 simvastatin의 농도를 달리하여 처리하여 배양한 결과 세 포형태학적 변화가 나타나고, 세포의 성장 정도가 억제되 는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). Cafforio 등 39은 lymphoblast와 myeloma를 여러 종류 의 20 μM statin을 첨가한 배양액을 사용하여 24시간 배 양한 후 thymidine 이용치를 측정하여 세포증식 억제효 과, 세포주기 중 sub-G0/G1기와 caspase-3,8,9의 효소 활성을 조사함으로써 세포자멸사 유도효과를 연구하였다. 실험결과, provastatin을 제외한 모든 statin에서 thymidine 이용치가 감소하여 세포증식이 억제되었으며, TUNEL 염 색에서는 70%에서 양성반응을 나타내고 caspase-3 효소 활성의 경우 대조군보다 2~4배의 활성도를 나타내어 statin이 세포자멸사를 유도함을 보고하였다. 본 연구에서 도 2 μM과 10 μM의 simvastatin을 첨가하여 자궁내막 기 질세포를 배양한 결과 대조군에 비해 simvastatin 첨가군 에서 sub-G1기가 유의하게 증가하였고, caspase-3의 활 성도도 10 μM simvastatin 첨가군에서 대조군보다 유의하 게 증가되어 있어, simvastatin이 세포자멸사를 유도함을 알 수 있었다. Simvastatin 2 μM과 10 μM을 첨가하여 Bcl-2와 Bax의 발현을 조사한 결과에서는 Bcl-2의 발현 은 대조군에 비하여 처리군에서 감소하였으나, Bax 발현 은 변화가 없는 것으로 나타났다. 그러나 Bcl-2와 Bax의 ratio를 비교한 결과 10 μM의 simvastatin 처리군에서 ratio의 유의한 감소를 보여 simvastatin이 세포자멸사 억 제 유전자인 Bcl-2의 발현을 억제하여 세포자멸사를 유도 하는 것으로 생각된다. 이상의 결과를 종합해 보면, simvastatin은 자궁내막 문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향 - 167 - 기질세포의 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도하는 것으 로 나타나 자궁내막증 치료제로 이용될 수 있는 가능성을 보여주었다. 그러나 본 연구의 대상군은 4명으로 표본 집 단의 수가 적어 향후 보다 많은 환자를 대상으로 한 추가 실험이 필요할 것으로 생각된다. 참고문헌 1. Strathy JH, Molgaard CA, Coulam CB, Melton LJ 3rd. Endometriosis and infertility: a laparoscopic study of endometriosis among fertile and infertile women. Fertil Steril 1982; 38: 667-72. 2. Husby GK, Haugen RS, Moen MH. Diagnostic delay in w om en with pain and endom etriosis. A cta O bstet Gyencol Scand 2003; 82: 649-53. 3. Ballard K, Lowton K, Wright J. What's the delay? A qualitative study of women's experiences of reaching a diagnosis of endometriosis. 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Caspase-3의 효소 활성 조사에서 10 μM simvastatin 을 첨가한 군이 대조군에 비해 활성도가 유의하게 증가하였다 (P<0.05). 결론: Simvastatin은 자궁내막 기질세포의 증식과 세포자멸사 억제유전자인 Bcl-2의 발현을 억제하고 caspase-3의 효소 활성을 증가시키는 것으로 나타나 자궁내막증의 치료제로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 중심단어: 자궁내막증, Simvastatin, 자궁내막 기질세포, 세포자멸사