{"paper_id":"72e71a02-c03f-4fae-a1fe-a62c3060ea24","body_text":"Korean Journal of Obstetrics and Gynecology\nVol. 53  No. 2  February 2010\n- 160 -\n접 수 일：2009. 12. 16.\n채 택 일：2010.  1. 27.\n교신저자：나용진\nE-mail：yjna@pusan.ac.kr\n* 이 논문은 부산대학교 자유과제 학술연구비 (2년)에 의하여 연구되었음.\nSimvastatin이 자궁내막증 환자의\n자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향\n부산대학교 의과대학 산부인과학교실\n문수현 ․ 이성의 ․ 김휘곤 ․ 최욱환 ․ 이규섭 ․ 나용진\nEffects of simvastatin on the pro liferation and apoptosis of human \nendometrial stromal cells from women with endometriosis\nSoo-Hyeon Moon, M.D., Seong-Eui L ee, M.D., Hwi-Gon Kim, M.D., \nOok-Hwan Choi, M.D., Kyu-Sup Lee, M.D., Yong-Jin Na, M.D.\nDepartment of Obstetrics and Gynecology, \nPusan National University School of Medicine, Busan, Korea\nObjective: To evaluate the effects of simvastatin on the proliferation and apoptosis of human endometrial cells from women with \nendometriosis.\nMethods: Endometrial tissues were obtained from four women with endometriosis. The endometrial stromal cells isolated from tissue were \ncultured with 0, 2 and 10 μM simvastatin treatments for 48 hours. The proliferation of endometrial stromal cells was inhibited with 2 \nand 10 μM simvastatin treatments compared to control. The effect of simvastatin on the sub-G1 phase of cell cycle was determined by \nflow cytometry. The expression of apoptosis related molecule (Bcl-2, Bax and caspase-3) was examined in control and simvastatin  \ntreatments using western blot. \nResults: The sub-G1 phase was higher in 10 μM simvastatin than in control and 2 μM simvastatin ( P<0.05). This result showed that \nsimvastatin could induce apoptosis of stromal cells. The expression of Bcl-2 was increased in simvastatin treatments slightly ( P<0.05) and \nthe expression of Bax was not different between control and experimental groups. The activation of caspase-3 was significantly higher in \n10 μM simvastatin treated group than control and 2 μM simvastatin treated groups ( P<0.05). \nConclusion: Simvastatin induces apoptosis of endometrial stromal cells and inhibits their proliferation. It was considered that simvastatin could \npotentially be a therapeutic agent for the treatment of endometriosis.\nKey Words: Endometriosis, Simvastatin, Endometrial stromal cell, Apoptosis\n서   론\n자궁내막증은 자궁내막 조직이 자궁강 (uterine cavity) \n이외의 부위에 존재하는 질환으로 만성 골반통, 불임, 월\n경통, 성교통 등 다양한 임상 증상을 유발하여 삶의 질을 \n저해한다.\n1 자궁내막증은 조기진단이 어렵고 수술을 통해\n서만 확진이 가능하며, 재발이 잦은 만성 질환으로 재발 \n방지 및 관리에 어려움이 있다.2,3 따라서 수술적 치료 이\n후에도 장기적이고 반복적인 약물 치료가 요구된다. 자궁\n내막증의 발병기전에 대해서는 논란의 여지가 많으나 생리\n혈의 역류현상으로 인한 이소성 착상설 (ectopic trans-\n\n문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향\n- 161 -\nplantation of endometrial tissue),4 유도설 (induction \ntheory)5 및 체강 화생설 (coelomic metaplasia)6 등으로 설\n명되고 있으며, 이들 중 착상설이 가장 설득력이 있는 자\n궁내막증의 원인으로 주목받고 있다. 그러나 생리혈의 역\n류현상이 거의 모든 여성에서 일어나는 것에 반해 자궁내\n막증이 일부여성에서만 발생되는 것은 생리혈의 역류 외에 \n다른 원인들이 존재할 것임을 시사하고 있다.  \n발병 기전으로 발표된 여러 가지 원인 중 하나로 \nHalme 등\n7은 자궁내막 세포가 복막에 착상하면 활성화된 \n염증세포의 축적소견을 보이며, 골반면역세포 중 대식세포 \n(macrophage)가 동원되어 복강내 싸이토카인의 다단계 \n(cascade) 분비에 의해 자궁내막증이 발생될 수 있음을 보\n고하였다. 다른 원인으로 복강액내 유사분열 작용을 하는 \ninsulin-like growth factor (IGF)가 골반내 이소성 자궁\n내막 조직의 성장인자일 수 있으며,\n8,9 쥐와 인간의 자궁 \n조직에서 에스트로겐의 중개자 역할을 하는 것이 보고되\n어10,11 생리혈의 역류 외에 다른 요인들이 자궁내막증에 관\n여함을 뒷받침하고 있다. Gebel 등12은 자궁내막증 환자의 \n경우 탈락된 자궁내막의 세포자멸사 (apoptosis) 비율이 \n유의하게 감소하여 복강으로 유입되는 생존 자궁내막 세포\n수가 증가함으로써 자궁내막증이 발병함을 제시하였다. 또\n한 Meresman 등\n13은 자궁내막증을 가진 환자의 자궁내막\n에서 세포자멸사를 억제하는 원발암유전자 (proto-onco-\ngene)인 Bcl-2가 증가되어있고, Bcl-2의 길항유전자인 \nBax는 발현되지 않아 세포자멸사가 감소됨을 보고하였다. \n아직도 여러 가지 원인인자들에 대한 보고가 계속되고 있\n으나 자궁내막증의 발병 기전은 명확히 밝혀지지 않은 상\n태이다.\n자궁내막증의 치료는 수술 및 약물요법이 병행되고 있\n다. 약물요법은 병변을 위축시키고 통증을 완화시키는데 \n목적을 두고 있으며,\n14 약제로는 경구피임제,15 프로게스틴 \n제제16 그리고 성선자극호르몬유리호르몬 효능제 (GnRH \nagonist)17 등이 있다. 경구 피임제는 자궁내막조직의 증식\n을 억제하며 세포자멸사를 촉진시키고, 프로게스틴 제제는 \n자궁내막을 탈락막화 (decidualization) 시키고 자궁내막\n조직의 착상과 증식에 중요한 역할을 하는 효소인 matrix \nmetalloproteinase (MMP)의 활성을 억제하는 것으로 보\n고되었다.\n16 GnRH agonist의 작용기전은 뇌하수체 GnRH \n수용체의 탈감작에 의한 하향조절로 폐경과 유사한 저에스\n트로겐 상태를 초래하여 무월경을 만들고 자궁내막조직을 \n위축시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 약제들은 \n각각의 단점이 있어 부작용 없이 효과적으로 장기간 사용\n할 수 없는 실정이다. 경구 피임제는 부정출혈, 구역, 유방 \n압통, 체중 증가 및 우울증 등이 발생할 수 있고, 프로게스\n틴 제제는 안드로겐 효과로 체중증가, 여드름, 유성피부 \n및 다모증, 변성 등이 생길 수 있으며 여성호르몬 감소로 \n유방 축소와 성욕 감퇴 등이 발생할 수 있다. GnRH \nagonist는 폐경 증상과 골 소실을 유발한다.\n18 따라서 환자\n의 상태에 따라 보다 특이적이고 부작용이 적은 약제에 대\n한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 최근에는 statin을 이\n용한 치료 연구가 보고되고 있다. \nStatin은 HMG-CoA 환원효소 억제제 (3-hydroxy-3- \nmethylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitor)로 혈\n청 콜레스테롤 수치를 낮추어 심장 질환을 치료할 목적으\n로 개발된 약제로서 항염증작용과 혈관형성 억제작용이 있\n는 것이 알려지면서 자궁내막증 치료 연구에도 이용되기 \n시작하였다.\n19 Esfandiari 등20은 in vitro에서 인간 자궁내\n막 조 직 을  배 양 하 였 을  때  statin의  농 도 에  따 라  혈 관 생 성 \n및 세포증식 억제가 나타남을 보고하였다. 또한 Oktem 등21\n은 쥐를 모델로 한 연구에서 statin이 신생혈관형성과 자\n궁내막세포의 주위 침윤을 억제함을 보고하였다. Piotrowski \n등22도 statin이 in vivo에서 사람의 자궁내막 기질세포의 \n증식을 억제시킴을 보고하여 statin이 자궁내막증의 치료\n제로 이용될 수 있는 가능성을 시사하였다.\n본 연구는 statin이 자궁내막증 환자의 자궁내막기질세\n포 증식 억제 및 세포자멸사 유발 효과가 있는지에 대해 \n알아보고자 시행되었다. \n연구대상 및 방법\n1. 연구대상\n본 연구는 부산대학교병원 산부인과에서 골반경 수술을 \n받은 후 조직학적으로 자궁내막증이 확진된 30~40세 사\n이의 여성 4명을 대상으로 하였다. 수술 당시 모든 환자는 \n생리주기 중 증식기 (proliferative phase)였다.\n\n대한산부회지 제53권 제2호, 2010\n- 162 -\n2. 실험방법\n1) 자궁내막 기질세포의 분리배양\n조직의 채취는 전 과정이 무균상태에서 이루어졌으며, \n소파술로 채취된 자궁내막조직은 1% anti-biotics/anti-\nmycotic (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)가 첨가된 \nDulbecco\n's Modified Eagle's Medium/F12 (DMEM/F12; \nGibco BRL) 배양액이 든 conical tube에 담아 수술실에서 \n실험실로 운반했으며 phosphate buffered saline (PBS; \nGibco BRL)로 여러 번 세척하여 남아 있는 혈액을 제거하\n였다. 배양 접시에 2~3 mL의 배양액을 담은 후 조직을 넣\n고 멸균된 가위를 이용하여 1~2 mm 크기로 잘게 잘랐다. \n자른 조직을 용액과 함께 conical tube로 옮겨 0.1% col-\nlagenase type I (Gibco BRL)과 0.05% DNase (Boehringer \nMannheim, Mannheim, Germany)를 처리하여 37\n℃ 항\n온수조에서 1시간 30분 동안 교반 배양하였다.23 이후 10% \nfetal bovine serum (FBS: Gibco BRL)을 첨가한 배양액\n을 첨가하여 효소작용을 정지시키고 100\nμM 나일론 망 \n(BD Falcon: Becton Drive Franklin, Lakes, NJ, USA)\n에 통과시켜 걸러낸 후 원심분리하여 상층액을 제거하였\n다. 침전세포를 다시 배양액에 풀어 40\nμM 나일론 망 (BD \nFalcon)에 통과시켜 걸러낸 후 아래의 통과액을 원심분리\n하였다.24 상층액을 제거하고 가라앉은 침전물인 세포를 \n10% FBS, 1% antibiotics/antimycotic, 5 μg/mL insulin \n(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 DMEM:F12 (1:1) \n배양액에 풀어 지름 100 mm의 배양접시 (BD Falcon)에 \n분주 후 20분간 정치시켰다. 그 후 배양 접시에 부착된 기\n질세포만을 남기고 제거 후 새 배양액을 첨가하여 37\n℃, \n5% CO2 조건 배양기에서 24시간 동안 방치한 다음, 2일에 \n한 번씩 배양액을 교체하며 배양하였다.25 배양된 세포는 \nvimentin, cytokeratin (Novocastra Laboratories, Bur-\nlingame, CA, USA)에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 \n양성 및 음성결과에 따라 97% 이상의 순수한 자궁내막 기질\n세포임을 확인한 후 1~3세대 세포만을 실험에 사용하였다.\n  \n2) 자궁내막세포 증식 측정법 (MTT assay)\n자궁내막 기질세포를 96 -well plate에 1×104 cells/ \nwell로 분주하여 48시간 동안 배양시킨 후, simvastatin\n을 농도별로 첨가하고 배양액에서 2일간 배양하여 실험에 \n사용하였다. MTT (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5 \ndiphenyl tetrazolium  Bromid, Sigma, USA) 용 액 을  5\nmg/mL 농도로 각 well 당 100μL씩 첨가하여 37℃, 5% \nCO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 \n제거하고 형성된 formazan 결정을 용해시키기 위하여 \nDMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma)를 각 well 당 100 μL\n씩 첨가한 후 formazan 결정이 녹을 수 있도록 진탕하여 \nELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, \nUSA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.\n3) Flow cytometry를 이용한 세포자멸사 비교\nSimvastatin을 2 및 10 μM 농도로 첨가하여 48시간 배\n양한 세포를 1% bovine serum albumin (BSA: Sigma)이 \n첨가된 PBS로 세척하고, 고정액 (70% ethyl alcohol, \n0.5% Tween 20)을 첨가하여 -20\n℃에서 고정시켰다. 이\n어 다시 PBS로 세척 후, 10 μg/mL propidium iodide \n(PI, Sigm a)와  0.1 m g/m L R N ase (Sigm a)를  처 리 하 여 \n4\n℃에서 빛을 차단하여 30분간 염색하였다. Flow cy-\ntometry 분석은 CELLFit 프로그램 (Becton-Dickinson, \nSunnyvale, CA, USA)을 사용하였다.\n4) Western blot assay\nSimvastatin을 48시간 동안 처리하여 얻어진 세포를 \nPB S로  세 척 한  후  lysis buffer (50 m M  Tris (pH  8.0), \n150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, \n1% NP40, 100 \nμg/mL PMSF, 2μg/mL aprotinin, 1μg/ \nmL pepstatin, 10μg/mL leupeptin)을 첨가하여 4℃에서 \n30분간 방치한 후 13,000 rpm에서 4℃ 10분간 원심분리한 \n뒤 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio- \nRad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 \n이용하여 정량하였다. 각 실험군에서 50 g의 단백질을 10% \nSDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리\n하였고, 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 ploy-\nvinylidene difuride (PVDF) membrane (Bio-Rad, USA)\n으로 electroblotting에 의해 transfer시켰다. \nM e m b r a n e 을  5 %  n o n - f a t  d r y  m i l k  T r i s - b u f f e r e d  \nsaline (10mM Tris (pH 7.7), 150mM NaCl) 용액에 1시\n간 동안 담궈 비특이적 결합을 방지하기 위한 blocking을 \n시행하였다. Blocking 후 membrane을 1 : 1000배 희석한 \n\n문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향\n- 163 -\n0 μM simvastatin 2 μM simvastatin 10 μM simvastatin\nFig. 1. Representative photograph examined by phase contrast microscopy to assess morphologic changes of human endometrial \nstromal cells from patients with endometriosis after 48h culture with 2 μM and 10 μM simvastatin (magnification, ×100).\n1:1000 anti-bcl-2 (BD science, San Jose, CA, USA), \nanti-bax (Cell Signaling, MA, USA), β-actin (Sigma)\n과 4℃에서 overnight로 반응시킨 후 TBS-T로 10분씩 6\n차례 세척하였다. 그 후, TBS-T로 희석한 1 : 5000 \nHorseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rab-\nbit goat IgG antibody (Santa Cruz, CA, USA), \nHorseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse \ngoat IgG antibody (Santa Cruz, USA)와 상온에서 1시간 \n반응시키고 5분씩 6차례 세척하였다. 마지막으로 en-\nhanced chemiluminescence (ECL) kit (Western blot-\nting detection reagents, Amersham- Biosciences)를 \n이용하여 발색시킨 다음 X-ray 필름에 감광시켜 단백질 \n발현을 확인하였다.\n5) Caspase-3 효소 활성검사\n세포에 simvastatin을 48시간 동안 처리한 후 caspase \n-3/CPP32 Colorimetric Assay kit (Biovision Inc., \nUSA)를 이용하여 그 활성도를 측정하였다. 모든 실험과정\n은 caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay kit에서 제공\n하는 실험방법에 따라 시행하였으며, 이를 간단히 기술하\n면, cell lysis buffer를 이용하여 세포질 단백질만을 분리\n하여 정량한 후, 50 g의 단백질을 50μL의 2x reaction \nbuffer와 2μL의 DEVD-pNA 기질을 첨가하여 37\n℃에서 \n2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, ELISA reader (Molecular \nDevices, USA)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.\n \n3. 통계 처리\n각각의 결과는 Student's t-test로 통계처리하였으며, \nP<0.05인 경우를 통계학적 의의가 있는 것으로 판정하\n였다.\n결   과\n1. Simvastatin 처리에 의한 자궁내막 기질세포의 \n세포형태학적 변화\n자궁내막증 환자로부터 채취한 자궁내막조직에서 분리\n한 자궁내막 기질세포를 simvastatin을 첨가하지 않은 대\n조군과 2 μM과 10 μM의 simvastatin을 각각 첨가한 처리\n군으로 나누어 48시간 배양한 후 세포의 형태를 관찰하였\n다. 그 결과 대조군에 비해 simvastatin 농도가 높아짐에 \n따라 자궁내막 기질세포의 밀도가 낮아지고 형태의 변화가 \n나타나는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).\n2. Simvastatin 처리에 의한 자궁내막 기질세포의 \n증식관찰\n자궁내막 기질세포에 simvastatin을 첨가하지 않은 배\n지에서 배양한 군을 대조군으로 삼고, simvastatin의 농도\n를 달리하여 0.5 \nμM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM을 각각 \n첨가한 군을 처리군으로 하여 48시간과 72시간 배양한 후 \n세포증식 정도를 관찰하였다. Simvastatin 농도가 높아짐\n\n대한산부회지 제53권 제2호, 2010\n- 164 -\n*\n*\n**\n**\n** **\n*\n**\n**\n0\n20\n40\n60\n80\n100\n120\nCon. 0.5 1 5 10 50\nSimvastatin ( μM)\nCell viability (%)\n48h\n72h\n0                      0.5                   1                  5                     10                   50 \n† †\n†\n†\n†\n†\nFig. 2. Effect of different concentrations of simvastatin on cell via-\nbility of endometrial stromal cells from patients with endometriosis \nafter 48h and 72h culture. \n*P<0.05, †P<0.01 as determined by \nStudent's t-test, difference compared to controls.\n(a)\n(b)\n(c)\nsubG1\nsubG1\nsubG1\nA\n0\n5\n10\n15\n20\n25\n30\n35\n40\nCon. Sim. 2 μm Sim. 10 μm \nApoptotic cells (%)\n*\n0                                     2                         10          \nSimvastatin (μM)B\nFig. 3. Cell-cycle analysis of endometrial stromal cells from patients with \nendometriosis after 48h culture with simvastatin. (A) Flow cytometry of \ncell cycle arrests with the appearance of subG1 peak; simvastatin 0 μM \n(a), 2 μM (b), 10 μM (c). (B) Percentage of apoptotic cells. * P<0.05 as \ndetermined by Student\n's t-test, difference compared to controls.\n에 따라, 그리고 처리 시간이 길어짐에 따라 세포의 성장 \n정도가 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 이러한 \n결과를 토대로 IC50 (Half maximal inhibitory concen-\ntration)인 10 \nμM 농도를 기준으로 삼아 2 μM과 10 μM의 \n두 농도로 다음 단계의 실험을 수행하였다. \n3. Simvastatin 처리에 의한 자궁내막 기질세포의 \n세포자멸사 유도\n자궁내막 기질세포에 simvastatin을 첨가하지 않은 대\n조군과 2 μM과 10 μM의 simvastatin을 각각 첨가한 처리\n군으로 나누어 48시간 배양한 후 flow cytometry를 통해 \n세포자멸사로 나타나는 sub-G1기를 측정하였고, 각각 3\n회 반복하여 측정하였다. 그 결과, 대조군 (2.6%)에 비해 \nsimvastatin 처리군 (2 \nμM simvastatin:17.1%, 10 μM \nsimvastatin: 20.2%)에서 sub-G1기가 현저히 증가되어 \nsimvastatin이 세포자멸사를 유도함을 알 수 있었다 (Fig. 3).\n4. Bcl-2와 Bax의 발현 변화\n세포자멸사에 관여하는 유전자로 알려진 Bcl-2와 Bax\n의 발현 정도를 western blot을 통해 조사하였다. 그 결\n과, Bcl-2의 발현 정도가 대조군에 비해 simvastatin을 \n처리한 군에서 전반적으로 감소하는 것으로 나타났고, 반\n면에 Bax의 발현 정도에는 큰 변화가 없었다 (Fig. 4A). \n두 유전자의 단백질 발현 정도 비율 (Bcl-2/Bax ratio)을 \n조사해 본 결과 대조군과 2 \nμM simvastatin을 첨가한 군\n에서는 ratio에 큰 변화가 없었으나, 10 μM 첨가군에서는  \n감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 미루어, sim-\nvastatin은 세포자멸사 억제유전자인 Bcl-2의 발현 억제\n에 영향을 미쳐 세포자멸사를 유도하는 것으로 생각된다 \n(Fig. 4B).\n\n문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향\n- 165 -\nSimvastatin (μM, 48h)\n0             2         10          \nBcl-2\nBax\nβ-Actin\nA\n**\n0.0\n0.4\n0.8\n1.2\n1.6\nCon. Sim. 2 μMS i m . 1 0 μM\nBcl-2/Bax ratio\nSimvastatin (μM)\n0                                     2                         10          \nB\n*\nFig. 4. Protein expression of Bcl-2 and Bax in endometrial stormal cells from patients with endometriosis after 48h culture with \nsimvastatin 0 μM, 2 μM, and 10 μM. (A) Western blot analysis. (B) The ratio of Bcl-2/Bax. * P<0.01 as determined by Student 's \nt-test, difference compared to controls.\n*\n80\n90\n100\n110\n120\nCon. Sim. 2 μMS i m . 1 0 μM\nCaspase 3 activity (%)\n0                                     2                         10          \nSimvastatin (μM)\nFig. 5. Effect of simvastatin on the caspase-3 activity on the \nendometrial stromal cells from patients with endometriosis after 48h \nculture with simvastatin. *P<0.05 as determined by Student\n's t-test, \ndifference compared to controls.\n5. Caspase-3 활성도\n세포자멸사를 유도하는 것으로 알려진 caspase-3의 효\n소 활성을 caspase activity assay kit를 이용하여 조사하\n였다. 그 결과, simvastatin을 첨가한 군에서 대조군에 비\n해 그 활성도가 증가하였고, 특히 10 \nμM simvastatin을 \n첨가한 군에서 caspase-3 효소 활성도가 대조군과 유의한 \n차이를 보여 (\nP<0.05), simvastatin에 의한 세포자멸사 과\n정에서 caspase-3 효소의 활성도 증가에 의해 세포자멸사\n가 유도됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). \n고   찰\n자궁내막증은 가장 흔한 부인과 양성질환 중의 하나이\n며 가임기 여성의 6~10%가 이 질환을 가지고 있다.26 이 \n질환은 그 임상 증상이 매우 다양하여 많은 연구에도 불구\n하고 아직까지 확실한 원인과 증상의 발현 기전이 명확하\n게 밝혀지지 않은 실정이지만, 자궁내막 세포를 포함한 월\n경혈이 난관을 통해 역류하여 복강내에 착상한 다음 월경\n주기에 따라 증식과 출혈을 반복하면서 자궁내막증을 일으\n킨다는 이소성 착상설이 가장 설득력을 얻고 있다.\n4 자궁\n내막증에 이환된 여성의 정상부위 자궁내막과 정상 여성의 \n자궁내막은 많은 차이점이 존재하는데, 세포증식, 면역세\n포, 접합인자, 단백질 분해효소 및 억제효소, 스테로이드 \n호르몬, 싸이토카인 등의 생성과 반응성, 유전자의 표현과 \n단백질 생성에 있어서 차이가 있다고 알려져 있다.\n27 이러\n한 차이점은 자궁내막 세포가 복강내로 역류되어도 생존하\n여 자궁내막증을 발병하게 하는 현상을 설명 가능하게 한\n다. 세포자멸사는 모든 다세포 기관에서 발생할 수 있으\n며, 세포증식과 세포소실이 균형을 이룸으로써 적절한 세\n포의 수를 유지하게 하거나 세포의 분화 및 발달을 조절하\n는 기능을 한다. 최근 들어 자궁내막증 환자의 정상부위 \n자궁내막과 이소성 자궁내막에서의 세포자멸사 과정이 보\n고되고 있는데, 정상인의 자궁내막은 세포자멸사를 통하여 \n자궁내막 기능층의 노화된 세포를 제거함으로써 세포의 항\n상성을 유지하지만 자궁내막증 환자의 역류된 자궁내막 세\n\n대한산부회지 제53권 제2호, 2010\n- 166 -\n포는 세포자멸사 과정이 현저하게 감소되고,121212 선상피세포\n에서의 세포자멸사 지수 (apoptotic index)도 감소된다고 \n보고되고 있다.28 이러한 현상은 자궁내막의 생리주기에서 \n후기 분비기와 생리기 및 전기 증식기에 걸쳐 나타나는데, \n이는 정상 자궁내막의 세포자멸사와는 다른 현상으로 정상\n적인 생리주기에서는 후기 분비기와 생리기의 선상피세포\n에서 세포자멸사가 많이 관찰되나, 증식기와 초기 분비기\n에서는 세포자멸사가 적게 관찰된다.\n29,30  \n현재까지 자궁내막에서의 세포자멸사 과정에 대해서는 \n알려지지 않은 것이 많으나 Bcl-2는 자궁내막의 선상피세\n포와 기질세포에서 증식기에 많이 발현되고 후기 증식기에 \n최고로 발현되어 세포자멸사 과정을 억제하며, 후기 분비\n기와 생리기로 갈수록 발현이 감소된다.\n31 \nBax는 Bcl-2계 유전자 중 하나이며, 세포자멸사 과정\n을 조장하여 Bcl-2에 길항하는 것으로 알려져 있다.32 서 \n등30은 정상 자궁내막의 생리주기에 따른 Bcl-2 단백질의 \n분포는 월경주기 전반에 걸쳐 자궁내막 기저층에서 확인되\n며, 초기 증식기, 후기 증식기에는 Bcl-2 단백질의 발현이 \n증가하였고, 후기 분비기에는 자궁내막 기능층에서 Bax \n유전자 및 단백질의 발현 비율이 월경주기에 따라 변화하\n는 것을 보고하였다. 김 등\n33은 초기 증식기 및 후기 증식\n기에서 자궁내막증의 정상부위 자궁내막에서 Bcl-2 단백\n질의 발현이 현저히 감소되며 세포증식은 증가되어 있는 \n것을 확인함으로써 비정상적인 세포자연사 과정이 일어남\n을 보고하였다.\n최근 항산화물질이 자궁내막증 환자의 기질세포 증식을 \n억제한다는 연구 결과가 발표되고 있어 내인성 항산화효과 \n(intrinsic antioxidant activity)를 가진 statin에 대한 관\n심이 높아지고 있다.\n34-36 Statin의 세포증식 억제작용은 \nHMG-CoA 환원효소를 억제시킴으로써 콜레스테롤 생합\n성과정의 중간물질인 프레닐이량체 (isoprenyl: geranyl- \ngeranyl pyrophosphate와 farnesyl pyrophosphate)와 \n메발로산염을 고갈시켜 세포가 이러한 물질을 이용하는 능\n력을 감소시키고, RAS와 RHO와 같은 small GTPases의 \n활성을 낮추어 성장신호전달경로 (growth-promoting \nsignal transduction pathway)를 방해하여 세포증식을 \n억제하는 것으로 보고되었다.\n34-37 또한 NADPH 산화제에 \n의해 활성산소 생성에 필수적인 RAC의 활성을 억제시키고 \n직접적인 항산화작용을 하여 세포증식을 억제시키는 것으\n로 보고되었다.38 Statin과 자궁내막 기질세포 증식에 관\n한 논문이 발표되고 있는데, Piotrowski 등22은 인간 자궁\n내막 기질세포의 배양 시 statin의 농도가 증가할수록 세\n포증식 억제효과가 크고, 콜레스테롤이나 메발로산염을 첨\n가하면 세포증식이 재개되는 것을 관찰하여 statin의 세포\n증식 억제효과를 역설적으로 보고하였다. Esfandiari 등\n20\n은 인간 자궁내막 조직을 fibrin matrix에서 2주간 배양하\n였을 때 혈관형성을 확인하였고, 5 μM과 10 μM의 statin\n을 배양액에 첨가하였을 때 혈관이 형성되지 않았으며 세\n포증식이 억제되고, 1 \nμM의 statin을 첨가하였을 경우 혈\n관형성은 억제되었으나 세포증식의 억제효과는 없었다고 \n보고하였다. 본 연구에서도 인간 자궁내막 기질세포에 \nsimvastatin의 농도를 달리하여 처리하여 배양한 결과 세\n포형태학적 변화가 나타나고, 세포의 성장 정도가 억제되\n는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). \nCafforio 등\n39은 lymphoblast와 myeloma를 여러 종류\n의 20 μM statin을 첨가한 배양액을 사용하여 24시간 배\n양한 후 thymidine 이용치를 측정하여 세포증식 억제효\n과, 세포주기 중 sub-G0/G1기와 caspase-3,8,9의 효소 \n활성을 조사함으로써 세포자멸사 유도효과를 연구하였다. \n실험결과, provastatin을 제외한 모든 statin에서 thymidine \n이용치가 감소하여 세포증식이 억제되었으며, TUNEL 염\n색에서는 70%에서 양성반응을 나타내고 caspase-3 효소 \n활성의 경우 대조군보다 2~4배의 활성도를 나타내어 \nstatin이 세포자멸사를 유도함을 보고하였다. 본 연구에서\n도 2 \nμM과 10 μM의 simvastatin을 첨가하여 자궁내막 기\n질세포를 배양한 결과 대조군에 비해 simvastatin 첨가군\n에서 sub-G1기가 유의하게 증가하였고, caspase-3의 활\n성도도 10 \nμM simvastatin 첨가군에서 대조군보다 유의하\n게 증가되어 있어, simvastatin이 세포자멸사를 유도함을 \n알 수 있었다. Simvastatin 2 \nμM과 10 μM을 첨가하여 \nBcl-2와 Bax의 발현을 조사한 결과에서는 Bcl-2의 발현\n은 대조군에 비하여 처리군에서 감소하였으나, Bax 발현\n은 변화가 없는 것으로 나타났다. 그러나 Bcl-2와 Bax의 \nratio를 비교한 결과 10 \nμM의 simvastatin 처리군에서 \nratio의 유의한 감소를 보여 simvastatin이 세포자멸사 억\n제 유전자인 Bcl-2의 발현을 억제하여 세포자멸사를 유도\n하는 것으로 생각된다.\n이상의 결과를 종합해 보면, simvastatin은 자궁내막 \n\n문수현 외 5인. Simvastatin이 자궁내막증 환자의 자궁내막 기질세포 증식과 세포자멸사에 미치는 영향\n- 167 -\n기질세포의 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도하는 것으\n로 나타나 자궁내막증 치료제로 이용될 수 있는 가능성을 \n보여주었다. 그러나 본 연구의 대상군은 4명으로 표본 집\n단의 수가 적어 향후 보다 많은 환자를 대상으로 한 추가 \n실험이 필요할 것으로 생각된다. \n참고문헌\n 1. Strathy JH, Molgaard CA, Coulam CB, Melton LJ 3rd. \nEndometriosis and infertility: a laparoscopic study of \nendometriosis among fertile and infertile women. \nFertil Steril 1982; 38: 667-72.\n 2. Husby GK, Haugen RS, Moen MH. Diagnostic delay \nin w om en with pain and endom etriosis. A cta O bstet \nGyencol Scand 2003; 82: 649-53.\n 3. Ballard K, Lowton K, Wright J. What's the delay? 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Caspase-3의 효소 활성 조사에서 10 μM simvastatin\n을 첨가한 군이 대조군에 비해 활성도가 유의하게 증가하였다 (P<0.05). \n결론: Simvastatin은 자궁내막 기질세포의 증식과 세포자멸사 억제유전자인 Bcl-2의 발현을 억제하고 caspase-3의 효소 활성을 \n증가시키는 것으로 나타나 자궁내막증의 치료제로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. \n중심단어: 자궁내막증, Simvastatin, 자궁내막 기질세포, 세포자멸사","source_license":"CC0","license_restricted":false}