Mediadores inflamatórios na dor pélvica crônica identificação de possíveis marcadores séricos da doença

ROCHA, MG. Inflammatory mediators in women with chronic pelvic pain . Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.

Chronic pelvic pain is a dise ase of high prevalence and a complex pathophysiology. The diagnostic methods are ofte n inadequate and, consequently, treatment and follow-up of women is quite difficult. Several diseases that present with chronic pain has an inflammatory profile, which has not yet been investigated for the topic. Aim: to quantify levels of nitric oxide (NO) and metalloprotei nases 2 (MMP-2) and 9 (MMP-9) in plasma of women with chronic pelvic pain. Methods: 64 women were included in the sudy and divided into 02 groups: chronic pelvic pain and cont rol group with 37 patients in the first group and 27 patients in the second group. Patients in the study group were follo wed at the Endoscopy and Pelvic Pain Unit and the control group patients were followed in the Contraception Unit of the Hospital of the Medica l School of Ribeirão Preto – University of São Paulo. We performed the measurement of clinical pa in by a unidimensional scale (VAS) and a multidimensional scale (McGill). Anxiety and depression scales were also filled. Individuals with any evidence of inflammation, hypertension, smoking or use of hormonal contraceptives were excluded. Individuals ta king medication for pain, such as painkillers or anti- inflammatory drugs were asked to stop them 72 hours before entering the study. A blood sample was collected from 10 ml during the appo intment. This material was stored in bottle itself with anti-coagulant (EDTA and / or hepari n), processed immediately on site for plasma separation and stored in a -70 ºC freezer. The c oncentrations of species related to NO were measured in liquid, always in triplicate by th e method of chemiluminescence, which is one of the most simple, sensitive and accurate availa ble to measure NO. We used a NO analyzer (Sievers Model 280 NO Analyzer - Boulder, CO, USA), which allows the measurement of NO in quantities as small as 1 pmol. The ac tivity of MMP-2 and MMP-9 in plasma was determined by the zymography method, which consists of an electrophoresis of the samples in an SDS / PAGE system, which includes the enzyme substrate (gelatin) in the gel separation, allowing the disclosure and quantification of enzyme activity. Results: Plasma NO levels were higher in CPP women than in controls (16.8 ± 7.9 versus 12.2 ± 2.4, respectively) (P=0.0016). Furthermore, plasma nitrate levels were hi gher in CPP women with evidence of pain of visceral origin than in CPP women with ev idence of an exclusive somatic component or controls (19.2 ± 8.9 versus 12.4 ± 1.8 vers us 12.2 ± 2.4, respectively) (P=0.0001). No correlation was detected between NO levels and duration of symptoms or intensity of pain. Regarding the MMP's, there was no statistical difference between the two groups. Conclusion: Plasma levels of NO are elevated in women with CPP, especially those with visceral pain. This fact can be considered an option in trea ting patients with CPP as it can be used as a serum marker for the disease. On the other ha nd, MMP´s did not turn out to be a good serum marker for women with CPP. Key words: chronic pelvic pain, visceral pain, nitric oxide, metalloproteinases, inflammation, endometriosis. Lista de Tabelas Tabela 1. Caracterização dos indivíduos incluídos no estudo ................................................. 50 Lista de Gráficos Gráfico 1 - Concentração de Óxido Nítrico no plasma de mulheres com dor pélvica crônica ...................................................................................................................................... 51 Gráfico 2 - Concentração de Metaloproteinase - 2 no plasma de mulheres com dor pélvica crônica ...................................................................................................................................... 52 Gráfico 3 - Concentração de Metaloproteinase – 9 no plasma de mulheres com dor pélvica crônica ...................................................................................................................................... 53 Lista de Abreviaturas NO – Óxido nítrico DPC – Dor pélvica crônica MMP-2 – Metaloproteinase 2 MMP-9 – Metaloproteinase 9 NOS – Óxido nítrico sintetase iNOS – Óxido nítrico sintetase induzida nNOS – Óxido nítrico sintetase neuronal eNOS - Óxido nítrico sintetase endotelial MEC – Matriz extracelular TIMP – Inibidor tecidual das metaloproteinases Sumário 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................26 1.1 Fisiopatologia .................................................................................................................28 1.2 Dor como evento inflamatório........................................................................................28 1.3 O papel da inflamação neurogênica................................................................................29 1.4 Óxido nítrico e inflamação .............................................................................................30 1.5 Associação entre óxido nítrico e doenças associadas à dor pélvica crônica ..................30 1.6 Evidências da associação entre óxido nítrico e dor pélvica crônica...............................31 1.7 Metaloproteinases e inflamação tecidual........................................................................32 1.8 Associação entre MMPs e doenças associadas à dor pélvica crônica ............................33 2. JUSTIFICATIVA ...............................................................................................................34 3. OBJETIVOS .......................................................................................................................36 4. CASUÍSTICA E MÉTODOS ............................................................................................38 4.1 Casuística........................................................................................................................39 4.1.1 Casos........................................................................................................................39 4.1.2 Controles..................................................................................................................39 4.2 Critérios de inclusão .......................................................................................................40 4.2.1 Casos........................................................................................................................40 4.2.2 Controles..................................................................................................................40 4.3 Critérios de exclusão ......................................................................................................40 4.4 Métodos ..........................................................................................................................40 4.4.1 Modelo de Estudo....................................................................................................40 4.4.2 Variáveis do Estudo.................................................................................................41 4.4.3 Mensuração clínica da dor.......................................................................................42 4.4.3.1 Unidimensional.................................................................................................42 4.4.3.2 Multidimensional..............................................................................................42 4.4.3.3 Outras ...............................................................................................................43 4.5 Operacionalização ..........................................................................................................44 4.5.1 Instrumento para coleta de informações – formulário.............................................44 4.5.2 Coleta do sangue......................................................................................................44 4.5.3 Determinação das concentrações plasmáticas de nitratos .......................................44 4.5.4 Determinação das atividades plasmáticas de MMP-2 e MMP-9.............................46 4.6 Banco de dados...............................................................................................................47 4.7 Análise estatística ...........................................................................................................47 4.8 Aspectos éticos ...............................................................................................................47 5. RESULTADOS ...................................................................................................................48 6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................54 7. CONCLUSÃO.....................................................................................................................60 8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................62 ANEXO....................................................................................................................................71 1. Introdução Introdução | 27 Dor pélvica crônica é um problema de saúde pública. A prevalência geral estimada é de 3,8% em mulheres (superior à enxaqueca, asma e dor nas costas) (Zondervan, Yudkin et al., 1999b; a; Zondervan e Barlow, 2000), varia ndo de 14 a 24% em mulheres na idade reprodutiva, com impacto direto na sua vida c onjugal, social e profissional. Não sabemos sua real prevalência em países em desenvolvime nto, como o Brasil, mas estima-se que seja superior àquela encontrada em países desenvolvidos (Latthe, Latthe et al., 2006). Em recente estudo realizado por nosso grupo de pesquisa, a prevalência de DPC em Ribeirão Preto ficou em torno de 11,5% das mulheres. Se separarmos apenas aquelas no me nacme, esses valores giram em torno de 15,1% (resultados ainda não pub licados). Tem um custo direto e indireto, incluindo gastos médicos, exames laboratoria is, redução de produtividade, estimado em 39 bilhões de dólares por ano (Mathias, Kuppermann et al., 1996; Parker, Leondires et al., 2006) e é responsável por 40% a 50% das laparoscopias ginecológicas (no nosso serviço essa taxa se encontra entre 10% e 15%), cerca de 10% das consultas ginecológicas e 12% de todas as histerectomias realizadas (Howard, 1993; Broder, Kanouse et al., 2000; Gambone, Mittman et al., 2002). Apesar de não haver um consenso, a dor pélvica crônica (D PC) é definida, mais comumente, como dor pélvica não menstrua l, com duração de pelo menos 6 meses suficientemente severa para in terferir com as atividades ha bituais, e que necessita de tratamento clínico e/ ou ci rúrgico (Howard, 1993). A etiologi a não é clara e, usualmente, resulta de uma complexa interação entre os sist emas gastrintestinal, urinário, ginecológico, músculo-esquelético, neurológico, psicológico e endócrino, influencia do ainda por fatores socioculturais (Howard, 2003). As estratégias atuais de tratam ento freqüentemente resultam em insucessos, o que é frustrante para a pacien te e para o profissional de saúde. Investigações sobre a fisiopatologia da doença são fundamentai s para a proposição de medidas terapêuticas mais eficazes e seguimento clínico mais objetivo. Introdução | 28 1.1 Fisiopatologia Vários são os mecanismos que corroboram para a manutenção e/ ou evolução da dor pélvica crônica. Entre eles pode mos citar: 1) mudanças neur oplásticas que ocorrem no corno posterior da medula espinhal em conseqüência de mudanças eletrofisiológicas, bioquímicas e metabólicas promovidas pelo estímulo nocivo in icial; o que leva à inflamação neurológica devido à liberação, dentre outros, de fator de cr escimento neural e substância P na periferia, local de origem do estímulo, exacerbando o mesmo; 2) Sensibilidade cruzada entre vísceras que compartilham uma mesma iner vação (reflexo víscero-visceral ); e 3) desenvolvimento de um reflexo víscero-muscular que pode culminar não só em repercussões disfuncionais como dificuldade miccional, incontinência urinária , mas também no desenvolvimento de síndrome miofascial e geração de novos pontos de dor (Butrick, 2003). Consequentemente, há uma sobreposição de sintomas como dispareuni a, dismenorréia, queixas gastrintestinais, geniturinárias e músculo-esqueléticas. 1.2 Dor como evento inflamatório Até recentemente, as teorias usadas para explicar a origem da dor eram baseadas na sintomatologia, marcadores genéticos, autoan ticorpos, etc. Não havi a uma regra geral que pudesse ser usada para diferentes entidades qu e unificasse as teorias em uma só. Omoigui propôs uma nova teoria na qual se tem a dor como evento inflamatório, ou seja, toda a origem da dor seria proveniente da inflamação e da resposta inflamatória gerada por cada entidade patológica (Omoigui, 2007b; a). Atualmente, o tratamento de doenças que se expressam com dor crônica, como por exemplo, artrite, dor lombar , cistite intersticial, fibromialgia, migrânea, ainda tem como alvo central um único mediator inflamatório, geralmente uma prostaglandina. O fenômeno inflamatório caracteriza-se por uma “sopa” de mediadores bioquímicos que estão presentes em todas as síndromes dolorosas. É por isso que se faz necessário o conhecimento Introdução | 29 do perfil inflamatório de cada síndrome dol orosa a fim de propor um tratamento individualizado e com uma melhor resposta. Na DPC em mulheres ainda não encontramos esse perfil inflamatório na literatura. 1.3 O papel da inflamação neurogênica Atualmente vem sendo dada ênfase ao papel da inflamação neurogênica na fisiopatologia da dor pélvica crônica (Wesselmann, 2001). Para embasar essa hipótese parte-se do princípio, universalmente aceito, que estímulos nocivos, por dano tecidual, podem aumentar a produção de substâncias promotoras de dor que estão presen tes nas terminações dos nociceptores aferentes primários e são liberadas quando o nociceptor é estimulado. Por outro lado, quando uma fibra sensitiva é estimulada eletricamente o impulso caminha não só em direção à medula espinhal (sentido ortodrômico), mas também no sentido inverso, para a periferia (sentido anti-drômico). Quando esse estímulo anti-drômico chega à peri feria, há liberação de inúmeros mediadores inflamatórios, como óxido nítrico (NO), substância P, CGRP (proteína relacionada ao gene da calcitonina), neuroquinina A e B, dentre outros. Esses elementos são os mediadores da inflamação neurogênica, caracterizada por vasodilatação, edema, e hiperalgesia (Wesselmann, 2001). Isso gera mais lesão tecidual o que fecha o ciclo e faz o estímulo doloroso perpetuar. Por sua vez, as células inflamatórias podem exercer algumas de suas atividades pela liberação de enzimas degradativas no espaço extracelular. Entre o grupo dessas enzimas, as metaloproteinases se destacam por serem moléculas-chaves no remodelamento da matrix extracelular (Le, Xue et al., 2007). Esse mecanismo permite interpretar que a dor pélvica crônica tem, ao menos em parte, um componente inflamatório crônico im portante. Neste momento temos interesse na avaliação do papel do óxido nítrico como media dor primário do processo inflamatório e do papel das metaloproteinases e seus mecanismos reguladores como eventos secundários à lesão tecidual, por sua vez, decorrente do processo inflamatório. Introdução | 30 1.4 Óxido nítrico e inflamação É cada vez mais evidente que o NO é um importante modulador da cascata inflamatória. Tanto nos transtornos inflam atórios agudos como nos crônicos, o NO tem influência sobre diversos processos fisiopatol ógicos como a interação leucócito-endotélio, a infiltração de leucócitos ativados nos sítios inflamatórios, dentre outros. 1.5 Associação entre óxido nítrico e doenças associadas à dor pélvica crônica É amplo o conhecimento da associação entr e dor pélvica crônica e algumas doenças, como: síndrome do intestino irritáve l (Longstreth, 1994; Walker, Gelfand et al., 1996), cistite intersticial (Butrick, 2003), endometriose (Whiteside e Falcone, 2003; Berkley, Rapkin et al., 2005; Fauconnier e Chapron, 2005), depressão (Walker, Sullivan et al. , 1993; Lorencatto, Petta et al. , 2006) e doenças músculo-esqueléticas (P rendergast e Weiss, 2003; Tu, As-Sanie et al., 2005b; a; 2006). Interessantemente, o óxido nítrico também está associado à maioria dessas doenças e, provavelmente, tem um papel importante na respectiva fisiopatologia dessas situações. O NO pode estar envolvido na fisiopatolo gia da hipersensibilidade visceral em pacientes com síndrome do cólon irritável, uma vez que o uso de inibidores seletivos das NOS melhoraram os sintomas dos pacientes(Kuiken, Klooker et al. , 2006), embora não pareça ter papel relevante na sensação ou tônus retal normal. Na cistite intersticial, a presença de óxido nítrico intra-vesical permite não só mensurar a inflamação, mas também avaliar objetivamente a resposta ao tratamento individual, o que o torna um marcador útil no manejo da cistite intersticial clássica(Hosseini, Ehren et al. , 2004). Com relação à endometriose, grandes quantidades de NO e NOS estão presentes no tecido endometrial de mulheres com endometriose, implicando um possível papel para o NO na patogênese da endometriose (Wu, Chao et al., 2003). O iNOS é a isoforma predominante em fagócitos mononucleares, como os Introdução | 31 monócitos e os macrófagos. Essa isoforma é cap az de produzir grandes quantidades de NO, fazendo com que haja uma atividade pró-inflamat ória importante. Em mulheres inférteis com endometriose, os macrófagos peritoneais e xpressam maiores níveis de iNOS e produzem maiores quantidades de NO (Osborn, Haney et al. , 2002), justificando sua elevada concentração em fluido peritoneal de mulher es com endometriose e seu ambiente pró- inlfamatório (Dong, Shi et al. , 2001). Estudos mostram que os níveis séricos de NO, especialmente de nitratos, estão elevados em pacientes com depressão (Suzuki, Yagi et al. , 2001) e que inibidores de NOS tem um papel antidepressivo em animais (Karolewicz, Bruce et al., 1999). Além disso, está asso ciado à fisiopatologia de outras doenças, como a doença celíaca, a artrite reumatóide e a doença inflam atória intestinal que possuem um componente inflamatório importante (Rueda, Lopez-Nevot et al., 2002; Gonzalez-Gay, Llorca et al., 2004; Tajouri, Martin et al., 2004; Oliver, Gomez-Garcia et al., 2006) ou aquelas com mecanismos mantenedores e perpetuadores de dor semelhante à dor pélvica crônica, como a dor nas costas ou lombalgia crônica(Sprott, Gay et al., 2006) e dor orofacial crônica (Gratt e Anbar, 2005). 1.6 Evidências da associação entre óxido nítrico e dor pélvica crônica Há alguns anos o papel do óxi do nítrico (NO) em vári os processos biológicos e fisiopatológicos vem sendo estudado, desde a bi ologia tumoral até a tr ansmissão neuronal, inclusive o seu papel na inflamação crônica (Laroux, Pavlick et al., 2001). O NO é um radical livre gasoso, lipossolúvel, produzido pela c onversão de L-arginina a L-citrulina por uma classe de enzimas denominadas óxido nítric o sintetases (NOS) (Moncada e Higgs, 1993). Existem três isoformas de NOS: a neuronal (nNOS), presente no cérebro e no sistema intestinal; a endotelial (eNOS), presente nas células endoteliais e a induzida (iNOS) que, como o nome diz, tem produção induzida por diversos mecanismos, incluindo estímulos inflamatórios (Moncada, 1997; Murad, 1998). As duas primeiras, em geral, produzem Introdução | 32 pequenas quantidades, benéficas, de óxido nítr ico, mas a iNOS pode produzi-lo em grande quantidade e por tempo prolongado (Gratt e Anbar, 2005). Há evid ências significativas que associam diretamente o óxido nítrico ao dese nvolvimento e à manutenção da nocicepção. Sabe-se que o óxido nítrico aumenta a sensibi lidade de nociceptores periféricos (Coutaux, Adam et al. , 2005) e os inibidores de iNOS têm ef eito analgésico na dor neuropática e inflamatória (De Alba, Clayton et al. , 2006). A associação entre óxido nítrico, nocicepção e inflamação crônica, embasa nossa hipótese qu e o óxido nítrico possa ter um papel na fisiopatologia da dor pélvica crônica em mulheres. 1.7 Metaloproteinases e inflamação tecidual As metaloproteinases de matrix (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco- dependentes, secretadas como pró-enzimas, que degradam a matrix extracelular (MEC). Há várias décadas tem sido claramente demons trado que as MMPs são moléculas-chaves associadas com o remodelamento da MEC, o qual é importante em uma série de processos fisiológicos e patológicos(Birkedal-Hansen, 1995) . Sua atividade é controlada pela regulação transcricional, ativação da pró-enzima e inibi ção por inibidores teci duais específicos de MMPs (TIMPs) (Bode, Fernandez-Catalan et al. , 1999). A identificação de novos substratos para as MMPS fora da matrix extracelular envo lvidos na inflamação, ressaltaram os diversos papéis das MMPs. Estas enzimas podem aumentar a invasão leucocitária e regular a atividade inflamatória de proteases, citocinas e quimocinas. Interessantemente, os membros da família MMP parecem ter uma “personalidade dupla” , no qual as MMPs podem favorecer tanto a ação anti como pró-inflamatória (Le, Xue et al., 2007). Vários estudos mostram que a interação entre as MMPs e TIMPs (inibidores teciduais das MMPS) é a responsáv el pela modulação do processo inflamatório, inclusive em doenças inflamatórias neuromusculares (Katoh, Hirano et al. , 2002; Matache, Stefanescu et Introdução | 33 al., 2003; Gardner, Borgmann et al. , 2006; Hurnaus, Mueller-Felber et al. , 2006), a qual guarda estreita relação com a dor pélvica crôn ica, como descrito nos itens acima. Modelos animais de indução de inflamação crônica têm observado aumento dos níveis séricos e locais de MMP-2 (uma colagenase tipo IV com 72 kDa, inibida pela TIMP-2, e sintetizada basicamente por células mesenquimais como fibr oblastos, macrófagos e células epiteliais e endoteliais) e MMP-9 (uma colagenase tipo IV com 92kDa, inibida pela TIMP-1, e produzida por células inflamatórias como monócitos/ macr ófagos, neutrófilos e eosinófilos) (Corbel, Theret et al. , 2001; Corbel, Belleguic et al. , 2002; Lanchou, Corbel et al. , 2003). Apesar dessas evidências, não há estudos evidenciando o papel das MMPs com dor pélvica crônica. 1.8 Associação entre MMPs e doenças associadas à dor pélvica crônica Alguns estudos têm observado maior atividade proteolítica das MMPs, juntamente com uma redução da expressão de se us inibidores específicos (TIMPs) no endométrio eutópico de pacientes com endometriose (Szamatowicz, Laudanski et al., 2002; Collette, Bellehumeur et al., 2004; Collette, Maheux et al., 2006). Por outro lado, a gravidade da lesão da endometriose está associada à redução da capacidade fagocitária dos macrófagos definida pela redução da atividade da MMP-9 expressada por eles, independente da atividade do TIMP-1 (Wu, Shoji et al., 2005). Também há estudos apontando relação sign ificativa das MMPs/ TIMPs com síndromes inflamatórias intestinais (Baugh, Perry et al. , 1999; Louis, Ribbens et al. , 2000; Mckaig, Mcwilliams et al., 2003) e aderências peritoniais (Chegini, Kotseos et al., 2001; Chegini, 2002; Cheong, Shelton et al., 2003), que por sua vez são causas importantes de dor pélvica crônica. Acreditamos que a expressão de MMP-2 e MMP-9 esteja relacionada ao processo de remodelamento da MEC conseqüente à injúria in flamatória presente na dor pélvica crônica, independente da causa primária. 2. Justificativa Justificativa | 35 A dor pélvica crônica é uma doença de alta prevalência, causada por uma heterogeneidade de doenças outras, cujo tratam ento clínico e/ ou cirú rgico adequado, muitas vezes não culmina em remissão dos sintomas. Além disso, os custos financeiros para pacientes e promotores de saúde são bastante elevados. Acreditamos que a compreensão dos mecanismos fisiopatológicos imbricados na gênese, manutenção e perpetuação da doença trará informações essenciais para o delineamento de melhores estratégias de tratamento para a dor pélvica crônica. Particularmente, acreditam os que, se confirmar a associação entre NO com dor pélvica crônica, novos caminhos para a terapêutica serão abertos, especialmente àquelas pacientes não-respondedoras ao tratam ento habitual de sua doença primária ou àquelas sem doença primária identificável. Como a endometriose é a principal causa ginecológica de DPC e as metaloproteinase s parecem estar envolvidas no crescimento de implantes endometriais, entendemos que se cons eguirmos demonstrar uma relação entre DPC e a expressão plasmática das metaloproteinases, poderemos ter um novo alento para o seguimento de pacientes com essa patologia. 3. Objetivos Objetivos | 37 Quantificar os níveis de NO, MMP-2 e MMP- 9 no plasma de mulheres com dor pélvica crônica; Verificar a correlação entre os níveis plasmáticos de NO, MMP-2 e MMP-9 com a duração e a intensidade dos sintomas de dor; Verificar a associação dos níveis plasmátic os de NO, MMP-2 e MMP-9 com as causas imputadas de dor pélvica crônica (endometriose e síndrome miofascial). 4. Casuística e Métodos Casuística e Métodos | 39 4.1 Casuística Foi realizado um estudo incluindo mulheres de uma série prospectiva de março de 2008 a novembro de 2009 junto ao Ambulatório de dor pélvica crôn ica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribe irão Preto da Universidade São Paulo e no Ambulatório de Dor Pélvica Crônica do Centro de Saúde Escola Pr of. Dr. Joel Domingos Machado (CSE – Cuiabá), localizado no Distrito Oeste (Sumarezinho) da cidade de Ribeirão Preto-SP, sob a responsabilidade da FMRP-USP. Esse estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HC FMRPUSP sob o nº 0112.0.004.000-07, e todas as mulheres que preencheram os critérios de inclus ão e manifestaram o desejo de participarem do projeto, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Sessenta e quatro pacientes (37 pacientes com DPC e 27 pacientes sem queixas ginecológicas compatíveis com DPC) preencher am os critérios de inclusão no período do estudo. 4.1.1 Casos Foram incluídas mulheres com dor pélvica crônica definida como uma dor constante, em região hipogástrica, com uma duração mínima de seis meses, suficientemente severa para interferir com as atividades habituais, e que necessita de tratamento clínico e/ ou cirúrgico. Não foi considerado dor pélvica crônica, casos de dores exclusivamente associadas ao ciclo menstrual, relação sexual ou mulheres que estiveram grávidas no último período de um ano. 4.1.2 Controles Mulheres saudáveis atendidas pelo setor de ginecologia no Centro Médico Social e Comunitário de Vila Lobato (assistência prim ária à saúde) e que fizeram coleta de sangue para outros exames da sua rotina. Casuística e Métodos | 40 4.2 Critérios de inclusão 4.2.1 Casos • Diagnóstico de dor pélvica crônica. • Concordância com o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. 4.2.2 Controles • Mulheres saudáveis que aceitaram partic ipar do estudo e que estiveram de acordo com os termos do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. 4.3 Critérios de exclusão • Mulheres com diagnóstico de osteoart rite, artrite reumatóide, asma, lupus, trauma agudo ou cirurgia a menos de 3 meses, câncer, gravidez, hipertensão ou qualquer outra doença sistêmica que tenha um componente inflamatório crônico significativo; • Mulheres usuárias de contraceptivos orais nos últimos 3 meses. • Uso de medicamentos analgésicos ou antinflamatórios nas últimas 72h • Tabagismo ou uso de drogas ou cafeína • Prática de atividade física em nível competitivo 4.4 Métodos 4.4.1 Modelo de Estudo Estudo observacional tipo caso-controle com pareamento por idade e atividade física. Casuística e Métodos | 41 4.4.2 Variáveis do Estudo • Idade: número de anos completos. • Dor pélvica crônica: presença ou ausência. • Tempo de dor: em meses. • Intensidade da dor: avaliada pela escal a visual analógica de dor, escala de categoria numérica e questionário McGill de dor. • Causa primária da dor pélvica crônica. • Dismenorréia: presença ou ausência. • Dispareunia: presença ou ausência. • Impacto da dismenorréia e/ ou dispar eunia nas atividades diárias: leve, moderada ou severa. • Nº. de gestações. • Nº. de partos. • Nº. de abortos. • Nº. de cesárias. • Nº. de fórceps. • Epsiotomia prévia. • Cirurgias na região inferior do abdome. • Hemograma. • Níveis sangüíneos de nitratos. • Níveis sangüíneos de MMP-2. • Níveis sangüíneos de MMP-9. Casuística e Métodos | 42 4.4.3 Mensuração clínica da dor Os instrumentos que foram utilizados nesta etapa já foram validados e são aplicáveis tanto em pesquisa científica quanto na clínica aplicada. A mensuração clínica da dor foi realizada através de uma escala unidimensional e uma escala multidimensional (Ong e Seymour, 2004): 4.4.3.1 Unidimensional • Escala analógica visual de dor Consta de uma linha ininterrupta de 10cm de extensão na qual a paciente é orientada a marcar o ponto que corresponde à dor referi da, lembrando que o início da escala (0) corresponde à ausência de dor e o término da es cala (10) corresponde à pior dor já vivenciada (parto sem analgesia, infarto do miocárdio, dor de dente, litíase urinária) ou imaginada. Tem como vantagem a simplicidade, é amplamente utilizada independente do idioma, compreensível pela maioria dos pacientes. 4.4.3.2 Multidimensional • Questionário McGill de dor Considerado o melhor instrumento e o mais u tilizado para caracterizar e discernir os componentes afetivo, sensitivo e avaliativo da dor, quando se pretende obter informações qualitativas e quantitativas a partir de descri ções verbais. É considerado um instrumento universal, capaz de padronizar a linguagem da dor. Ausência de dor Pior dor vivenciada Casuística e Métodos | 43 Consta de um questionário com 78 descri tores de dor, agrupados em 4 classes (sensorial, afetivo, avaliativo e miscelânea) e 16 subclasses. 4.4.3.3 Outras A presença e severidade da dismenorréia foram avaliadas através de um sistema multidimensional destacando o impacto social dos sintomas dolorosos. Este método descreve a dor conforme a limitação da capacidade de trabalho, a coexistência de sintomas sistêmicos e a necessidade do uso de analgésicos (Andersch e Milsom, 1982): 0 = Ausente; 1 = Leve: Desconforto pélvico ocasional que não prejudica a atividade diária, uso eventual de medicação; 2 = Moderada: Dor durante grande parte do ci clo, afeta a atividade diária, responsiva ao uso de medicação; 3 = Severa: Dor persistente por todo o ciclo, com limitação importante da atividade diária, uso freqüente de analgésicos potentes, sem resposta efetiva. A presença e severidade da dispareunia pr ofunda serão avaliadas através de uma escala que caracteriza a dor de acordo com a limitação da atividade sexual (Biberoglu e Behrman, 1981) da seguinte maneira: 0 = Ausente; 1 = Leve: Dor tolerável, não leva à interrupção da relação sexual; 2 = Moderada: Dor intensa o suficiente para levar à interrupção da relação sexual; 3 = Severa: Dor que impede a relação sexual. Casuística e Métodos | 44 4.5 Operacionalização 4.5.1 Instrumento para coleta de informações – formulário Todas as mulheres com o diagnóstico de dor pélvica crônica foram atendidas pela equipe médica das instituições lotadas acima e submetidas à entrevista e exame físico que segue formulário padronizado e adotado pelo Setor de vídeo-endoscopia do Depto.de Ginecologia e Obstetrícia do HC-FMRP-USP. 4.5.2 Coleta do sangue A coleta do sangue foi realizada após a consulta médica (ou no dia que a paciente retornou para colher sangue para eventuais exam es solicitados na consulta e essenciais para esclarecimento diagnóstico) por um dos pesquisa dores envolvidos utilizando seringa e agulha descartáveis. A partir dessa coleta foram realizadas as dosagens de hemoglobina, hematócrito, plaquetas, glóbulos brancos e contagem difere ncial. Foi armazenado em frasco próprio com anticoagulante, processado imediatamente no lo cal para separação do plasma e armazenado em freezer, a -70C para mensuração futura. • Foi solicitado a todas as mulheres do estudo que não usassem medicamentos antiinflamatórios durante as 72 horas que antecederem a coleta do sangue (Gratt e Anbar, 2005) e que estivessem em jejum de 12 horas. 4.5.3 Determinação das concentrações plasmá ticas de nitratos (Metzger, Souza- Costa et al., 2005; Nagassaki, Sertorio et al., 2006) Os níveis plasmáticos de espécies relaci onadas ao NO refletem a atividade da NOS. O NO participa de várias e complexas reações químicas no organismo. Sua curta meia-vida e as suas pequenas concentrações dificultam a avaliação quantitativa da produção in vivo de Casuística e Métodos | 45 NO pelos tecidos. Por este motivo, quantificaçõe s de espécies relacionadas ao NO têm sido usadas para avaliar a produção de NO. Entre elas, as concentrações plasmáticas dos principais produtos da oxidação do NO (nitr itos e nitratos) são mais comume nte utilizadas. Os nitritos derivam da reação do NO com oxigênio em so lução e são biologica mente ativos. É um componente instável com dosagens muito inferior es aos nitratos. Em virtude disso não foi dosado no presente estudo. Os nitratos, que são biologicamente inativos, são produzidos através da oxidação dos nitritos pela oxihemogl obina nas hemácias. Medidas destes produtos do NO após 12 horas de jejum refletem a produção endógena de NO, independentemente de fatores dietéticos. As concentrações de espécies relaciona das ao NO em líquidos foram medidas, sempre em triplicata, pelo método da quimi oluminescência, que é um dos métodos mais simples, sensíveis e precisos di sponíveis para medir NO. Foi utilizado um analisador de NO (Sievers Model 280 NO Analyzer - Boulder, CO, EUA), o qual permite medir NO em quantidades tão pequenas quanto 1 pmol. Resumidamente, a medida das concentr ações de produtos da oxidação de NO (nitritos e nitratos) em amostras líquidas re quer que estes produtos da oxidação do NO sejam reduzidos a NO (gás). As quantidades de NO produzidas são medidas após reação do NO com ozônio numa câmara do analisador de NO. Ne sta câmara, a reação do NO com ozônio cria moléculas de NO2 que, no seu estado excitado, emitem luz proporcionalmente às quantidades de NO liberado pela amostra. O analisador cont ém um detector de luz que transforma o sinal luminoso em sinal elétrico, que é finalmente convertido em sinal analógico e registrado. Determinação da concentração de nitratos : A concentração plasmática de nitratos é medida de forma idêntica à descrita no item anterior, com a diferença de que a solução redutora é aquecida a 90ºC e composta de 3 mL de Vanádio (III) a 0.1 M e 3 mL de HCl a 1M. Esta solução reduz os nitratos e nitrito s presentes na amostra a gás NO. Portanto, a Casuística e Métodos | 46 concentração real de nitratos corresponde à diferença entre a concentração medida com a solução de Vanádio (nitratos e nitritos) e a co ncentração medida no item anterior (somente nitritos). 4.5.4 Determinação das atividades plasmá ticas de MMP-2 e MMP-9 (Gerlach, Uzuelli et al., 2005; Souza-Tarla, Uzuelli et al., 2005; Martinez, Lopes et al., 2006) A atividade das MMP-2 e MMP-9 no plasma foram determinadas pelo método da zimografia, que consiste em uma eletroforese das amostras em um sistema SDS/PAGE que inclui o substrato da enzima (gelatina) no gel de separação, de modo a permitir a evidenciação e quantificação da atividade da enzima. Um microlitro de plasma, tr atado com tampão de amostra não-redutor, será utilizado para eletrofo rese. As enzimas das amostras tratadas foram separadas por eletroforese em um sistema de scontínuo de tampões, conforme a técnica de SDS-PAGE descrita por Laemmli, em géis de poliacrilamida na concentração de 12%, contendo gelatina (substrato enzimático) na concentração de 1%, preparados no próprio laboratório. Após a corrida, os géis foram submetidos a dois banhos de Triton X-100 (a 2%, em água) para remover o SDS e, em seguida, permaneceram submersos durante 16 horas em solução de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,4, contendo CaCl2 a 10 mM , à temperatura de 37C. Em seguida, os géis foram fixados e corados com solução de Coommassie Blue (metanol a 50%, ácido acético a 5% e Coomassie Blue G-250 a 0,5%, em água) por 3 horas, sendo então descorados até a visualização da s bandas características de atividade de MMPs: bandas claras contra um fundo azul escuro, devido à coloração da gela tina incorporada ao gel e ausência de coloração nos locais onde houve degradação de gelatina. A quantificação da atividade gelatinolítica foi realizada através de densitometria das bandas e comparação entre a presença da forma ativa (menor massa molecular) e a forma Casuística e Métodos | 47 inativa (maior massa molecular) das enzimas. Dessa maneira, podemos comparar a atividade total das gelatinases entre os diferentes grupo s e, ainda, comparar em quais amostras houve predomínio das formas ativas das gelati nases no plasma. Resultados das análises densitométricas de três corridas de uma mesma am ostra (em géis diferentes, corridos em dias diferentes) foram utilizados para a obtenção da atividade enzimática média daquela amostra, valor que foi plotado em gráfico e comparado com outras amostras. 4.6 Banco de dados Os dados obtidos foram registrados e transf eridos para o banco de dados eletrônico. A confecção do banco de dados e das planilhas pa ra a análise estatística, tabelas e gráficos foram realizadas com auxílio do aplicativo FileMaker Pro 8 Advanced. O aplicativo Microsoft Word® versão 7.0 foi o editor de texto. Os dados de identificação pessoal foram codificados e mantidos sob sigilo. 4.7 Análise estatística A análise estatística foi realizada com a ajuda do programa GraphPad Prism (Prism 5, 2007) for Windows. 4.8 Aspectos éticos Os princípios de confiabilidade dos da dos obtidos, manutenção da autonomia dos participantes, sigilo à identif icação pessoal e beneficência/ não-maleficência dos propósitos foram respeitados. O projeto somente foi iniciado após aprovação pela Comissão de Pesquisa do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia e pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HC da FMRPUSP. 5. Resultados Resultados | 49 As caracterização da casuística está apresentada na Tabela 1. Os níveis plasmáticos de NO foram maiores nas pacientes com DPC quando comparadas às pacientes do grupo controle (16.8 ± 7.9 versus 12.2 ± 2.4, respectivamente) (P = 0.0016) (Gráfico 2). Especificamente, os ní veis plasmáticos de NO foram maiores nas pacientes com DPC de origem visceral ou peritoneal quando comparadas às pacientes com dor exclusivamente somática ou aos controles saudáveis (19.2 ± 8.9 versus 12.4 ± 1.8 versus 12.2 ± 2.4, respectivamente) (P=0.0001) (Gráfico 3). Não observamos uma correlação entre os níveis plasmáticos de NO e a duração dos sintomas (em meses) (Spearman r = 0.04, 95%CI:-0.34 to 0.40, P = 0.84) ou com a intens idade dos sintomas avaliado pela EAV (Spearman r =:-0.18, 95%CI:-0.52 to 0.20, P=0 .34), ou inventário Mc Gill (Spearman r = - 0.06, 95%CI:-0.41 to 0.30, P =0.72). Os níveis plasmáticos das MMPs 2 e 9 não diferiram entre as pacientes com DPC e as mulheres saudáveis (1.464 ± 0.1392 versus 1.245 ± 0.1412 e 0.5004 ± 0.3541 versus 0.5571 ± 0.8360, respectivamente) (P = 0.2803 e P = 0.3769, respectivamente) (Gráficos 2 e 3). Resultados | 50 Tabela 1: Caracterização dos indivíduos incluídos no estudo Parâmetros Controles (n=27) Casos (n=37) P Idade, anos (média ± DP) 32.0±1.8 34.7±1.0 0.22 Paridade (mediana, variância) 1.5, 0-11 1, 0-3 0.19 BDI (mediana, variância) 3, 0-16 11, 0-16 0.08 Duração da dor, meses (mediana, variância) --- 30, 6-120 --- EAV (média ± DP) --- 81.8±3.2 --- McGill (média ± DP) --- 33.8±2.8 --- Glóbulos vermelhos (média·106 ± DP) 4.5 ± 0.1 4.6±0.1 0.28 Hematócrito (média ± DP) 40.2± 0.5 40.8±0.6 0.54 Hemoglobina (média ± DP) 13.3± 0.2 13.5±0.2 0.63 Leucócitos (média·103 ± DP) 7.1±0.4 8.0±0.4 0.18 BDI: inventário de depressão de Beck; EAV: escala analógica visual, em milímetros; DP: desvio padrão da média. Resultados | 51 NO controles casos somatica visceral 0 10 20 30 40 50 Gráfico 1: Concentração de NO Resultados | 52 MMP-2 controles casos pré casos pós 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 Gráfico 2: Concentração de MMP-2 Resultados | 53 MMP-9 controles casos pré casos pós 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 Gráfico 3: Concentração de MMP-9 6. Discussão Discussão | 55 A dor pélvica crônica (DPC) ainda se cons titui de um grande desafio para os profissionais da área da saúde visto que podemos ter diferentes etiologias e consequentemente diferentes tratamentos para a mesma patologia. Esses diferentes órgãos e sistemas, de uma forma ou de outra, levam a um mesmo resultado final, a geração de uma síndrome dolorosa que geralmente compromete a qualidade de vida das pacientes. Omoigui em 2007 propôs uma teoria unificadora, ou “lei da dor”, na qual ele afirma que t oda a origem da dor advém da inflamação e/ou da resposta inflamatória (Omoigui, 2007a). Nesse mesmo trabalho, ele afirma que o tratamento das síndromes dolorosas deve riam ser baseadas na determinação do perfil inflamatório da síndrome dolorosa, na inibiç ão ou supressão dos mediadores inflamatórios produzidos naquela síndrome dolorosa por bloqueadores dos mediadores inflamatórios ou por intervenção cirúrgica, quando necessária, na in ibição ou supressão da transmissão nervosa, seja no neurônio aferente, seja no neurônio eferente (motor) por drogas anti-convulsivantes ou bloqueio anestésico e por modulação da transmi ssão neuronal através de opióides (Omoigui, 2007a). Seguindo a mesma linha de raciocínio, re solvemos, ainda que inicialmente, fazer um perfil inflamatório das pacientes com DPC. Ap esar de encontrarmos na literatura o perfil inflamatório de algumas patologias que pode m levar a quadros álgicos crônicos, como a fibromialgia, a cistite intersticial, a ar trite (Omoigui, 2007b), não encontramos estudos que abordem, de uma maneira geral, esse perf il inflamatório independentemente do fator etiológico. Tem sido repetidamente demonstrado em modelos murinos, que o óxido nítrico aumenta a sensibilidade das regiões noc iceptoras periféricas (Steel, Terenghi et al. , 1994)(Meller, Cummings et al., 1994)(Wiertelak, Furness et al., 1994) e que os inibidores da NOS agem como substâncias analgésicas (Meller, Dykstra et al., 1994)(Babbedge, Wallace et al., 1993)(Malmberg e Yaksh, 1993)(Bjorkman, 1995) . O efeito álgico do NO pode ocorrer tanto a nível espinhal quanto a nível periférico. Além disso, in jeções intradérmica de NO em Discussão | 56 humanos foram capazes de provocar dor em car áter dose-dependente (Wiertelak, Furness et al., 1994)(Meller, Dykstra et al. , 1994)(Dickenson, 1995)(Gordh, Karlsten et al. , 1995). Isso nos leva a crer que o conhecimento dos níveis de NO em síndromes dolorosas como a DPC pode ser de grande valia no acompanhamento durante o tratamento dessa patologia. É amplo o conhecimento da associação entr e dor pélvica crônica e algumas doenças, como: síndrome do intestino irritáve l (Longstreth, 1994; Walker, Gelfand et al., 1996), cistite intersticial (Butrick, 2003), endometriose (Whiteside e Falcone, 2003; Berkley, Rapkin et al., 2005; Fauconnier e Chapron, 2005), depressão (Walker, Sullivan et al. , 1993; Lorencatto, Petta et al. , 2006) e doenças músculo-esqueléticas (P rendergast e Weiss, 2003; Tu, As-Sanie et al., 2005b; a; 2006). Interessantemente, o óxido nítrico também está associado à maioria dessas doenças e, provavelmente, tem um papel importante na respectiva fisiopatologia dessas situações. O NO pode estar envolvido na fisiopat ologia da hipersensibilidade visceral em pacientes com síndrome do cólon irritável, uma vez que o uso de inibidores seletivos das NOS melhoraram os sintomas dos pacientes(Kuiken, Klooker et al. , 2006), embora não pareça ter papel relevante na sensação ou tônus retal normal. Na cistite intersticial, a presença de óxido nítrico intra-vesical permite não só mensurar a inflamação, mas também avaliar objetivamente a resposta ao tratamento individual, o que o torna um marcador útil no manejo da cistite intersticial clássica (Hosseini, Ehren et al. , 2004). Nesse trabalho, os autores fizeram a dosagem de NO usando uma cânula de silicone na bexiga. Através dela, foi infundido cerca de 25 ml de ar ambiente e, 5 minutos após, es se ar foi retirado e levado a um aparelho que analisava a quantidade de NO intravesical. Atra vés desse trabalho, os autores conseguiram descobrir um novo marcador de atividade de ssa doença, visto que houve uma correlação significativa entre as mudanças nos sintomas e mudanças na formação de NO nos indivíduos com cistite instersticial clássica. Infelizmente, a dor pélvica crônica apresenta diversos fatores etiológicos. O que torna a dosagem in locu dessa substância algo ex tremamente difícil de ser Discussão | 57 realizado. É por isso que a dosagem plasmáti ca do NO torna-se uma nova ferramenta para o acompanhamento das pacientes com DPC. Com re lação à endometriose, grandes quantidades de NO e NOS estão presentes no tecido endo metrial de mulheres com endometriose, implicando um possível papel para o NO na patogênese da endometriose (Wu, Chao et al. , 2003), isso poderia justificar os níveis elevados dessa substâ ncia encontrados na corrente sanguínea, uma vez que o NO tem a propriedade de rapidamente se difundir. Mesmo sendo rapidamente destruído pela hemoglobina quando liberado na corrente sanguínea, os níveis de NO mostraram-se bastante elevado nas paci entes com DPC, favorecendo o seu uso como ferramenta para o seguimento desas pacientes. Adicionalmente, macrófagos peritoneais de mulheres com endometriose associada à infert ilidade expressam maiores níveis de iNOS e produzem maiores quantidades de NO (Osborn, Haney et al. , 2002), o que justifica sua elevada concentração em fluido peritoneal de mulheres com endometriose (Dong, Shi et al. , 2001). Estudos mostram que os níveis séricos de NO, especialmente de nitratos, estão elevados em pacientes co m depressão (Suzuki, Yagi et al. , 2001) e que inibidores de NOS tem um papel antidepressivo em animais (Karolewicz, Bruce et al. , 1999). Além disso, está associado à fisiopatologia de outras doen ças com componente inflamatório importante (Rueda, Lopez-Nevot et al. , 2002; Gonzalez-Gay, Llorca et al. , 2004; Tajouri, Martin et al. , 2004; Oliver, Gomez-Garcia et al. , 2006) ou aquelas com mecanismos mantenedores e perpetuadores de dor semelhante à dor pélvic a crônica, como a dor nas costas ou lombalgia crônica(Sprott, Gay et al. , 2006) e dor orofacial crônica (G ratt e Anbar, 2005). Observou-se neste estudo que os níveis plasmáticos de NO foram maiores nas p acientes com DPC quando comparadas às pacientes do grupo controle ( 16.8 ± 7.9 versus 12.2 ± 2. 4, respectivamente (P = 0.0016) corroborando com os resultados encontra dos na literatura quando diferentes fatores etiológicos eram estudados separadamente.Em te rmos práticos, isso é de suma importância, Discussão | 58 visto que uma dosagem sanguínea é mais fácil e f actível de ser realizada rotineiramente que uma amostragem do fluido peritoneal. Alguns estudos têm observado maior ativid ade proteolítica das MMPs, juntamente com uma redução da expressão de seus inib idores específicos (TIMPs) no endométrio eutópico de pacientes com endo metriose (Szamatowicz, Laudanski et al. , 2002; Collette, Bellehumeur et al., 2004; Collette, Maheux et al., 2006). Por outro lado, a gravidade da lesão da endometriose está associada à redução da cap acidade fagocitária dos macrófagos definida pela redução da atividade da MMP-9 expressada por eles, independente da atividade do TIMP-1 (Wu, Shoji et al. , 2005). Também há estudos apontando relação significativa das MMPs/ TIMPs com síndromes inflamatórias intestinais (Baugh, Perry et al. , 1999; Louis, Ribbens et al. , 2000; Mckaig, Mcwilliams et al. , 2003) e aderências pe ritoniais (Chegini, Kotseos et al., 2001; Chegini, 2002; Cheong, Shelton et al., 2003), que por sua vez são causas importantes de dor pélvica crônica. A comp leta remodulação da matriz extracelular é necessária para que haja o cres cimento dos implantes ectópicos e isso se faz com a presença das MMPs. As células do estroma endometria l expressam várias MMPs, incluindo MMP-2 e MMP-9, as quais parecem desempenhar um pa pel fundamental no desarranjo da matriz extracelular. A expressão alte rada dessas proteinases podem levar a um estabelecimento e a uma progressão da endometriose, pois já foi relatado que uma expressão gênica aberrante de MMP-2 e MMP-9 estaria presente em focos eut ópicos e ectópicos de endometriose (Hulboy, Rudolph et al. , 1997; Chung, Wen et al. , 2001; Shaco-Levy, Sharabi et al. , 2008; Di Carlo, Bonifacio et al., 2009). Entre as causas ginecológicas, a endometriose merece atenção espe cial visto que é a patologia mais prevalente. Diversos mecanismos parecem estar envolvidos na gênese das queixas álgicas relacionadas à endometriose, de ntre os quais podemos citar as aderências, a extensão das lesões, os micro-sangramentos reco rrentes das lesões e, principalmente, o grau Discussão | 59 de infiltração das lesões. Es te último parece ser o mais be m entendido quando se discute a relação de endometriose e do r pélvica crônica (Fauconnier e Chapron, 2005).Vários autores têm mostrado a relação existente entre as metalo proteinases e endometriose. Essa relação tem sido evidenciada principalmente nos focos de endometriose, existi ndo poucos estudos que correlacionem com a sua concentração plasmátic a. Alguns autores demonstraram que as concentrações de metaloproteinases e seus inibidores não podem ser usados como uma ferramenta válida para inferir a severidade da endometriose (Salata, Stojanovic et al. , 2008) nos levando a crer que, talvez, não exista um a relação entre os níveis de MMP´s no foco primário e no plasma. O nosso estudo verifico u que a expressão no plasma não foi diferente entre as pacientes casos e as pacientes do grupo controle, ou seja, as dosagens podem até estar elevadas no local do evento, mas no plasma isso não se verifica. Um outro ponto a ser considerado é que polimorfismos de MMP-2 e MMP-9 parecem estar envolvidos no processo inflamatório da endometriose (Saare, Lamp et al. , ; Sillem, Prifti et al. , 2001). Isso poderia justificar a ausência de difere nça estatística no nosso estudo entre os grupos estudados e os casos controles, necessitando, talvez, que uma dosagem individualizada desses polimórficos fosse realizada. É possível que se consiga iden tificar um marcador plasmático nas pacientes com DPC, visto que acreditamos que essas substâncias estão, de alguma forma, relacionadas à gênese dessa patologia. Entretanto, as MMP´s parecem não conseguir refletir a sua expressão tecidual com os seus níveis plasmáticos. 7. Conclusão Conclusão | 61 Podemos concluir neste estudo que os níve is plasmáticos de NO estão aumentados em mulheres com Dor Pélvica Crônica quando comp aradas àquelas saudáveis. Essa alteração é ainda mais evidente quando a dor é de or igem visceral, podendo vir a ser um importante marcador plasmático dessa patologia. Po r outro lado, os níveis plasmáticos de metaloproteinases não foram diferentes quando se comparou o grande grupo de DPC com as pacientes controles, mostrando que, apesar das MMPs estarem relacionadas à patogênese de algumas doenças que causam DPC, particular mente endometriose, sua dosagem plasmática não reflete isso. Estudos veri ficando se existem polimorfism os envolvidos nessa patologia devem ser realizados a fim de checarmos se as MMPs podem também atuar como marcadores plasmáticos na DPC. 8. Referências Referências | 63 Andersch, B. e I. Milsom. An epidemiologi c study of young women with dysmenorrhea. Am J Obstet Gynecol, v.144, n.6, p.655-60. 1982. Babbedge, R. C., P. Wallace , et al. L-NG-nitro arginine p-nitr oanilide (L-NAPNA) is anti- nociceptive in the mouse. Neuroreport, v.4, n.3, Mar, p.307-10. 1993. Baugh, M. D., M. J. 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Título do Projeto: Mediadores inflam atórios na dor pélvica crônica Pesquisador Responsável: Prof. Dr. Omero Benedicto Po li Neto (16) 3602- 2407 / 2311 Pesquisadores participantes: Prof. Dr. Ant onio Alberto Nogueira (16) 3602- 2589 / 2311 Prof. Dr. Francisco José Candido dos Reis (16) 3602-2589 / 2311 Prof . Dr. José Eduardo Tanus dos Santos (16) 3602-3163 1) Este projeto prete nde basicamente estudar a lterações de substâncias inflamatórias no sangue e peritônio (fina memb rana que reveste o interior da cavidade abdominal e pélvica) relaciona das à dor pélvica crônica. 2) Você poderá participar da primeira e/ ou da segunda etapa do projeto c onsentindo separadamente ao final desse termo. Sua participação na 1ª etapa será permitir a obtenção de 10ml de sangue na primeira consulta e após 3 e 6 meses de tratamento. Se você consen tir, e caso haja necessidade de cirurgia para o diagnóstico ou tratamento da sua doença, sua participação na 2ª etapa será permitir a obtenção de líquido da cavidade pe ritoneal (presente na maioria das mulheres) e amostra de peritônio de 1x1cm englobando a lesão encontra da durante a cirurgia ou de uma região aleatória da pelve caso não forem localizad as quaisquer lesões. Salientamos que este procedimento não compromete sua recuperação a pós a cirurgia, não inte rferirá no tempo para alta hospitalar, e não compro mete seu tratamento em quais quer circunstâncias. Caso você esteja incluída no grupo contro le (sem dor pélvica crônica) referente às pacientes que serão submetidas à laparoscopia por outros motivos, informamos que não haverá incisões (cortes) adicionais e que não haverá prolongamento do tempo cirúrgico em mais que 2 ou 3 minutos, nem prolongará sua estadia no hospital ou su a recuperação pós-operatória, tampouco interferirá no resultado da ciru rgia principal; 3) Você não terá gastos financeiros adicionais, Anexo | 73 pois as avaliações serão feitas no mesmo período de sua consulta médica e/ ou procedimento cirúrgico. 4) Caso ha ja dano comprovadamente decorrente da pesquisa você terá direito à indenização. 5) O projeto não interferirá no te mpo para o diagnóstico definitivo da causa do seu problema, tampouco nas eventuais indicações cirúrgicas ou nos tratamentos propostos. 6) Os pesquisadores se comprometem que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de sua participação no pr ojeto, bem como de que lhe será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. 7) Os resultados da pesquisa serão importantes para entende r melhor a doença em questão (dor pélvica crônica) e, certamente trarão informações que podem facilitar o tratamento de mulheres com a doença ou que, futuramente, venham a desenvolvê -la. 8) Você terá a segurança de não ser identificada e ter mantido o caráter confidencial da informação relacionada à sua privacidade. 9) Nos comprometemos a prestar-lhe informaçã o atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar a sua vontade de continuar dele participando. 10) Você pode retirar o seu consentimento para participar deste estudo a qua lquer momento, inclusive sem justificativas e sem qualquer prejuízo para você. 11) Você terá a garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer dúvi da a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações relacionadas com a pesquisa. Qu alquer questão a respeito do estudo ou de sua saúde deve ser dirigida aos responsáveis pelo projeto, designados no início deste termo, o que poderá ser realizada no Am bulatório AGDE que ocorre às 6ª feiras no período da manhã no balcão 1 – verde claro do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Ambulatório de Gi necologia; ou no Ambulatório de dor pélvica crônica do CSE – Cuiabá que ocorre às 4ª feiras no período da manhã; ou ainda pelos telefones de contato informados no início de sse termo. O Comitê de Ética em Pesquisa do HCRP pode lhe oferecer informações cas o você não queira falar com nenhum dos pesquisadores responsáveis por este estudo. Eu, ___________________________________________________________________, abaixo assinado, concordo em participar do estudo “M ediadores inflamatórios na dor pélvica crônica” , como sujeito. Fui devidamente info rmada em detalhes pelo(s) pesquisador(es) Anexo | 74 responsável(is) no que diz resp eito ao objetivo da pesquisa , aos procedimentos que serei submetida, aos riscos e benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como à indenização se houver danos decorren tes da pesquisa. Decl aro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram asseguradas e que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isto leve a qualquer penalidade ou interrupção de meu acompanhamento/ assistência/ tratamen to. Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade de participar desse estudo. Ri beirão Preto, _____ de ____________________________ de ___________. Se você concordar com a 1ª etapa da pesquisa assine abaixo: __________________________________________________ Assinatura do voluntário ___________________________________________________Assinatura do investigador/ testemunha Se você concordar com a 2ª etapa da pesquisa assine abaixo: ___________________________________________________Assinatura do voluntário ___________________________________________________Assinatura do investigador/ testemunha