Estudo de polimorfismos da região controladora (D-Ioop) do DNA mitocondrial  em amostra de mulheres brasileiras com endometriose

Andres MP. Polymorphisms of control region (D-loop) of mitochondrial DNA in Brazilian women with endometriosis [Dissertation]. São Paulo: "Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo"; 2017.

There is increasing evidence that oxidative stress is a major factor in the pathogenesis of endometriosis, a prevalent disease that affects 5 –15% of reproductive-aged women worldwide. Polymorphisms in the control region of mitochondrial DNA (mtDNA) can lead to the altered replication and transcription of mitochondrial genes, thereby affecting both overall mitochondrial function, and the intracellular generation of reactive oxygen species. Objective: The present study investigated whether the incidence of mtDNA polymorphisms and/or haplogroups is associated with endometriosis in a Brazilian population. Methods: Female patients (aged 18–50 years) were enrolled in the present s tudy, and assigned to either endometriosis (n = 90) or control (n = 92) group. The former group comprised patients who had received a histological diagnosis of endometriosis and had been assigned a surgical stage, while the latter comprised patients who had undergone gynecological surgery for tubal ligation, leiomyoma, or ovarian cysts, and showed no evidence of endometriosis. DNA was extracted from peripheral blood samples, and then subjected to Sanger sequencing and capillary electrophoresis. Polymorphisms were identified by comparing the isolated mtDNA sequences with the revised Cambridge Reference Sequence.

The frequency of some identified polymorphisms was found to be higher in the endometriosis group than in the control group, including polymorphisms T16217C (found in 14.4% and 5.4% of endometriosis - and control-group members, respectively; p=0.049), G499A (13.3% vs. 4.3%; p=0.038), T236C (5.6% vs. 0%; p=0.028), and G185A (6.7% vs. 0%; p=0.013). In contrast, polymorphisms T146C (18.9% vs. 32.6%; p=0.042) and 573.2C (5.6% vs. 29.3%; p<0.001) were found to occur at a lower frequency in the endometriosis compared to the control group. Observed haplogroup frequencies were similar between the endometriosis and control groups, and did not appear to be affected by either disease location and/or staging.

mtDNA polymorphisms T16217C, G499A, T236C, and G185A were found to be associated with endometriosis, while conversely, T146C and 573.2C were shown to be associated with an absence of disease in the analyzed Brazilian population. No significant differences were observed bet ween the mitochondrial haplogroups of patients with, versus without endometriosis. Descriptors: endometriosis; DNA, mitochondrial; polymorphism, genetic; Brazilian population; genetics, medical; haplotypes. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Mapa do genoma mitocondrial humano e diagrama da região controladora ...................................................................................................... 21 Figura 2 - Representação gráfica do padrão de migração das linhagens mitocondriais ..................................................................................................... 23 Figura 3 - Filogenia simplificada do DNA mitocondrial ilustr ando o uso de letras do alfabeto para a designação do haplogrupo .................................................. 23 Figura 4 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmias de ponto ............. 25 Figura 5 - Eletroferogramas exemplificando uma heteroplasmia de comprimento na região HV1 ................................................................................................... 25 Figura 6 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmia de comprimento na região HV3 ........................................................................................................ 25 Figura 7 - Fluxograma representando a dinâmica do estudo ............................ 33 Figura 8 - Eletroferogramas de indivíduos com heteroplasmia de comprimento na região 16.193 e transição no nucleotídeo 16.189 ........................................ 45 Figura 9 - Eletroferogramas apresentando indivíduos com heteroplasmia de comprimento na região HV2, posição 309 e inserção de 1C na posição 315 ... 45 Figura 10 - Heteroplasmia de comprimento na região HV3, entre os nucleotídeos 515 e 524 .......................................................................................................... 45 Figura 11 - Duplicação de 15 nucleotídeos entre as posições 16.018 e 16.032 do DNA mitocondrial .............................................................................................. 46 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Classificação da American Society for Reproductive Medicine e por tipo de lesão das pacientes incluídas no grupo endometriose (n=90) .............. 42 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Volume e concentrações dos reagentes utilizados na reação de cadeia da polimerase (PCR) para amplificação da região controladora do DNA mitocondrial ....................................................................................................... 35 Tabela 2 - Condições de temperatura, tempo e número de ciclos da reação de cadeia da polimerase (PCR) utilizadas para amplificação da região controladora do DNA mitocondrial ......................................................................................... 36 Tabela 3 - Primers utilizados no estudo para as reações de PCR e sequenciamento da região controladora do DNA mitocondrial ......................... 37 Tabela 4 - Dados demográficos e clínicos das pacientes incluídas no estudo nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) ..................................................... 41 Tabela 5 - Quadro clínico das pacientes incluídas nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) .......................................................................................... 43 Tabela 6 - Análise estatística das heteroplasmias da região controladora do DNA mitocondrial encontradas nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) ..... 44 Tabela 7 - Polimorfismos na região controladora do DNA mitocondrial nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) ................................................................. 47 Tabela 8 - Distribuição e análise estatística dos haplogrupos mitocondriais nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) ..................................................... 48 Tabela 9 - Distribuição dos haplogrupos mitocondriais por estádio e tipo de lesão no grupo endometriose ..................................................................................... 48 Tabela 10 - Distribuição dos haplogrupos mitocondriais por subgrupo no grupo controle .............................................................................................................. 49 LISTA DE ABREVIATURAS ASRM American Society for Reproductive Medicine A Adenosina a Alfa AF Antecedente familiar ATP Trifosfato de adenosina b Beta CAPPesq Comissão de Ética para Análises de Projetos de Pesquisa C Citosina °C Graus Celsius CT Controle D-loop Displacement Loop (Região controladora do DNA mitocondrial) DNA Ácido Desoxirribonucleico dNTP Desoxirribonucleotídeo Tri Fosfatado EDT Endometriose EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético EVA Escala visual analógica de dor et al et alia (e outros) FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo IC Intervalo de confiança INS Inserções iPSC Induced Pluripotent Stem Cells DEL Deleções DP Desvio padrão G Guanina GWAS Genome-wide association studies HV Região hipervariável do DNA mitocondrial LIM 40 Laboratório de Investigação Médica 40 MgCL2 Cloreto de magnésio min Minutos mm Milímetros mM Milimolar mt Mitochondrial mtDNA DNA mitocondrial MT-TP Mitochondrailly encoded tRNA proline MRCA Matrilineal most recente common ancestor n Número de indivíduos/ eventos NADH Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina reduzido ng Nanograma OR Odds Ratio Pb Pares de bases PCR Reação em Cadeia da Polimerase pmol Picomol rCRS Revised Cambridge Reference Sequence (Sequência Referência de Cambridge Revisada) RNA Ácido Ribonucleico SNPs Single Nucleotide Polymorphisms (Polimorfismos de base única) T Timina tRNA RNA de transferência uL Microlitro UI Unidades internacionais vs Versus X² Qui-quadrado SUMÁRIO AGRADECIMENTOS .......................................................................................... 5 RESUMO ............................................................................................................. 6

......................................................................................................... 8 LISTA DE GRÁFICOS ...................................................................................... 11 LISTA DE TABELAS ........................................................................................ 12 LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. 13 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 19 1.1. Endometriose ........................................................................................ 19 1.2. DNA mitocondrial .................................................................................. 20 1.3. Haplogrupos mitocondriais ................................................................... 22 1.4. Heteroplasmia ....................................................................................... 24 1.5. DNA mitocondrial e endometriose ........................................................ 26 1.6. Justificativa do estudo .......................................................................... 27 2. OBJETIVO .................................................................................................... 29 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS .......................................................................... 31 3.1. Casuística ............................................................................................. 31 3.1.1. Critérios de inclusão ........................................................................ 31 3.1.2. Critérios de exclusão ....................................................................... 31 3.1.3. Dinâmica do estudo ......................................................................... 32 3.1.4. Cálculo do tamanho da amostra ..................................................... 34 3.2. Métodos ................................................................................................ 34 3.2.1. Coleta de amostras ......................................................................... 34 3.2.2. Extração de DNA ............................................................................. 34 3.2.3. Amplificação do mtDNA .................................................................. 35 3.2.4. Reação de sequenciamento ............................................................ 36 3.2.5. Análise estatística ........................................................................... 38 4. RESULTADOS ............................................................................................. 40 4.1. Avaliação Clínica .................................................................................. 40 4.2. Análise Genética ................................................................................... 43 5. DISCUSSÃO ................................................................................................. 50 6. CONCLUSÕES ............................................................................................. 60 REFERÊNCIAS ................................................................................................. 63 ANEXOS ........................................................................................................... 74 APÊNDICES...................................................................................................... 86 1. INTRODUÇÃO Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 19 1. INTRODUÇÃO 1.1. Endometriose Endometriose é definida pela presença de tecido endometrial (glândulas e/ou estroma) fora do útero. Estima-se que esta doença atinja de 10 a 15% das mulheres em idade fértil, chegando, entre mulheres com dor pélvica crônica ou infertilidade, a 40% e 48%, respectivamente (1). Existem inúmeras classificações propostas para a endometriose. A American Society for Reproductive Medicine (ASRM) classifica a endometriose em estádios de I a IV, de acordo com o tamanho das lesões, presença de aderências e bloqueio do fundo de saco de Douglas (2). Morfologicamente, podemos dividi r a doença em endometriose peritoneal superficial, endometrioma ovariano ou endometriose profunda. A endometriose superficial é caracterizada por focos de lesões localizados no peritônio de forma superficial, histologicamente semelhantes ao endométrio tópico (3). Os endometriomas ovarianos estão presentes em até 44% das pacientes com endometriose e caracterizam -se por cistos de conteúdo espesso de cor “achocolatada”, usualmente associados a aderências ao peritônio posterior e ao ligamento largo, com patogênese ainda controversa (3). Os implantes profundos são definidos por nódulos de profundidade maior que cinco milímetros. Usualmente, os principais sítios acometidos são: ligamentos útero-sacros, região retrocervical, terço superior de vagina, retossigmoide, bexiga e ureter (4). A suspeita clínica da endometriose é feita com base em dados de anamnese e exame físico. Os sintomas mais comumente apresentados por essas pacientes são: dor pélvica em cólica no período menstrual (dismenorreia), dor pélvica crônica (ou acíclica), dispareunia de profundidade, sintomas intestinais ou urinários cíclicos e infertilidade. Tais queixas podem variar de acordo com o local dos implantes endometrióticos, podendo acometer praticamente todos os locais do organismo, mesmo sítios não usuais como, por exemplo, pulmão, plexo sacral e pâncreas (4). A prevalência correta dos tipos de endometriose na população geral não é bem estabelecida, visto que o diagnóstico definitivo é hist ológico (4). A abordagem moderna da endometriose se baseia no reconhecimento do tipo de Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 20 acometimento das lesões, sendo o diagnóstico correto d a endometriose profunda o maior desafio para a obtenção de bons resultados terapêuticos (5). Diversas teorias foram propostas para explicar a etiopatogenia da doença e a mais aceita ainda é a da menstruação retrógrada (6). Diversos fatores determinam a adesão e proliferação das células endometriais na cavidade pélvica, como alterações imunológicas, inflamatórias e o stress oxidativo (7-11). Além disso, a regulação de inúmeros desses mecanismos parece ser determinada por fatores genéticos, podendo levar a p erda ou ganho de função, secundárias à instabilidade de microssatélite, instabilidade cromossômica, perda de heterozigose, polimorfismos , mutações de genes nucleares e mutações do DNA mitocondrial (mtDNA) (10). O desbalanço entre a produção de espécies reativas de oxigênio, que são metabólitos intermediários da metabolização normal do oxigênio, e os sistemas anti-oxidativos, que são designados para controlar a produção e inativar os radicais livres de oxigênio e reparar as células danificadas, caracteriza o stress oxidativo (12). Sendo a mitocôndria a organela responsável pelo metabolismo de oxigênio intracelular, alterações no mtDNA poderiam alterar a transcrição, tradução e replicação do mesmo, e interferir nas vias de sinalização nuclear (13). 1.2. DNA mitocondrial As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas encontradas em todas as células nucleadas, responsáveis pelo metabolismo de oxigênio intracelular (13). O mtDNA é composto por uma dupla fita circular q ue contém 16.569 pares de bases onde se localizam 37 genes, todos envolvidos no metabolismo de oxigênio e produção de energia na célula (14). Os componentes da cadeia respiratória localizam -se na membrana interna da mitocôndria sob a forma de quatro complexos proteína-lipídeos: o complexo I (NADH ubiquinona oxidoreductase) com mais de 40 polipeptí deos, o complexo II (succinato-ubiquinona oxidoreduc tase), o complexo III (ubiquinolcitocromo c oxidoreductase) e o complexo IV (citocromo c oxidase). A cadeia respiratória mitocondrial possui ainda dois transportadores de elétrons: a ubiquinona e o citocromo c. Estes constituintes, bem como o complexo V (ATP sintetase), formam o sistema de fosforilação oxidativa, que fo rnece o ATP necessário à Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 21 célula (15). O complexo I mitocondrial é formado por um grande número de proteínas e possui 46 subunidades, sendo sete codificadas por gene s mitocondriais e as restantes pelo DNA nuclear. Devido à complexidade desse sistema, defeitos genéticos resultam em uma grande variedade de fenótipos clínicos (15). Há também uma região não codificadora denominada região control adora, D-loop (Displacement Loop) ou região hipervariável (HV), responsável pela regulação da transcrição e replicação do mtDNA. Essa região compreende três segmentos: HV1, localizado entre as posições 16.024 e 16.365; HV2, da posição 73 a 340; e HV3, da posição 438 a 574 (Figura 1) (16-18). Figura 1 - Mapa do genoma mitocondrial humano e diagrama da região controladora A designação dos genes tRNA são indicados por for a do círculo . A numeração na região controladora se refere à sequência referência de Anderson et al. (19). Fonte: adaptado de MITOMAP (www.mitomap.org) O mtDNA apresenta uma taxa de mutaç ão 5 a 10 vezes maior do que o DNA nuclear, sua herança é exclusivamente materna e a molécula não sofre Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 22 recombinação, resultando no acúmulo de mutações ao longo das linhagens matrilineares (20). As mutações encontradas em mais de 1% da população são denominadas polimorfismos e são definidas a partir da comparação da sequência do mtDNA do indivíduo analisado com uma sequência padrão, sendo atualmente utilizada a Revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) (21). O conjunto de polimorfismos do DNA mitocondrial de um indivíduo é denominado de haplótipo. 1.3. Haplogrupos mitocondriais Haplogrupo mitocondrial refere-se ao grupo de indivíduos que apresentam determinados polimorfismos em comum, característicos de um grupo étnico e de uma origem geográfica (13). O modelo “out of Africa” (22) sugere uma origem única dos homens modernos originada na África há aproximadamente 250.000 anos (Figura 2). A partir de um haplogrupo ancestral, novas mutações surgiram, formando novos haplogrupos e, consequentemente, novas linhagens evolutivas. Com o advento das migrações e com o isolamento geográfico dessas populações, os haplogrupos e os polimorfismos mitocondriais formaram linhagens independentes, tornando -se específicos para cada região geográfica, classificados nos grandes grupos africano, europeu, asiático e a meríndio (13; 23). Conforme o aumento no número de diferentes populações estudadas, polimorfismos adicionais população-específicos vão sendo descritos e, portanto, os haplogrupos mitocondriais vão sendo constantemente rearranjados e subdivididos. A Figura 3 ilustra um diagrama da filogenia dos haplogrupos. Todos os mtDNA africanos estão incluídos no macro haplogr upo L. O haplogrupo africano L0 é a linhagem mais antiga do mtDNA encontrada na população Koi-San e L1 e L2 são encontrados em populações de pigmeus africanos. Os macro haplogrupos M e N surgiram na região subsaariana a partir de L3 do nordeste africano e migraram para formar as populações indígenas , europeia e asiática. Enquanto o haplogrupo M ficou confinado à Ásia, os haplogrupos A, C e D ocuparam o nordeste da Sibéria e migraram ao longo do estreito de Bering há cerca de 20.000 anos para formar os nativ os americanos. Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 23 Migrações adicionais trouxeram para as Américas os haplogrupos B e X, e o haplogrupo B colonizou as Ilhas do Pacífico (9). Figura 2 - Representação gráfica do padrão de migração das linhagens mitocondriais As letras representam a distribuição dos haplogrupos mitocondriais para cada região do mapa. Fonte: MITOMAP (24). Figura 3 - Filogenia simplificada do DNA mitocondrial ilustrando o uso de letras do alfabeto para a designação do haplogrupo A raiz da árvore é indicada pela inscrição mt -MRCA (matrilineal most recent common ancestor ). Os haplogrupos L são as linhagens mais antigas. Haplogrupo L3 deu origem aos haplogrupos M e N, que abrangem toda a var iação observada fora da África. Fonte: Phylotree, 2016. ("http://www.phylotree.org” ). Nesse sentido, os haplogrupos mitocondriais, por serem caracterizados por polimorfismos específicos, podem estar associados a condições fisiológicas no Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 24 metabolismo intracelular ou a doenças: os haplogrupos T e U, por exemplo, já foram associados com redução na motilidade do esperma (25); haplogrupos J e Uk são encontrados em corredores de alta performance de curtas distâncias e o haplogrupo I em corredores de alta performance de longa distância. De forma inversa, os polimorfismos e, portanto, seus respectivos haplogrupos, podem determinar alterações cruciais no metabolismo de oxigênio e aumento do stress oxidativo e já foram associados a diversas doenças metabólicas, degenerativas, infecciosas e autoimunes como diabetes melito, miopatias, carcinoma hepatocelular, dentre outras (23; 26-30). 1.4. Heteroplasmia Algumas doenças associadas ao mtDNA e suas variações fenotípicas poderiam ser explicadas pela presença de heteroplasmia do mtDNA, que consiste na co-expressão, em um mesmo indivíduo, da variante selvagem e da variante polimórfica em graus variados (31; 32). Devido ao grande número de cópias do mtDNA em cada célula, uma mutação ocorrida em apenas algumas delas pode resultar em uma mistura de diversas sequê ncias de mtDNA dentro da mitocôndria, célula, tecido ou órgão (33). A heteroplasmia pode se manifestar de duas maneiras: sequência e comprimento (deleção ou inserção). A heteroplasmia de sequência, ou de ponto, tem origem quando duas linhagens de mtDNA diferem pela substituição de uma única base (Figura 4). A heteroplasmia de comprimento é definida quando há variação no número de bases em uma região homopolimérica, tipicamente na concentração de bases C s ou repetições de AC s (Figura 5). As regiões homopoliméricas de C-stretch estão localizadas entre as posições 16.184 e 16.193 na região HV1, entre 303 e 315 em HV2 e entre 568 e 573 em HV3. Na região HV3, entre os nucleotídeos 515 e 524, pode ser observada a ocorrência de heteroplasmia de comprimento com adição ou deleção de dinucleotídeos ACs (Figura 6) (31; 34). O aumento da quantidade de heteroplasmia intracelular pode conferir uma vantagem adaptativa ou determinar um defeito bioquímico no metabolismo de oxigênio celular, aumentando a produção de radicais livres de oxigênio, causando defeito na síntese de ATP, disfunção e morte celular (22). Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 25 Figura 4 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmias de ponto A: Indivíduo com heteroplasmia de ponto na posição 16.278, com a presença das bases T e C. B: Indivíduo com heteroplasmia de ponto na posição 16.241, com a presença das bases A e G. Fonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP). Figura 5 - Eletroferogramas exemplificando uma heteroplasmia de comprimento na região HV1 A: Indivíduo sem a heteroplasmia de comprimento. B: Indivíduo com heteroplasmia de comprimento devido à presença de 1C na posição 16.189 (ao invés do T) e a inserção de 1C na posição 16.193, resultando em um trecho heteroplasmático, que resulta na leitura fora de fase a 3’ do ponto de heteroplasmia. Fonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, FMUSP. Figura 6 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmia de comprimento na região HV3 . A: Indivíduo sem a heteroplasmia de comprimento, com 5 conjuntos de dinucleotídeos AC. B: Indivíduo com heteroplasmia de comprimento devido à inserção de um dinucleotídeo AC na posição 524. C: Indivíduo com heteroplasmia de comprimento devido à deleção de um dinucleotídeo AC na posição 524. Fonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, FMUSP. Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 26 1.5. DNA mitocondrial e endometriose Alguns trabalhos já relacionaram o DNA mitocondrial e a presença de endometriose em populações asiáticas e são descritos abaixo. Cho et al. (36), em 2012, analisaram 365 mulheres coreanas na menacme submetidas a cirurgias eletivas, sendo 198 diagnosticadas com endometriose e 167 controles. As pacientes com endometriose foram classificadas como estádio I (n = 26), II (n = 11), III (n = 80) e IV (n = 81), de acordo com a ASRM (2). Foram avaliados os polimorfismos A10.398G, G13 .708A e T16.189C. Dentre esses, o T16.189C foi encontrado em uma frequência significativamente maior no grupo com endometriose quando comparado ao grupo controle (45,9% versus 34,7%; p = 0,03), com odds ratio de 1,598 (IC 95%: 1,046 - 2,442). Govatati et al. (37), em 2012, pesquisaram os polimorfismos do mtDNA em amostras de endométrio tópico e de lesões de endometriose em 32 pacientes indianas com endometriose moderada ou grave e avaliaram os haplogrupos mitocondriais de 128 amostras de sangue periférico de pacientes com endometriose confirmada e de 90 controles. Foram observados diferentes polimorfismos na região controladora em 45,1% das amostras de endométrio, sendo 6 heteroplasmias de ponto observadas apenas nas lesões de endometriose. Foram identificados 39 haplogrupos mitocondriais entre pacientes e controles, sendo que o haplogrupo M5 (característico de populações do Sul da Ásia) apresentou frequência significativamente mais elevada entre pacientes com endometriose em comparação ao grupo controle (19,5% versus 3,3% , respectivamente; p = 0,00069). Em 2013, o mesmo grupo de Govatati et al. (17) estudou 152 mulheres indianas com idades entre 20 e 40 anos e endometriose confirmada histologicamente. As pacientes apresentavam endometriose estádio III (n = 98) ou IV (n = 54) da ASRM (2). Foram incluídas 150 pacientes inférteis no grupo controle, submetidas à laparoscopia diagnóstica, sem endometriose. A partir do sequenciamento completo da região controladora do mtDNA de todas as amostras, observou-se que as frequências dos polimorfismos A189G (49% versus 33%; p = 0,0455), 310C (51% versus 43%; p = 0,354) e T16.189C (41% versus 17%; p = 0,0005) foram significativamente maiores nas pacientes com endometriose quando comparadas àquelas sem a doença. Marina de Paula Andres INTRODUÇÃO 27 1.6. Justificativa do estudo Crescente evidência tem demonstrado que o stress oxidativo pode estar relacionado à etiopatogenia da endometriose (12). Sendo a mitocôndria o maior gerador intracelular de espécies reativas de oxigênio, polimorfismos na região controladora do DNA mitocondrial podem alterar a transcrição e expressão dos genes mitocondriais, aumentando ou diminuindo a produção de tais elem entos. Além disso, estudos em famílias e irmãs gêmeas sugerem também uma predisposição genética ao desenvolvimento da endometriose. A avaliação genômica desses indivíduos já permitiu identificar diversos polimorfismos em genes que codificam proteínas relac ionadas à resposta imune, citocinas, moléculas de adesão, inflamação e stress oxidativo relacionados com a doença (10; 38). A relação do mtDNA e endometriose já foi descrita em alguns estudos que avaliaram o fluido peritoneal e lesões da doença (39; 40). Nas populações coreana e indiana já foi sugerida a associação de alguns polimorfismos da região controladora do mtDNA com a endometriose (17; 36; 37; 41). Dessa forma, baseado no conhecimento de que os polimorfismos podem ser específicos para cada população estudada e que a brasileira é altamente miscigenada, elaboramos o presente estudo para avaliar de forma inédita a possível associação dos polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial e dos haplogrupos mitocondriais com a presença de endometriose, em amostra de mulheres brasileiras. 2. OBJETIVO 29 2. OBJETIVO Avaliar a associação dos polimorfismos da região controladora ( D-loop) do DNA mitocondrial e dos haplogrupos mitocondriais com a presença de endometriose em amostra de mulheres brasileiras. Marina de Paula Andres OBJETIVO 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 31 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS 3.1. Casuística Esse estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo ( FMUSP), onde foram recrutadas as participantes , em colaboração com o Laboratório de Imuno -Hematologia e Hematologia Forense (LIM 40), do Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho da FMUSP, onde foi realizada a análise genética do mtDNA. As pacientes foram divididas em dois grupos: endometriose (pacientes com endometriose confirmada histologicamente, n = 90) e controles (pacientes sem endometriose, n = 92). As pacientes foram previamente informadas sobre o estudo e o material biológico (sangue) foi coletado após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexos A e B). A coleta das amostras respeitou os protocolos técnicos do hospital e dos médicos envolvidos e a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da FMUSP sob o parecer 534714/14 (Anexo C). 3.1.1. Critérios de inclusão Para o grupo com endometriose , os critérios de inclusão foram: mulheres com idade entre 18 e 50 anos com endometriose comprovada histologicamente. Para o grupo controle, foram selecionadas mulheres entre 18 e 50 anos submetidas a cirurgias por leiomioma uterino, hidrossalpinge, teratoma ovariano, cistos benignos ovarianos ou laqueadura tubária, de acordo com indicação apropriada dos Setor es de Planejamento Familiar e Grupo Cirúrgico Geral da Divisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da FMUSP, momento em que foi verificada a ausência de endometriose. 3.1.2. Critérios de exclusão Foi considerado critério de exclusão a presença de comorbidades previamente associadas aos polimorfismos do mtDNA, como insuficiência renal Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 32 crônica, carcinoma hepatocelular e doença coronariana (42). Foram também excluídas pacientes com diagnóstico de adenomiose. 3.1.3. Dinâmica do estudo Após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, foi realizada a coleta de amostra de sangue periférico das pacientes que atenderam aos critérios de inclusão e exclusão acima descritos, no ambulatório do Setor de Endometriose (grupo endometriose) ou na enfermaria da Divisão de Clínica Ginecológica do Hospital da Clínicas da FMUSP (grupo controle). O fluxograma da dinâmica do estudo está representado na Figura 7. Todas as pacientes incluídas responderam a um questionário (Anexo D) aplicado por esta pesquisadora, com dados demográficos, presença dos sintomas típicos da doença (dismenorreia, dor pélvica crônica, dispareunia de profundidade, dor ao evacuar cíclica, disúria cíclica e infertilidade), graduação de zero a dez dos sintomas dolorosos pela escala visual analógica de do r (EVA), uso de medicações e comorbidades. Os dados cirúrgicos foram levantados do prontuário eletrônico, bem como o estádio da doença pela cla ssificação da ASRM (Anexo E), resultado do exame anatomopatológico da lesão e classificação por tipo de lesão: superficial (doença exclusivamente peritoneal, com infiltração menor que 5 mm), ovariana (presença do endometrioma cístico ovariano com ou sem le são peritoneal) ou profunda (presença de qualquer lesão profunda com infiltração maior que 5 mm) (3). As amostras foram processadas e analisadas no Laboratório de Imuno - Hematologia e Hematologia Forense (LIM 40) da FMUSP. Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 33 Figura 7 - Fluxograma representando a dinâmica do estudo ASRM: American Society for Reproductive Medicine (2). Fonte: Departamento de Ginecologia e Obstetrícia , FMUSP. Grupo endometriose (n = 90) Grupo Controle (n = 92) Coleta de 4 mL de sangue periférico Assinatura do TCLE Extração do DNA Sequenciamento da região controladora do mtDNA Comparação com a Sequência de Cambridge revisada (Polimorfismos) Determinação dos haplótipos e haplogrupos mitocondriais • Mulheres 18-50 anos • Diagnóstico histológico • Classificação ASRM • Tipo de endometriose (superficial, ovariana, profunda) • Mulheres 18-50 anos • Mioma uterino (n=44) • Laqueadura tubária (n=30) • Teratoma ovariano (n=13) • Hidrossalpinge (n=2) • Cistoadenoma ovariano (n=3) Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 34 3.1.4. Cálculo do tamanho da amostra Não havendo estudo prévio sobre o mtDNA e endometriose em mulheres brasileiras, o cálculo amostral foi baseado no estudo de Govatati et al. (25), no qual o polimorfismo T16.189C foi encontrado em apr oximadamente 17% da população geral e em 41% das mulheres com endometriose. Baseado nesses dados, com intervalo de confiança e poder de 95%, a amostra necessária para encontrar esta diferença em mulheres brasileiras seria de 87 mulheres em cada grupo (com e sem a doença). O cálculo da amostra seguiu a fórmula abaixo (31): Onde: p 1 é a frequência do polimorfismo T16 .189C nas mulheres sem endometriose; p2 é a frequência do polimorfismo T16 .189C nas mulheres com endometriose; e Z são os valores da distribuição normal padrão com confiança 1-α e poder 1-β. 3.2. Métodos 3.2.1. Coleta de amostras Foram coletados, por punção venosa periférica de antebraço , 4 mL de sangue total em tubo com EDTA e armazenad os em geladeira a 4 ºC para posterior processamento. 3.2.2. Extração de DNA A extração do DNA foi realizada pelo processo de Salting-out, de acordo com protocolo previamente publicado (44), à medida que as amostras foram coletadas. O DNA extraído foi eluído em tampão de Tris-EDTA, quantificado em espectrofotômetro Nanodrop 2.000 (Thermo Fisher), aliquotado e armazenado em microtubos a temperatura de -20 °C para posterior sequenciamento e análise de polimorfismos. ( ) ( ) ( ) 2 21 2211 2 βα/2 pp )p(1p)p(1px ZZn - -+-+= Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 35 3.2.3. Amplificação do mtDNA A região controladora do mtDNA foi amplificada e analisada em todas as amostras para construção das sequências, análise dos polimorfismos dessa região, composição dos haplótipos e classificação dos respectivos haplogrupos mitocondriais. Os DNAs foram submetidos a uma única reação de PCR para amplificação da sequência do nucleotídeo 15.879 ao 727, contendo 1.417 pb, abrangendo as três regiões de interesse (HV1, HV2 e HV3). Os componentes, bem como as condições de ciclagem necessárias para realização da reação de PCR, estão descritos nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Os primers utilizados (Invitrogen Life Technologies) foram o L15.879 e H727 e suas respectivas sequências estão descritas na Tabela 3. Após este procedimento, foi realizada a purificação dos produtos de PCR com a utilização de Exonuclease I e Shrimp Alkaline Phosphatase (EXO/SAP, Thermo Fisher Scientific), segundo recomendações do fabricante. Tabela 1 - Volume e concentrações dos reagentes utilizados na reação de cadeia da polimerase (PCR) para amplificação da região controladora do DNA mitocondrial Componentes Concentração Volume (uL) DNA 50 ng/uL 2 Primer Forward (F) 2,5 pmol/uL 0,4 Primer Reverse (R) 2,5 pmol/uL 0,4 dNTP 1,25 mM 0,8 Enzima Taq DNA Polimerase 5U/uL 0,15 Tampão da Enzima 10x 1 MgCl2 50 mM 0,3 Água ultrapura - 4,95 DNA: ácido desoxirribonucleico ; dNTP: desoxirribonucleotídeo tri -fosfatado; MgCL2: cloreto de magnésio Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 36 Tabela 2 - Condições de temperatura , tempo e número de ciclos da reação de cadeia da polimerase (PCR) utilizadas para amplificação da região controladora do DNA mitocondrial Etapas Temperatura (°C) Tempo (min) Ciclos (n) Desnaturação inicial 95 1 1 Desnaturação 95 1 36 Anelamento 60 1 Extensão 72 1 Extensão Final 72 7 1 Min: minutos; n: número de ciclos; °C: graus Celsius. 3.2.4. Reação de sequenciamento Os produtos de PCR foram sequenciados com a utilização do BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA), conforme protocolo do fabricante. As amostras foram sequenciadas nas duas direções, forward e reverse, utilizando-se os mesmos primers da reação de PCR, L15.879 e H727, respectivamente. Nas amostras que apresentaram heteroplasmia de comprimento nas regiões HV1 ou HV2 foram usados adicionalmente os primers H16.548 e L16.413 (Tabela 3), respectivamente, em uma nova reação de sequenciamento para garantir a leitura de todas as bases dessas regiões. Após as reações de sequenciamento, foi realizada eletroforese capilar com a utilização do sequenciador automático ABI3130 ( Applied Biosystems, Foster City, CA). Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 37 Tabela 3 - Primers utilizados no estudo para as reações de PCR e sequenciamento da região controladora do DNA mitocondrial Primer Região Sequência Direção L15.879 HV 1 5’-AATGGGCCTGTCCTTGTAGT-3’ Foward H16.548 HV 1 5’-GGGAACGTGTGGGCTATTTA-3’ Reverse H727 HV 3 5’-AGGGTGAACTCACTGGAACG-3’ Reverse L16.413 HV 2 5’-TGAAATCAATATCCCGCACA-3’ Foward As sequências individuais foram alinhadas e comparadas com a sequência padrão Revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) (21) utilizando o programa BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Os polimorfismos são apresentados como sendo diferenças em relação à sequência referência rCRS. Todos os polimorfismos observados só foram considerados reais quando confirmados pelo sequenciamento da fita reversa e nomeados de acordo com as recomendações (18; 45-47). Para definição final do haplótipo foi utilizado o programa Haplosite (http://www.haplosite.com/haplosearch) e, a partir dos haplótipos finais individuais, foi possível a classificação dos haplogrupos mitocondriais, utilizando o aplicativo Haplogrep (http://haplogrep.uibk.ac.at). Esse aplicativo é baseado em dados do site Phylotree, que utiliza algoritmos para a classificação automática dos haplogrupos mitocondriais. O programa apresenta como resultado a posição filogenética do respectivo haplogrupo, em forma de árvores filogenéticas, proporcionando assim, uma explicação detalhada de como e porque o indivíduo foi classificado naquele haplogrupo (48). Para as análises das frequências dos polimorfismos encontrados e para conferir a existência de seus relatos anteriores, foi consultado o banco de dados do genoma mitocondrial humano, MITOMAP (24). Esse banco relata dados publicados e não publicados sobre as variações do mtDNA. O sequenciamento e a análise dos polimorfismos da região controladora do mtDNA compreendendo as regiões HV1, HV2 e HV3 foram realizados em todas as amostras. Marina de Paula Andres CASUÍSTICA E MÉTODOS 38 3.2.5. Análise estatística As variáveis qualitativas foram descritas segundo grupos com uso de frequências absolutas e relativas e foi verificada a associação com os grupos com uso de testes qui-quadrado, teste da razão de verossimilhanças ou teste exato de Fisher. As variáveis contínuas foram descritas segundo grupos com uso de medidas resumo (média e desvio padrão) e comparadas entre os grupos com uso do teste T-Student ou teste Mann-Whitney (43). Foram considerados estatisticamente significantes os valores de p menores que 0,05. 4. RESULTADOS Marina de Paula Andres RESULTADOS 40 4. RESULTADOS 4.1. Avaliação Clínica Foram incluídas 90 pacientes no grupo endometriose (EDT) e 92 no grupo controle (CT). A média etária das pacientes foi de 39,2 ± 6,2 anos no grupo EDT e de 40,1 ± 9,8 anos no grupo CT. Os grupos foram semelhantes quanto à idade, grau de instrução e cor de pele autodeclarada (Tabela 4). As mulheres incluídas nos grupos endometriose eram, em sua maioria, casadas ou amasiadas ( 69,8%), de pele branca (49,4%) e sem comorbidades (63,3%). O grupo controle foi composto, em sua maioria, de mulheres casadas ou amasiadas (65,2%), de pele parda (46,2%) e sem comorbidades (64,1%). As principais comorbidades observadas foram hipertensão arterial ( 17,8% grupo endometriose vs. 21,7% grupo controle, respectivamente), diabetes melito tipo 2 (2,2% vs. 4,3%) e hipotireoidismo (3,3% vs. 1,0%). Quando comparadas ao grupo controle, as mulheres do grupo endometriose apresentaram menor número de gestações (1,1 ± 1,4 vs. 2,0 ± 1,7 ; p<0,001, respectivamente). No grupo controle, as pacientes usavam menos métodos contraceptivos hormonais, em comparação ao grupo endometriose (29,7% versus 44,9%; p = 0,034; Tabela 4). Marina de Paula Andres RESULTADOS 41 Tabela 4 - Dados demográficos e clínicos das pacientes incluídas no estudo no s grupos controle (CT) e endometriose (EDT) Variável Grupo, n (%) Total p Controle (n=92) EDT (n=90) Estado civil Solteira 27 (29,3) 21 (23,6) 48 (26,4) 0,1161 Casada/ Amasiada 60 (65,2) 62 (69,7) 122 (67,0) Separada 2 (2,2) 6 (6,7) 8 (4,4) Viúva 3 (3,3) 0 (0) 3 (1,7) Instrução 1º Grau 21 (22,8) 18 (20,2) 39 (21,5) 0,1781 2º Grau 51 (55,4) 40 (44,9) 91 (50,3) Superior 20 (21,7) 31 (34,8) 51 (28,2) Cor de pele Branca 36 (39,6) 44 (49,4) 80 (44,4) 0,6051 Parda 42 (46,2) 35 (39,3) 77 (42,8) Negra 12 (13,2) 9 (10,1) 21 (11,7) Amarela 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) Anticoncepcional hormonal 27 (29,7) 40 (44,9) 67 (37,2) 0,0342 Sem comorbidades 59 (64,1) 57 (63,3) 116 (63,7) 0,9112 Tabagismo 9 (9,9) 5 (5,6) 14 (7,8) 0,2852 AF de endometriose 3 (3,3) 8 (9) 11 (6,1) 0,1112 AF: antecedente familiar. 1Teste da razão de verossimilhanças; 2Teste qui-quadrado. Foram incluídas no grupo controle mulheres submetidas à cirurgia por mioma uterino (47,8 %, n = 44), laqueadura tubária (3 2,6%, n = 30), teratoma ovariano (14,1%, n = 13), cistoadenoma ovariano (3,3%, n = 3) e hidrossalpinge (2,2%, n = 2). No Gráfico 1 estão representadas as pacientes do grupo endometriose por tipo e estádio da ASRM da doença (2). Marina de Paula Andres RESULTADOS 42 Gráfico 1 - Classificação da American Society for Reproductive Medicine e por tipo de lesão das pacientes incluídas no grupo endometriose (n= 90) ASRM: American Society for Reproductive Medicine (2). Fonte: Departamento de Ginecologia e Obstetrícia , FMUSP. As pacientes do grupo endometriose apresent aram como principal sintoma a dismenorreia (73,3%), seguido de dor pélvica crônica (56,7%). Os sintomas álgicos típicos da doença ocorreram em maior frequência no grupo EDT quando comparados ao grupo CT para todos os sintomas avaliados . A dismenorreia foi classificada como severa (EVA ≥ 7) em maior número de mulheres no grupo endometriose quando comparadas ao grupo controle (62,2% vs. 41,8%, p = 0,006). Os resultados se encontram resumidos na Tabela 5. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 18 0 36 36 17 3 70 ASRM Marina de Paula Andres RESULTADOS 43 Tabela 5 - Quadro clínico das pacientes incluídas nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) Sintoma Grupo, n (%) Total p* CT (n=92) EDT (n=90) Infertilidade 5 (5,5) 23 (25,8) 28 (15,6) <0,001 Dismenorreia (EVA ≥ 7) 38 (41,8) 56 (62,2) 94 (51,9) 0,006 Dispareunia de profundidade 28 (30,8) 48 (53,3) 76 (42) 0,002 Dor pélvica crônica 21 (23,1) 51 (56,7) 72 (39,8) <0,001 Alterações intestinais 0 (0) 21 (23,3) 21 (11,6) <0,001 Alterações urinárias 2 (2,2) 9 (10) 11 (6,1) 0,028 EVA: escala visual analógica de dor. *Teste qui-quadrado. 4.2. Análise Genética Foram observados 205 polimorfismos diferentes na região controladora do mtDNA nas amostras avaliadas. Destes, 85,3% estavam localizados nas regiões hipervariáveis: 120 (58,5%) na HV1, 35 (17,0%) na HV2 e 20 (9,7%) na HV3 (Apêndices A e B). As heteroplasmias encontradas est ão resumidas na Tabela 6. Foram observadas heteroplasmias de ponto em dois indivíduos do grupo endometriose e dois do grupo controle, todas na posição 73 (A/G), sem diferença entre os grupos (2,2% vs. 2,2%, respectivamente; p > 0,999). A heteroplasmia de comprimento foi a forma mais comum das heteroplasmias na s mulheres incluídas. Na região HV1, a transição de T para C na posição 16.189 (T16.189C) ocorreu em 43,3% (n = 39) das pacientes no grupo endometriose e 3 4,0% (n = 37) no grupo controle, sem diferença estatisticamente significante (p = 0,450). A combinação do polimorfismo T16.189C com a inserção de Cs na posição 16.193 foi também semelhante entre os grupos avaliados (Tabela 6 , Figura 8). Nas regiões HV2 e HV3 também foram observadas heteroplasmias de comprimento, nas posições 310, 315, 523 e 524, com frequências semelhantes entre os grupos avaliados (Tabela 6). Alguns exemplos estão nas Figuras 9 e 10 . Na posição 573, a inserção de 2 citosinas foi observada em maior frequência no grupo controle (29,3%) em comparação ao grupo endometriose (5,6%). Marina de Paula Andres RESULTADOS 44 Tabela 6 - Análise estatística das h eteroplasmias da região controladora do DNA mitocondrial encontradas nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) Heteroplasmia Grupo, n(%) p* Tipo Região Localização CT (n=92) EDT (n=90) Ponto HV3 73 A/G 2 (2,2) 2 (2,2) >0,999 Comprimento HV1 16.182C 3 (3,3) 4 (4,4) 0,719 16.189C 34 (37,0) 39 (43,3) 0,450 16.188C.1C 2 (2,2) 7 (7,8) 0,098 16.188C.2C 24 (26,1) 22 (24,4) 0,865 Comprimento HV2 310.1C 44 (47,8) 48 (53,3) 0,463 310.2C 5 (5,4) 10 (11,1) 0,187 315.1C 89 (96,7) 90 (100) 0,246 Comprimento HV3 524.1AC 1 (1,1) 2 (2,2) 0,619 524.2AC 0 (0) 2 (2,2) 0,243 523del 35 (38,0) 31 (34,4) 0,646 524del 35 (38,0) 31 (34,4) 0,646 573.1C 4 (4,3) 0 (0) 0,121 573.2C 27 (29,3) 5 (5,6) <0,001 *Teste Qui-quadrado. Marina de Paula Andres RESULTADOS 45 Figura 8 - Eletroferogramas de indivíduos com heteroplasmia de comprimento na região 16.193 e transição no nucleotídeo 16.189 As setas pretas indicam a heteroplasmia de comprimento e as setas vermelhas a heteroplasmia de ponto. A: inserção de 1C na posição 16.193. B: inserção de 2Cs na posição 16.193. Fonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, FMUSP. Figura 9 - Eletroferogramas apresentando indivíduos com heteroplasmia de comprimento na região HV2, posição 309 e inserção de 1C na posição 315 A: inserção de 1C na posição 309 e 1C na posição 315. B: inserção de 2C s na posição 309 e 1C na posição 315. Fonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, FMUSP. Figura 10 - Heteroplasmia de comprimento na região HV3, entre os nucleotídeos 515 e 524 A: Indivíduo com adição de um AC na posição 524 (AC 6). B: Indivíduo com adição de 2 ACs na posição 524 (AC7). Fonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, FMUSP. Marina de Paula Andres RESULTADOS 46 Uma paciente com diagnóstico de teratoma ovariano apresentou uma duplicação de 15 nucleotídeos na região HV 1, da posição 16.032 à 16.118 (TCTCTGTTCTTTCAT), representada na Figura 11, pertencente ao haplogrupo africano L1C2. Figura 11 - Duplicação de 15 nucleotídeos entre as posições 16.018 e 16.032 do DNA mitocondrial A: Eletroferograma de um indivíduo mostrando a sequência normal entre as posições 16.018 e 16.032 (colchetes). B: Eletroferograma mostrando a sequência de nucleotídeos de uma paciente com teratoma ovariano com duplicação de 15 nucleotídeos entre as posições 1 6.018 e 16.032 (colchetes). Marina de Paula Andres RESULTADOS 47 Na Tabela 7 estão destacados os polimorfismos com diferença estatisticamente significante entre os grupos: 4 deles relacionados com a presença de endometriose (G185A, T236C, G499A e T16.217C) e um (T146C) associado à ausência de doença. Além disso, encontram-se listados a frequência dos polimorfismos A189G e 310C , relacionados previamente à endometriose por outros autores, que, no entanto, tiveram frequência semelhante entre os grupos em nossa amostra. Tabela 7 - Polimorfismos na região controladora do DNA mitocondrial nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) Posição rCRS SNP Grupo, n(%) Total, n(%) p* CT (n=92) EDT (n=90) 146 T C 30 (32,6) 17 (18,9) 47 (25,8) 0,042 185 G A 0 (0) 6 (6,7) 6 (3,3) 0,013 236 T C 0 (0) 5 (5,6) 5 (2,7) 0,028 499 G A 4 (4,3) 12 (13,3) 16 (8,8) 0,038 16.217 T C 5 (5,4) 13 (14,4) 18 (9,9) 0,049 189 A G 11 (12) 12 (13,3) 23 (12,6) 0,826 310 - 1C 44 (47,8) 48 (53,3) 92 (50,5) 0,463 310 - 2C 5 (5,4) 10 (11,1) 15 (8,2) 0,187 *Teste exato de Fisher; rCRS: sequência referência de Cambridge revisada (21); SNP: single nucleotide polymorphism ou polimorfismo de base única. Na amostra total foram encontrados 182 haplótipos. Desses, 180 foram únicos e 2 comuns a mais de um indivíduo. A distribuição dos haplogrupos mitocondriais foi semelhante entre os grupos e est á resumida na Tabela 8. Os resultados mostraram que das 92 pacientes do grupo controle , 48,9% pertenciam a haplogrupos africanos, 30,4% a haplogrupos ameríndios, 19,6% europeus e 1,1% asiáticos. No grupo endometriose, a maioria das pacientes apresentou haplogrupo africano (40,0%), seguidas do ameríndio (33,3%), europeu (21,1%) e asiático (5,6%). Marina de Paula Andres RESULTADOS 48 Tabela 8 - Distribuição e análise estatística dos haplogrupos mitocondriais nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) Haplogrupo Grupo, n(%) Total p* CT (n=92) EDT (n=90) Africano 45 (48,9) 36 (40) 81 (44,5) 0,263 Ameríndio 28 (30,4) 30 (33,3) 58 (31,9) Europeu 18 (19,6) 19 (21,1) 37 (20,3) Asiático 1 (1,1) 5 (5,6) 6 (3,3) *Teste da razão de verossimilhanças . A distribuição dos subhaplogrupos mitocondriais foi semelhante entre os grupos endometriose e controle ( Apêndice C). No grupo endometriose, não houve diferença nos haplogrupos entre os estádios da ASRM e os tipos de lesão (Tabela 9). Na avaliação do grupo controle, a distribuição também foi semelhante por tipo de doença tratada ou laqueadura tubária (Tabela 10). Tabela 9 - Distribuição dos h aplogrupos mitocondriais por estádio e tipo de lesão no grupo endometriose Variável Haplogrupo, n(%) Total (n=90) p* Africano (n=36) Ameríndio (n=30) Europeu (n=19) Asiático (n=5) Estádio ASRM I - II 6 (16,7) 4 (13,3) 7 (36,8) 1 (20) 18 (20) 0,255 III - IV 30 (83,3) 26 (86,7) 12 (63,2) 4 (80) 72 (80) Tipo EDT Superficial 5 (13,9) 5 (16,7) 6 (31,6) 1 (20) 17 (18,9) Ovariana 1 (2,8) 0 (0) 1 (5,3) 1 (20) 3 (3,3) 0,310 Profunda 30 (83,3) 25 (83,3) 12 (63,2) 3 (60) 70 (77,8) ASRM: American Society for Reproductive M edicine; EDT: endometriose; *Teste da razão de verossimilhanças. Marina de Paula Andres RESULTADOS 49 Tabela 10 - Distribuição dos haplogrupos mitocondriais por subgrupo no grupo controle Diagnóstico Haplogrupo, n(%) Total (n=92) p* Africano (n=45) Ameríndio (n=28) Europeu (n=18) Asiático (n=1) Laqueadura 15 (33,3) 6 (21,4) 8 (44,4) 1 (100) 30 (32,6) 0,375 Mioma 23 (51,1) 14 (50) 7 (38,9) 0 (0) 44 (47,8) Teratoma 5 (11,1) 6 (21,4) 2 (11,1) 0 (0) 13 (14,1) Cistoadenoma 2 (4,4) 0 (0) 1 (5,6) 0 (0) 3 (3,3) Hidrossalpinge 0 (0) 2 (7,1) 0 (0) 0 (0) 2 (2,2) *Teste da razão de verossimilhanças . 5. DISCUSSÃO Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 51 5. DISCUSSÃO Endometriose é uma doença ginecológica benigna, caracterizada por sintomas dolorosos intensos, relacionados ao período menstrual (49). Há evidências crescentes de que o estresse oxidativo está envolvido na sua patogênese (11; 12). Dessa forma, os polimorfismos na região controladora do mtDNA podem levar à alteração na replicação e transcrição dos genes mitocondriais, afetando a função mitocondrial e a geração intracelular de espécies reativas de oxigênio (12). Estudos recentes sugerem que os polimorfismos do mtDNA estão relacionados à endometriose (17; 36; 37). No presente trabalho realizamos o sequenciamento e a identificação dos polimorfismos e haplogrupos da regiã o controladora do mtDNA em mulheres com e sem endometriose. Dados clínicos e epidemiológicos Em nosso estudo, incluímos pacientes com endometriose confirmada histologicamente e, em aproximadamente 70% dos casos , o acometimento era do tipo profundo, sendo 70% estádios III-IV da ASRM (2). Os sintomas foram prevalentes e acometeram a maioria das pacientes com endometriose incluídas, sendo a dismenorreia o mais importante deles, afetando 73,3% das mulheres, com intensidade classificada como severa em 62,2% dos casos. Todos os sintomas dolorosos tipicamente relacionados à endometriose foram mais prevalentes no grupo EDT em comparação ao grupo controle (4). Alguns autores, de forma concordante com nosso trabalho, já demonstraram a correlação da presença e intensidade dos sintomas com a doença, podendo chegar a uma p revalência de 62,9% de dismenorreia nas pacientes com endometriose profunda (4; 50; 51). Em casais inférteis, 54% podem apresentar endometriose e, entre mulheres com endometriose, a prevalência de infertilidade é de aproximadamente 35% (1; 52; 53). Esses resultados são comparáveis aos obtidos em nossa amostra, na qual o grupo endometriose apresentou maior frequência de infertilidade conjugal (25,8% vs. 5,5%) e número de gestações menor (1,1 ± 1,4 vs. 2,0 ± 1,7 gestações) em comparação ao grupo controle. Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 52 O tratamento dos sintomas da endometriose baseia -se no bloqueio ovulatório com o uso de contraceptivos hormonais, buscando, assim, a supressão hormonal dos focos de doença e diminuição da inflamação local (54). O principal objetivo desse tratamento é a melhora da qualidade de vida, relacionada à melhora do quadro clínico, estabilização da lesão e diminuição da taxa de recorrência da doença. O contraceptivo hormonal é a primeira linha n o tratamento dos sintomas dolorosos relacionados à endometriose, tem baixo custo e é de fácil acesso, além de promover o planejamento familiar (49). Dessa forma, é esperada uma alta prevalência do uso de tratamento hormonal nas pacientes com endometriose que, em nossa casuística, foi observado em quase metade das pacientes com a doença. Quanto ao grupo controle, este foi representado em 48% por mulheres portadoras de mioma uterino e 50% por laqueadura tubária ou cistoadenoma de ovário. Os miomas são os tumores ginecológicos mais frequentes em mulheres em idade reprodutiva e podem acometer até 77% das mulheres (55). Dentre os fatores de risco no seu desenvolvimento est ão etnia, idade e obesidade (55). Tipicamente, esses tumores são hormônio-dependentes, surgindo durante o período reprodutivo. Estudos GWAS (genome-wide association studies ) demonstraram que genes nucleares estão associados aos miomas uterinos; porém, até o presente momento, nenhum polimorfismo ou alteração na expressão do mtDNA foi identificado (55). Pejić et al. (56), em 2009, compararam o stress oxidativo em amostras de endométrio de pacientes com miomas uterinos, pólipos endometriais, hiperplasia de endométrio e câncer endometrial . Os resultados mostraram que os miomas uterinos têm atividade oxidativa diminuída e atividade anti-oxidativa aumentada em relação às doenças pré-malignas e malignas (56). De forma inversa, estudo de Ota H et al. (57), mostrou que a atividade da enzima catalase é aumentada no endométrio tópico e nas lesões de pacientes com endometriose e adenomiose, mostrando um aumento da atividade oxidativa. Dessa forma, tendo como limitação o número de pacientes submetidas a laqueadura tubária em nosso serviço, o fato de que não há evidência de que os miomas uterinos estão relacionados ao stress oxidativo e baseado na análise por subgrupo do grupo controle, que não demonstrou diferença significativa na frequência de Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 53 polimorfismos e haplogrupos mitocondriais (Tabela 10), a inclusão de pacientes submetidas à cirurgia por leiomioma uterino no grupo controle parece se justificar. Polimorfismos do DNA mitocondrial Os polimorfismos mitocondriais herdados, como aqueles que definem os haplogrupos mitocondriais, podem afetar diretamente o metabolismo oxidativo intracelular e a susceptibilidade a doenças (58). Em nosso estudo, encontramos diferença significativa entre as mulheres com e sem endometriose e a presença dos polimorfismos T146C, G185A, T236C, G499A, 573.2C e T16.217C, os quais serão detalhados a seguir. Posição 146 O polimorfismo T146C é característico do haplogrupo mitocondrial africano L2 e foi observado em maior frequência no grupo controle (32,6%), em comparação ao grupo endometriose (18,9%; p = 0,042). Govatati et al., em 2013 (1), reportaram frequência também maior no grupo controle (22.7%) em comparação ao grupo endometriose (15.8% ), porém sem diferença estatisticamente significante. Alguns estudos já relacionaram a presença desse polimorfismo como fator de risco independente em algumas neoplasias , como linfoma não-Hodking e carcinoma hepatocelular (59-61). No entanto, no que concerne doenças ginecológicas, esse é o primeiro relato da literatura. Apesar de ser considerada uma doença benigna, a endometriose muitas vezes tem um comportamento semelhante aos tumores malignos, como invasão e destruição de tecidos, disseminação linfo-hemática e implantação à distância (62). Além disso, as lesões de endometriose podem ter expressão desregulada de genes como o Connective Tissue Growth Factor, p53 e MYC, os quais já foram descritos em vias de sinalização do câncer, atuando na adesão celular, facilitação de metástases e contribuição ao processo de malignização das células (63). Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 54 Posição 185 O polimorfismo G185A foi observado em nossa amostra em 6 (6,7%) mulheres com endometriose e nenhuma paciente d o grupo controle (p = 0,01). De forma semelhante, Govatati et al . (17) reportaram uma baixa frequência desse polimorfismo, identificado em apenas 0,6% das pacientes com endometriose (1/152) e nenhuma do grupo controle (0/150). O polimorfismo G185A pertence aos haplogrupos J1b1a1d e J1C. O haplogrupo J é identificado em aproximadamente 12% das populações nativas da Europa, sendo o subhaplogrupo J1 o mais frequente, em torno de 80%, e espalhado uniformemente por todo o continente europeu (64). O polimorfismo G185A não foi associado a nenhuma doença até o presente momento, no entanto, o haplogrupo mitocondrial J1 já foi relacionado com o aumento de 2,4 vezes na incidência de diabetes melito tipo 2 e com o au mento da penetrância da Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (65; 66). Posição 236 O polimorfismo T236C foi observado apenas em mulheres com endometriose em nosso estudo ( n = 5, 5,6%; p = 0,028). Esse polimorfismo é característico do haplogrupo mitocondrial L0 e já foi associado à Síndrome de Leigh, caracterizada pela deficiência isolada do Complexo I da cadeia respiratória mitocondrial (67). Não há dados na literatura que correlacionem esse polimorfismo com endometriose ou outras doenças ginecológicas até o presente momento. Posição 499 A troca de G por A na posição 499 esteve significativamente associada à presença de endometriose em noss o trabalho (13,3% versus 4,3%; p = 0,03). Esse polimorfismo é característico do haplogrupo mitocondrial U4, concentrado principalmente nas populações europeias. Embora o polimorfismo G499A não tenha sido descrito em nenhuma doença até o momento, o haplogru po U4 foi relacionado com maior proteçã o contra acidente vascular cerebral (68) e diminuição da velocidade de progressão d a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (69). Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 55 Posição 573 Em nossa amostra, observamos frequência menor da inserção de duas citosinas na posição 573 (573.2C) em mulheres com endometriose em relação ao grupo controle (5,6% vs. 29,3%; p <0,001). Nessa posição, tipicamente pode ocorrer a heteroplasmia de comprimento, definida pela co existência de pelo menos duas populações de moléculas de mtDNA em um extrato de DNA que diferem no número de nucleotídeos e, portanto, no s eu comprimento (23). Em geral, as heteroplasmias são observadas em trechos homopoliméricos que ocorrem em grande frequência entre as posições 16,024–16,365, 73–340 e 438– 574 (23). A relevância biológica das heteroplasmias ainda não é completamente compreendida. Sabe-se que os tecidos de um mesmo indivíduo podem apresentar diferentes heteroplasmias de comprimento, o que poderia determinar diferentes fenótipos. Além disso, o acúmulo de heteroplasmias ao longo das gerações pode levar ao aparecimento de determinadas doenças, como miopatia mitocondrial ácido lática e episódios semelhantes a ac idente vascular cerebral, síndrome de Kearns–Sayre e epilepsia mioclônica com fibras rotas vermelhas (70). Futuramente, a avaliação destas heteroplasmias em amostras de endométrio tópico e ectópic o poderá trazer novas informações para a patogênese da endometriose. Posição 16217 O polimorfismo T16.217C pertencente ao haplogrupo B4 , característico do sul da Ásia, foi observado em frequência maior no grupo endometriose (14,4%) em comparação ao controle (5,4%; p = 0,049). Em estudo de 2013, com população coreana (17), este mesmo polimorfismo foi observado em frequência menor que a nossa: 1,9% das pacientes com endometriose e 0,7% daquelas sem a doença, sem diferença significante entre os grupos. Outras doenças relacionadas ao stress oxidativo, como diabetes melito , também já foram relacionadas à presença do T16.217C (71). Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 56 Posição 10.018 Observamos uma duplicação de 15 pb potencialmente patogênica na região HV1 do mtDNA, entre os nucleotídeos 16.018 e 16.032, em uma paciente do grupo controle com teratoma ovariano maduro. Essa duplicação engloba parte do gene mitochondrially encoded tRNA proline (MT-TP gene), que é compreendido entre as posições 15.955 e 16.023 do mtDNA e que codifica o MT-TP, um RNA pequeno, não codificador, de 68 nucleotídeos (19; 26). Outras mutações nesse gene já foram reportadas em pacientes com e pilepsia mioclônica com fibras rotas vermelhas (72), retinose pigmentar (73), surdez (73), miopatias (74) e cardiomiopatia dilatada (26). As duplicações mitocondriais acometem principalmente a região controladora (D-loop). A mais comum é uma duplicação de 260 pb entre os nucleotídeos 308 e 567, reportada em pacientes com miopatia mitocondrial (75). Duplicações já foram relatadas também em pacientes com diferentes tipos de câncer, dentre eles gástrico, mamário, hepatocelular, cólon e pulmonar (76), além de oftalmoplegia crônica progressiva externa (77; 78), síndrome de Kearns- Sayre (79) e síndrome de Pearson (80). Os teratomas são tumores nos quais estão presentes os tipos celulares representativos das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme) e são as neoplasia ovarianas benignas mais comuns, com incidência de 20 a 25% (81; 82). Além disso, a capacidade de formação de teratomas representa um marcador da pluripotência no estudo de indução da formação de células tronco pluripotentes (iPSCs), que são derivadas de células adultas somáticas (83; 84). As iPSCs são semelhantes às células -tronco pluripotentes naturais em muitos aspectos, tais como a expressão de genes e proteínas, padrões de metilação da cromatina e tempo de duplicação (85). Existem poucos estudos sobre o papel do metabolismo mitocondrial n o mecanismo biológico das células-tronco e estes demonstraram que aquelas células que apresentam baixa taxa de consumo de oxigênio a nível mitocondrial tem uma capacidade reduzida de formar teratomas (85; 86). A duplicação encontrada em nosso trabalho é inédita em pacientes com teratoma ovariano. Outrossim, já foi relatada previamente por nosso grupo em um indivíduo com cardiomiopatia dilatada (26). Ambos indivíduos foram Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 57 classificados como pertencentes ao haplogroupo L1c2, de forma que a duplicação pode tratar-se de uma mutação rara por efeito fundador comum aos dois pacientes. Posições 189, 310 e 16.189 No presente estudo não encontramos associação entre endometriose e os polimorfismos T16.189C, A189G e 310C, previamente reportada nas populações coreana e indiana (17; 36). A frequência do polimorfismo A189G em nossa amostra foi de 13,3% no grupo endometriose, enquanto na população indiana, essa frequência chegou a 41% de mulheres com a doença (17). No grupo sem endometriose, a frequência que observamos do A189G foi de 12,0%, pouco menor do que a reportada por outros autores, de 17% (17). A inserção de uma citosina na posição 310 (310C) foi observada no nosso estudo em 53,3% das pacientes incluídas com endometriose e 47,8% daquelas sem endometriose, sem diferença estatisticamente significante. Essa frequência foi diferente daquela reportada por Govatati et al., em 2013, que observaram maior prevalência desse polimorfismo em pacientes com a doença ( 33,5% vs. 22,7%; p<0,05) (17) A substituição do nucleotídeo T pelo C na posição 16.189 não esteve associada a presença de endometriose em nossa casuística, resultado oposto daquele encontrado por outros autores (17; 36). A frequência desse polimorfismo em nossa amostra de mulheres com endometriose foi de 43,3%, semelhante à reportada na população coreana (45,9%), porém maior que a reportada na população indiana (27,0%). Por outro lado, nas mulheres sem endometriose, encontramos frequência de 37,0%, superior à reportada em ambos os estudos (34,7% e 11,3%, respectivamente) (17; 36). Haplogrupos mitocondriais A ancestralidade mitocondrial é diretamente relacionada com o proc esso de migração das populações, de forma que se observa uma distribuição não homogênea nas diferentes regiões do Brasil, fruto do processo de colonização. Na região Nordeste predomina a ancestralidade mitocondrial africana, resultado Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 58 da imigração dos escravos africanos; na região Norte, predomina a ancestralidade ameríndia, proveniente da ocupação dos povos indígenas sul- americanos; enquanto na s regiões Sul e Sudeste predomina a ancestralidade europeia, proveniente dos colonos europeus (87-89). Em nosso trabalho, observamos maior prevalência do haplogrupo mitocondrial africano (44,5%), seguido do ameríndio (31,9%), europeu (20,3%) e asiático (3,3%). Essa proporção foi semelhante à relatada por outros autores em indivíduos brasileiros do estado de São Paulo (90-92). Não encontramos associação significativa de nenhuma das ancestralidades ou haplogrupos mitocondriais com a presença de endometriose, estádio da ASRM ou por subtipo da doença (superficial, ovariana ou profunda). Esse resultado foi diferente do de Govatati et al., em população indiana, que encontraram uma frequência maior dos haplogrupos mitocondriais M5 e N em mulheres com endometriose em relação aos controles (37; 41). O haplogrupo M5 é específico do sul asiático e não foi observado em nenhuma paciente em nossa amostra, enq uanto o haplogrupo N é derivado do haplogrupo L3, distribuído pelo norte da África, Eurásia e Oceania, e foi observado em apenas 6 pacientes (3,2%) em nossa casuística (93; 94). Considerações finais O presente estudo avaliou de forma inédita da associação dos polimorfismos e haplogrupos da região controladora do mtDNA com endometriose no Brasil. As limitações deste trabalho encontram-se principalmente na heterogeneidade do subgrupo das pacientes incluídas que, por serem recrutadas em um hospital terciário, no grupo endometriose incluíram em sua maioria doenças do tipo profundo e estádios avançados e, no grupo controle, incluiu doenças do trato genital feminino, como mioma uterino e teratoma ovariano em aproximadamente metade dos casos. Os resultados encontrados mostraram associação de determinados polimorfismos do mtDNA com a presença de endometriose em mulheres brasileiras que diferiram, porém, de estudos realizados previamente em populações homogêneas da Coreia e Índia. Vale ressaltar, que estudos genéticos na população brasileira são particularmente desafiadores, uma vez Marina de Paula Andres DISCUSSÃO 59 que esta possui múltiplas ancestralidades e alta miscigenação. Tais resultados díspares suscitam a questão de fisiopatologias diferentes, multifatoriais, concorrendo para uma via final comum, a endometriose. Ademias, tendo em vista que até o presente momento poucos estudos foram conduzidos nessa temática e que a frequência das mutacões do mtDNA são específicas para cada região geográfica, para a generalização dos resultados, faz-se necessária a avaliação do mtDNA em mulheres com endometriose em diferentes populações e regiões do Brasil e do mundo. Não obstante, na era da medicina de precisão, caracterizada pelo uso de análises genômicas par a o desenvolvimento de diagnósticos e tratamentos direcionados para cada paciente, estudos em pesquisa básica são fundamentais não apenas para aprofundar nosso entendimento sobre a fisiopatologia de doenças complexas, como também para servir de fundamento para novos potencias alvos terapêuticos, dando a esperança aos nossos pacientes de sempre melhorar e direcionar seus cuidados, especialmente para uma doenç a prevalente e debilitante como a endometriose. 6. CONCLUSÕES Marina de Paula Andres CONCLUSÃO 61 6. CONCLUSÕES Os polimorfismos G185A, T236C, G499A e T16217C da região controladora do DNA mitocondrial foram associados com a presença de endometriose em amostra de mulheres brasileiras, enquanto o s polimorfismos T146C e 573.2C foram associados com a ausência da doença. Não houve diferença significativa entre a ancestralidade ou haplogrupos mitocondriais e a presença, estádio da ASRM ou tipo de endometriose. REFERÊNCIAS Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 63 REFERÊNCIAS* 1. von Theobald P, Cottenet J, Iacobelli S, Quantin C. Epidemiology of Endometriosis in France: A Large, Nation -Wide Study Based on Hospital Discharge Data. Biomed Res Int. 2016;2016:3260952. 2. Revised American Society for Reproductive Medicine classificati on of endometriosis (1996). Fertil Steril. 1997; 67(5):817-21. 3. Nisolle M, Donnez J. Peritoneal endometriosis, ovarian endometriosis, and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entities. Fertil Steril. 1997; 68(4):585-96. 4. Bellelis P, Dias JA Jr, Podgaec S, Gonzales M, Baracat EC, Abrão MS. Epidemiological and clinical aspects of pelvic endometriosis: a case series. Rev Assoc Med Bras. 2010; 56(4):467-71. 5. Halis G, Mechsner S, Ebert AD. The diagnosis and treatment of deep infiltrating endometriosis. Dtsch Arztebl Int. 2010;107(25):446-55. 6. Sampson JA. Peritoneal endometriosis due to menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity. Am J Obstet Gynecol 1927; 14:422- 69. 7. Podgaec S, Dias Junior JA, Chapron C, Oliveira RM, Baracat EC, Abrão MS. Th1 and Th2 immune responses related to pelvic endometriosis. Rev Assoc Med Bras. 2010; 56(1):92-8. 8. Podgaec S, Rizzo LV, Fernandes LF, Baracat EC, Abrao MS. CD4(+) CD25(high) Foxp3(+) cells increased in the peritoneal fluid of patients with endometriosis. Am J Reprod Immunol. 2012; 68(4):301-8. *De acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT NBR 6023). Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 64 9. Fairbanks F, Abrão MS, Podgaec S, Dias JA Jr, de Oliveira RM, Rizzo LV. Interleukin-12 but not interleukin-18 is associated with severe endometriosis. Fertil Steril. 2009; 91(2):320-4. 10. Kobayashi H, Imanaka S, Nakamura H, Tsuji A. Understanding the role of epigenomic, genomic and genetic alterations in the development of endometriosis (review). Mol Med Rep. 2014; 9(5):1483-505. 11. Turkyilmaz E, Yildirim M, Cendek BD, Baran P, Alisik M, Dalgaci F, et al. Evaluation of oxidative stress markers and intra-extracellular antioxidant activities in patients with endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2016;199:164- 8. 12. Szczepańska M, Koźlik J, Skrzypczak J, Mikołajczyk M. Oxidative stress may be a piece in the endometriosis puzzle. Fertil Steril. 2003; 79(6):1288-93. 13. Wallace DC. Mitochondrial DNA variation in human radiation and disease. Cell. 2015;163(1):33-8. 14. Srinivasan S, Guha M, Kashina A, Avadh ani NG. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochim Biophys Acta. 2017 Jan 16. pii: S0005-2728(17)30005-1. 15. Ferreira M, Aguiar T, Vilarinho L. Cadeia Respiratória Mitocondrial. Aspectos Clínicos, Bioquímicos, Enzimáticos e Moleculares Associados ao Défice do Complexo I. Arq Med. 2008;22(2/3):49-56. 16. Clayton DA. Transcription and replication of mitochondrial DNA. Hum Reprod. 2000;15(2):11-7. 17. Govatati S, Deenadayal M, Shivaji S, Bhanoori M. Mitochondrial displacement loop alterations are associated with endometriosis. Fertil Steril. 2013 ;99(7):1980-6. 18. Lee HR, Johnson KA. Fidelity of the human mitochondrial DNA polymerase. J Biol Chem. 2006; 81(47):36236-40. 19. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 1981; 290(5806):457-65. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 65 20. White DJ, Wolff JN, Pierson M, Gemmell NJ. Revealing the hidden complexities of mtDNA inheritance. Mol Ecol. 2008; 17(23):4925-42. 21. Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet. 1999; 23(2):147. 22. Jin L, Su B. Natives or immigrants: modern hu man origin in east Asia. Nat Rev Genet. 2000;1(2):126-33. 23. Stewart JB, Chinnery PF. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nat Rev Genet. 2015; 16(9):530-42. 24. Brandon MC, Lott MT, Nguyen KC, Spolim S, Navathe SB, Baldi P, Wallace DC. MITOMAP: a human mitochondrial genome database (2004). Nucleic Acids Res. 2005; 33:D611-3. 25. Montiei-Sosa F, Ruiz-Pesini E, Enríquez JA, Marcuello A, Díez -Sánchez C, Montoya J, Wallace DC, López-Pérez MJ. Differences of sperm motility in mitochondrial DNA haplogroup U sublineages. Gene. 2006; 368:21–27. 26. Cardena MM, Mansur AJ, Pereira Ada C, Fridman C. A new duplication in the mitochondrially encoded tRNA proline gene in a patient with dilated cardiomyopathy. Mitochondrial DNA. 2013; 24(1):46-9. 27. Behar DM, Villems R, Soodyall H, Blue-Smith J, Pereira L, Metspalu E, et al. The dawn of human matrilineal diversity. Am J Hum Genet. 2008; 82(5):1130-40. 28. Aral C, Akkiprik M, Caglayan S, Atabey Z, Ozişik G, Bekiroglu N, et al. Investigation of relationship of the mitochondrial DNA 16189 T>C polymorphism with metabolic syndrome and its associated clinical parameters in Turkish patients. Hormones (Athens). 2011; 10(4):298-303. 29. Maggrah A, Robinson K, Creed J, Wittock R, Gehman K, Gehman T, et al. Paired ductal carcinoma in situ and invasive breast cancer lesions in the D -loop of the mitochondrial genome indicate a cancerization field effect. Biomed Res Int. 2013;2013:379438. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 66 30. Tang DL, Zhou X, Li X, Zhao L, Liu F. Variation of mitochondrial gene and the association with type 2 diabetes mellitus in a Chinese population. Diabetes Res Clin Pract. 2006; 73(1):77-82. 31. Holland MM, Parsons TJ. Mitochondrial DNA sequence analysis -validation and use for forensic casework. Forensic Sci Ver. 1999;11:21-50. 32. Stefano GB, Kream RM. Mitochondrial DNA heteroplasmy in human health and disease. Biomed Rep. 2016;4(3):259-262. 33. Krjutškov K, Koltšina M, Grand K, Võsa U, Sauk M, Tõnisson N, Salumets A. Tissue-specific mitochondrial heteroplasmy at position 16,093 within the same individual. Curr Genet. 2014 Feb;60(1):11-6. 34. Chung U, Lee HY, Yoo JE, Park MJ, Shin KJ. Mitochondrial DNA CA dinucleotide repeats in Koreans: the presence of length heteroplasmy. Int J Legal Med. 2005;119(1):50-3. 35. Shen J, Wan J, Song R, Zhao H. Length heteroplasmies in human mitochondrial DNA control regions and breast cancer risk. Carcinogenesis. 2015;36(11):1307-13. 36. Cho S, Lee YM, Choi YS, Yang HI, Jeon YE, Lee KE, et al. Mitochondria DNA polymorphisms are associated with susceptibility to endometriosis. DNA Cell Biol. 2012; 31(3):317-22. 37. Govatati S, Tipirisetti NR, Perugu S, Kodati VL, Deenadayal M, Satti V, et al. Mitochondrial genome variati ons in advanced stage endometriosis: a study in South Indian population. PLoS One. 2012;7(7):e40668. 38. Wang Y, Liu VW, Tsang PC, Chiu PM, Cheung AN, Khoo US, et al . Microsatellite instability in mitochondrial genome of common female cancers. Int J Gynecol Cancer. 2006; 16(1):259-66. 39. Kao SH, Huang HC, Hsieh RH, Chen SC, Tsai MC, Tzeng CR. Oxidative damage and mitochondrial DNA mutations with endometriosis. Ann N Y Acad Sci. 2005; 1042:186-94. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 67 40. Shu J, Xing L, Ding G, Luo Q, Liu X, Yan Q, Sheng J, Huang H. The effect of peritoneal fluid from patients with endometriosis on mitochondrial function and development of early mouse embryos. PLoS One. 2013; 8(12):e82334. 41. Govatati S, Deenadayal M, Shivaji S, Bhanoori M. Mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase alterations are associated with endometriosis. Mitochondrion. 2013;13(6):782-90. 42. Mueller EE, Eder W, Ebner S, Schwaiger E, Santic D, Kreindl T, et al. The mitochondrial T16189C polymorphism is associated with coronary artery disease in Middle European populations. PLoS One. 2011; 6(1):e16455. 43. Kirkwood BR, Sterne JAC. Essential medical statistics. 2nd ed. Blackwell Science: Massachusetts, USA, 2006;502. 44. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988; 16(3):1215. 45. Bandelt HJ, Parson W. Consistent treatment of length variants in the human mtDNA control region: a reappraisal. Int J Legal Med. 2008; 122(1):11-21 йил. 46. Salas A, Carracedo A, Macaulay V, Richards M, Bandelt HJ. A practical guide to mitochondrial DNA error prevention in clinical, forensic, and population genetics. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 335(3):891-9. 47. Wilson MR, Allard MW, Monson K, Miller KW, Budowle B. Recommendations for consistent treatment of length variants in the human mitochondrial DNA control region. Forensic Sci Int. 2002; 129(1):35-42. 48. van Oven M, Kayser M. Updated comprehensive phylogenetic tree of global human mitochondrial DNA variation. Hum Mutat. 2009; 30(2):E386-94. 49. Dunselman GA, Vermeulen N, Becker C, Calhaz -Jorge C, D'Hooghe T, De Bie B, et al . ESHRE guideline: management of women with endometriosis. (European Society of Human Reproduction and Embryology). Hum Reprod. 2014; 29(3):400-12. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 68 50. Dai Y, Leng JH, Lang JH, Li XY, Zhang JJ. Anatomical distribution of pelvic deep infiltrating endometriosis and its relationship with pain symptoms. Chin Med J (Engl). 2012; 125(2):209-13. 51. Seracchioli R, Mabrouk M, Guerrini M, Manuzzi L, Savelli L, Frascà C, et al. Dyschezia and posterior deep infiltrating endometriosis: analysis of 360 cases. J Minim Invasive Gynecol. 2008;15(6):695-9. 52. de Oliveira R, Adami F, Mafra FA, Bianco B, Vilarino FL, Barbosa CP. Causes of endometriosis and prevalent infertility in patients undergoing laparoscopy without achieving pregnancy. Minerva Ginecol. 2016; 68(3):250-8. 53. Santulli P, Lamau MC2, Marcellin L, Gayet V, Marzouk P, Borghese B, et al. Endometriosis-related infertility: ovarian endometrioma per se is not associated with presentation for infertility. Hum Reprod. 2016; 31(8):1765-75. 54. Vercellini P, Frontino G, Pietropaolo G, Gattei U, Daguati R, Crosignani PG. Deep endometriosis: definition, pathogenesis, and clinical management. J Am Assoc Gynecol Laparosc. 2004;11(2):153-61. 55. Sparic R, Mirkovic L, Malvasi A, Tinelli A. Epidemiology of Uterine Myomas: A Review. Int J Fertil Steril. 2016; 9(4):424-35. 56. Pejić S, Todorović A, Stojiljković V, Kasapović J, Pajović SB. Antioxidant enzymes and lipid peroxidation in endometrium of patients with polyps, myoma, hyperplasia and adenocarcinoma. Reprod Biol Endocrinol. 2009; 7:149. 57. Ota H, Igarashi S, Sato N, Tanaka H, Tanaka T. Involvement of catalase in the endometrium of patients with endometriosis and adenomyosis. Fertil Steril. 2002; 78(4):804-9. 58. Gómez-Durán A, Pacheu-Grau D, Martínez-Romero I, López-Gallardo E, López-Pérez MJ, Montoya J, Ruiz-Pesini E. Oxidative phosphorylation differences between mitochondrial DNA haplogroups modify the risk of Leber's hereditary optic neuropathy. Biochim Biophys Acta. 2012; 1822(8):1216-22. 59. DiMauro S. Mitochondrial diseases. Biochim Biophys Acta. 2004; 1658(1- 2):80-8. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 69 60. Blakely EL, Yarham JW, Alston CL, Craig K, Poulton J, Brierley C, et al . Pathogenic mitochondrial tRNA point mutations: nine novel mutations affirm their importance as a cause of mitochondrial disease. Hum Mutat. 2013; 34(9):1260- 8. 61. Hardy SA, Blakely EL, Purvis AI, Rocha MC, Ahmed S, Falkous G, et al. Pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial myopathy: The need for muscle biopsy. Neurol Genet. 2016; 2(4):e82. 62. Brockington M, Sweeney MG, Hammans SR, Morgan-Hughes JA, Harding AE. A tandem duplication in the D -loop of human mitochondrial DNA is associated with deletions in mitochondrial myopathies. Nat Genet. 1993; 4(1):67- 71. 63. Hung WY, Lin JC, Lee LM, Wu CW, Tseng LM, Yin PH, et al . Tandem duplication/triplication correlated with poly -cytosine stretch variation in human mitochondrial DNA D-loop region. Mutagenesis. 2008; 23(2):137-42. 64. Van Goethem G, Luoma P, Rantamäki M, Al Memar A, Kaakkola S, Hackman P, et al . POLG mutations in neurodegenerat ive disorders with ataxia but no muscle involvement. Neurology. 2004; 63(7):1251-7. 65. Van Goethem G, Dermaut B, Löfgren A, Martin JJ, Van Broeckhoven C. Mutation of POLG is associated with progressive external ophthalmoplegia characterized by mtDNA deletions. Nat Genet. 2001; 28(3):211-2. 66. Kearns TP, Sayre GP. Retinitis pigmentosa, external ophthalmophegia, and complete heart block: unusual syndrome with histologic study in one of two cases. AMA Arch Ophthalmol. 1958; 60(2):280-9. 67. Damas J, Samuels DC, Carneiro J, Amorim A, Pereira F. Mitochondrial DNA rearrangements in health and disease --a comprehensive study. Hum Mutat. 2014; 35(1):1-14. 68. Tandon A, Gulleria K, Gupta S, Goel S, Bhargava SK, Vaid NB. Mature ovarian dermoid cyst invading the urinary bladder. Ultrasound Obstet Gynecol. 2010; 35(6):751-3. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 70 69. Kakuda M, Matsuzaki S, Kobayashi E, Yoshino K, Morii E, Kimura T. A Case of Extragonadal Teratoma in the Pouch of Douglas and Literature Review. J Minim Invasive Gynecol. 2015; 22(7):1311-7. 70. Bustamante-Marín X, Garness JA, Capel B. Testicular teratomas: an intersection of pluripotency, differentiation and cancer biology. Int J Dev Biol. 2013;57(2-4):201-10. 71. Wang XM, Yik WY, Zhang P, Lu W, Huang N, Kim BR, et al. Induced pluripotent stem cell models of Zellweger spectrum disorder show impaired peroxisome assembly and cell type-specific lipid abnormalities. Stem Cell Res Ther. 2015; 6:158. 72. Schieke SM, Ma M, Cao L, McCoy JP, Liu C, Hensel NF, et al. Mitochondrial metabolism modulates differentiation and teratoma formation capacity in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 2008; 283(42):28506-12. 73. Wang C, Zhang F, Fan H, P eng L, Zhang R, Liu S, Guo Z. Sequence polymorphisms of mitochondrial D -loop and hepatocellular carcinoma outcome. Biochem Biophys Res Commun. 2011; 406(3):493-6. 74. Johnson DC, Shrestha S, Wiener HW, Makowsky R, Kurundkar A, Wilson CM, Aissani B. Mitochondrial DNA diversity in the African American population. Mitochondrial DNA. 2015;26(3):445-51. 75. Xu J, Guo Z, Bai Y, Zhang J, Cui L, Zhang H, Zhang S, Ai X. Single nucleotide polymorphisms in the D-loop region of mitochondrial DNA is associated with th e kidney survival time in chronic kidney disease patients. Ren Fail. 2015; 37(1):108- 12. 76. Bai Y, Guo Z, Xu J, Zhang J, Cui L, Zhang H, Zhang S, Ai X. Association of sequence polymorphism in the mitochondrial D-loop with chronic kidney disease. Ren Fail. 2014; 36(5):781-4. 77. Borrelli GM, Abrão MS, Taube ET, Darb-Esfahani S, Köhler C, Chiantera V, et al . (Partial) Loss of BAF250a (ARID1A) in rectovaginal deep -infiltrating endometriosis, endometriomas and involved pelvic sentinel lymph nodes. Mol Hum Reprod. 2016; 22(5):329-37. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 71 78. Dentillo DB, Meola J, Ferriani RA, Rosa-E-Silva JC. Common Dysregulated Genes in Endometriosis and Malignancies. Rev Bras Ginecol Obstet. 2016; 38(5):253-62. 79. Quintana-Murci L, Chaix R, Wells RS, Behar DM, Sayar H, Scozzari R, et al. Where west meets east: the complex mtDNA landscape of the southwest and Central Asian corridor. Am J Hum Genet. 2004; 74(5):827-45. 80. Feder J, Ovadia O, Blech I, Cohen J, Wainstein J, Harman-Boehm I, et al. Parental diabetes status reveals association of mitochondrial DNA haplogroup J1 with type 2 diabetes. BMC Med Genet. 2009;10:60. 81. Khan NA, Govindaraj P, Soumittra N, Srilekha S, Ambika S, Vanniarajan A, et al. Haplogroup heterogeneity of LHON patients carrying the m.14484T>C mutation in India. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013; 54(6):3999-4005. 82. Tuppen HA, Hogan VE, He L, Blakely EL, Worgan L, Al-Dosary M, et al. The p.M292T NDUFS2 mutation causes complex I -deficient Leigh syndrome in multiple families. Brain. 2010; 133(10):2952-63. 83. Rollins B, Martin MV, Sequeira PA, Moon EA, Morgan LZ, Watson SJ, et al. Mitochondrial variants in schizophrenia, bipolar disorder, and major depressive disorder. PLoS One. 2009;4(3):e4913. 84. Hendrickson SL, Hutcheson HB, Ruiz -Pesini E, Poole JC, Lautenberger J, Sezgin E, et al . Mitochondrial DNA Haplogroups influence AIDS Progression. AIDS. 2008; 22(18):2429-39. 85. Stewart JB, Chinnery PF. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nat Rev Genet. 2015;16(9):530-42. 86. Liou CW, Chen JB, Tiao MM, Weng SW, Huang TL, Chuang JH, et al. Mitochondrial DNA coding and control region variants as genetic risk factors for type 2 diabetes. Diabetes. 2012;61(10):2642-51. 87. Fridman C, Gonzalez RS, Pereira AC, Cardena MM. Haplotype diversity in mitochondrial DNA hypervariable region in a population of southeastern Brazil. Int J Legal Med. 2014; 128(4):589-93. Marina de Paula Andres REFERÊNCIAS 72 88. Silva WA, Bortolini MC, Schneider MP, Marrero A, Elion J, Krishnamoorthy R, et al. MtDNA haplogroup analysis of black Brazilian and sub -Saharan populations: implications for the Atlantic slave trade. Hum Biol. 2006; 78(1):29- 41. 89. Feio -Dos-Santos AC, Carvalho BM, Batista dos Santos SE, Ribeiro -dos- Santos AK. Nucleotide variability of HV-I in admixed population of the Brazilian Amazon Region. Forensic Sci Int. 2006; 164(2-3):276-7. 90. Cardena MM, Ribeiro-dos-Santos A, Santos S, Mansur AJ, Pereira AC, Fridman C. Amerindian genetic ancestry is associated with higher survival rates compared to African and European ancestry in Brazilian patients with heart failure. Int J Cardiol. 2014; 176(2):527-8. 91. Bernardo S, Hermida R, Desidério M, Silva DA, de Carvalho EF. MtDNA ancestry of Rio de Janeiro population, Brazil. Mol Biol Rep. 2014; 41(4):1945-50. 92. Paneto GG, Köhnemann S, Martins JA, Cicarelli RM, Pfeiffer H. A single multiplex PCR and SNaPshot minisequencing reac - tion of 42 SNPs to classify admixture populations into mitochondrial DNA haplogroups. Mitochondrion. 2011; 11(2):296-302. 93. Maji S, Krithika S, Vasulu TS. Distribution of Mitochondrial DNA Macrohaplogroup N in India with Special Reference to Haplogroup R and its Sub- Haplogroup U. Int J Hum Genet. 2008;8(1-2): 85-96. 94. Metspalu M, Kivisild T, Metspalu E, Parik J, Hudjashov G, Kaldma K, et al. Most of the extant mtDNA boundaries in south and southwest Asia were likely shaped during the initial settlement of Eurasia by anatomically modern humans. BMC Genet. 2004; 5:26. ANEXOS Marina de Paula Andres ANEXOS 74 ANEXOS ANEXO A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo controle) Marina de Paula Andres ANEXOS 75 Continuação do ANEXO A - Termo de Consentimento Livr e e Esclarecido (grupo controle) Marina de Paula Andres ANEXOS 76 Conclusão do ANEXO A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo controle) Marina de Paula Andres ANEXOS 77 ANEXO B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose) Marina de Paula Andres ANEXOS 78 Continuação do ANEXO B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose) Marina de Paula Andres ANEXOS 79 Conclusão do ANEXO B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose) Marina de Paula Andres ANEXOS 80 ANEXO C - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) Marina de Paula Andres ANEXOS 81 Conclusão do ANEXO C - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) Marina de Paula Andres ANEXOS 82 ANEXO D - Questionário para coleta de dados das pacientes incluídas no estudo Marina de Paula Andres ANEXOS 83 Conclusão do ANEXO D - Questionário para coleta de dados das pacientes incluídas no estudo Marina de Paula Andres ANEXOS 84 ANEXO E - Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive Medicine em 1996 (2). Estadiamento da endometriose ASRM (1996) ENDOMETRIOSE 3 cm PERITÔNIO Superficial 1 2 4 Profunda 2 4 6 OVÁRIO D Superficial 1 2 4 Profunda 4 16 20 OVÁRIO E Superficial 1 2 4 Profunda 4 16 20 OBLITERACAO DO FUNDO DE SACO POSTERIOR Parcial Completa 4 40 ADERÊNCIAS 2/3 Envolvidos OVÁRIO D Velamentosa 1 2 4 Densa 4 8 16 OVÁRIO E Velamentosa 1 2 4 Densa 4 8 16 TROMPA D Velamentosa 1 2 4 Densa 4* 8* 16 TROMPA E Velamentosa 1 2 4 Densa 4* 8* 16 Estádio I (mínima): 1 -5 Estádio II (leve): 6 -15 Estádio III (moderada): 16 -40 Estádio IV (severa): >40 *Se as fímbrias tubárias estiverem totalmente envolvidas por aderências, mude o escore para 16. Porcentagem de implantes: Lesões vermelhas (claras, vermelhas, rosadas, em chama, vesículas): ___% Lesões brancas (brancas, amareladas, marrons, defeitos de peritônio): ___% Lesões pretas (pretas, depósitos de hemossi derina, azuis): ___% Endometriose adicional : _________________________________________ Usar em caso de trompas e ovários normaisE D Usar em caso de trompas e ovários anormaisE D APÊNDICES Marina de Paula Andres APÊNDICES 86 APÊNDICES APÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 1. 16.031G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 2. 16.051G 3 (3,3) 4 (4,4) 7 (3,8) 0,719 3. 16.063C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 4. 16.067T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 5. 16.071T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 6. 16.073.1C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 7. 16.078T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 8. 16.086C 5 (5,4) 2 (2,2) 7 (3,8) 0,444 9. 16.087C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 10. 16.092C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 11. 16.093C 6 (6,5) 5 (5,6) 11 (6) >0,999 12. 16.097C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 13. 16.098G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 14. 16.104T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 15. 16.111T 11 (12) 4 (4,4) 15 (8,2) 0,104 16. 16.114A 3 (3,3) 1 (1,1) 4 (2,2) 0,621 17. 16.123A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 18. 16.124C 8 (8,7) 3 (3,3) 11 (6) 0,212 19. 16.126C 11 (12) 9 (10) 20 (11) 0,814 20. 16.129A 13 (14,1) 12 (13,3) 25 (13,7) >0,999 21. 16.129C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 22. 16.145A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 23. 16.148T 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 24. 16.153A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 25. 16.154C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 26. 16.162G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 27. 16.163G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 Marina de Paula Andres APÊNDICES 87 Continuação APÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 28. 16.168T 0 (0) 3 (3,3) 3 (1,6) 0,119 29. 16.171 DEL 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 30. 16.172C 6 (6,5) 10 (11,1) 16 (8,8) 0,306 31. 16.176T 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 32. 16.178C 1 (1,1) 3 (3,3) 4 (2,2) 0,365 33. 16.179T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 34. 16.182C 3 (3,3) 4 (4,4) 7 (3,8) 0,719 35. 18.182 DEL 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 36. 16.183C 10 (10,9) 16 (17,8) 26 (14,3) 0,208 37. 19183DEL 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 38. 16.184T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 39. 16.185T 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 40. 16.187T 14 (15,2) 10 (11,1) 24 (13,2) 0,512 41. 16.188T 14 (15,2) 10 (11,1) 24 (13,2) 0,512 42. 16.188G 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 43. 16.188 INS 1C 2 (2,2) 7 (7,8) 9 (4,9) 0,098 44. 16.188 INS 2C 24 (26,1) 22 (24,4) 46 (25,3) 0,865 45. 16.189C 34 (37) 39 (43,3) 73 (40,1) 0,450 46. 16.192T 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 47. 16.193T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 48. 16.197G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 49. 16.203G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 50. 16.207G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 51. 16.209C 4 (4,3) 2 (2,2) 6 (3,3) 0,682 52. 16.213A 5 (5,4) 1 (1,1) 6 (3,3) 0,211 53. 16.214T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 54. 16.215G 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 55. 16.217C 5 (5,4) 13 (14,4) 18 (9,9) 0,049 Marina de Paula Andres APÊNDICES 88 Continuação APÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 56. 16.218T 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 57. 16.221T 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 58. 16.223T 69 (75) 55 (61,1) 124 (68,1) 0,056 59. 16.224C 1 (1,1) 4 (4,4) 5 (2,7) 0,208 60. 16.230G 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 61. 16.234T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 62. 16.235G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 63. 16.239T 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 64. 16.241G 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 65. 16.245T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 66. 16.246T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 67. 16.248T 3 (3,3) 0 (0) 3 (1,6) 0,246 68. 16.249C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 69. 16.256T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 70. 16.260T 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 71. 16.261T 2 (2,2) 2 (2,2) 4 (2,2) >0,999 72. 16.262T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 73. 16.263C 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 74. 16.264T 5 (5,4) 3 (3,3) 8 (4,4) 0,721 75. 16.265C 3 (3,3) 3 (3,3) 6 (3,3) >0,999 76. 16.266T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 77. 16.270T 8 (8,7) 3 (3,3) 11 (6) 0,212 78. 16.271C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 79. 16.274A 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 80. 16.278T 30 (32,6) 26 (28,9) 56 (30,8) 0,632 81. 16.284G 3 (3,3) 0 (0) 3 (1,6) 0,246 82. 16.286A 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 83. 16.286G 3 (3,3) 1 (1,1) 4 (2,2) 0,621 Marina de Paula Andres APÊNDICES 89 Continuação APÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 84. 16.286T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 85. 16.287T 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 86. 16.288C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 87. 16.290T 12 (13) 8 (8,9) 20 (11) 0,479 88. 16.291T 3 (3,3) 4 (4,4) 7 (3,8) 0,719 89. 16.292T 4 (4,3) 4 (4,4) 8 (4,4) >0,999 90. 16.293G 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 91. 16.294T 21 (22,8) 15 (16,7) 36 (19,8) 0,354 92. 16.295T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 93. 16.296T 2 (2,2) 2 (2,2) 4 (2,2) >0,999 94. 16.298C 8 (8,7) 8 (8,9) 16 (8,8) >0,999 95. 16.301T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 96. 16.302G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 97. 16.304C 3 (3,3) 3 (3,3) 6 (3,3) >0,999 98. 16.305G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 99. 16.309G 7 (7,6) 8 (8,9) 15 (8,2) 0,793 100. 16.311C 21 (22,8) 17 (18,9) 38 (20,9) 0,586 101. 16.312G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 102. 16.316G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 103. 16.318T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 104. 16.319A 10 (10,9) 8 (8,9) 18 (9,9) 0,805 105. 16.320T 6 (6,5) 7 (7,8) 13 (7,1) 0,781 106. 16320A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 107. 16.324C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 108. 16.325C 9 (9,8) 7 (7,8) 16 (8,8) 0,795 109. 16.327T 10 (10,9) 8 (8,9) 18 (9,9) 0,805 110. 16.335T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 111. 16.342C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 Marina de Paula Andres APÊNDICES 90 Conclusão APÊNDICE A - Polimorfismos do Da região controladora do DNA mitocondrial das posições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 112. 16.343G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 113. 16.344T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 114. 16.355T 4 (4,3) 1 (1,1) 5 (2,7) 0,368 115. 16.360T 8 (8,7) 4 (4,4) 12 (6,6) 0,372 116. 16.362C 22 (23,9) 19 (21,1) 41 (22,5) 0,724 117. 16.368C 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 118. 16.372C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 119. 16.380A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 120. 16.381C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 Dados expressos como n (%); Teste exato de Fisher . Marina de Paula Andres APÊNDICES 91 APÊNDICE B - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 1 a 727, contendo as regiões HV2 e HV3 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 121. 45G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 122. 57G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 123. 59C 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 124. 62A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 125. 64T 6 (6,5) 7 (7,8) 13 (7,1) 0,781 126. 65A 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 127. 73G 79 (85,9) 75 (83,3) 154 (84,6) 0,685 128. 73R 2 (2,2) 2 (2,2) 4 (2,2) >0,999 129. 89C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 130. 93G 5 (5,4) 7 (7,8) 12 (6,6) 0,565 131. 95C 0 (0) 3 (3,3) 3 (1,6) 0,119 132. 103A 0 (0) 3 (3,3) 3 (1,6) 0,119 133. 143A 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 134. 146C 30 (32.6) 17 (18.9) 47 (25.8) 0,042 135. 150T 17 (18,5) 10 (11,1) 27 (14,8) 0,211 136. 151T 12 (13) 5 (5,6) 17 (9,3) 0,125 137. 152C 49 (53,3) 41 (45,6) 90 (49,5) 0,304 138. 153G 10 (10,9) 8 (8,9) 18 (9,9) 0,805 139. 182T 18 (19,6) 9 (10) 27 (14,8) 0,095 140. 183G 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 141. 185A 0 (0) 6 (6.7) 6 (3.3) 0,013 142. 185T 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 143. 186A 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 144. 188G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 145. 189C 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 146. 189G 11 (12) 12 (13.3) 23 (12.6) 0,826 147. 194T 4 (4,3) 2 (2,2) 6 (3,3) 0,682 148. 195C 32 (34,8) 27 (30) 59 (32,4) 0,529 Marina de Paula Andres APÊNDICES 92 Continuação APÊNDICE B - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 1 a 727, contendo as regiões HV2 e HV3 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 149. 198T 11 (12) 9 (10) 20 (11) 0,814 150. 199C 4 (4,3) 2 (2,2) 6 (3,3) 0,682 151. 200G 7 (7,6) 9 (10) 16 (8,8) 0,610 152. 204C 4 (4,3) 3 (3,3) 7 (3,8) >0,999 153. 207A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 154. 210G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 155. 211G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 156. 215G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 157. 217C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 158. 228A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 159. 235G 11 (12) 9 (10) 20 (11) 0,814 160. 236C 0 (0) 5 (5.6) 5 (2.7) 0,028 161. 239C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 162. 247A 15 (16,3) 12 (13,3) 27 (14,8) 0,678 163. 249 DEL 8 (8,7) 8 (8,9) 16 (8,8) >0,999 164. 251A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 165. 252C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 166. 257G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 167. 263G 88 (95,7) 87 (96,7) 175 (96,2) >0,999 168. 271T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 169. 279C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 170. 290 DEL 7 (7,6) 7 (7,8) 14 (7,7) >0,999 171. 291 DEL 7 (7,6) 7 (7,8) 14 (7,7) >0,999 172. 293C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 173. 295G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 174. 297G 7 (7,6) 6 (6,7) 13 (7,1) >0,999 175. 310 INS 1C 44 (47.8) 48 (53.3) 92 (50.5) 0,463 176. 310 INS 2C 5 (5.4) 10 (11.1) 15 (8.2) 0,187 Marina de Paula Andres APÊNDICES 93 Continuação APÊNDICE B - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 1 a 727, contendo as regiões HV2 e HV3 nos grupos endometriose e controle Variável Controle (N = 92) EDT (N = 90) Total (N = 182) p 177. 315 INS 1C 89 (96,7) 90 (100) 179 (98,4) 0,246 178. 316A 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 179. 325T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 180. 337 INS 1A 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 181. 340T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 182. 357G 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 183. 385G 1 (1,1) 3 (3,3) 4 (2,2) 0,365 184. 408A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 185. 418T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 186. 445A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 187. 447T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 188. 455 INS.1T 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 189. 460C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 190. 471C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 191. 489C 10 (10,9) 11 (12,2) 21 (11,5) 0,820 192. 493G 4 (4,3) 5 (5,6) 9 (4,9) 0,746 193. 497T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 194. 499A 4 (4.3) 12 (13.3) 16 (8.8) 0,038 195. 508G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 196. 511T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 197. 512A 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 198. 523 DEL 35 (38) 31 (34,4) 66 (36,3) 0,646 199. 524 DEL 35 (38) 31 (34,4) 66 (36,3) 0,646 200. 524 INS.1CA 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 201. 524 INS.1CACA 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 202. 534T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 203. 548G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 204. 573 INS.1C 4 (4,3) 0 (0) 4 (2,2) 0,121 205. 573 INS.2C 27 (29,3) 5 (5,6) 32 (17,6) <0,001 Marina de Paula Andres APÊNDICES 94 APÊNDICE C - Distribuição dos subhaplogrupos mitocondriais nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) Subhaplogrupo Haplogrupo CT EDT Total p* n % n % n % A Ameríndio 0 0,0 1 1,1 1 0,5 0,06 A2 Ameríndio 11 12,0 5 5,6 16 8,8 A5 Ameríndio 1 1,1 0 0,0 1 0,5 A6 Ameríndio 0 0,0 2 2,2 2 1,1 B2 Ameríndio 4 4,3 6 6,7 10 5,5 B4 Ameríndio 1 1,1 7 7,8 8 4,4 B6 Ameríndio 0 0,0 1 1,1 1 0,5 C0 Ameríndio 3 3,3 0 0,0 3 1,6 C1 Ameríndio 6 6,5 2 2,2 8 4,4 C2 Ameríndio 0 0,0 1 1,1 1 0,5 C3 Ameríndio 0 0,0 1 1,1 1 0,5 C4 Ameríndio 0 0,0 1 1,1 1 0,5 C5 Ameríndio 0 0,0 1 1,1 1 0,5 C6 Ameríndio 0 0,0 1 1,1 1 0,5 D1 Ameríndio 1 1,1 0 0,0 1 0,5 D4 Ameríndio 1 1,1 1 1,1 2 1,1 H1 Europeu 3 3,3 2 2,2 5 2,7 H10 Europeu 0 0,0 2 2,2 2 1,1 H2 Europeu 4 4,3 0 0,0 4 2,2 H27 Europeu 0 0,0 2 2,2 2 1,1 H3 Europeu 0 0,0 3 3,3 3 1,6 H4 Europeu 1 1,1 0 0,0 1 0,5 H5 Europeu 1 1,1 0 0,0 1 0,5 H6 Europeu 0 0,0 1 1,1 1 0,5 HV0 Europeu 1 1,1 0 0,0 1 0,5 JT Europeu 1 1,1 0 0,0 1 0,5 K1 Europeu 1 1,1 3 3,3 4 2,2 L0 Africano 0 0,0 5 5,6 5 2,7 L1 Africano 14 15,2 7 7,8 21 11,5 L2 Africano 12 13,0 11 12,2 23 12,6 L3 Africano 18 19,6 13 14,4 31 17,0 L4 Africano 1 1,1 0 0,0 1 0,5 M2 Asiático 0 0,0 1 1,1 1 0,5 M9 Asiático 1 1,1 0 0,0 1 0,5 N1 Asiático 0 0,0 1 1,1 1 0,5 N9 Asiático 0 0,0 1 1,1 1 0,5 R0 Europeu 0 0,0 2 2,2 2 1,1 T2 Europeu 2 2,2 2 2,2 4 2,2 U2 Europeu 0 0,0 1 1,1 1 0,5 U3 Europeu 1 1,1 0 0,0 1 0,5 U5 Europeu 2 2,2 0 0,0 2 1,1 W3 Europeu 0 0,0 1 1,1 1 0,5 W6 Europeu 1 1,1 0 0,0 1 0,5 X2 Asiático 0 0,0 1 1,1 1 0,5 Z4 Asiático 0 0,0 1 1,1 1 0,5 *Teste da razão de verossimilhanças .