{"paper_id":"223db1e0-4440-400e-bd5b-ad2410a1fad6","body_text":"MARINA DE PAULA ANDRES \n \n \n \n \n \nEstudo de polimorfismos da região controladora (D-loop) do DNA \nmitocondrial em amostra de mulheres brasileiras com endometriose \n  \n \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo para obtenção do título de \nMestre em Ciências \n \nPrograma de Ginecologia e Obstetrícia \nOrientador: Prof. Dr. Sergio Podgaec \nCoorientadora: Prof\na. Dra. Cintia Fridman Rave \n \n \n  \n \n  \n \n \n \n \nSão Paulo  \n2017 \n\n \n \nMARINA DE PAULA ANDRES \n \n \n \n \n \nEstudo de polimorfismos da região controladora (D-loop) do DNA \nmitocondrial em amostra de mulheres brasileiras com endometriose \n  \n \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo para obtenção do título de \nMestre em Ciências \n \nPrograma de Ginecologia e Obstetrícia \nOrientador: Prof. Dr. Sergio Podgaec \nCoorientadora: Prof\na. Dra. Cintia Fridman Rave \n \n \n  \n \n  \n \n \n \n \nSão Paulo  \n2017 \n\n \n \n \n \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) \nPreparada pela Biblioteca da \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \n \nreprodução autorizada pelo autor \n   \n                       Andres, Marina de Paula \n      Estudo de polimorfismos da região controladora (D-loop) do DNA mitocondrial em \namostra de mulheres brasileiras com endometriose  /  Marina de Paula Andres.  --  São \nPaulo, 2017. \n \n Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. \nPrograma de Ginecologia e Obstetrícia. \n \n Orientadora: Cintia Fridman Rave.  \n      \n   \n Descritores: 1.Endometriose  2.DNA mitocondrial  3.Polimorfismo genético  \n4.População brasileira  5.Genética médica  6.Haplótipos \n \n  \n \n \n USP/FM/DBD-255/17  \n \n \n\n \n \nNome: ANDRES, Marina de Paula \nTítulo: Estudo de polimorfismos da região controladora ( D-loop) do DNA \nmitocondrial em amostra de mulheres brasileiras com endometriose. \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo para obtenção do título de \nMestre em Ciências.  \nAprovado em:  \n \nBanca Examinadora \nProf. Dr. ___________________________________________________  \nInstituição: _________________________________________________  \nJulgamento: ________________________________________________  \n \n \n \nProf. Dr. ___________________________________________________  \nInstituição: _________________________________________________  \nJulgamento: ________________________________________________ \n \n \n \nProf. Dr. ___________________________________________________  \nInstituição: _________________________________________________  \nJulgamento: ________________________________________________ \n  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedico esta dissertação... \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAos meus pais, Cesar e Marcia, minha irmã Luiza e meu marido Alexandre. \nObrigada pelo incentivo incansável, apoio inabalável e amor incondicional. Sem \nvocês nada disso seria possível.  \n\n \n \nAGRADECIMENTOS \n \nDesejo agradecer aos meus orientadores Prof. Sergio e Prof a. Cintia, obrigada \npela confiança, oportunidade e pelo imensurável aprendizado. \n \nAos meus pais e família, obrigada por estimular desde sempre o espírito curioso \ne o contato com a ciência. As discussões sobre física e sobre o Universo foram \nessenciais na formação do meu espírito e caráter. \n \nAo meu marido, obrigada pelo incentivo e incansáveis leituras e conversas sobre \nmitocôndrias e Biologia Molecular. \n \nAos colegas do LIM 40 e do Departamento de Medicina Legal, Ética Médica, \nMedicina Social e do Trabalho , obrigada pela paciência , pela ajuda, almoços e \nrisadas durante todo esse período. \n \nÀs amigas Nathalie, Mari e Felícia, obrigada por me ensinarem um mundo novo \ne por manterem minha janela sempre aberta. \n \nAos amigos e colegas do Setor de Endometriose do Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia, obrigada pelo acolhimento e por permitir meu \ncrescimento pessoal e acadêmico. \n \nÀ Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e ao Programa de \nGinecologia e Obstetrícia, agradeço por toda a minha formação como médica e \npesquisadora.  \n \n \n \n \n \n  \n\n \n \nRESUMO \n \nANDRES, Marina de Paula. Estudo de polimorfismos da região controladora (D-\nloop) do DNA mitocondrial em amostra de mulheres brasileiras com \nendometriose [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade \nde São Paulo; 2017. \n \nIntrodução: A endometriose afeta 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva \ne há evidências crescentes de que o estresse oxidativo está envolvido na sua \npatogênese. Os polimorfismos na região controladora do DNA mitocondrial \npodem levar à replicação e à transcrição alterada dos genes mitocondriais, o que \npode afetar a função mitocondrial e , consequentemente, a geração intracelular \nde espécies reativas de oxigênio. Descobertas recentes indicam q ue os \npolimorfismos do DNA mitocondrial (mtDNA) estão relacionados à endometriose \nem populações coreana e indiana.  Objetivo: Avaliar a associação entr e \npolimorfismos e haplogrupos do DNA mitocondrial e a presença de endometriose \nem mulheres brasileiras.  Métodos: Pacientes com idade entre 18 e 50 anos \nforam divididas nos grupos endometriose (n = 90) e controle (n = 92). O primeiro \ngrupo incluiu mulheres  com diagnóstico histológico  de endometriose e \nestadiamento cirúrgico, enquanto o segundo grupo incluiu pacientes submetidas \nà cirurgia para laqueadura tubária, leiomioma ou cistos ovarianos benignos, sem \nevidência de endometriose. O DNA foi extraído a partir de amostras de sangue \nperiférico seguido do sequenciamento de Sanger e eletroforese capilar. O s \npolimorfismos foram determinados comparando as sequências obtidas com a \nSequência padrão de Cambridge Revisada. Resultados: As frequências dos \npolimorfismos T16217C (14,4% vs. 5,4%; p = 0,049), G499A (13,3% vs. 4,3%; p \n= 0,038), T236C (5,6% vs. 0%; p = 0,028) e G185A (6,7% vs. 0%; p = 0.013) \nforam maior no grupo endometriose em comparação ao grupo controle,  \nrespectivamente, enquanto as frequências dos polimorfismos T146C (18,9% vs \n32,6%; p = 0,042) e 573.2C ( 5,6% vs. 29,3%; p<0.001) foram menores. A \ndistribuição dos haplogrupos foi semelhante entre  os grupos endometriose e \ncontrole. Nenhuma diferença foi observada nos haplogrupos de acordo com o \nestádio ou localização da doença.  Conclusão: Os polimorfismos T16217C, \n\n \n \nG499A, T236C e G185A do DNA mitocondrial foram relacionados à presença de \nendometriose, enquanto T146C  e 573.2C foram relacionados à ausência de \ndoença, em amostra de mulheres brasileiras. Não foram observadas diferenças \nsignificativas entre os haplogrupos mitocondriais. \n \nDescritores: endometriose; DNA mitocondrial; polimorfismo genético; população \nbrasileira; genética médica; haplótipos. \n  \n\n \n \nABSTRACT \n \nAndres MP. Polymorphisms of control region (D-loop) of mitochondrial DNA in \nBrazilian women with endometriosis [Dissertation]. São Paulo: \"Faculdade de \nMedicina, Universidade de São Paulo\"; 2017. \n \nBackground: There is increasing evidence that oxidative stress is a major factor \nin the pathogenesis of endometriosis, a prevalent disease that affects 5 –15% of \nreproductive-aged women worldwide. Polymorphisms in the control region of \nmitochondrial DNA (mtDNA) can lead to the altered replication and transcription \nof mitochondrial genes, thereby affecting both overall mitochondrial function, and \nthe intracellular generation of reactive oxygen species. Objective: The present \nstudy investigated whether the incidence of mtDNA polymorphisms and/or \nhaplogroups is associated with endometriosis in a Brazilian population. Methods: \nFemale patients (aged 18–50 years) were enrolled in the present s tudy, and \nassigned to either endometriosis (n = 90) or control (n = 92) group. The former \ngroup comprised patients who had received a histological diagnosis of \nendometriosis and had been assigned a surgical stage, while the latter comprised \npatients who had undergone gynecological surgery for tubal ligation, leiomyoma, \nor ovarian cysts, and showed no evidence of endometriosis. DNA was extracted \nfrom peripheral blood samples, and then subjected to Sanger sequencing and \ncapillary electrophoresis. Polymorphisms were identified by comparing the \nisolated mtDNA sequences with the revised Cambridge Reference Sequence. \nResults: The frequency of some identified polymorphisms was found to be higher \nin the endometriosis group than in the control group, including polymorphisms \nT16217C (found in 14.4% and 5.4% of endometriosis - and control-group \nmembers, respectively; p=0.049), G499A (13.3% vs. 4.3%; p=0.038), T236C \n(5.6% vs. 0%; p=0.028), and G185A (6.7% vs. 0%; p=0.013). In contrast, \npolymorphisms T146C (18.9% vs. 32.6%; p=0.042) and 573.2C (5.6% vs. 29.3%; \np<0.001) were found to occur at a lower frequency in the endometriosis \ncompared to the control group. Observed haplogroup frequencies were similar \nbetween the endometriosis and control groups, and did not appear to be affected \nby either disease location and/or staging.  \n\n \n \nConclusion: mtDNA polymorphisms T16217C, G499A, T236C, and G185A were \nfound to be associated with endometriosis, while conversely, T146C and 573.2C \nwere shown to be associated with an absence of disease in the analyzed \nBrazilian population. No significant differences were observed bet ween the \nmitochondrial haplogroups of patients with, versus without endometriosis. \n \nDescriptors: endometriosis; DNA, mitochondrial; polymorphism, genetic; \nBrazilian population; genetics, medical; haplotypes.\n\n \n \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1 - Mapa do genoma mitocondrial humano e diagrama da região \ncontroladora ...................................................................................................... 21\t\nFigura 2 - Representação gráfica do padrão de migração das linhagens \nmitocondriais ..................................................................................................... 23\t\nFigura 3 - Filogenia simplificada do DNA mitocondrial ilustr ando o uso de letras \ndo alfabeto para a designação do haplogrupo .................................................. 23\t\nFigura 4 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmias de ponto ............. 25\t\nFigura 5 - Eletroferogramas exemplificando uma heteroplasmia de comprimento \nna região HV1 ................................................................................................... 25\t\nFigura 6 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmia de comprimento na \nregião HV3 ........................................................................................................ 25\t\nFigura 7 - Fluxograma representando a dinâmica do estudo ............................ 33\t\nFigura 8 - Eletroferogramas de indivíduos com heteroplasmia de comprimento \nna região 16.193 e transição no nucleotídeo 16.189 ........................................ 45\t\nFigura 9 - Eletroferogramas apresentando indivíduos com heteroplasmia de \ncomprimento na região HV2, posição 309 e inserção de 1C na posição 315 ... 45\t\nFigura 10 - Heteroplasmia de comprimento na região HV3, entre os nucleotídeos \n515 e 524 .......................................................................................................... 45\t\nFigura 11 - Duplicação de 15 nucleotídeos entre as posições 16.018 e 16.032 do \nDNA mitocondrial .............................................................................................. 46\t\n \n  \n\n \n \nLISTA DE GRÁFICOS \n \nGráfico 1 - Classificação da American Society for Reproductive Medicine e por \ntipo de lesão das pacientes incluídas no grupo endometriose (n=90) .............. 42\t\n \n \n  \n\n \n \nLISTA DE TABELAS \n \nTabela 1 - Volume e concentrações dos reagentes utilizados na reação de cadeia \nda polimerase (PCR) para amplificação da região controladora do DNA \nmitocondrial ....................................................................................................... 35\t\nTabela 2 - Condições de temperatura, tempo e número de ciclos da reação de \ncadeia da polimerase (PCR) utilizadas para amplificação da região controladora \ndo DNA mitocondrial ......................................................................................... 36\t\nTabela 3 - Primers utilizados no estudo para as reações de PCR e \nsequenciamento da região controladora do DNA mitocondrial ......................... 37\t\nTabela 4 - Dados demográficos e clínicos das pacientes incluídas no estudo nos \ngrupos controle (CT) e endometriose (EDT) ..................................................... 41\t\nTabela 5 - Quadro clínico das pacientes incluídas nos grupos controle (CT) e \nendometriose (EDT) .......................................................................................... 43\t\nTabela 6 - Análise estatística das heteroplasmias da região controladora do DNA \nmitocondrial encontradas nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) ..... 44\t\nTabela 7 - Polimorfismos na região controladora do DNA mitocondrial nos grupos \ncontrole (CT) e endometriose (EDT) ................................................................. 47\t\nTabela 8 - Distribuição e análise estatística dos haplogrupos mitocondriais nos \ngrupos controle (CT) e endometriose (EDT) ..................................................... 48\t\nTabela 9 - Distribuição dos haplogrupos mitocondriais por estádio e tipo de lesão \nno grupo endometriose ..................................................................................... 48\t\nTabela 10 - Distribuição dos haplogrupos mitocondriais por subgrupo no grupo \ncontrole .............................................................................................................. 49\t\n \n  \n\n \n \nLISTA DE ABREVIATURAS \nASRM American Society for Reproductive Medicine \nA Adenosina \na Alfa \nAF Antecedente familiar \nATP Trifosfato de adenosina \nb Beta \nCAPPesq Comissão de Ética para Análises de Projetos de Pesquisa \nC Citosina \n°C Graus Celsius \nCT Controle \nD-loop Displacement Loop (Região controladora do DNA mitocondrial) \nDNA Ácido Desoxirribonucleico \ndNTP Desoxirribonucleotídeo Tri Fosfatado \nEDT Endometriose \nEDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético \nEVA Escala visual analógica de dor \net al et alia (e outros) \nFMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \nIC Intervalo de confiança \nINS Inserções \niPSC Induced Pluripotent Stem Cells \n\n \n \nDEL Deleções \nDP Desvio padrão \nG Guanina \nGWAS Genome-wide association studies \nHV Região hipervariável do DNA mitocondrial \nLIM 40 Laboratório de Investigação Médica 40 \nMgCL2 Cloreto de magnésio \nmin Minutos \nmm Milímetros \nmM Milimolar \nmt Mitochondrial \nmtDNA DNA mitocondrial \nMT-TP Mitochondrailly encoded tRNA proline \nMRCA Matrilineal most recente common ancestor \nn Número de indivíduos/ eventos \nNADH Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina reduzido \nng Nanograma \nOR Odds Ratio \nPb Pares de bases \nPCR Reação em Cadeia da Polimerase \npmol Picomol \n\n \n \n  \nrCRS Revised Cambridge Reference Sequence (Sequência Referência \nde Cambridge Revisada) \nRNA Ácido Ribonucleico \nSNPs Single Nucleotide Polymorphisms (Polimorfismos de base única) \nT Timina \ntRNA RNA de transferência \nuL Microlitro \nUI Unidades internacionais \nvs Versus \nX² Qui-quadrado \n\n \n \nSUMÁRIO \n \nAGRADECIMENTOS .......................................................................................... 5\t\nRESUMO ............................................................................................................. 6\t\nABSTRACT ......................................................................................................... 8\t\nLISTA DE GRÁFICOS ...................................................................................... 11\t\nLISTA DE TABELAS ........................................................................................ 12\t\nLISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. 13\t\n1.\tINTRODUÇÃO .............................................................................................. 19\t\n1.1.\t Endometriose ........................................................................................ 19\t\n1.2.\t DNA mitocondrial .................................................................................. 20\t\n1.3.\t Haplogrupos mitocondriais ................................................................... 22\t\n1.4.\t Heteroplasmia ....................................................................................... 24\t\n1.5.\t DNA mitocondrial e endometriose ........................................................ 26\t\n1.6.\t Justificativa do estudo .......................................................................... 27\t\n2.\tOBJETIVO .................................................................................................... 29\t\n3.\tCASUÍSTICA E MÉTODOS .......................................................................... 31\t\n3.1.\t Casuística ............................................................................................. 31\t\n3.1.1.\t Critérios de inclusão ........................................................................ 31\t\n3.1.2.\t Critérios de exclusão ....................................................................... 31\t\n3.1.3.\t Dinâmica do estudo ......................................................................... 32\t\n3.1.4.\t Cálculo do tamanho da amostra ..................................................... 34\t\n3.2.\t Métodos ................................................................................................ 34\t\n3.2.1.\t Coleta de amostras ......................................................................... 34\t\n\n \n \n3.2.2.\t Extração de DNA ............................................................................. 34\t\n3.2.3.\t Amplificação do mtDNA .................................................................. 35\t\n3.2.4.\t Reação de sequenciamento ............................................................ 36\t\n3.2.5.\t Análise estatística ........................................................................... 38\t\n4.\tRESULTADOS ............................................................................................. 40\t\n4.1.\t Avaliação Clínica .................................................................................. 40\t\n4.2.\t Análise Genética ................................................................................... 43\t\n5.\tDISCUSSÃO ................................................................................................. 50\t\n6.\tCONCLUSÕES ............................................................................................. 60\t\nREFERÊNCIAS ................................................................................................. 63\t\nANEXOS ........................................................................................................... 74\t\nAPÊNDICES...................................................................................................... 86\t\n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1. INTRODUÇÃO \n \n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n19 \n \n1. INTRODUÇÃO \n1.1. Endometriose \nEndometriose é definida pela presença de tecido endometrial (glândulas \ne/ou estroma) fora do útero. Estima-se que esta doença atinja de 10 a 15% das \nmulheres em idade fértil, chegando, entre mulheres com dor pélvica crônica ou \ninfertilidade, a 40% e 48%, respectivamente (1). \nExistem inúmeras classificações propostas para a endometriose. A \nAmerican Society for Reproductive Medicine  (ASRM) classifica a endometriose \nem estádios de I a IV, de acordo com o tamanho das lesões, presença  de \naderências e bloqueio do fundo de saco de Douglas (2). \nMorfologicamente, podemos dividi r a doença em endometriose peritoneal \nsuperficial, endometrioma ovariano ou endometriose profunda. A endometriose \nsuperficial é caracterizada por focos de lesões localizados no peritônio de forma \nsuperficial, histologicamente semelhantes ao endométrio tópico (3). Os \nendometriomas ovarianos estão presentes em até 44% das pacientes com \nendometriose e caracterizam -se por cistos de conteúdo espesso de cor \n“achocolatada”, usualmente associados a aderências ao peritônio posterior e ao \nligamento largo, com patogênese ainda controversa (3). Os implantes profundos \nsão definidos por nódulos de profundidade maior que cinco milímetros.  \nUsualmente, os principais sítios acometidos são: ligamentos útero-sacros, região \nretrocervical, terço superior de vagina, retossigmoide, bexiga e ureter (4). \nA suspeita clínica da endometriose é feita com base em dados de \nanamnese e exame físico. Os sintomas mais comumente apresentados por \nessas pacientes são: dor pélvica em cólica no período menstrual (dismenorreia), \ndor pélvica crônica (ou acíclica), dispareunia de profundidade, sintomas \nintestinais ou urinários cíclicos e infertilidade.  Tais queixas podem variar de \nacordo com o local dos implantes endometrióticos, podendo acometer \npraticamente todos os locais do organismo, mesmo sítios não usuais como, por \nexemplo, pulmão, plexo sacral e pâncreas (4).  \nA prevalência correta dos tipos de endometriose na população geral não é \nbem estabelecida, visto que o diagnóstico definitivo é hist ológico (4). A \nabordagem moderna da endometriose se baseia no reconhecimento do tipo de \n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n20 \n \nacometimento das lesões, sendo o diagnóstico correto d a endometriose \nprofunda o maior desafio para a obtenção de bons resultados terapêuticos (5). \nDiversas teorias foram propostas para explicar a etiopatogenia da doença \ne a mais aceita ainda é a da menstruação retrógrada (6). Diversos fatores \ndeterminam a adesão e proliferação das células endometriais na cavidade \npélvica, como alterações imunológicas, inflamatórias e o stress oxidativo (7-11). \nAlém disso, a regulação de inúmeros desses mecanismos parece ser \ndeterminada por fatores genéticos, podendo levar a p erda ou ganho de função, \nsecundárias à instabilidade de microssatélite, instabilidade cromossômica, perda \nde heterozigose, polimorfismos , mutações de genes nucleares  e mutações do \nDNA mitocondrial (mtDNA) (10). \nO desbalanço entre a produção de espécies reativas de oxigênio, que são \nmetabólitos intermediários da metabolização normal do oxigênio, e os sistemas \nanti-oxidativos, que são designados para controlar a produção e inativar os \nradicais livres de oxigênio e reparar as células danificadas, caracteriza o stress \noxidativo (12). Sendo a mitocôndria a organela responsável pelo metabolismo de \noxigênio intracelular, alterações no mtDNA poderiam alterar a transcrição, \ntradução e replicação do mesmo, e interferir nas vias de sinalização nuclear (13).  \n \n1.2. DNA mitocondrial \nAs mitocôndrias são organelas citoplasmáticas encontradas em todas as \ncélulas nucleadas, responsáveis pelo metabolismo de oxigênio intracelular (13). \nO mtDNA é composto por uma dupla fita circular q ue contém 16.569 pares de \nbases onde se localizam 37 genes, todos envolvidos no metabolismo de oxigênio \ne produção de energia na célula (14).  \nOs componentes da cadeia respiratória localizam -se na membrana interna \nda mitocôndria sob a forma de quatro complexos proteína-lipídeos: o complexo I \n(NADH ubiquinona oxidoreductase) com mais de 40 polipeptí deos, o complexo \nII (succinato-ubiquinona oxidoreduc tase), o complexo III (ubiquinolcitocromo c \noxidoreductase) e o complexo IV (citocromo c oxidase). A cadeia respiratória \nmitocondrial possui ainda dois transportadores de elétrons: a ubiquinona e  o \ncitocromo c. Estes constituintes, bem como o complexo V  (ATP sintetase), \nformam o sistema de fosforilação oxidativa, que fo rnece o ATP necessário à \n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n21 \n \ncélula (15). O complexo I mitocondrial é formado por um grande número de \nproteínas e possui 46 subunidades, sendo sete codificadas por gene s \nmitocondriais e as restantes pelo DNA nuclear. Devido à complexidade desse \nsistema, defeitos genéticos resultam em uma grande variedade de fenótipos \nclínicos (15). \nHá também uma região não codificadora denominada região control adora, \nD-loop (Displacement Loop) ou região hipervariável (HV),  responsável pela \nregulação da transcrição e replicação do mtDNA. Essa região compreende três \nsegmentos: HV1, localizado entre as posições 16.024 e 16.365; HV2, da posição \n73 a 340; e HV3, da posição 438 a 574 (Figura 1) (16-18). \n \nFigura 1 - Mapa do genoma mitocondrial humano e diagrama da região controladora  \n \nA designação dos genes tRNA  são indicados por for a do círculo . A numeração na região \ncontroladora se refere à sequência referência de Anderson et al. (19).  \nFonte: adaptado de MITOMAP (www.mitomap.org) \n \nO mtDNA apresenta uma taxa de mutaç ão 5 a 10 vezes maior do que o \nDNA nuclear, sua herança é exclusivamente materna e a molécula não sofre \n\n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n22 \n \nrecombinação, resultando no acúmulo de mutações ao longo das linhagens \nmatrilineares (20). \nAs mutações encontradas em mais de 1% da população são denominadas \npolimorfismos e são definidas a partir da comparação da sequência do mtDNA \ndo indivíduo analisado com uma sequência padrão, sendo atualmente utilizada \na Revised Cambridge Reference  Sequence (rCRS) (21). O conjunto de \npolimorfismos do DNA mitocondrial de um indivíduo é denominado de haplótipo. \n \n1.3. Haplogrupos mitocondriais \nHaplogrupo mitocondrial refere-se ao grupo de indivíduos que apresentam \ndeterminados polimorfismos em comum, característicos de um grupo étnico e de \numa origem geográfica (13).  \nO modelo “out of Africa” (22) sugere uma origem única dos homens \nmodernos originada na África há aproximadamente 250.000 anos (Figura 2). A \npartir de um haplogrupo ancestral, novas mutações surgiram, formando novos \nhaplogrupos e, consequentemente, novas linhagens evolutivas. Com o advento \ndas migrações e com o isolamento geográfico dessas populações, os \nhaplogrupos e os polimorfismos mitocondriais formaram linhagens \nindependentes, tornando -se específicos para cada região geográfica, \nclassificados nos grandes grupos  africano, europeu, asiático e a meríndio (13; \n23). \nConforme o aumento no número de diferentes populações estudadas, \npolimorfismos adicionais população-específicos vão sendo descritos e, portanto, \nos haplogrupos mitocondriais vão sendo constantemente rearranjados e \nsubdivididos. A Figura 3 ilustra um diagrama da filogenia dos haplogrupos. \nTodos os mtDNA africanos estão incluídos no macro haplogr upo L. O \nhaplogrupo africano L0 é a linhagem mais antiga do mtDNA encontrada na \npopulação Koi-San e L1 e L2 são encontrados em populações de pigmeus \nafricanos. Os macro haplogrupos M e N surgiram na região subsaariana a partir \nde L3 do nordeste africano e migraram para formar as populações indígenas , \neuropeia e asiática. Enquanto o haplogrupo M ficou confinado à Ásia, os \nhaplogrupos A, C e D ocuparam o nordeste da Sibéria e migraram ao longo do \nestreito de Bering há cerca de 20.000 anos para formar os nativ os americanos. \n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n23 \n \nMigrações adicionais trouxeram para as Américas os haplogrupos B e X, e o \nhaplogrupo B colonizou as Ilhas do Pacífico (9). \n \nFigura 2 - Representação gráfica do padrão de migração das linhagens mitocondriais  \nAs letras representam a distribuição dos haplogrupos mitocondriais para cada região do mapa. \nFonte: MITOMAP (24). \n \nFigura 3 - Filogenia simplificada do DNA mitocondrial ilustrando o uso de letras do alfabeto para \na designação do haplogrupo \nA raiz da árvore é indicada pela inscrição mt -MRCA (matrilineal most recent common ancestor ). \nOs haplogrupos L são as linhagens mais antigas. Haplogrupo L3 deu origem aos haplogrupos \nM e N, que abrangem toda a var iação observada fora da África.\n \nFonte: Phylotree, 2016. (\"http://www.phylotree.org” ). \n \nNesse sentido, os haplogrupos mitocondriais, por serem caracterizados por \npolimorfismos específicos, podem estar associados a condições fisiológicas no \n\n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n24 \n \nmetabolismo intracelular ou a doenças: os haplogrupos T e U, por exemplo, já \nforam associados com redução na motilidade do esperma (25); haplogrupos J e \nUk são encontrados em corredores de alta performance de curtas distâncias e o \nhaplogrupo I em corredores de alta performance de longa distância. De forma \ninversa, os polimorfismos e, portanto, seus respectivos haplogrupos, podem \ndeterminar alterações cruciais no metabolismo de oxigênio e aumento do stress \noxidativo e já foram associados a diversas doenças metabólicas, degenerativas, \ninfecciosas e autoimunes  como diabetes melito, miopatias, carcinoma \nhepatocelular, dentre outras (23; 26-30). \n \n1.4. Heteroplasmia \nAlgumas doenças associadas ao mtDNA e suas variações fenotípicas \npoderiam ser explicadas pela presença de heteroplasmia do mtDNA, que \nconsiste na co-expressão, em um mesmo indivíduo, da variante selvagem e da \nvariante polimórfica em graus variados (31; 32). Devido ao grande número de \ncópias do mtDNA em cada célula, uma mutação ocorrida em apenas algumas \ndelas pode resultar em uma mistura de diversas sequê ncias de mtDNA dentro \nda mitocôndria, célula, tecido ou órgão (33).  \nA heteroplasmia pode se manifestar de duas maneiras: sequência e \ncomprimento (deleção ou inserção). A heteroplasmia de sequência, ou de ponto, \ntem origem quando duas linhagens de mtDNA diferem pela substituição de uma \núnica base (Figura 4). A heteroplasmia de comprimento é definida quando há \nvariação no número de bases em uma região homopolimérica,  tipicamente na \nconcentração de bases C\ns ou repetições de AC s (Figura 5). As regiões \nhomopoliméricas de C-stretch estão localizadas entre as posições 16.184 e \n16.193 na região HV1, entre 303 e 315 em HV2 e entre 568 e 573 em HV3. Na \nregião HV3, entre os nucleotídeos 515 e 524, pode ser observada a ocorrência \nde heteroplasmia de comprimento com adição ou deleção de dinucleotídeos ACs \n(Figura 6) (31; 34). \n O aumento da quantidade de heteroplasmia intracelular pode conferir uma \nvantagem adaptativa ou determinar um defeito bioquímico no metabolismo de \noxigênio celular, aumentando a produção de radicais livres de oxigênio, \ncausando defeito na síntese de ATP, disfunção e morte celular (22).\n  \n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n25 \n \nFigura 4 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmias de ponto  \n \nA: Indivíduo com heteroplasmia de ponto na posição 16.278, com a presença das bases T e C. \nB: Indivíduo com heteroplasmia de ponto na posição 16.241, com a presença das bases A e G. \nFonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e  Medicina Social e do Trabalho, \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP).  \n \nFigura 5 - Eletroferogramas exemplificando uma heteroplasmia de comprimento na região HV1 \n \nA: Indivíduo sem a heteroplasmia de comprimento. B: Indivíduo com heteroplasmia de \ncomprimento devido à presença de 1C na posição 16.189 (ao invés do T) e a inserção de 1C na \nposição 16.193, resultando em um trecho heteroplasmático, que resulta na leitura fora de fase a \n3’ do ponto de heteroplasmia.  \nFonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho,  FMUSP. \n \nFigura 6 - Eletroferogramas exemplificando heteroplasmia de comprimento na região HV3\n \n. \nA: Indivíduo sem a heteroplasmia de comprimento, com 5 conjuntos de dinucleotídeos AC. B: \nIndivíduo com heteroplasmia de comprimento devido à inserção de um dinucleotídeo AC na \nposição 524.  C: Indivíduo com heteroplasmia de comprimento devido à deleção de um \ndinucleotídeo AC na posição 524.  \nFonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, FMUSP.  \n \n\n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n26 \n \n1.5. DNA mitocondrial e endometriose \nAlguns trabalhos já relacionaram o DNA mitocondrial e a presença de \nendometriose em populações asiáticas e são descritos abaixo. \nCho et al. (36), em 2012, analisaram 365 mulheres coreanas na menacme \nsubmetidas a cirurgias eletivas, sendo 198 diagnosticadas com endometriose e \n167 controles. As pacientes com endometriose foram classificadas como estádio \nI (n = 26), II (n = 11), III (n = 80) e IV (n = 81), de acordo com a ASRM (2). Foram \navaliados os polimorfismos A10.398G, G13 .708A e T16.189C. Dentre esses, o \nT16.189C foi encontrado em uma frequência significativamente maior no grupo \ncom endometriose quando comparado ao grupo controle (45,9% versus 34,7%; \np = 0,03), com odds ratio de 1,598 (IC 95%: 1,046 - 2,442). \nGovatati et al. (37), em 2012, pesquisaram os polimorfismos do mtDNA em \namostras de endométrio tópico e de lesões de endometriose em 32 pacientes \nindianas com endometriose moderada ou grave e avaliaram os haplogrupos \nmitocondriais de 128 amostras de sangue periférico de pacientes  com \nendometriose confirmada e de 90 controles.  Foram observados diferentes \npolimorfismos na região controladora em 45,1% das amostras de endométrio, \nsendo 6 heteroplasmias  de ponto observadas apenas nas lesões de \nendometriose. Foram identificados 39 haplogrupos mitocondriais entre pacientes \ne controles, sendo que o haplogrupo M5 (característico de populações do Sul da \nÁsia) apresentou frequência significativamente mais elevada entre pacientes \ncom endometriose em comparação ao grupo controle (19,5% versus 3,3% , \nrespectivamente; p = 0,00069). \nEm 2013, o mesmo grupo de Govatati et al. (17) estudou 152 mulheres \nindianas com idades entre 20 e 40 anos e endometriose confirmada \nhistologicamente. As pacientes apresentavam endometriose estádio III (n = 98) \nou IV (n = 54) da ASRM (2). Foram incluídas 150 pacientes inférteis no grupo \ncontrole, submetidas à laparoscopia diagnóstica, sem endometriose.  A partir do \nsequenciamento completo da região controladora do mtDNA de todas as \namostras, observou-se que as frequências dos polimorfismos A189G (49% \nversus 33%; p = 0,0455), 310C (51% versus 43%; p = 0,354) e T16.189C (41% \nversus 17%; p = 0,0005) foram significativamente maiores nas pacientes com \nendometriose quando comparadas àquelas sem a doença. \n\nMarina de Paula Andres   INTRODUÇÃO \n \n27 \n \n \n1.6. Justificativa do estudo \nCrescente evidência tem demonstrado que o stress oxidativo pode estar \nrelacionado à etiopatogenia da endometriose (12). Sendo a mitocôndria o maior \ngerador intracelular de espécies reativas de oxigênio, polimorfismos na região \ncontroladora do DNA mitocondrial podem alterar a transcrição e expressão dos \ngenes mitocondriais, aumentando ou diminuindo a produção de tais elem entos. \nAlém disso, estudos em famílias e irmãs gêmeas sugerem também uma \npredisposição genética ao desenvolvimento da endometriose. A avaliação \ngenômica desses indivíduos já permitiu identificar diversos polimorfismos em \ngenes que codificam proteínas relac ionadas à resposta imune, citocinas, \nmoléculas de adesão, inflamação e stress oxidativo relacionados com a doença \n(10; 38). \nA relação do mtDNA e endometriose já foi descrita em alguns estudos que \navaliaram o fluido peritoneal e lesões  da doença (39; 40). Nas populações \ncoreana e indiana já foi sugerida a associação de alguns polimorfismos da região \ncontroladora do mtDNA com a endometriose (17; 36; 37; 41).  \nDessa forma, baseado no conhecimento de que os polimorfismos podem \nser específicos para cada população estudada e que a brasileira é altamente \nmiscigenada, elaboramos o presente estudo para avaliar de forma inédita a \npossível associação dos polimorfismos da região controladora do DNA \nmitocondrial e dos haplogrupos mitocondriais com a presença de endometriose, \nem amostra de mulheres brasileiras. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2. OBJETIVO\n\n \n \n \n29\n \n2. OBJETIVO \n Avaliar \na associação dos polimorfismos da região controladora ( D-loop) \ndo DNA mitocondrial e dos haplogrupos mitocondriais com a presença de \nendometriose em amostra de mulheres brasileiras. \nMarina de Paula  Andres  OBJETIVO\n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3. CASUÍSTICA E MÉTODOS \n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n31 \n \n3. CASUÍSTICA E MÉTODOS \n3.1. Casuística \nEsse estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão de Clínica \nGinecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo ( FMUSP), onde foram recrutadas as participantes , \nem colaboração com o Laboratório de Imuno -Hematologia e Hematologia \nForense (LIM 40), do Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina \nSocial e do Trabalho da FMUSP, onde foi realizada a análise genética do mtDNA.  \nAs pacientes foram divididas em dois grupos: endometriose (pacientes com \nendometriose confirmada histologicamente, n = 90) e controles (pacientes sem \nendometriose, n = 92). As pacientes foram previamente informadas sobre o \nestudo e o material biológico (sangue) foi coletado após a assinatura do Termo \nde Consentimento Livre e Esclarecido (Anexos A e B). A coleta das amostras \nrespeitou os protocolos técnicos do hospital e dos médicos envolvidos e a \npesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa \n(CAPPesq) do Hospital das Clínicas da FMUSP sob o parecer 534714/14 (Anexo \nC). \n \n3.1.1. Critérios de inclusão \nPara o grupo com endometriose , os critérios de inclusão foram:  mulheres \ncom idade entre 18 e 50 anos com endometriose comprovada histologicamente. \nPara o grupo controle, foram selecionadas mulheres entre 18 e 50 anos \nsubmetidas a cirurgias por leiomioma uterino, hidrossalpinge, teratoma ovariano, \ncistos benignos ovarianos  ou laqueadura tubária, de acordo com indicação \napropriada dos Setor es de Planejamento Familiar e Grupo Cirúrgico Geral da \nDivisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da FMUSP, momento \nem que foi verificada a ausência de endometriose. \n \n3.1.2. Critérios de exclusão \nFoi considerado critério de exclusão a presença de  comorbidades \npreviamente associadas aos polimorfismos do mtDNA, como insuficiência renal \n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n32 \n \ncrônica, carcinoma hepatocelular e doença coronariana (42). Foram também \nexcluídas pacientes com diagnóstico de adenomiose. \n \n3.1.3. Dinâmica do estudo \nApós assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, foi \nrealizada a coleta de amostra de sangue periférico das pacientes que atenderam \naos critérios de inclusão e exclusão acima descritos, no ambulatório do Setor de \nEndometriose (grupo endometriose) ou na enfermaria da  Divisão de Clínica \nGinecológica do Hospital da Clínicas da FMUSP (grupo controle). O fluxograma \nda dinâmica do estudo está representado na Figura 7. \nTodas as pacientes incluídas responderam a um questionário (Anexo D) \naplicado por esta pesquisadora, com dados demográficos, presença dos \nsintomas típicos da doença (dismenorreia, dor pélvica crônica, dispareunia de \nprofundidade, dor ao evacuar cíclica, disúria cíclica e infertilidade), graduação de \nzero a dez dos sintomas dolorosos pela escala visual analógica de do r (EVA), \nuso de medicações e comorbidades. \nOs dados cirúrgicos foram levantados do prontuário eletrônico, bem como o \nestádio da doença pela cla ssificação da ASRM (Anexo E), resultado do exame \nanatomopatológico da lesão e classificação por tipo de lesão: superficial (doença \nexclusivamente peritoneal, com infiltração menor que 5 mm), ovariana (presença \ndo endometrioma cístico ovariano com ou sem le são peritoneal) ou profunda \n(presença de qualquer lesão profunda com infiltração maior que 5 mm) (3). \nAs amostras foram processadas e analisadas no Laboratório de Imuno -\nHematologia e Hematologia Forense (LIM 40) da FMUSP. \n \n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n33 \n \nFigura 7 - Fluxograma representando a dinâmica do estudo \n \nASRM: American Society for Reproductive Medicine  (2). \nFonte: Departamento de Ginecologia e Obstetrícia , FMUSP. \n  \nGrupo endometriose \n(n = 90) \nGrupo Controle \n(n = 92) \nColeta de 4 mL de sangue periférico \nAssinatura do TCLE \nExtração do DNA \nSequenciamento da região \ncontroladora do mtDNA \nComparação com a Sequência de \nCambridge revisada \n(Polimorfismos) \nDeterminação dos haplótipos e \nhaplogrupos mitocondriais \n• Mulheres 18-50 anos \n• Diagnóstico histológico \n• Classificação ASRM \n• Tipo de endometriose \n(superficial, ovariana, \nprofunda) \n• Mulheres 18-50 anos \n• Mioma uterino  (n=44) \n• Laqueadura tubária (n=30) \n• Teratoma ovariano (n=13) \n• Hidrossalpinge (n=2) \n• Cistoadenoma ovariano (n=3) \n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n34 \n \n3.1.4. Cálculo do tamanho da amostra \nNão havendo estudo prévio sobre o mtDNA e endometriose em mulheres \nbrasileiras, o cálculo amostral foi baseado no estudo de Govatati  et al. (25), no \nqual o polimorfismo T16.189C foi encontrado em apr oximadamente 17% da \npopulação geral e em 41% das mulheres com endometriose. Baseado nesses \ndados, com intervalo de confiança e poder de 95%, a amostra necessária para \nencontrar esta diferença em mulheres brasileiras seria de 87 mulheres em cada \ngrupo (com e sem a doença). \nO cálculo da amostra seguiu a fórmula abaixo (31): \n \nOnde: p\n1 é a frequência do polimorfismo T16 .189C nas mulheres sem \nendometriose; p2 é a frequência do polimorfismo T16 .189C nas mulheres com \nendometriose; e Z são os valores da distribuição normal padrão com confiança \n1-α e poder 1-β. \n \n \n3.2. Métodos \n3.2.1. Coleta de amostras \nForam coletados, por punção venosa periférica de antebraço , 4 mL de \nsangue total em tubo com EDTA e armazenad os em geladeira a 4  ºC para \nposterior processamento. \n \n3.2.2. Extração de DNA \nA extração do DNA foi realizada pelo processo de Salting-out, de acordo \ncom protocolo previamente publicado (44), à medida que as amostras foram \ncoletadas. O DNA extraído foi eluído em tampão de Tris-EDTA, quantificado em \nespectrofotômetro Nanodrop 2.000 (Thermo Fisher), aliquotado e armazenado \nem microtubos a temperatura de -20 °C para posterior sequenciamento e análise \nde polimorfismos. \n \n( ) ( )\n( )\n2\n21\n2211\n2\nβα/2\npp\n)p(1p)p(1px ZZn\n-\n-+-+=\n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n35 \n \n3.2.3. Amplificação do mtDNA \nA região controladora do mtDNA foi amplificada e analisada em todas as \namostras para construção das sequências, análise dos polimorfismos dessa \nregião, composição dos haplótipos e classificação dos respectivos haplogrupos \nmitocondriais. \nOs DNAs foram submetidos a uma única reação de PCR para amplificação \nda sequência do nucleotídeo 15.879 ao 727, contendo 1.417 pb, abrangendo as \ntrês regiões de interesse (HV1, HV2 e HV3).  Os componentes, bem como as \ncondições de ciclagem necessárias para realização da reação de PCR, estão \ndescritos nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Os primers utilizados (Invitrogen \nLife Technologies) foram o L15.879 e H727  e suas respectivas sequências estão \ndescritas na Tabela 3. Após este procedimento, foi realizada a purificação dos \nprodutos de PCR com a utilização de Exonuclease I  e Shrimp Alkaline \nPhosphatase (EXO/SAP, Thermo Fisher Scientific), segundo recomendações do \nfabricante. \n \nTabela 1 - Volume e concentrações dos reagentes utilizados na reação de cadeia da polimerase \n(PCR) para amplificação da região controladora do DNA mitocondrial  \nComponentes Concentração \nVolume  \n(uL) \nDNA  50 ng/uL 2 \nPrimer Forward (F) 2,5 pmol/uL 0,4 \nPrimer Reverse (R) 2,5 pmol/uL 0,4 \ndNTP 1,25 mM 0,8 \nEnzima Taq DNA Polimerase 5U/uL 0,15 \nTampão da Enzima 10x 1 \nMgCl2 50 mM 0,3 \nÁgua ultrapura - 4,95 \nDNA: ácido desoxirribonucleico ; dNTP: desoxirribonucleotídeo tri -fosfatado; MgCL2: cloreto de \nmagnésio \n \n  \n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n36 \n \nTabela 2 - Condições de temperatura , tempo  e número de ciclos da reação de cadeia da \npolimerase (PCR) utilizadas para amplificação da região controladora do DNA mitocondrial  \nEtapas \nTemperatura \n(°C) \nTempo \n(min) \nCiclos \n(n) \nDesnaturação inicial 95 1 1 \nDesnaturação 95 1 \n36 Anelamento 60 1 \nExtensão 72 1 \nExtensão Final 72 7 1 \nMin: minutos; n: número de ciclos; °C: graus Celsius. \n \n3.2.4. Reação de sequenciamento \nOs produtos de PCR foram sequenciados com a utilização do BigDye \nTerminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA), \nconforme protocolo do fabricante.  As amostras foram sequenciadas nas duas \ndireções, forward e reverse, utilizando-se os mesmos primers da reação de PCR, \nL15.879 e H727, respectivamente. Nas amostras que apresentaram \nheteroplasmia de comprimento nas regiões HV1 ou HV2 foram usados \nadicionalmente os primers H16.548 e L16.413 (Tabela 3), respectivamente, em \numa nova reação de sequenciamento para garantir a leitura de todas as bases \ndessas regiões. \nApós as reações de sequenciamento, foi realizada eletroforese capilar com \na utilização do sequenciador automático ABI3130 ( Applied Biosystems, Foster \nCity, CA). \n \n  \n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n37 \n \nTabela 3 - Primers utilizados no estudo para as reações de PCR e sequenciamento da região \ncontroladora do DNA mitocondrial  \nPrimer Região Sequência Direção \nL15.879 HV 1 5’-AATGGGCCTGTCCTTGTAGT-3’ Foward \nH16.548 HV 1 5’-GGGAACGTGTGGGCTATTTA-3’ Reverse \nH727 HV 3 5’-AGGGTGAACTCACTGGAACG-3’ Reverse \nL16.413 HV 2 5’-TGAAATCAATATCCCGCACA-3’ Foward \n \n As sequências individuais foram alinhadas e comparadas com a \nsequência padrão Revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) (21) \nutilizando o programa BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). \nOs polimorfismos são apresentados como sendo diferenças em relação à \nsequência referência rCRS. Todos os polimorfismos observados só foram \nconsiderados reais quando confirmados pelo  sequenciamento da fita reversa  e \nnomeados de acordo com as recomendações (18; 45-47). \nPara definição final do haplótipo foi utilizado o programa Haplosite \n(http://www.haplosite.com/haplosearch) e, a partir dos haplótipos finais \nindividuais, foi possível a classificação dos haplogrupos mitocondriais, utilizando \no aplicativo Haplogrep (http://haplogrep.uibk.ac.at). Esse aplicativo é baseado \nem dados do site Phylotree, que utiliza algoritmos para a classificação \nautomática dos haplogrupos mitocondriais.  O programa apresenta como \nresultado a posição filogenética do respectivo haplogrupo, em forma de árvores \nfilogenéticas, proporcionando assim, uma explicação detalhada de como e \nporque o indivíduo foi classificado naquele haplogrupo (48). \nPara as análises das frequências dos polimorfismos encontrados e para \nconferir a existência de seus relatos anteriores, foi consultado o banco de dados \ndo genoma mitocondrial humano, MITOMAP (24). Esse banco relata dados \npublicados e não publicados sobre as variações do mtDNA. \nO sequenciamento e a análise dos polimorfismos da região controladora do \nmtDNA compreendendo as regiões HV1, HV2 e HV3 foram realizados em todas \nas amostras. \n \n\nMarina de Paula  Andres  CASUÍSTICA E MÉTODOS  \n \n38 \n \n3.2.5. Análise estatística \n  As variáveis qualitativas foram descritas segundo grupos com uso de \nfrequências absolutas e relativas e foi verificada a associação com os grupos \ncom uso de testes qui-quadrado, teste da razão de verossimilhanças  ou teste \nexato de Fisher. As variáveis contínuas foram descritas segundo grupos com uso \nde medidas resumo (média e desvio padrão) e comparadas entre os grupos com \nuso do teste T-Student ou teste Mann-Whitney  (43). Foram considerados \nestatisticamente significantes os valores de p menores que 0,05. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4. RESULTADOS \n \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n40 \n4. RESULTADOS \n4.1. Avaliação Clínica \nForam incluídas 90 pacientes no grupo endometriose (EDT)  e 92 no grupo \ncontrole (CT). A média etária das pacientes foi de 39,2 ± 6,2 anos no grupo EDT \ne de 40,1 ± 9,8 anos no grupo CT. Os grupos foram semelhantes quanto à idade, \ngrau de instrução e cor de pele autodeclarada (Tabela 4). \nAs mulheres incluídas nos grupos endometriose eram, em sua maioria, \ncasadas ou amasiadas ( 69,8%), de pele branca (49,4%)  e sem comorbidades \n(63,3%). O grupo controle foi composto, em sua maioria, de mulheres casadas \nou amasiadas (65,2%), de pele parda (46,2%) e sem comorbidades (64,1%). As \nprincipais comorbidades observadas foram hipertensão arterial ( 17,8% grupo \nendometriose vs. 21,7% grupo controle, respectivamente), diabetes melito tipo 2 \n(2,2% vs. 4,3%) e hipotireoidismo (3,3% vs. 1,0%). Quando comparadas ao \ngrupo controle, as mulheres do grupo endometriose apresentaram menor \nnúmero de gestações (1,1 ± 1,4  vs. 2,0 ± 1,7 ; p<0,001, respectivamente).  No \ngrupo controle, as pacientes usavam menos métodos contraceptivos hormonais, \nem comparação ao grupo endometriose (29,7% versus 44,9%; p = 0,034; Tabela \n4). \n \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n41 \nTabela 4 - Dados demográficos e clínicos das pacientes incluídas no estudo no s grupos controle \n(CT) e endometriose (EDT)  \nVariável \nGrupo, n (%) \nTotal p \nControle (n=92) EDT (n=90) \nEstado civil     \nSolteira 27 (29,3) 21 (23,6) 48 (26,4) \n0,1161 \nCasada/ Amasiada  60 (65,2) 62 (69,7) 122 (67,0) \nSeparada 2 (2,2) 6 (6,7) 8 (4,4) \nViúva 3 (3,3) 0 (0) 3 (1,7) \nInstrução     \n1º Grau 21 (22,8) 18 (20,2) 39 (21,5) \n0,1781 2º Grau 51 (55,4) 40 (44,9) 91 (50,3) \nSuperior 20 (21,7) 31 (34,8) 51 (28,2) \nCor de pele     \nBranca 36 (39,6) 44 (49,4) 80 (44,4) \n0,6051 \nParda 42 (46,2) 35 (39,3) 77 (42,8) \nNegra 12 (13,2) 9 (10,1) 21 (11,7) \nAmarela 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) \nAnticoncepcional hormonal  27 (29,7) 40 (44,9) 67 (37,2) 0,0342 \nSem comorbidades  59 (64,1) 57 (63,3) 116 (63,7) 0,9112 \nTabagismo 9 (9,9) 5 (5,6) 14 (7,8) 0,2852 \nAF de endometriose  3 (3,3) 8 (9) 11 (6,1) 0,1112 \nAF: antecedente familiar. 1Teste da razão de verossimilhanças; 2Teste qui-quadrado. \n \nForam incluídas no grupo controle mulheres submetidas à cirurgia por \nmioma uterino (47,8 %, n = 44), laqueadura tubária (3 2,6%, n = 30), teratoma \novariano (14,1%, n = 13), cistoadenoma ovariano (3,3%, n = 3) e hidrossalpinge \n(2,2%, n = 2). No Gráfico 1 estão representadas as pacientes do grupo \nendometriose por tipo e estádio da ASRM da doença (2). \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n42 \nGráfico 1 - Classificação da American Society for  Reproductive Medicine  e por tipo de lesão \ndas pacientes incluídas no grupo endometriose (n= 90) \nASRM: American Society for Reproductive Medicine (2).  \nFonte: Departamento de Ginecologia e Obstetrícia , FMUSP. \n \nAs pacientes do grupo endometriose apresent aram como principal \nsintoma a dismenorreia (73,3%), seguido de dor pélvica crônica (56,7%). Os \nsintomas álgicos típicos da doença ocorreram em maior frequência no grupo \nEDT quando comparados ao grupo CT  para todos os sintomas avaliados . A \ndismenorreia foi classificada como severa (EVA ≥ 7)  em maior número de \nmulheres no grupo endometriose quando comparadas ao grupo controle (62,2% \nvs. 41,8%, p = 0,006). Os resultados se encontram resumidos na Tabela 5. \n  \n0% \n10% \n20% \n30% \n40% \n50% \n60% \n70% \n18\n0\n36 36\n17\n3\n70\nASRM\n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n43 \n \nTabela 5 - Quadro clínico das pacientes incluídas nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT) \nSintoma \nGrupo, n (%) \nTotal p* \nCT (n=92) EDT (n=90) \nInfertilidade 5 (5,5) 23 (25,8) 28 (15,6) <0,001 \nDismenorreia (EVA ≥ 7) 38 (41,8) 56 (62,2) 94 (51,9) 0,006 \nDispareunia de \nprofundidade \n28 (30,8) 48 (53,3) 76 (42) 0,002 \nDor pélvica crônica 21 (23,1) 51 (56,7) 72 (39,8) <0,001 \nAlterações intestinais 0 (0) 21 (23,3) 21 (11,6) <0,001 \nAlterações urinárias 2 (2,2) 9 (10) 11 (6,1) 0,028 \nEVA: escala visual analógica  de dor. *Teste qui-quadrado. \n \n4.2. Análise Genética \nForam observados 205 polimorfismos diferentes na região controladora do \nmtDNA nas amostras avaliadas. Destes, 85,3% estavam localizados nas regiões \nhipervariáveis: 120 (58,5%) na HV1, 35 (17,0%) na HV2 e 20 (9,7%) na HV3 \n(Apêndices A e B). \nAs heteroplasmias encontradas est ão resumidas na Tabela 6. Foram  \nobservadas heteroplasmias de ponto em dois indivíduos do grupo endometriose \ne dois do grupo controle, todas na posição 73 (A/G), sem diferença entre os \ngrupos (2,2% vs. 2,2%, respectivamente; p > 0,999). A heteroplasmia de \ncomprimento foi a forma mais comum das heteroplasmias na s mulheres \nincluídas. Na região HV1, a transição de T para C na posição 16.189 (T16.189C) \nocorreu em 43,3% (n = 39) das pacientes no grupo endometriose e 3 4,0% (n = \n37) no grupo controle, sem diferença estatisticamente significante (p = 0,450). A \ncombinação do polimorfismo T16.189C com a inserção de Cs na posição 16.193 \nfoi também semelhante entre os grupos avaliados  (Tabela 6 , Figura 8). Nas \nregiões HV2 e HV3 também foram observadas heteroplasmias de comprimento, \nnas posições 310, 315, 523 e 524, com frequências semelhantes entre os grupos \navaliados (Tabela 6). Alguns exemplos estão nas Figuras 9 e 10 . Na posição \n573, a inserção de 2 citosinas foi observada em maior frequência no grupo \ncontrole (29,3%) em comparação ao grupo endometriose (5,6%). \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n44 \n \nTabela 6 - Análise estatística das h eteroplasmias da região controladora  do DNA mitocondrial  \nencontradas nos grupos controle (CT) e endometriose (EDT)  \nHeteroplasmia  Grupo, n(%) \np* \nTipo Região Localização  CT (n=92) EDT (n=90) \nPonto HV3 73 A/G  2 (2,2) 2 (2,2) >0,999 \nComprimento HV1 16.182C  3 (3,3) 4 (4,4) 0,719 \n 16.189C  34 (37,0) 39 (43,3) 0,450 \n 16.188C.1C  2 (2,2) 7 (7,8) 0,098 \n 16.188C.2C  24 (26,1) 22 (24,4) 0,865 \nComprimento HV2 310.1C  44 (47,8) 48 (53,3) 0,463 \n 310.2C  5 (5,4) 10 (11,1) 0,187 \n 315.1C  89 (96,7) 90 (100) 0,246 \nComprimento HV3 524.1AC  1 (1,1) 2 (2,2) 0,619 \n 524.2AC  0 (0) 2 (2,2) 0,243 \n 523del  35 (38,0) 31 (34,4) 0,646 \n 524del  35 (38,0) 31 (34,4) 0,646 \n 573.1C  4 (4,3) 0 (0) 0,121 \n 573.2C  27 (29,3) 5 (5,6) <0,001 \n*Teste Qui-quadrado. \n \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n45 \n \nFigura 8 - Eletroferogramas de indivíduos com heteroplasmia de comprimento na região 16.193 \ne transição no nucleotídeo 16.189  \n \nAs setas pretas indicam a heteroplasmia de comprimento e as setas vermelhas a heteroplasmia \nde ponto. \nA: inserção de 1C na posição 16.193. B: inserção de 2Cs na posição 16.193. \nFonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho,  \nFMUSP. \n \nFigura 9 - Eletroferogramas apresentando indivíduos com heteroplasmia de comprimento na \nregião HV2, posição 309 e inserção de 1C na posição 315  \n \nA: inserção de 1C na posição 309 e 1C na posição 315. B: inserção de 2C s na posição 309 e \n1C na posição 315.  \nFonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho,  \nFMUSP. \n \nFigura 10 - Heteroplasmia de comprimento na região HV3, entre os nucleotídeos 515 e 524  \n \nA: Indivíduo com adição de um AC na posição 524 (AC 6). B: Indivíduo com  adição de 2 ACs na \nposição 524 (AC7). \nFonte: Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho,  \nFMUSP. \n \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n46 \nUma paciente com diagnóstico de teratoma ovariano apresentou uma \nduplicação de 15 nucleotídeos na região HV 1, da posição 16.032 à  16.118 \n(TCTCTGTTCTTTCAT), representada na Figura 11, pertencente ao haplogrupo \nafricano L1C2. \n \n \n \n  \nFigura 11 - Duplicação de 15 nucleotídeos entre as posições 16.018 e 16.032  do DNA \nmitocondrial \n \n \nA: Eletroferograma de um indivíduo mostrando a sequência normal entre as posições 16.018 e \n16.032 (colchetes). B: Eletroferograma mostrando a sequência  de nucleotídeos de uma paciente \ncom teratoma ovariano com duplicação de 15 nucleotídeos entre as posições 1 6.018 e 16.032 \n(colchetes). \n \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n47 \nNa Tabela 7 estão destacados os polimorfismos com diferença \nestatisticamente significante entre os grupos: 4 deles relacionados com a \npresença de endometriose (G185A, T236C, G499A e T16.217C) e um (T146C) \nassociado à ausência de doença. Além disso, encontram-se listados a \nfrequência dos polimorfismos A189G e 310C , relacionados previamente à \nendometriose por outros autores, que, no entanto, tiveram frequência \nsemelhante entre os grupos em nossa amostra. \n \nTabela 7 - Polimorfismos na região controladora do DNA mitocondrial  nos grupos controle (CT) \ne endometriose (EDT) \nPosição rCRS SNP \nGrupo, n(%) \n Total, \nn(%) \n \np* CT (n=92) EDT (n=90) \n146 T C 30 (32,6) 17 (18,9) 47 (25,8) 0,042 \n185 G A 0 (0) 6 (6,7) 6 (3,3) 0,013 \n236 T C 0 (0) 5 (5,6) 5 (2,7) 0,028 \n499 G A 4 (4,3) 12 (13,3) 16 (8,8) 0,038 \n16.217 T C 5 (5,4) 13 (14,4) 18 (9,9) 0,049 \n189 A G 11 (12) 12 (13,3) 23 (12,6) 0,826 \n310 - 1C 44 (47,8) 48 (53,3) 92 (50,5) 0,463 \n310 - 2C 5 (5,4) 10 (11,1) 15 (8,2) 0,187 \n*Teste exato de Fisher; rCRS: sequência referência de Cambridge revisada (21); SNP: single \nnucleotide polymorphism ou polimorfismo de base única. \n \nNa amostra total foram encontrados 182 haplótipos. Desses, 180 foram \núnicos e 2 comuns a mais de um indivíduo. A distribuição dos  haplogrupos \nmitocondriais foi semelhante entre os grupos e est á resumida na Tabela 8. Os \nresultados mostraram que das 92 pacientes do grupo controle , 48,9% \npertenciam a haplogrupos africanos, 30,4% a haplogrupos ameríndios, 19,6%  \neuropeus e 1,1%  asiáticos. No grupo endometriose, a maioria das pacientes \napresentou haplogrupo africano (40,0%), seguidas do ameríndio (33,3%), \neuropeu (21,1%) e asiático (5,6%). \n \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n48 \nTabela 8 - Distribuição e análise estatística dos haplogrupos mitocondriais nos grupos controle \n(CT) e endometriose (EDT) \nHaplogrupo \nGrupo, n(%) \nTotal p* \nCT (n=92) EDT (n=90) \nAfricano 45 (48,9) 36 (40) 81 (44,5) \n0,263 \nAmeríndio 28 (30,4) 30 (33,3) 58 (31,9) \nEuropeu 18 (19,6) 19 (21,1) 37 (20,3) \nAsiático 1 (1,1) 5 (5,6) 6 (3,3) \n*Teste da razão de verossimilhanças . \n \nA distribuição dos subhaplogrupos mitocondriais foi semelhante entre os \ngrupos endometriose e controle ( Apêndice C). No grupo endometriose, não \nhouve diferença nos haplogrupos entre os estádios da ASRM e os tipos de lesão \n(Tabela 9). Na avaliação do grupo controle, a distribuição também foi semelhante \npor tipo de doença tratada ou laqueadura tubária (Tabela 10). \n \nTabela 9 - Distribuição dos h aplogrupos mitocondriais por estádio e tipo de lesão no grupo \nendometriose \n \nVariável \n \nHaplogrupo, n(%) \nTotal \n(n=90) \np* \n \nAfricano \n(n=36) \nAmeríndio \n(n=30) \nEuropeu \n(n=19) \nAsiático \n(n=5) \nEstádio ASRM       \nI - II 6 (16,7) 4 (13,3) 7 (36,8) 1 (20) 18 (20) \n0,255 \nIII - IV 30 (83,3) 26 (86,7) 12 (63,2) 4 (80) 72 (80) \nTipo EDT       \nSuperficial 5 (13,9) 5 (16,7) 6 (31,6) 1 (20) 17 (18,9)  \nOvariana 1 (2,8) 0 (0) 1 (5,3) 1 (20) 3 (3,3) 0,310 \nProfunda 30 (83,3) 25 (83,3) 12 (63,2) 3 (60) 70 (77,8)  \nASRM: American Society for Reproductive M edicine; EDT: endometriose; *Teste da razão de \nverossimilhanças. \n  \n\nMarina de Paula Andres   RESULTADOS \n \n \n \n49 \nTabela 10 - Distribuição dos haplogrupos mitocondriais por subgrupo no grupo controle \nDiagnóstico \nHaplogrupo, n(%) \nTotal \n(n=92) \np* Africano \n(n=45) \nAmeríndio \n(n=28) \nEuropeu \n(n=18) \nAsiático \n(n=1) \nLaqueadura 15 (33,3) 6 (21,4) 8 (44,4) 1 (100) 30 (32,6) \n0,375 \nMioma 23 (51,1) 14 (50) 7 (38,9) 0 (0) 44 (47,8) \nTeratoma 5 (11,1) 6 (21,4) 2 (11,1) 0 (0) 13 (14,1) \nCistoadenoma 2 (4,4) 0 (0) 1 (5,6) 0 (0) 3 (3,3) \nHidrossalpinge 0 (0) 2 (7,1) 0 (0) 0 (0) 2 (2,2) \n*Teste da razão de verossimilhanças .     \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5. DISCUSSÃO \n \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n51 \n \n5. DISCUSSÃO \nEndometriose é uma doença ginecológica benigna, caracterizada por \nsintomas dolorosos intensos, relacionados ao período menstrual  (49). Há \nevidências crescentes de que o estresse oxidativo está envolvido na sua \npatogênese (11; 12). Dessa forma, os polimorfismos na região controladora  do \nmtDNA podem levar à alteração na replicação e  transcrição dos genes \nmitocondriais, afetando a função mitocondrial e a geração intracelular de \nespécies reativas de oxigênio  (12). Estudos recentes sugerem que os \npolimorfismos do mtDNA estão relacionados à endometriose (17; 36; 37). \nNo presente trabalho realizamos o sequenciamento e a identificação dos \npolimorfismos e haplogrupos da regiã o controladora do mtDNA em mulheres \ncom e sem endometriose. \n \nDados clínicos e epidemiológicos \nEm nosso estudo, incluímos pacientes com endometriose confirmada \nhistologicamente e, em aproximadamente 70% dos casos , o acometimento era \ndo tipo profundo, sendo 70% estádios III-IV da ASRM (2).  \nOs sintomas foram prevalentes e acometeram a maioria das pacientes \ncom endometriose incluídas, sendo a dismenorreia o mais importante deles, \nafetando 73,3% das mulheres, com intensidade classificada como severa em \n62,2% dos casos. Todos os sintomas dolorosos tipicamente relacionados à \nendometriose foram mais prevalentes no grupo EDT em comparação ao grupo \ncontrole (4). Alguns autores, de forma concordante com nosso trabalho, já \ndemonstraram a correlação da presença e intensidade dos sintomas com a  \ndoença, podendo chegar a uma p revalência de 62,9% de dismenorreia nas \npacientes com endometriose profunda (4; 50; 51).  \nEm casais inférteis, 54% podem apresentar endometriose e, entre  \nmulheres com endometriose, a prevalência de infertilidade é de \naproximadamente 35% (1; 52; 53). Esses resultados são comparáveis aos \nobtidos em nossa amostra, na qual o grupo endometriose apresentou maior \nfrequência de infertilidade conjugal (25,8% vs. 5,5%) e número de gestações \nmenor (1,1 ± 1,4 vs. 2,0 ± 1,7 gestações) em comparação ao grupo controle.  \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n52 \n \nO tratamento dos sintomas da endometriose baseia -se no bloqueio \novulatório com o uso de contraceptivos hormonais, buscando, assim, a \nsupressão hormonal dos focos de doença e diminuição da inflamação local (54). \nO principal objetivo desse tratamento é a melhora da qualidade de  vida, \nrelacionada à melhora do quadro clínico, estabilização da lesão e diminuição da \ntaxa de recorrência da doença. O contraceptivo hormonal é a primeira linha n o \ntratamento dos sintomas dolorosos relacionados à endometriose, tem baixo \ncusto e é de fácil acesso, além de promover o planejamento familiar (49). Dessa \nforma, é esperada uma alta prevalência do uso de tratamento hormonal nas \npacientes com endometriose que, em nossa casuística, foi observado em quase \nmetade das pacientes com a doença. \nQuanto ao grupo controle, este foi representado em 48% por mulheres \nportadoras de mioma uterino e 50% por laqueadura tubária ou cistoadenoma de \novário. Os miomas são os tumores ginecológicos mais frequentes em mulheres \nem idade reprodutiva e podem acometer até 77% das mulheres (55). Dentre os \nfatores de risco no seu desenvolvimento est ão etnia, idade e obesidade  (55). \nTipicamente, esses tumores são hormônio-dependentes, surgindo durante o \nperíodo reprodutivo. Estudos GWAS (genome-wide association studies ) \ndemonstraram que genes nucleares estão associados aos miomas uterinos; \nporém, até o presente momento, nenhum polimorfismo ou alteração na \nexpressão do mtDNA foi identificado (55).  \nPejić et al. (56), em 2009, compararam o stress oxidativo em amostras de \nendométrio de pacientes com miomas uterinos, pólipos endometriais, hiperplasia \nde endométrio e câncer endometrial . Os resultados mostraram que os miomas \nuterinos têm atividade oxidativa diminuída e atividade anti-oxidativa aumentada \nem relação às doenças pré-malignas e malignas (56). De forma inversa, estudo \nde Ota H et al. (57), mostrou que a atividade da enzima catalase é aumentada \nno endométrio tópico e nas lesões de pacientes com endometriose e \nadenomiose, mostrando um aumento da atividade oxidativa. Dessa forma, tendo \ncomo limitação o número de pacientes submetidas a laqueadura tubária em \nnosso serviço, o fato de que não há evidência de que os miomas uterinos estão \nrelacionados ao stress oxidativo e baseado na análise por subgrupo do grupo \ncontrole, que não demonstrou diferença significativa na frequência de \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n53 \n \npolimorfismos e haplogrupos mitocondriais (Tabela 10), a inclusão de pacientes \nsubmetidas à cirurgia por leiomioma uterino  no grupo controle parece se \njustificar. \n \nPolimorfismos do DNA mitocondrial \nOs polimorfismos mitocondriais herdados, como aqueles que definem os \nhaplogrupos mitocondriais, podem afetar diretamente o metabolismo oxidativo \nintracelular e a susceptibilidade a doenças (58). Em nosso estudo, encontramos \ndiferença significativa entre as mulheres com e sem endometriose e a presença \ndos polimorfismos T146C, G185A, T236C, G499A, 573.2C e T16.217C, os quais \nserão detalhados a seguir. \n \nPosição 146 \nO polimorfismo T146C é característico do haplogrupo mitocondrial \nafricano L2 e foi observado em maior frequência no grupo controle (32,6%), em \ncomparação ao grupo endometriose (18,9%; p = 0,042). Govatati et al., em 2013 \n(1), reportaram frequência também maior no grupo controle (22.7%) em \ncomparação ao grupo endometriose (15.8% ), porém sem diferença \nestatisticamente significante. \nAlguns estudos já relacionaram a presença desse polimorfismo como fator \nde risco independente em algumas neoplasias , como linfoma não-Hodking e \ncarcinoma hepatocelular  (59-61). No entanto, no que concerne doenças \nginecológicas, esse é o primeiro relato da literatura. Apesar de ser considerada \numa doença benigna, a endometriose muitas vezes tem um comportamento \nsemelhante aos tumores malignos, como invasão e destruição de tecidos, \ndisseminação linfo-hemática e implantação à distância (62). Além disso, as \nlesões de endometriose podem ter expressão desregulada de genes como o \nConnective Tissue Growth Factor, p53 e MYC, os quais já foram descritos em \nvias de sinalização do câncer, atuando na  adesão celular, facilitação de \nmetástases e contribuição ao processo de malignização das células (63). \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n54 \n \nPosição 185 \nO polimorfismo G185A foi observado em nossa amostra em 6 (6,7%) \nmulheres com endometriose e nenhuma paciente d o grupo controle (p = 0,01). \nDe forma semelhante, Govatati et al . (17) reportaram uma baixa frequência \ndesse polimorfismo, identificado  em apenas 0,6% das pacientes  com \nendometriose (1/152) e nenhuma do grupo controle (0/150). \nO polimorfismo G185A pertence aos haplogrupos J1b1a1d e J1C. O \nhaplogrupo J é identificado em aproximadamente 12% das populações nativas \nda Europa, sendo o subhaplogrupo J1 o mais frequente, em torno de 80%, e \nespalhado uniformemente por todo o continente europeu (64). O polimorfismo \nG185A não foi associado a nenhuma doença até o presente momento, no \nentanto, o haplogrupo mitocondrial J1 já foi relacionado com o aumento de 2,4 \nvezes na incidência de diabetes melito tipo 2 e com o au mento da penetrância \nda Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (65; 66). \n \nPosição 236 \nO polimorfismo T236C foi observado apenas em  mulheres com \nendometriose em nosso estudo ( n = 5, 5,6%; p = 0,028). Esse polimorfismo é \ncaracterístico do haplogrupo mitocondrial L0 e já foi associado à Síndrome de \nLeigh, caracterizada pela deficiência isolada do Complexo I  da cadeia \nrespiratória mitocondrial (67). Não há dados na literatura que correlacionem esse \npolimorfismo com endometriose ou outras doenças ginecológicas até o presente \nmomento. \n  \nPosição 499 \n A troca de G por A na posição 499 esteve significativamente associada à \npresença de endometriose em noss o trabalho (13,3% versus 4,3%; p = 0,03). \nEsse polimorfismo é característico do haplogrupo mitocondrial U4, concentrado \nprincipalmente nas populações  europeias. Embora o polimorfismo G499A não \ntenha sido descrito em nenhuma doença até o momento, o haplogru po U4 foi \nrelacionado com maior proteçã o contra acidente vascular cerebral (68) e \ndiminuição da velocidade de progressão d a Síndrome da Imunodeficiência \nAdquirida (69). \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n55 \n \nPosição 573  \n Em nossa amostra, observamos frequência menor da inserção de duas \ncitosinas na posição 573 (573.2C) em mulheres com endometriose em relação \nao grupo controle (5,6% vs. 29,3%; p <0,001). Nessa posição, tipicamente pode \nocorrer a heteroplasmia de comprimento, definida pela co existência de pelo \nmenos duas populações de moléculas de mtDNA em um extrato de DNA que \ndiferem no número de nucleotídeos e, portanto, no s eu comprimento (23). Em \ngeral, as heteroplasmias são observadas em trechos homopoliméricos  que \nocorrem em grande frequência entre as posições 16,024–16,365, 73–340 e 438–\n574 (23).  \nA relevância biológica das heteroplasmias ainda não é completamente \ncompreendida. Sabe-se que os tecidos de um mesmo indivíduo podem \napresentar diferentes heteroplasmias de comprimento, o que poderia determinar \ndiferentes fenótipos. Além disso, o acúmulo de heteroplasmias ao longo das \ngerações pode levar ao aparecimento de determinadas doenças, como miopatia \nmitocondrial ácido lática e episódios semelhantes a ac idente vascular cerebral, \nsíndrome de Kearns–Sayre e epilepsia mioclônica com fibras rotas vermelhas  \n(70).  \nFuturamente, a avaliação destas heteroplasmias em amostras de \nendométrio tópico e ectópic o poderá trazer novas informações para a \npatogênese da endometriose. \n \nPosição 16217 \n O polimorfismo T16.217C pertencente ao haplogrupo B4 , característico \ndo sul da Ásia,  foi observado em frequência maior no grupo endometriose \n(14,4%) em comparação ao controle (5,4%; p = 0,049). Em estudo de 2013, com \npopulação coreana (17), este mesmo polimorfismo foi observado em frequência \nmenor que a nossa: 1,9% das pacientes com endometriose e 0,7% daquelas \nsem a doença, sem diferença significante entre os grupos. \n Outras doenças relacionadas ao stress oxidativo, como diabetes melito , \ntambém já foram relacionadas à presença do T16.217C (71). \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n56 \n \nPosição 10.018 \nObservamos uma duplicação de 15 pb potencialmente patogênica na \nregião HV1 do mtDNA, entre os nucleotídeos 16.018 e 16.032, em uma paciente \ndo grupo controle com teratoma ovariano maduro. Essa duplicação engloba \nparte do gene mitochondrially encoded tRNA proline (MT-TP gene), que é \ncompreendido entre as posições 15.955 e  16.023 do mtDNA e que codifica o \nMT-TP, um RNA pequeno, não codificador, de 68 nucleotídeos (19; 26). Outras \nmutações nesse gene já foram reportadas em pacientes com e pilepsia \nmioclônica com fibras rotas vermelhas (72), retinose pigmentar (73),  surdez (73), \nmiopatias (74) e cardiomiopatia dilatada (26).  \nAs duplicações mitocondriais acometem principalmente a região \ncontroladora (D-loop). A mais comum é uma duplicação de 260 pb entre os \nnucleotídeos 308 e 567, reportada em pacientes com miopatia mitocondrial (75). \nDuplicações já foram relatadas também em pacientes com diferentes tipos de \ncâncer, dentre eles gástrico, mamário, hepatocelular, cólon e pulmonar  (76), \nalém de oftalmoplegia crônica progressiva externa (77; 78), síndrome de Kearns-\nSayre (79) e síndrome de Pearson (80). \nOs teratomas são tumores nos quais estão presentes os tipos celulares \nrepresentativos das três camadas germinativas  (ectoderme, mesoderme e \nendoderme) e são as neoplasia ovarianas benignas mais comuns, com \nincidência de 20 a 25%  (81; 82). Além disso, a capacidade de formação de \nteratomas representa um marcador da pluripotência no estudo de indução da \nformação de células tronco pluripotentes (iPSCs), que são derivadas de células \nadultas somáticas (83; 84). As iPSCs são semelhantes às células -tronco \npluripotentes naturais em muitos aspectos, tais como a expressão de genes e \nproteínas, padrões de metilação da cromatina e tempo de duplicação (85). \nExistem poucos estudos sobre o papel do metabolismo mitocondrial n o \nmecanismo biológico das células-tronco e estes demonstraram que aquelas \ncélulas que apresentam baixa taxa de consumo de oxigênio a nível mitocondrial \ntem uma capacidade reduzida de formar teratomas (85; 86). \nA duplicação encontrada em nosso trabalho é inédita em pacientes com \nteratoma ovariano. Outrossim, já foi relatada previamente por nosso grupo em \num indivíduo com cardiomiopatia dilatada  (26). Ambos indivíduos foram \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n57 \n \nclassificados como pertencentes ao haplogroupo L1c2, de forma que a \nduplicação pode tratar-se de uma mutação rara por efeito fundador comum aos \ndois pacientes. \n \nPosições 189, 310 e 16.189 \nNo presente estudo não encontramos associação entre endometriose e \nos polimorfismos T16.189C, A189G e 310C, previamente reportada nas \npopulações coreana e indiana (17; 36).  \nA frequência do polimorfismo A189G em nossa amostra foi de 13,3%  no \ngrupo endometriose, enquanto na população indiana, essa frequência chegou a \n41% de mulheres com a doença (17). No grupo sem endometriose, a frequência \nque observamos do A189G foi de 12,0%, pouco menor do que a reportada por \noutros autores, de 17% (17). \nA inserção de uma citosina na posição 310 (310C) foi observada no nosso \nestudo em 53,3% das pacientes incluídas com endometriose e 47,8% daquelas \nsem endometriose, sem diferença estatisticamente significante. Essa frequência \nfoi diferente daquela reportada por Govatati et al., em 2013, que observaram \nmaior prevalência desse polimorfismo em pacientes com a doença ( 33,5% vs. \n22,7%; p<0,05) (17) \nA substituição do nucleotídeo T pelo C na posição 16.189 não esteve \nassociada a presença de endometriose em nossa casuística, resultado oposto \ndaquele encontrado por outros autores (17; 36). A frequência desse polimorfismo \nem nossa amostra de mulheres com endometriose foi de 43,3%, semelhante à \nreportada na população coreana (45,9%), porém maior que a  reportada  na \npopulação indiana (27,0%). Por outro lado, nas mulheres sem endometriose, \nencontramos frequência de 37,0%, superior à reportada em ambos os estudos \n(34,7% e 11,3%, respectivamente) (17; 36).  \n \nHaplogrupos mitocondriais \n A ancestralidade mitocondrial é diretamente relacionada com o proc esso \nde migração das populações, de  forma que se observa uma distribuição não \nhomogênea nas diferentes regiões do Brasil, fruto do processo de colonização. \nNa região Nordeste predomina a ancestralidade mitocondrial africana, resultado \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n58 \n \nda imigração dos escravos africanos; na região Norte, predomina a \nancestralidade ameríndia, proveniente da ocupação dos povos indígenas sul-\namericanos; enquanto na s regiões Sul e Sudeste predomina a ancestralidade \neuropeia, proveniente dos colonos europeus (87-89). \nEm nosso trabalho, observamos maior prevalência do haplogrupo \nmitocondrial africano (44,5%), seguido do ameríndio (31,9%), europeu (20,3%) \ne asiático (3,3%). Essa proporção foi semelhante à relatada por outros autores \nem indivíduos brasileiros do estado de São Paulo (90-92). \n Não encontramos associação significativa de nenhuma das \nancestralidades ou haplogrupos mitocondriais com a presença de endometriose, \nestádio da ASRM ou por subtipo da doença (superficial, ovariana ou profunda). \nEsse resultado foi diferente do de Govatati et al., em população indiana, que \nencontraram uma frequência maior dos haplogrupos mitocondriais M5 e N em \nmulheres com endometriose em relação aos controles (37; 41). O haplogrupo \nM5 é específico do sul asiático e não foi observado em nenhuma paciente em \nnossa amostra, enq uanto o haplogrupo N é derivado do haplogrupo L3, \ndistribuído pelo norte da África, Eurásia e Oceania, e  foi observado em apenas \n6 pacientes (3,2%) em nossa casuística (93; 94). \n \nConsiderações finais  \n O presente estudo avaliou de forma inédita da associação dos \npolimorfismos e haplogrupos da região controladora do mtDNA com \nendometriose no Brasil. As limitações deste trabalho encontram-se \nprincipalmente na heterogeneidade do subgrupo das pacientes incluídas que, \npor serem recrutadas em um hospital terciário, no grupo endometriose incluíram \nem sua maioria doenças do tipo profundo e estádios avançados e, no grupo \ncontrole, incluiu doenças do trato genital feminino, como mioma uterino e \nteratoma ovariano em aproximadamente metade dos casos. \nOs resultados encontrados mostraram associação de determinados \npolimorfismos do mtDNA com a presença de endometriose em mulheres \nbrasileiras que diferiram, porém, de estudos realizados previamente em \npopulações homogêneas da Coreia e Índia. Vale ressaltar, que estudos \ngenéticos na população brasileira são particularmente desafiadores, uma vez \n\nMarina de Paula Andres   DISCUSSÃO \n \n59 \n \nque esta possui múltiplas ancestralidades e alta miscigenação. Tais resultados \ndíspares suscitam a questão de fisiopatologias diferentes, multifatoriais, \nconcorrendo para uma via final comum, a endometriose. Ademias, tendo em \nvista que até o presente momento poucos estudos foram conduzidos nessa \ntemática e que a frequência das mutacões do mtDNA são específicas para cada \nregião geográfica, para a generalização dos resultados, faz-se necessária a \navaliação do mtDNA em mulheres com endometriose em diferentes populações \ne regiões do Brasil e do mundo. Não obstante, na era da medicina de precisão, \ncaracterizada pelo uso de análises genômicas par a o desenvolvimento de \ndiagnósticos e tratamentos direcionados para cada paciente, estudos em \npesquisa básica são fundamentais não apenas para aprofundar nosso \nentendimento sobre a fisiopatologia de doenças complexas, como também para \nservir de fundamento para novos potencias alvos terapêuticos, dando a \nesperança aos nossos pacientes de sempre melhorar e direcionar seus \ncuidados, especialmente para uma doenç a prevalente e debilitante como a \nendometriose. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. CONCLUSÕES\n\nMarina de Paula Andres  CONCLUSÃO \n \n \n \n61 \n6. CONCLUSÕES \nOs polimorfismos G185A, T236C, G499A e T16217C da região \ncontroladora do DNA mitocondrial foram associados com a presença de \nendometriose em amostra de mulheres brasileiras, enquanto o s polimorfismos \nT146C e 573.2C  foram associados com a ausência da doença.  Não houve \ndiferença significativa entre a ancestralidade ou haplogrupos mitocondriais e a \npresença, estádio da ASRM ou tipo de endometriose. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nREFERÊNCIAS\n\nMarina de Paula Andres   REFERÊNCIAS \n \n \n \n63 \nREFERÊNCIAS*\n \n1. von Theobald P, Cottenet J, Iacobelli S, Quantin C. Epidemiology of \nEndometriosis in France: A Large, Nation -Wide Study Based on Hospital \nDischarge Data. Biomed Res Int. 2016;2016:3260952.  \n2. Revised American Society for Reproductive Medicine classificati on of \nendometriosis (1996). Fertil Steril. 1997; 67(5):817-21.  \n3. Nisolle M, Donnez J. Peritoneal endometriosis, ovarian endometriosis, and \nadenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entities. Fertil \nSteril. 1997; 68(4):585-96. \n4. Bellelis P, Dias JA Jr, Podgaec S, Gonzales M, Baracat EC, Abrão MS. \nEpidemiological and clinical aspects of pelvic endometriosis: a case series. 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Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose)  \n  \n\n\nMarina de Paula Andres   ANEXOS \n \n \n80 \n \n \nANEXO C - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de \nPesquisa (CAPPesq)  \n \n\n\nMarina de Paula Andres   ANEXOS \n \n \n81 \n \n \nConclusão do ANEXO C - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de \nProjetos de Pesquisa (CAPPesq)  \n \n  \n\n\nMarina de Paula Andres   ANEXOS \n \n \n82 \n \n \nANEXO D - Questionário para coleta de dados das pacientes incluídas no estudo  \n \n  \n\n\nMarina de Paula Andres   ANEXOS \n \n \n83 \n \n \nConclusão do ANEXO D - Questionário para coleta de dados das pacientes incluídas no \nestudo \n \n \n  \n\n\nMarina de Paula Andres   ANEXOS \n \n \n84 \n \n \nANEXO E - Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive \nMedicine em 1996 (2). \n \nEstadiamento da endometriose ASRM (1996) \nENDOMETRIOSE <1cm 1–3 cm > 3 cm \nPERITÔNIO \nSuperficial 1 2 4 \nProfunda 2 4 6 \nOVÁRIO D \nSuperficial 1 2 4 \nProfunda 4 16 20 \nOVÁRIO E \nSuperficial 1 2 4 \nProfunda 4 16 20 \nOBLITERACAO DO FUNDO DE SACO \nPOSTERIOR \nParcial Completa \n4 40 \nADERÊNCIAS <1/3 Envolvido 1/3–2/3 Envolvidos  > 2/3 Envolvidos \nOVÁRIO D \nVelamentosa 1 2 4 \nDensa 4 8 16 \nOVÁRIO E \nVelamentosa 1 2 4 \nDensa 4 8 16 \nTROMPA D \nVelamentosa 1 2 4 \nDensa 4* 8* 16 \nTROMPA E \nVelamentosa 1 2 4 \nDensa 4* 8* 16 \n \nEstádio I (mínima): 1 -5  Estádio II (leve): 6 -15 \nEstádio III (moderada): 16 -40 Estádio IV (severa): >40  \n*Se as fímbrias tubárias estiverem totalmente envolvidas por aderências, mude o escore para 16.  \nPorcentagem de implantes:  \nLesões vermelhas (claras, vermelhas, rosadas, em chama, vesículas): ___%  \nLesões brancas (brancas, amareladas, marrons, defeitos de peritônio): ___%  \nLesões pretas (pretas, depósitos de hemossi derina, azuis): ___%  \nEndometriose adicional : _________________________________________  \n \n  \n \n \nUsar em caso de trompas\ne ovários normaisE D\n Usar em caso de trompas\ne ovários anormaisE D\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAPÊNDICES\n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n86 \n \n \nAPÊNDICES \n \nAPÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 16024 \na 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle  \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n1.  16.031G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n2.  16.051G 3 (3,3) 4 (4,4) 7 (3,8) 0,719 \n3.  16.063C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n4.  16.067T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n5.  16.071T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n6.  16.073.1C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n7.  16.078T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n8.  16.086C 5 (5,4) 2 (2,2) 7 (3,8) 0,444 \n9.  16.087C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n10.  16.092C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n11.  16.093C 6 (6,5) 5 (5,6) 11 (6) >0,999 \n12.  16.097C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n13.  16.098G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n14.  16.104T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n15.  16.111T 11 (12) 4 (4,4) 15 (8,2) 0,104 \n16.  16.114A 3 (3,3) 1 (1,1) 4 (2,2) 0,621 \n17.  16.123A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n18.  16.124C 8 (8,7) 3 (3,3) 11 (6) 0,212 \n19.  16.126C 11 (12) 9 (10) 20 (11) 0,814 \n20.  16.129A 13 (14,1) 12 (13,3) 25 (13,7) >0,999 \n21.  16.129C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n22.  16.145A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n23.  16.148T 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 \n24.  16.153A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n25.  16.154C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n26.  16.162G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n27.  16.163G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n87 \n \n \nContinuação APÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das \nposições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n28.  16.168T 0 (0) 3 (3,3) 3 (1,6) 0,119 \n29.  16.171 DEL 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n30.  16.172C 6 (6,5) 10 (11,1) 16 (8,8) 0,306 \n31.  16.176T 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 \n32.  16.178C 1 (1,1) 3 (3,3) 4 (2,2) 0,365 \n33.  16.179T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n34.  16.182C 3 (3,3) 4 (4,4) 7 (3,8) 0,719 \n35.  18.182 DEL 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 \n36.  16.183C 10 (10,9) 16 (17,8) 26 (14,3) 0,208 \n37.  19183DEL 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n38.  16.184T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n39.  16.185T 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 \n40.  16.187T 14 (15,2) 10 (11,1) 24 (13,2) 0,512 \n41.  16.188T 14 (15,2) 10 (11,1) 24 (13,2) 0,512 \n42.  16.188G 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 \n43.  16.188 INS 1C 2 (2,2) 7 (7,8) 9 (4,9) 0,098 \n44.  16.188 INS 2C 24 (26,1) 22 (24,4) 46 (25,3) 0,865 \n45.  16.189C 34 (37) 39 (43,3) 73 (40,1) 0,450 \n46.  16.192T 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 \n47.  16.193T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n48.  16.197G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n49.  16.203G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n50.  16.207G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n51.  16.209C 4 (4,3) 2 (2,2) 6 (3,3) 0,682 \n52.  16.213A 5 (5,4) 1 (1,1) 6 (3,3) 0,211 \n53.  16.214T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n54.  16.215G 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 \n55.  16.217C 5 (5,4) 13 (14,4) 18 (9,9) 0,049 \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n88 \n \n \nContinuação APÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das \nposições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n56.  16.218T 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 \n57.  16.221T 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 \n58.  16.223T 69 (75) 55 (61,1) 124 (68,1) 0,056 \n59.  16.224C 1 (1,1) 4 (4,4) 5 (2,7) 0,208 \n60.  16.230G 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 \n61.  16.234T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n62.  16.235G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n63.  16.239T 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 \n64.  16.241G 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 \n65.  16.245T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n66.  16.246T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n67.  16.248T 3 (3,3) 0 (0) 3 (1,6) 0,246 \n68.  16.249C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n69.  16.256T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n70.  16.260T 0 (0) 4 (4,4) 4 (2,2) 0,058 \n71.  16.261T 2 (2,2) 2 (2,2) 4 (2,2) >0,999 \n72.  16.262T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n73.  16.263C 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n74.  16.264T 5 (5,4) 3 (3,3) 8 (4,4) 0,721 \n75.  16.265C 3 (3,3) 3 (3,3) 6 (3,3) >0,999 \n76.  16.266T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n77.  16.270T 8 (8,7) 3 (3,3) 11 (6) 0,212 \n78.  16.271C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n79.  16.274A 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n80.  16.278T 30 (32,6) 26 (28,9) 56 (30,8) 0,632 \n81.  16.284G 3 (3,3) 0 (0) 3 (1,6) 0,246 \n82.  16.286A 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 \n83.  16.286G 3 (3,3) 1 (1,1) 4 (2,2) 0,621 \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n89 \n \n \nContinuação APÊNDICE A - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das \nposições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle  \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n84.  16.286T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n85.  16.287T 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 \n86.  16.288C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n87.  16.290T 12 (13) 8 (8,9) 20 (11) 0,479 \n88.  16.291T 3 (3,3) 4 (4,4) 7 (3,8) 0,719 \n89.  16.292T 4 (4,3) 4 (4,4) 8 (4,4) >0,999 \n90.  16.293G 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 \n91.  16.294T 21 (22,8) 15 (16,7) 36 (19,8) 0,354 \n92.  16.295T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n93.  16.296T 2 (2,2) 2 (2,2) 4 (2,2) >0,999 \n94.  16.298C 8 (8,7) 8 (8,9) 16 (8,8) >0,999 \n95.  16.301T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n96.  16.302G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n97.  16.304C 3 (3,3) 3 (3,3) 6 (3,3) >0,999 \n98.  16.305G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n99.  16.309G 7 (7,6) 8 (8,9) 15 (8,2) 0,793 \n100.  16.311C 21 (22,8) 17 (18,9) 38 (20,9) 0,586 \n101.  16.312G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n102.  16.316G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n103.  16.318T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n104.  16.319A 10 (10,9) 8 (8,9) 18 (9,9) 0,805 \n105.  16.320T 6 (6,5) 7 (7,8) 13 (7,1) 0,781 \n106.  16320A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n107.  16.324C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n108.  16.325C 9 (9,8) 7 (7,8) 16 (8,8) 0,795 \n109.  16.327T 10 (10,9) 8 (8,9) 18 (9,9) 0,805 \n110.  16.335T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n111.  16.342C 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n90 \n \n \nConclusão APÊNDICE A - Polimorfismos do Da região controladora do DNA mitocondrial das \nposições 16024 a 16387, contendo a região HV1 nos grupos endometriose e controle \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n112.  16.343G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n113.  16.344T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n114.  16.355T 4 (4,3) 1 (1,1) 5 (2,7) 0,368 \n115.  16.360T 8 (8,7) 4 (4,4) 12 (6,6) 0,372 \n116.  16.362C 22 (23,9) 19 (21,1) 41 (22,5) 0,724 \n117.  16.368C 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n118.  16.372C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n119.  16.380A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n120.  16.381C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \nDados expressos como n (%); Teste exato de Fisher . \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n91 \n \n \nAPÊNDICE B - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das posições 1 a 727, \ncontendo as regiões HV2 e HV3 nos grupos endometriose e controle  \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n121.  45G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n122.  57G 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n123.  59C 2 (2,2) 0 (0) 2 (1,1) 0,497 \n124.  62A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n125.  64T 6 (6,5) 7 (7,8) 13 (7,1) 0,781 \n126.  65A 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n127.  73G 79 (85,9) 75 (83,3) 154 (84,6) 0,685 \n128.  73R 2 (2,2) 2 (2,2) 4 (2,2) >0,999 \n129.  89C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n130.  93G 5 (5,4) 7 (7,8) 12 (6,6) 0,565 \n131.  95C 0 (0) 3 (3,3) 3 (1,6) 0,119 \n132.  103A 0 (0) 3 (3,3) 3 (1,6) 0,119 \n133.  143A 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 \n134.  146C 30 (32.6) 17 (18.9) 47 (25.8) 0,042 \n135.  150T 17 (18,5) 10 (11,1) 27 (14,8) 0,211 \n136.  151T 12 (13) 5 (5,6) 17 (9,3) 0,125 \n137.  152C 49 (53,3) 41 (45,6) 90 (49,5) 0,304 \n138.  153G 10 (10,9) 8 (8,9) 18 (9,9) 0,805 \n139.  182T 18 (19,6) 9 (10) 27 (14,8) 0,095 \n140.  183G 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n141.  185A 0 (0) 6 (6.7) 6 (3.3) 0,013 \n142.  185T 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 \n143.  186A 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 \n144.  188G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n145.  189C 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 \n146.  189G 11 (12) 12 (13.3) 23 (12.6) 0,826 \n147.  194T 4 (4,3) 2 (2,2) 6 (3,3) 0,682 \n148.  195C 32 (34,8) 27 (30) 59 (32,4) 0,529 \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n92 \n \n \nContinuação APÊNDICE B - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das \nposições 1 a 727, contendo as regiões HV2 e HV3 nos grupos endometriose e controle  \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n149.  198T 11 (12) 9 (10) 20 (11) 0,814 \n150.  199C 4 (4,3) 2 (2,2) 6 (3,3) 0,682 \n151.  200G 7 (7,6) 9 (10) 16 (8,8) 0,610 \n152.  204C 4 (4,3) 3 (3,3) 7 (3,8) >0,999 \n153.  207A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n154.  210G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n155.  211G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n156.  215G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n157.  217C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n158.  228A 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n159.  235G 11 (12) 9 (10) 20 (11) 0,814 \n160.  236C 0 (0) 5 (5.6) 5 (2.7) 0,028 \n161.  239C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n162.  247A 15 (16,3) 12 (13,3) 27 (14,8) 0,678 \n163.  249 DEL 8 (8,7) 8 (8,9) 16 (8,8) >0,999 \n164.  251A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n165.  252C 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n166.  257G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n167.  263G 88 (95,7) 87 (96,7) 175 (96,2) >0,999 \n168.  271T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n169.  279C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n170.  290 DEL 7 (7,6) 7 (7,8) 14 (7,7) >0,999 \n171.  291 DEL 7 (7,6) 7 (7,8) 14 (7,7) >0,999 \n172.  293C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n173.  295G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n174.  297G 7 (7,6) 6 (6,7) 13 (7,1) >0,999 \n175.  310 INS 1C 44 (47.8) 48 (53.3) 92 (50.5) 0,463 \n176.  310 INS 2C 5 (5.4) 10 (11.1) 15 (8.2) 0,187 \n \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n93 \n \n \nContinuação APÊNDICE B - Polimorfismos da região controladora do DNA mitocondrial das \nposições 1 a 727, contendo as regiões HV2 e HV3 nos grupos endometriose e controle \n Variável \nControle \n(N = 92) \nEDT \n(N = 90) \nTotal \n(N = 182) \np \n177.  315 INS 1C 89 (96,7) 90 (100) 179 (98,4) 0,246 \n178.  316A 9 (9,8) 4 (4,4) 13 (7,1) 0,249 \n179.  325T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n180.  337 INS 1A 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n181.  340T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n182.  357G 6 (6,5) 2 (2,2) 8 (4,4) 0,278 \n183.  385G 1 (1,1) 3 (3,3) 4 (2,2) 0,365 \n184.  408A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n185.  418T 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n186.  445A 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n187.  447T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n188.  455 INS.1T 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 \n189.  460C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n190.  471C 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n191.  489C 10 (10,9) 11 (12,2) 21 (11,5) 0,820 \n192.  493G 4 (4,3) 5 (5,6) 9 (4,9) 0,746 \n193.  497T 1 (1,1) 1 (1,1) 2 (1,1) >0,999 \n194.  499A 4 (4.3) 12 (13.3) 16 (8.8) 0,038 \n195.  508G 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n196.  511T 0 (0) 1 (1,1) 1 (0,5) 0,495 \n197.  512A 2 (2,2) 1 (1,1) 3 (1,6) >0,999 \n198.  523 DEL 35 (38) 31 (34,4) 66 (36,3) 0,646 \n199.  524 DEL 35 (38) 31 (34,4) 66 (36,3) 0,646 \n200.  524 INS.1CA 1 (1,1) 2 (2,2) 3 (1,6) 0,619 \n201.  524 INS.1CACA 0 (0) 2 (2,2) 2 (1,1) 0,243 \n202.  534T 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n203.  548G 1 (1,1) 0 (0) 1 (0,5) >0,999 \n204.  573 INS.1C 4 (4,3) 0 (0) 4 (2,2) 0,121 \n205.  573 INS.2C 27 (29,3) 5 (5,6) 32 (17,6) <0,001 \n  \n\nMarina de Paula Andres   APÊNDICES \n \n \n94 \n \n \nAPÊNDICE C - Distribuição dos subhaplogrupos mitocondriais nos grupos controle (CT) e \nendometriose (EDT)  \nSubhaplogrupo Haplogrupo CT  EDT  Total p* \nn %  n %  n %  \nA Ameríndio 0 0,0  1 1,1  1 0,5 0,06 \nA2 Ameríndio 11 12,0  5 5,6  16 8,8  \nA5 Ameríndio 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nA6 Ameríndio 0 0,0  2 2,2  2 1,1  \nB2 Ameríndio 4 4,3  6 6,7  10 5,5  \nB4 Ameríndio 1 1,1  7 7,8  8 4,4  \nB6 Ameríndio 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nC0 Ameríndio 3 3,3  0 0,0  3 1,6  \nC1 Ameríndio 6 6,5  2 2,2  8 4,4  \nC2 Ameríndio 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nC3 Ameríndio 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nC4 Ameríndio 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nC5 Ameríndio 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nC6 Ameríndio 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nD1 Ameríndio 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nD4 Ameríndio 1 1,1  1 1,1  2 1,1  \nH1 Europeu 3 3,3  2 2,2  5 2,7  \nH10 Europeu 0 0,0  2 2,2  2 1,1  \nH2 Europeu 4 4,3  0 0,0  4 2,2  \nH27 Europeu 0 0,0  2 2,2  2 1,1  \nH3 Europeu 0 0,0  3 3,3  3 1,6  \nH4 Europeu 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nH5 Europeu 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nH6 Europeu 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nHV0 Europeu 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nJT Europeu 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nK1 Europeu 1 1,1  3 3,3  4 2,2  \nL0 Africano 0 0,0  5 5,6  5 2,7  \nL1 Africano 14 15,2  7 7,8  21 11,5  \nL2 Africano 12 13,0  11 12,2  23 12,6  \nL3 Africano 18 19,6  13 14,4  31 17,0  \nL4 Africano 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nM2 Asiático 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nM9 Asiático 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nN1 Asiático 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nN9 Asiático 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nR0 Europeu 0 0,0  2 2,2  2 1,1  \nT2 Europeu 2 2,2  2 2,2  4 2,2  \nU2 Europeu 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nU3 Europeu 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nU5 Europeu 2 2,2  0 0,0  2 1,1  \nW3 Europeu 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nW6 Europeu 1 1,1  0 0,0  1 0,5  \nX2 Asiático 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \nZ4 Asiático 0 0,0  1 1,1  1 0,5  \n*Teste da razão de verossimilhanças .","source_license":"CC0","license_restricted":false}