Glycodelin vermindert die Makrophagenanzahl in der Peritonealhöhle von C57BL/6-Mäusen - Neue Therapiemöglichkeit bei Endometriose?

JOURNAL FÜR FERTILITÄT UND REPRODUKTION JOURNAL FÜR FERTILITÄT UND REPRODUKTION Krause & Pachernegg GmbH · VERLAG für MEDIZIN und WIRTSCHAFT · A-3003 Gablitz ZEITSCHRIFT FÜR IN-VITRO-FERTILISIERUNG, ASSISTIERTE REPRODUKTION UND KONTRAZEPTION Indexed in EMBASE/ Excerpta Medica Homepage: www.kup.at/fertilitaet Online-Datenbank mit Autoren- und Stichwortsuche HORNUNG D, CHAO VA, TAYLOR RN, VIGNE J-L, WALLWIENER D Glycodelin vermindert die Makrophagenanzahl in der Peritonealhöhle von C57BL/6-Mäusen - Neue Therapiemöglichkeit bei Endometriose? Journal für Fertilität und Reproduktion 2003; 13 (1) (Ausgabe für Schweiz), 13-15 Journal für Fertilität und Reproduktion 2003; 13 (1) (Ausgabe für Österreich), 16-20 Glycodelin vermindert die Makrophagenanzahl in der Peritonealhöhle von C57BL/6-Mäusen – Neue Therapiemöglichkeit bei Endometriose? D. Hornung1, 2, J.-L. Vigne2, V. A. Chao2, D. Wallwiener1, R. N.Taylor2 Eine erhöhte Anzahl von aktivierten Peritonealmakrophagen, die durch Chemokine angezogen werden, sind ein wichtiges pathophysiologisches Merk­ mal für Frauen mit Endometriose. In dieser Studie charakterisier en wir die inflammatorische Antwort in einem in vivo-Mausmodell von Peritonitis und untersuchen die antiinflammatorischen Effekte v on Glycodelin. Menschliches Gly codelin wird in den Endometriumz ellen der späten sekretorischen Phase und in der F rühschwangerschaft unter Hormoneinfluß s ynthetisiert. Die genaue ph ysiologische R olle v on Gly codelin ist bish er noch nicht bekannt. Seine Expression während der Nidation des Embryos und seine Verhinderung der T-Zell-Proliferation läßt jedoch auf eine immunmodulatori­ sche Rolle schließen. Die intraperitoneale Injektion v on Thioglycollat-Medium in 7 Wochen alte, weibliche C57BL/6-Mäuse wurde d azu benutzt, um eine Rekrutierung von aktivierten Peritonealmakrophagen hervorzurufen. RT-PCR für Maus-spezifische c-fms mRNA-Transkripte verifizierte den mono­ zytischen Ursprung dieser Z ellen. Glycodelin, ein Glyk oprotein von 27 kDa, welches zuv or schon in vitr o seine immunsuppr essiven Effekte gez eigt hatte, verhinderte die Makrophagenakkumulation im Mausmodell. Außerdem sekretierten die Peritonealmakrophagen der Glycodelingruppe weniger RANTES und IL-1β-Protein, wenn sie in vitro kultiviert und mit TNF-α für 48 h stimuliert wurden, als die der Thioglycollatgruppe. Wir schlagen vor, daß weitere Studien durchgeführ t werden sollten, um zu zeigen, ob Glycodelin als neue Therapie für Frauen mit Endometriose eingeset zt werden kann. Elevated numbers of activated peritoneal macrophages, attracted by chemokines, are important pathophysiological features in women with endo­ metriosis. In the current studies we characterized the inflammatory response in an in vivo murine model of peritonitis and assessed the anti-inflamma­ tory effect of gly codelin. Human gly codelin is s ynthesized by endometrial cells in the late secr etory phase and early pr egnancy under hormonal regulation. Whereas the pr ecise physiological r ole of gly codelin is unkno wn, its e xpression during embr yonic nidation and its i nhibition of T cell proliferation suggests an immunomodulator y role. Intraperitoneal injection of thioglycollate solution into 7-week-old female C57BL/6 mice was used to elicit the r ecruitment of activ ated peritoneal leuk ocytes. RT-PCR for mouse c-fms mRN A transcripts v erified the monocy tic derivation of these cells. Glycodelin, a 27 kDa glycoprotein with recently documented immunosuppr essive effects in vitr o, inhibited macr ophage accumulatio n in the mouse model. When the murine peritoneal macrophages were cultured in vitro and stimulated with TNF-α for 48 hours, prior exposure to glycodelin resulted in less RANTES and IL-1β protein secretion than from cells of mice treated with thioglycollate alone. We propose that further studies should be done to show, if glycodelin could be consider ed as a novel therapy for women with endometriosis. J Fertil Reprod 2003; 13: 16 –20. E ndometriose mit der Anwesenheit von ektopem Endo- Die Thioglycollatinjektion in Mäuse induziert ein P eri­ metrium-Stroma und -Drüsen ist ein häufiger Grund für tonealexsudat, welc hes das inflammatorisc he Milieu bei Dysmenorrhoe, Unterbauc hschmerzen und Infertilität [1, Patientinnen mit Endometriose gut widerspiegelt [16, 17]: 2]. Die P athophysiologie der endometrioseassoziierten Die Immunantwort ist hauptsächlich monozytisch. Unsere Symptome ist noch nicht vollständig geklärt, aber es deu- Daten zeigen, daß Glycodelin die Monozytenmigr ation in tet vieles darauf hin, daß die Symptome der Endometriose vivo im Maus-Modell hemmen kann. Klinisc he Studien das Produkt einer lokalen, inflammatorisc hen Antwort müssen zeigen, ob die anti-inflammatorische Wirkung von sind [3–6]. Endometrioseläsionen treten hauptsäc hlich in Glycodelin dazu dienen kann, die Symptome der Patientin der Peritonealhöhle auf. In den letzten 20 J ahren wurde mit Endometriose zu behandeln. entdeckt, daß die Endometriose-Implantate von einer Im­ munzell-Infiltration begleitet sind. Endometriose ist mit Tiere und Methodik einem hauptsäc hlich monozytisc hen P eritonealexsudat verbunden [1, 7]. Mit der Hilfe v on Bo yden-Kammern Wir benutzten für diese Experimente 7 Wochen alte, weibli­ konnten wir die Monozytenmigr ation in vitro quantifizie- che C57BL/6 Mäuse. Die Mäuse wurden in der Uni versity ren und demonstrieren, daß Glycodelin die mensc hliche of California, San F rancisco in den USA gehalten. Sie er - Monozytenchemotaxis inhibiert [8]. hielten Wasser und Futter ad libitum. Die Experimente wurden von dem UCSF Animal Care and Use Committee Endometriose tritt spontan bei F rauen und menstruie- genehmigt und entspr achen den Ric htlinien des National renden Primaten auf [9–11], jedoch nicht bei anderen Tie- Institute of Environmental Health Sciences. ren. Modelle der Endometriose wurden bei Ratten dadurch kreiert, daß uterines Gewebe an das Bec kenperitoneum Medien und Reagenzien genäht wurde [12, 13] oder dadur ch, daß ath ymischen 1 ml 4 % Thioglycollat-Medium (Sigma, St. Louis, USA) Mäusen menschliches Endometrium intraperitoneal appli- wurde dazu benutzt, P eritonealmakrophagen in die P eri­ ziert wurde [14, 15]. K eines dieser Modelle spiegelt tonealhöhle anzuziehen [16, 17]. Glycodelin wurde aus jedoch die lokale Immunantwort dar , die typisch für die der Dezidua des ersten Sc hwangerschaftstrimesters extr a­ peritoneale Endometriose bei F rauen ist. hiert, wie zuv or besc hrieben [8]. Alle zuv or genannten Reagenzien waren endotoxinfrei und wurden in Kalzium und Magnesium freier , Phosphat gepufferte NaCl-Lösung Von der 1Universitätsfrauenklinik Tübingen, Deutschland und dem (PBS) gelöst, um die Effekte der Zelladhäsion zu minimie- 2Center for Reproductive Sciences, University of California, ren. San Francisco, USA Korrespondenzadresse : Priv. Doz. Dr. Daniela Hornung, Universitäts- Stimulation und Gewinnung der inflammatorischen frauenklinik Tübingen, D-72076 Tübingen, Calwerstraße 7; Peritonealzellen E-mail: [email protected] 1 ml 4 % Thioglycollat-Medium oder PBS (K ontrolle) wur- Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, de in die Peritonealhöhle von je 4 Mäusen an den Behand- Projekt Ho 1832/2-2 (DH), und v on der NIH/NICHD, lungstagen 1 und 3 injiziert. Zusätzlic h zu Thioglycollat Projekt U54-HD37321, gefördert (DH, J-L V, VAC und RNT). erhielten je 4 Mäuse 20 µg Glycodelin intr aperitoneal an 16 J. FERTIL. REPROD. 1/2003 For personal use only. Not to be reproduced without permission of Krause & Pachernegg GmbH. Homepage Journal für Fertilität und Reproduktion: http://www.kup.at/fertilitaet den Tagen 1 und 3 appliziert. An dem 4. Behandlungstag wurden die Tiere dekapitiert, um eine traumatische Blutung in die Peritonealhöhle zu minimieren. Diese Versuche wur­ den dreimal wiederholt, so daß insgesamt 12 Mäuse pro Behandlungsgruppe untersuc ht wurden. Die P eritoneal­ flüssigkeit wurde folgendermaßen gew onnen: 4 ml PBS wurde in die P eritonealhöhle injiziert und das Abdomen vorsichtig massiert, um die Flüssigkeit gleichmäßig zu ver­ teilen. Das Abdomen wurde daraufhin durch eine Ventral­ inzision eröffnet, w obei darauf geachtet wurde, daß der Inhalt nic ht verloren wurde. Die Flüssigkeit wurde aspi­ riert, nochmals 3 ml PBS instilliert und der Aspirationspro­ zeß wiederholt. Die Zellen wurden unter dem Mikroskop in einer Neubauer-Zählkammer von 3 unabhängigen Beob­ achtern in jeweils 4 Meßquadr aten ausgezählt. Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Die Gesamt-RNA von den Peritonealmakrophagen wurde mit Trizol® isoliert und 2 µg v on jeder RN A-Probe wurde mittels MML V rev erser Transkriptase, oligo-dT und Ran­ domhexamer-Primern rev ers tr anskribiert, wie zuv or be­ schrieben [18]. Die PCR-Amplifikation v on cDNA wurde mit c-fms-spezifischen Primern wie nachfolgend durchge­ führt: upstream: 5’-GGT GCG CTG GAA GA T CAT CGA GAG ATA-3’; downstream: 5’-CTC CGT GA G TAC AGG CTC CC A AGA GGT T-3’. Die Zykluspar ameter für die PCR-Amplifikation w aren: 9 4°C, 11 Minuten; 8 Zyklen von94°C, 40s; 60°C, 20s,75°C, 80s, 30 Zyklen von 94°C, 40s; 62°C, 20s,75°C, 80s. Eine abschließende Extensions­ runde (75°C, 10 Min) wurde dazu benutzt, um die kom­ plette Produktformation zu optimieren. 10 µl v on jedem PCR-Produkt wurde mit Samplepuffer gemisc ht und auf ein 4 % E-Gel Agarosegel aufgetragen (Invitrogen, Carls­ bad, USA). Die RT-PCR für GAPDH-Transkripte wurde als Kontrolle eingesc hlossen, um die Integrität der RN A zu bestätigen. Statistische Analysen Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweic hung angegeben. J edes Experiment wurde dreimal wiederholt. Wir benutzten non-par ametrische Methoden (Kruskal- Wallis- und Mann-Whitney-Statistiken), um die Daten zu analysieren. Signifikante Untersc hiede wurden akzeptiert, wenn die Analysen einen P-Wert < 0,05 ergaben. Ergebnisse Die Peritonealzellen wurden direkt nach ihrer Gewinnung an Tag 4 gezählt. Die Gesamtzellanzahl in der K ontroll­ gruppe (PBS) betrug 117.000 ± 11.000 Zellen. Die Anzahl der Zellen v on Mäusen, die nur mit Thioglycollat behan­ delt worden waren, betrug 381.000 ± 69.000 und war da- mit mehr als dreifach gegenüber der Kontroll-PBS-Gruppe erhöht. Die Mäuse, die mit Thioglycollat plus Glycodelin behandelt wurden, zeigten eine Reduktion der Zellanzahl um 44 % auf 233.000 ± 19.000 Zellen v erglichen mit der Gruppe, die aussc hließlich Thioglycollat erhalten hatte. Beide Ergebnisse waren statistisch signifikant (p < 0,05). Die P eritonealzellen wurden gew onnen, gew aschen und auf Gewebekultursc halen kulti viert. Wir konnten durch RT-PCR für Maus c- fms mRNA verifizieren, daß es sich bei den gew onnenen Zellen um Makrophagen han­ delte. c-fms kodiert den CSF-1-Rezeptor, der spezifisch für Makrophagen bei Mäusen ist. Die R T-PCR für alle experi­ mentellen Gruppen w ar positi v für c- fms. Eine positi ve Kontrolle wurde dur ch die RNA von Maus-Plazenta, eine negative Kontrolle durch RNA von adrenalen MA10-Zellen durchgeführt. GAPDH-Transkripte als positive Kontrolle für die Integrität der mRNA war in allen Proben nachweisbar. Die RANTES-Protein-Produktion der Mausmakropha­ gen in K ulturmedium wurde nac h 4 8 h Stimulation mit 100 ng TNF-α gemessen. Die Sekretion v on Maus-RAN- TES wurde mit Hilfe eines ELISA gemessen und pro 100.000 Zellen angegeben. Die P eritonealmakrophagen der Kontrollgruppe (PBS) produzierten 1551 ± 198 pg/ml RANTES pro 100.000 Zellen. Die RANTES-Sekretion v on Mausmakrophagen der Thioglycollatgruppe war auf 3393 ± 1062 pg/ml/100.000 Zellen erhöht und betrug damit 218 % mehr als bei der negativen Kontrolle mit PBS. Glyco­ delin bewirkte eine signifikante Hemmung der RANTES- Sekretion der Makrophagen auf 1919 ± 368 pg/ml/ 100.000 Zellen und damit um 8 0% v erglichen mit der Gruppe, die nur mit Thioglycollat behandelt w orden war (p < 0,05). Die selben Zellkulturüberstände wurden ebenfalls mit Hilfe eines ELISA untersuc ht und die Menge an sekretier ­ tem IL-1β gemessen. IL-1 β von Mauszellen der PBS-K on­ trollgruppe betrug 20 ± 4 pg/ml/100.000 Zellen. IL-1 β der positiven Kontrolle (Thioglycollat) war auf 34 ± 12 pg/ml/ 100.000 Zellen und damit um 172 % gegenüber der nega­ tiven K ontrolle erhöht. Die IL-1 β-Produktion der P erito­ nealmakrophagen in der Glycodelingruppe war auf 26 ± 2 pg/ml/100.000 Zellen und damit um 5 5 % verglichen mit der Thioglycollatgruppe signifikant supprimiert (p < 0,05). Diskussion Thioglycollat-Medium, ein unspezifisc hes Irritanz, konnte ein monozytisches, peritoneales Exsudat im Nagetiermo­ dell hervorrufen [16, 17]. Es wurde behauptet, daß die in­ flammatorische Antwort mit einer reduzierten F ertilität einherging [16]. Diese Beobac htung wurde jedoc h v on einer anderen Arbeitsgruppe widerlegt [17]. In unserer Studie konnten wir bestätigen, daß Thioglycollat eine peri­ toneale Inflammation hervorrufen kann. Obwohl die Peritonealhöhle viele v erschiedene Immun- und Meso­ thelzellen enthält, ist der v orherrschende Zelltyp in Thio­ glycollat-stimuliertem P eritonealexsudat der P eritoneal­ makrophage, wie durch Immunfluoreszenz-Flowzytometrie gezeigt werden konnte [19]. Wir haben die Makrophagen­ charakteristik dieser Zellen dur ch die Demonstr ation der Maus c-fms-mRNA-Expression verifiziert [20]. Die Behandlung mit Glycodelin, einem Endometrium- Lipocalin, reduzierte die Monozyteninfiltr ation im Maus­ modell. Zuvor konnten wir sc hon zeigen, daß diese Sub­ stanz auch die mensc hliche Monozytenmigr ation in vitro in Boydenkammer-Versuchen gehemmt hatte [8]. Glyco­ delin war im Vergleich zu anderen Substanzen, wie z . B. Ciglitazone aus der Gruppe der Thiazolidinedione, dur ch eine noc h deutlichere Makrophagenmigr ationshemmung charakterisiert. Auch die Reduktion der Zytokinproduktion von RANTES und IL-1 β nach 48h TNF-α-Stimulation war bei den Zellen v on Tieren, die zuv or mit Glycodelin be­ handelt wurden, deutlic her als nac h Vorbehandlung mit Thiazolidinedionen [21, 22]. Ein Problem für die klinische Anwendung v on Glycodelin könnte darin bestehen, daß eine Herstellung von Glycodelin bisher nicht kommerziell durchgeführt wird, sondern seine Extraktion aus menschli­ cher Dezidua des ersten Trimesters oder aus Amnionflüs­ sigkeit mittels aufwendiger HPLC-T echnik dur chgeführt werden muß [8]. Auf Basis unserer präklinischen Versuche schlagen wir v or, daß die Wirkungen und das Nebenwir - 18 J. FERTIL. REPROD. 1/2003 kungsspektrum v on Glycodelin noc h näher untersuc ht werden sollten, bevor Glycodelin möglicherweise als me­ dikamentöse Therapie bei Frauen mit Endometriose einge­ setzt werden kann. Literatur: 1. Halme J, Becker S, Hammond M, Raj M, Raj S. 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Habilitation 2002 an der Universitätsfrauenklinik Tübingen. 1991 Gödecke-Forschungspreis (Freiburg/Br.), 1997 Preis der Oberrhein. Gesellschaft für Gynäk ologie und Geburtshilfe (Rastatt), 2002 First Prize Paper Award, Welt-Endometriose-Kongreß, San Diego. Wissenschaftliche Schwerpunkte: Endometriose, Zytokine, Immunologie. Mitgliedschaften: World Endometriosis Society (WES), Deutsche Gesellschaft für Gynäkologische Endokrino­ logie und Fortpflanzungsmedizin (DGGEF). 19 Originalarbeiten, 9 Buchkapitel, 29 Abstracts. 20 J. FERTIL. REPROD. 1/2003 Mitteilungen aus der Redaktion Haftungsausschluss Die in unseren Webseiten publizierten Informationen richten sich ausschließlich an geprüfte und autorisierte medizinische Berufsgruppen und entbinden nicht von der ärztlichen Sorg- faltspflicht sowie von einer ausführlichen Patientenaufklärung über therapeutische Optionen und deren Wirkungen bzw. Nebenwirkungen. 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