Influência do agente antiangiogênico bevacizumab em endometriose experimentalmente induzida em ratas

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO ANA CAROLINA TAGLIATTI ZANI Influência do agente antiangiogênico Bevacizumab em endometriose experimentalmente induzida em ratas Ribeirão Preto 2017     ANA CAROLINA TAGLIATTI ZANI Influência do agente antiangiogênico Bevacizumab em endometriose experimentalmente induzida em ratas Versão Original Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto para obtenção do título de Mestre em Medicina Locais de execução: Departamento de Ginecologia e Obstetrícia e Departamento de Patologia e Medicina Legal Orientador: Prof. Dr. Júlio César Rosa e Silva Ribeirão Preto 2017     Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Zani, Ana Carolina Tagliatti Influência do agende antiangiogênico Bevacizumab em endometriose experimentalmente induzida em ratas. / Ana Carolina Tagliatti Zani ; orientador, Júlio César Rosa e Silva. Ribeirão Preto, 2017. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina da Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2017. 1. Endometriose. 2. Angiogênese. 3. Bevacizumab. 4. VEGF. 5. Proliferação Celular. 6.Invasão Tecidual. 7. Ratas     Nome: ZANI, Ana Carolina Tagliatti Título: Influência do agente antiangiogênico Bevacizumab em endometriose experimentalmente induzida em ratas Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre. Aprovado em: Banca Examinadora Prof. Dr. Instituição: Julgamento: _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ Prof. Dr. Instituição: Julgamento: _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ Prof. Dr. Instituição: Julgamento: _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________     Agradecimentos Agradeço, em primeiro lugar, a meu pai, João Luís, e minha mãe, Rosilei, por sempre acreditarem em minha capacidade e me apoiarem em todas a s decisões que tomei em minha vida pessoal e profissional. Agradeço, també m, a meus irmãos, Vinícius e Vítor. Sem essas quatro pessoas não seria metade do que sou hoje, sem o apoio, mesmo a distância, não teria metade das conquistas que tenho hoje. A Demetrio agradeço a persistência que teve em não me deixar pe rder minha própria persistência, o suporte emocional que tem me dado no dia a dia. Amizades são sempre especiais e cada uma delas colabora um pouq uinho em nossas vidas. Um agradecimento especial ao José Vitor, que m e incentivou na especialidade, me despertou no assunto, e a Julia, por toda a c olaboração na confecção dessa dissertação, nos prazos e burocracias. E obriga da aos dois pela amizade. Agradeço todos os que me ajudaram no trabalho braçal: à equipe do laboratório de cirurgia experimental da FMRP-USP (especialmente o Carlinhos), à equipe do laboratório de Ginecologia e Obstetrícia (Juliana, Cr istiana e Lilian) e do laboratório de patologia (Laura e Professor Alfredo). Um obrigada especial ao Professor Júlio, meu orientador, pela p aciência, pelas dúvidas sanadas, pelos incentivos, por não ter desistido d e m i m e p e l a compreensão nos últimos meses. Agradeço a todas as pacientes, que me ensinam a cada dia mais. E, acima de tudo, agradeço a Deus, pela capacidade me dada para concluir mais esse projeto em minha vida!     ZANI, A. C. T. Influência do agente antiangiogênico Bevacizumab e m endometriose experimentalmente induzida em ratas. Dissertação d e Mestrado. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, 2017. Resumo A endometriose, caracterizada por crescimento de tecido endomet rial fora da cavidade uterina, é responsável por sintomas álgicos com grande impacto na qualidade de vida da paciente. Várias linhas de medicações têm sido estudadas para essa o tratamento da endometriose, já que a cirurgia não é o tratamento de escolha sempre e, quando realizado, não é um tratamento definit ivo. O conhecimento da patogenia da endometriose é fundamental para o estudo de novas classes de medicações. Uma delas, os fatores inibitórios da ang iogênese, tem papel fundamental no estabelecimento e crescimento de lesões de endom etriose. Neste estudo, buscamos a influência da Bevacizumab, droga anti-fator de crescimento endotelial (anti-VEGF), utilizada em duas dosagens diferentes, em endometriose peritoneal induzida em ratas, modelo animal já bem estabelecido para o estudo de endometriose. As ratas permaneceram sob tratamento durante 4 se manas, após as quais foram sacrificadas, sendo as lesões e o corno uterino rem anescente retirados para posterior avaliação. Foi realizada avaliação da área das lesões de cada rata, da presença de tecido endometrial à microscopia, da positividade p ara o anticorpo anti- VEGF na imunohistoquímica e da expressão gênica de PCNA, MMP9, Tp63 e VEGFA. O bevacizumab atuou reduzindo a área das lesões nos grup os que receberam medicação (p=0,002) e reduzindo a expressão gênica pa ra Tp63 nas lesões (p=0,04). Não houve resultado significativo nas outras avaliações Palavras-chave: Endometriose. Angiogênese. Bevacizumab. VEGF. Proliferação Celular. Invasão Tecidual. Ratas. Diferenciação Celular.     ZANI, A. C. T. Influence of antiangiogenic agent bevacizumab on endometriosis experimentally induced in rats. Dissertation (Mestrado). Faculd ade de Medicina de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, 2017. Abstract Endometriosis, characterized by growth of endometrial tissue ou tside the uterine cavity, is responsible for painful symptoms with great impact on the quality of life of women. Several lines of medications have been studied f or endometriosis’s treatment, since surgery is not a lways the treatment of choice and, when done, it is not a definitive treatment. Knowing the pathogenesis of this di sease is fundamental for the study of new classes of medications. One of them, the i nhibitory factors of angiogenesis, plays a fundamental role in the establishment and growth of endometriosis lesions. In this study, we sought the influence o f Bevacizumab, an anti-endothelial growth factor (anti-VEGF) drug, used in two di fferent dosages, in peritoneal endometriosis induced in rats, an animal model well established for the study of endometriosis. The rats remained under treatment for 4 weeks, after which they were sacrificed, with the remaining lesions and uterine ho rn being removed for further evaluation. An evaluation of the lesion area of each ra t, the presence of endometrial tissue under microscopy, the positivity of the anti -VEGF antibody in immunohistochemistry and the gene expression of PCNA, MMP9, Tp6 3 and VEGFA were performed. Bevacizumab wo rked by reducing the area of the lesions in the groups receiving medication (p = 0.002) and reducing the gene e xpression for Tp63 in the lesions (p = 0.04). There was no significant result in the other evaluations Key words: Endometriosis. Angiogenesis. Bevacizumab. VEGF. Cell Proliferation. Tissue Invasion. Rats. Cell Differentiation.     Lista de Tabelas Tabela 1: Peso inicial e final das ratas. ............................. ........................ 13 Tabela 2: Área final das lesões nos diferentes grupos. ................. ........... 14 Tabela 3: Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica do endométrio tópico (uterino) nos diferentes grupos. ............ ........ 15 Tabela 4: Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica das lesões (endometriose induzida) entre os diferentes grupos. ........... .......... 15 Tabela 5: Comparação entre os grupos para a expressão gênica de cada tip o de gene. P-valor referente ao teste de Kruskall Wallis. .......... .......... 18 Tabela 6: Pós-teste de Dunn para a expressão do gene TP63 .............. ...... 18     Lista de Figuras Figura 1: Identificação do corno uterino esquerdo .............................. 8 Figura 2 e 3: Aspecto macroscópico das les ões peritoneais no momento da segunda abordagem cirúrgica. ............................................. 9 Figura 4: Coloração para HE (aumento 100x) confirmando a presença de tecido endometrial nas lesões do grupo controle (A), Baixa Dose (B) e Alta Dose (C) ............................................................... 14 Figura 5: Imunohistoquímica para VEGF em lesão do grupo controle mostrando positividade forte (Microscopia, aumento 100x)...15 Figuras 6 e 7: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca a moderada (à direita) em rata do grupo de baixa dose (Microscopia, aumento de 100x) ................................................................................ 16 Figuras 8 e 9: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca (à direita) em r ata do grupo de alta dose (Microscopia, aumento 100x) .......... 16 Figuras 10 e 11: Exemplos de lesão sem representatitvidade endometrial à HE (à esquerda) e sem marcação de VEGF na imunohistoquímica (à direita). Microscopia, aumento .............................................. 17     Lista de Abreviaturas MMPs Metaloproteinases de Matriz MMP9 Metaloproteinase de Matriz 9 VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular GnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas VEGFR2 Receptor 2 do VEGF PCNA Antígeno Nuclear de Proliferação Celular Tp63 Gene Supressor de Tumor p63 CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais RNA Ácido Ribonucleico HE Hematoxilina e Eosina pH Potencial hidrogeniônico PBS Tampão de Solução Salina TBST Tris buffered saline e Polissorbato 20 HRP Enzima Peroxidase DAB Diaminobenzina cDNA Ácido Desoxirribonucleico Complementar DNA Ácido Desoxirribonucleico PCR Reação em Cadeia da Polimerase TIMP Inibidor tecidual da Matriz de Metaloproteinase     Lista de Símbolos % Porcentagem g gramas cm centímetros ˚C graus Celsius ® Marca Registrada ml mililitro mg miligrama kg quilograma µl microlitro     Sumário 1. Introdução ................................................. .............................................. 1 2. Justificativa .............................................. ................................................. 5 3. Objetivos .................................................. ............................................. 6 3.1. Objetivos Gerais ........................................ ....................... 6 3.2. Objetivos Específicos .................................... ........................... 6 4. Metodologia ................................................ ............................................... 7 4.1. Animais e Procedimentos para modelo experimental ......... ............ 7 4.2. Processamento do material para Coloração e imunohistoquími ca...10 4.3. Extração do RNA total e síntese do cDNA, quantificação por PCR em tempo real ................................................... ................................. 11 4.4. Análise estatística ..................................... .......................... 12 5. Resultados ................................................. .............................................. 13 5.1. Do preparo e coleta do material .......................... .......................... 13 5.2. Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica ......... ............... 14 5.3. Da avaliação genética .................................... ........................... 17 6. Discussão .................................................. ............................................. 19 6.1. Avaliação macroscópica ................................... .............................. 19 6.2. Avaliação imunohistoquímica .............................. ........................... 19 6.3. Avaliação em biologia molecular .......................... .......................... 20 6.3.1. Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP9) .................... ........... 20 6.3.2. Antígeno de Proliferação Nuclear (PCNA) ................ ............... 21 6.3.3. Proteína tumoral P63(Tp63) ............................. ....................... 22 6.3.4. Fator de Crescimento Endotelial Vascular A (VEGFA) ..... ..... 23 7. Conclusões ................................................. .............................................. 24     Referências Bibliográficas ................................... ....................................... 25 Anexo ........................................................ .................................................. 29 - 1 -   1. Introdução Endometriose é uma doença caracterizada pelo crescimento de glâ ndula e estroma endometriais fora da cavidade uterina. É uma doença ben igna, dependente do status hormonal da mulher (estrógeno-dependente), que ocorre em 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva (Worley et al., 2013), podendo chegar de 40 a 60% entre as mulheres com dismenorreia (Farquhar, 2007). Os principais sintomas de endometriose são dismenorreia, dor pé lvica não relacionada à menstruação e infertilidade (Catenacci, Sastry e Falcone, 2009). Tais sintomas tem grande impacto no bem estar físico, mental e socia l da mulher (Dunselman et al. , 2014) e configuram, por isso, um problema de saúde pública, tornando fundamental o seu correto tratamento. Para que o tratamento da endometriose seja eficaz, faz-se neces sário conhecer a sua patogenia. Várias teorias tentam explicá-la. A m ais aceita, a teoria de Sampson, propõe que lesões endometrióticas se originam de fr agmentos endometriais que, durante a menstruação, caem de forma retrógra da (via tubas uterinas) na cavidade peritoneal (Sampson, 1927). Se levarmos e m consideração que a menstruação retrógrada ocorre em 76 a 90% das mulheres no menacme, incidência maior que a da própria endometriose, a teoria da men struação retrógrada não é suficiente para justificá-la. Outras teorias surgiram para dar essa explicação, como as que r elacionam fatores imunológicos, fatores de adesão celular e a metaplasia celômica à gênese da endometriose (Gazvani, Rafet e Templeton, 2002; Gazvani, R. e T empleton, 2002; Kruitwagen et al., 1991; Suginami, 1991). A teoria da metaplasia celômica explic a a ocorrência de endometriose em localizações extra-pélvicas, como cavidade pleural e em mulheres que nunca menstruaram. Está embasada na diferenciaç ão de células celômicas primitivas em células endometriais (Suginami, 1991). O conhecimento da composição do fluido peritoneal (fatores imun ológicos e os fatores de adesão celular) ajudou a explicar o motivo da end ometriose não ter uma incidência maior, dada a incidência de menstruação retrógra da na população e a presença de tecido celômico em todas as mulheres. - 2 -   O fluido peritoneal nas pacientes com endometriose contém maior número de macrófagos, que se encontram mais ativados. Após a adesão das c élulas endometriais ao peritônio, os macrófagos locais, através da pro dução de interleucinas 1 e 8, estimulam a produção de metaloproteinases de matriz (MMPs). Entre as MMPs, a MMP9 está sabi damente envolvida na invasão tec idual de vários tumores e tem sido relacionada à patogenia da endometriose, com demonstrações de elevados níveis tanto no líquido peritoneal como no plasma s anguíneo de pacientes com diferentes graus de endometriose (Liu et al., 2015). Seguindo a adesão e invasão tecidual, ocorre o estímulo à angio gênese, através, principalmente, do fator de crescimento vascular endot elial (VEGF), produzido tanto pelas células endometriais em hipóxia como pelo s macrófagos peritoneais (Groothuis et al. , 2005). As lesões endometrióticas são ricamente vascularizadas e estudos já comprovaram que o surgimento de nov os vasos tem importância central, seja através de vasos já existentes na pro ximidade ou através do recrutamento de células precursoras endoteliais (Bourlev et al., 2006; Laschke et al., 2011; Laschke, Giebels e Menger, 2011; Nisolle et al., 1993). O VEGF estimula a migração e a proliferação de células endoteliais e aumenta a pe rmeabilidade vascular, com maior ou menor expressão proteica sendo encontrad a a depender do grau da doença: quanto maior a invasão tecidual, maior o nível proteico do VEGF (Song et al. , 2014)(Machado et al. , 2008). Sem uma angiogênese adequada, não são possíveis a manutenção das lesões e o seu crescimento local , o que nos leva à hipótese de que uma medicação que atue na cascata da angiogênes e possa ser uma boa aposta para o tratamento da endometriose (Becker e D’Am ato, 2007; Hull et al., 2003; Laschke e Menger, 2012; Nap et al., 2004; Taylor, Lebovic e Mueller, 2002). O padrão ouro de diagnóstico da endometriose é a visualização d ireta das lesões via laparoscópica com confirmação histológica através do achado de macrófagos com hemossiderina ou tecido endometrial, glândulas ou estroma (ACOG Committee on Practice Bulletins--Gynecology, 1999). O tratament o cirúrgico tem a intenção de reduzir a dor e aumentar as taxas de fertilidade. P ara tanto, é necessário remover todas as lesões visíveis e restaurar a anato mia pélvica, o que torna a laparoscopia um procedimento diagnóstico e terapêutico. - 3 -   Basear todo o tratamento da endometriose na cirurgia não é adeq uado, pois a endometriose apresenta-se em diferentes formas micro e macrosco picamente, em alguns casos, inclusive, não sendo possível identificá-las (How ard, 2011). Além disso, nem sempre a opção cirúrgica é o melhor tratamento para uma determinada paciente, como quando lidamos com infertilidade, tornando o tra tamento medicamentoso essencial para controle da dor e da progressão da s lesões (Petta et al., 2009). Nesse ponto, faz-se necessária a associação de medicam entos que reduzam o crescimento das lesões, bem como o aparecimento de novas. As opções medicamentosas são vast as, algumas delas já bem estab elecidas e em uso, como os anticoncepcionais hormonais, os análogos do G nRH, os inibidores da aromatase. Tais classes de medicamentos possuem u ma limitação importante na prática clínica: por atuarem através da modulação hormonal, podem inibir a ovulação, não sendo uma opção adequada para as pacient es que desejam engravidar (Streuli et al., 2013). O foco deste estudo é um agente antagonista do fator de crescim ento endotelial vascular (anti-VEGF), o bevacizumabe, comparando-o e m duas dosagens no que diz respeito à redução de lesões endometrióticas induzidas em ratas. Bevacizumabe é um anticorpo monoclonal que se liga e neutraliza de forma seletiva a atividade biológica do fator de crescimento do endot élio vascular humano (VEGF), inibindo sua ligação aos seus receptores, principalment e VEGFR2, na superfície das células endoteliais, com consequente redução da vascularização. Sua ação antitumoral já está bem estabelecida no tratamento de tumo res sólidos, como em câncer de colon, mama, pâncreas e próstata, quando associado a outros quimioterápicos (Shih e Lindley, 2006). O bevacizumab tem se mo strado eficaz também no tratamento de doenças vasculares retinianas, com resu ltados comparáveis à foto coagulação (Ollendorf, Colby e Pearson, 2013 ). Mais recentemente, estudos com bevacizumab já tem demonstrado result ados melhores em endometriose quando comparado com outras classes de drogas ( Soysal et al., 2014). Assim como o estudo de qualquer nova droga para determinada doe nça, ou mesmo novos usos para drogas já utilizadas, o estudo de novas c lasses de medicamentos para endometriose encontra uma barreira ética impo rtante, não - 4 -   devendo ser testadas diretamente em humanos. Por isso, modelos animais tem se mostrado uma ótima opção para o estudo experimental. Modelos ut ilizando ratas (Uchiide, Ihara e Sugamata, 2002) e coelhas (Silva et al. , 2004) se mostraram eficazes na indução da lesão endometriótica e similaridades imp ortantes com endometriose humana, permitindo a extrapolação dos resultados d e estudos com animais para a patogenia da doença humana. A escolha do modelo em ratas para o estudo experimental baseou-se no fato de apresentar técnica cir úrgica simples, ter altas taxas de sucesso na indução da endometriose e ser altamen te reprodutível (Jones, 1984). - 5 -   2. Justificativa Endometriose é uma doença de grande impacto na saúde pública. A angiogênese é de fundamental importância para a implantação e o crescimento da endometriose. Fatores angiogênicos atuam através do recrutament o de células endoteliais, organização da microvascularização e aumento da pe rmeabilidade vascular. Medicamentos que atuam inibindo a angiogênese constit uem um a classe promissora de drogas para tratamento primário ou adjuvante da e ndometriose, sem ação hormonal concomitante. - 6 -   3. Objetivos 3.1. Objetivo Geral Avaliar o efeito do bevacizumab sobre endometriose experimental mente induzida em ratas. 3.2. Objetivos específicos Avaliar a influência do agente anti-angiogênico bevacizumab sob re lesões de endometriose através da análise objetiva do tamanho final das l esões e da expressão proteica de VEGF na imunohistoquímica, assim como sua expressão gênica. Adicionalmente, quantificar a expressão gênica de marca dores de adesão – Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP9), proliferação – Antígeno Nu clear de Proliferação Celular (PCNA) e apoptose celular – Gene Supressor de Tumor p63 (Tp63). - 7 -   4. Metodologia O presente estudo foi realizado nos Departamentos de Ginecologi a e Obstetrícia e de Patologia e Medicina Legal, além do Setor de C irurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão preto da Universidade de São Paulo e foi aprovado no Comitê de Ética no uso de animais (CEUA) desta Instituição (Anexo 1). 4.1. Animais e Procedimentos para Modelo experimental Foram utilizadas 30 ratas Wistar virgens, com aproximadamente 2 00g no início do experimento, provenientes do Serviço de Biotério do C ampus Universitário de Ribeirão Preto. Para aclimatação, antes do início do experim ento, as ratas foram mantidas em gaiolas com 41x32 centímetros de perímetro e 17 cm de altura, com no máximo quatro animais por gaiola, sob controle ambiental de temperatura e umidade (22 a 25˚C) e luminosidade, com ciclo claro-escuro de 12 em 12 horas, por sete dias e alimentadas com água e ração Purina® para ratos a livre deman da, condições estas que permaneceram as mesmas durante todo o experimento. Inicialmente, todas as ratas foram submetidas a laparotomia par a indução da lesão de endometriose. A indução foi realizada após anestesia d os an im ais com a injeção intraperitoneal com 0,3ml de cloridrato de quetamina a 10% (Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional AS, Uso veterinário ) associado a 0,2ml de xilasina a 2mg/ml (Dopaser, Hertape Calier). A seguir, foram procedidos a tricotomia pélvica, os cuidados de antissepsia e a lavagem das luvas de látex utilizadas com soro fisiológico para reduzir a formação de ader ências. A cavidade pélvica foi aberta através de incisão longitudinal mediana de c erca de dois centímetros, a dois centímetros do púbis do roedor. Aberta a ca vidade, foram ressecados quatro centímetros do corno uterino esquerdo, sendo o coto uterino fechado na sequência (Figura 1). A porção uterina dissecada foi incisada longitudinalmente para retirada de dois fragmentos de 5x5 milím etros. Esses fragmentos de tecido endometrial foram suturados no peritônio p róximo ao trato - 8 -   reprodutivo da rata, usando o fio Vicryl 6-0 (Ethicon, Inc., Ne w Jersey, EUA), com a face endometrial voltada para a cavidade pélvica, sendo um frag mento à direita e o outro à esquerda. Posteriormente, a cavidade pélvica foi fechad a através de sutura contínua da musculatura e da pele com Nylon 4-0 (Mononylon 3-0, Ethicon, Inc. New Jersey, EUA). Todos os procedimentos descritos foram realizados p e l o m e s m o pesquisador e nenhuma suplementação hormonal foi administrada a ntes ou após a laparotomia, nem uso de antibioticoterapia ou profilática. Como droga analgésica pós-operatória foi utilizada dipirona na dose de 100mg/kg por s ete dias (Abbott e Hellemans, 2000). Figura 1: Identificação do corno uterino esquerdo. Após a primeira cirurgia, as ratas foram alocadas em três grupo s de 10 animais cada: um grupo controle (grupo Controle), em que não fo i utilizada droga alguma no pós-operatório; um grupo que recebeu a droga bevacizumab (2,5mg/kg) a cada 14 dias (grupo Baixa Dose) (Ozer et al. , 2013); e um terceiro grupo que recebeu a mesma droga, na mesma dose, porém a cada 3 dias (grup o Alta Dose). A droga foi administrada após quatro semanas da cirurgia, período necessário para implantação e consolidação da lesão (Novella-Maestre et al. , 2009) e durante um período de quatro semanas. Finalizadas as quatro semanas de tratamento, as ratas foram sub metidas à eutanásia através da sobredosagem de anestésicos (xilasina + quetamina), no dobro - 9 -   da dose utilizada anteriormente para a anestesia, e foi realiza da a inspeção da cavidade abdomino-pélvica, com identificação e documentação das lesões, sendo medida as lesões nos dois maiores diâmetros e documentada atrav és de fotografia macroscópica das lesões (Figuras 2 e 3). Figuras 2 e 3: Aspecto macroscópico das lesões peritoneais no momento da segunda abordagem cirúrgica. O corno uterino direito e as lesões de endometriose foram excis ados para análise, sendo os tecidos retirados divididos ao meio e process ados da seguinte - 10 -   forma: uma metade fixada em formol para processamento para incl usão em parafina e coloração por hematoxilina e eosina para documentação da pres ença ou não de tecido endometrial e reação de imunohistoquímica anti-VEGF.; e a outra metade armazenada com RNAlater e congelada em freezer -80 oC para posterior análise de biologia molecular. 4.2. Processamento do material para Coloração e imunohistoquími ca Os tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo uma parte f ixada em formol 10%, processada para inclusão em parafina e corada por h ematoxilina e eosina (HE) com objetivo de identificar a presença de lesões co mpatíveis com endometriose e posterior realização de imunohistoquímica. Foram realizados cortes histológicos com 4µm. Para o preparo da imunohistoquímica foi utilizado o kit Revel ( Biogen): os cortes foram desparafinizados em xileno e hidratados em uma sér ie de álcoois em ordem decrescente e água destilada. Em seguida, foram submetido s à recuperação antigênica com tampão de citrato (pH 6,0) em panela a vapor por 40 minutos e, logo após, as amostras foram resfriadas por 30 minutos em temperatura ambiente. Após o resfriamento, os cortes foram lavados em PBS para bloque io da peroxidase endógena por 15 minutos, em TBST por 5 minutos e foi r e a l i z a d o o bloqueio da proteína com Protein Block por 10 minutos. Então, as amostras foram incubadas no anticorpo primário (VEGF na diluição de 1:100) por 1 hora em temperatura ambiente. O processo para p reparo das lâminas após foi o seguinte: lavagem em TBST por 1 minuto, apli cação de Revel Complemento por 10 minutos, aspiração, aplicação de HRP conjuga do por 15 minutos, lavagem em TBST por 5 minutos, aplicação de DAB (3,3 d iaminobenzina) por 105 segundos, lavagem em água destilada. A coloração foi re alizada com Hematoxilina de Harris e azulada em amônia a 5%. Foi realizada a desidratação na ordem crescente de álcoois e xilol, com montagem das lâminas co m Entellan (Merck). - 11 -   As lâminas foram avaliadas por dois examinadores independentes e a reatividade para VEGF no citoplasma celular foi avaliada de for ma qualitativa e classificada em ausente, fraca a moderada (marrom claro a escur o) e forte (marrom escuro a preta, obscurecendo a cromatina nuclear). 4.3. Extração do RNA total e síntese do cDNA, quantificação por PCR em tempo real As amostras de tecidos coletadas foram lavadas em PBS 1X e arma zenadas em um microtubo contendo 200 uL de RNA later Solution (Ambion) . Esses microtubos foram estocados na geladeira por 24 horas e, após es se período, armazenados no freezer -80ºC até o isolamento do RNA total. Tod os os procedimentos foram realizados e m condições isentas de RNase, e vitando a contaminação com RNase exógena. O RNA total, extraído utilizando Trizol Plus RNA Purification K it (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante, foi tratado com DNA-fre e Kit (Invitrogen) para a remoção de possíveis contaminações com DNA genômico e em seguida foi quantificado por espectrofotometria à OD 260/280 (NanoDrop2000c , Thermo Scientific). Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir de 500 ηg de RNA total utilizando High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RN ase Inhibitor (Invitrogen). A PCR em tempo real foi realizado utilizando-se o equipamento 7 500 Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems). As seguintes sondas de hidrólise do tipo TaqMan (Applied Biosystems) foram utilizadas neste estudo: Rn01511602_m1 (Vegfa), Rn01404783_m1 (Tp63), Rn01514538_g1 (Pcna), Rn00579162 _m1 (Mmp9), Rn00667869_m1 (Actb) e Rn00560865_m1 (B2m). Os ciclos de PCR foram os seguintes: um ciclo de 95ºC durante 20 segundos, 40 ciclos d e 95ºC por 3 segundos e a 60ºC por 30 minutos. Cada reação de PCR foi realiz ada em triplicata. Os genes beta actina (Rn00667869_m1) e B2M (Rn 00560865_m1) for am utilizados como gene de referência para normalizar as reações. Como amostra calibradora nos c á l c u l o s f o i u s a d o u m pool de cDNA das amostras controles. As eficiências das - 12 -   sondas e primers foram testadas na reação de amplificação dos g enes selecionados. Para esse estudo, foram consideradas ideais as ef iciências na faixa de 90 a 110%. As reações de PCR em tempo real foram realizadas na diluição de 1:4 de cDNA. A expressão relativa para os genes analisados foi calculada para cada amostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT. 4.4. Análise estatística O teste qui-quadrado foi utilizado para verificar se existe ass ociação entre os grupos (alta, baixa ou controle) em relação à expressão de VEGF n a imunohistoquímica. O teste não paramétrico de Kruskal Wallis foi utilizado para co mparar os grupos quando a distribuição da variável resposta não tem uma d istribuição normal. Para as variáveis com p-valor menor que 0,05 no teste de Kruska l Wallis foi realizado o pós-teste de Dunn. As análises foram realizadas no programa SAS versão 9.3. Somente o pós- teste de Dunn que foi implementado no programa R versão 3.2.5. Foi considerado um nível de significância de teste de 5%. - 13 -   5. Resultados 5.1. Do preparo e coleta do material A média do peso inicial das ratas em cada grupo foi de 215,1g ( grupo Controle), 226g (grupo Baixa Dose) e 206g (grupo Alta Dose). Ao final do experimento, ou seja, no dia da eutanásia e da exérese das lesões, a média de peso entre os grupos era de: 387g (Controle), 394g (Baixa Dose) e 38 1g (Alta Dose), sem diferença estatística entre eles. (tabela 1) Tabela 1: Peso inicial e final das ratas Rata Controle Baixa Dose Alta Dose p Inicial Final Inicial Final Inicial Final 1 216 378 228 360 210 368 2 208 426 236 456 206 320 3 228 386 234 378 204 364 4 214 388 228 372 206 416 5 202 392 238 439 204 418 6 220 412 228 378 214 446 7 208 388 240 356 206 382 8 218 380 218 418 194 350 9 222 386 202 409 220 364 10 215 330 216 382 200 Óbito Média 215,1 387 226,8 394 206,4 381 p<0,05 A primeira cirurgia foi realizada nas 30 ratas da maneira inici almente descrita, não havendo nenhuma perda nesse momento. Após o início da medic ação, houve o óbito de uma rata do grupo Alta Dose, com causa provável infecção pós-cirúrgica. Foram anotadas as duas maiores medi das das lesões e calculadas suas áreas, evidenciando diferença estatística entre os grupos Alta e Baixa Dose quando comparados ao grupo Controle (tabela 2). - 14 -   Tabela 2: Área final das lesões nos diferentes grupos Variáveis Controle Baixa dose Alta dose p Diâmetro 1 0,99 0,45 0,56 0,02 Diâmetro 2 0,82 0,50 0,46 0,01 Área de lesão 1,16 0,23 0,35 0,002 5.2. Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica Todos os úteros apresentavam endométrio ativo na avaliação hist opatológica com coloração de Hematoxilina e Eosina, comprovando que o estím ulo para a indução da endometriose peritoneal foi igual em todas as ratas. A avaliação da HE (Figura 4) das lesões demonstrou a presença de endométrio em 9 ratas no grupo Controle(A), 9 ratas no grupo Baixa Dose (B) e 7 ratas no grupo Alta Dose (C). Figura 4: Coloração para HE (Aumento 100x) confirmando a presença de tecido endometrial nas lesões do grupo controle (A), Baixa Dose (B) e Alta Dose (C) - 15 -   A imunohistoquímica para VEGF no endométrio tópico das ratas mo strou positividade em todas as ratas. (tabela 3). A avaliação da imun ohistoquímica nas lesões endometrióticas está representada na tabela 4. Tabela 3: Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica do endométrio tópico (uterino) nos diferentes grupos Ausente Fraco-Moderado Forte p Alta Dose 0 (0) 0 (0) 9 (100) Baixa Dose 0 (0) 0 (0) 10 (100) Controle 0 (0) 5 (50) 5 (50) p =0,003 Tabela 4: Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica das lesões (endometriose induzida) entre os diferentes grupos Ausente Fraco-Moderado Forte p Alta Dose 2 (22) 3 (33) 4 (44) Baixa Dose 1 (10) 6 (60) 3(30) Controle 1 (10) 5 (50) 4 (40) p =0,79 No Grupo controle, cinco ratas apresentaram positividade fraca a moderada para VEGF no tecido endometriótico e 4 com positividade forte (Figura 5). Figura 5: Imunohistoquímica para VEGF em lesão do grupo controle mostrando positividade forte (Microscopia, aumento 100x). - 16 -   No grupo de Baixa Dose, três ratas apresentaram lesões com reat ividade forte e 6 ratas lesões com reatividade fraca a moderada. (Figura 6 e 7) Figuras 6 e 7: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca a moderada (à dir eita) em rata do grupo de baixa dose (Microscopia, aumento de 100x) Por fim, no grupo de Alta Dose, quatro ratas apresentaram posi tividade forte e 3 ratas, fraca a moderada. (Figuras 8 e 9) Figuras 8 e 9: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca (à direita) em ra ta do grupo de alta dose (Microscopia, aumento de 100x) Todas as ratas que não apresentaram positividade para VEGF, nos t r ê s grupos, corresponderam às mesmas ratas em que não foi encontrad o tecido endometrial na lesão à coloração com HE (Figuras 10 e 11). - 17 -   Figuras 10 e 11: Exemplos de lesão sem representatividade endometrial à HE (à esquerda) e sem marcação de VEGF na imunohistoquímica (à direita). Não houve diferença estatística entre os grupos na imunohistoqu ímica para VEGF (p=0,79). 5.3. Da avaliação genética Não houve diferença estatística entre os grupos na expressão gê nica do MMP9, tanto no útero (p=0,33) como nas lesões (p=0,24), assim c omo também não foi encontrada diferença na expressão do PCNA (p=0,06 para o út ero e p=0,7 para lesão). Não houve diferença na expressão gênica do VEGF nas lesões, com p=0,07. Com relação ao TP63, foi encontrada diferença estatística entre os grupos tanto nos úteros (p=0,03) como nas lesões (p=0,04). Os dados encontram-se resumidos na tabela 5. - 18 -   Tabela 5 : Comparação entre os grupos para a expressão gênica de cada ti po de gene. P-valor referente ao teste de Kruskall Wallis. Variável Grupo N Média D .P. Mediana Q1 Q3 Mínimo Máximo P Útero MMP9 altadose 9 0,60 1,04 0,05 0,04 0,33 0,02 2,48 0,33 baixadose 8 0,13 0,26 0,03 0,02 0,08 0,01 0,76 controle 10 0,36 0,62 0,06 0,04 0,43 0,02 1,89 Lesão MMP9 altadose 7 0,99 1,02 0,61 0,22 1,95 0,16 2,83 0,24 baixadose 10 0,88 1,24 0,38 0,14 1,17 0,03 4,17 controle 10 0,27 0,20 0,24 0,14 0,38 0,04 0,69 Útero PCNA altadose 9 0,82 0,77 0,72 0,43 0,74 0,09 2,69 0,06 baixadose 8 1,40 1,21 0,91 0,55 2,24 0,27 3,53 controle 10 9,26 24,6 1,34 1,16 2,40 0,45 79,20 Lesão PCNA altadose 7 0,79 0,73 0,56 0,36 1,36 0,04 2,18 0,70 baixadose 10 0,92 0,57 0,97 0,47 1,24 0,23 1,99 controle 10 0,91 0,51 0,81 0,65 1,39 0,21 1,84 Útero TP63 altadose 9 0,23 0,22 0,20 0,09 0,25 0,03 0,74 0,03 baixadose 8 0,28 0,23 0,21 0,13 0,41 0,05 0,71 controle 10 1,42 1,34 0,87 0,20 2,72 0,10 3,45 Lesão TP63 altadose 7 0,42 0,59 0,20 0,04 0,46 0,02 1,69 0,04 baixadose 10 2,12 2,94 1,34 0,41 2,19 0,07 10,00 controle 10 2,91 3,06 2,02 0,68 4,97 0,03 9,43 Útero VEGFA altadose 9 1,58 1,48 1,16 0,95 1,28 0,37 5,06 0,42 baixadose 8 2,07 1,38 1,71 1,26 2,47 0,59 5,06 controle 10 1,61 0,73 1,27 1,11 2,01 0,82 2,86 Lesão VEGFA altadose 7 0,98 0,64 0,95 0,41 1,65 0,05 1,88 0,07 baixadose 10 1,42 1,01 1,11 0,94 1,57 0,33 4,00 controle 10 1,82 0,69 1,76 1,27 2,25 0,83 3,04 O pós-teste de Dunn confirmou a diferença na expressão gênica d o TP63 nas lesões apenas quando comparado o Grupo de Alta Dose com o de Ba ixa Dose e com o grupo controle, não havendo diferença quando comparou gru po de Baixa Dose com grupo controle. (Tabela 6) Tabela 6: Pós-teste de Dunn para expressão do gene TP63 Baixo X Alta Baixo X Cont r Contr X Alta UteroTP63 0,3341 0,0275 0,0075 LesãoTP63 0,0227 0,316 0,0074 - 19 -   6. Discussão Como já previamente bem estabelecido, após ocorrer a adesão das células endometriais ao peritônio, as lesões endometrióticas precisam da neovascularização para se manter e crescer, estando isso diretamente relacionado com a invasão tecidual (Bourlev et al. , 2006; Laschke et al. , 2011; Laschke, Giebels e Menger, 2011; Nisolle et al., 1993). Drogas antiangiogênicas vem sendo estudadas como uma boa opção terapêutica para o tratamento da endometriose, o que foi possív el comprovar, nesse estudo, através de análise macroscópica, imunohistoquímica e de biologia molecular das lesões. 6.1. Avaliação macroscópica O uso do bevacizumab representou em redução da área das lesões (p=0,002) nos grupos de alta e de baixa dose quando comparados ao grupo c ontrole, confirmando a informação já conhecida de que inibidores da angi ogênese atuem diretamente inibindo o crescimento da lesão. Na literatura, Soy sal et al. (Liu et al., 2016; Soysal et al., 2014) demonstrou resultados que corroboram os desse estudo, com comprovação de redução na taxa de adesão celular e aumento na taxa de apoptose com o uso de Bevacizumab, efeitos que comprovou serem iguais àqueles encontrados com o uso de análogos de GnRH. Ricci et al. (Ricci et al., 2011) e Ozer et al ( O z e r et al. , 2013) também encontraram em seus estudos reduções significativas no volume das lesões após o uso do bevacizumab e m comparação com grupos controles. 6.2. Avaliação Imunohistoquímica Em nosso estudo, a imunohistoquímica para VEGF no endométrio tó pico (uterino) demonstrou que o bevacizumab não apresenta efeito nesse local (p=0,003). - 20 -   Sendo a endometriose uma patologia comum entre mulheres inférte is, com prevalência chegando a 50% entre esse grupo específico (Bullett i et al. , 2010), existir uma medicação que controle a doença sem afetar o endomé trio tópico é um importante ponto. A ausência de ação no endométrio uterino enco ntrada no estudo permite inferir que o bevacizumab tenha essa característica, pr eservando a funcionalidade do endométrio tópico e não prejudicando, futuram ente, a ocorrência de uma gestação. As drogas que são utilizadas para tratamento d a endometriose atualmente carecem desse perfil de ação Em relação à expressão proteica do VEGF nas lesões, o estudo nã o demonstrou diferença estatística entre os grupos. Entretanto, p odemos observar que houve um desvio da intensidade da positividade, sendo encontrad o mais positividade fraca a moderada do que positividade forte. Ozer e t al. (Ozer et al. , 2013) comparou o efeito do Bevacizumab em dosagem intermediária à utilizada no presente estudo (30mg/kg, dose total) com duas outras drogas (S orafenib e Ácido Retinóico) e com controle (nenhuma medicação) na expressão de V EGF na imunohistoquímica e na microvascularização e no volume das lesõ es endometrióticas, obtendo resultados significativamente melhores c o m o bevacizumab em relação às outras duas drogas e em relação ao gr upo controle.. Ozer também comparou o efeito das drogas utilizadas na reserva ovariana das ratas, não encontrando redução da mesma. 6.3. Avaliação em Biologia Molecular 6.3.1. Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP9) A MMP9 está envolvida na decomposição da matriz extracelular em processos fisiológicos normais, como desenvolvimento embrionári o, reprodução e remodelação de tecidos, e em processos patológicos, como artrit e, metástases e endometriose. A MMP9, assim como outras MMPs, tem demonstrado s er um fator importante na progressão e invasão de tumores de endométrio (Gr aesslin et al. , 2006). O mecanismo patogênico da endometriose inclui, além de p roliferação e invasão, degradação da matriz extracelular, com facilitação na penetração da - 21 -   camada basal pelas células endometriais, já tendo sido demonstr ado níveis elevados de MMP9 no líquido peritoneal e no plasma em pacientes c o m endometriose (Liu et al., 2015). A inibição das MMPs ocorre por genes da família TIMP (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase). Mulheres com endometriose possuem um a expressão diferente de MMP9 e TIMP2 no endométrio tópico e no ectópico, s endo que baixos níveis de TIMP2 no fluido peritoneal levam a um aumento na MMP9 e t a l desequilíbrio favorece a degradação da matriz extracelular e a invasão tecidual, promovendo a implantação de tecido endometrial ectópico (Londero et al., 2012). Com base em tudo o que já se sabe, esperávamos que houvesse uma redução na expressão gênica da MMP9 com o uso do bevacizumab, j á que a medicação reduziu o tamanho das lesões. Porém, o estudo não dem onstrou esta diferença esperada entre os grupos, tanto na avaliação das lesões quanto do útero. 6.3.2. Antígeno de Proliferação Nuclear (PCNA) O PCNA é um gene que codifica uma proteína encontrada no núcleo celular, cofator da DNA polimerase, expressa durante a fase de síntese d e DNA, sendo então, um marcador de proliferação celular. Além de ser utilizado para avaliação de proliferação celular em determinados tumores malignos, o PCNA vem mostrando uma correlação entre o n ível de expressão e o grau de invasão da endometriose, com as maiores t axas de proliferação celular sendo encontradas em endometriose colorret al e menores em endometriose peritoneal (Weigel et al., 2012). Ricci et al. (Ricci et al., 2011), em 2011, comparou a quantificação de VEGF no lavado peritoneal e a expressão de PCNA na imunohistoquímica das lesões de endometriose induzidas experimentalmente em ratas entre grupo c ontrole e grupo que recebeu bevacizumab na dosagem de 5mg/kg a cada 3 dias (o d obro da dose utilizada no grupo Alta Dose neste estudo). Foi demonstrado red ução nos dois parâmetros, com significância estatística, favorecendo o uso do bevacizumab. - 22 -   No presente estudo, a avaliação da expressão gênica do PCNA não encontrou diferença estatística entre os grupos, o que pode sig nificar, baseado no estudo citado, que a dose utilizada no estudo ou foi insuficien te para afetar a expressão do gene, embora tenha levado à redução objetiva nas á reas das lesões, conforme já mencionado, mas que a dose utilizada possa atuar na expressão proteica, que não foi avaliada no presente estudo. 6.3.3. Proteína tumoral p63 (Tp63) A proteína de membrana p63 é um homólogo do gene supressor de tumor p53. É expresso em células escamosas basais do colo uterino, ma ma, glândula salivar e próstata e tem papel na regulação da proliferação e d iferenciação epitelial, demonstrando ser um bom marcador de diferenciação celular (Di Como et al., 2002). Poli Neto et al.(Poli Neto et al., 2007), em 2007, demonstrou que células com marcação para p63 na imunohistoquímica se concentram principalm ente em endometriose peritoneal e endomet rioma, não havendo marcação na maior parte dos casos de adenomiose, endometriose retovaginal e endometrios e de parede abdominal. Esses dados sugerem que a patogenia das lesões perit oneais seja diferente das lesões profundas. O nível de positividade para p6 3 não está correlacionado ao grau da endometriose. Os resultados do presente estudo demonstraram redução significa tiva na expressão gênica do Tp63 tanto na lesão quanto no útero, sugeri ndo que o bevacizumab tenha, de fato, agido na diferenciação celular dos implantes endometrióticos. Quando comparados de forma separada, notamos q ue a baixa dose foi suficiente para apresentar efeito no endométrio eutópi co (p=0,02), entretanto foi necessária uma alta dose para haver efeito na le são (p=0,31 na comparação entre Baixa Dose e Controle, versus p=0,007 na compa ração entre Alta Dose e Controle). - 23 -   6.3.4. Fator de Crescimento Endotelial Vascular A (VEGFA) O VEGFA codifica uma proteína de ligação à heparina que induz a proliferação e migração de células endoteliais vasculares, send o essencial para angiogênese. A regulação desse gene encontra-se alterada em mui tos tumores, correlacionando-se com o estágio tumoral e a progressão. Como já mencionado, a angiogênese tem papel central no estabele cimento das lesões endometrióticas, sendo que a disrupção desse process o culmina na redução das lesões, conforme dem onstrado em estudos prévios que a v a l i a r a m a expressão proteica do VEGF (Ozer et al., 2013). Não foi encontrada diferença estatística na expressão gênica ut erina do VEGFA nos grupos avaliados nesse estudo, o que demonstra que o bevacizumab não age nas células endometriais tópicas. Também não houve dife rença estatística na análise da expressão nas lesões (p=0,07), embora a avaliação pormenorizada dos resultados permita inferir que haja uma tendência a diferen ça estatística, que talvez possa ser obtida com um aumento do número amostral. - 24 -   7. Conclusões No presente estudo da ação do bevac izumab nas lesões endometrió ticas experimentalmente induzidas em ratas, observamos que: 1. Houve redução significativa da área das lesões entre os grup os, sugerindo que o bevacizumab tenha um efeito positivo no controle da doença. 2. Não houve alteração na expressão proteica do VEGF no útero d as ratas, independentemente do uso do bevacizumab e da dose empregada, sugerindo que a ação da droga é maior do tecido endometrial ect ópico do que no endométrio tópico. 3. A expressão gênica do Tp63 foi significativamente menor no g rupo Alta Dose quando comparado aos outros dois grupos, do que concluímos que o bevacizumab atue reduzindo a diferenciação celular nas lesões. 4. A avaliação da expressão gênica do VEGFA nas lesões demonstr a uma tendência a redução para os grupos que usaram a medicação quand o comparados ao grupo controle. Esses achados permitem concluir que inibidores da angiogênese s ejam opções reais para o tratamento da endometriose, com grandes per spectivas de ação seletiva na lesão, sem prejuízo da função reprodutiva da paciente. Estudos futuros devem ser focados na ação da droga na expressão proteica de fatores envolvidos na adesão e diferenciação celular, com ap rofundamento no estudo de seu efeito tanto no endométrio tópico como nos ovários. Tais descobertas poderão otimizar o tratamento das pacientes co m endometriose, reduzindo o grande impacto que tem hoje essa doen ça na saúde pública. - 25 -   Referências Bibliográficas ABBOTT, F. V.; HELLEMANS, K. G. Phenacetin, acetami nophen and dipyrone: analgesic and rewarding effects. Behavioural Brain Research , v. 112, n. 1–2, p. 177–186, jul. 2000.   ACOG COMMITTEE ON PRACTICE BULLETINS--GYNECOLOGY. ACOG Practice Bulletin No. 11: Medical management of endometriosis. Obstetrics and Gynecology, v. 94, n. 6, p. 1–14, dez. 1999. BECKER, C. M.; D’AMATO, R. J. Angiogenesis and antiangiogenic t herapy in endometriosis. Microvascular Research, v. 74, n. 2–3, p. 121–130, nov. 2007. BOURLEV, V. et al. The relationship between microvessel density, proliferative activity and expression of vascular endothelial growth factor-A and its receptors in eutopic endometrium and endometriotic lesions. Reproduction, v. 132, n. 3, p. 501– 509, 1 set. 2006. BULLETTI, C. et al. 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