{"paper_id":"46acfbe8-54f3-45ac-917f-4527417058d4","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \n \n \nANA CAROLINA TAGLIATTI ZANI \n \n \n \n \n \nInfluência do agente antiangiogênico Bevacizumab em endometriose \nexperimentalmente induzida em ratas \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2017 \n  \n\n \n \nANA CAROLINA TAGLIATTI ZANI \n \n \nInfluência do agente antiangiogênico Bevacizumab em endometriose \nexperimentalmente induzida em ratas \n \nVersão Original \n \nDissertação apresentada à Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto para obtenção \ndo título de Mestre em Medicina \n \nLocais de execução: Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia e Departamento \nde Patologia e Medicina Legal \n \nOrientador: Prof. Dr. Júlio César Rosa e \nSilva  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2017 \n\n \n \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a \nfonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nZani, Ana Carolina Tagliatti \n \nInfluência do agende antiangiogênico Bevacizumab em endometriose \nexperimentalmente induzida em ratas. / Ana Carolina Tagliatti Zani ; orientador, \nJúlio César Rosa e Silva. Ribeirão Preto, 2017. \n \nDissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina da Ribeirão Preto, \nUniversidade de São Paulo, 2017. \n \n \n1. Endometriose. 2. Angiogênese. 3. Bevacizumab. 4. VEGF. 5. Proliferação \nCelular. 6.Invasão Tecidual. 7. Ratas \n \n \n \n \n \n  \n\n \n \nNome: ZANI, Ana Carolina Tagliatti \nTítulo: Influência do agente antiangiogênico Bevacizumab em endometriose \nexperimentalmente induzida em ratas \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de \nMestre. \nAprovado em: \nBanca Examinadora \n \nProf. Dr. \nInstituição: \nJulgamento: \n \n_________________________________________________________ \n_________________________________________________________ \n_________________________________________________________ \nProf. Dr. \nInstituição: \nJulgamento: \n \n_________________________________________________________ \n_________________________________________________________ \n_________________________________________________________ \nProf. Dr. \nInstituição: \nJulgamento: \n \n_________________________________________________________ \n_________________________________________________________ \n_________________________________________________________ \n  \n \n  \n\n \n \nAgradecimentos \n \n \nAgradeço, em primeiro lugar, a meu pai, João Luís, e minha mãe,  Rosilei, por \nsempre acreditarem em minha capacidade e me apoiarem em todas a s decisões \nque tomei em minha vida pessoal e profissional. Agradeço, també m, a meus irmãos, \nVinícius e Vítor. Sem essas quatro pessoas não seria metade do que sou hoje, sem \no apoio, mesmo a distância, não teria metade das conquistas que tenho hoje. \nA Demetrio agradeço a persistência que teve em não me deixar pe rder minha \nprópria persistência, o suporte emocional que tem me dado no dia a dia.  \nAmizades são sempre especiais e cada uma delas colabora um pouq uinho \nem nossas vidas. Um agradecimento especial ao José Vitor, que m e incentivou na \nespecialidade, me despertou no assunto, e a Julia, por toda a c olaboração na \nconfecção dessa dissertação, nos  prazos e burocracias. E obriga da aos dois pela \namizade. \nAgradeço todos os que me ajudaram no trabalho braçal: à equipe do \nlaboratório de cirurgia experimental da FMRP-USP (especialmente  o Carlinhos), à \nequipe do laboratório de Ginecologia e Obstetrícia (Juliana, Cr istiana e Lilian) e do \nlaboratório de patologia (Laura e Professor Alfredo). \nUm obrigada especial ao Professor Júlio, meu orientador, pela p aciência, \npelas dúvidas sanadas, pelos incentivos, por não ter desistido d e  m i m  e  p e l a  \ncompreensão nos últimos meses. \nAgradeço a todas as pacientes, que me ensinam a cada dia mais. \nE, acima de tudo, agradeço a Deus, pela capacidade me dada para  concluir \nmais esse projeto em minha vida! \n \n  \n\n \n \nZANI, A. C. T. Influência do agente antiangiogênico Bevacizumab  e m  \nendometriose experimentalmente induzida em ratas. Dissertação d e Mestrado. \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, 2017. \nResumo \nA endometriose, caracterizada por crescimento de tecido endomet rial fora da \ncavidade uterina, é responsável por sintomas álgicos com grande  impacto na \nqualidade de vida da paciente. Várias linhas de medicações têm sido estudadas \npara essa o tratamento da endometriose, já que a cirurgia não é  o tratamento de \nescolha sempre e, quando realizado, não é um tratamento definit ivo. O \nconhecimento da patogenia da endometriose é fundamental para o estudo de novas \nclasses de medicações. Uma delas, os fatores inibitórios da ang iogênese, tem papel \nfundamental no estabelecimento e crescimento de lesões de endom etriose. Neste \nestudo, buscamos a influência da Bevacizumab, droga anti-fator de crescimento \nendotelial (anti-VEGF), utilizada em duas dosagens diferentes, em endometriose \nperitoneal induzida em ratas, modelo animal já bem estabelecido  para o estudo de \nendometriose. As ratas permaneceram sob tratamento durante 4 se manas, após as \nquais foram sacrificadas, sendo as lesões e o corno uterino rem anescente retirados \npara posterior avaliação. Foi realizada avaliação da área das lesões de cada rata, da \npresença de tecido endometrial à microscopia, da positividade p ara o anticorpo anti-\nVEGF na imunohistoquímica e da expressão gênica de PCNA, MMP9, Tp63 e \nVEGFA. O bevacizumab atuou reduzindo a área das lesões nos grup os que \nreceberam medicação (p=0,002) e reduzindo a expressão gênica pa ra Tp63 nas \nlesões (p=0,04). Não houve resultado significativo nas outras avaliações \nPalavras-chave: Endometriose. Angiogênese. Bevacizumab. VEGF. Proliferação \nCelular. Invasão Tecidual. Ratas. Diferenciação Celular. \n \n \n  \n\n \n \nZANI, A. C. T. Influence of antiangiogenic agent bevacizumab on endometriosis \nexperimentally induced in rats. Dissertation (Mestrado). Faculd ade de Medicina \nde Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, 2017. \nAbstract \nEndometriosis, characterized by growth of endometrial tissue ou tside the \nuterine cavity, is responsible for painful symptoms with great impact on the quality of \nlife of women. Several lines of medications have been studied f or endometriosis’s \ntreatment, since surgery is not a lways the treatment of choice and, when done, it is \nnot a definitive treatment. Knowing the pathogenesis of this di sease is fundamental \nfor the study of new classes of medications. One of them, the i nhibitory factors of \nangiogenesis, plays a fundamental role in the establishment and  growth of \nendometriosis lesions. In this study, we sought the influence o f Bevacizumab, an \nanti-endothelial growth factor (anti-VEGF) drug, used in two di fferent dosages, in \nperitoneal endometriosis induced in rats, an animal model well established for the \nstudy of endometriosis. The rats remained under treatment for 4  weeks, after which \nthey were sacrificed, with the remaining lesions and uterine ho rn being removed for \nfurther evaluation. An evaluation of the lesion area of each ra t, the presence of \nendometrial tissue under microscopy, the positivity of the anti -VEGF antibody in \nimmunohistochemistry and the gene expression of PCNA, MMP9, Tp6 3 and VEGFA \nwere performed. Bevacizumab wo rked by reducing the area of the lesions in the \ngroups receiving medication (p = 0.002) and reducing the gene e xpression for Tp63 \nin the lesions (p = 0.04). There was no significant result in the other evaluations \nKey words: Endometriosis. Angiogenesis. Bevacizumab. VEGF. Cell  Proliferation. \nTissue Invasion. Rats. Cell Differentiation. \n \n \n \n  \n\n \n \nLista de Tabelas \n \nTabela 1:  Peso inicial e final das ratas. ............................. ........................ 13 \nTabela 2: Área final das lesões nos diferentes grupos. ................. ........... 14 \nTabela 3: Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica do \nendométrio tópico (uterino) nos diferentes grupos. ............ ........ 15 \nTabela 4:  Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica das lesões \n(endometriose induzida) entre os diferentes grupos. ........... .......... 15 \nTabela 5: Comparação entre os grupos para a expressão gênica de cada tip o de \ngene. P-valor referente ao teste de Kruskall Wallis. .......... .......... 18 \nTabela 6: Pós-teste de Dunn para a expressão do gene TP63 .............. ...... 18 \n  \n\n \n \nLista de Figuras \n \nFigura 1:  Identificação do corno uterino esquerdo  .............................. 8 \nFigura 2 e 3: Aspecto macroscópico das les ões peritoneais no momento da \nsegunda abordagem cirúrgica. ............................................. 9 \nFigura 4: Coloração para HE (aumento 100x) confirmando a presença de \ntecido endometrial nas lesões do grupo controle (A), Baixa Dose  \n(B) e Alta Dose (C) ............................................................... 14 \nFigura 5: Imunohistoquímica para VEGF em lesão do grupo controle \nmostrando positividade forte (Microscopia, aumento 100x)...15 \nFiguras 6 e 7: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca a moderada (à \ndireita) em rata do grupo de baixa dose (Microscopia, aumento \nde 100x) ................................................................................ 16 \nFiguras 8 e 9: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca (à direita) em r ata \ndo grupo de alta dose (Microscopia, aumento 100x) .......... 16  \nFiguras 10 e 11: Exemplos de lesão sem representatitvidade endometrial à HE (à \nesquerda) e sem marcação de VEGF na imunohistoquímica (à \ndireita). Microscopia, aumento .............................................. 17 \n \n  \n\n \n \nLista de Abreviaturas \n \nMMPs  Metaloproteinases de Matriz \n  MMP9  Metaloproteinase de Matriz 9 \n  VEGF  Fator de Crescimento Endotelial Vascular \n  GnRH  Hormônio Liberador de Gonadotrofinas \n  VEGFR2 Receptor 2 do VEGF \n  PCNA  Antígeno Nuclear de Proliferação Celular \n  Tp63  Gene Supressor de Tumor p63 \n  CEUA  Comitê de Ética no Uso de Animais \n  RNA  Ácido Ribonucleico \n  HE  Hematoxilina e Eosina \n  pH  Potencial hidrogeniônico \n  PBS  Tampão de Solução Salina \n  TBST  Tris buffered saline e Polissorbato 20   \n  HRP  Enzima Peroxidase \n  DAB  Diaminobenzina \n  cDNA  Ácido Desoxirribonucleico Complementar \n  DNA  Ácido Desoxirribonucleico \n  PCR  Reação em Cadeia da Polimerase \n  TIMP  Inibidor tecidual da Matriz de Metaloproteinase \n \n \n \n  \n\n \n \nLista de Símbolos \n \n \n  %  Porcentagem \n  g  gramas  \n  cm  centímetros \n  ˚C  graus Celsius \n  ®  Marca Registrada \n  ml  mililitro \n  mg  miligrama \n  kg  quilograma \n  µl  microlitro \n   \n    \n\n \n \nSumário \n \n1. Introdução ................................................. .............................................. 1 \n \n2. Justificativa .............................................. ................................................. 5 \n \n3. Objetivos .................................................. ............................................. 6 \n3.1. Objetivos Gerais  ........................................ ....................... 6 \n3.2. Objetivos Específicos .................................... ........................... 6 \n \n4. Metodologia ................................................ ............................................... 7 \n4.1. Animais e Procedimentos para modelo experimental ......... ............ 7 \n4.2. Processamento do material para Coloração e imunohistoquími ca...10 \n4.3. Extração do RNA total e síntese do cDNA, quantificação por  PCR em  \ntempo real  ................................................... ................................. 11 \n4.4. Análise estatística  ..................................... .......................... 12 \n \n5. Resultados ................................................. .............................................. 13 \n5.1. Do preparo e coleta do material .......................... .......................... 13 \n5.2. Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica ......... ............... 14 \n5.3. Da avaliação genética .................................... ........................... 17 \n \n6. Discussão .................................................. ............................................. 19 \n6.1. Avaliação macroscópica ................................... .............................. 19 \n6.2. Avaliação imunohistoquímica .............................. ........................... 19 \n6.3. Avaliação em biologia molecular .......................... .......................... 20 \n6.3.1. Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP9) .................... ........... 20 \n6.3.2. Antígeno de Proliferação Nuclear (PCNA) ................ ............... 21 \n6.3.3. Proteína tumoral P63(Tp63) ............................. ....................... 22 \n6.3.4. Fator de Crescimento Endotelial Vascular A (VEGFA) ..... ..... 23 \n \n7. Conclusões ................................................. .............................................. 24 \n \n\n \n \nReferências Bibliográficas  ................................... ....................................... 25 \nAnexo  ........................................................ .................................................. 29 \n \n \n \n \n \n\t\n  \n\n- 1 - \n \n1. Introdução \n \nEndometriose é uma doença caracterizada pelo crescimento de glâ ndula e \nestroma endometriais fora da cavidade uterina. É uma doença ben igna, dependente \ndo status hormonal da mulher (estrógeno-dependente), que ocorre  em 5 a 10% das \nmulheres em idade reprodutiva (Worley et al., 2013), podendo chegar de 40 a 60% \nentre as mulheres com dismenorreia (Farquhar, 2007). \nOs principais sintomas de endometriose são dismenorreia, dor pé lvica não \nrelacionada à menstruação e infertilidade (Catenacci, Sastry e Falcone, 2009). Tais \nsintomas tem grande impacto no bem estar físico, mental e socia l da mulher \n(Dunselman et al. , 2014) e configuram, por isso, um problema de saúde pública, \ntornando fundamental o seu correto tratamento. \nPara que o tratamento da endometriose seja eficaz, faz-se neces sário \nconhecer a sua patogenia. Várias teorias tentam explicá-la. A m ais aceita, a teoria \nde Sampson, propõe que lesões endometrióticas se originam de fr agmentos \nendometriais que, durante a menstruação, caem de forma retrógra da (via tubas \nuterinas) na cavidade peritoneal (Sampson, 1927). Se levarmos e m consideração \nque a menstruação retrógrada ocorre em 76 a 90% das mulheres no  menacme, \nincidência maior que a da própria endometriose, a teoria da men struação retrógrada \nnão é suficiente para justificá-la.  \nOutras teorias surgiram para dar essa explicação, como as que r elacionam \nfatores imunológicos, fatores de adesão celular e a metaplasia celômica à gênese da \nendometriose (Gazvani, Rafet e Templeton, 2002; Gazvani, R. e T empleton, 2002; \nKruitwagen et al., 1991; Suginami, 1991). A teoria da metaplasia celômica explic a a \nocorrência de endometriose em localizações extra-pélvicas, como cavidade pleural e \nem mulheres que nunca menstruaram. Está embasada na diferenciaç ão de células \ncelômicas primitivas em células endometriais (Suginami, 1991).  \nO conhecimento da composição do fluido peritoneal (fatores imun ológicos e \nos fatores de adesão celular) ajudou a explicar o motivo da end ometriose não ter \numa incidência maior, dada a incidência de menstruação retrógra da na população e \na presença de tecido celômico em todas as mulheres. \n\n- 2 - \n \nO fluido peritoneal nas pacientes com endometriose contém maior  número de \nmacrófagos, que se encontram mais ativados. Após a adesão das c élulas \nendometriais ao peritônio, os macrófagos locais, através da pro dução de \ninterleucinas 1 e 8, estimulam a produção de metaloproteinases de matriz (MMPs). \nEntre as MMPs, a MMP9 está sabi damente envolvida na invasão tec idual de vários \ntumores e tem sido relacionada à patogenia da endometriose, com  demonstrações \nde elevados níveis tanto no líquido peritoneal como no plasma s anguíneo de \npacientes com diferentes graus de endometriose (Liu et al., 2015). \nSeguindo a adesão e invasão tecidual, ocorre o estímulo à angio gênese, \natravés, principalmente, do fator de crescimento vascular endot elial (VEGF), \nproduzido tanto pelas células endometriais em hipóxia como pelo s macrófagos \nperitoneais (Groothuis et al. , 2005). As lesões endometrióticas são ricamente \nvascularizadas e estudos já comprovaram que o surgimento de nov os vasos tem \nimportância central, seja através de vasos já existentes na pro ximidade ou através \ndo recrutamento de células precursoras endoteliais (Bourlev et al., 2006; Laschke et \nal., 2011; Laschke, Giebels e Menger, 2011; Nisolle et al., 1993). O VEGF estimula a \nmigração e a proliferação de células endoteliais e aumenta a pe rmeabilidade \nvascular, com maior ou menor expressão proteica sendo encontrad a a depender do \ngrau da doença: quanto maior a invasão tecidual, maior o nível proteico do VEGF \n(Song et al. , 2014)(Machado et al. , 2008). Sem uma angiogênese adequada, não \nsão possíveis a manutenção das lesões e o seu crescimento local , o que nos leva à \nhipótese de que uma medicação que atue na cascata da angiogênes e possa ser \numa boa aposta para o tratamento da endometriose (Becker e D’Am ato, 2007; Hull \net al., 2003; Laschke e Menger, 2012; Nap et al., 2004; Taylor, Lebovic e Mueller, \n2002).  \nO padrão ouro de diagnóstico da endometriose é a visualização d ireta das \nlesões via laparoscópica com confirmação histológica através do  achado de \nmacrófagos com hemossiderina ou tecido endometrial, glândulas ou estroma (ACOG \nCommittee on Practice Bulletins--Gynecology, 1999). O tratament o cirúrgico tem a \nintenção de reduzir a dor e aumentar as taxas de fertilidade. P ara tanto, é \nnecessário remover todas as lesões visíveis e restaurar a anato mia pélvica, o que \ntorna a laparoscopia um procedimento diagnóstico e terapêutico. \n\n- 3 - \n \nBasear todo o tratamento da endometriose na cirurgia não é adeq uado, pois a \nendometriose apresenta-se em diferentes formas micro e macrosco picamente, em \nalguns casos, inclusive, não sendo possível identificá-las (How ard, 2011). Além \ndisso, nem sempre a opção cirúrgica é o melhor tratamento para uma determinada \npaciente, como quando lidamos com infertilidade, tornando o tra tamento \nmedicamentoso essencial para controle da dor e da progressão da s lesões (Petta et \nal., 2009). Nesse ponto, faz-se necessária a associação de medicam entos que \nreduzam o crescimento das lesões, bem como o aparecimento de novas. \nAs opções medicamentosas são vast as, algumas delas já bem estab elecidas \ne em uso, como os anticoncepcionais hormonais, os análogos do G nRH, os \ninibidores da aromatase. Tais classes de medicamentos possuem u ma limitação \nimportante na prática clínica: por atuarem através da modulação  hormonal, podem \ninibir a ovulação, não sendo uma opção adequada para as pacient es que desejam \nengravidar (Streuli et al., 2013). \nO foco deste estudo é um agente antagonista do fator de crescim ento \nendotelial vascular (anti-VEGF), o bevacizumabe, comparando-o e m duas dosagens \nno que diz respeito à redução de lesões endometrióticas induzidas em ratas.  \nBevacizumabe é um anticorpo monoclonal que se liga e neutraliza  de forma \nseletiva a atividade biológica do fator de crescimento do endot élio vascular humano \n(VEGF), inibindo sua ligação aos seus receptores, principalment e VEGFR2, na \nsuperfície das células endoteliais, com consequente redução da vascularização. Sua \nação antitumoral já está bem estabelecida no tratamento de tumo res sólidos, como \nem câncer de colon, mama, pâncreas e próstata, quando associado  a outros \nquimioterápicos (Shih e Lindley, 2006). O bevacizumab tem se mo strado eficaz \ntambém no tratamento de doenças vasculares retinianas, com resu ltados \ncomparáveis à foto coagulação (Ollendorf, Colby e Pearson, 2013 ). Mais \nrecentemente, estudos com bevacizumab já tem demonstrado result ados melhores \nem endometriose quando comparado com outras classes de drogas ( Soysal et al., \n2014). \nAssim como o estudo de qualquer nova droga para determinada doe nça, ou \nmesmo novos usos para drogas já utilizadas, o estudo de novas c lasses de \nmedicamentos para endometriose encontra uma barreira ética impo rtante, não \n\n- 4 - \n \ndevendo ser testadas diretamente em humanos. Por isso, modelos animais tem se \nmostrado uma ótima opção para o estudo experimental. Modelos ut ilizando ratas \n(Uchiide, Ihara e Sugamata, 2002) e coelhas (Silva et al. , 2004) se mostraram \neficazes na indução da lesão endometriótica e similaridades imp ortantes com \nendometriose humana, permitindo a extrapolação dos resultados d e estudos com \nanimais para a patogenia da doença humana. A escolha do modelo em ratas para o \nestudo experimental baseou-se no fato de apresentar técnica cir úrgica simples, ter \naltas taxas de sucesso na indução da endometriose e ser altamen te reprodutível \n(Jones, 1984). \n \n  \n\n- 5 - \n \n2. Justificativa \n \nEndometriose é uma doença de grande impacto na saúde pública. A  \nangiogênese é de fundamental importância para a implantação e o  crescimento da \nendometriose. Fatores angiogênicos atuam através do recrutament o de células \nendoteliais, organização da microvascularização e aumento da pe rmeabilidade \nvascular. Medicamentos que atuam inibindo a angiogênese constit uem  um a classe \npromissora de drogas para tratamento primário ou adjuvante da e ndometriose, sem \nação hormonal concomitante. \n \n \n \n  \n\n- 6 - \n \n3. Objetivos \n \n3.1. Objetivo Geral \n \nAvaliar o efeito do bevacizumab sobre endometriose experimental mente \ninduzida em ratas. \n \n3.2. Objetivos específicos \n \nAvaliar a influência do agente anti-angiogênico bevacizumab sob re lesões de \nendometriose através da análise objetiva do tamanho final das l esões e da \nexpressão proteica de VEGF na imunohistoquímica, assim como sua  expressão \ngênica. Adicionalmente, quantificar a expressão gênica de marca dores de adesão – \nMetaloproteinase de Matriz 9 (MMP9), proliferação – Antígeno Nu clear de \nProliferação Celular (PCNA) e apoptose celular – Gene Supressor  de Tumor p63 \n(Tp63). \n \n \n  \n\n- 7 - \n \n4. Metodologia \n \nO presente estudo foi realizado nos Departamentos de Ginecologi a e \nObstetrícia e de Patologia e Medicina Legal, além do Setor de C irurgia Experimental \ndo Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina  de Ribeirão \npreto da Universidade de São Paulo e foi aprovado no Comitê de Ética no uso de \nanimais (CEUA) desta Instituição (Anexo 1). \n \n4.1. Animais e Procedimentos para Modelo experimental \n \nForam utilizadas 30 ratas Wistar virgens, com aproximadamente 2 00g no \ninício do experimento, provenientes do Serviço de Biotério do C ampus Universitário \nde Ribeirão Preto. Para aclimatação, antes do início do experim ento, as ratas foram \nmantidas em gaiolas com 41x32 centímetros de perímetro e 17 cm de altura, com no \nmáximo quatro animais por gaiola, sob controle ambiental de temperatura e umidade \n(22 a 25˚C) e luminosidade, com ciclo claro-escuro de 12 em 12 horas, por sete dias \ne alimentadas com água e ração Purina® para ratos a livre deman da, condições \nestas que permaneceram as mesmas durante todo o experimento. \nInicialmente, todas as ratas foram submetidas a laparotomia par a indução da \nlesão de endometriose. A indução foi realizada após anestesia d os  an im ais com  a \ninjeção intraperitoneal com 0,3ml de cloridrato de quetamina a 10% (Ketamina \nAgener, União Química Farmacêutica Nacional AS, Uso veterinário ) associado a \n0,2ml de xilasina a 2mg/ml (Dopaser, Hertape Calier). A seguir,  foram procedidos a \ntricotomia pélvica, os cuidados de antissepsia e a lavagem das luvas de látex \nutilizadas com soro fisiológico para reduzir a formação de ader ências. A cavidade \npélvica foi aberta através de incisão longitudinal mediana de c erca de dois \ncentímetros, a dois centímetros do púbis do roedor. Aberta a ca vidade, foram \nressecados quatro centímetros do corno uterino esquerdo, sendo o coto uterino \nfechado na sequência (Figura 1). A porção uterina dissecada foi  incisada \nlongitudinalmente para retirada de dois fragmentos de 5x5 milím etros. Esses \nfragmentos de tecido endometrial foram suturados no peritônio p róximo ao trato \n\n- 8 - \n \nreprodutivo da rata, usando o fio Vicryl 6-0 (Ethicon, Inc., Ne w Jersey, EUA), com a \nface endometrial voltada para a cavidade pélvica, sendo um frag mento à direita e o \noutro à esquerda. Posteriormente, a cavidade pélvica foi fechad a através de sutura \ncontínua da musculatura e da pele com Nylon 4-0 (Mononylon 3-0,  Ethicon, Inc. New \nJersey, EUA). Todos os procedimentos descritos foram realizados  p e l o  m e s m o  \npesquisador e nenhuma suplementação hormonal foi administrada a ntes ou após a \nlaparotomia, nem uso de antibioticoterapia ou profilática. Como  droga analgésica \npós-operatória foi utilizada dipirona na dose de 100mg/kg por s ete dias (Abbott e \nHellemans, 2000). \n \nFigura 1: Identificação do corno uterino esquerdo. \n \nApós a primeira cirurgia, as ratas foram alocadas em três grupo s de 10 \nanimais cada: um grupo controle (grupo Controle), em que não fo i utilizada droga \nalguma no pós-operatório; um grupo que recebeu a droga bevacizumab (2,5mg/kg) a \ncada 14 dias (grupo Baixa Dose) (Ozer et al. , 2013); e um terceiro grupo que \nrecebeu a mesma droga, na mesma dose, porém a cada 3 dias (grup o Alta Dose). A \ndroga foi administrada após quatro semanas da cirurgia, período  necessário para \nimplantação e consolidação da lesão (Novella-Maestre et al. , 2009) e durante um \nperíodo de quatro semanas. \nFinalizadas as quatro semanas de tratamento, as ratas foram sub metidas à \neutanásia através da sobredosagem de anestésicos (xilasina + quetamina), no dobro \n\n\n- 9 - \n \nda dose utilizada anteriormente para a anestesia, e foi realiza da a inspeção da \ncavidade abdomino-pélvica, com identificação e documentação das  lesões, sendo \nmedida as lesões nos dois maiores diâmetros e documentada atrav és de fotografia \nmacroscópica das lesões (Figuras 2 e 3). \n \nFiguras 2 e 3: Aspecto macroscópico das lesões peritoneais no \nmomento da segunda abordagem cirúrgica. \n \nO corno uterino direito e as lesões de endometriose foram excis ados para \nanálise, sendo os tecidos retirados divididos ao meio e process ados da seguinte \n\n\n- 10 - \n \nforma: uma metade fixada em formol para processamento para incl usão em parafina \ne coloração por hematoxilina e eosina para documentação da pres ença ou não de \ntecido endometrial e reação de imunohistoquímica anti-VEGF.; e a outra metade \narmazenada com RNAlater e congelada em freezer -80 oC para posterior análise de \nbiologia molecular. \n \n4.2. Processamento do material para Coloração e imunohistoquími ca \n \nOs tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo uma parte f ixada em \nformol 10%, processada para inclusão em parafina e corada por h ematoxilina e \neosina (HE) com objetivo de identificar a presença de lesões co mpatíveis com \nendometriose e posterior realização de imunohistoquímica. Foram  realizados cortes \nhistológicos com 4µm.  \nPara o preparo da imunohistoquímica foi utilizado o kit Revel ( Biogen): os \ncortes foram desparafinizados em xileno e hidratados em uma sér ie de álcoois em \nordem decrescente e água destilada. Em seguida, foram submetido s à recuperação \nantigênica com tampão de citrato (pH 6,0) em panela a vapor por  40 minutos e, logo \napós, as amostras foram resfriadas por 30 minutos em temperatura ambiente. \nApós o resfriamento, os cortes foram lavados em PBS para bloque io da \nperoxidase endógena por 15 minutos, em TBST por 5 minutos e foi  r e a l i z a d o  o  \nbloqueio da proteína com Protein Block por 10 minutos. \nEntão, as amostras foram incubadas no anticorpo primário (VEGF na diluição \nde 1:100) por 1 hora em temperatura ambiente. O processo para p reparo das \nlâminas após foi o seguinte: lavagem em TBST por 1 minuto, apli cação de Revel \nComplemento por 10 minutos, aspiração, aplicação de HRP conjuga do por 15 \nminutos, lavagem em TBST por 5 minutos, aplicação de DAB (3,3 d iaminobenzina) \npor 105 segundos, lavagem em água destilada. A coloração foi re alizada com \nHematoxilina de Harris e azulada em amônia a 5%. Foi realizada a desidratação na \nordem crescente de álcoois e xilol, com montagem das lâminas co m Entellan \n(Merck). \n\n- 11 - \n \nAs lâminas foram avaliadas por dois examinadores independentes e a \nreatividade para VEGF no citoplasma celular foi avaliada de for ma qualitativa e \nclassificada em ausente, fraca a moderada (marrom claro a escur o) e forte (marrom \nescuro a preta, obscurecendo a cromatina nuclear). \n \n4.3. Extração do RNA total e síntese do cDNA, quantificação por  PCR em \ntempo real \n \nAs amostras de tecidos coletadas foram lavadas em PBS 1X e arma zenadas \nem um microtubo contendo 200 uL de RNA later Solution (Ambion) . Esses \nmicrotubos foram estocados na geladeira por 24 horas e, após es se período, \narmazenados no freezer -80ºC até o isolamento do RNA total. Tod os os \nprocedimentos foram realizados e m condições isentas de RNase, e vitando a \ncontaminação com RNase exógena. \nO RNA total, extraído utilizando Trizol Plus RNA Purification K it (Ambion) de \nacordo com as instruções do fabricante, foi tratado com DNA-fre e Kit (Invitrogen) \npara a remoção de possíveis contaminações com DNA genômico e em  seguida foi \nquantificado por espectrofotometria à OD 260/280 (NanoDrop2000c , Thermo \nScientific). Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir de 500  ηg de RNA total \nutilizando High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RN ase Inhibitor \n(Invitrogen).  \nA PCR em tempo real foi realizado utilizando-se o equipamento 7 500 Fast \nReal-time PCR System (Applied Biosystems). As seguintes sondas de hidrólise do \ntipo TaqMan (Applied Biosystems) foram utilizadas neste estudo:  Rn01511602_m1 \n(Vegfa), Rn01404783_m1 (Tp63), Rn01514538_g1 (Pcna), Rn00579162 _m1 \n(Mmp9), Rn00667869_m1 (Actb) e Rn00560865_m1 (B2m). Os ciclos de PCR foram \nos seguintes: um ciclo de 95ºC durante 20 segundos, 40 ciclos d e 95ºC por 3 \nsegundos e a 60ºC por 30 minutos. Cada reação de PCR foi realiz ada em triplicata. \nOs genes beta actina (Rn00667869_m1) e B2M (Rn 00560865_m1) for am utilizados \ncomo gene de referência para normalizar as reações. Como amostra calibradora nos \nc á l c u l o s  f o i  u s a d o  u m  pool de cDNA das amostras controles. As eficiências das \n\n- 12 - \n \nsondas e primers foram testadas na reação de amplificação dos g enes \nselecionados. Para esse estudo, foram consideradas ideais as ef iciências na faixa \nde 90 a 110%. As reações de PCR em tempo real foram realizadas na diluição de \n1:4 de cDNA. A expressão relativa para os genes analisados foi calculada para cada \namostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT. \n \n4.4. Análise estatística \n \nO teste qui-quadrado foi utilizado para verificar se existe ass ociação entre os \ngrupos (alta, baixa ou controle) em relação à expressão de VEGF  n a  \nimunohistoquímica. \nO teste não paramétrico de Kruskal Wallis foi utilizado para co mparar os \ngrupos quando a distribuição da variável resposta não tem uma d istribuição normal. \nPara as variáveis com p-valor menor que 0,05 no teste de Kruska l Wallis foi \nrealizado o pós-teste de Dunn. \nAs análises foram realizadas no programa SAS versão 9.3. Somente o pós-\nteste de Dunn que foi implementado no programa R versão 3.2.5. Foi considerado \num nível de significância de teste de 5%. \n \n \n  \n\n- 13 - \n \n5. Resultados \n \n5.1. Do preparo e coleta do material \n \nA média do peso inicial das ratas em cada grupo foi de 215,1g ( grupo \nControle), 226g (grupo Baixa Dose) e 206g (grupo Alta Dose). Ao  final do \nexperimento, ou seja, no dia da eutanásia e da exérese das lesões, a média de peso \nentre os grupos era de: 387g (Controle), 394g (Baixa Dose) e 38 1g (Alta Dose), sem \ndiferença estatística entre eles.  (tabela 1) \nTabela 1: Peso inicial e final das ratas \nRata Controle Baixa Dose Alta Dose p \n Inicial Final Inicial Final Inicial Final  \n1 216 378 228 360 210 368  \n2 208 426 236 456 206 320  \n3 228 386 234 378 204 364  \n4 214 388 228 372 206 416  \n5 202 392 238 439 204 418  \n6 220 412 228 378 214 446  \n7 208 388 240 356 206 382  \n8 218 380 218 418 194 350  \n9 222 386 202 409 220 364  \n10 215 330 216 382 200 Óbito  \nMédia 215,1 387 226,8 394 206,4 381 p<0,05 \n  \nA primeira cirurgia foi realizada nas 30 ratas da maneira inici almente descrita, \nnão havendo nenhuma perda nesse momento. Após o início da medic ação, houve o \nóbito de uma rata do grupo Alta Dose, com causa provável infecção pós-cirúrgica. \nForam anotadas as duas maiores medi das das lesões e calculadas suas \náreas, evidenciando diferença estatística entre os grupos Alta e Baixa Dose quando \ncomparados ao grupo Controle (tabela 2). \n \n\n- 14 - \n \nTabela 2: Área final das lesões nos diferentes grupos \nVariáveis Controle Baixa dose Alta dose p \nDiâmetro 1 0,99 0,45 0,56 0,02 \nDiâmetro 2 0,82 0,50 0,46 0,01 \nÁrea de lesão 1,16 0,23 0,35 0,002 \n  \n5.2. Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica \n \nTodos os úteros apresentavam endométrio ativo na avaliação hist opatológica \ncom coloração de Hematoxilina e Eosina, comprovando que o estím ulo para a \nindução da endometriose peritoneal foi igual em todas as ratas.  A avaliação da HE \n(Figura 4) das lesões demonstrou a presença de endométrio em 9 ratas no grupo \nControle(A), 9 ratas no grupo Baixa Dose (B) e 7 ratas no grupo Alta Dose (C).  \n \nFigura 4: Coloração para HE (Aumento 100x) confirmando a presença de tecido \nendometrial nas lesões do grupo controle (A), Baixa Dose (B) e Alta Dose (C) \n\n\n- 15 - \n \nA imunohistoquímica para VEGF no endométrio tópico das ratas mo strou \npositividade em todas as ratas. (tabela 3). A avaliação da imun ohistoquímica nas \nlesões endometrióticas está representada na tabela 4.  \nTabela 3:  Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica do \nendométrio tópico (uterino) nos diferentes grupos \n Ausente Fraco-Moderado Forte p \nAlta Dose 0 (0) 0 (0) 9 (100)  \nBaixa Dose 0 (0) 0 (0) 10 (100)  \nControle 0 (0) 5 (50) 5 (50) p =0,003 \n \nTabela 4: Avaliação da positividade para VEGF na imunohistoquímica das  lesões \n(endometriose induzida) entre os diferentes grupos \n Ausente Fraco-Moderado Forte p \nAlta Dose 2 (22) 3 (33) 4 (44)  \nBaixa Dose 1 (10) 6 (60) 3(30)  \nControle 1 (10) 5 (50) 4 (40) p =0,79  \n \nNo Grupo controle, cinco ratas apresentaram positividade fraca a moderada \npara VEGF no tecido endometriótico e 4 com positividade forte (Figura 5). \n \nFigura 5: Imunohistoquímica para VEGF em lesão do grupo controle mostrando \npositividade forte (Microscopia, aumento 100x). \n\n\n- 16 - \n \nNo grupo de Baixa Dose, três ratas apresentaram lesões com reat ividade \nforte e 6 ratas lesões com reatividade fraca a moderada. (Figura 6 e 7) \n \n \nFiguras 6 e 7: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca a moderada (à dir eita) \nem rata do grupo de baixa dose (Microscopia, aumento de 100x) \n \n Por fim, no grupo de Alta Dose, quatro ratas apresentaram posi tividade forte e \n3 ratas, fraca a moderada. (Figuras 8 e 9) \n \n \nFiguras 8 e 9: Exemplos de reação forte (à esquerda) e fraca (à direita) em ra ta do \ngrupo de alta dose (Microscopia, aumento de 100x) \n \nTodas as ratas que não apresentaram positividade para VEGF, nos  t r ê s  \ngrupos, corresponderam às mesmas ratas em que não foi encontrad o tecido \nendometrial na lesão à coloração com HE (Figuras 10 e 11). \n\n\n- 17 - \n \n \nFiguras 10 e 11: Exemplos de lesão sem representatividade endometrial à HE (à \nesquerda) e sem marcação de VEGF na imunohistoquímica (à direita). \nNão houve diferença estatística entre os grupos na imunohistoqu ímica para \nVEGF (p=0,79). \n \n5.3. Da avaliação genética \n \nNão houve diferença estatística entre os grupos na expressão gê nica do \nMMP9, tanto no útero (p=0,33) como nas lesões (p=0,24), assim c omo também não \nfoi encontrada diferença na expressão do PCNA (p=0,06 para o út ero e p=0,7 para \nlesão). \nNão houve diferença na expressão gênica do VEGF nas lesões, com  p=0,07. \nCom relação ao TP63, foi encontrada diferença estatística entre  os grupos tanto nos \núteros (p=0,03) como nas lesões (p=0,04). \nOs dados encontram-se resumidos na tabela 5. \n \n \n \n \n \n \n\n\n- 18 - \n \nTabela 5 : Comparação entre os grupos para a expressão gênica de cada ti po de \ngene.  P-valor referente ao teste de Kruskall Wallis. \nVariável Grupo N Média D .P. Mediana Q1 Q3 Mínimo Máximo P\nÚtero \nMMP9 \naltadose 9 0,60 1,04 0,05 0,04 0,33 0,02 2,48 \n0,33 baixadose 8 0,13 0,26 0,03 0,02 0,08 0,01 0,76 \ncontrole 10 0,36 0,62 0,06 0,04 0,43 0,02 1,89 \nLesão \nMMP9 \naltadose 7 0,99 1,02 0,61 0,22 1,95 0,16 2,83 \n0,24 baixadose 10 0,88 1,24 0,38 0,14 1,17 0,03 4,17 \ncontrole 10 0,27 0,20 0,24 0,14 0,38 0,04 0,69 \nÚtero \nPCNA \naltadose 9 0,82 0,77 0,72 0,43 0,74 0,09 2,69 \n0,06 baixadose 8 1,40 1,21 0,91 0,55 2,24 0,27 3,53 \ncontrole 10 9,26 24,6 1,34 1,16 2,40 0,45 79,20 \nLesão \nPCNA \naltadose 7 0,79 0,73 0,56 0,36 1,36 0,04 2,18 \n0,70 baixadose 10 0,92 0,57 0,97 0,47 1,24 0,23 1,99 \ncontrole 10 0,91 0,51 0,81 0,65 1,39 0,21 1,84 \nÚtero \nTP63 \naltadose 9 0,23 0,22 0,20 0,09 0,25 0,03 0,74 \n0,03 baixadose 8 0,28 0,23 0,21 0,13 0,41 0,05 0,71 \ncontrole 10 1,42 1,34 0,87 0,20 2,72 0,10 3,45 \nLesão \nTP63 \naltadose 7 0,42 0,59 0,20 0,04 0,46 0,02 1,69 \n0,04 baixadose 10 2,12 2,94 1,34 0,41 2,19 0,07 10,00 \ncontrole 10 2,91 3,06 2,02 0,68 4,97 0,03 9,43 \nÚtero \nVEGFA \naltadose 9 1,58 1,48 1,16 0,95 1,28 0,37 5,06 \n0,42 baixadose 8 2,07 1,38 1,71 1,26 2,47 0,59 5,06 \ncontrole 10 1,61 0,73 1,27 1,11 2,01 0,82 2,86 \nLesão \nVEGFA \naltadose 7 0,98 0,64 0,95 0,41 1,65 0,05 1,88 \n0,07 baixadose 10 1,42 1,01 1,11 0,94 1,57 0,33 4,00 \ncontrole 10 1,82 0,69 1,76 1,27 2,25 0,83 3,04 \n \nO pós-teste de Dunn confirmou a diferença na expressão gênica d o TP63 nas \nlesões apenas quando comparado o Grupo de Alta Dose com o de Ba ixa Dose e \ncom o grupo controle, não havendo diferença quando comparou gru po de Baixa \nDose com grupo controle. (Tabela 6) \nTabela 6: Pós-teste de Dunn para expressão do gene TP63 \n  Baixo X Alta Baixo X Cont r Contr X Alta \nUteroTP63 0,3341 0,0275 0,0075 \nLesãoTP63 0,0227 0,316 0,0074 \n\n- 19 - \n \n6. Discussão \n \n \nComo já previamente bem estabelecido, após ocorrer a adesão das  células \nendometriais ao peritônio, as lesões endometrióticas precisam da neovascularização \npara se manter e crescer, estando isso diretamente relacionado com a invasão \ntecidual (Bourlev et al. , 2006; Laschke et al. , 2011; Laschke, Giebels e Menger, \n2011; Nisolle et al., 1993).  \nDrogas antiangiogênicas vem sendo estudadas como uma boa opção \nterapêutica para o tratamento da endometriose, o que foi possív el comprovar, nesse \nestudo, através de análise macroscópica, imunohistoquímica e de  biologia molecular \ndas lesões. \n6.1. Avaliação macroscópica \n \nO uso do bevacizumab representou em redução da área das lesões (p=0,002) \nnos grupos de alta e de baixa dose quando comparados ao grupo c ontrole, \nconfirmando a informação já conhecida de que inibidores da angi ogênese atuem \ndiretamente inibindo o crescimento da lesão. Na literatura, Soy sal et al. (Liu et al., \n2016; Soysal et al., 2014) demonstrou resultados que corroboram os desse estudo, \ncom comprovação de redução na taxa de adesão celular e aumento na taxa de \napoptose com o uso de Bevacizumab, efeitos que comprovou serem iguais àqueles \nencontrados com o uso de análogos de GnRH. Ricci et al. (Ricci et al., 2011) e Ozer \net al  ( O z e r  et al. , 2013) também encontraram em seus estudos reduções \nsignificativas no volume das lesões após o uso do bevacizumab e m comparação \ncom grupos controles. \n \n6.2. Avaliação Imunohistoquímica \n \nEm nosso estudo, a imunohistoquímica para VEGF no endométrio tó pico \n(uterino) demonstrou que o bevacizumab não apresenta efeito nesse local (p=0,003). \n\n- 20 - \n \nSendo a endometriose uma patologia comum entre mulheres inférte is, com \nprevalência chegando a 50% entre esse grupo específico (Bullett i et al. , 2010), \nexistir uma medicação que controle a doença sem afetar o endomé trio tópico é um \nimportante ponto. A ausência de ação no endométrio uterino enco ntrada no estudo \npermite inferir que o bevacizumab tenha essa característica, pr eservando a \nfuncionalidade do endométrio tópico e não prejudicando, futuram ente,  a ocorrência \nde uma gestação. As drogas que são utilizadas para tratamento d a endometriose \natualmente carecem desse perfil de ação \nEm relação à expressão proteica do VEGF nas lesões, o estudo nã o \ndemonstrou diferença estatística entre os grupos. Entretanto, p odemos observar que \nhouve um desvio da intensidade da positividade, sendo encontrad o mais \npositividade fraca a moderada do que positividade forte. Ozer e t al. (Ozer et al. , \n2013) comparou o efeito do Bevacizumab em dosagem intermediária  à utilizada no \npresente estudo (30mg/kg, dose total) com duas outras drogas (S orafenib e Ácido \nRetinóico) e com controle (nenhuma medicação) na expressão de V EGF na \nimunohistoquímica e na microvascularização e no volume das lesõ es \nendometrióticas, obtendo resultados significativamente melhores  c o m  o  \nbevacizumab em relação às outras duas drogas e em relação ao gr upo controle.. \nOzer também comparou o efeito das drogas utilizadas na reserva ovariana das \nratas, não encontrando redução da mesma. \n \n6.3. Avaliação em Biologia Molecular \n \n6.3.1. Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP9) \nA MMP9 está envolvida na decomposição da matriz extracelular em  \nprocessos fisiológicos normais, como desenvolvimento embrionári o, reprodução e \nremodelação de tecidos, e em processos patológicos, como artrit e, metástases e \nendometriose. A MMP9, assim como outras MMPs, tem demonstrado s er um fator \nimportante na progressão e invasão de tumores de endométrio (Gr aesslin et al. , \n2006). O mecanismo patogênico da endometriose inclui, além de p roliferação e \ninvasão, degradação da matriz extracelular, com facilitação na penetração da \n\n- 21 - \n \ncamada basal pelas células endometriais, já tendo sido demonstr ado níveis \nelevados de MMP9 no líquido peritoneal e no plasma em pacientes  c o m  \nendometriose (Liu et al., 2015). \nA inibição das MMPs ocorre por genes da família TIMP (Tissue Inhibitor of \nMatrix Metalloproteinase). Mulheres com endometriose possuem um a expressão \ndiferente de MMP9 e TIMP2 no endométrio tópico e no ectópico, s endo que baixos \nníveis de TIMP2 no fluido peritoneal levam a um aumento na MMP9  e  t a l  \ndesequilíbrio favorece a degradação da matriz extracelular e a invasão tecidual, \npromovendo a implantação de tecido endometrial ectópico (Londero et al., 2012). \nCom base em tudo o que já se sabe, esperávamos que houvesse uma  \nredução na expressão gênica da MMP9 com o uso do bevacizumab, j á que a \nmedicação reduziu o tamanho das lesões. Porém, o estudo não dem onstrou esta \ndiferença esperada entre os grupos, tanto na avaliação das lesões quanto do útero.  \n \n6.3.2. Antígeno de Proliferação Nuclear (PCNA) \nO PCNA é um gene que codifica uma proteína encontrada no núcleo  celular, \ncofator da DNA polimerase, expressa durante a fase de síntese d e DNA, sendo \nentão, um marcador de proliferação celular.  \nAlém de ser utilizado para avaliação de proliferação celular em  determinados \ntumores malignos, o PCNA vem mostrando uma correlação entre o n ível de \nexpressão e o grau de invasão da endometriose, com as maiores t axas de \nproliferação celular sendo encontradas em endometriose colorret al e menores em \nendometriose peritoneal (Weigel et al., 2012). \nRicci et al. (Ricci et al., 2011), em 2011, comparou a quantificação de VEGF \nno lavado peritoneal e a expressão de PCNA na imunohistoquímica  das lesões de \nendometriose induzidas experimentalmente em ratas entre grupo c ontrole e grupo \nque recebeu bevacizumab na dosagem de 5mg/kg a cada 3 dias (o d obro da dose \nutilizada no grupo Alta Dose neste estudo). Foi demonstrado red ução nos dois \nparâmetros, com significância estatística, favorecendo o uso do bevacizumab. \n\n- 22 - \n \nNo presente estudo, a avaliação da expressão gênica do PCNA não  \nencontrou diferença estatística entre os grupos, o que pode sig nificar, baseado no \nestudo citado, que a dose utilizada no estudo ou foi insuficien te para afetar a \nexpressão do gene, embora tenha levado à redução objetiva nas á reas das lesões, \nconforme já mencionado, mas que a dose utilizada possa atuar na  expressão \nproteica, que não foi avaliada no presente estudo. \n \n6.3.3. Proteína tumoral p63 (Tp63) \n A proteína de membrana p63 é um homólogo do gene supressor de tumor \np53. É expresso em células escamosas basais do colo uterino, ma ma, glândula \nsalivar e próstata e tem papel na regulação da proliferação e d iferenciação epitelial, \ndemonstrando ser um bom marcador de diferenciação celular (Di Como et al., 2002). \nPoli Neto et al.(Poli Neto et al., 2007), em 2007, demonstrou que células com \nmarcação para p63 na imunohistoquímica se concentram principalm ente em \nendometriose peritoneal e endomet rioma, não havendo marcação na  maior parte \ndos casos de adenomiose, endometriose retovaginal e endometrios e de parede \nabdominal. Esses dados sugerem que a patogenia das lesões perit oneais seja \ndiferente das lesões profundas. O nível de positividade para p6 3 não está \ncorrelacionado ao grau da endometriose. \nOs resultados do presente estudo demonstraram redução significa tiva na \nexpressão gênica do Tp63 tanto na lesão quanto no útero, sugeri ndo que o \nbevacizumab tenha, de fato, agido na diferenciação celular dos implantes \nendometrióticos. Quando comparados de forma separada, notamos q ue a baixa \ndose foi suficiente para apresentar efeito no endométrio eutópi co (p=0,02), \nentretanto foi necessária uma alta dose para haver efeito na le são (p=0,31 na \ncomparação entre Baixa Dose e Controle, versus p=0,007 na compa ração entre Alta \nDose e Controle). \n \n \n \n\n- 23 - \n \n6.3.4. Fator de Crescimento Endotelial Vascular A (VEGFA) \nO VEGFA codifica uma proteína de ligação à heparina que induz a  \nproliferação e migração de células endoteliais vasculares, send o essencial para \nangiogênese. A regulação desse gene encontra-se alterada em mui tos tumores, \ncorrelacionando-se com o estágio tumoral e a progressão.  \nComo já mencionado, a angiogênese tem papel central no estabele cimento \ndas lesões endometrióticas, sendo que a disrupção desse process o culmina na \nredução das lesões, conforme dem onstrado em estudos prévios que  a v a l i a r a m  a  \nexpressão proteica do VEGF (Ozer et al., 2013). \nNão foi encontrada diferença estatística na expressão gênica ut erina do \nVEGFA nos grupos avaliados nesse estudo, o que demonstra que o bevacizumab \nnão age nas células endometriais tópicas. Também não houve dife rença estatística \nna análise da expressão nas lesões (p=0,07), embora a avaliação  pormenorizada \ndos resultados permita inferir que haja uma tendência a diferen ça estatística, que \ntalvez possa ser obtida com um aumento do número amostral. \n  \n\n- 24 - \n \n7. Conclusões \n \nNo presente estudo da ação do bevac izumab nas lesões endometrió ticas \nexperimentalmente induzidas em ratas, observamos que: \n1. Houve redução significativa da área das lesões entre os grup os, sugerindo \nque o bevacizumab tenha um efeito positivo no controle da doença. \n2. Não houve alteração na expressão proteica do VEGF no útero d as ratas, \nindependentemente do uso do bevacizumab e da dose empregada, \nsugerindo que a ação da droga é maior do tecido endometrial ect ópico do \nque no endométrio tópico. \n3. A expressão gênica do Tp63 foi significativamente menor no g rupo Alta Dose \nquando comparado aos outros dois grupos, do que concluímos que o \nbevacizumab atue reduzindo a diferenciação celular nas lesões. \n4. A avaliação da expressão gênica do VEGFA nas lesões demonstr a uma \ntendência a redução para os grupos que usaram a medicação quand o \ncomparados ao grupo controle. \nEsses achados permitem concluir que inibidores da angiogênese s ejam \nopções reais para o tratamento da endometriose, com grandes per spectivas de ação \nseletiva na lesão, sem prejuízo da função reprodutiva da paciente. \nEstudos futuros devem ser focados na ação da droga na expressão  proteica \nde fatores envolvidos na adesão e diferenciação celular, com ap rofundamento no \nestudo de seu efeito tanto no endométrio tópico como nos ovários. \nTais descobertas poderão otimizar  o tratamento das pacientes co m \nendometriose, reduzindo o grande impacto que tem hoje essa doen ça na saúde \npública. \n \n  \n\n- 25 - \n \nReferências Bibliográficas \n \nABBOTT, F. V.; HELLEMANS, K. G. Phenacetin, acetami nophen and dipyrone: \nanalgesic and rewarding effects. 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