Pathogenesis of Implantation Incompetence of Endometrium in Endometriosis-Associated Infertility

Study Objective: T o expand the idea of the pathogenesis of implantation incompetence of endometrium in women with endometriosis- associated infertility. Study Design: open perspective comparative study. GYNECOLOGY | | Gynecology. Vol. 20, No. 6 (2021)58 Волкова Снежана Владимировна — аспирант кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института Ф ГАО У ВО РУДН. 117198, Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. eLIBRARY.RU SPIN: 4330-9246. https://orcid.org/0000-0003-2198-7927. E-mail: [email protected] Хамошина Марина Борисовна — профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института Ф ГАО У ВО РУДН, д. м. н., профессор. 117198, Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. http://orcid.org/0000-0003-1940-4534. E-mail: [email protected] Хованская Татьяна Николаевна — младший научный сотрудник ФГБНУ НИИМЧ. 117418, Россия, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3. eLIBRARY.RU SPIN: 4330-9246. http://orcid.org/0000-0002-5646-2605. E-mail: [email protected] Шустова Виктория Борисовна — врач акушер-гинеколог, репродуктолог ООО «МедИнСервис» — Центр репродукции и генетики Nova Clinic. 119415, Россия, г. Москва, ул. Лобачевского, д. 20. https://orcid.org/0000-0003-4397-0042. E-mail: [email protected] (Окончание. Начало см. на с. 57.) ВВЕДЕНИЕ Влияние эндометриоза на фертильность широко обсуждает- ся в научной литературе, так как почти 50% женщин, страда- ющих этим заболеванием, бесплодны [1–3]. Одной из при- чин, вызывающих бесплодие при эндометриозе, считается имплантационная несостоятельность эндометрия, лежащая в основе нарушений его рецептивности. Рецептивность эндометрия — это комплекс его струк- турно-функциональных параметров с четкими временны ’ми и пространственными константами, характеризующими его способность к имплантации и вынашиванию беремен- ности [4]. Подсчитано, что нарушения рецептивности эндо- метрия являются причиной ~40% неудач при имплантации эуплоидных эмбрионов [5]. Считается, что две трети таких неудач обусловлены эндометриальным фактором и лишь одна треть — эмбриональным [6]. Подтверждением служат исследования биоптатов этой уникальной ткани в период предполагаемого окна имплантации, соответствующего мак- симальной рецептивности эндометрия. В биоптатах выявле- на аберрантная экспрессия таких маркеров рецептивности, как рецепторы прогестерона и эстрогенов, интегрины, фак- тор, ингибирующий лейкемию (LIF), гликоделин A (GdA), остеопонтин (OPN), рецептор лизофосфатидной кислоты 3 (LP A3), HOXA10 и др. [7]. Следует отметить, что существует и ряд контраверсион- ных убеждений, основанных на выводах клинических иссле- дований, демонстрирующих большее влияние эмбриональ- ного и овариального факторов при неудачах преодоления эндомет риоз-ассоциированного бесплодия, опровергаю- щих наличие функциональных изменений эутопическо- го эндомет рия при наружном генитальном эндометрио- зе (НГЭ) [6, 8, 9]. С учетом противоречивости и актуальности данной темы необходимы дальнейшие исследования, в первую очередь посвященные изучению патогенеза нарушений импланта- ционной несостоятельности эндометрия у женщин, страдаю- щих бесплодием на фоне НГЭ. Цель исследования: расширить представления о пато- генезе имплантационной несостоятельности эндометрия у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В настоящее исследование включены 65 женщин в возрас- те от 29 до 40 лет (средний возраст составил 35 ± 4,2 года) с морфологически верифицированным НГЭ (МКБ-10: N80.1, 80.3, 80.4). Исследование проведено на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института ФГ АОУ ВО РУДН в 2019–2020 гг. Основную группу составили 32 пациентки с НГЭ и беспло- дием (МКБ-10: N97.8, средняя продолжительность бес- плодия — 4,5 ± 0,8 года), имевшие de facto в анамнезе 2 и более безуспешные попытки переноса одного эмбриона хорошего качества в полость матки при проведении про- грамм ВРТ. В группу сравнения вошли 33 пациентки с НГЭ, реализовавшие свою репродуктивную функцию не более 3 лет назад от момента исследования и не имевшие в анам- незе бесплодия, которые обратились для хирургического лечения тазовой боли, ассоциированной с НГЭ. Г руппу морфологического контроля составили 13 фер- тильных женщин, имевших в анамнезе 2 и более родов Conflict of interest: The authors declare that they do not have any conflict of interests. For citation: Mikhaleva L.M., Orazov M.R., Volkova S.V., Khamoshina M.B., Khovanskaya T .N., Shustova V.B. Pathogenesis of Implantation Incompetence of Endometrium in Endometriosis-Associated Infertility. Doctor.Ru. 2021; 20(6): 57–61. (in Russian). DOI: 10.31550/1727-2378- 2021-20-6-57-61 Contributions: Mikhaleva, L.M. — study design; analysis and interpretation of morphology and immunohistochemistry results; review of critically important material; approval of the manuscript for publication; Orazov, M.R. — patient selection; study design, review of critically important material, approval of the manuscript for publication; Volkova, S.V. — thematic publications reviewing; collection of clinical materials; data processing, analysis and interpretation; text of the manuscript; Khamoshina, M.B. — article review and editing; approval of the manuscript for publication; Khovanskaya, T .N. — analysis and interpretation of morphology and immunohistochemistry results; statistical data processing; Shustova, V.B. — thematic publications reviewing; clinical materials collection.

and Methods. The study enrolled 78 women. The study group included 32 patients with endometriosis genitalis externa (EGE) and infertility; the comparison group included 33 patients with EGE who used their reproductive function not more than 3 years before the study and who were not diagnosed with infertility; the group of morphological control made 13 fertile women without EGE. The subject of the study was endometrium biopsy material obtained on day 5–7 of menstruation, following the peak blood concentration of luteinizing hormone during the expected implantation window. Study Results. When patients with endometriosis-associated infertility were compared to fertile women with EGE, we noted increased expression of GATA2 — 1.6-fold, GATA6 — 1.7-fold, SF-1 — 1.5-fold and reduced HOXA10 expression by 2.9 times (p < 0.05 in all cases) in stroma of infertile women. When patients with endometriosis-associated infertility were compared to fertile women without EGE, we recorded statistically significant (р < 0.05) increase in expression of GATA2 in stroma (2.5-fold) and glands (2.2-fold), GATA6 and SF-1 in stroma (2-fold in both cases), and reduced HOXA10 expression both in stroma (3.6-fold) and glands (2.8-fold). Conclusion. Pathogenesis of implantation incompetence of endometrium in endometriosis-associated infertility is caused by impaired endometrium receptivity because of aberrant expression of transcription factor affecting local hormonal balance.

endometriosis-associated infertility, implantation incompetence of endometrium. ГИНЕКОЛОГИЯ Гинекология. Том 20, № 6 (2021) | | 59 доношенными здоровыми детьми и лапароскопическое вме- шательство по поводу цистаденомы яичника, в ходе которого НГЭ обнаружен не был, давшие добровольное информиро- ванное согласие на участие в исследовании. Материалом исследования являлись биоптаты эндомет- рия, полученные путем пайпель-биопсии на 5–7-й день после пика концентрации ЛГ в крови в период предполагае- мого окна имплантации. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30 заливали в парафин на станции Leica EG 1150 (Г ермания). Г истологи- ческие срезы толщиной 4 микрометра окрашивали гематок- силином и эозином в автоматической станции Leica ST 5010. Микроскопическое исследование осуществлялось на три- окулярном микроскопе Leica DMLB (окуляры с 10-кратным увеличением) с использованием цифровой камеры Leica DFC 420 (Г ермания). В полученных микропрепаратах проводи- лась патоморфологическая оценка состояния эндометрия, и при отсутствии патологических процессов биоптат вклю- чали в исследование. Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндо- метрия осуществлялось с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскиров- кой антигена и применением стандартных наборов монокло- нальных и поликлональных антител фирм Ventana, Cell Marque и Diagnostic BioSystems (США). Иммуногистохимическое окрашивание производилось в иммуностейнере Ventana BenchMark Ultra IHdSH (США) на парафиновых срезах по стан- дартной методике с предварительной демаскировкой антиге- нов в СВЧ-печи с использованием соответствующих антител к стероидным рецепторам, HOXA10, GATA2, GATA6, SF-1. Обработку данных выполняли с помощью электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 26. Распределение количественных (пара- метрических) переменных на нормальность проверяли при помощи критерия Шапиро — Уилка с дополнительной оцен- кой асимметрии, эксцесса и гистограмм. При распределении, отличном от нормального, значения количественных пере- менных выражали в виде медианы (Ме) и межквартильного интервала (Q1–Q3). Межгрупповые различия изучали с помощью критерия Стьюдента, U-критерия Манна — Уитни (для количествен- ных переменных при отличном от нормального распреде- лении и для непараметрических переменных). Связь между переменными оценивали с применением критерия ранговых знаков Вилкоксона. Нулевую гипотезу отвергали при уровне значимости p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ Эутопический эндометрий в период окна имплантации у пациенток с эндометриоз-ассоциированным бесплодием продемонстрировал аберрантную экспрессию исследуемых маркеров (табл.). При сравнении пациенток с эндометриоз-ассоцииро- ванным бесплодием и фертильных женщин с НГЭ мы отме- тили в строме у бесплодных женщин повышение экспрес- сии GATA2 в 1,6 раза, GATA6 — в 1,7 раза, SF-1 — в 1,5 раза и снижение экспрессии HOXA10 в 2,9 раза (во всех случаях р < 0,05), что может свидетельствовать о нарушении локаль- ного гормонального баланса эндометрия из-за аберрант- ной экспрессии факторов, участвующих в его поддержании (GATA2, GATA6 и SF-1), и об уменьшении имплантационно- го потенциала эндометрия вследствие сниженной экспрес- сии HOXA10. При сравнении фертильных женщин с НГЭ и без НГЭ мы выя- вили статистически значимое (р < 0,05) повышение экспрес сии GATA2 в строме (в 1,6 раза) и в железах (в 1,8 раза). Согласно данным литературы, активация GATA2 необходима для содейст- вия передачи сигналов прогестерона в строме эндометрия, что и наблюдалось в обеих группах [10]. По остальным парамет- рам значимых различий не было, что говорит о состоятельнос- ти имплантационного потенциала эндометрия у фертильных женщин как с НГЭ, так и без него. При сравнении пациенток с эндометриоз-ассоциирован- ным бесплодием и фертильных женщин без НГЭ мы отметили статистически значимые (р < 0,05) повышение экспрессии Таблица / Table Результаты иммуногистохимического исследования эутопического эндометрия женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием, фертильных женщин с наружным генитальным эндометриозом и без него Immunohistochemistry results for eutopic endometrium of women with endometriosis-associated infertility, fertile women with and without endometriosis genitalis externa * Отличия от группы морфологического контроля статистически значимы (р < 0,05). ** Отличия от группы сравнения статистически значимы (р < 0,05). * Statistically significant differences vs. morphological controls (p < 0.05). ** Statistically significant differences vs. comparison group (p < 0.05). Транскрипционные факторы / Transcription factors , % Основная группа / Study group Г руппа сравнения / Comparison group Г руппа морфологического контроля / Morphological controls HOXA10 железы / glands 27,0 (17,0; 37,0)* 43,5 (28,3; 58,8) 75,5 (51,0; 100,0) строма / stroma 21,0 (13,4; 28,6)* , ** 61,6 (33,3; 90,0) GATA2 железы / glands 13,4 (5,8; 21,0)* 11,0 (3,0; 19,0)* 6,0 (2,0; 10,0) строма / stroma 76,4 (52,8; 100,0)* , ** 49,1 (13,2; 85,0)* 30,5 (11,0; 50,0) GATA6 железы / glands 1,2 (1,0; 1,4) 1,1 (1,0; 1,25) 1,0 строма / stroma 2,0 (1,1; 2,9)* , ** 1,17 (1,0; 1,35) SF-1 железы / glands 1,2 (1,0; 1,35) 1,2 (1,0; 1,45) 1,0 строма / stroma 2,0 (1,1; 2,9)* , ** 1,3 (1,0; 1,6) GYNECOLOGY | | Gynecology. Vol. 20, No. 6 (2021)60 GATA2 в строме (в 2,5 раза) и в железах (в 2,2 раза), GATA6 и SF-1 в строме (в обоих случаях в 2 раза) и снижение экспрессии HOXA10 как в строме (в 3,6 раза), так и в желе- зах (в 2,8 раза) ( рис. 1–4). Полученные данные свидетельствуют о нарушениях в эутопическом эндометрии у женщин с эндометриоз-ас- социированным бесплодием, в первую очередь за счет более выраженного снижения имплантационного потенциа- ла эндометрия, на что указывает уменьшение экспрессии HOXA10 не только в стромальном компартменте, но и в желе- зистом, наряду с аберрантной экспрессией транскрипцион- ных факторов GATA6 и SF-1, участвующих в стероидогенезе, и GATA2, являющегося регулятором прогестерон-зависимого сигнального пути и децидуализации. Их чрезмерная акти- вация наблюдается именно при НГЭ и, по нашему мнению, вносит вклад в реализацию нарушений стероидного про- филя эндомет рия, а значит, ухудшает его восприимчивость к имплантации бластоцисты. Стоит отметить, что в доступной литературе на момент нашего исследования не обнаружено ни одной работы, в которой методом иммуногистохимии изучали бы экспрес- сию GATA2, GATA6 и SF-1 в эутопическом эндометрии женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием. Существуют единичные работы, посвященные оценке экспрессии данных транскрипционных факторов при эндометриозе, но преиму- щественно в клетках эктопического эндометрия, без уточне- ния наличия или отсутствия бесплодия [11–13]. ОБСУЖДЕНИЕ Переход эндометрия в период окна имплантации в макси- мально восприимчивое состояние — результат взаимодейст- вия в первую очередь эстрогена и прогестерона, являющих- ся «вершиной айсберга» сложных сигнальных каскадов, участие в которых принимают различные факторы роста и транскрипции, цитокины и многие другие биологически активные вещества. В некоторых исследованиях показано, что молекулярная дезрегуляция, приводящая к нарушению рецептивности эндометрия за счет аберрантной экспрессии прогестероно- вых и эстрогеновых рецепторов, негативно влияет на фер- тильность женщин с НГЭ [14, 15]. Накапливается все больше данных, свидетельствующих об изменении преимущественно функциональных характеристик эутопического эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии. Предполагают, что очаги эндометриоза способны акти- вировать пути передачи сигналов через эпигенетическую модуляцию экспрессии генов в эутопическом эндометрии, вызывая локальный гиперэстрогенизм и эстроген-инду- цированное воспаление, препятствующие осуществлению клю чевых функций главного гормона беременности — про- гестерона [16, 17]. В ряде зарубежных работ продемонстрирована высокая специфичность для эндометриоза таких транскрипционных факторов, как GATA2, GATA6, SF-1, а для оценки рецептив- ности эндометрия — НОХА10 [11–13, 18]. При подробном изучении механизмов, описанных в небольшом количестве исследований, мы обнаружили связь данных факторов в еди- ном патогенезе, заключающемся в формировании резистент- ности к прогестерону. Так, транскрипционные факторы GATA6 и SF-1 являются участниками стероидогенеза, а их повышенная экспрессия при НГЭ вызывает нарушения локального гормонального баланса за счет индукции эстроген-зависимых провоспали- тельных каскадов, изменяющих стероидный фон эндометрия, необходимый для успешной имплантации, в период его мак- симальной восприимчивости к бластоцисте. В свою очередь, GATA2, будучи одним из транскрипционных факторов, регу- лирующих прогестерон-зависимый сигнальный путь имплан- тационной состоятельности эндометрия, характеризует про- гестерон-устойчивое состояние рецепторов, но его высокая Рис. 1. Сравнительная характеристика экспрессии HOXA10. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к HOXA10. Примечание. Здесь и в рисунках 2–4: размер масштабной шкалы — 200 микрометров; А — основная группа, В — группа сравнения, С — группа морфологического контроля Fig. 1. Comparative analysis of HOXA10 expression. Immunohistochemical staining with anti-HOXA10 antibodies. Note. Here and in figures 2–4: step scale is 200 micron; А is the study group; В is the comparison group; С is the morphological controls А B C Рис. 2. Сравнительная характеристика экспрессии GATA2. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к GATA2 Fig. 2. Comparative analysis of GATA2 expression. Immunohistochemical staining with anti-GATA2 antibodies А B C Рис. 3. Сравнительная характеристика экспрессии GATA6. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к GATA6 Fig. 3. Comparative analysis of GATA6 expression. Immunohistochemical staining with anti-GATA6 antibodies А B C Рис. 4. Сравнительная характеристика экспрессии SF-1. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к SF-1 Fig. 4. Comparative analysis of SF-1 expression. Immunohistochemical staining with anti-SF-1 antibodies А B C ГИНЕКОЛОГИЯ Гинекология. Том 20, № 6 (2021) | | 61 ЛИТЕР АТУР А / REFERENCES 1. Evans M.B., Decherney A.H. Fertility and endometriosis. Clin. Obstet. Gynecol. 2017; 60(3): 497–502. DOI: 10.1097 / GRF.0000000000000295 2. Garcia-Fernandez J., Garcí a-Velasco J.A. Endometriosis and reproduc- tion: what we have learned. Yale J. Biol. Med. 2020; 93(4): 571–7. 3. Радзинский В.Е., Оразов М.Р., ред. Бесплодие и эндометриоз. Версии и контраверсии. М.: Редакция журнала StatusPraesens; 2019. 208 с. [Radzinsky V.E., Orazov M.R., eds. Infertility and endometriosis. Versions and controversies. M.: Editorial office of the journal StatusPraesens; 2019. 208 p. (in Russian)] 4. Шуршалина А.В., Демура Т.А. Морфофункциональные перестрой- ки эндометрия в окно имплантации. Акушерство и гинекология. 2011; 7–2: 9–13. [Shurshalina A.V., Demura T.A. Morphofunctional rearrangements of the endometrium during the implantation window. Obstetrics and Gynecology. 2011; 7–2: 9–13. (in Russian)] 5. Harton G.L., Munné S., Surrey M. et al. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertil. Steril. 2013; 100(6): 1695–703. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.2002 6. Tsai H.W., Wang P.H., Hsu P.T. et al. Laser irradiation pretreatment improves endometrial preparation of frozen-thawed embryo transfer in recurrent implantation failure patients. Gynecol. Endocrinol. 2020; 36(8): 734–8. DOI: 10.1080/09513590.2020.1712694 7. Broi M.G.D., Ferriani R.A., Navarro P.A. Ethiopathogenic mechanisms of endometriosis-related infertility. JBRA Assist. Reprod. 2019; 23(3): 273–80. DOI: 10.5935/1518-0557.20190029 8. Garcia-Velasco J.A., Fassbender A., Ruiz-Alonso M. et al. Is endometrial receptivity transcriptomics affected in women with endometriosis? A pilot study. Reprod. Biomed. Online. 2015; 31(5): 647–54. DOI: 10.1016/j.rbmo.2015.07.014 9. Da Broi M.G., Rocha C.V. Jr, Carvalho F.M. et al. Ultrastructural evaluation of eutopic endometrium of infertile women with and without endometriosis during the window of implantation: a pilot study. Reprod. Sci. 2017; 24(9): 1469–75. DOI: 10.1177/1933719117691142 10. Rubel C.A., Wu S.P., Lin L. et al. A GATA2-dependent transcription network regulates uterine progesterone responsiveness and endometrial function. Cell Rep. 2016; 17(5): 1414–25. DOI: 10.1016/j.celrep.2016.09.093 11. Brosens I., Brosens J.J., Benagiano G. The eutopic endometrium in endometriosis: are the changes of clinical significance? Reprod. Biomed. Online. 2012; 24(5): 496–502. DOI: 10.1016/j.rbmo.2012.01.022 12. Dyson M.T., Roqueiro D., Monsivais D. et al. Genome-wide DNA methylation analysis predicts an epigenetic switch for GATA factor expression in endometriosis. PLoS Genet. 2014; 10(3): e1004158. DOI: 10.1371/journal.pgen.1004158 13. Bernardi L.A., Dyson M.T., Tokunaga H. et al. The essential role of GATA6 in the activation of estrogen synthesis in endometriosis. Reprod. Sci. 2019; 26(1): 60–9. DOI: 10.1177/1933719118756751 14. Lessey B.A., Young S.L. Homeostasis imbalance in the endometrium of women with implantation defects: the role of estrogen and progesterone. Semin. Reprod. Med. 2014; 32(5): 365–75. DOI: 10.1055/s-0034-1376355 15. Miravet-Valenciano J., Ruiz-Alonso M., G ómez E. et al. Endometrial receptivity in eutopic endometrium of women with endometriosis: it is affected, let me show you why. Fertil. Steril. 2017; 108(1): 28–31. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2017.06.002 16. Оразов М.Р., Хамошина М.Б., Михалева Л.М. и др. Молекулярно- генетические особенности состояния эндометрия при эндо - метриоз-ассоциированном бесплодии. Трудный пациент. 2020; 18(1–2): 23–32. [Orazov M.R., Khamoshina M.B., Mikhaleva L.M. et al. Molecular genetic features of the state of endometry in endometriosis-associated infertility. Difficult Patient. 2020; 18(1–2): 23–32. (in Russian)]. DOI: 10.24411/2074-1995-2020- 10005 17. Izawa M., T aniguchi F., Harada T. GATA6 expression promoted by an active enhancer may become a molecular marker in endometriosis lesions. Am. J. Reprod. Immunol. 2019; 81(2): e13078. DOI: 10.1111/aji.13078 18. Özcan C., Özdamar Ö., Gökbayrak M.E. et al. HOXA-10 gene expression in ectopic and eutopic endometrium tissues: does it differ between fertile and infertile women with endometriosis? Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2019; 233: 43–8. DOI: 10.1016/j.ejogrb.2018.11.027 Поступила / Received: 27.03.2021 Принята к публикации / Accepted: 02.06.2021 экспрессия, специфичная для эндометриоз-ассоциирован- ного бесплодия, дезрегулирует данный путь. Снижение экспрессии HOXA10, вызванное нарушениями регуляции сигнальных путей стероидных гормонов, отража- ет уменьшение имплантационного потенциала эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии. Таким образом, перечисленные маркеры могут быть исполь- зованы для иммуногистохимической оценки имплантационной несостоятельности эндометрия у женщин с НГЭ и бесплодием. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В эутопическом эндометрии женщин с наружным гениталь- ным эндометриозом (НГЭ) и неудачными попытками имплан- тации наблюдаются функциональные нарушения, являю- щиеся результатом дезрегуляции стероидных рецепторов на фоне аномальной экспрессии транскрипционных фак- торов, специфичных для НГЭ, которая отражает нарушения имплантационного потенциала эндометрия, что клинически детерминируется неудачами имплантации.