COMPARATIVE ASSESSMENT OF THE EFFECTIVENESS AND EFFECT OF ENDOMETRIAL INJURY ON INTRACELLULAR CYTOKINE PRODUCTION IN PREPARATION FOR IVF IN WOMEN WITH "SMALL" FORMS OF GENITAL ENDOMETRIOSIS

УДК [618.177-089.888.11:618.145-007]: 616-092.6/.18/.19 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И ВЛИЯНИЯ ТРАВМЫ ЭНДОМЕТРИЯ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ ПРИ ПОДГОТОВКЕ К ЭКО У ЖЕНЩИН С «МАЛЫМИ» ФОРМАМИ ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА Красильникова А.К.1, Малышкина А.И.1,2, Сотникова Н.Ю.1,2, Бойко Е.Л.1, Воронин Д.Н.1, Семененко С.С.1 1ФГБУ «Ив НИИ материнства и д етства им. В.Н. Городкова» Минздрава России, Иваново, e-mail: [email protected]; 2ФГБОУ ВО «Ивановская государственная медицинская академия » Минздрава России, Иваново, e-mail: [email protected] Цель исследования – провести сравнительный анализ эффективности разных методов травматизации эндометрия и их влияния на продукцию цитокинов макрофагами эндометрия при подготовке к ЭКО у женщин с бесплодием, обусловленным генитальным эндометриозом I –II стадии. Обследованы 57 женщин с бесплодием и генитальным эндометриозом I –II стадии при подготовке к ЭКО. Пациентки были разделены на 2 группы в зависимости от способа нанесения травмы эндометрия: 1 -я (n=17) – методом скретчинга, 2 -я (n=40) – раздельным диагностическим выскабливанием полости матки при гистероскопии. Внутриклеточную продукцию цитокинов эндометриальными макрофагами определяли методом проточной цитофлюорим етрии. Травма эндометрия путем скретчинга приводила к снижению внутриклеточной продукции IL-6, IFNγ макрофагами эндометрия по сравнению с исходными данными. В случае нанесения травмы эндометрия раздельным диагностическим выскабливанием полости матки существенных сдвигов в продукции цитокинов на локальном уровн е не наблюдалось. Тем не менее сама травматизация эндометрия независимо от метода нанесенной травмы может повышать результативность ЭКО у женщин с бесплодием и «малыми» формами генитального эндометриоз а. Эффективность ЭКО не зависит от техники нанесения локальной травмы эндометрия. У пациенток с наступившей беременностью в протоколах ЭКО происходил и повышение изначально сниженных показателей и снижение изначально повышенных показателей внутриклеточной п родукции цитокинов эндометриальными макрофагами независимо от метода травматизации. Ключевые слова: локальная травма эндометрия, бесплодие, «малые» формы эндометриоза , эндометрий, макрофаги, цитокины. COMPARATIVE ASSESSMENT OF THE EFFECTIVENESS AND EFFECT OF ENDOMETRIAL INJURY ON INTRACELLULAR CYTOKINE PRODUCTION IN PREPARATION FOR IVF IN WOMEN WITH "SMALL" FORMS OF GENITAL ENDOMETRIOSIS Krasilnikova A.К.1, Malyshkina A.I.1,2, Sotnikova N.Yu.1,2, Bojko E.L.1, Voronin D.N.1, Semenenko S.S.1 1FGBI «Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood named after V.N. Gorodkov» Ministry of Health of Russia, Ivanovo, e-mail: [email protected]; 2FSBEI HE «Ivanovo State Medical Academy» Ministry of Health of Russia, Ivanovo, e-mail: [email protected] The aim of the study. To carry out a comparative analysis of the effectiveness of different methods of endometrial trauma and their effect on the production of cytokines in preparation for IVF in women with infertility due to stage I-II genital endometriosis. 57 women with infertility and I–II stage genital endometriosis during preparation for IVF were examined. Patients were divided into 2 groups depending on the method o f inflicting endometrial injury: First (n=17) – by method of scretching , Second (n=40) – by separate diagnostic curettage of the uterine cavity during hysteroscopy. Cytokine intracellular production macrop hages were assessed by flow cytometry method. However endometrial trauma by the method of scretching led to the normalizat ion of intracellular production of IL-1β, IL-6, IFNγ by endometrial macrophages. In case of inflicting endometrial injury by separate diagnostic curettage of the uterine cavity no significant shifts in cytokine production loc al level were observed. Nevertheless, the very trauma of the endometrium, regardless of the method of injury, can increase the effectiveness of IVF in women with infertility and «small» forms of genital endometriosis. The effectiveness of IVF does not depend on the technique of applyin g local trauma to the endometrium. In patients with the onset of pregnancy in IVF protocols, there was an increase in the initially decreased indicators and a decrease in the initially increased indicators of intracellular cytokine production by endometria l macrophages, regardless of the method of trauma. Keywords: local endometrial trauma, infertility, «small» forms of endometriosis, endometrium, macropages, cytokines. Бесплодие, ассоциируемое с эндометриозом, является одной из основных причин обращения женщин к использованию вспомогательных реп родуктивных технологий (ВРТ) [1], которые имеют относительно невысокий процент эффективности [ 2]. Часто виновником неудач в экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) выступает нарушение процессов взаимодействия между бластоцистой и эндометрием [ 3] при исключении генетических аномалий. В качестве метода, повышающего имплантационные свойства эндометрия перед проведением программы ЭКО, была предложена методика травматиза ции эндометрия путем скретчинга (нанесения линейных насечек на эндометрий) [ 4] или раздельным диагностическим выскабливанием (РДВ) полости матки. Высказывается предположение, что «дозированное» нарушение целостности эндометрия приводит к развитию местной воспалительной реакции с массированной секрецией ростовых факторов и провоспалительных цитокинов, способствует ремоделированию ткани и повышению чувствительности рецепторов эндометрия, под действием этих процессов внутренняя поверхность матки становится более «липкой», и шансы на удачную имплантацию возрастают [5]. Однако отсутствует четкое понимание механизма действия травмирующего фактора на эндометрий. Нет убедительных данных в выборе оптимального метода нанесения травмы эндометрия в программе ЭКО [6]. Цель исследования – провести сравнительный анализ эффективности разных методов травматизации эндометрия и их влияния на продукцию цитокинов макрофагами эндометрия при подготовке к ЭКО у женщин с бесплодием, обусловленным генитальным эндометриозом I–II стадии. Материал и методы исследования Отбор и обследование пациенток осуществлялись в отделении ВРТ и лаборатории клинической иммунологии на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Основной причиной обращения женщин в отделение ВРТ было отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции в течение 12 месяцев после установленного диагноза бес плодия, обусловленного генитальным эндометриозом I–II стадии. Диагноз генитального эндометриоза был подтвержд ен при лапароскопии с морфологическим исследованием материала. Всего обследованы 57 пациенток, которые методом рандомизации в зависимости от способа нанесения травмы эндометрия на 7 –10-й постовуляторный день были разделены на две группы: 1-ю группу составили 17 женщин, которым проводился скретчинг эндометрия; 2 -ю группу – 40 женщин, которым проводилось раздельное диагностическое выскабливание полости матки при гистероскопии. Контрольное исследование эндометрия (забор материала пайпель-зондом) в обеих группах проводилось на 7 –10-й постовуляторный день следующего менструального цикла перед началом стимуляции суперовуляции по «длинному» протоколу. Забор биоптата эндометрия осуществлялся после подписания женщиной информированного согласия. Внутриклеточную продукцию цитокинов IL -1β, IL -6, IFNγ эндометриальными макрофагами определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) в гейте CD14+CD45+ клеток методом многоцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACSCantoII (Becton Dickinson, USA). Процедуру пермеабилиазации клеточной мембраны осуществляли с использованием коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA, USA). Статистическая обработка данных проводилась при помощ и пакета лицензионных программ «Microsoft Office 2013», «Statistica for Windows 13.0». При сравнении лабораторных данных между группам и использовали U -критерий Манна –Уитни. Статистический анализ изменений между показателями эндометрия первого и контрольного заборов в исследуемых группах проводился с использованием критерия Вилкоксона для зависимых групп. В таблицах данные представлены в формате – медиана с указанием п ервого и третьего квартилей (Me(Q1;Q3)). Значимыми считались различия при уровне р<0,05. Результаты исследования и их обсуждение Все женщины на момент включения в группы исследования были сопоставимы между собой по возрасту, образованию, социальному статус у, показателям репродуктивного и общесоматического здоровья, генитальной и экстрагенитальной патологии, по структуре применяемой контрацеп ции. Всем пациенткам проводился протокол стимуляции суперовуляции с аГнРГ в программе ЭКО. При анализе внутриклеточной продукции цитокинов эндометриальными макрофагами в момент нанесения травмы эндометрия было выявлено, что у женщин обеих групп показатели были сопоставимы между собой и не имели значимых различий (p>0,05 во всех случаях) (таблица). Через 1 месяц после нанесения травмы эндометрия методом скретчинга показатели внутриклеточной продукции IL -6 и IFNγ эндометриальными макрофагами снижались по сравнению с исходными данными (p=0,016 и p=0,050 соответственно). В то же время РДВ не оказывало существенного влияния на показатели продукции IL-6 и IFN-γ эндометриальными макрофагами (p>0,05 в обоих случаях). Неизменным оставался и уровень внутриклеточной продукции IL-1β макрофагами (p>0,05) независимо от способа травматизации эндометрия. Динамика показателей внутриклеточной продукции цитокинов эндометриальными макрофагами при использовании разных методов нанесения травмы эндометрия Параметр 1-я группа (n=17) 2-я группа (n=40) Метод скретчинга День 0 Пайпель- биопсия Через 1 месяц РДВ День 0 Пайпель- биопсия Через 1 месяц IL-1β, % 35,95 (33,07;40,83) 40,07 (34,74;46,29) 34,75 (18,91;46,67) 31,07 (23,90;46,10) IL-6, % 51,05 (34,04;63,26) 41,07 (34,44;44,70) p=0,016 39,41 (25,2;50,34) 35,50 (29,82;38,97) IFNγ, % 42,89 (31,37;51,46) 28,10 (24,66;36,04) p=0,050 37,22 (27,95;46,88) 36,65 (24,90;43,70) Примечание: р – критерии значимости различий результатов до и после нанесения травмы эндометрия по критерию Вилкоксона для зависимых групп. В следующем цикле после контрольной биопсии эндометрия пациентки всех групп исследования вступали в программу ЭКО. Для стимуляции суперовуляции была применена стандартная схема: диферелин, гонал Ф, в качестве триггеров овуляции использовались хорагон и овитрель. Поддержка эндометрия производилась назначением в первую фазу трансдермальных и пероральных препаратов эстрогенового ряда, вторая фаза формировалась назначением пероральных (дидрогестерон) или вагинальных (микронизированные прогестероны) форм прогестеронов. Нами не было получено данных о существенных различиях по кол ичеству пунктированных фолликулов, полученных ооцитов и оплодотворившихся ооцитов у женщин обеих групп (р>0,05 во всех случаях). Частота клинической беременности, подтвержденной наличием плодного яйца в полости матки по данным УЗИ, была сопоставима в обеих группах: 58,8% (10 /17) в группе пациенток, которым выполнялся скретчинг э ндометрия, и 52,9% (21/40 ) в группе женщин, которым выполнялось РДВ (р>0,05). Высокий процент наступления беременности у пациенток может свидетельствовать о положительном влиянии мех анической травмы эндометрия на успех проведения ЭКО независимо от метода ее нанесения. Наши результаты подтверждаются литературными данными с указанием значительной разницы в частоте наступления клинической беременности в программе ЭКО у женщин после механ ической стимуляции эндометрия – 47–49% [7, 8] и без – 35–37% [9]. Анализ течения беременности показал, что у 1 пациентки 1-й группы (10%) произошел самопроизвольный выкидыш до 12 недель беременности, у 3 (30%) женщин беременность закончилась преждевременн ыми родами в сроке 35 –36 недель, у 6 женщин (60%) роды произошли своевременно. Во 2 -й группе у 4 женщин (19%) беременност и завершилась ранними самопроизвольными выкидышами, у 4 пациенток (19%) произошли преждевременные роды в сроке 34–36 недель, 13 пациенток (62%) родили в срок доношенной беременности. С целью оценки зависимости между иммунологическими показателями и наступлением беременности в протоколах ЭКО обследованные женщины были дополнительно разделены на 2 подгруппы: 1 -ю (n=7) составили женщины с н аступившей беременностью, 2-ю (n=19) – с отсутствием беременности. Было отмечено, что у женщин с наступившей беременностью в протоколах ЭКО происходил и повышение изначально сниженных показателей и снижение изначально повышенных показателей внутриклеточной продукции цитокинов эндометриальными макрофагами независимо от метода травматизации (рисунок). Мы предположили, что на фоне травмы эндометрия происходит нормализация внутриклеточной продукции макрофагами всех изучаемых цит окинов: IL -1β, IL -6, IFNγ . Макрофаги играют важную роль в поддержании иммунного равновесия во время беременности [10]. Особенно велика их роль на ранних этапах беременности в период децидуализации и имплантации. Нарушение маточного микроокружения в этот период оказывает существенное влияние на макрофагальную активность и в дальнейшем – на исход беременности. У пациенток с отсутствием беременности в протоколах ЭКО после нанесения травмы отмечалось снижение внутриклеточной продукции IFNγ эндометриальным и макрофагами (р=0,027). П редположительно, происходит сдвиг поляризации макрофагов в сторону альтернативно активированных провоспалительных макрофагов , которые не способны к поддержанию ремоделирования эндометрия и формированию функциональной плаценты [10]. Внутриклеточная продукция цитокинов эндометриальными макрофагами у обследованных женщин при наступлении и отсутствии беременности В ранее проведенных нами исследованиях было показано, что, с одной стороны, при генитальном эндометриозе отмечаются выраженные воспалительные изме нения на уровне перитонеальной полости, более того, тяжесть воспалительных изменений была прямо пропорциональна стадии эндометриоза [1 1]. С другой стороны, известно, что повреждение эндометрия создает особые условия, сходные с воспалительным процессом, кот орые благоприятны для имплантации и роста плода [1 2]. Существует несколько гипотез, объясняющих положительный эффект травматизации эндометрия на частоту наступления беременности. Наиболее распространенной является теория воспаления, согласно которой локальная травма эндометрия приводит к развитию местной воспалительной реакции, создавая благоприятное для плода микроокружение, что, в свою очередь, может способствовать установлению взаимодействия между бластоцистой и эндометрием, обеспечивая процесс имплантац ии. Воспалительный ответ индуцирует выработку провоспалительных цитокинов и последующее рекрутирование макрофагов и других иммунных клеток, которые участвуют в процессе имплантации [12]. При травматизации эндометрия путем скретчинга у женщин с бесплодие м и генитальным эндометриозом I –II стадии мы отмечали статистически значимое снижение внутриклеточной продукции макрофагами IL -6 и IFNγ на фоне неизмененной продукции IL - 1β. Данный факт можно расценивать как положительный момент, необходимый для купирования и злишней воспалительной реакции, которая всегда присутствует у больных с бесплодием и эндометриозом и лежит в основе многих неудач ЭКО. Минимальная локальная травма при скретчинге лишь местно стимулирует воспаление с развитием классических гуморальных, клет очных и сосудистых реакций, в остальной ткани эндометрия начинают активироваться процессы репарации и васкулогенеза за сч ет изменения состава цитокинов/хемокинов, факторов роста, молекул адгезии, накопления специфических иммунных клеток, макрофагов, дендри тных клеток и естественных киллеров, что улучшает рецептивность слизистой оболочки полости матки и снижает уровень общей воспалительной реакции [13]. При травматизации эндометрия путем РДВ полости матки в период «окна имплантации» мы не наблюдали существе нных изменений в продукции цитокинов на локальном уровне. Возможно, данный факт связан с большой площадью травматизации слизистой полости матки, что сопровождается потерей большого количества иммунокомпетентных клеток, в том числе эндометриальных макрофагов, и их восполнение в следующем цикле происходит преимущественно за счет привлечения циркулирующих клеток. При скретчиге эндометрия в воспалительной реакции участвует больше иммунокомпетентных клеток, которые частично сохраняются в следующем цикле, а при Р ДВ резидентные макрофаги полностью удаляются вместе с тканью эндометрия. Следует подчеркнуть, что независимо от метода нанесения травмы эндометрия у женщин с бесплодием, обусловленным «малыми» формами генитального эндометриоза, мы отметили положительное влияние на результативность ЭКО в сравнении с имплантацией при переносе эмбрионов без нанесения травмы. Так, у женщин с наступившей беременностью при проведении ЭКО независимо от вида нанесения травмы эндометрия отмечалась модуляция внутриклеточной продукции цитокинов IL -1, IL-6, IFNγ эндометриальными макрофагами, и она была сопряжена с успехом берем енности, что может свидетельствовать о нормализации их функции и участии в формировании благоприятной среды для имплантации. У пациенток с отсутствием наступления беременности после нанесения травмы отмечалось снижение внутриклеточной продукции IFNγ при со хранении уровня выработки IL -1β и IL -6 эндометриальными макрофагами, что, предположительно, может свидетельствовать о сдвиге поляризации эндометриальных макрофагов в сторону альтернативно активированных провоспалительных макрофагов. Принимая во внимание вы шеупомянутые результаты, мы предполагаем, что травматизация эндометрия вызывает воспалительный ответ, который индуцирует выработку провоспалительных цитокинов с последующ им привлечением макрофагов и других иммунных клеток, тем самым запуска ется целая цепочка сложных биологических процессов в эндометрии с повышением его пролиферации, регенерации и рецептивности, что может способствовать повышению частоты наступления беременности. Заключение Эффективность ЭКО не зависит от техники нанесения локальной травмы э ндометрия. У пациенток с наступившей беременностью в протоколах ЭКО происходил и повышение изначально сниженных показателей и снижение изначально повышенных показателей внутриклеточной продукции цитокинов эндометриальными макрофагами независимо от метода тр авматизации. Дальнейшее исследование механизмов контроля воспалительных реакций в эндометрии женщин с «малыми» формами эндометриоза позволит выявить новые аспекты патогенеза ассоциированного с ним бесплодия и повысить эффективность методов ВРТ. Список литературы 1. As-Sanie S., Black R., Giudice L.C., Gray Valbrun T., Gupta J., Jones B., Laufer M.R., Milspaw A.T., Missmer S.A., Norman A., Taylor R.N., Wallace K., Williams Z., Yong P.J., Nebel R.A. Assessing research gaps and unmet needs in endometriosis. Am J. Obstet Gynecol. 2019. vol. 221. no. 2. P. 86-94. DOI: 10.1016/j.ajog.2019.02.033. 2. Оразов М.Р., Радзинский В.Е., Хамошина М.Б., Кавтеладзе Е.В., Шустова В.Б., Цораева Ю.Р., Новгидов Д.С. Бесплодие, ассоциированное c эндометриозом: от легенды к суровой реальности // Трудный пациент. 2019. Т. 17. № 1-2. С. 6-12. DOI: 10.24411/2074-1995-2019- 10001. 3. Mahajan N. Endometrial receptivity array: Clinical application. J. Hum ReprodSci. 2015. vol. 8. no. 3. P. 121-129. DOI: 10.4103/0974-1208.165153. 4. Wadhwa L., Mishra M. Therapeutic efficacy of endometrial scratching in repeated Controlled Ovarian S timulation (COS) failure cycles . J. Hum Reprod Sci . 2018. no. 11. P. 59-57. DOI: 10.4103/jhrs.JHRS_130_17. 5. Nastri C.O., Lensen S.F ., Gibreel A., Raine -Fenning N., Ferriani R.A., Bhattacharya S. , Martins W.P. Endometrial injury in women undergoing a ssisted reproductive techniques. Cochrane Database Syst Rev. 2015. no. 3. DOI: 10.1002/14651858. 6. Hoogenhuijze N.E. van, Kasius J.C, Broekm ans F.J.M., Bosteels J., Torrance H.L. Endometrial scratching prior to IVF; does it help and for whom? A syst ematic review and meta - analysis. Human Reproduction Open. 2019. no. 1. P. 1-18. DOI: 10.1093/hropen/hoy025. 7. Nastri C .O., Ferriani R .A., Raine-Fenning N ., Martins W .P. Endometrial scratching performed in the non -transfer cycle and outcome of assisted reproduction: a randomized controlled trial. Ultrasound Obstet Gynecol. 2013. vol. 42. no. 4. P. 375-382. DOI: 10.1002/uog.12539. 8. Gibreel A., El-Adawi N., Elgindy E ., Al-Inany H., Allakany N ., Tournaye H. Endometrial scratching for women with previous IVF f ailure undergoing IVF treatment . Gynecol Endocrinol . 2015. no. 4. P. 313-316. DOI: 10.3109/09513590.2014.994603. 9. De Geyter C., Calhaz -Jorge C., Kupka M.S., Wyns C., Mocanu E., Motrenko T. , Scaravelli G., Smeenk J., Vidakovic S., Goossens V. ART in Europe, 2014: results generated from European registries by ESHRE: the European IVF -monitoring Consortium (EIM) for the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). Human Reproduction. 2018. no. 9. P. 1586-1601. DOI: 10.1093/humrep/dey242. 10. Brown M.B., von Chamier M., Allam A.B., Reyes L. M1/M2 macrophage polarity in normal and complicated pregnancy . Frontiers Immunology. 2014. no. 5. 606. DOI: 10.3389/fimmu.2014.00606. 11. Красильникова А.К., Абдуллаева Л.Х., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю, Анциферова Ю.С. Особенности регуляции гуморального иммунного ответа на системном и лок альном уровнях при эндометриозе // Таврический медико-биологический вестник. 2017. Т. 20. № 2. С. 58-62. 12. Gnainsky Y., Granot I., Aldo P., Barash A., Or Y., Mor G., Dekel N . Biopsy-induced inflammatory conditions improve endometrial recep tivity: the mechanism of action . Reproduction. 2015. vol. 149. no. 1. P. 75-85. DOI: 10.1530/REP-14-0395. 13. Dekel N., Gnainsky Y., Granot I., Racicot K., Mor G. The role of inflammation fo r a successful implantation. American Journal of Reproductive Immunology. 2014. vol. 72. no. 2. P. 141- 147. DOI: 10.1111/aji.12266.