Atividade da aromatase em células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO ATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE MULHERES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA Ribeirão Preto, São Paulo 2005 Lauriane Giselle de Abreu UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO ATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE MULHERES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA Lauriane Giselle de Abreu Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Medicina na área de concentração: Tocoginecologia Orientador: Prof. Dr. Marcos Dias de Moura Ribeirão Preto, São Paulo 2005 11 Ficha catalográfica Abreu, Lauriane Giselle de Atividade da Aromatase em Células da Granulosa de Mulheres com Endometriose Submetidas a Técnicas de Reprodução Assistida/ Lauriane Giselle de Abreu. Ribeirão Preto, São Paulo, 2005. xix, 97p., il. Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / Universidade de São Paulo, Departamento de Tocoginecologia. Data da Defesa: 31/05/2005 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Marcos Dias de Moura Julgamento: _ ________________ _ _ Assinatura: -------------------- Profa. Dra. Rosana Maria dos Reis Julgamento: _ ____________ _____ _ Assinatura: ----------------- --- Prof. Dr. Mauri Piazza Julgamento: _ ____________ ______ _ Assinatura: -------------------- iii "Sejam quais forem os sentimentos e os interesses humanos, o intelecto é, também ele, uma força. Esta não consegue prevalecer imediatamente, mas por fim os seus efeitos revelam-se ainda mais peremptórios. A verdade que mais fere acaba sempre por ser notada e por se impor, assim que os interesses que lesa e as emoções que suscita tenham esgotado a sua virulência." Sigmund Freud IV Ao meu pai, Luiz Antonio. A minha mãe, Rosemarie. DEDICATÓRIAS Dedico a vocês, com muito amor, este trabalho e todas as minhas realizações. Minha enorme gratidão pela confiança e apoio que sempre me ofereceram. Aos meus irmãos, Luciana e Júnior, pelo apoio. Ao meu companheiro, Marcelo, pela confiança e paciência. V AGRADECIMENTOS Ao Prof Dr. Marcos Dias de Moura, agradecimento especial pela confiança na realização deste trabalho. Minha total admiração pelo seu talento como dÕcente, como médico, como pesquisador e grande cientista. Também minha gratidão pela orientação e pela amizade e gentileza sempre presentes. Ao Prof. Dr. Marcos Felipe Silva de Sá, chefe da pós-graduação na área de Tocoginecologia, grande mestre, toda a admiração por seu trabalho como docente e cientista e minha gratidão pelo apoio científico e confiança neste trabalho. vi AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Fernando Mangieri Sobrinho e Prof. Inácio Teruo lnoue; pela amizade, estímulo para a carreira científica e confiança. Aos Profs. Rosana Maria dos Reis e Rui Alberto Ferriani, pela atenção e incentivo para a realização deste trabalho. A todos os docentes do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP, pela imensa colaboração em minha formação. A sra. Maria Albina Verceze Bortoliero, que me ensinou a técnica do cultivo celular e realizou as dosagens hormonais, minha enorme gratidão pelo seu carinho, dedicação e auxílio em todo o processo. A sra. llza Rezende Mazzocato, minha gratidão pela amizade e auxílio. Às sras. Renata Maria Rebouças, Maria Cristina Piccinato Araújo; Maria Auxiliadora Pádua, Sandra Viana, Maria Aparecida Carneiro Vasconcelos, Marilda Hatsumi Yamada Dantas, pelo auxílio prestado neste trabalho, disponibilidade e amizade. Aos meus colegas de pós-graduação: Luciana de Barros Duarte, Carolina Sales Vieira, Alessandra Marcolin, Laura Ferreira Santana, Arlene de Oliveira Fernandes, e todos em geral, pela amizade e apoio. Vll SUMÁRIO Abreviaturas ...................................................................................................... x Lista de tabelas ............................................................................................... xii Lista de figuras .............................................................................................. xiv Resumo .......................................................................................................... xv Summary ...................................................................................................... xvii 1. Introdução .................................................................................................. 19 1.1. Etiopatogenia da Endometriose .................................................. 19 1.2. Aroma ta se e Endometriose ........................................................ 27 2. Objetivo ...................................................................................................... 34 3. Pacientes e Métodos ................................................................................. 35 3.1. Delineamento do estudo .................................................................. 35 3.2. Amostra ...................................... ..................................................... 35 3.3. Local de realização do estudo ......................................................... 35 3.4. Comitê de ética ................................................................................ 35 3.5. Seleção de pacientes ....................................................................... 35 3.5.1. Critérios de inclusão para os dois grupos ................................. 36 3.5.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo ................................ 36 3.5.3. Critérios de exclusão para o grupo-estudo ............................... 36 3.5.4. Critérios de inclusão para o grupo-controle .............................. 36 3.5.5. Critérios de exclusão para o grupo-controle ............................. 36 3.6. Protocolo de Hiperestimulação Ovaria na Controlada ...................... 37 viii SUMÁRIO 3.7. Captação de oócitos ........................................................................ 38 3.8. Cultivo de Células da Granulosa .................................................... .40 3.8.1. Procedimento do Cultivo Celular ............................................. 42 3.9. Atividade da aromatase ................................................................... 45 3.1 O. Experimentos realizados ............................................................... 46 3.11. Dosagens hormonais ..................................................................... 4 7 3.11.1 Estradiol ................................................................................. 47 3.11.2. Progesterona ........................................................................ 47 3.12. Análise Estatística .......................................................................... 48 4. Resultados ................................................................................................ 49 4.1. Características clínicas das pacientes do estudo ............................. 49 4.2. Dosagens Hormonais nos Fluidos de Cultivas Celulares ................. 56 4.2.1. Estradiol ..................................................................................... 56 4.2.2. Atividade da aromatase ............................................................. 57 4.2.3. Progesterona ............................................................................. 63 5. Discussão .................................................................................................. 67 6. Conclusão ................................................................................................. 71 7. Referências Bibliográficas ......................................................................... 72 Apêndice 01 .................................................................................................. 82 Apêndice 02 .................................................................................................. 84 Anexos .......................................................................................................... 86 lX ABREVIATURAS A - androstenediona Bax - proteína anti-apoptótica denominada proteína X associada à Bcl-2 Bcl-2 - proteína anti-apoptótica derivada da célula B CLUlinfoma 2 CC - citrato de clomifeno E1 - estrona E2 - estradiol FIV - Fertilização ln Vitro FMRP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto FSH - hormônio folículo-estimulante FSHr - hormônio folículo-estimulante recombinante GnRH - hormônio liberador de gonadotrofinas GnRHa - análogos do GnRH hCG - gonadotrofina coriônica humana hMG ou HMG- gonadotrofinas menopausais humanas ICSI - Injeção lntracitoplasmática de Espermatozóide IGF-1 - fator de crescimento insulina símile tipo 1 IL- interleucina IUI - Inseminação Intra uterina LH - hormônio luteinizante M - concentração molar mlCAM - molécula de adesão intercelular forma de membrana X ABREVIATURAS MMTPs - metaloproteinases NK - células de citotoxidade natural PCR - reação em cadeia de polimerase P4 - progesterona P450 - termo genérico para denominar a família de enzimas oxidativas contendo o pigmento 450 cuja absorbância muda enquanto é reduzido P450 arom - aromatase P450 RNAm - ácido ribonucléico mensageiro ROS - espécies reativas de oxigênio SD - desvio padrão slCAM - molécula de adesão intercelular tipo solúvel sTAR- proteína de regulação aguda da esteroidogênese TEC - transferência de embriões congelados TIMPs - inibidores das metaloproteinases Th1- subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo 1 Th2 - subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo2 TGF - fator de crescimento tumoral TNF - fator de necrose tumoral USG - ultrassonografia UI - unidades internacionais VEGF - fator de crescimento vascular endotelial xi LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Preparo dos meios para cultivo de células da granulosa. Tabela 2 - Características clínicas das mulheres do grupo controle: idade, tempo de infertilidade, tratamentos de infertilidade prévios e causa da infertilidade. Tabela 3 - Características clínicas das mulheres do grupo com endometriose: idade, tempo de infertilidade, tratamentos de infertilidade prévios, classificação da endometriose e antecedente familiar de endometriose. Tabela 4 - Características da hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI das pacientes do grupo com endometriose e controle. Tabela 5 - Características da captação de oócitos e transferência embrionária para FIV e ICSI nos grupo controle e endometriose. Tabela 6 - Valores em média das dosagens de estradiol em pg/ml de fluidos de cultivas de células da granulosa de mulheres sem endometriose (grupo controle) submetidas à reprodução assistida. Xll LISTA DE TABELAS Tabela 7 -Valores em média das dosagens de estradiol em pg/ml de fluidos de cultivas de células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas à reprodução assistida. Tabela 8 - Valores em média das dosagens de progesterona em ng/ml de fluidos de cultivas de células da granulosa de mulheres sem endometriose (grupo controle) submetidas à reprodução assistida. Tabela 9 - Valores em média das dosagens de progesterona em ng/ml de fluidos de cultivas de células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas à reprodução assistida. Xlll LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Possíveis alterações fisiopatológicas na cavidade peritoneal de mulheres com endometriose. Figura 2 - mecanismo de estresse oxidativo na endometriose. Figura 3 - lnativação defectiva de estradiol na endometriose. Figura 4 - Esquema de hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI Figura 5 - Esquema do procedimento de cultivo de células da granulosa. Figura 6 - Níveis de P4 (ng/ml) produzidos em condições basais e em resposta à adição de testosterona (2 x 10"6M e 2 x 10"5M) em cultivo de células da granulosa do grupo de mulheres com endometriose e controle. Gráfico 1 - Níveis de E2 (pg/ml) em fluido de cultivo de células da granulosa do grupo de mulheres com endometriose e controle, em condições basais. Gráficos 2 e 3 - Atividade da aromatase expressa em níveis de E2 (pg/ml) produzidos em resposta à adição de testosterona na concentração de 2 x 10-6M (Gráfico 2) e 2 x 1 o·5M (Gráfico 3) em cultivo de células da granulosa de mulheres com endometriose e controle. XIV RESUMO Abreu LG. Atividade da aromatase em células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. 2005. 97p. Dissertação de Mestrado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Endometriose significa presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina. Sua associação com infertilidade é inequívoca, entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos e aberrações moleculares emergem como possíveis alvos de defeitos. Acredita­ se em comprometimento poligênico com alterações de citocinas, moléculas do estresse oxidativo e enzimas relacionadas à esteroidogênese como a aromatase. Esta é responsável por catalisar a transformação de andrógenos em estrógenos; está presente em vários tecidos e na célula da granulosa é de primordial importância para a foliculogênese. Em mulheres com endometriose, foram encontradas alterações da aromatase tanto em implantes endometrióticos como no endométrio tópico, além de redução de sua atividade em células da granulosa, com possível comprometimento da qualidade oocitária. Este trabalho tem por objetivo medir a atividade da aromatase nas XV células da granulosa in vitro de mulheres com endometriose submetidas à reprodução assistida. Pacientes e Métodos: Estudo caso-controle, com 8 pacientes com endometriose e 8 com outras causas de infertilidade submetidas à FIV ou ICSI. Coletaram-se células da granulosa a partir de folículos pré-ovulatórios no dia da captação oocitária e realizou-se cultivo destas células por 24 horas, na presença ou não de testosterona nas concentrações de 2 x 1 o-6M e 2 x 10-5 M; FSH (50 ng/ml) e IGF-1 (50 ng/ml) e foi feita dosagem posterior de estradiol (radioimunoensaio) e progesterona (quimioluminescência) nos fluidos de cultivo. Resultados: Houve redução da atividade da aromatase nas células da granulosa de mulheres com endometriose quando comparadas ao controle, quando houve adição de testosterona na concentração de 2 x 10-6M (p=0, 0303). A produção de estradiol e progesterona, basal ou estimulada por IGF-1 e FSH, não mostrou nenhuma diferença entre os grupos. Também não houve nenhuma diferença na produção de progesterona mediante adição de testosterona. Palavras-chave: Aromatase; endometriose; células da granulosa; reprodução assistida. xvi SUMMARY Abreu LG. Aromatase activity in granulosa cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques. 2005. 97p. Dissertação de Mestrado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Endometriosis represents the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. The infertility-endometriosis association is unequivocal; however, the mechanisms involved are still not totally elucidated and molecular aberrations have been proposed as possible targets. There is a belief that a polygenic insult results in molecular alterations of cytokines, molecules of the oxidative stress and enzymes related to steroid synthesis, such as aromatase. This enzyme is responsible for converting androgens to estrogens, is present in severa! tissues and in granulosa cells and is of primordial importance for folliculogenesis. ln women with endometriosis, aromatase alterations have been found both in endometriotic implants and in topic endometrium, as well as reduced activity in granulosa cells, with possible oocyte damage. The aim of this study was to measure aromatase activity in granulosa cells of women with endometriosis undergoing assisted reproductive techniques. xvu Patients and Methods: A case-contrai study was conducted on 8 patients with endometriosis and 8 with other infertility causes submitted to IVF or ICSI. Granulosa cells were obtained from a pre-ovulatory follicle during oocyte retrieval and cultured for 24 hours in the presence or absence of testosterane at 2 x 1 o-s M and 2 x 10-5 M concentration, FSH (50 ng/ml) and IGF-1 (50 ng/ml). Estradiol (radioimmunoassay) and progesterone (quimiolumminescence) were then measured in culture fluids. Results: Reduced aromatase activity was detected in granulosa cells of women with endometriosis compareci to contrai when testosterone was added at 2x 1 o-s M concentration (p=0.0303). The production of estradiol and pragesterane under basal conditions or in the presence of stimulation with IGF- 1 and FSH did not differ between groups. Also, no difference in pragesterone production was observed in the presence of testosterone. Key-words: aromatase; endometriosis; granulosa cells; assisted repraduction techniques. XVlll 1. Introdução 1.1. Etiopatogenia da Endometriose Endometriose, por definição, siginifica presença de endométrio (com glândula e estrema) fora da cavidade uterina (Noble et ai., 1996 Speroff et ai., 1999). Clinicamente, apresenta-se sob a tríade: dor pélvica crônica, dismenorréia e infertilidade, porém, não se encontra correspondência entre estágio da doença e severidade dos sintomas, de maneira que pequenas lesões podem causar sintomas exuberantes e vice-versa (Moura et ai., 1999). Atinge preferencialmente mulheres no menacme, sendo infreqüente antes da menarca e após a menopausa (Schenken, 1996; Moura et ai., 1999; Neme et ai., 2001) e representa uma doença crônica e de elevada morbidade, a qual acomete cerca de 10% das mulheres em idade reprodutiva e 25 a 35% das inférteis (Wheeler, 1989; Schenken, 1996; Moura et ai., 1999; Speroff et ai., 1999). Na verdade, a prevalência da endometriose depende muito do método empregado para seu diagnóstico e a população estudada. Wheeler (1989) demonstrou prevalência de aproximadamente 10% em achados cirúrgicos em mulheres em idade reprodutiva com outros diagnósticos, Hess (1988), por sua vez, encontrou 9,4% de endometriose em mulheres submetidas à laparoscopia por algia pélvica crônica (Neme et ai., 2001). Quando se analisam mulheres com infertilidade e dor pélvica associadas, pode-se encontrar até 50% de prevalência de endometriose (Cornillie et ai., 1990), por outro lado, mulheres assintomáticas apresentam incidência de cerca de 1-2% (Moura et ai., 1999). 19 Admite-se que a etiopatogenia de endometriose seja multifatorial e existem várias teorias para tentar explicá-la (Pellicer et ai., 1998; Bulun et ai., 2002). De acordo com a teoria de Sampson, a mais aceita, os debris mestruais que refluem para a cavidade peritoneal possuem células endometriais viáveis que potencialmente podem formar um implante endometriótico. Entretanto, por que existe refluxo em 90% das mulheres e somente 10% delas têm endometriose? Acredita-se que algumas destas células endometriais das pacientes com endometriose apresentam características singulares geneticamente determinadas que possam aumentar sua probabilidade de implantar-se, bem como a existência de um mecanismo imunológico aberrante que possa aumentar a sobrevida destas células e favorecer a formação de implante endometriótico (Zeitoun et ai., 1999; Bulun et ai., 2002). Outras teorias tentam explicar a presença de lesões de endometriose fora da cavidade pélvica. Em 1927, Meyer (1924) propôs que a endometriose seria resultado de uma metaplasia das células da linhagem peritoneal; esta teoria explica a endometriose em homens, em pré-púberes, mulheres que nunca menstruaram e lesões em sítios atípicos, como cavidade pleural e meninges. A constatação da presença de células endometriais viáveis na luz de vasos sanguíneos e linfáticos por Halban e Sampson (1925) levou-os a especular que focos distantes de endometriose poderiam surgir a partir da disseminação de células endometriais por via hematogênica ou linfática. Esta teoria explicaria lesões na pleura, umbigo, espaço retroperitoneal, vagina e colo do útero. Acredita-se que a endometriose também represente uma doença poligênica com envolvimento de alterações moleculares, principalmente as 20 citocinas 0/Vu & Ho, 2003); enzimas relacionadas à esteroidogênese como a aromatase (Zeitoun et ai., 1999; Bulun et ai., 2002) e moléculas envolvidas com o estresse oxidativo celular (Langendonckt et ai., 2002; Szczepanska et ai., 2003). Kao e colaboradores (2003), através da análise de microarrays em amostras de endométrio de mulheres com endometriose, encontraram 91 genes com expressão aumentada e 115 reduzidos significativamente nestas mulheres; entre estes genes alterados incluem aqueles envolvidos com resposta imune e apoptose celular, receptor de progesterona, fatores angiogênicos e o gene da aromatase. Arvanitis e colaboradores (2003) também encontraram a presença de um polimorfismo no gene da aromatase associado com endometriose. Com relação ao sistema imune, encontram-se alterações tanto na imunidade celular quanto humoral na endometriose, de maneira que ocorra um ambiente peritoneal favorável à maior sobrevida das células endometriais após o fluxo retrógrado para formação dos implantes endometrióticos (Pellicer et ai., 1998; Wu & Ho, 2003). O fluido peritoneal de pacientes com endometriose apresenta um maior número e maior atividade macrocítica; entretanto, estes apresentam atividade fagocítica reduzida e produzem maior quantidade de fatores de crescimento e citocinas que estimulam a adesão celular e expressão de metaloproteinases (substâncias modeladoras da matriz extracelular), favorecendo a formação dos implantes endometrióticos (Clive et ai., 1985; Zeller et ai., 1987; Dunselman et ai., 1988). As células NK (Natural Killer) também apresentam atividade de citotoxidade reduzida na endometriose, levando a uma menor capacidade de clearence das células endometriais refluídas (Oosterlynck et ai., 1991; Wilson et ai., 1994). Entre os linfócitos, há uma dominância na 21 atividade dos linfócitos da subpopulação Th2 em relação à Th1 r,Nu & Ho, 2003). Quanto à imunidade humoral, sugere-se a associação entre endometriose e doenças auto-imunes (Gallová et ai., 2002). Em estudo realizado com 313 mulheres inférteis com endometriose (261 estágios I e li; 62 estágios Ili e IV) comparativamente a 101 mulheres inférteis sem endometriose, houve maiores níveis de auto-anticorpos do tipo antifosfolípide contra inositol, cardiolipina, etanolamida e �2glicoproteína nas pacientes com endometriose, sendo mais exuberante naquelas nos estágios I e li. E em 40% das pacientes com endometriose graus leve e mínimo apresentaram anticorpos antizona pelúcida (Gallová et ai., 2002). Além disso, níveis elevados de citocinas no fluido peritoneal de pacientes com endometriose foram relatados em diversos estudos. Entre elas estão IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, TNFcx, TGF� 0/Vu & Ho, 2003). (Figura 1) Destaque merece ser dado à IL-6, que corresponde a uma interleucina das mais importantes na etiopatogenia da endometriose. Está envolvida com a produção esteroidogênica ovariana, foliculogênese e implantação embrionária, apresenta atividade multifuncional e possui efeitos angiogênicos, induzindo a expressão de VEGF. Além disso, por estímulo de IL-1, ocorre produção de IL-6 em células endometriais de pacientes com endometriose, porém não em pacientes sem a doença. A IL-6 também estimula a produção da aromatase em células adiposas 0/Vitz et ai., 2000), e, em elevadas concentrações, é embriotóxica em ratos (Wu & Ho, 2003). (Figura 1) 22 Macrófago IL 1, IL6, IL8, IL 10 TNFa, TGF�; VEGFj Adesão, angiogênese AM-1, VEGF, IL6, IL8 TNF .. _,,. ... -� � ,, '--' · . -7 _ MMTPs/TIMPs Bcl-2/Bax ROS/antioxidantes Th2 IL4, ILS, IL 10 i Th1 1� Célula NK IFN � t Figura 1 - Possíveis alterações fisiopatológicas na cavidade peritoneal de mulheres com endometriose. O endométrio anormal da endometriose em ROS ( espécies reativas de oxigênio), antioxidantes, metaloproteinases e seus inibidores (MMPs e TIMPs). Thl = subpopulação de linfócitos 1; Th2 = subpopulação de linfócitos 2. sICAM-1: molécula de adesão intercelular forma solúvel. VEGF = fator de crescimento vascular endotelial. Bcl-2 e Bax = proteínas anti­ apoptóticas. (adaptado de Wu & Ho. 2003). 23 Pesquisa-se também a presença de alterações nos mecanismos de controle de proliferação celular do endométrio de pacientes com endometriose. A "homeostase tecidual" normalmente é produto de um equilíbrio entre mecanismos de destruição ou degradação celular (apoptose) e de proliferação celular. Na endometriose parece haver um desbalanço nesta homeostase, com maior proliferação celular nas lesões endometrióticas e menor apoptose, permitindo a sobrevivência e crescimentos das lesões. (Fujishita et ai., 1999; Dmowski et ai., 200; Braun et ai., 2002; Toya et ai., 2002). As proteínas anti­ apoptóticas Bcl2 e Bax apresentam aumento de sua expressão em macrófagos e células endometriais de pacientes com endometriose (:Nu & Ho, 2003). Ainda, acredita-se que a cavidade peritoneal de pacientes com endometriose represente um ambiente pró-oxidante, com produção de substâncias denominadas espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem contribuir para a reação inflamatória associada à endometriose (Langendonckt et ai., 2002). Existem algumas evidências de estresse oxidativo na endometriose: (1) A enzima óxido nítrico-sintetase encontra-se superexpressa levando a uma maior produção de óxido nítrico (substância pró-oxidante); (2) aumento da peroxidação lipídica com produção de produtos reativos como o malonaldeído e lisofosfatidilcolina; (3) expressão aumentada de enzimas antioxidantes no endométrio de pacientes com endometriose, que ocorreria em resposta à presença de maior quantidade de espécies reativas de oxigênio; (4) níveis reduzidos de vitamina E no fluido peritoneal de mulheres com endometriose consumida durante reações de oxidação; (5) presença de indutores potenciais de estresse oxidativo na cavidade peritoneal como eritrócitos, debris celulares e 24 os macrófagos (Langendonckt et ai., 2002; Szczepanska et ai., 2003). (Figura 2). Os efeitos sobre a fertilidade residem sobre a toxicidade do fluido peritoneal sobre os espermatozóides, ovulação, sobre o desenvolvimento embrionário pré­ implantação e na implantação (Langendonckt et ai., 2002) (Figura 2). Debris --, / celul;res Macrófagos Dioxina, agentes tóxicos , ...... ... '=-'-- - - --► Estresse oxidativo NOS + 4 ______ NO + Vasodilatação Menstruação retrógrada + Hemácias + Hb + Heme + F�rro + Biliverdina + CO, Sangramento da lesão endometriótica Figura 2 - mecanismo de estresse oxidativo na endometriose. ( adaptado de Langendonckt et al., 2002). (Hb = hemoglobina; C02 = dióxido de carbono; NO= óxido nítrico; NOS= óxido nítrico sintase). Outras moléculas também se mostraram como alvos de alterações na endometriose: (1) Metaloproteinases - as metaloproteinases (MMP) e seus inibidores (TIMPs) são reguladores fisiológicos da remodelação da matriz extracelular. Um desbalanço entre eles pode produzir uma doença invasiva e favorecer a implantação endometrial no peritôneo. Na endometriose, pode ocorrer uma falta de inibidores das metaloproteinases, bem como aumento dos níveis das próprias metaloproteinases do tipo 1 e 2, como já foi detectado. A MMP2 é considerada um marcador de possível invasão por tumores epiteliais e 25 encontra-se aumentada na endometriose (Wu & Ho, 2003). (2) Moléculas de adesão (ICAM, SIGAM) - molécula de adesão intercelular, é fortemente expressa em células endometriais e sua forma de expressão de membrana (mlCAM) é importante para interação com o sistema imune e para a eliminação destas células do peritôneo. Entretanto, existe uma forma solúvel (slCAM) que se liga às células imunológicas, impedindo-as de interagir com a mlCAM, em última instância, prevenindo a destruição das células endometriais do peritôneo. A elevação de níveis séricos e no fluido peritoneal de slCAM foi detectada na endometriose. A presença desta molécula (slCAM) corresponde a mais um mecanismo das células endometriais na endometriose de escapar da ação imune e aumentar sua sobrevida no ambiente peritoneal favorecendo sua implantação em sítios ectópicos (Wu & Ho, 2003). Além da etiopatogenia, também existem controvérsias sobre o comportamento da endometriose e sua classificação. Nisolle & Donnez (1997) defendem a hipótese das três doenças, ou seja, que, a endometriose peritoneal, a ovariana e a de septo retovaginal representariam três doenças distintas com comportamentos clínicos e histopatológicos diferentes. Brosens (2000), por sua vez, classifica a endometriose de acordo com sua topografia, em superficial e profunda: a forma superficial ou adenomiose seguiria o trajeto dos duetos mullerianos incluindo útero, fórnices vaginais, septo retovaginal e ligamentos uterinos; as lesões profundas seriam aquelas localizadas fora da extensão dos duetos de Muller e incluiriam lesões peritoneais e ovarianas. 26 1.2. Aromatase e Endometriose Como já foi relatado, emerge a teoria de que a endometriose represente uma doença poligênica hereditária com envolvimento de alterações moleculares com expressão aberrante de citocinas e enzimas relacionadas à esteroidogênese como a 17beta-hidróxi-esteróide-desidrogenase e a aromatase (Zeitoun & Bulun, 1999; Attia et ai., 2001; Neme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002). De fato, evidências apontam neste sentido, especialmente no caso da aromatase (Bulun et ai., 1995; Noble et ai., 1996; Zeitoun & Bulun, 1999; Neme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002). Esta é uma enzima codificada pelo gene CYP 19 localizado no cromossomo 15 (Meinhart & Mullis, 2002), corresponde a um complexo enzimático do citocromo P450 responsável por catalisar a transformação de andrógenos (testosterona, androstenediona) em estrógenos (estradiol, estrona, respectivamente) (Zeitoun & Bulun, 1999; Neme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002; Karaer et ai., 2004). Ela está presente em vários tecidos: ovários (células da granulosa), testículo, tecido adiposo, placenta, cérebro, músculo, fibroblastos da pele e do tecido ósseo (Karaer et ai., 2004). Vários promotores tecido­ específicos regulam a sua expressão, e, apesar da presença de primeiros exons alternativos e de promoters tecido-específicos que permitem a regulação local da enzima, a proteína expressa é a mesma (Meinhart & Mullis, 2002; Karaer et ai., 2004). Na célula da granulosa, a aromatase apresenta um papel essencial na foliculogênese e produção de estradiol: sua expressão aumenta à medida que o desenvolvimento folicular progride (Tetsuka & Hillier, 1997; Guet et ai., 1999), sob influência do FSH, segundo a teoria das duas células-duas 27 gonadotrofinas (Speroff et ai., 1999). Portanto, a aromatase é uma enzima de primordial importância na célula da granulosa e responsável por produzir um microambiente estrogênico folicular, essencial ao seu processo de desenvolvimento e maturação (Speroff et ai., 1999). O envolvimento da aromatase e a produção de estradiol na etiopatogenia da endometriose tem sido alvo de numerosos estudos (Bulun et ai., 1995; Noble et ai., 1996; Zeitoun & Bulun, 1999; Neme et ai., 2001; Attia et ai., 2001; Bulun et ai., 2002). Uma vez que a endometriose é considerada uma doença estrogênio­ dependente, a expressão da enzima aromatase torna-se essencial para a etiopatogenia da doença. O estrógeno é um mitógeno para os tecidos mullerianos (Bulun et ai., 2002) e a possível ação autócrina deste hormônio, ou seja, sua ação local sobre o endométrio de mulheres com endometriose pode ser um facilitador para a implantação e desenvolvimento de implantes na cavidade peritoneal. (Noble et ai., 1996; Fang et ai., 2002) Foram detectados níveis estrogênicos significativamente aumentados no sangue menstrual de mulheres com endometriose (Neme et ai., 2001). Além disso, níveis muito elevados da aromatase em implantes endometrióticos e endometriomas por meio de PCR (po/ymerase chain reaction) (Noble et ai., 1996; Kitawaki et ai., 2002) e RNAm da aromatase foi detectado em endométrio eutópico de mulheres com endometriose porém não naquelas sem a doença (Bulun et ai., 1995). Porém, a quantidade de aromatase encontrada no endométrio tópico de mulheres com endometriose foi menor do que nos implantes peritoneais; a hipótese é que este endométrio defectivo, quando reflui para a cavidade peritoneal, causa uma reação inflamatória que aumenta exponencialmente a expressão da aromatase, já que a prostaglandina E2 é o mais potente 28 estimulador desta enzima. Desta forma, se estabelece um ciclo vicioso de produção de estradiol e prostaglandinas que facilita a formação dos implantes endometrióticos e perpetua este mecanismo fisiopatológico que favorece as características proliferativas e inflamatórias da endometriose (Zeitoun & Bulun, 1999; Bulun et ai., 2002) (Figura 3). A proteína sTAR (steroidogenic acute regulatory protein) também encontra-se alterada nos tecidos endometrióticos e também sofre estímulo das prostaglandinas (Sun et ai., 2003). Além disso, acredita-se numa resistência à ação da progesterona na endometriose (Zeitoun & Bulun, 1999; Bulun et ai., 2002). A progesterona estimula a ação da enzima denominada 17beta-hidróxi-esteróide-desidrogenase tipo 2, que faz a inativação do estradiol para estrona. A expressão desta enzima apresenta-se deficiente nas células endometrióticas glandulares, portanto, o efeito protetor da progesterona é reduzido na endometriose. (Bulun et ai., 2002) (Figura 3). Attia et ai. (2001) relataram alterações na expressão das isoformas de receptores de progesterona na endometriose: não foi detectada a expressão da isoforma B do receptor de progesterona no tecido endometriótico, responsável por mediar a ação progesterônica nos tecidos-alvo; a isoforma A, cuja função é ser repressora da forma B, apresentou-se expressa na endometriose. 29 Célula estromal Vaso sanauíneo Célula epitelial 17 HSD-1 E1 HSD- ------�... + ,' ', , ......... , ,..._ r -------- PgE2 + ,,', , , , , , E2 Figura 3 - Inativação defectiva de estradiol na endometriose. Os estrógenos estradiol (E2) e estrona (El) e a androstenediona (A) chegam às lesões endometrióticas através da corrente sanguínea, a aromatase (P450 arom) na célula estromal endometriótica catalisa a transformação de androstenediona (A) para estrona (El), que, por sua vez, é convertida à E2 pela ação da enzima 17 beta hidroxiesteroidedesidrogenase tipol (17pHSD-l). O E2 normalmente é inativado para El através da enzima 17 betadesidrogenasetipo2 (17pHSD- 2) na célula epitelial glandular do endométrio tópico na fase secretória. Na célula endometriótica, no entanto, a l 7j3HSD-2 apresenta-se defeituosa, mantendo E2 em elevados níveis locais. E2 promove crescimento do tecido endometriótico e produção de prostaglandinas (PGE2) que, por sua vez, estimula a aromatase, completando um ciclo de feedback positivo de E2 e PGE2. (Adaptado de Zeitoun & Bulun, 1999) 30 Em suma, o envolvimento da aromatase com a endometriose se explica da seguinte maneira: em primeiro lugar, a endometriose é uma doença do menacme, portanto, sua etiopatogenia possivelmente se relaciona com a esteroidogênese (Zeitoun & Bulun, 1999; Neme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002) e a aromatase está diretamente envolvida neste processo. Em segundo lugar, alterações da aromatase na endometriose já foram relatadas: níveis muito elevados da aromatase foram encontrados em implantes endometrióticos e em endometriomas (Noble et ai., 1996) e também foi detectado RNAm da aromatase em endométrio eutópico de pacientes com endometriose mas não em mulheres sem a doença (Bulun et ai., 1995). Ora, se existe funcionamento aberrante da aromatase em implantes endometrióticos ou endométrio tópico de pacientes com endometriose, por que não ocorreria o mesmo dentro da célula da granulosa com comprometimento da foliculogênese e qualidade oocitária, com conseqüências sobre a fertilidade? Harlow e cols. ( 1996) pesquisaram a atividade da aromatase em pacientes com endometriose de graus leve e mínimo através de cultura de células da granulosa na qual avaliaram a produção de estrógeno frente à adição de testosterona ao meio de cultura. Encontraram redução da atividade da aromatase nas pacientes com endometriose em comparação ao controle. A escassez de outros estudos similares, bem como o uso de outros métodos mais específicos para tal avaliação, estimulou a proposta deste estudo. 31 Se se considerar a associação infertilidade-endometriose, esta é inequívoca, entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos. Quando há defeito anatômico pélvico não existe dúvida quanto à sua relação com infertilidade, porém, quando isto não ocorre, encontra­ se dificuldade para explicá-la (Schenken, 1996; Speroff et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000). Neste caso, os mecanismos propostos compreendem: (1) alterações no microambiente folicular ou no oócito (Schenken, 1996; Speroff et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000; Pellicer et ai., 1998); (2) falência na implantação (Ferriani et ai., 2000); (3) disfunção ovulatória (Speroff et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000); (4) defeitos imunológicos inclusive relacionados a processo auto-imune (Lucena & Cubillos, 1999); (5) hiperativação dos macrófagos peritoneais (Pellicer et ai., 1998; Wu & Ho, 2003); (6) alterações nas citocinas no fluido folicular e sistemicamente particularmente da interleucina 6 (Oliveira, 2002; Pellicer et ai., 1998; Witz, 2000; Wu & Ho, 2003); (7) síndrome do folículo luteinizado não roto (Moura et ai., 1999; Speroff et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000); (8) alterações no desenvolvimento embrionário precoce (Moura et ai., 1999); (9) apoptose celular aumentada em células da granulosa (Toya et ai., 2002); além de (10) alterações endócrinas como fase lútea inadequada e hiperprolactinemia (Gomes, 2002; Moura et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000). A Fertilização in Vitro (FIV) tem se tornado o método de escolha para tratamento da infertilidade associada à endometriose (Neme et ai., 2001). Numerosos estudos foram realizados para avaliar se a endometriose afeta os resultados da FIV e seus achados foram controversos (Rinesi et ai., 2002). Entretanto, Barnhart e cols (2002) realizaram uma metanálise de 22 estudos sobre o assunto e verificaram que todos os parâmetros encontravam-se 32 alterados nas pacientes com endometriose quando comparadas àquelas com outras causas de infertilidade, com redução na taxa de fertilização, número de oócitos captados, taxas de implantação e gestação. Considerando-se as evidências de que o principal fator alterado nas pacientes inférteis com endometriose e submetidas à FIV seja a qualidade oocitária (Pellicer et ai., 1998; Barnhart et ai., 2002; Diaz et ai., 2000) em detrimento de outros fatores como a receptividade endometrial (Diaz et ai., 2000); o estudo da atividade da aromatase nas células da granulosa visa a um esclarecimento dos mecanismos responsáveis por este comprometimento oocitário, bem como busca um possível alvo terapêutico. 33 2. Objetivo O objetivo deste trabalho é: ✓ Medir a atividade da enzima aromatase nas células da granulosa em cultivo in vitro de mulheres com endometriose em comparação àquelas sem endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV ou ICSI). A hipótese a ser validada é que: ✓ Mulheres com endometriose apresentam redução da atividade da aromatase nas células da granulosa in vitro. 34 3. Pacientes e Métodos 3.1. Delineamento do estudo - estudo caso-controle. 3.2. Amostra - 08 pacientes para cada grupo. 3.3. Local de realização do estudo: Serviço de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. 3.4. Comitê de Ética em Pesquisa: o presente estudo foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) de acordo com o parecer número 1492/2004. Cada paciente assinou um termo de consentimento antes da realização do procedimento de reprodução assistida e da realização da pesquisa, após os devidos esclarecimentos (vide Anexos). 3.5. Seleção de Pacientes Foram selecionadas 16 pacientes inférteis com indicação para FIV ou ICSI, com um total 08 para cada grupo (com e sem endometriose). Os critérios para seleção de pacientes de ambos os grupos estão descritos abaixo: 35 3.5.1. Critérios de inclusão para os dois grupos: estar cadastrada no Programa de Reprodução Assistida do Setor de Reprodução Humana do Departamento de Tocoginecologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; ter idade inferior a 40 anos, apresentar ciclos menstruais regulares e dosagens de LH e FSH ( 3° dia do ciclo) normais para o menacme. 3.5.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo: presença de endometriose em qualquer estágio de acordo com a classificação da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva diagnosticada por laparoscopia prévia realizada até 6 meses antes do estudo. 3.5.3. Critérios de exclusão para o grupo-estudo: idade acima de 40 anos, presença de outros fatores de infertilidade ou patologias endócrinas associadas à endometriose. 3.5.4. Critérios de inclusão para o grupo-controle: ausência de endometriose confirmada por laparoscopia prévia há no máximo 6 meses, ausência de doenças endócrinas associadas. 3.5.5. Critérios de exclusão para o grupo-controle: idade acima de 40 anos, presença de outras doenças endócrinas associadas. 36 3.6. Protocolo de Hiperestimulação Ovariana Controlada Inicialmente, realizou-se a programação do período menstrual através de uso de anticoncepcionais orais combinados no ciclo prévio àquele da indução da ovulação. Do 1 °-3° dia do ciclo de estimulação ovariana, foi realizada uma ultrassonografia (USG) transvaginal para excluir cistos ovarianos e então iniciada a estimulação ovariana controlada com gonadotrofinas: hMG (Menogon®, Ferring, Brasil; Pergonal®, Serona, Brasil) ou FSH recombinante (Puregon®, Organon, Brasil.; Gonal-F®, Serona, Brasil) nos primeiros 5 dias na dose de 200 a 450 UI/dia e a partir do 6° dia a dose da gonadotrofina foi ajustada de acordo com o crescimento folicular monitorizado por USG. Quando houve pelo menos 2 folículos com 17 mm de diâmetro, foi administrado hCG intramuscular (Profasi®, Serona, Brasil) 10.000 UI ou hCG recombinante 250µg via subcutânea (Ovidrel®, Sereno, Brasil) e após 34 a 36 horas, realizada a captação de oócitos. Para dessensibilização hipofisária, foi utilizado o agonista do GnRH, acetato de leuprolide (Lupron®, Abbott; Reliser®, Serono, Brasil), 1 O UI/dia via subcutânea ou nafarelina via nasal 400 µg/dia (Synarel®, Pharmacia, Brasil) conforme protocolo longo, ou seja, iniciado na fase lútea do ciclo prévio ou sete dias antes da menstruação programada (Ferriani et ai., 2004). A suplementação lútea foi iniciada a partir do dia da captação oocitária e, no caso de gravidez, até a 12ª semana de gestação (Figura 4); as progesteronas utilizadas foram: diidrogesterona 30 mg/dia (Duphaston®; Solvay; Brasil) ou a progesterona gel uma aplicação diária (Crinone 8%; Sereno; Brasil). 37 3. 7. Captação de Oócitos A captação oocitária foi realizada sob anestesia geral tipo sedação com uso de propofol (Diprivan®, Astra Zeneca, Brasil) associado ao fentanil (Fentanil®, Janssen Cilag, Brasil), administrados por via endovenosa. O procedimento foi feito via vaginal através de punção de fundo de saco e guiado por ultrassonografia. O conteúdo de cada folículo foi aspirado em tubos de Falcon sob pressão de 120-130 mmHg e mantido a 37° e os oócitos manuseados e separados do restante do fluido folicular em capela de fluxo de ar laminar para depois serem mantidos em meio de cultura em incubadora com temperatura controlada a 37°C e concentração de CO2 de 5% 38 Programação da menstruação BH M Gonadotrofina diária GnRH-agonista USG basal hCG Suplementação da fase lútea co TE Figura 4 - Esquema de hiperestimulação ovanana controlada para FIV ou ICSI conforme protocolo longo. (BH = Bolqueio hipofisário; M = menstruação; USG = ultrassonografia basal; M-USG = monitorização ultrassonográfica; MF = maturidade folicular; CO = captação oocitária; TE = transferência embrionária). (Adaptado de Ferriani et al., 2004). 39 3.8. Cultivo de Células da Granulosa Para o cultivo das células da granulosa foi usada a técnica do Instituto Valenciano de Infertilidade da Universidade de Medicina de Valencia, Espanha (Pellicer e cais., 1998), com algumas modificações (Silva, 1997) descritas abaixo: Colunas de Percoll: para preparação das colunas de Percoll foram adicionados 9 mi de Percoll® (Pharmacia, Upsala, Suécia) a 1 mi de Meio-199 (Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil), e a estes 1 O mi foram adicionados 1 O mi de meio de lavado (HAM-F1 O® com 20% de Soro Fetal Bovino (SFB)®, ambos da Cultilab, Campinas, Brasil). Alíquotas de 5 mi foram distribuídas em quatro tubos, mantidos sob refrigeração a 4° C. ( Tabela 1) Meio de Cultivo: foi usado o Meio-199 com 20% de Soro Fetal Bovino (SFB®) e L-Glutamina 2 mM (Sigma®, Estados Unidos). A preparação do meio de cultivo foi realizada sob fluxo laminar utilizando-se material estéril. O Meio-199 é constituído por uma combinação de vitaminas, aminoácidos, sais inorgânicos e outros componentes como fonte nutritiva definida para cultura celular. O Soro Fetal Bovino, por sua vez, é composto por inúmeras substâncias ainda pouco definidas, porém é necessária sua adição para culturas celulares prolongadas (Fernandes; 2004). Foram adicionados 2 antibióticos ao meio de cultivo com objetivo de evitar contaminação bacteriana: (1) Penicilina Cristalina (Cristalpen®, Biolab, Brasil) na concentração de 100.000 UI/mi e sulfato de estreptomicina (Estreptomicina®, FURP, Brasil) na concentração de 20 mg/ml (Tabela 1). 40 Tabela 1 - Preparo dos meios para cultivo de células da granulosa. Meio de Lavado 40ml HAM F10 32 mi SFB 20% 8ml Colunas de Percoll 20 mi Percoll 9ml Meio 199 1 mi Meio de lavado 10 mi Meio de Cultivo 10 mi Meio 199 8ml SFB 20% 2ml Estreptomicina 50 µI Penicilina 10 µI L-glutamina 2,92 mg Antibióticos Estreptomicina 1 g H2O destilada 50ml Penicilina cristalina 5.000.000 UI H2O destilada 50ml 41 3.8.1. Procedimento do Cultivo Celular: Isolamento das Células da Granulosa: Os grumos de células da granulosa, presentes no fluido folicular ou no lavado do aspirado folicular, foram captados com pipeta Pasteur sob visualização em microscópio invertido (Coleman® ST- 302L, Brasil), após a espera de que o sangue aspirado se depositasse no fundo das placas de Petri, onde foram vertidos o fluido folicular e o meio de lavado após o isolamento dos oócitos. Os grumos celulares captados, então, foram transferidos para outra placa contendo meio de lavado (HAM F10® e SFB®) onde, novamente, foi aguardado o tempo necessário para que as células sanguíneas se depositassem no fundo da placa de Petri. A seguir, o conteúdo desta placa foi transferido, com pipeta Pasteur, para o tubo de Falcon e centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos a 4°C (centrífuga Spin VI®, lncibrás, Brasil). O sobrenadante foi, então, retirado e foram adicionados 2 mi de meio de lavado ao pellet, misturando-se bem com pipeta Pasteur, para que as células se separassem. Este conteúdo, então, foi transferido delicadamente sobre as colunas de Percoll preparadas previamente, e centrifugado a 500 rpm por 30 minutos a 4ºC. As células da granulosa ficaram na interface da coluna de Percoll, e foram captadas com pipeta Pasteur e, após, transferidas para outro tubo de Falcon estéril no qual foi adicionado 4 mi de meio de lavado para posterior centrifugação por 10 minutos a 1500 rpm a 4ºC. Por fim, deste conteúdo, foi desprezado o sobrenadante e o precipitado foi dissolvido em 1 mi de meio de cultivo, para posterior contagem da viabilidade das células da granulosa. 42 Contagem e Viabilidade das Células da Granulosa: 50 µI da suspensão celular anterior foram colocados em tubo de hemólise e adicionados 450 µI de Azul de Trypan (Trypanblau®, Merck, Alemanha) a 0,4 % na diluição 1: 1 O. A seguir, este conteúdo foi colocado em uma câmara de Newbauer para contagem do número de células viáveis. Para calcular o número total, multiplicou-se o número de células vivas contadas por 104 e pelo fator de diluição dez. As células mortas mostraram-se coradas pelo Azul de Trypan e as células vivas ficaram brancas com aspecto refringente à visualização no microscópio óptico (Coleman® N 107, Brasil). Da suspensão celular obtida, após cálculo do número total das células vivas, calculou-se a concentração das células por placa de maneira que se tivesse uma concentração de 50.000 células por placa de cultivo. Para a realização de todos os experimentos (6 experimentos em triplicata), era necessária uma concentração total de, no mínimo, 900.000 células viáveis. Cultivo Celular: as células foram cultivadas em placas de cultivo celular 35 x 1 O mm. Assim, foram colocadas 50.000 células da granulosa viáveis por placa de cultivo, e foi adicionado meio de cultivo de forma a completar um volume total de 1 mi por placa de cultivo. O ensaio foi realizado em triplicata. Os cultivas celulares foram mantidos em estufa com atmosfera gasosa a 5% de CO2 e em temperatura de 37ºC por um tempo de 24 horas. Após esse período, os meios de cultivo foram aspirados e estocados a -20° C para posterior análise. 43 Captar os grumos tk céls com pipeta Je Pasl<'llr Tran,-,f.-rir p/ placa contendo meio de lavado Transferir p/ tubo cônico .., ,,,. Retirar o sohrenaJante o Dissolver o precipitado em 2 mi Je meio de lavado i Colocar sobre a coluna ele Percoll Centrifuqar o 10mm 1500 rpm Centr ifuqar o 30 min 500 rpm Captar as CG na interface da coluna de Percoll Transferir para tubo cônico contendo 4 mi de meio de lavado Centrifuqar Desprezar o sobrenadante o Dissolver o precipitado em 1 mi de meio de cultivo o 10mm 1500 rpm Contagem das celulas na Câmara de Newbawer Figura 5 - Esquema do procedimento de cultivo de células da granulosa (Fernandes, 2004). 44 3.9. Atividade da Aromatase A atividade da enzima aromatase nas células da granulosa em cultivo celular in vitro foi medida através da produção de estradiol frente à adição de testosterona (substrato da aromatase) ao meio de cultivo. A testosterona® (Sigma, Estados Unidos) foi adicionada ao meio de cultivo nas concentrações finais de 2x10 -6 Me a 2x10- 5 M. O tempo de incubação foi de 24 horas em estufa com atmosfera gasosa a 5% de CO2 e em temperatura de 37°C e, posteriormente, foi dosado o estradiol produzido, através de radioimunoensaio (DPC Medlab, EUA). Para controle, foi avaliada a produção de estradiol quando não foi adicionada testosterona ao meio de cultivo. Este método foi aplicado para os dois grupos (com e sem endometriose). 45 3.1 O. Experimentos realizados Para cada paciente selecionada (tanto no grupo com endometriose como no grupo controle), foram realizados 6 experimentos diferentes, em triplicata, com adição reagentes específicos a cada um deles. Os reagentes utlizados foram: testosterona (Sigma, Estados Unidos); FSH (Recombinant human FSH for B/0 studies, Serona, Estados Unidos) e IGF- 1 (Human IGF-1 for BI0 studies, Serona, Estados Unidos), ambos na concentração final de 50 ng/ml. A testosterona foi adicionada como substrato da enzima aromatase (Harlow et ai., 1996); e os reagentes FSH e IGF-1 como estimuladores da ação da aromatase (Erickson et ai., 1989; deMoura et ai., 1997; Fernandes, 2004). Experimento 1: somente células da granulosa; Experimento 2: Células da granulosa + Testosterona (2 x 10"6M); Experimento 3: Células da granulosa Testosterona a (2 x 10·5 M); Experimento 4: Células da granulosa+ FSH e IGF-1 (50 ng/ml); Experimento 5: Células da granulosa + Testosterona (2 x 1 o·6M) + FSH e IGF-1 (50 ng/ml); Experimento 6: Células da granulosa + Testosterona (2 x 1 o·6M) + FSH e IGF-1 (50 ng/ml). 46 3.11. Dosagens Hormonais 3.11.1. Estradiol A determinação quantitativa do estradiol no fluido de cultivo celular foi realizada através de radioimunoensaio no laboratório de Ginecologia e Obstetrícia, Hospital das Clínicas, FMRP, Ribeirão Preto, São Paulo. Utilizou-se o kit Double Antibody, fase sólida, da DPC, USA, com sensibilidade de 1,4 pg/ml. A medida da radioatividade gama para o isótopo 1125 foi realizada pelo aparelho Cobra li Auto-Gama®, Brasil. O erro intra-ensaio foi de 5,8%. Houve amostras que necessitaram de diluição, que foram feitas utilizando-se o meio 199. 3.11.2. Progesterona A determinação quantitativa de progesterona no fluido de cultivo celular foi realizada através de quimioluminescência no laboratório de Ginecologia e Obstetrícia, Hospital das Clínicas, FMRP, Ribeirão Preto, São Paulo; utilizando­ se kit da DPC, USA e leitura no aparelho lmmulite 2000®, também da DPC. A sensibilidade foi de 0,2 ng/ml e algumas amostras necessitaram de diluição realizada com meio 199. O erro intra-ensaio foi de 4,9%. 47 Para excluir a presença de estradiol, progesterona ou testosterona nos meios de cultivo que pudessem interferir nos resultados, foram realizadas as respectivas dosagens em seus componentes: 1 )Meio 199®; 2)SFB® ; 3) HAM­ F1 O®, todos indetectáveis através de radioimunoensaio (Fernandes, 2004; Silva, 1997). 3.12. Análise Estatística Para a análise dos dados, primeiramente foi realizado o teste da normalidade para os dados referentes às dosagens de estradiol e progesterona nos fluidos de cultivo celular. Os dados apresentaram distribuição gaussiana verificados através do teste KS, porém as variâncias foram diferentes em alguns grupos analisados, dessa forma, foi usada a correção de Welch ou a normalização da variável para fins de análise estatística. Os resultados foram comparados entre os dois grupos (controle e endometriose) através do teste T não pareado. Para comparações dentro de um mesmo grupo (controle ou endometriose), foi realizado o teste T pareado. O programa usado para realização dos cálculos estatísticos foi o GraphPad Prism® versão 3.0. Considerou-se um nível de significância de 5% ( p <0,05). 48 4. Resultados 4.1. Características clínicas das pacientes do estudo A idade das pacientes variou de 28 a 37 anos de idade, e não houve diferença estatística quanto à idade entre os grupos controle e endometriose (p= O, 1450) (Tabela 2 e 3). Do total de 16 pacientes, 14 eram nuligestas e 04 já haviam engravidado previamente, 02 do grupo com endometriose tiveram um aborto de primeiro trimestre e 02 pacientes do grupo controle tiveram filhos (uma delas teve uma cesárea prévia e outra, 03 partos vaginais). Quanto ao tempo de infertilidade, 13 do total de 16 pacientes tinham um tempo de infertilidade superior a quatro anos, somente 03 pacientes tinham tempo inferior a 4 anos (uma delas com 1 ano e outra com 02 anos de infertilidade). Quatorze pacientes já tinham realizado tratamentos prévios de infertilidade e somente 2 delas ainda não tinham realizado nenhum tipo de tratamento. (Tabelas 2 e 3) Do total de 08 pacientes do grupo controle, 05 delas tinham fator tubáreo (uma delas com laqueadura prévia e as outras com provável etiologia infecciosa) e 03 pacientes apresentavam fator masculino (uma delas com parceiro com oligospermia moderada e as outras 02 pacientes apresentavam parceiros com asteno e teratozoospermia). No grupo com endometriose, 03 pacientes apresentavam endometriose grau leve, 01 tinha grau mínimo, 03 delas grau moderado e 01 grau severo ou grave. (Tabelas 2 e 3) 49 Tabela 2 - Características clínicas das mulheres do grupo controle: idade, tempo de infertilidade, tratamentos de infertilidade prévios e causa da infertilidade. (DP = desvio­ padrão). w - rn w w rn e rn owc c(cw o cC - o t- e e( e� 1- a.. g f/) z z rn e z o �..JQ e( WQ::J e( ::J w z - �-- rn-w i= z w c(>I- :::, 1- 1- a::: e( e 1- •W 0:: e( a::: � w- e( � a::: w o�LI.. e a.. LI.. z 1- � z 01 10 32 CC + IUI (1) Fator masculino 02 05 33 FIV + ICSl(7) Fator masculino 03 05 28 Fator masculino 04 02 33 FIV (1) Fator tubáreo 05 >4 32 FIV (1) Fator tubáreo 06 11 37 Fator tubáreo 07 >4 35 CC Fator tubáreo 08 05 34 FIV(1) Fator tubáreo Média± DP 33 ± 2,62 50 Tabela 3 - Características clínicas das mulheres do grupo com endometriose: idade, tempo de infertilidade, tratamentos de infertilidade prévios, classificação da endometriose e antecedente familiar de endometriose. (DP = desvio-padrão). w -rn e rn o e( - o w o. 9 tn z z o :5::!0 e( w z - w .... z w (.) .... o:: li( e e( w- e( 0. L&. e z 01 6 30 02 10 34 03 11 32 04 08 28 05 01 29 06 02 28 07 >4 33 08 04 34 Média± DP 31 ±2,56 C/) w owc ..,. e e( z rn e WQ:::::J :5 -- e( > .... 1--•W O:: �,x:W 0. L&. .... � CC FIV(1) + TEC(1) CC ICSI (1) ICSI (1) FIV(1) + ICSl(2) ICSI (1) IUI (2) o wrn 1<( o, o e( ii: o e( .... U:::cW - :e tn o rn e :3 z o w leve leve grave moderada moderada moderada mínima leve wwwCI) .... co z -w a:: a:: e e( ..,. w-w (.) :::! :5 w :::E o..,. e( ez L&. z e( w Não não Não Sim (mãe) Sim (irmã) Não Não Não Em relação ao protocolo de hiperestimulação ovariana, os dados estão representados abaixo (tabela 4): 51 Tabela 4- Características da hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI das pacientes do grupo com endometriose e controle, quanto à duração do bloqueio hipofisário; tipo da gonadotrofina usada (FSHr ou HMG), dias de indução e unidades totais de gonadotrofinas usadas. * variâncias estatisticamente diferentes. U) o o e( w o e( w U) a:: e w o e a:: e 1- :::::, cu - w 1- e( e 1<( e( 1- e( :e U) e o U) e o z o o a::e( o e U) e( o, j::: w e U) z :::::, ::, e 0.. z a CL e( <( e e z e( e( :E � - j:: z e( z e( w o z o z :::::, o z 1- C) ii: z a C) ii: Controle 01 21 FSHr 10 2200UI 02 33 FSHr 12 5250UI 03 21 FSHr 09 2250UI 04 22 FSHr 11 2050UI 05 20 FSHr 10 2850UI 06 20 FSHr 08 2400UI 07 20 FSHr 10 3000UI 08 30 FSHr 10 2000UI Média± 5D 23,38 ± 5,12 10 ± 1,19 2750 ± 1072 * Endometriose 01 17 HMG 10 2150UI 02 21 FSHr 11 3300UI 03 20 FSHr 08 1800UI 04 21 FSHr 10 2250UI 05 19 FSHr 11 1700UI 06 19 FSHr 08 1600UI 07 19 FSHr 10 2000UI 08 22 FSHr 12 2400UI Média± 5D 19,75 ± 1,58 10±1,41 2150 ± 540,5* 52 Ainda em relação ao procedimento de hiperestimulação ovariana controlada, não houve diferença significativa quanto ao tempo do bloqueio hipofisário (p = 0,0766), dias de indução (p = 1,0) e quantidade de gonadotrofina usada (p = 0,5760). Das 16 pacientes do estudo, 13 delas utilizaram a nafarelina como agonista do GnRH para bloqueio hipofisário. Somente 03 pacientes utilizaram o acetato de leuprolide. Somente uma paciente com endometriose apresentou a síndrome de hiperestimulação ovariana grau leve. As características da captação de oócitos e da transferência embrionária estão descritas na tabela 5. Não houve diferença estatística quanto ao número de folículos puncionados (p = 0,7844) e número de oócitos captados (p = 0,6619) entre os grupos controle e endometriose. 53 Tabela 5 - Características da captação de oócitos e transferência embrionária para FIV e ICSI nos grupo controle e endometriose. ti) ti) ti) ti) ti) o o ti) ti) w o w ..J e o o ,o ::, <C !::: e � õ2 z 0 o z o <C w w z ':::l o ·O ... m u o u o a. :E <C <C w z LL. z 0 � a. o ::, z o a. z Controle 01 22 14 02 02 05 02 02 03 20 13 03 04 14 09 03 05 16 09 01 06 13 07 01 07 28 16 03 08 25 09 03 Média± SD 17,88 ± 7,4 9,875 ± 4,42 2,250 ± 0,89 Endometriose 01 28 15 03 02 13 07 03 03 10 07 03 04 19 11 03 05 30 08 03 06 15 05 03 07 18 07 03 08 18 12 03 Média± SD 18,88 ± 6,94 9,0 ± 3,34 3,0 ± 0,0 54 Do grupo com endometriose, 04 pacientes engravidaram: duas delas tiveram gestação gemelar e duas tiveram gestação única. Do grupo controle, 04 pacientes também apresentaram gravidez: uma delas apresentou aborto no primeiro trimestre de gestação; duas pacientes tiveram gestação única e uma gemelar. 55 4.2. Dosagens Hormonais nos Fluidos de Cultivos Celulares 4.2.1. Estradiol Os valores das dosagens de estradiol (radioimunoensaio) realizadas nas pacientes do grupo com endometriose e grupo controle, em triplicata, apresentam-se descritas no apêndice 01. As dosagens em média estão na tabela 6 e 7. A produção basal de estradiol nas células da granulosa, ou seja, sem a adição de nenhum reagente ao meio de cultivo, apresentou diferença entre os grupos controle e endometriose (p = 0,0390) (Gráfico 1 ). A adição de FSH e IGF-1 não acarretou aumento na produção de estradiol tanto no grupo controle (p = O, 1228) como no grupo com endometriose (p = O, 6051). 56 4.2.2. Atividade da aromatase A atividade da aromatase nas células da granulosa in vitro foi avaliada através de adição de testosterona ao meio de cultivo (substrato da aromatase) com medida da produção de estradiol frente a esta adição (ver métodos). Neste estudo, foi adicionada a testosterona em duas concentrações ao meio de cultivo. Na concentração final de 2 x 1 o-6 M houve diferença na produção de estradiol comparando-se o grupo de mulheres com endometriose e controle (p = 0,303) (Gráfico 2). No entanto, a testosterona na concentração final de 2x10-5 M adicionada não apresentou diferença na produção de estradiol entre controle e endometriose (p = 0,6759; Gráfico 3). Além disso, a suplementação de IGF-1 e de FSH ao meio de cultivo juntamente à testosterona em ambas as concentrações não acarretou diferença significante na produção de estradiol (p = 0,8322 quando testosterona a 2x 1 o-s M e p = 0,8558 com a concentração de testosterona de 2x10-5 M). 57 Tabela 6 - Valores em média das dosagens de estradiol em pg/ml de fluidos de cultivos de células da granulosa de mulheres sem endometriose (grupo controle) submetidas à reprodução assistida. Pacientes Exp 1 Exp2 Exp3 Exp4 Nº 01 269,84 1097, 15 5920,43 257,25 02 2267,4 2577,05 10700,38 1453,8 03 805,10 711,86 1853, 17 1380,45 04 651,29 1071,08 1304, 10 1153,03 05 184,56 370, 16 1278,80 197,90 06 143,05 689,45 1244,87 175,40 07 417,96 467,28 1698,90 228,63 08 165,06 332,33 808,56 176,06 Média 613,03 914,54 3101, 15 627,81 Experimento 1: Células da granulosa; Experimento 2: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10� ; Experimento 3: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10º5M; Experimento 4: Células da granulosa+ FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); Exp5 Exp6 710,00 6826,57 1752, 1 7327,20 1138,5 2188,53 1397,44 1561,30 349,50 1490,20 314,93 1242,03 278,53 1576,97 306,33 1607,90 780,91 2977,58 Experimento 5: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10"6M + FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); Experimento 6: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10"5M + FSH (50 ng/ml) + IGF•l (50 ng/ml). 58 Tabela 7 - Valores em média das dosagens de estradiol em pg/ml de fluidos de cultivos de células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas à reprodução assistida. Pacientes Nº Exp 1 Exp2 Exp3 Exp4 01 111,20 120,66 141,66 160,00 02 7,43 7, 11 7,79 7,69 03 436,66 383,00 273,00 402,00 04 311,66 262,66 230,00 469,33 05 214,50 161,66 165,83 152,00 06 1 70, 16 189,26 110,93 213,33 07 301,33 192,66 247,00 270,66 08 717,25 562, 16 253,50 643,33 Média 283,77 234,90 178,71 289,79 Experimento 1: Células da granulosa; Experimento 2: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10·6M ; Experimento 3: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10"5M; Experimento 4: Células da granulosa+ FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); ExpS Exp6 120,33 144,53 7,30 9,70 541,00 505,33 300,66 223,50 352,50 646,00 226,50 143,50 330,33 408,33 448,50 382,00 290,89 307,86 Experimento 5: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10� + FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); Experimento 6: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10"5M + FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml). 59 3000 E 2000 * W 1000 $ 0----------------- C-- endometriose ___:::controle Gráfico 1 - Níveis de E2 (pg/ml) em fluido de cultivo de células da granulosa do grupo de mulheres com endometriose e controle, em condições basais. * p<0,05 60 2500 2000 cii 1500 1000 w 500 o * $ 1 endometriose c::::::::J controle Gráfico 2 - Atividade da aromatase expressa em níveis de E2 em pg/ml produzidos em resposta à adição de testosterona na concentração final de 2 x 10- 6 M em cultivo de células da granulosa do grupo de mulheres com endometriose e controle. * p<0,05 61 12000 controle endometriose -E 8000 4000 Gráfico 3 - Atividade da aromatase expressa em níveis de E2 (estradiol) em pg/ml produzidos em resposta à adição de testosterona na concentração final de 2 x 10-5M em cultivo de células da granulosa do grupo de mulheres com endometriose e controle. 62 4.2.3. Progesterona Os valores das dosagens de progesterona nos fluidos de cultives celulares da granulosa de mulheres com endometriose e controle, submetidas à FIV ou ICSI, encontram-se descritas no apêndice 02 (triplicata). Os valores expressos em média estão contidos nas tabelas 8 e 9. Não foi observada nenhuma diferença na produção de progesterona pelas células da granulosa de mulheres com endometriose e pacientes do grupo controle em condições .. basais, ou seja, sem adição de nenhum reagente ao meio de cultivo (p = 0,8830); ou com adição de testosterona a 2x1 o-6M (p = 0,6933) ou a 2 x 1 o-5M (p = O, 1603) (Figura 6). Ainda, também não houve diferença nos níveis de progesterona quando foi adicionado IGF-1 ou FSH ao meio de cultivo sozinho (p = O, 1306) ou associados à testosterona (p = 0,6795 quando à 2x 1 o-s M e p = 0,5790 com a concentração de 2x10-5 M). 63 Tabela 8- Valores em média das dosagens de progesterona em ng/ml de fluidos de cultivos de células da granulosa de mulheres sem endometriose (grupo controle) submetidas à reprodução assistida. Pacientes Nº Exp 1 Exp2 Exp3 Exp4 01 182,66 178,33 93,53 145,53 02 349,33 256,50 312, 16 247,00 03 198,33 170,00 236,33 341,00 04 391,00 463,33 417,66 489,00 05 213,33 235,33 195,33 289,33 06 38,47 70,60 42,26 41,3 07 210,00 153,50 176,00 141,86 08 414,33 406,00 323,00 331,00 Média 249,68 241,70 224,53 253,25 Experimento 1: Células da granulosa; Experimento 2: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10� ; Experimento 3: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10"5M; Experimento 4: Células da granulosa+ FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); Exp5 Exp6 122, 10 135,56 303,33 365,33 336,66 338,00 500,00 588,66 272,66 234,66 41,96 28,70 80,26 138,00 355,66 378,66 251,58 275,95 Experimento 5: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10� + FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); Experimento 6: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10º5M + FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml). 64 Tabela 9 - Valores em média das dosagens de progesterona em ng/ml de fluidos de cultivos de células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas à reprodução assistida. Pacientes Nº Exp 1 Exp2 Exp3 Exp4 01 111,20 120,66 141,66 160,00 02 7,43 7, 11 7,79 7,69 03 436,66 383,00 273,00 402,00 04 311,66 262,66 230,00 469,33 05 214,50 161,66 165,83 152,00 06 170, 16 189,26 110,93 213,33 07 301,33 192,66 247,00 270,66 08 717,25 562,16 253,50 643,33 Média 283,77 234,90 178,71 289,79 Experimento 1: Células da granulosa; Experimento 2: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10� ; Experimento 3: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10·5M; Experimento 4: Células da granulosa+ FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); ExpS Exp6 120,33 144,53 7,30 9,70 541,00 505,33 300,66 223,50 352,50 646,00 226,50 143,50 330,33 408,33 448,50 382,00 290,89 307,86 Experimento S: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10� + FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml); Experimento 6: Células da granulosa+ Testosterona a 2 x 10-5M + FSH (50 ng/ml) + IGF-1 (50 ng/ml). 65 750 - E 500 ã; 0. 250 :::-500 E ã; C.. 250 1000- _ 750- E ã; ,S 500- 11::1' 0. 250- o--- ---- ---------- (A) controle endometriose (B) (C) Figura 6 - Níveis de P4 (ng/ml) produzidos em condições basais (gráfico A); em resposta à adição de testosterona na concentração final de 2 x 10-6M (gráfico B) e 2 x 10·5M (gráfico C) em cultivo de células da granulosa do grupo de mulheres com endometriose e controle. 66 Discussão Aromatase é uma enzima que se tornou alvo de crescente interesse em reprodução humana. Primeiramente porque representa uma enzima "chave" no processo de foliculogênese com envolvimento direto com a qualidade oocitária (Guet et ai., 1999); em segundo lugar, seu envolvimento na etiopatogenia da endometriose vem sendo extensivamente estudado com evidências importantes de alterações em sua expressão nos tecidos endometrióticos, bem como no endométrio tópico de mulheres com endometriose (Bulun et ai., 2002), além de possível defeito genético envolvendo polimorfismos do seu gene associados com a endometriose (Arvanitis et ai., 2003). E, em terceiro lugar, o impacto que representa esta enzima sobre o tratamento da infertilidade e endometriose com o advento de drogas denominadas inibidoras da aromatase (Neme et ai., 2001; Karaer et ai., 2004). Estas drogas inibidoras da enzima aromatase têm apresentado resultados favoráveis como indutores de ovulação. O mecanismo de ação se baseia no fato de que esta droga levaria ao bloqueio do estradiol no início do ciclo menstrual, reduzindo o "feedback" central, com elevação dos níveis de gonadotrofinas (Mitwally & Casper; 2002). Ainda, com o bloqueio da conversão de andrógenos a estrógenos no ovário, os andrógenos acumulados na fase inicial de desenvolvimento folicular parecem ter um efeito estimulatório sobre a ação do FSH, aumentando a expressão de seus receptores (Mitwally & Casper, 2002; 2004). Neste sentido, os inibidores da aromatase podem substituir o uso do clomifeno no futuro, com as vantagens de não apresentar os efeitos anti­ estrogênicos deste. Contudo, os estudos ainda apresentam casuísticas 67 limitadas, com estudos não randomizados nem placebo-controlados (Mitwally & Casper, 2002). Em adição, o acúmulo de andrógenos no folículo na fase inicial do ciclo mesntrual também pode estimular o IGF-1, agindo em sinergismo com o FSH no processo de foliculogênese (Mitwally & Casper, 2002; 2004). Com isso, encontra-se uma possível associação entre aromatase, sistema IGF-1 e FSH; todos agindo de maneira parácrina no folículo. A alteração deste sinergismo com a expressão aberrante da aromatase como provavelmente acontece na endometriose, pode comprometer a foliculogênese e produzir oócitos de má qualidade (Harlow et ai., 1996). De fato, neste estudo observou-se a produção basal de estradiol reduzida na endometriose em relação ao controle, na progesterona, entretanto, não houve diferença. No presente estudo, encontrou-se redução da atividade da aromatase nas mulheres com endometriose em comparação àquelas do grupo controle. Porém, esta diferença foi encontrada somente quando a concentração de testosterona adicionada ao meio de cultivo foi de 2 x 10-6M, achado concordante com o estudo de Harlow et ai. (1996). Na maior concentração utilizada neste estudo, de 2x10-5M, não foi encontrada diferença entre os dois grupos, apesar de os valores de produção de estradiol (pg/ml) em média apresentarem-se superiores no grupo controle em relação ao grupo com endometriose. Poderá existir algum mecanismo intrínseco enzimático de regulação da atividade da enzima, como a própria saturação de seus receptores, que impeça que mesmo adições crescentes de substrato, neste caso a testosterona, não acarrete aumento da atividade da aromatase como esperado. 68 Quanto à suplementação de FSH e IGF-1 ao meio de cultivo, há a descrição de seus efeitos estimulatórios sobre a aromatase (Erickson et ai., 1989; Fernandes, 2004). No presente estudo não encontramos qualquer diferença quanto à atividade da aromatase quando foram adicionados os reagentes FSH e IGF-1 ao meio de cultivo. Uma das hipóteses desse achado no grupo com endometriose seria o comprometimento, nesta doença, da responsividade das células da granulosa a agentes estimulatórios como o FSH e IGF-1 (Cahill et ai., 2003). Outra hipótese seria a baixa densidade celular no meio de cultivo. Em nosso estudo utilizamos placas de 35 x 1 O mm, com um volume total de 1 mi. DeMoura et ai. (1997) relataram que a menor densidade celular pode afetar estímulos autócrinos ou parácrinos devido ao menor contato entre as células no cultivo na placa. Ainda, outro fator envolvido poderia ser o tempo de cultivo. DeMoura et ai. (1997) encontraram uma correlação positiva do IGF-I (50ng/ml) e do FSH (20 ng/ml) em placas de cultivo contendo 2 x 106 células viáveis/placa num período de 72 h; no presente estudo utilizamos 50.000 células viáveis/placa e um tempo de cultivo de 24 horas. Esta redução no número de células/placa bem como no tempo de cultivo podem ter ocasionado interferência nos resultados encontrados, com discordância quanto aos dados da literatura sobre o papel sinérgico do IGF-I e FSH sobre a esteroidogênese ovariana. Fernandes (2004) também não encontrou qualquer efeito estimulatório do IGF-1 e FSH sobre a produção de estradiol e progesterona ovarianos in vitro através de cultivo celular da granulosa usando a mesma densidade de células do presente estudo (50.000 células viáveis/placa), com um tempo de cultivo de 48 horas. 69 Ainda em relação à aromatase e endometriose, essa enzima apresenta importância indiscutível na etiopatogenia da endometriose. E nesta doença, caracterizada por diversas interações moleculares em seu processo fisiopatológico, o tratamento clínico hormonal ainda não se apresenta satisfatório (Neme et ai., 2001). Os inibidores de aromatase representam uma emergente modalidade terapêutica na endometriose, pois atuam diminuindo os níveis séricos de estrógenos com inibição do crescimento do tecido endometriótico e também atuam reduzindo a expressão do gene da aromatase (Neme et ai., 2001) Diante deste intenso envolvimento fisiopatológico entre aromatase e endometriose, espera-se que a expressão desta enzima possa ser implementada no processo de diagnóstico da endometriose, com o advento de técnicas sensíveis e específicas que possam identificar até mesmo estágios iniciais desta doença. 70 6. Conclusão Observou-se no presente estudo a redução da atividade da aromatase nas células da granulosa in vitro em mulheres com endometriose comparadas às pacientes do grupo controle, submetidas à reprodução assistida (FIV e ICSI) quando houve adição de testosterona a 2 x 10-6M. A produção basal de estradiol também foi menor no grupo com endometriose. A suplementação de FSH e IGF-1, entretanto, não mostrou quaisquer diferenças entre os grupos controle e endometriose. 71 7. Referências Bibliográficas Arvanitis DA, Koumantakis GE, Goumenou AG, Matalliotakis IM, Koumantakis, EE, Spandidos DA. CYP1A1, CYP19, and GSTM1polymorphisms increase the risk of endometriosis. Fertil Steril 2003; 79: 702-09. Attia GR, Zeitoun K, Edwards D, Johns A, Carr BR, Bulun SE. Progesterone Receptor lsoform A but not B is Expressed in Endometriosis. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85:2897-902. Barnhart K, Dunsmoor SU, Coutifaris C. Effect of Endometriosis on ln Vitro Fertilization. Fertil Steril 2002; 77:1148-55. 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C,0M u, .... C,0M �z � -E-- M - E--M e,� �- � z E-< c,�-��Z E--< < e, o e, � 00 < �oo< ���� ���< e,�:< u s�z � - -�z � E-- -- - - E-z -- - E--z 116 113 139 203 127 149 01 131 111 143 120 100 97,6 86,6 138 143 157 134 187 8,48 9,05 6,69 6,97 8,35 6,29 02 9,24 5,84 8,92 8,39 5,04 12 4,56 6,44 7,76 7,71 8,52 10 8 489 408 348 548 468 773 03 442 311 209 167 X 381 379 430 262 491 614 362 301 271 278 465 283 231 04 271 229 197 356 256 216 363 288 215 587 363 X 318 177 272 138 390 520 05 189,5 142,5 115 173 478 653 136 165,5 110,5 145 189,5 765 136 314 108,5 253 149,5 118,5 06 253 106,8 125,5 254 281 154 121,5 147 98,8 133 249 158 444 192 303 317 512 224 07 222 171 206 281 266 684 238 215 232 214 213 317 919,5 487 240 962 421 513 08 X 707,5 X 265 X 318 515 492 267 703 476 315 Apêndice 02 - Níveis de progesterona em ng/ml de fluidos de cultivo celular de células da granulosa de mulheres inférteis com endometriose submetidas à reprodução assistida {FIV ou ICSI). x = valores desconsiderados. 00 .i:,. 00 - r;;r;lº i r;;r;lo �� i� �����, r.;i r;;r;l M� � !"')��i � � ...::1 OO�b ºº �.,, Zo ºº � b oor-. =- oor-....::i�� �� ll-1< 00 � �•< 00 � Q..1< r;;r;l c::5 Q..1<r;;r;l�oo � r.;i z ;u- OM ; u-� z ;;:i�u,�Ç,!)OM � �z ��º � u e��< e � � < "��� C�,...�Z�< < co e��< u � - -�Z -�z .._,,... _.... [,.. z 304,00 1053,30 6497,90 230,17 594,80 01 259,75 1141,00 4986,70 295,16 732,40 245,76 X 6276,70 246,43 802,80 2514,00 X 10904,00 1206,80 1696,60 02 2020,80 2573,40 9206,40 1700,80 X X 2580,70 11990,75 X 1807,60 724,40 552,30 1956,50 X 1096,50 03 852,15 846,60 1671,90 1572,00 1148,60 838,74 736,70 1931, 10 1188,90 1170,40 634,24 1247,04 1207,6 1401,24 1230,00 04 X 960,08 1170,1 1142,57 1420,85 668,34 1006,12 1534,6 915,28 1541,46 193,9 379,0 1220, 1 210,7 372,3 05 185,1 374,8 1114,7 189,9 332,9 174,7 356,7 1501,6 193,1 343,3 X X 1220, 1 181,3 322,9 06 125,4 1023,5 1242,9 191,8 341,6 160,7 355,4 1271,6 153,1 280,3 394,9 X 1992,0 259,6 190,0 07 436,6 457,3 1341,6 237,5 263,6 422,4 477,26 1763,1 188,8 382,0 174,7 295,2 812,2 175,6 328,4 08 168,2 434,0 848,7 179,1 294,8 152,3 267,79 764,8 173,5 295,8 Apêndice 01 - Níveis de estradiol em pg/ml de fluidos de cultivo celular de células da granulosa de mulheres inférteis sem endomet riose (grupo controle) submetidas à reprodução assistida (FIV ou ICSI). x = valores desconsiderados. \C�ir;;r;l�foor-....::i�� Q..1< í;;r;l �00 � �� u- � COM C�,...�Z�<e��<_ .... �z 6907,00 7904,20 5668,50 7828,50 X 6825,90 2231,00 2337,00 1997,60 1435,3 1656, 1 1592,5 X 1480,7 1499,7 1165, 1 1119,0 1442,0 1676,0 1561,6 1493,3 1739,9 1761,6 1322,2 00 V'I 00 - � � �� i� lfl ��Íilil � i � .... � N�� trl � � � oo�<i oo�<i ºº���< Zo 00 ºº � ::l � � �•< O Z'i' � •< � � 'b �•< � c:s �•E--0= u e� .... oo� � � .... �zoo� � < Ç,!)�� N Ç,!)�� N "'��� C�c,�� N u � - - - ,,_,..,. _ .... 175,58 560,20 6379,00 X 542,30 01 99,86 488,00 6601,20 157,82 537,90 119,28 674,26 5904,20 156,12 539,30 52,20 59,10 191,50 52,93 117,30 02 64,89 50,90 331,60 82,46 96,80 30,15 76,80 276,80 80,93 89,30 987,20 838,78 914,8 884,85 1449,9 03 X 852,70 1070,9 907,0 1503,0 708,20 X 1006,7 865,89 1530,32 460,07 652,60 2633,5 541,61 681,15 04 404,98 778,75 2115,2 470,19 658,03 556,17 703,39 2283,8 713,87 767,84 305,2 619,24 1692,5 250,31 512,13 05 347,76 513, 18 1818,8 292,88 X 252,39 577,62 1794, 1 259,34 642,62 358,7 X 834,2 X 351,9 06 478,7 496,3 943,8 349,7 388,6 370,9 302,8 1149,0 300,85 411,8 386,0 384,4 752,9 X 568,2 07 403,0 373,5 745,9 358,7 443,9 336,1 363,2 634,9 340,5 388,6 350,2 424,1 556,4 436,1 339,4 08 648,7 X 919,7 311,7 X 273,8 X 578,1 334,9 775,5 Apêndice 01 - Níveis de estradiol em pg/ml de fluidos de cultivo celular de células da granulosa de mulheres inférteis com endometriose submetidas à reprodução assistida (FIV ou ICSI). x = valores desconsiderados. �= o \C�rl.)��ioor..�E-<'b �•< � �00 .... ªu-... co� "'� -- ���< e lfl � z _.... E-o 4857,20 4487,40 5801,90 414,10 389,80 302,15 1597,9 1139, 1 938,80 2484,6 2045,6 1874,7 2520,6 3040,0 3244,0 1123,9 1255,3 1260,2 613,1 903,0 812,9 746,6 731,8 519,5 ANEXOS 86 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Eu, - --------------------- --- - abaixo assinado, tendo sido devidamente esclarecida sobre todas as condições do documento "ESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA" (anexo 2), de que se trata o Projeto de Pesquisa intitulado "ATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE PACIENTES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS À TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA", que tem como pesquisadora responsável a mestranda Lauriane Giselle de Abreu, sob orientação do Prof. Dr. Marcos Dias de Moura, especialmente no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos a que serei submetida, aos riscos e benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como a forma de indenização por danos decorrentes da pesquisa, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram asseguradas, a seguir relacionadas: 1. A garantia de obter resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações relacionadas com a pesquisa e o tratamento a que serei submetida; 2. A liberdade de retirar o meu consentimento e deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isso traga prejuízo à continuidade do meu tratamento; 87 3. A segurança de que não serei identificada e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada à minha privacidade; 4. O compromisso de que será prestada informação atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar a minha vontade de continuar dele participando; 5. O compromisso de que serei devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de minha participação no projeto, bem como de que será garantida a continuidade do meu tratamento após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que foram apresentadas e que, livremente, manifesto a vontade de participar do referido projeto. Ribeirão Preto, __ de _______ de __ _ Assinatura da paciente 88 ESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA 1. TITULO DA PESQUISA: "ATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE PACIENTES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA" 2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: LAURIANE GISELLE DE ABREU, CRM/SP Nº 111.248 (ALUNA de MESTRADO NA LISP/RIBEIRÃO PRETO) 3. ORIENTADOR: PROFESSOR DOUTOR MARCOS DIAS DE MOURA, CRM Nº 49.816/SP 4. PROMOTORA DA PESQUISA: FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. Vimos, por meio desta, solicitar sua participação neste estudo. Ele tem como objetivo testar a hipótese de que a aromatase (uma enzima, ou seja, uma substância que o organismo produz normalmente que se relaciona com o funcionamento do oócito, ou óvulo), e que estaria alterada nas células da granulosa (células componentes do oócito), presentes no fluido folicular (líquido que fica junto ao oócito). Isto será verificado em pacientes 89 normais (sem endometriose) e naquelas que possuem endometriose (doença na qual as células do endométrio, que correspondem à camada interna do útero, se implantam em outros locais fora do útero). Estamos propondo este estudo pois pesquisas similares apontam para esta alteração nestas pacientes com endometriose e isto poderia ser um fator correlacionado à infertilidade e resultados insatisfatórios apresentados por estas pacientes nas Técnicas de Reprodução Assistida (FIV - Fertilização in Vitro e ICSI - Injeção lntracitoplasmática de Espermatozóide, ou seja, técnica em que se injeta o espermatozóide dentro do óvulo). Desta maneira, estamos propondo este estudo que constará de 2 grupos: (1) grupo de pacientes sem endometriose e (2) grupo de pacientes com endometriose, todas submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV ou ICSI). No final do estudo, realizaremos a comparação entre estes dois grupos e checaremos se há diferença na atividade da aromatase nas células da granulosa destas pacientes e também se há diferenças nos resultados da FIV ou da ICSI. Participando deste projeto, você receberá o tratamento da mesma forma que as pacientes que não participam, com todos o exames e recursos disponíveis para melhor atendê-la. Durante a coleta de oócitos para a FIV ou ICSI, é aspirado o fluido folicular que contém o oócito que será utilizado. Este fluido, normalmente, depois é desprezado. Neste projeto pretendemos, com o seu consentimento, usar este fluido contendo as células da granulosa para pesquisar a atividade da enzima aromatase, como já foi exposto previamente. Não será necessário 90 submeter-se a nenhum procedimento adicional, além do que já ocorre normalmente no processo da FIV ou da ICSI. Informamos que seu nome e seus dados pessoais não aparecerão no trabalho ou em outro meio de informação, ou seja, o sigilo será mantido. Além disso, a qualquer momento você poderá solicitar sua saída do trabalho, se assim desejar, sem nenhum prejuízo à continuação de seu tratamento neste serviço. Ficamos à disposição para esclarecer todas as dúvidas que surgirem, inclusive sobre o andamento da pesquisa e seus resultados. Os pesquisadores. 91 Protocolo de Pesquisa Grupo Procedimento Nome RG Diagnóstico Antecedentes Pessoais Cirurgias Prévias ( ) Caso ) FIV Paridade G ...... P ...... c ........ A ..... . Endometriose ( )mínima ( )leve ( ) fator masculino - ( ) oligo ( ) fator tubáreo ( ) ESCA ( ) outros -......... .. ( ) Controle ( ) ICSI Idade Filhos Vivos )moderada ( ) terato Antecedente Familiar ( )endometriose Grau de Parentesco ..... . Tempo de Infertilidade ....... anos ....... anos . .............. ) grave ( ) asteno Tratamentos de ( ) sim - ( ) Clomifeno ( ) IUI ......... ( )FIV.......... ( ) ICSI .............. . infertilidade anteriores ( ) não Laparoscopia Data -... / ... ./,,,,, (descrição) Anátomo patológico Histeroscopia Histerossalpingografia Espermograma ( ) não ( ) sim .......................... . Data -.... / .... / .... ............................... . Data -... / .... / .... ................................ . .......... mi Nº ........ Milhões/mi Vitalidade ....... % A ....... % B ........ % C ....... % Nº spz móveis no recuperadoNº ...... D ....... % Morfologia ....... % (Kruger) Milhões/mi FSH Protocolo de indução Medicamento Análogo GnRH Folículos puncionados Data ... / .... /..... nível. ............. ng/dl Nº dias ........... .. ( ) FSHr -dose................................. ( ) outros - nome - ( ) HMG -dose................................. - dose ( )agonista - nome......................... ( )antagonista - nome .................... . Nº de oócitos captados Nº dias ........... . ........... % 92 Nº de embriões formados .......... transferidos .......... Endométrio no dia da Transferência ....................... mm Passagem do catéter ( ) fácil Complementação lútea ( ) duphaston 30 mg/dia Cultivo N No de células Data da incubação ....... /....... ,....... Dosagem estradiol 1.1 2.1 3.1 4.1 5.1 6.1 PHCG ( )pos Gravidez clínica ( )s im Nº sacos ( ) 1 ( gestacionais + lntercorrências Grupos: 1. Célula + meio cultivo ng/ml ( ) neg ( ) não ) 2 ( ) 3 ou 1.2 2.2 3.2 4.2 5.2 6.2 Aborto Qualidade: ( ) difícil - ( ) crinone gel 8% Data da retirada 1.3 Média 2.3 3.3 4.3 5.3 6.3 ( ) não ( )sim 2. Célula + 20 1,.11 solução mãe Testosterona + meio de cultivo 3. Célula + 200 1,.11 solução mãe Testosterona + meio de cultivo 4. Célula+ 10 1,.11 FSH + 10 1,.1I IGF-1 + meio de cultivo 1 2 3 4 especificar: ( ) outro ....... /........ /....... Mediana 5. Célula +20 1,.11 de solução mãe Testosterona+ 10 1,.11 FSH + 10 µI IGF-1 + meio de cultivo 6. Célula+ 200µ1 de solução mãe Testosterona+ 10 1,.11 FSH + 10 µI IGF-1 + meio de cultivo 93 HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO CEP. 14048-900 RIBEIRÃO PRETO· S.P. BRASIL CAMPUS UNIVERSITÀRIO • MONTE ALEGRE FONE: 602-1000 • FAX (016) 633-1144 Ribeirão Preto, O 1 de setembro de 2004 Oficio nº 2501/2004 CEP/SPC PROCESSO HCRP nº 5694/2004 Senhor Professor: O Comitê de Ética em Pesquisa, em sua 187ª Reunião Ordinária realizada em 30/08/2004, tomou conhecimento e aprovou a recomendação solicitada pela CONEP, em Parecer nº 1492/2004, referente ao Projeto de Pesquisa intitulado: "ATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE PACIENTES COM ENDOMETPJOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA". Aproveito a oportunidade· para renovar a Vossa Senhoria protestos de estima e consider�ção. _____ ..,. Ilustríssimo Senhor PROF. DR. MARCOS DIAS DE MOURA LAURlANE GISELLE D� ABREU (Aluna) Depto. de Ginecologia e Obstetrícia Em mãos 94 FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO-USP DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar. Ribeirão Preto-SP • CEP 14049- 900 Fone (016) 633-0216 - Fax (016) 633-0946 S11tor de Reprodução Humana 1 REPRODUÇAO ASSISTIDA TERMO DE CONSENTIMENTO Eu .......... ....... ....... .. ..................... .. ...... .. .......... .. .... ............ .... .. .. ........... ........................ ............ ... .......... ..... ..... ........ ...... ........... . e aneu m;;irido ........ ...... .. .. .. .... ......... . .. ... . ... ....... ...... . . .. ..... ... ... . .. . ... . .. ....... ... ...... .. ..... ..... ........... ...... ... ... .. ..... .. . .... ..... ......... ... ........... . nos �ub111e1emos livrt:menh:: 11 p11rticip11r tlc proct.-<linu.·mmc que vhmm li uhhmi;ilu de umn gi:slm;tlo d.:vido li infürtiliúmlt:: cun jugnl. Fomo11 infonnndos dos diversos ospectos m.:úico.o;, éticos e jurfdicos 4ue envolvem os dili:rente:. trn111111ento:1. assim como dos rcsultlldos já obtidos nessa uniwidc de 1.rnt11mento. Como participantes do Prognuna de Fertiliznçllo Assislitla do HCRP-USP <lama.� livre e voluntariamente nosso consentimento e autorimçilo ao Setor de Reprodução Humana do HCRP dn Faculdade de Medicina de Ribcirtlo Preto da Unh·crsiuade de Sllo Pnulo. seus diretores. métlicos e ussistcnlcs n rcnliznrem os scguinlcs procet.iimenlu.1 as:."inalooos: lNSEMI.N § AÇ: � INTRA-ÚTERO NÃO NÃO SE APLICA Para a r=liznção de inscmiuação intra-ütero (IU[) autorizamos a indução da ovulação e o preparo do sêmen do meu marido (cnpocitaçllo ) pnm postarior inscmúui çllo iutm-útcro. Pnm a reolizoçilo de3sc procedimento entendo que di:vcrci utilizar drosos que podem ter efeitos colalet11is, os quais me foram devidamente esc:larccidos. sendo os pri nci pa is II Sindrome de Hipereslimulação Ovariana e a Multiparidadc: (gravidez múltipla). Isentamos a equipe de qualquer responsabilidade sohre as complicações ou efeitos col11tcrais que venham a ocorrer. Em nlgun111s situações pod e oçorrcr c:<cessiva re,postn aos mcdicruncntos utiliz:idos e nesse cnsos o trntamcnto pode ser interrompiuo ou ser mudauo para oulro procedimento como a fertilização i11 \litro (FIV). Seremos informados dessa situação e po<lc:remos reali7.ar a opçã o de continuarmos o tratamento com a FIV ou intcrTomp,:r a inseminai;ão intra-útero :k::m p rejuízo para futuru insemino,;i1cs. FERTILIZA ÇÃO IN nTRO (FIV) E MJCR § O�� .IPULAÇÃO DE GAMETAS (ICSI) NÃO NÃO SE APLICA Fomos infonnados de que pura a remimçilo de F[V e/ou [CS( s.to necessárias diversas ctnpas. a saber: 1. indução da o,'Ulnçllo que: ,isn a obtenção de wn grnndc número de 6yulos a pnrtir da utilização de medicações (gonadotrotinas); 2. monitoriznçilo da ovulação feita por ullra-sonogratia • tnlllSvnsin al �ada � 3. cap tação de óvulos que se i:onslitui do aspiração dos folfculos feita através da punção transvaginal guiada pe lo ultra-som sob anestesia gemi endovenosa; 4. in seminação e cultivo dos óvulos capl4dos po r meio de FTV ou ICSl, ícita no lahorat6rio; S. t.ran,fcrência de at� 4 embriões ao útero, de ocnrdo com meu c:on�e11tiina11tn no dia da trn11:1ícrêncio; 6. rase lilleo que se constitui da utili7.açllo de mecfü:uçi1es pm-11 suplc:mcuuir a prudm;,io Jc honnünios dos ovárin.'i. Autoriz amos n reuli2açdo de: Iodas =itas etnpas ocima llc:icrilas e nos re:,-ponsabilizamos pelo oueqUllWl utilização tias mcúicaçõcs p rescritas. Fomos oriC11todos de que podem ocorrer tilllllls cm diversos pontos do processo para rcaiizaç do de F[V e/ou [CS[: fülha ele: resposta â induçllo da ovulaç ão, aus!ncia ou rcduziuo número de 6vul011 captados e falha ou baixa l.ixa de fcrtiliznçllo dos óv\llos inseminados, o que pode resultar em po ucos ou nenhum embrillo a St:l(em) transfcrido(s). Aus.:nlmnos a equi pe de prolissionnis responsáveis pe lo nos.'10 tratomcnto de quaisquer dcstos intercotrêncins que: po.'1$1U1l vir a ocorrer llurnnte o nos,"IO trotamento. Fomos também esclarecidos das ta.us de gcslac;lo deste serviço. Fomos infonnados de que podem ocorrer eleitos colaterais e/ou complicações decorrentes do uso das medicações indutoras da ovulaçllo (Slndrome de Hiperestimulaçllo Ovariana). da captação oocitária (sangramento no locai da pw \Çlo e risco anestésico) e dos riscos de gestações 111últip lns. [sentamos a equi po: de tod4 e qualquer responsabilidade sobre as comp lica ções ou eleitos colatcmis que venham a ocorrer. A micromanipulaç ão (ICSI) é uma técnica onde é realizada a i njeção de wn ünico espc:rmaw1.óidc no interior de um óvulo. Concortlamn., que II indicaçllo de FTV ou TCSI sem de n:sponsnhilidadc Jn cqui p: mc!tfü:11 e de cmhri11l11j1i:lla:1 n:spo1\-a\vci:1 pel o no.w1 lrnl1111K.'tllo. F111111�'1 i111i>mu1tl11,'I ili: 1111c: 11 ICSI é lcs:nii:11 i11lm1hr,.i1l11 ,1,:-ul,! 11)1111'. nh� 1111111t1w11l1111111L11l1�, �,J111111111111111111!1111 1ili1H'i rlt• 11111ltiirnu1ç1� li.-t11i:c 1111:1 '-'fin11c;11:1 1v1:u:id11s llfKl!I c:tln lcs:nicn nllu silo c1>111:hL'IÍv11�. IIUL'I nllo �ll!.(Clcm lu1vc1 c:tlc 11111111:ntu c111 1 dm;Jlu 1111 esperado cm gestações csponlãncas. Isentamos a equi pe de profissionais responsáveis pelo nosso tratamento de qua lquer distürbio gcstacional e: anomalia c:ongênilll ou 1naltormaçilo fütal que por vcntum venham 11 ocorrer, Imito dn rcnlizu çilo de FIV como de ICSI. 96 CONGELAMENTO DE EMBRIÕES § SIM . N à O NÃO SE APLICA . No decorrer �e um ciclo de _fertilização in vi lro (FIV) ou de núcromauipuloção de gamelas (iCSI) pode ser produzido umnumero mmor de cmhnõcs do que o numero que pode ser trnnslcriúo no mesmo ciclo. Caso existmn cmhrifü:s excedentes, os mesmospoderão ser cong elados. Concordamos co1� o congelamento 110 dia a ser determinado pcln ,:qtúpc mcúic;i. Estamo:. cientes que apósdc:scongclamc:nlo. algmlS ou lodos os cmbnõ.:s podem não sobreviver ao proccs.<;tl de congclamculo. Concordamos com 11 estOC11gem dos embriões congclodo!I por um pcrtodo máximo de 3 imos. /\pós 3 anos de cstoc:ngcm dost.inbriões con gelatlos, cnS<> niio desejemos a trnn.�fercnci11 cios c:mbriiies dt."SCongelodos e \'Ínvcis, cunconlmnos com a Joaçüo :111õ11imndos embriões pnrn outro(�) cnsnl(is) que dcseje(m) gravidez. . Cn .so ucorrn 1> liilccima,10 de llOl dos cônjuge., ou de n mbos, divórcio ou doença.,; graves em 1un ou .:111 ambos <>S ciinjugcs,que mcnpocucm o(s) m.:.o;mo(s) a tomor(em) <.lc:cisõc.'I. autori1.nmos 11 <lonçRn n11611ima de lurcscrvndos porauutro(s) ca:;o�is) que dcscje(m) gravidez. No uio <ln n:rui1i1çiio do congelaint.•11lo Jus emhriiic:s 110:1 scrj íomo:ciJo um 11uvu lo:n11u ok o.:011s,:11li111t.,1lo inlunnudo, undc: constará o número lolnl de embriões que foram efcliv1unentc congclodos, onde <lnn.'lllos ciência.. Fomos infonm1dos de que, caso niio concordemos com a realização tle o.:ongelamcnlo tle pos.'<ivo:is cinhriõe.• remanesco:nlc:s. opiamos pela inseminnçlio de um níuncro máximo de S óvulos (se lbr produzido um niunero maior. ns 6'-ulos devcriln ser descnrUldos ou doados, confonne consentimento especifico sobre donçffo de óvulos). DOR Ã�f; ÓVULOS D NÃ.O Sl!. A.l'L\CA.. Concorúo.n,os com a doaçãu anâ1úmo uc óvu\os, que sem fcil11 openns qu1111üo o llllllld'0 de 1)\'lllos obtidos lor superior li �. OU superior li S se tlecitlimos 11.'10 congelnr embriões. Estamos cientes t1e quo: as crinm;us 1111SCid.lll u pm1ir c.1.a uU111;00 tl.: óvulos s.1o moral e legalmente Je lit.'US pais que n geraram. nio .havendo de nossa parte ncnhwn interesse c:111 conh1.-ccr n sua evolução nem de pedir Jireitos legais sobre estas crianças. Fomos iníonnados de que a autorização para doannos ou mio óniloli em nada inílucnciarã a conduto <ln equipe de profissionais deste Serviço pcnll\te o \\osso tmtamenlo dc infcrtilidlldc. A doação não lerá caráter lucrativo ou comercial e os doadores não devem c:onhecer a idenlid11c.lc Jos recc:plores e vice-versa. Em situações especiais. as informações sobre os doadores, por motivo médico, podem ser fornecidas e.'\clusivamente para médicos. resguardando-se a identidade civil do doador. O Serviço de Reprodução Humnna monlém um registro de dados clínicos de cmúler gemi, a fim de evitar que Wll doador tenha produzido nuus do que duas gcstoçõcs, de sc.xos diferentes, numa nrca de wu ntilhlio de habitantes. A escolha de doadores é de responsabilidade da wúdade e, dentro do passivei deverá garantir que o doador tenha a maior semelhança cum a n:ceplora. DOAÇÃO DE EMBRIÕES § SIM NÃO NÃO SE APLICA Concor<lnmos com a doação de embriões que .11ão ser.lo utilizados por nós. Estamos cientes d.: que as crianças 1111.,;ci<lns a partir de embriões dondos stlo moral e leg11lma1tc dos pois que vllo gerar o(s) lilho(s), 1lllo havendo de nosso p111te ne11lnun interesse cm conhecer a sua evolução nem de pedir direitos legais sobre estas crianças. A autorização pam doam1os ou não embriões em nada intluenciarà a postura da equipe de profissionais dcsle Serviço perante o nosso tratamento de infcrtilidauc. A doação não terá Cllrátcr lucmlivo ou comercial e os doadores n4o devem conhecer a identidade dos rcc:cptores e vice-verso. Em situações especiais, ns infom1ações sobre os doodorcs. por motivo mt!dico, podem ser fornecidas exclusivamente pará médicas, resguardando-se a identidade civil do doador. O Serviço de Reprodução Humwia mantém wn registro de dlldos cllnicos de caráter geral, a fim de evitar que um doador lenha produzido mais dó que duns gestações, de se.xos diferentes, nw,111 arca de 1111\ milhão de habitontes. A escolha de doadores é de responsabilidade da wudade e, dentro do pos:nvcl deverá gnmntir que o dondor tenha 11 mllior sc:mc:Jhanç:a com a receptora. Tendo lido com atenção e compreendido todas·as in íonnações contidas nas duas págin8ll deste doc1u11ento, recc=bido infom1nçõ es adicionais e esclarecimt.'lltos. concordamos espontanerunente em participar do Programa de Ft:rtilizaç.'kl Assistida do HCRP. Nós entcni.lemos que em todo tmtnma\to médico, bem como t\11 Rcproduçito Assistida existem riscos e efüitos 1.-olatcrnis aos quais estamos expostos, tendo sido esclarecidos todas as nossas dúviJas cm relnção ao procedimento. É Je nosso conhecimento que o tratamento proposto poderá ser suspenso II critério medico e que também poderemos nos recusar a continuar o tratamento, sem nos isentarmos dos cu.,tos ou responsabilidades já WL'lurniclas. Eximimos a equipe médica de qlllllquer responsabilidade em eventuais ocorrêneins de complicações como abortnmento , nmlfonnnções li:tais ou patologias nmto:rtUL'I em cn.'IO de gmvi<le1_ Não havendo dúvidas, datamos e ob11ixo assinamos: Casal : Sr .............................................................. •.· •··••·••·· •··••· ···· ·· ······ ··· ·· ··············································· ··········· ·· ····· Sr" .......................... ............. ... ....... ..... ...... ... ... .... • ....... ...... . ..... .. ............ ........... ........... .... .. .... .......... ... ..... ...... . Teslen 11uú111S: ................................................. _ ... ...... ..... .. ........ .............. ....... .. ...................................................... . Ribciriio P�to, ........ dr;: ... .................. de 21.(1. .... . 97