{"paper_id":"9ddd2e75-1bee-464a-a2e0-a863ef0c6630","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA \nDE MULHERES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A \nTÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA \nRibeirão Preto, São Paulo \n2005 \nLauriane Giselle de Abreu \n\nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA \nDE MULHERES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A \nTÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA \nLauriane Giselle de Abreu \nDissertação de Mestrado apresentada à \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da \nUniversidade de São Paulo, para obtenção do título \nde Mestre em Medicina na área de concentração: \nTocoginecologia \nOrientador: Prof. Dr. Marcos Dias de Moura \nRibeirão Preto, São Paulo \n2005 \n11 \n\nFicha catalográfica \nAbreu, Lauriane Giselle de \nAtividade da Aromatase em Células da Granulosa de Mulheres com \nEndometriose Submetidas a Técnicas de Reprodução Assistida/ \nLauriane Giselle de Abreu. Ribeirão Preto, São Paulo, 2005. \nxix, 97p., il. \nDissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto / Universidade de São Paulo, Departamento de \nTocoginecologia. \n\nData da Defesa: 31/05/2005 \nBANCA EXAMINADORA \nProf. Dr. Marcos Dias de Moura \nJulgamento: _ ________________ _ _ \nAssinatura: --------------------\nProfa. Dra. Rosana Maria dos Reis \nJulgamento: _ ____________ _____ _ \nAssinatura: ----------------- ---\nProf. Dr. Mauri Piazza \nJulgamento: _ ____________ ______ _ \nAssinatura: --------------------\niii \n\n\"Sejam quais forem os sentimentos e os interesses \nhumanos, o intelecto é, também ele, uma força. Esta não consegue \nprevalecer imediatamente, mas por fim os seus efeitos revelam-se ainda \nmais peremptórios. A verdade que mais fere acaba sempre por ser notada \ne por se impor, assim que os interesses que lesa e as emoções que suscita \ntenham esgotado a sua virulência.\" \nSigmund Freud \nIV \n\nAo meu pai, Luiz Antonio. \nA minha mãe, Rosemarie. \nDEDICATÓRIAS \nDedico a vocês, com muito amor, este trabalho e todas as minhas \nrealizações. Minha enorme gratidão pela confiança e apoio que sempre me \nofereceram. \nAos meus irmãos, Luciana e Júnior, pelo apoio. \nAo meu companheiro, Marcelo, pela confiança e paciência. \nV \n\nAGRADECIMENTOS \nAo Prof Dr. Marcos Dias de Moura, agradecimento especial pela confiança na \nrealização deste trabalho. Minha total admiração pelo seu talento como \ndÕcente, como médico, como pesquisador e grande cientista. Também minha \ngratidão pela orientação e pela amizade e gentileza sempre presentes. \nAo Prof. Dr. Marcos Felipe Silva de Sá, chefe da pós-graduação na área de \nTocoginecologia, grande mestre, toda a admiração por seu trabalho como \ndocente e cientista e minha gratidão pelo apoio científico e confiança neste \ntrabalho. \nvi \n\nAGRADECIMENTOS \nAo Prof. Dr. Fernando Mangieri Sobrinho e Prof. Inácio Teruo lnoue; pela \namizade, estímulo para a carreira científica e confiança. \nAos Profs. Rosana Maria dos Reis e Rui Alberto Ferriani, pela atenção e \nincentivo para a realização deste trabalho. \nA todos os docentes do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP, \npela imensa colaboração em minha formação. \nA sra. Maria Albina Verceze Bortoliero, que me ensinou a técnica do cultivo \ncelular e realizou as dosagens hormonais, minha enorme gratidão pelo seu \ncarinho, dedicação e auxílio em todo o processo. \nA sra. llza Rezende Mazzocato, minha gratidão pela amizade e auxílio. \nÀs sras. Renata Maria Rebouças, Maria Cristina Piccinato Araújo; Maria \nAuxiliadora Pádua, Sandra Viana, Maria Aparecida Carneiro Vasconcelos, \nMarilda Hatsumi Yamada Dantas, pelo auxílio prestado neste trabalho, \ndisponibilidade e amizade. \nAos meus colegas de pós-graduação: Luciana de Barros Duarte, Carolina \nSales Vieira, Alessandra Marcolin, Laura Ferreira Santana, Arlene de Oliveira \nFernandes, e todos em geral, pela amizade e apoio. \nVll \n\nSUMÁRIO \nAbreviaturas ...................................................................................................... x \nLista de tabelas ............................................................................................... xii \nLista de figuras .............................................................................................. xiv\nResumo .......................................................................................................... xv\nSummary ...................................................................................................... xvii\n1. Introdução .................................................................................................. 19 \n1.1. Etiopatogenia da Endometriose .................................................. 19 \n1.2. Aroma ta se e Endometriose ........................................................ 27 \n2. Objetivo ...................................................................................................... 34 \n3. Pacientes e Métodos ................................................................................. 35 \n3.1. Delineamento do estudo .................................................................. 35 \n3.2. Amostra ...................................... ..................................................... 35 \n3.3. Local de realização do estudo ......................................................... 35 \n3.4. Comitê de ética ................................................................................ 35 \n3.5. Seleção de pacientes ....................................................................... 35 \n3.5.1. Critérios de inclusão para os dois grupos ................................. 36 \n3.5.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo ................................ 36 \n3.5.3. Critérios de exclusão para o grupo-estudo ............................... 36 \n3.5.4. Critérios de inclusão para o grupo-controle .............................. 36 \n3.5.5. Critérios de exclusão para o grupo-controle ............................. 36 \n3.6. Protocolo de Hiperestimulação Ovaria na Controlada ...................... 37 \nviii \n\nSUMÁRIO \n3.7. Captação de oócitos ........................................................................ 38 \n3.8. Cultivo de Células da Granulosa .................................................... .40 \n3.8.1. Procedimento do Cultivo Celular ............................................. 42 \n3.9. Atividade da aromatase ................................................................... 45 \n3.1 O. Experimentos realizados ............................................................... 46 \n3.11. Dosagens hormonais ..................................................................... 4 7 \n3.11.1 Estradiol ................................................................................. 47 \n3.11.2. Progesterona ........................................................................ 47 \n3.12. Análise Estatística .......................................................................... 48 \n4. Resultados ................................................................................................ 49 \n4.1. Características clínicas das pacientes do estudo ............................. 49 \n4.2. Dosagens Hormonais nos Fluidos de Cultivas Celulares ................. 56 \n4.2.1. Estradiol ..................................................................................... 56 \n4.2.2. Atividade da aromatase ............................................................. 57 \n4.2.3. Progesterona ............................................................................. 63 \n5. Discussão .................................................................................................. 67 \n6. Conclusão ................................................................................................. 71 \n7. Referências Bibliográficas ......................................................................... 72 \nApêndice 01 .................................................................................................. 82 \nApêndice 02 .................................................................................................. 84 \nAnexos .......................................................................................................... 86 \nlX \n\nABREVIATURAS \nA - androstenediona \nBax - proteína anti-apoptótica denominada proteína X associada à Bcl-2 \nBcl-2 - proteína anti-apoptótica derivada da célula B CLUlinfoma 2 \nCC - citrato de clomifeno \nE1 - estrona \nE2 - estradiol \nFIV - Fertilização ln Vitro \nFMRP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nFSH - hormônio folículo-estimulante \nFSHr - hormônio folículo-estimulante recombinante \nGnRH - hormônio liberador de gonadotrofinas \nGnRHa - análogos do GnRH \nhCG - gonadotrofina coriônica humana \nhMG ou HMG- gonadotrofinas menopausais humanas \nICSI - Injeção lntracitoplasmática de Espermatozóide \nIGF-1 - fator de crescimento insulina símile tipo 1 \nIL- interleucina \nIUI - Inseminação Intra uterina \nLH - hormônio luteinizante \nM - concentração molar \nmlCAM - molécula de adesão intercelular forma de membrana \nX \n\nABREVIATURAS \nMMTPs - metaloproteinases \nNK - células de citotoxidade natural \nPCR - reação em cadeia de polimerase \nP4 - progesterona \nP450 - termo genérico para denominar a família de enzimas oxidativas \ncontendo o pigmento 450 cuja absorbância muda enquanto é reduzido \nP450 arom - aromatase P450 \nRNAm - ácido ribonucléico mensageiro \nROS - espécies reativas de oxigênio \nSD - desvio padrão \nslCAM - molécula de adesão intercelular tipo solúvel \nsTAR- proteína de regulação aguda da esteroidogênese \nTEC - transferência de embriões congelados \nTIMPs - inibidores das metaloproteinases \nTh1- subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo 1 \nTh2 - subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo2 \nTGF - fator de crescimento tumoral \nTNF - fator de necrose tumoral \nUSG - ultrassonografia \nUI - unidades internacionais \nVEGF - fator de crescimento vascular endotelial \nxi \n\nLISTA DE TABELAS \nTabela 1 - Preparo dos meios para cultivo de células da granulosa. \nTabela 2 - Características clínicas das mulheres do grupo controle: idade, \ntempo de infertilidade, tratamentos de infertilidade prévios e causa da \ninfertilidade. \nTabela 3 - Características clínicas das mulheres do grupo com endometriose: \nidade, tempo de infertilidade, tratamentos de infertilidade prévios, classificação \nda endometriose e antecedente familiar de endometriose. \nTabela 4 - Características da hiperestimulação ovariana controlada para FIV \nou ICSI das pacientes do grupo com endometriose e controle. \nTabela 5 - Características da captação de oócitos e transferência embrionária \npara FIV e ICSI nos grupo controle e endometriose. \nTabela 6 - Valores em média das dosagens de estradiol em pg/ml de fluidos \nde cultivas de células da granulosa de mulheres sem endometriose (grupo \ncontrole) submetidas à reprodução assistida. \nXll \n\nLISTA DE TABELAS \nTabela 7 -Valores em média das dosagens de estradiol em pg/ml de fluidos de \ncultivas de células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas à \nreprodução assistida. \nTabela 8 - Valores em média das dosagens de progesterona em ng/ml de \nfluidos de cultivas de células da granulosa de mulheres sem endometriose \n(grupo controle) submetidas à reprodução assistida. \nTabela 9 - Valores em média das dosagens de progesterona em ng/ml de \nfluidos de cultivas de células da granulosa de mulheres com endometriose \nsubmetidas à reprodução assistida. \nXlll \n\nLISTA DE FIGURAS \nFigura 1 - Possíveis alterações fisiopatológicas na cavidade peritoneal de \nmulheres com endometriose. \nFigura 2 - mecanismo de estresse oxidativo na endometriose. \nFigura 3 - lnativação defectiva de estradiol na endometriose. \nFigura 4 - Esquema de hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI \nFigura 5 - Esquema do procedimento de cultivo de células da granulosa. \nFigura 6 - Níveis de P4 (ng/ml) produzidos em condições basais e em \nresposta à adição de testosterona (2 x 10\"6M e 2 x 10\"5M) em cultivo de células \nda granulosa do grupo de mulheres com endometriose e controle. \nGráfico 1 - Níveis de E2 (pg/ml) em fluido de cultivo de células da granulosa \ndo grupo de mulheres com endometriose e controle, em condições basais. \nGráficos 2 e 3 - Atividade da aromatase expressa em níveis de E2 (pg/ml) \nproduzidos em resposta à adição de testosterona na concentração de 2 x 10-6M \n(Gráfico 2) e 2 x 1 o·5M (Gráfico 3) em cultivo de células da granulosa de \nmulheres com endometriose e controle. \nXIV \n\nRESUMO \nAbreu LG. Atividade da aromatase em células da granulosa de mulheres \ncom endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. 2005.\n97p. Dissertação de Mestrado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, \nUniversidade de São Paulo, Ribeirão Preto. \nEndometriose significa presença de tecido endometrial fora da cavidade \nuterina. Sua associação com infertilidade é inequívoca, entretanto, os \nmecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos e \naberrações moleculares emergem como possíveis alvos de defeitos. Acredita­\nse em comprometimento poligênico com alterações de citocinas, moléculas do \nestresse oxidativo e enzimas relacionadas à esteroidogênese como a \naromatase. Esta é responsável por catalisar a transformação de andrógenos \nem estrógenos; está presente em vários tecidos e na célula da granulosa é de \nprimordial importância para a foliculogênese. Em mulheres com endometriose, \nforam encontradas alterações da aromatase tanto em implantes \nendometrióticos como no endométrio tópico, além de redução de sua atividade \nem células da granulosa, com possível comprometimento da qualidade \noocitária. Este trabalho tem por objetivo medir a atividade da aromatase nas \nXV \n\ncélulas da granulosa in vitro de mulheres com endometriose submetidas à \nreprodução assistida. \nPacientes e Métodos: Estudo caso-controle, com 8 pacientes com \nendometriose e 8 com outras causas de infertilidade submetidas à FIV ou ICSI. \nColetaram-se células da granulosa a partir de folículos pré-ovulatórios no dia \nda captação oocitária e realizou-se cultivo destas células por 24 horas, na \npresença ou não de testosterona nas concentrações de 2 x 1 o-6M e 2 x 10-5 M; \nFSH (50 ng/ml) e IGF-1 (50 ng/ml) e foi feita dosagem posterior de estradiol \n(radioimunoensaio) e progesterona (quimioluminescência) nos fluidos de \ncultivo. \nResultados: Houve redução da atividade da aromatase nas células da \ngranulosa de mulheres com endometriose quando comparadas ao controle, \nquando houve adição de testosterona na concentração de 2 x 10-6M (p=0, \n0303). A produção de estradiol e progesterona, basal ou estimulada por IGF-1 \ne FSH, não mostrou nenhuma diferença entre os grupos. Também não houve \nnenhuma diferença na produção de progesterona mediante adição de \ntestosterona. \nPalavras-chave: Aromatase; endometriose; células da granulosa; reprodução \nassistida. \nxvi \n\nSUMMARY \nAbreu LG. Aromatase activity in granulosa cells of women with \nendometriosis undergoing assisted reproduction techniques. 2005. 97p. \nDissertação de Mestrado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, \nUniversidade de São Paulo, Ribeirão Preto. \nEndometriosis represents the presence of endometrial tissue outside the uterine \ncavity. The infertility-endometriosis association is unequivocal; however, \nthe mechanisms involved are still not totally elucidated and molecular \naberrations have been proposed as possible targets. There is a belief that a \npolygenic insult results in molecular alterations of cytokines, molecules of the \noxidative stress and enzymes related to steroid synthesis, such as aromatase. \nThis enzyme is responsible for converting androgens to estrogens, is present in \nsevera! tissues and in granulosa cells and is of primordial importance \nfor folliculogenesis. ln women with endometriosis, aromatase alterations have \nbeen found both in endometriotic implants and in topic endometrium, as well as \nreduced activity in granulosa cells, with possible oocyte damage. The aim of \nthis study was to measure aromatase activity in granulosa cells of women with \nendometriosis undergoing assisted reproductive techniques. \nxvu \n\nPatients and Methods: A case-contrai study was conducted on 8 patients with \nendometriosis and 8 with other infertility causes submitted to IVF or ICSI. \nGranulosa cells were obtained from a pre-ovulatory follicle during oocyte \nretrieval and cultured for 24 hours in the presence or absence of testosterane at \n2 x 1 o-s M and 2 x 10-5 M concentration, FSH (50 ng/ml) and IGF-1 (50 ng/ml). \nEstradiol (radioimmunoassay) and progesterone (quimiolumminescence) were \nthen measured in culture fluids. \nResults: Reduced aromatase activity was detected in granulosa cells of women \nwith endometriosis compareci to contrai when testosterone was added at 2x 1 o-s \nM concentration (p=0.0303). The production of estradiol and \npragesterane under basal conditions or in the presence of stimulation with IGF-\n1 and FSH did not differ between groups. Also, no difference in pragesterone \nproduction was observed in the presence of testosterone. \nKey-words: aromatase; endometriosis; granulosa cells; assisted repraduction \ntechniques. \nXVlll \n\n1. Introdução\n1.1. Etiopatogenia da Endometriose \nEndometriose, por definição, siginifica presença de endométrio (com \nglândula e estrema) fora da cavidade uterina (Noble et ai., 1996 Speroff et ai., \n1999). Clinicamente, apresenta-se sob a tríade: dor pélvica crônica, \ndismenorréia e infertilidade, porém, não se encontra correspondência entre \nestágio da doença e severidade dos sintomas, de maneira que pequenas lesões \npodem causar sintomas exuberantes e vice-versa (Moura et ai., 1999). Atinge \npreferencialmente mulheres no menacme, sendo infreqüente antes da menarca \ne após a menopausa (Schenken, 1996; Moura et ai., 1999; Neme et ai., 2001) e \nrepresenta uma doença crônica e de elevada morbidade, a qual acomete cerca \nde 10% das mulheres em idade reprodutiva e 25 a 35% das inférteis (Wheeler, \n1989; Schenken, 1996; Moura et ai., 1999; Speroff et ai., 1999). Na verdade, a \nprevalência da endometriose depende muito do método empregado para seu \ndiagnóstico e a população estudada. Wheeler (1989) demonstrou prevalência de \naproximadamente 10% em achados cirúrgicos em mulheres em idade \nreprodutiva com outros diagnósticos, Hess (1988), por sua vez, encontrou 9,4% \nde endometriose em mulheres submetidas à laparoscopia por algia pélvica \ncrônica (Neme et ai., 2001). Quando se analisam mulheres com infertilidade e \ndor pélvica associadas, pode-se encontrar até 50% de prevalência de \nendometriose (Cornillie et ai., 1990), por outro lado, mulheres assintomáticas \napresentam incidência de cerca de 1-2% (Moura et ai., 1999). \n19 \n\nAdmite-se que a etiopatogenia de endometriose seja multifatorial e \nexistem várias teorias para tentar explicá-la (Pellicer et ai., 1998; Bulun et ai., \n2002). De acordo com a teoria de Sampson, a mais aceita, os debris mestruais \nque refluem para a cavidade peritoneal possuem células endometriais viáveis \nque potencialmente podem formar um implante endometriótico. Entretanto, por \nque existe refluxo em 90% das mulheres e somente 10% delas têm \nendometriose? Acredita-se que algumas destas células endometriais das \npacientes com endometriose apresentam características singulares \ngeneticamente determinadas que possam aumentar sua probabilidade de \nimplantar-se, bem como a existência de um mecanismo imunológico aberrante \nque possa aumentar a sobrevida destas células e favorecer a formação de \nimplante endometriótico (Zeitoun et ai., 1999; Bulun et ai., 2002). \nOutras teorias tentam explicar a presença de lesões de endometriose fora \nda cavidade pélvica. Em 1927, Meyer (1924) propôs que a endometriose seria \nresultado de uma metaplasia das células da linhagem peritoneal; esta teoria \nexplica a endometriose em homens, em pré-púberes, mulheres que nunca \nmenstruaram e lesões em sítios atípicos, como cavidade pleural e meninges. \nA constatação da presença de células endometriais viáveis na luz de \nvasos sanguíneos e linfáticos por Halban e Sampson (1925) levou-os a \nespecular que focos distantes de endometriose poderiam surgir a partir da \ndisseminação de células endometriais por via hematogênica ou linfática. Esta \nteoria explicaria lesões na pleura, umbigo, espaço retroperitoneal, vagina e colo \ndo útero. \nAcredita-se que a endometriose também represente uma doença \npoligênica com envolvimento de alterações moleculares, principalmente as \n20 \n\ncitocinas 0/Vu & Ho, 2003); enzimas relacionadas à esteroidogênese como a \naromatase (Zeitoun et ai., 1999; Bulun et ai., 2002) e moléculas envolvidas com \no estresse oxidativo celular (Langendonckt et ai., 2002; Szczepanska et ai.,\n2003). \nKao e colaboradores (2003), através da análise de microarrays em \namostras de endométrio de mulheres com endometriose, encontraram 91 genes \ncom expressão aumentada e 115 reduzidos significativamente nestas mulheres; \nentre estes genes alterados incluem aqueles envolvidos com resposta imune e \napoptose celular, receptor de progesterona, fatores angiogênicos e o gene da \naromatase. Arvanitis e colaboradores (2003) também encontraram a presença \nde um polimorfismo no gene da aromatase associado com endometriose. \nCom relação ao sistema imune, encontram-se alterações tanto na \nimunidade celular quanto humoral na endometriose, de maneira que ocorra um \nambiente peritoneal favorável à maior sobrevida das células endometriais após o \nfluxo retrógrado para formação dos implantes endometrióticos (Pellicer et ai., \n1998; Wu & Ho, 2003). O fluido peritoneal de pacientes com endometriose \napresenta um maior número e maior atividade macrocítica; entretanto, estes \napresentam atividade fagocítica reduzida e produzem maior quantidade de \nfatores de crescimento e citocinas que estimulam a adesão celular e expressão \nde metaloproteinases (substâncias modeladoras da matriz extracelular), \nfavorecendo a formação dos implantes endometrióticos (Clive et ai., 1985; Zeller \net ai., 1987; Dunselman et ai., 1988). As células NK (Natural Killer) também \napresentam atividade de citotoxidade reduzida na endometriose, levando a uma \nmenor capacidade de clearence das células endometriais refluídas (Oosterlynck \net ai., 1991; Wilson et ai., 1994). Entre os linfócitos, há uma dominância na \n21 \n\natividade dos linfócitos da subpopulação Th2 em relação à Th1 r,Nu & Ho, \n2003). Quanto à imunidade humoral, sugere-se a associação entre \nendometriose e doenças auto-imunes (Gallová et ai., 2002). Em estudo realizado \ncom 313 mulheres inférteis com endometriose (261 estágios I e li; 62 estágios Ili \ne IV) comparativamente a 101 mulheres inférteis sem endometriose, houve \nmaiores níveis de auto-anticorpos do tipo antifosfolípide contra inositol, \ncardiolipina, etanolamida e �2glicoproteína nas pacientes com endometriose, \nsendo mais exuberante naquelas nos estágios I e li. E em 40% das pacientes \ncom endometriose graus leve e mínimo apresentaram anticorpos antizona \npelúcida (Gallová et ai., 2002). \nAlém disso, níveis elevados de citocinas no fluido peritoneal de pacientes \ncom endometriose foram relatados em diversos estudos. Entre elas estão IL-1, \nIL-6, IL-8, IL-10, VEGF, TNFcx, TGF� 0/Vu & Ho, 2003). (Figura 1) \nDestaque merece ser dado à IL-6, que corresponde a uma interleucina \ndas mais importantes na etiopatogenia da endometriose. Está envolvida com a \nprodução esteroidogênica ovariana, foliculogênese e implantação embrionária, \napresenta atividade multifuncional e possui efeitos angiogênicos, induzindo a \nexpressão de VEGF. Além disso, por estímulo de IL-1, ocorre produção de IL-6 \nem células endometriais de pacientes com endometriose, porém não em \npacientes sem a doença. A IL-6 também estimula a produção da aromatase em \ncélulas adiposas 0/Vitz et ai., 2000), e, em elevadas concentrações, é \nembriotóxica em ratos (Wu & Ho, 2003). (Figura 1) \n22 \n\nMacrófago \nIL 1, IL6, IL8, IL 10 \nTNFa, TGF�; VEGFj \nAdesão, angiogênese \nAM-1, VEGF, IL6, IL8 TNF \n.. _,,. ... -� � \n,, '--' · . -7 _ \nMMTPs/TIMPs \nBcl-2/Bax \nROS/antioxidantes \nTh2 \nIL4, ILS, IL 10 i \nTh1 \n1� \nCélula NK \nIFN � t \nFigura 1 - Possíveis alterações fisiopatológicas na cavidade peritoneal de mulheres com \nendometriose. O endométrio anormal da endometriose em ROS ( espécies reativas de oxigênio), \nantioxidantes, metaloproteinases e seus inibidores (MMPs e TIMPs). Thl = subpopulação de \nlinfócitos 1; Th2 = subpopulação de linfócitos 2. sICAM-1: molécula de adesão intercelular \nforma solúvel. VEGF = fator de crescimento vascular endotelial. Bcl-2 e Bax = proteínas anti­\napoptóticas. (adaptado de Wu & Ho. 2003). \n23 \n\nPesquisa-se também a presença de alterações nos mecanismos de \ncontrole de proliferação celular do endométrio de pacientes com endometriose. \nA \"homeostase tecidual\" normalmente é produto de um equilíbrio entre \nmecanismos de destruição ou degradação celular (apoptose) e de proliferação \ncelular. Na endometriose parece haver um desbalanço nesta homeostase, com \nmaior proliferação celular nas lesões endometrióticas e menor apoptose, \npermitindo a sobrevivência e crescimentos das lesões. (Fujishita et ai., 1999; \nDmowski et ai., 200; Braun et ai., 2002; Toya et ai., 2002). As proteínas anti­\napoptóticas Bcl2 e Bax apresentam aumento de sua expressão em macrófagos \ne células endometriais de pacientes com endometriose (:Nu & Ho, 2003). \nAinda, acredita-se que a cavidade peritoneal de pacientes com \nendometriose represente um ambiente pró-oxidante, com produção de \nsubstâncias denominadas espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem \ncontribuir para a reação inflamatória associada à endometriose (Langendonckt et \nai., 2002). \nExistem algumas evidências de estresse oxidativo na endometriose: (1) A \nenzima óxido nítrico-sintetase encontra-se superexpressa levando a uma maior \nprodução de óxido nítrico (substância pró-oxidante); (2) aumento da peroxidação \nlipídica com produção de produtos reativos como o malonaldeído e \nlisofosfatidilcolina; (3) expressão aumentada de enzimas antioxidantes no \nendométrio de pacientes com endometriose, que ocorreria em resposta à \npresença de maior quantidade de espécies reativas de oxigênio; (4) níveis \nreduzidos de vitamina E no fluido peritoneal de mulheres com endometriose \nconsumida durante reações de oxidação; (5) presença de indutores potenciais \nde estresse oxidativo na cavidade peritoneal como eritrócitos, debris celulares e \n24 \n\nos macrófagos (Langendonckt et ai., 2002; Szczepanska et ai., 2003). (Figura 2). \nOs efeitos sobre a fertilidade residem sobre a toxicidade do fluido peritoneal \nsobre os espermatozóides, ovulação, sobre o desenvolvimento embrionário pré­\nimplantação e na implantação (Langendonckt et ai., 2002) (Figura 2). \nDebris --, \n/ \ncelul;res \nMacrófagos \nDioxina, \nagentes tóxicos \n, ......\n... \n'=-'-- - - --► Estresse \noxidativo \nNOS \n+ \n4 ______ NO \n+ \nVasodilatação \nMenstruação \nretrógrada + Hemácias + Hb + Heme + F�rro + Biliverdina + CO,\nSangramento da \nlesão endometriótica \nFigura 2 - mecanismo de estresse oxidativo na endometriose. ( adaptado de \nLangendonckt et al., 2002). (Hb = hemoglobina; C02 = dióxido de carbono; \nNO= óxido nítrico; NOS= óxido nítrico sintase). \nOutras moléculas também se mostraram como alvos de alterações na \nendometriose: (1) Metaloproteinases - as metaloproteinases (MMP) e seus \ninibidores (TIMPs) são reguladores fisiológicos da remodelação da matriz \nextracelular. Um desbalanço entre eles pode produzir uma doença invasiva e \nfavorecer a implantação endometrial no peritôneo. Na endometriose, pode \nocorrer uma falta de inibidores das metaloproteinases, bem como aumento dos \nníveis das próprias metaloproteinases do tipo 1 e 2, como já foi detectado. A \nMMP2 é considerada um marcador de possível invasão por tumores epiteliais e \n25 \n\nencontra-se aumentada na endometriose (Wu & Ho, 2003). (2) Moléculas de \nadesão (ICAM, SIGAM) - molécula de adesão intercelular, é fortemente expressa \nem células endometriais e sua forma de expressão de membrana (mlCAM) é \nimportante para interação com o sistema imune e para a eliminação destas \ncélulas do peritôneo. Entretanto, existe uma forma solúvel (slCAM) que se liga \nàs células imunológicas, impedindo-as de interagir com a mlCAM, em última \ninstância, prevenindo a destruição das células endometriais do peritôneo. A \nelevação de níveis séricos e no fluido peritoneal de slCAM foi detectada na \nendometriose. A presença desta molécula (slCAM) corresponde a mais um \nmecanismo das células endometriais na endometriose de escapar da ação \nimune e aumentar sua sobrevida no ambiente peritoneal favorecendo sua \nimplantação em sítios ectópicos (Wu & Ho, 2003). \nAlém da etiopatogenia, também existem controvérsias sobre o \ncomportamento da endometriose e sua classificação. Nisolle & Donnez (1997) \ndefendem a hipótese das três doenças, ou seja, que, a endometriose peritoneal, \na ovariana e a de septo retovaginal representariam três doenças distintas com \ncomportamentos clínicos e histopatológicos diferentes. Brosens (2000), por sua \nvez, classifica a endometriose de acordo com sua topografia, em superficial e \nprofunda: a forma superficial ou adenomiose seguiria o trajeto dos duetos \nmullerianos incluindo útero, fórnices vaginais, septo retovaginal e ligamentos \nuterinos; as lesões profundas seriam aquelas localizadas fora da extensão dos \nduetos de Muller e incluiriam lesões peritoneais e ovarianas. \n26 \n\n1.2. Aromatase e Endometriose \nComo já foi relatado, emerge a teoria de que a endometriose represente \numa doença poligênica hereditária com envolvimento de alterações moleculares \ncom expressão aberrante de citocinas e enzimas relacionadas à \nesteroidogênese como a 17beta-hidróxi-esteróide-desidrogenase e a aromatase \n(Zeitoun & Bulun, 1999; Attia et ai., 2001; Neme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002). \nDe fato, evidências apontam neste sentido, especialmente no caso \nda aromatase (Bulun et ai., 1995; Noble et ai., 1996; Zeitoun & Bulun, 1999; \nNeme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002). \nEsta é uma enzima codificada pelo gene CYP 19 localizado no \ncromossomo 15 (Meinhart & Mullis, 2002), corresponde a um complexo \nenzimático do citocromo P450 responsável por catalisar a transformação de \nandrógenos (testosterona, androstenediona) em estrógenos (estradiol, estrona, \nrespectivamente) (Zeitoun & Bulun, 1999; Neme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002; \nKaraer et ai., 2004). Ela está presente em vários tecidos: ovários (células da \ngranulosa), testículo, tecido adiposo, placenta, cérebro, músculo, fibroblastos da \npele e do tecido ósseo (Karaer et ai., 2004). Vários promotores tecido­\nespecíficos regulam a sua expressão, e, apesar da presença de primeiros exons \nalternativos e de promoters tecido-específicos que permitem a regulação local \nda enzima, a proteína expressa é a mesma (Meinhart & Mullis, 2002; Karaer et \nai., 2004). Na célula da granulosa, a aromatase apresenta um papel essencial \nna foliculogênese e produção de estradiol: sua expressão aumenta à medida \nque o desenvolvimento folicular progride (Tetsuka & Hillier, 1997; Guet et ai., \n1999), sob influência do FSH, segundo a teoria das duas células-duas \n27 \n\ngonadotrofinas (Speroff et ai., 1999). Portanto, a aromatase é uma enzima de \nprimordial importância na célula da granulosa e responsável por produzir um \nmicroambiente estrogênico folicular, essencial ao seu processo de \ndesenvolvimento e maturação (Speroff et ai., 1999). \nO envolvimento da aromatase e a produção de estradiol na etiopatogenia \nda endometriose tem sido alvo de numerosos estudos (Bulun et ai., 1995; Noble \net ai., 1996; Zeitoun & Bulun, 1999; Neme et ai., 2001; Attia et ai., 2001; Bulun et \nai., 2002). Uma vez que a endometriose é considerada uma doença estrogênio­\ndependente, a expressão da enzima aromatase torna-se essencial para a \netiopatogenia da doença. O estrógeno é um mitógeno para os tecidos \nmullerianos (Bulun et ai., 2002) e a possível ação autócrina deste hormônio, ou \nseja, sua ação local sobre o endométrio de mulheres com endometriose pode \nser um facilitador para a implantação e desenvolvimento de implantes na \ncavidade peritoneal. (Noble et ai., 1996; Fang et ai., 2002) Foram detectados \nníveis estrogênicos significativamente aumentados no sangue menstrual de \nmulheres com endometriose (Neme et ai., 2001). Além disso, níveis muito \nelevados da aromatase em implantes endometrióticos e endometriomas por \nmeio de PCR (po/ymerase chain reaction) (Noble et ai., 1996; Kitawaki et ai., \n2002) e RNAm da aromatase foi detectado em endométrio eutópico de mulheres \ncom endometriose porém não naquelas sem a doença (Bulun et ai., 1995). \nPorém, a quantidade de aromatase encontrada no endométrio tópico de \nmulheres com endometriose foi menor do que nos implantes peritoneais; a \nhipótese é que este endométrio defectivo, quando reflui para a cavidade \nperitoneal, causa uma reação inflamatória que aumenta exponencialmente a \nexpressão da aromatase, já que a prostaglandina E2 é o mais potente \n28 \n\nestimulador desta enzima. Desta forma, se estabelece um ciclo vicioso de \nprodução de estradiol e prostaglandinas que facilita a formação dos implantes \nendometrióticos e perpetua este mecanismo fisiopatológico que favorece as \ncaracterísticas proliferativas e inflamatórias da endometriose (Zeitoun & Bulun, \n1999; Bulun et ai., 2002) (Figura 3). A proteína sTAR (steroidogenic acute \nregulatory protein) também encontra-se alterada nos tecidos endometrióticos e \ntambém sofre estímulo das prostaglandinas (Sun et ai., 2003). \nAlém disso, acredita-se numa resistência à ação da progesterona na \nendometriose (Zeitoun & Bulun, 1999; Bulun et ai., 2002). A progesterona \nestimula a ação da enzima denominada 17beta-hidróxi-esteróide-desidrogenase \ntipo 2, que faz a inativação do estradiol para estrona. A expressão desta enzima \napresenta-se deficiente nas células endometrióticas glandulares, portanto, o \nefeito protetor da progesterona é reduzido na endometriose. (Bulun et ai., 2002) \n(Figura 3). Attia et ai. (2001) relataram alterações na expressão das isoformas \nde receptores de progesterona na endometriose: não foi detectada a expressão \nda isoforma B do receptor de progesterona no tecido endometriótico, \nresponsável por mediar a ação progesterônica nos tecidos-alvo; a isoforma A, \ncuja função é ser repressora da forma B, apresentou-se expressa na \nendometriose. \n29 \n\nCélula estromal \nVaso sanauíneo \nCélula epitelial \n17 HSD-1 \nE1 \nHSD-\n------�... + ,' ', , \n......... , \n,..._ r \n-------- PgE2 \n+ ,,', , \n, \n, \n, \n, \nE2 \nFigura 3 - Inativação defectiva de estradiol na endometriose. Os estrógenos estradiol (E2) \ne estrona (El) e a androstenediona (A) chegam às lesões endometrióticas através da \ncorrente sanguínea, a aromatase (P450 arom) na célula estromal endometriótica catalisa a \ntransformação de androstenediona (A) para estrona (El), que, por sua vez, é convertida à \nE2 pela ação da enzima 17 beta hidroxiesteroidedesidrogenase tipol (17pHSD-l). O E2 \nnormalmente é inativado para El através da enzima 17 betadesidrogenasetipo2 (17pHSD-\n2) na célula epitelial glandular do endométrio tópico na fase secretória. Na célula\nendometriótica, no entanto, a l 7j3HSD-2 apresenta-se defeituosa, mantendo E2 em \nelevados níveis locais. E2 promove crescimento do tecido endometriótico e produção de \nprostaglandinas (PGE2) que, por sua vez, estimula a aromatase, completando um ciclo de \nfeedback positivo de E2 e PGE2. (Adaptado de Zeitoun & Bulun, 1999) \n30 \n\nEm suma, o envolvimento da aromatase com a endometriose se explica \nda seguinte maneira: em primeiro lugar, a endometriose é uma doença do \nmenacme, portanto, sua etiopatogenia possivelmente se relaciona com a \nesteroidogênese (Zeitoun & Bulun, 1999; Neme et ai., 2001; Bulun et ai., 2002) e \na aromatase está diretamente envolvida neste processo. Em segundo lugar, \nalterações da aromatase na endometriose já foram relatadas: níveis muito \nelevados da aromatase foram encontrados em implantes endometrióticos e em \nendometriomas (Noble et ai., 1996) e também foi detectado RNAm da \naromatase em endométrio eutópico de pacientes com endometriose mas não em \nmulheres sem a doença (Bulun et ai., 1995). \nOra, se existe funcionamento aberrante da aromatase em implantes \nendometrióticos ou endométrio tópico de pacientes com endometriose, por que \nnão ocorreria o mesmo dentro da célula da granulosa com comprometimento da \nfoliculogênese e qualidade oocitária, com conseqüências sobre a fertilidade? \nHarlow e cols. ( 1996) pesquisaram a atividade da aromatase em \npacientes com endometriose de graus leve e mínimo através de cultura de \ncélulas da granulosa na qual avaliaram a produção de estrógeno frente à adição \nde testosterona ao meio de cultura. Encontraram redução da atividade da \naromatase nas pacientes com endometriose em comparação ao controle. A \nescassez de outros estudos similares, bem como o uso de outros métodos mais \nespecíficos para tal avaliação, estimulou a proposta deste estudo. \n31 \n\nSe se considerar a associação infertilidade-endometriose, esta é \ninequívoca, entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não \ntotalmente esclarecidos. Quando há defeito anatômico pélvico não existe dúvida \nquanto à sua relação com infertilidade, porém, quando isto não ocorre, encontra­\nse dificuldade para explicá-la (Schenken, 1996; Speroff et ai., 1999; Ferriani et \nai., 2000). Neste caso, os mecanismos propostos compreendem: (1) alterações \nno microambiente folicular ou no oócito (Schenken, 1996; Speroff et ai., 1999; \nFerriani et ai., 2000; Pellicer et ai., 1998); (2) falência na implantação (Ferriani et \nai., 2000); (3) disfunção ovulatória (Speroff et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000); (4) \ndefeitos imunológicos inclusive relacionados a processo auto-imune (Lucena & \nCubillos, 1999); (5) hiperativação dos macrófagos peritoneais (Pellicer et ai., \n1998; Wu & Ho, 2003); (6) alterações nas citocinas no fluido folicular e \nsistemicamente particularmente da interleucina 6 (Oliveira, 2002; Pellicer et ai., \n1998; Witz, 2000; Wu & Ho, 2003); (7) síndrome do folículo luteinizado não roto \n(Moura et ai., 1999; Speroff et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000); (8) alterações no \ndesenvolvimento embrionário precoce (Moura et ai., 1999); (9) apoptose celular \naumentada em células da granulosa (Toya et ai., 2002); além de (10) alterações \nendócrinas como fase lútea inadequada e hiperprolactinemia (Gomes, 2002; \nMoura et ai., 1999; Ferriani et ai., 2000). \nA Fertilização in Vitro (FIV) tem se tornado o método de escolha para \ntratamento da infertilidade associada à endometriose (Neme et ai., 2001). \nNumerosos estudos foram realizados para avaliar se a endometriose afeta os \nresultados da FIV e seus achados foram controversos (Rinesi et ai., 2002). \nEntretanto, Barnhart e cols (2002) realizaram uma metanálise de 22 estudos \nsobre o assunto e verificaram que todos os parâmetros encontravam-se \n32 \n\nalterados nas pacientes com endometriose quando comparadas àquelas com \noutras causas de infertilidade, com redução na taxa de fertilização, número de \noócitos captados, taxas de implantação e gestação. \nConsiderando-se as evidências de que o principal fator alterado nas \npacientes inférteis com endometriose e submetidas à FIV seja a qualidade \noocitária (Pellicer et ai., 1998; Barnhart et ai., 2002; Diaz et ai., 2000) em \ndetrimento de outros fatores como a receptividade endometrial (Diaz et ai., \n2000); o estudo da atividade da aromatase nas células da granulosa visa a um \nesclarecimento dos mecanismos responsáveis por este comprometimento \noocitário, bem como busca um possível alvo terapêutico. \n33 \n\n2. Objetivo\nO objetivo deste trabalho é: \n✓ Medir a atividade da enzima aromatase nas células da granulosa em\ncultivo in vitro de mulheres com endometriose em comparação àquelas\nsem endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV ou\nICSI).\nA hipótese a ser validada é que: \n✓ Mulheres com endometriose apresentam redução da atividade da\naromatase nas células da granulosa in vitro.\n34 \n\n3. Pacientes e Métodos\n3.1. Delineamento do estudo - estudo caso-controle. \n3.2. Amostra - 08 pacientes para cada grupo. \n3.3. Local de realização do estudo: Serviço de Reprodução Humana do \nDepartamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão \nPreto, São Paulo, Brasil. \n3.4. Comitê de Ética em Pesquisa: o presente estudo foi aprovado pela \nComissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) de acordo com o parecer \nnúmero 1492/2004. Cada paciente assinou um termo de consentimento antes da \nrealização do procedimento de reprodução assistida e da realização da \npesquisa, após os devidos esclarecimentos (vide Anexos). \n3.5. Seleção de Pacientes \nForam selecionadas 16 pacientes inférteis com indicação para FIV ou \nICSI, com um total 08 para cada grupo (com e sem endometriose). Os critérios \npara seleção de pacientes de ambos os grupos estão descritos abaixo: \n35 \n\n3.5.1. Critérios de inclusão para os dois grupos: estar cadastrada no \nPrograma de Reprodução Assistida do Setor de Reprodução Humana do \nDepartamento de Tocoginecologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto; ter idade inferior a 40 anos, apresentar ciclos \nmenstruais regulares e dosagens de LH e FSH ( 3° dia do ciclo) normais para o \nmenacme. \n3.5.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo: presença de \nendometriose em qualquer estágio de acordo com a classificação da Sociedade \nAmericana de Medicina Reprodutiva diagnosticada por laparoscopia prévia \nrealizada até 6 meses antes do estudo. \n3.5.3. Critérios de exclusão para o grupo-estudo: idade acima de 40 \nanos, presença de outros fatores de infertilidade ou patologias endócrinas \nassociadas à endometriose. \n3.5.4. Critérios de inclusão para o grupo-controle: ausência de \nendometriose confirmada por laparoscopia prévia há no máximo 6 meses, \nausência de doenças endócrinas associadas. \n3.5.5. Critérios de exclusão para o grupo-controle: idade acima de \n40 anos, presença de outras doenças endócrinas associadas. \n36 \n\n3.6. Protocolo de Hiperestimulação Ovariana Controlada \nInicialmente, realizou-se a programação do período menstrual através de \nuso de anticoncepcionais orais combinados no ciclo prévio àquele da indução da \novulação. Do 1 °-3° dia do ciclo de estimulação ovariana, foi realizada uma \nultrassonografia (USG) transvaginal para excluir cistos ovarianos e então \niniciada a estimulação ovariana controlada com gonadotrofinas: hMG \n(Menogon®, Ferring, Brasil; Pergonal®, Serona, Brasil) ou FSH recombinante \n(Puregon®, Organon, Brasil.; Gonal-F®, Serona, Brasil) nos primeiros 5 dias na \ndose de 200 a 450 UI/dia e a partir do 6° dia a dose da gonadotrofina foi \najustada de acordo com o crescimento folicular monitorizado por USG. Quando \nhouve pelo menos 2 folículos com 17 mm de diâmetro, foi administrado hCG \nintramuscular (Profasi®, Serona, Brasil) 10.000 UI ou hCG recombinante 250µg \nvia subcutânea (Ovidrel®, Sereno, Brasil) e após 34 a 36 horas, realizada a \ncaptação de oócitos. Para dessensibilização hipofisária, foi utilizado o agonista \ndo GnRH, acetato de leuprolide (Lupron®, Abbott; Reliser®, Serono, Brasil), 1 O \nUI/dia via subcutânea ou nafarelina via nasal 400 µg/dia (Synarel®, Pharmacia, \nBrasil) conforme protocolo longo, ou seja, iniciado na fase lútea do ciclo prévio \nou sete dias antes da menstruação programada (Ferriani et ai., 2004). A \nsuplementação lútea foi iniciada a partir do dia da captação oocitária e, no caso \nde gravidez, até a 12ª semana de gestação (Figura 4); as progesteronas \nutilizadas foram: diidrogesterona 30 mg/dia (Duphaston®; Solvay; Brasil) ou a \nprogesterona gel uma aplicação diária (Crinone 8%; Sereno; Brasil). \n37 \n\n3. 7. Captação de Oócitos\nA captação oocitária foi realizada sob anestesia geral tipo sedação com \nuso de propofol (Diprivan®, Astra Zeneca, Brasil) associado ao fentanil \n(Fentanil®, Janssen Cilag, Brasil), administrados por via endovenosa. O \nprocedimento foi feito via vaginal através de punção de fundo de saco e guiado \npor ultrassonografia. O conteúdo de cada folículo foi aspirado em tubos de \nFalcon sob pressão de 120-130 mmHg e mantido a 37° e os oócitos \nmanuseados e separados do restante do fluido folicular em capela de fluxo de ar \nlaminar para depois serem mantidos em meio de cultura em incubadora com \ntemperatura controlada a 37°C e concentração de CO2 de 5% \n38 \n\nProgramação da \nmenstruação \nBH M \nGonadotrofina diária \nGnRH-agonista \nUSG basal hCG \nSuplementação \nda fase lútea \nco TE \nFigura 4 - Esquema de hiperestimulação ovanana controlada para FIV ou ICSI \nconforme protocolo longo. (BH = Bolqueio hipofisário; M = menstruação; USG =\nultrassonografia basal; M-USG = monitorização ultrassonográfica; MF = maturidade \nfolicular; CO = captação oocitária; TE = transferência embrionária). \n(Adaptado de Ferriani et al., 2004). \n39 \n\n3.8. Cultivo de Células da Granulosa \nPara o cultivo das células da granulosa foi usada a técnica do Instituto \nValenciano de Infertilidade da Universidade de Medicina de Valencia, Espanha \n(Pellicer e cais., 1998), com algumas modificações (Silva, 1997) descritas \nabaixo: \nColunas de Percoll: para preparação das colunas de Percoll foram adicionados 9 \nmi de Percoll® (Pharmacia, Upsala, Suécia) a 1 mi de Meio-199 (Instituto Adolfo \nLutz, São Paulo, Brasil), e a estes 1 O mi foram adicionados 1 O mi de meio de \nlavado (HAM-F1 O® com 20% de Soro Fetal Bovino (SFB)®, ambos da Cultilab, \nCampinas, Brasil). Alíquotas de 5 mi foram distribuídas em quatro tubos, \nmantidos sob refrigeração a 4° C. ( Tabela 1) \nMeio de Cultivo: foi usado o Meio-199 com 20% de Soro Fetal Bovino (SFB®) e \nL-Glutamina 2 mM (Sigma®, Estados Unidos). A preparação do meio de cultivo\nfoi realizada sob fluxo laminar utilizando-se material estéril. O Meio-199 é \nconstituído por uma combinação de vitaminas, aminoácidos, sais inorgânicos e \noutros componentes como fonte nutritiva definida para cultura celular. O Soro \nFetal Bovino, por sua vez, é composto por inúmeras substâncias ainda pouco \ndefinidas, porém é necessária sua adição para culturas celulares prolongadas \n(Fernandes; 2004). Foram adicionados 2 antibióticos ao meio de cultivo com \nobjetivo de evitar contaminação bacteriana: (1) Penicilina Cristalina (Cristalpen®, \nBiolab, Brasil) na concentração de 100.000 UI/mi e sulfato de estreptomicina \n(Estreptomicina®, FURP, Brasil) na concentração de 20 mg/ml (Tabela 1). \n40 \n\nTabela 1 - Preparo dos meios para cultivo de células da granulosa. \nMeio de Lavado 40ml \nHAM F10 32 mi \nSFB 20% 8ml \nColunas de Percoll 20 mi \nPercoll 9ml \nMeio 199 1 mi \nMeio de lavado 10 mi \nMeio de Cultivo 10 mi \nMeio 199 8ml \nSFB 20% 2ml \nEstreptomicina 50 µI \nPenicilina 10 µI \nL-glutamina 2,92 mg \nAntibióticos \nEstreptomicina 1 g \nH2O destilada 50ml \nPenicilina cristalina 5.000.000 UI \nH2O destilada 50ml \n41 \n\n3.8.1. Procedimento do Cultivo Celular: \nIsolamento das Células da Granulosa: Os grumos de células da granulosa, \npresentes no fluido folicular ou no lavado do aspirado folicular, foram captados \ncom pipeta Pasteur sob visualização em microscópio invertido (Coleman® ST-\n302L, Brasil), após a espera de que o sangue aspirado se depositasse no fundo \ndas placas de Petri, onde foram vertidos o fluido folicular e o meio de lavado \napós o isolamento dos oócitos. Os grumos celulares captados, então, foram \ntransferidos para outra placa contendo meio de lavado (HAM F10® e SFB®) \nonde, novamente, foi aguardado o tempo necessário para que as células \nsanguíneas se depositassem no fundo da placa de Petri. A seguir, o conteúdo \ndesta placa foi transferido, com pipeta Pasteur, para o tubo de Falcon e \ncentrifugado a 1500 rpm por 10 minutos a 4°C (centrífuga Spin VI®, lncibrás, \nBrasil). O sobrenadante foi, então, retirado e foram adicionados 2 mi de meio de \nlavado ao pellet, misturando-se bem com pipeta Pasteur, para que as células se \nseparassem. Este conteúdo, então, foi transferido delicadamente sobre as \ncolunas de Percoll preparadas previamente, e centrifugado a 500 rpm por 30 \nminutos a 4ºC. As células da granulosa ficaram na interface da coluna de \nPercoll, e foram captadas com pipeta Pasteur e, após, transferidas para outro \ntubo de Falcon estéril no qual foi adicionado 4 mi de meio de lavado para \nposterior centrifugação por 10 minutos a 1500 rpm a 4ºC. Por fim, deste \nconteúdo, foi desprezado o sobrenadante e o precipitado foi dissolvido em 1 mi \nde meio de cultivo, para posterior contagem da viabilidade das células da \ngranulosa. \n42 \n\nContagem e Viabilidade das Células da Granulosa: 50 µI da suspensão celular \nanterior foram colocados em tubo de hemólise e adicionados 450 µI de Azul de \nTrypan (Trypanblau®, Merck, Alemanha) a 0,4 % na diluição 1: 1 O. A seguir, este \nconteúdo foi colocado em uma câmara de Newbauer para contagem do número \nde células viáveis. Para calcular o número total, multiplicou-se o número de \ncélulas vivas contadas por 104 e pelo fator de diluição dez. As células mortas \nmostraram-se coradas pelo Azul de Trypan e as células vivas ficaram brancas \ncom aspecto refringente à visualização no microscópio óptico (Coleman® N 107, \nBrasil). Da suspensão celular obtida, após cálculo do número total das células \nvivas, calculou-se a concentração das células por placa de maneira que se \ntivesse uma concentração de 50.000 células por placa de cultivo. Para a \nrealização de todos os experimentos (6 experimentos em triplicata), era \nnecessária uma concentração total de, no mínimo, 900.000 células viáveis. \nCultivo Celular: as células foram cultivadas em placas de cultivo celular 35 x 1 O \nmm. Assim, foram colocadas 50.000 células da granulosa viáveis por placa de\ncultivo, e foi adicionado meio de cultivo de forma a completar um volume total de \n1 mi por placa de cultivo. O ensaio foi realizado em triplicata. Os cultivas \ncelulares foram mantidos em estufa com atmosfera gasosa a 5% de CO2 e em \ntemperatura de 37ºC por um tempo de 24 horas. Após esse período, os meios \nde cultivo foram aspirados e estocados a -20° C para posterior análise. \n43 \n\nCaptar os grumos tk céls \ncom pipeta Je Pasl<'llr \nTran,-,f.-rir p/ placa \ncontendo meio de \nlavado \nTransferir p/ \ntubo cônico \n.., ,,,. \nRetirar o \nsohrenaJante \no \nDissolver o \nprecipitado em \n2 mi Je meio de \nlavado \ni Colocar sobre a \ncoluna ele Percoll \nCentrifuqar \no 10mm \n1500 rpm \nCentr ifuqar \no 30 min \n500 rpm \nCaptar as CG na \ninterface da \ncoluna de Percoll \nTransferir para tubo \ncônico contendo 4 mi de \nmeio de lavado \nCentrifuqar \nDesprezar o \nsobrenadante \no Dissolver o precipitado em \n1 mi de meio de cultivo \no 10mm \n1500 rpm \nContagem das celulas \nna Câmara de \nNewbawer \nFigura 5 - Esquema do procedimento de cultivo de células da granulosa (Fernandes, \n2004). \n44 \n\n3.9. Atividade da Aromatase \nA atividade da enzima aromatase nas células da granulosa em cultivo \ncelular in vitro foi medida através da produção de estradiol frente à adição de \ntestosterona (substrato da aromatase) ao meio de cultivo. A testosterona® \n(Sigma, Estados Unidos) foi adicionada ao meio de cultivo nas concentrações \nfinais de 2x10 -6 Me a 2x10- 5 M. O tempo de incubação foi de 24 horas em estufa \ncom atmosfera gasosa a 5% de CO2 e em temperatura de 37°C e, \nposteriormente, foi dosado o estradiol produzido, através de radioimunoensaio \n(DPC Medlab, EUA). Para controle, foi avaliada a produção de estradiol quando \nnão foi adicionada testosterona ao meio de cultivo. Este método foi aplicado \npara os dois grupos (com e sem endometriose). \n45 \n\n3.1 O. Experimentos realizados \nPara cada paciente selecionada (tanto no grupo com endometriose como \nno grupo controle), foram realizados 6 experimentos diferentes, em triplicata, \ncom adição reagentes específicos a cada um deles. \nOs reagentes utlizados foram: testosterona (Sigma, Estados Unidos); \nFSH (Recombinant human FSH for B/0 studies, Serona, Estados Unidos) e IGF-\n1 (Human IGF-1 for BI0 studies, Serona, Estados Unidos), ambos na \nconcentração final de 50 ng/ml. A testosterona foi adicionada como substrato da \nenzima aromatase (Harlow et ai., 1996); e os reagentes FSH e IGF-1 como \nestimuladores da ação da aromatase (Erickson et ai., 1989; deMoura et ai., \n1997; Fernandes, 2004). \nExperimento 1: somente células da granulosa; \nExperimento 2: Células da granulosa + Testosterona (2 x 10\"6M); \nExperimento 3: Células da granulosa Testosterona a (2 x 10·5 M); \nExperimento 4: Células da granulosa+ FSH e IGF-1 (50 ng/ml); \nExperimento 5: Células da granulosa + Testosterona (2 x 1 o·6M) + FSH e \nIGF-1 (50 ng/ml); \nExperimento 6: Células da granulosa + Testosterona (2 x 1 o·6M) + FSH e \nIGF-1 (50 ng/ml). \n46 \n\n3.11. Dosagens Hormonais \n3.11.1. Estradiol \nA determinação quantitativa do estradiol no fluido de cultivo celular foi \nrealizada através de radioimunoensaio no laboratório de Ginecologia e \nObstetrícia, Hospital das Clínicas, FMRP, Ribeirão Preto, São Paulo. Utilizou-se \no kit Double Antibody, fase sólida, da DPC, USA, com sensibilidade de 1,4\npg/ml. A medida da radioatividade gama para o isótopo 1125 foi realizada pelo \naparelho Cobra li Auto-Gama®, Brasil. O erro intra-ensaio foi de 5,8%. \nHouve amostras que necessitaram de diluição, que foram feitas \nutilizando-se o meio 199. \n3.11.2. Progesterona \nA determinação quantitativa de progesterona no fluido de cultivo celular \nfoi realizada através de quimioluminescência no laboratório de Ginecologia e \nObstetrícia, Hospital das Clínicas, FMRP, Ribeirão Preto, São Paulo; utilizando­\nse kit da DPC, USA e leitura no aparelho lmmulite 2000®, também da DPC. A \nsensibilidade foi de 0,2 ng/ml e algumas amostras necessitaram de diluição \nrealizada com meio 199. O erro intra-ensaio foi de 4,9%. \n47 \n\nPara excluir a presença de estradiol, progesterona ou testosterona nos \nmeios de cultivo que pudessem interferir nos resultados, foram realizadas as \nrespectivas dosagens em seus componentes: 1 )Meio 199®; 2)SFB® ; 3) HAM­\nF1 O®, todos indetectáveis através de radioimunoensaio (Fernandes, 2004; Silva, \n1997). \n3.12. Análise Estatística \nPara a análise dos dados, primeiramente foi realizado o teste da \nnormalidade para os dados referentes às dosagens de estradiol e progesterona \nnos fluidos de cultivo celular. Os dados apresentaram distribuição gaussiana \nverificados através do teste KS, porém as variâncias foram diferentes em alguns \ngrupos analisados, dessa forma, foi usada a correção de Welch ou a \nnormalização da variável para fins de análise estatística. Os resultados foram \ncomparados entre os dois grupos (controle e endometriose) através do teste T \nnão pareado. Para comparações dentro de um mesmo grupo (controle ou \nendometriose), foi realizado o teste T pareado. \nO programa usado para realização dos cálculos estatísticos foi o \nGraphPad Prism® versão 3.0. \nConsiderou-se um nível de significância de 5% ( p <0,05). \n48 \n\n4. Resultados\n4.1. Características clínicas das pacientes do estudo \nA idade das pacientes variou de 28 a 37 anos de idade, e não houve \ndiferença estatística quanto à idade entre os grupos controle e endometriose (p= \nO, 1450) (Tabela 2 e 3). Do total de 16 pacientes, 14 eram nuligestas e 04 já \nhaviam engravidado previamente, 02 do grupo com endometriose tiveram um \naborto de primeiro trimestre e 02 pacientes do grupo controle tiveram filhos (uma \ndelas teve uma cesárea prévia e outra, 03 partos vaginais). \nQuanto ao tempo de infertilidade, 13 do total de 16 pacientes tinham um \ntempo de infertilidade superior a quatro anos, somente 03 pacientes tinham \ntempo inferior a 4 anos (uma delas com 1 ano e outra com 02 anos de \ninfertilidade). Quatorze pacientes já tinham realizado tratamentos prévios de \ninfertilidade e somente 2 delas ainda não tinham realizado nenhum tipo de \ntratamento. (Tabelas 2 e 3) \nDo total de 08 pacientes do grupo controle, 05 delas tinham fator tubáreo \n(uma delas com laqueadura prévia e as outras com provável etiologia infecciosa) \ne 03 pacientes apresentavam fator masculino (uma delas com parceiro com \noligospermia moderada e as outras 02 pacientes apresentavam parceiros com \nasteno e teratozoospermia). No grupo com endometriose, 03 pacientes \napresentavam endometriose grau leve, 01 tinha grau mínimo, 03 delas grau \nmoderado e 01 grau severo ou grave. (Tabelas 2 e 3) \n49 \n\nTabela 2 - Características clínicas das mulheres do grupo controle: idade, tempo de \ninfertilidade, tratamentos de infertilidade prévios e causa da infertilidade. (DP = desvio­\npadrão). \nw - rn w w \nrn e rn owc c(cw o cC - o t- e e( e� 1-\na.. g f/) \nz z rn e z o �..JQ e( WQ::J e( ::J w z - �-- rn-w i= z w c(>I- :::, 1-\n1- a::: e( e 1- •W 0:: e( a::: � w- e( � a::: w o�LI.. e a.. LI.. z \n1- � z\n01 10 32 CC + IUI (1) Fator masculino \n02 05 33 FIV + ICSl(7) Fator masculino \n03 05 28 Fator masculino \n04 02 33 FIV (1) Fator tubáreo \n05 >4 32 FIV (1) Fator tubáreo \n06 11 37 Fator tubáreo \n07 >4 35 CC Fator tubáreo \n08 05 34 FIV(1) Fator tubáreo \nMédia± DP 33 ± 2,62 \n50 \n\nTabela 3 - Características clínicas das mulheres do grupo com endometriose: idade, \ntempo de infertilidade, tratamentos de infertilidade prévios, classificação da endometriose \ne antecedente familiar de endometriose. (DP = desvio-padrão). \nw -rn e rn \no \ne( \n-\no w \no. 9 tn z z o :5::!0 e( \nw z -\nw .... z w \n(.) .... o:: li( e e( w- e( 0. L&. e z \n01 6 30 \n02 10 34 \n03 11 32 \n04 08 28 \n05 01 29 \n06 02 28 \n07 >4 33 \n08 04 34 \nMédia± DP 31 ±2,56 \nC/) w owc ..,. e e( \nz rn e\nWQ:::::J :5 --\ne( > .... 1--•W O::\n�,x:W\n0. L&. \n.... � \nCC \nFIV(1) + \nTEC(1) \nCC \nICSI (1) \nICSI (1) \nFIV(1) + \nICSl(2) \nICSI (1) \nIUI (2) \no wrn 1<( \no, o\ne( ii: o e( .... \nU:::cW - :e \ntn o rn e :3 z o w\nleve \nleve \ngrave \nmoderada \nmoderada \nmoderada \nmínima \nleve \nwwwCI) .... co z -w a:: a:: e e( ..,. \nw-w\n(.) :::! :5 w :::E o..,. e( ez L&. z e( w \nNão \nnão \nNão \nSim (mãe) \nSim (irmã) \nNão \nNão \nNão \nEm relação ao protocolo de hiperestimulação ovariana, os dados estão \nrepresentados abaixo (tabela 4): \n51 \n\nTabela 4- Características da hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI das \npacientes do grupo com endometriose e controle, quanto à duração do bloqueio \nhipofisário; tipo da gonadotrofina usada (FSHr ou HMG), dias de indução e unidades \ntotais de gonadotrofinas usadas. * variâncias estatisticamente diferentes. \nU) o o e( w o e( \nw U) a:: e w o e a:: e \n1- :::::, cu - w 1- e( e \n1<( e( 1- e( :e U) e o U) e o z o o a::e( o e U) \ne( o, j::: w e U) \nz :::::, ::, e 0.. z a CL e( <( e e z e( e( :E � - j:: z e( z e( w o z o z :::::, o z\n1- C) ii: z a C) ii:\nControle \n01 21 FSHr 10 2200UI \n02 33 FSHr 12 5250UI \n03 21 FSHr 09 2250UI \n04 22 FSHr 11 2050UI \n05 20 FSHr 10 2850UI \n06 20 FSHr 08 2400UI \n07 20 FSHr 10 3000UI \n08 30 FSHr 10 2000UI \nMédia± 5D 23,38 ± 5,12 10 ± 1,19 2750 ± 1072 * \nEndometriose \n01 17 HMG 10 2150UI \n02 21 FSHr 11 3300UI \n03 20 FSHr 08 1800UI \n04 21 FSHr 10 2250UI \n05 19 FSHr 11 1700UI \n06 19 FSHr 08 1600UI \n07 19 FSHr 10 2000UI \n08 22 FSHr 12 2400UI \nMédia± 5D 19,75 ± 1,58 10±1,41 2150 ± 540,5* \n52 \n\nAinda em relação ao procedimento de hiperestimulação ovariana \ncontrolada, não houve diferença significativa quanto ao tempo do bloqueio \nhipofisário (p = 0,0766), dias de indução (p = 1,0) e quantidade de gonadotrofina \nusada (p = 0,5760). Das 16 pacientes do estudo, 13 delas utilizaram a nafarelina \ncomo agonista do GnRH para bloqueio hipofisário. Somente 03 pacientes \nutilizaram o acetato de leuprolide. Somente uma paciente com endometriose \napresentou a síndrome de hiperestimulação ovariana grau leve. \nAs características da captação de oócitos e da transferência embrionária \nestão descritas na tabela 5. Não houve diferença estatística quanto ao número \nde folículos puncionados (p = 0,7844) e número de oócitos captados (p =\n0,6619) entre os grupos controle e endometriose. \n53 \n\nTabela 5 - Características da captação de oócitos e transferência embrionária para FIV e \nICSI nos grupo controle e endometriose. \nti) ti) ti) ti) \nti) o o ti) ti) w o w ..J e o o ,o ::, u,0M U,0 M � u-\"\"\" z u, .... C,0M u, .... C,0M �z � -E-- M - E--M\ne,� �- � z E-< c,�-��Z E--< < e, o e, � 00 < �oo< \n���� ���< e,�:< u s�z � - -�z � E-- -- - - E-z -- - E--z \n116 113 139 203 127 149 \n01 131 111 143 120 100 97,6 \n86,6 138 143 157 134 187 \n8,48 9,05 6,69 6,97 8,35 6,29 \n02 9,24 5,84 8,92 8,39 5,04 12 \n4,56 6,44 7,76 7,71 8,52 10 8 \n489 408 348 548 468 773 \n03 442 311 209 167 X 381 \n379 430 262 491 614 362 \n301 271 278 465 283 231 \n04 271 229 197 356 256 216 \n363 288 215 587 363 X \n318 177 272 138 390 520 \n05 189,5 142,5 115 173 478 653 \n136 165,5 110,5 145 189,5 765 \n136 314 108,5 253 149,5 118,5 \n06 253 106,8 125,5 254 281 154 \n121,5 147 98,8 133 249 158 \n444 192 303 317 512 224 \n07 222 171 206 281 266 684 \n238 215 232 214 213 317 \n919,5 487 240 962 421 513 \n08 X 707,5 X 265 X 318 \n515 492 267 703 476 315 \nApêndice 02 - Níveis de progesterona em ng/ml de fluidos de cultivo celular de células da granulosa de mulheres inférteis com endometriose submetidas à \nreprodução assistida {FIV ou ICSI). x = valores desconsiderados. \n\n00 \n.i:,. \n00 - r;;r;lº\ni r;;r;lo �� i� �����, r.;i r;;r;l M� � !\"')��i � � ...::1 \nOO�b ºº �.,, \nZo ºº � b oor-. =- oor-....::i�� \n�� ll-1< 00 � �•< 00 � Q..1< r;;r;l c::5 Q..1E--0= \nu e� .... oo� � � .... �zoo� � \n< Ç,!)�� \nN Ç,!)�� \nN \n\"'��� C�c,�� N u � - - - ,,_,..,. _ .... \n175,58 560,20 6379,00 X 542,30 \n01 99,86 488,00 6601,20 157,82 537,90 \n119,28 674,26 5904,20 156,12 539,30 \n52,20 59,10 191,50 52,93 117,30 \n02 64,89 50,90 331,60 82,46 96,80 \n30,15 76,80 276,80 80,93 89,30 \n987,20 838,78 914,8 884,85 1449,9 \n03 X 852,70 1070,9 907,0 1503,0 \n708,20 X 1006,7 865,89 1530,32 \n460,07 652,60 2633,5 541,61 681,15 \n04 404,98 778,75 2115,2 470,19 658,03 \n556,17 703,39 2283,8 713,87 767,84 \n305,2 619,24 1692,5 250,31 512,13 \n05 347,76 513, 18 1818,8 292,88 X \n252,39 577,62 1794, 1 259,34 642,62 \n358,7 X 834,2 X 351,9 \n06 478,7 496,3 943,8 349,7 388,6 \n370,9 302,8 1149,0 300,85 411,8 \n386,0 384,4 752,9 X 568,2 \n07 403,0 373,5 745,9 358,7 443,9 \n336,1 363,2 634,9 340,5 388,6 \n350,2 424,1 556,4 436,1 339,4 \n08 648,7 X 919,7 311,7 X \n273,8 X 578,1 334,9 775,5 \nApêndice 01 - Níveis de estradiol em pg/ml de fluidos de cultivo celular de células da granulosa de mulheres inférteis com \nendometriose submetidas à reprodução assistida (FIV ou ICSI). x = valores desconsiderados. \n�= o \\C�rl.)��ioor..�E-<'b �•< � �00 .... \nªu-... co� \n\"'�\n--\n���< e lfl � z _.... E-o \n4857,20 \n4487,40 \n5801,90 \n414,10 \n389,80 \n302,15 \n1597,9 \n1139, 1 \n938,80 \n2484,6 \n2045,6 \n1874,7 \n2520,6 \n3040,0 \n3244,0 \n1123,9 \n1255,3 \n1260,2 \n613,1 \n903,0 \n812,9 \n746,6 \n731,8 \n519,5 \n\nANEXOS \n86 \n\nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \nEu, - --------------------- --- -\nabaixo assinado, tendo sido devidamente esclarecida sobre todas as \ncondições do documento \"ESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA\" \n(anexo 2), de que se trata o Projeto de Pesquisa intitulado \"ATIVIDADE DA \nAROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE PACIENTES COM \nENDOMETRIOSE SUBMETIDAS À TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO \nASSISTIDA\", que tem como pesquisadora responsável a mestranda Lauriane \nGiselle de Abreu, sob orientação do Prof. Dr. Marcos Dias de Moura, \nespecialmente no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos \na que serei submetida, aos riscos e benefícios, à forma de ressarcimento no \ncaso de eventuais despesas, bem como a forma de indenização por danos \ndecorrentes da pesquisa, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e \ndas condições que me foram asseguradas, a seguir relacionadas: \n1. A garantia de obter resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de\nqualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de\noutras situações relacionadas com a pesquisa e o tratamento a que\nserei submetida;\n2. A liberdade de retirar o meu consentimento e deixar de participar do\nestudo a qualquer momento, sem que isso traga prejuízo à\ncontinuidade do meu tratamento;\n87 \n\n3. A segurança de que não serei identificada e que será mantido o caráter\nconfidencial da informação relacionada à minha privacidade;\n4. O compromisso de que será prestada informação atualizada durante o\nestudo, ainda que esta possa afetar a minha vontade de continuar dele\nparticipando;\n5. O compromisso de que serei devidamente acompanhada e assistida\ndurante todo o período de minha participação no projeto, bem como de\nque será garantida a continuidade do meu tratamento após a conclusão\ndos trabalhos da pesquisa.\nDeclaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que foram \napresentadas e que, livremente, manifesto a vontade de participar do referido \nprojeto. \nRibeirão Preto, __ de _______ de __ _ \nAssinatura da paciente \n88 \n\nESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA \n1. TITULO DA PESQUISA:\n\"ATIVIDADE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE \nPACIENTES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE \nREPRODUÇÃO ASSISTIDA\" \n2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL:\nLAURIANE GISELLE DE ABREU, CRM/SP Nº 111.248 (ALUNA de \nMESTRADO NA LISP/RIBEIRÃO PRETO) \n3. ORIENTADOR:\nPROFESSOR DOUTOR MARCOS DIAS DE MOURA, CRM Nº 49.816/SP \n4. PROMOTORA DA PESQUISA:\nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE \nDE SÃO PAULO. \nVimos, por meio desta, solicitar sua participação neste estudo. \nEle tem como objetivo testar a hipótese de que a aromatase (uma \nenzima, ou seja, uma substância que o organismo produz normalmente que se \nrelaciona com o funcionamento do oócito, ou óvulo), e que estaria alterada nas \ncélulas da granulosa (células componentes do oócito), presentes no fluido \nfolicular (líquido que fica junto ao oócito). Isto será verificado em pacientes \n89 \n\nnormais (sem endometriose) e naquelas que possuem endometriose (doença \nna qual as células do endométrio, que correspondem à camada interna do \nútero, se implantam em outros locais fora do útero). \nEstamos propondo este estudo pois pesquisas similares apontam para \nesta alteração nestas pacientes com endometriose e isto poderia ser um fator \ncorrelacionado à infertilidade e resultados insatisfatórios apresentados por \nestas pacientes nas Técnicas de Reprodução Assistida (FIV - Fertilização in \nVitro e ICSI - Injeção lntracitoplasmática de Espermatozóide, ou seja, técnica \nem que se injeta o espermatozóide dentro do óvulo). \nDesta maneira, estamos propondo este estudo que constará de 2 \ngrupos: (1) grupo de pacientes sem endometriose e (2) grupo de pacientes \ncom endometriose, todas submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV \nou ICSI). No final do estudo, realizaremos a comparação entre estes dois \ngrupos e checaremos se há diferença na atividade da aromatase nas células \nda granulosa destas pacientes e também se há diferenças nos resultados da \nFIV ou da ICSI. \nParticipando deste projeto, você receberá o tratamento da \nmesma forma que as pacientes que não participam, com todos o exames e \nrecursos disponíveis para melhor atendê-la. \nDurante a coleta de oócitos para a FIV ou ICSI, é aspirado o fluido \nfolicular que contém o oócito que será utilizado. Este fluido, normalmente, \ndepois é desprezado. Neste projeto pretendemos, com o seu consentimento, \nusar este fluido contendo as células da granulosa para pesquisar a atividade \nda enzima aromatase, como já foi exposto previamente. Não será necessário \n90 \n\nsubmeter-se a nenhum procedimento adicional, além do que já ocorre \nnormalmente no processo da FIV ou da ICSI. \nInformamos que seu nome e seus dados pessoais não aparecerão no \ntrabalho ou em outro meio de informação, ou seja, o sigilo será mantido. \nAlém disso, a qualquer momento você poderá solicitar sua saída do \ntrabalho, se assim desejar, sem nenhum prejuízo à continuação de seu \ntratamento neste serviço. \nFicamos à disposição para esclarecer todas as dúvidas que \nsurgirem, inclusive sobre o andamento da pesquisa e seus resultados. \nOs pesquisadores. \n91 \n\nProtocolo de Pesquisa \nGrupo \nProcedimento \nNome \nRG \nDiagnóstico \nAntecedentes Pessoais \nCirurgias Prévias \n( ) Caso \n) FIV \nParidade G ...... P ...... c ........ A ..... . \nEndometriose ( )mínima ( )leve \n( ) fator masculino - ( ) oligo \n( ) fator tubáreo \n( ) ESCA ( ) outros -......... .. \n( ) Controle \n( ) ICSI \nIdade \nFilhos Vivos \n)moderada \n( ) terato \nAntecedente Familiar ( )endometriose Grau de Parentesco ..... . \nTempo de Infertilidade ....... anos \n....... anos \n. .............. \n) grave \n( ) asteno \nTratamentos de ( ) sim - ( ) Clomifeno ( ) IUI ......... ( )FIV.......... ( ) ICSI .............. . \ninfertilidade anteriores ( ) não \nLaparoscopia Data -... / ... ./,,,,, \n(descrição) \nAnátomo patológico \nHisteroscopia \nHisterossalpingografia \nEspermograma \n( ) não ( ) sim .......................... . \nData -.... / .... / .... ............................... . \nData -... / .... / .... ................................ . \n.......... mi Nº ........ Milhões/mi Vitalidade ....... % \nA ....... % B ........ % C ....... % \nNº spz móveis no \nrecuperadoNº ...... \nD ....... % Morfologia ....... % (Kruger) Milhões/mi \nFSH \nProtocolo de indução \nMedicamento \nAnálogo GnRH \nFolículos puncionados \nData ... / .... /..... nível. ............. ng/dl \nNº dias ........... .. \n( ) FSHr -dose................................. ( ) outros - nome -\n( ) HMG -dose................................. - dose \n( )agonista - nome......................... ( )antagonista -\nnome .................... . \nNº de oócitos captados \nNº \ndias ........... . \n........... % \n92 \n\nNº de embriões formados .......... \ntransferidos .......... \nEndométrio no dia da Transferência ....................... mm \nPassagem do catéter ( ) fácil \nComplementação lútea ( ) duphaston 30 mg/dia \nCultivo N \nNo de células \nData da incubação ....... /....... ,....... \nDosagem estradiol 1.1 \n2.1 \n3.1 \n4.1 \n5.1 \n6.1 \nPHCG ( )pos \nGravidez clínica ( )s im \nNº sacos ( ) 1 ( \ngestacionais + \nlntercorrências \nGrupos: \n1. Célula + meio cultivo\nng/ml \n( ) neg \n( ) não \n) 2 ( ) 3 ou \n1.2 \n2.2 \n3.2 \n4.2 \n5.2 \n6.2 \nAborto \nQualidade: \n( ) difícil -\n( ) crinone gel 8% \nData da retirada \n1.3 Média \n2.3 \n3.3 \n4.3 \n5.3 \n6.3 \n( ) não ( )sim \n2. Célula + 20 1,.11 solução mãe Testosterona + meio de cultivo\n3. Célula + 200 1,.11 solução mãe Testosterona + meio de cultivo\n4. Célula+ 10 1,.11 FSH + 10 1,.1I IGF-1 + meio de cultivo\n1 \n2 \n3 \n4 \nespecificar: \n( ) outro \n....... /........ /....... \nMediana \n5. Célula +20 1,.11 de solução mãe Testosterona+ 10 1,.11 FSH + 10 µI IGF-1 + meio de cultivo\n6. Célula+ 200µ1 de solução mãe Testosterona+ 10 1,.11 FSH + 10 µI IGF-1 + meio de cultivo\n93 \n\nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA \nDE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nCEP. 14048-900 \nRIBEIRÃO PRETO· S.P. \nBRASIL \nCAMPUS UNIVERSITÀRIO • MONTE ALEGRE \nFONE: 602-1000 • FAX (016) 633-1144 \nRibeirão Preto, O 1 de setembro de 2004 \nOficio nº 2501/2004 \nCEP/SPC \nPROCESSO HCRP nº 5694/2004 \nSenhor Professor: \nO Comitê de Ética em Pesquisa, em sua 187ª\nReunião Ordinária realizada em 30/08/2004, tomou conhecimento e\naprovou a recomendação solicitada pela CONEP, em Parecer nº\n1492/2004, referente ao Projeto de Pesquisa intitulado: \"ATIVIDADE \nDA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE PACIENTES COM \nENDOMETPJOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO \nASSISTIDA\". \nAproveito a oportunidade· para renovar a \nVossa Senhoria protestos de estima e consider�ção. _____ ..,.\nIlustríssimo Senhor \nPROF. DR. MARCOS DIAS DE MOURA \nLAURlANE GISELLE D� ABREU (Aluna) \nDepto. de Ginecologia e Obstetrícia \nEm mãos \n94 \n\nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO-USP \nDEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA \nAv. Bandeirantes, 3900 - 1º andar. Ribeirão Preto-SP • CEP 14049- 900 \nFone (016) 633-0216 - Fax (016) 633-0946 \nS11tor de Reprodução Humana 1 \nREPRODUÇAO ASSISTIDA \nTERMO DE CONSENTIMENTO \nEu .......... ....... ....... .. ..................... .. ...... .. .......... .. .... ............ .... .. .. ........... ........................ ............ ... .......... ..... ..... ........ ...... ........... . \ne aneu m;;irido ........ ...... .. .. .. .... ......... . .. ... . ... ....... ...... . . .. ..... ... ... . .. . ... . .. ....... ... ...... .. ..... ..... ........... ...... ... ... .. ..... .. . .... ..... ......... ... ........... . \nnos �ub111e1emos livrt:menh:: 11 p11rticip11r tlc proct.-mu1tl11,'I ili: 1111c: 11 ICSI é lcs:nii:11 i11lm1hr,.i1l11 ,1,:-ul,! 11)1111'. nh� 1111111t1w11l1111111L11l1�, �,J111111111111111111!1111 1ili1H'i rlt• \n11111ltiirnu1ç1� li.-t11i:c 1111:1 '-'fin11c;11:1 1v1:u:id11s llfKl!I c:tln lcs:nicn nllu silo c1>111:hL'IÍv11�. IIUL'I nllo �ll!.(Clcm lu1vc1 c:tlc 11111111:ntu c111 1 dm;Jlu 1111 \nesperado cm gestações csponlãncas. Isentamos a equi pe de profissionais responsáveis pelo nosso tratamento de qua lquer distürbio \ngcstacional e: anomalia c:ongênilll ou 1naltormaçilo fütal que por vcntum venham 11 ocorrer, Imito dn rcnlizu çilo de FIV como de ICSI. \n96 \n\nCONGELAMENTO DE EMBRIÕES \n§ SIM \n. N\nÃ\nO \nNÃO SE APLICA \n. No decorrer �e um ciclo de _fertilização in vi lro (FIV) ou de núcromauipuloção de gamelas (iCSI) pode ser produzido umnumero mmor de cmhnõcs do que o numero que pode ser trnnslcriúo no mesmo ciclo. Caso existmn cmhrifü:s excedentes, os mesmospoderão ser cong elados. Concordamos co1� o congelamento 110 dia a ser determinado pcln ,:qtúpc mcúic;i. Estamo:. cientes que apósdc:scongclamc:nlo. algmlS ou lodos os cmbnõ.:s podem não sobreviver ao proccs.<;tl de congclamculo.\nConcordamos com 11 estOC11gem dos embriões congclodo!I por um pcrtodo máximo de 3 imos. /\\pós 3 anos de cstoc:ngcm dost.inbriões con gelatlos, cnS<> niio desejemos a trnn.�fercnci11 cios c:mbriiies dt.\"SCongelodos e \\'Ínvcis, cunconlmnos com a Joaçüo :111õ11imndos embriões pnrn outro(�) cnsnl(is) que dcseje(m) gravidez. \n. Cn .so ucorrn 1> liilccima,10 de llOl dos cônjuge., ou de n mbos, divórcio ou doença.,; graves em 1un ou .:111 ambos <>S ciinjugcs,que mcnpocucm o(s) m.:.o;mo(s) a tomor(em) <.lc:cisõc.'I. autori1.nmos 11 rcscrvndos porauutro(s) ca:;o�is) que dcscje(m) gravidez. \nNo uio