Modulazione dell’espressione endometriale del pathway di VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto

Introduzione L ’impianto è il processo in cui la blastocisti aderisce alla mucosa uterina e penetra nell’endometrio oppor- tunamente preparato da una corretta sequenza di even- ti, regolati da ormoni ovarici e da fattori embrionali e ca- ratterizzati da un’intensa proliferazione cellulare, rimo- dellamento vascolare, angiogenesi. L ’angiogenesi, processo caratterizzato dallo sviluppo di nuovi vasi, è indotta da RIASSUNTO: Modulazione dell’espressione endometriale del pathway di VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto. F. CAPRIO, L. I ZZO, A. N OCERINO, A. P ANARIELLO, I. P ISANI, A. GRIMALDI, S. LEO, M. E. SALZILLO, L. COBELLIS Introduzione. È stato ipotizzato che un’alterazione dell’angioge- nesi possa essere responsabile dei difetti di impianto in alcune condi- zioni di sterilità primaria ed associata ad endometriosi. VEGF e Not- ch sono molecole che partecipano in maniera rilevante ai processi an- giogenetici. Lo scopo dello studio è valutare l’espressione endometriale di Notch-1 e VEGF nelle varie fasi del ciclo endometriale di donne af- fette da endometriosi e da sterilità idiopatica in confronto a controlli sani. Materiali e metodi. È stata esaminata, con metodica immunoi- stochimica, l’espressione di VEGF e Notch nell’endometrio prelevato in fase proliferativa e secretiva in tre gruppi di pazienti. Gruppo A: con- trolli sani. Gruppo B: donne sterili affette da endometriosi. Gruppo C: donne con sterilità primaria. Risultati. Nel gruppo A l’espressione del VEGF è lieve nella fase proliferativa e moderata in quella secretiva, mentre l’espressione di Notch-1 si mantiene costantemente elevata nelle due fasi. Nel gruppo B il pattern di espressione del VEGF è invertito e l’espressione di Not- ch-1 è lieve nelle due fasi. Nel gruppo C l’espressione del VEGF e Not- ch-1 si mantiene bassa durante tutto il ciclo. Conclusioni. VEGF e Notch hanno un ruolo potenzialmente ri- levante nella modulazione del rimodellamento vascolare dell’endome- trio nei difetti di impianto. S UMMARY: VEGF and Notch-1 endometrial pathway in implantation failure. F. CAPRIO, L. I ZZO, A. N OCERINO, A. P ANARIELLO, I. P ISANI, A. GRIMALDI, S. LEO, M. E. SALZILLO, L. COBELLIS Background. It has been suggested that an impaired angiogenesis could be responsible for implantation failure in some patients affected by primary infertility or endometriosis. VEGF and Notch play a rele- vant role in angiogenesis. The aim of this study was to evaluate the ex- pression of Notch and VEGF in both proliferative and secretive endo- metrium from women affected by endometriosis or primary infertility as compared to healthy controls. Material and methods. Expression of VEGF and Notch were analyzed by means of histochemistry in proliferative and secretive en- dometrium from three groups of patients: healthy controls (group A), women affected by endometriosis (group B), women with primary in- fertility (group C). Results. In group A the expression of VEGF was mild in prolife- rative phase and moderate in secretive phase, while the expression of Notch 1 was high in both phases. In group B the expression pattern of VEGF was reversed as compared to group A and the expression of Not- ch1 was mild in both phases. In group C the expression of VEGF and Notch 1 was mild in both phases. Conclusions. VEGF and Notch play a potentially critical role in the modulation of vascular remodeling of endometrium in implanta- tion failures. Modulazione dell’espressione endometriale del pathway di VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto F. CAPRIO, L. IZZO, A. NOCERINO, A. PANARIELLO, I. PISANI, A. GRIMALDI, S. LEO, M. E. SALZILLO, L. COBELLIS Giorn. It. Ost. Gin. Vol. XXXII - n. 2 Marzo-Aprile 2010 87 Seconda Università di Napoli Dipartimento di Scienze Ginecologiche Ostetriche e della Riproduzione © Copyright 2010, CIC Edizioni Internazionali, Roma KEY WORDS: Impianto - Angiogenesi - VEGF - Notch - Endometriosi - Sterilità primaria. Implantation - Angiogenesis - VEGF - Notch- Endometriosis - Primary infertility. © CIC Edizioni Internazionali una serie di molecole tra le quali il VEGF (vascular en- dothelial growt factor) ha sicuramente un ruolo rilevan- te: esso è, infatti, un fattore di crescita con spiccata at- tività mitotica sulle cellule endoteliali delle quali favo- risce la migrazione ed agisce come vasodilatatore au- mentando la permeabilità vascolare. Alcuni Autori han- no evidenziato che il VEGF partecipa in maniera si- gnificativa ai processi angiogenetici a livello endometriale ed in particolare alla preparazione dell’endometrio al- l’impianto e all’invasione del trofoblasto (1, 2). Recentemente è stato evidenziato un nuovo recetto- re transmembrana, appartenente alla famiglia dei fatto- ri di crescita endoteliali, che interviene nei processi di pro- liferazione, differenziazione cellulare e apoptosi, noto come Notch. Si riconoscono quattro isoforme (N1-4) funzio- nalmente correlate, ciascuna delle quali è una proteina transmembrana costituita da una porzione extracellula- re con sequenze ripetute EGF-like che consentono il le- game con due differenti tipi di ligando, Delta e Jagged, anch’essi proteine transmembrana con sequenze EGF- like ripetute. A seguito dell’interazione tra Notchcon uno dei suoi ligandi si osserva il distacco, per clivaggio pro- teolitico, del dominio intracellulare (Notch Intracellular Domain - NID) che trasloca nel nucleo e modula la tra- scrizione di vari geni. Insieme ai suoi ligandi, Notch è espresso in diversi tessuti umani ed è coinvolto nella neu- rogenesi, nell’epatogenesi, cancerogenesi e nella vascu- logenesi (3). Nostri studi preliminari hanno evidenzia- to, inoltre, che Notch-1 è implicato in maniera signifi- cativa nel rimodellamento vascolare dell’endometrio fi- siologico e patologico (4) mentre altri Autori hanno pro- posto un suo coinvolgimento nell’impianto (5). Numerosi studi hanno dimostrato che un’alterazio- ne dell’angiogenesi è responsabile dei difetti di impian- to e della mancata progressione della gravidanza (6, 7) in numerose condizioni sia idiopatiche sia secondarie. In particolare nelle pazienti sterili affette da endometriosi è stata dimostrata un’alterazione dell’impianto embrio- nario che sarebbe responsabile, insieme ad altri fattori, della sterilità (8). Lo scopo dello studio è quello di valutare l’espressione di Notch-1 e del VEGF nelle varie fasi del ciclo endo- metriale (secretiva e proliferativa) di donne affette da en- dometriosi e da sterilità idiopatica in confronto a con- trolli sani. Materiali e metodi Il campione oggetto del nostro studio è composto di tre gruppi. Gruppo A. Campioni di endometrio sono stati ot- tenuti da donne con fertilità confermata dalla presenza nell’anamnesi ostetrica di almeno due gravidanze insorte spontaneamente. Sono state reclutate pazienti con età compresa tra i 25 e 40 anni che si sottoponevano ad in- terventi ginecologici per patologia non endometriale. Sono stati raccolti 10 campioni di endometrio in fase proli- ferativa e 10 campioni in fase secretiva. Gruppo B. Campioni di endometrio eutopico di don- ne affette da endometriosi sono stati ottenuti da pazienti di età compresa tra i 25 e 40 anni che si sottoponevano ad interventi di laparoscopia operativa per cisti endo- metriosica. Sono stati raccolti 5 campioni di endome- trio prelevato durante l’intervento eseguito in fase pro- liferativa e 5 campioni prelevati in fase secretiva duran- te isteroscopia precedente l’intervento. Gruppo C. Campioni di endometrio di donne con infertilità inspiegata che si sottoponevano ad isterosco- pia diagnostica prima di un ciclo di fecondazione in vi- tro. Abbiamo ottenuto 5 campioni di endometrio in fase proliferativa e 5 campioni di endometrio in fase secre- tiva per ogni paziente reclutata. Subito dopo la raccolta, i campioni tissutali, della gran- dezza di circa 1 cm, sono stati lavati in soluzione fisio- logica, per eliminare sangue e coaguli, e fissati in for- malina. Per un’adeguata valutazione immunoistochimica, le biopsie sono state disidratate attraverso passaggi in di- luizioni decrescenti di etanolo e chiarificate in xilene. Così si è potuto procedere all’inclusione in paraffina. Una volta solidificato il blocchetto, sono state tagliate sezioni di 5 µm, montate su vetrino porta oggetto e asciu- gate durante la notte a 37°C, in seguito sono state co- lorate con ematossilina-eosina. T utte le sezioni sono state sparaffinate in xilene, rei- dratate attraverso passaggi in diluizioni di alcool crescenti e successivamente lavate in soluzione salina tamponata con i fosfati (PBS). Le sezioni di tessuto, poste in una camera umida per evitare che andassero incontro ad es- siccamento, sono state estinte in perossido di idrogeno per 15 minuti per bloccare le perossidasi endogene. In seguito le sezioni sono state trattate al microonde in tam- pone citrato (Citrato tribasico, Ac.Citrico, pH6,1) per effettuare lo smascheramento antigenico e successivamente incubate con il PBS-latte in polvere magro al 6% per 1 ora per bloccare i siti aspecifici di legame del tessuto. Sono state, poi, incubate durante la notte a 4°C con gli an- ticorpi diretti contro Notch-1(hamster monoclonale IgG, Upstate), e VEGF (rabbit policlonale IgG, Santa Cruz Biotechnology), usati tutti a diluizione 1:100. Dopo 24 ore le sezioni sono state più volte lavate in PBS per ri- muovere l’eccesso di anticorpo e, poi, nuovamente in- cubate, per 1 ora e a temperatura ambiente, con gli an- ticorpi secondari (anti-hamster, anti-rabbit) diluiti 1:200. Di nuovo si sono effettuati più lavaggi in PBS. T utti i ve- trini sono stati processati con il metodo ABC (Vector La- boratories) per 30 minuti. Come cromogeno è stata usa- ta la DAB e come contrastante nucleare l’ematossilina. Per ogni anticorpo usato è stato effettuato un control- lo negativo, e un controllo positivo. Ai campioni è sta- 88 F . Caprio e Coll. © CIC Edizioni Internazionali to attribuito un punteggio in base alla percentuale di cel- lule positive. È stata osservata una media di 25 campi per ogni campione. T utti i valori sono stati espressi come me- dia ± errore medio standard (SEM) e le differenze sono state comparate usando il t-test di Student. Risultati Attraverso la tecnica immunoistochimica abbiamo no- tato che nell’endometrio fisiologico l’espressione di Notch-1 è molto marcata a livello delle ghiandole dello stroma e dei vasi sia in fase proliferativa che secretiva; l’e- spressione del VEGF nei campioni di endometrio fi- siologico risulta lieve in fase proliferativa sia a livello sto- male che ghiandolare, mentre in fase secretiva risulta mo- derata in tutte le componenti tissutali (Fig. 1). Nell’endometrio eutopico di donne con endometriosi per Notch-1non si riscontra alcuna espressione né in fase proliferativa né in quella secretiva. In fase proliferativa l’espressione del VEGF risulta intensa a livello ghiandolare; in fase secretiva, invece, l’espressione del VEGF risulta lieve in entrambe le componenti (Fig. 2). Nell’endometrio di donne con sterilità idiopatica, l’e- spressione di Notch-1è bassa sia in fase proliferativa che in fase secretiva, mostrando un pattern di espressione si- mile a quello riscontrato nell’endometrio di donne con endometriosi. Anche l’espressione del VEGF , durante la fase proliferativa, è lieve e l’espressione si mantiene bas- sa in fase secretiva (Fig. 3). Discussione e conclusioni L ’endometrio va incontro ad una serie di trasforma- zioni cicliche che lo preparano ad accogliere la blasto- cisti tra le quali l’angiogenesi è sicuramente un fenomeno cruciale. È ormai noto che il VEGF ha un ruolo im- portante nell’angiogenesi a livello endometriale per la sua capacità di regolare la crescita vascolare e la permeabi- lità nella mucosa uterina e della placenta (9). Negli ul- timi anni molti Autori hanno evidenziato il ruolo del pathway di Notch nel processo angiogenico, in partico- lare nel rimodellamento vascolare endometriale, dimo- strando che esso è espresso ciclicamente nell’endometrio ed è coinvolto nella differenziazione delle cellule endo- metriali e nell’impianto della blastocisti (5-10). Nostri precedenti studi confermano l’importanza di Notch nei processi di proliferazione, differenziazione e apoptosi nel- la placenta e del suo contributo nell’angiogenesi al fine di garantire l’evoluzione della gravidanza (11). La nostra precedente osservazione di una ridotta espressione di VEGF e di Notchin placente di donne con preeclampsia ci suggerisce un ruolo nelle alterazioni della decidualiz- zazione (12). Da recenti studi è emerso che un’alterazione della vasculogenesi potrebbe essere la causa dei difetti di impianto e di una ridotta pregnancy rate(13) sia in con- dizioni idiopatiche che secondarie ad alcune patologie tra cui l’endometriosi. Secondo alcuni Autori, casi di ste- rilità inspiegate potrebbero essere causate da alterazio- ni della funzione endometriale dovute a difetti nell’e- spressione di fattori angiogenici nella finestra d’impianto 89 Modulazione dell’espressione endometriale del pathway di VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto Fig. 1 - Espressione di VEGF e Notch1 nell’endometrio dei controlli sani. © CIC Edizioni Internazionali (14). Infatti è stato osservato in pazienti affette da en- dometriosi un’alterata espressione nell’endometrio eu- topico delle integrine (15) e di fattori angiogenici tra cui il VEGF (16), a dimostrazione dell’ipotesi di un difet- to dell’impianto nella patogenesi della sterilità. L ’importanza dell’angiogenesi e del VEGF nell’im- pianto è confermata dall’osservazione che un polimor- fismo del gene per il VEGF sarebbe un fattore di su- scettibilità per difetti di impianto e abortività ricorren- te (17) e da studi su animali che dimostrano che l’im- piego di anticorpi anti-VEGF nel periodo peri-impian- to inducono un fallimento dell’impianto e della gravi- danza (18). I dati del nostro studio offrono un nuovo contribu- to nella comprensione dei meccanismi endometriali po- tenzialmente coinvolti nella patogenesi della sterilità idio- patica e da endometriosi. L ’intensa espressione nell’en- dometrio fisiologico di Notch-1, soprattutto in fase pro- 90 F . Caprio e Coll. Fig. 2 - Espressione di VEGF e Notch-1 nell’endometrio in donne con endometriosi. Fig. 3 - Espressione di VEGF e Notch-1 nell’endometrio di donne con sterilità primaria. © CIC Edizioni Internazionali liferativa, offre la possibilità di confermare i dati di let- teratura che ipotizzavano un ruolo per il recettore Not- ch-1 nei processi di proliferazione e differenziamento im- plicati nella decidualizzazione e nell’impianto. I bassi li- velli di espressione nell’endometrio eutopico di donne con endometriosi e nell’endometrio di donne con ste- rilità idiopatica può far ipotizzare che l’alterazione del pathwaydi Notch-1sia implicato nel determinismo di un basso tasso di fertilità che caratterizza queste pazienti, pro- prio a causa di una deregolazione dei processi di deci- dualizzazione ed impianto. L ’espressione del VEGF nell’endometrio eutopico di donne con endometriosi è invertita in confronto al- l’endometrio fisiologico, cioè maggiore in fase prolife- rativa rispetto alla fase secretiva; dal momento che que- sta fase è caratterizzata dai processi di differenziamento culminanti nella decidualizzazione, possiamo ipotizza- re che la riduzione dell’espressione del VEGF giochi un ruolo rilevante nell’alterazione della fase di preparazio- ne all’impianto. Nelle donne con sterilità idiopatica, l’e- spressione del VEGF è lieve sia in fase proliferativa che in quella secretiva, dimostrando una potenziale inade- guadezza dell’endometrio di queste donne a sostenere una gravidanza sia in fase di preparazione che in quella d’im- pianto. In conclusione i dati del nostro studio suggeriscono un ruolo significativo del pathway di Notch nella mo- dulazione del rimodellamento endometriale nei difetti di impianto ed aprono nuove prospettive nello studio del- la sterilità primaria ed associata ad endometriosi. 91 Modulazione dell’espressione endometriale del pathway di VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto 1. Nardo LG. Vascular endothelial growth factor expression in the endometrium during the menstrual cycle, implantation window and early pregnancy. Curr Opin Obstet Gynecol. 2005 Aug;17(4):419-23. Review 2. Krüssel JS, Bielfeld P , Polan ML, Simón C. Regulation of em- bryonic implantation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2003 Sep 22;110 Suppl 1:S2-9. Review. 3. Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development.Science. 1999 Apr 30;284(5415):770-6. 4. Cobellis L, Caprio F , T rabucco E, Mastrogiacomo A, Coppola G, Manente L, Colacurci N, De Falco M, De Luca A. 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