{"paper_id":"96c115bf-3eeb-4f4f-8004-7afd8b3b0dc1","body_text":"Introduzione\nL ’impianto è il processo in cui la blastocisti aderisce\nalla mucosa uterina e penetra nell’endometrio oppor-\ntunamente preparato da una corretta sequenza di even-\nti, regolati da ormoni ovarici e da fattori embrionali e ca-\nratterizzati da un’intensa proliferazione cellulare, rimo-\ndellamento vascolare, angiogenesi. L ’angiogenesi, processo\ncaratterizzato dallo sviluppo di nuovi vasi, è indotta da\nRIASSUNTO: Modulazione dell’espressione endometriale del pathway\ndi VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto.\nF.  CAPRIO, L. I ZZO, A. N OCERINO, A. P ANARIELLO, I. P ISANI,\nA. GRIMALDI, S. LEO, M. E. SALZILLO, L. COBELLIS\nIntroduzione. È stato ipotizzato che un’alterazione dell’angioge-\nnesi possa essere responsabile dei difetti di impianto in alcune condi-\nzioni di sterilità primaria ed associata ad endometriosi. VEGF  e Not-\nch sono molecole che partecipano in maniera rilevante ai processi an-\ngiogenetici. Lo scopo dello studio è valutare l’espressione endometriale\ndi Notch-1 e VEGF nelle varie fasi del ciclo endometriale di donne af-\nfette da endometriosi e da sterilità idiopatica in confronto a controlli\nsani.\nMateriali e metodi. È stata esaminata, con metodica immunoi-\nstochimica, l’espressione di VEGF e Notch nell’endometrio prelevato in\nfase proliferativa e secretiva in tre gruppi di pazienti. Gruppo A: con-\ntrolli sani. Gruppo B: donne sterili affette da endometriosi. Gruppo C:\ndonne con sterilità primaria.\nRisultati. Nel gruppo A l’espressione del VEGF è lieve nella fase\nproliferativa e moderata in quella secretiva, mentre l’espressione di\nNotch-1 si mantiene costantemente elevata nelle due fasi. Nel gruppo\nB il pattern di espressione del VEGF è invertito e l’espressione di Not-\nch-1 è lieve nelle due fasi. Nel gruppo C l’espressione del VEGF e Not-\nch-1 si mantiene bassa durante tutto il ciclo.\nConclusioni. VEGF e Notch hanno un ruolo potenzialmente ri-\nlevante nella modulazione del rimodellamento vascolare dell’endome-\ntrio nei difetti di impianto.\nS\nUMMARY: VEGF and Notch-1 endometrial pathway in implantation\nfailure. \nF.  CAPRIO, L. I ZZO, A. N OCERINO, A. P ANARIELLO, I. P ISANI,\nA. GRIMALDI, S. LEO, M. E. SALZILLO, L. COBELLIS\nBackground. It has been suggested that an impaired angiogenesis\ncould be responsible for implantation failure in some patients affected\nby primary infertility or endometriosis. VEGF and Notch play a rele-\nvant role in angiogenesis. The aim of this study was to evaluate the ex-\npression of Notch and VEGF in both proliferative and secretive endo-\nmetrium from women affected by endometriosis or primary infertility\nas compared to healthy controls.\nMaterial and methods. Expression of VEGF and Notch were\nanalyzed by means of histochemistry in proliferative and secretive en-\ndometrium from three groups of patients: healthy controls (group A),\nwomen affected by endometriosis (group B), women with primary in-\nfertility (group C). \nResults. In group A the expression of VEGF was mild in prolife-\nrative phase and moderate in secretive phase, while the expression of\nNotch 1 was high in both phases. In group B the expression pattern of\nVEGF was reversed as compared to group A and the expression of Not-\nch1 was mild in both phases. In group C the expression of VEGF and\nNotch 1 was mild in both phases.\nConclusions. VEGF and Notch play a potentially critical role in\nthe modulation of vascular remodeling of endometrium in implanta-\ntion failures.\nModulazione dell’espressione endometriale del pathway \ndi VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto\nF. CAPRIO, L. IZZO, A. NOCERINO, A. PANARIELLO, I. PISANI, \nA. GRIMALDI, S. LEO, M. E. SALZILLO, L. COBELLIS\nGiorn. It. Ost. Gin. Vol. XXXII - n. 2\nMarzo-Aprile 2010\n87\nSeconda Università di Napoli\nDipartimento di Scienze Ginecologiche\nOstetriche e della Riproduzione\n© Copyright 2010, CIC  Edizioni Internazionali, Roma\nKEY WORDS: Impianto - Angiogenesi - VEGF - Notch - Endometriosi - Sterilità primaria.\nImplantation - Angiogenesis - VEGF - Notch- Endometriosis - Primary infertility.\n© CIC Edizioni Internazionali\n\nuna serie di molecole tra le quali il VEGF (vascular en-\ndothelial growt factor) ha sicuramente un ruolo rilevan-\nte: esso è, infatti, un fattore di crescita con spiccata at-\ntività mitotica sulle cellule endoteliali delle quali favo-\nrisce la migrazione ed agisce come vasodilatatore au-\nmentando la permeabilità vascolare. Alcuni Autori han-\nno evidenziato che il VEGF partecipa in maniera si-\ngnificativa ai processi angiogenetici a livello endometriale\ned in particolare alla preparazione dell’endometrio al-\nl’impianto e all’invasione del trofoblasto (1, 2). \nRecentemente è stato evidenziato un nuovo recetto-\nre transmembrana, appartenente alla famiglia dei fatto-\nri di crescita endoteliali, che interviene nei processi di pro-\nliferazione, differenziazione cellulare e apoptosi, noto come\nNotch. Si riconoscono quattro isoforme (N1-4) funzio-\nnalmente correlate, ciascuna delle quali è una proteina\ntransmembrana costituita da una porzione extracellula-\nre con sequenze ripetute EGF-like che consentono il le-\ngame con due differenti tipi di ligando, Delta e Jagged,\nanch’essi proteine transmembrana con sequenze EGF-\nlike ripetute. A seguito dell’interazione tra Notchcon uno\ndei suoi ligandi si osserva il distacco, per clivaggio pro-\nteolitico, del dominio intracellulare (Notch Intracellular\nDomain - NID) che trasloca nel nucleo e modula la tra-\nscrizione di vari geni. Insieme ai suoi ligandi, Notch è\nespresso in diversi tessuti umani ed è coinvolto nella neu-\nrogenesi, nell’epatogenesi, cancerogenesi e nella vascu-\nlogenesi (3). Nostri studi preliminari hanno evidenzia-\nto, inoltre, che Notch-1 è implicato in maniera signifi-\ncativa nel rimodellamento vascolare dell’endometrio fi-\nsiologico e patologico (4) mentre altri Autori hanno pro-\nposto un suo coinvolgimento nell’impianto (5). \nNumerosi studi hanno dimostrato che un’alterazio-\nne dell’angiogenesi è responsabile dei difetti di impian-\nto e della mancata progressione della gravidanza (6, 7)\nin numerose condizioni sia idiopatiche sia secondarie. In\nparticolare nelle pazienti sterili affette da endometriosi\nè stata dimostrata un’alterazione dell’impianto embrio-\nnario che sarebbe responsabile, insieme ad altri fattori,\ndella sterilità (8). \nLo scopo dello studio è quello di valutare l’espressione\ndi Notch-1 e del VEGF nelle varie fasi del ciclo endo-\nmetriale (secretiva e proliferativa) di donne affette da en-\ndometriosi e da sterilità idiopatica in confronto a con-\ntrolli sani.\nMateriali e metodi\nIl campione oggetto del nostro studio è composto di\ntre gruppi.\nGruppo A. Campioni di endometrio sono stati ot-\ntenuti da donne con fertilità confermata dalla presenza\nnell’anamnesi ostetrica di almeno due gravidanze insorte\nspontaneamente. Sono state reclutate pazienti con età\ncompresa tra i 25 e 40 anni che si sottoponevano ad in-\nterventi ginecologici per patologia non endometriale. Sono\nstati raccolti 10 campioni di endometrio in fase proli-\nferativa e 10 campioni in fase secretiva.\nGruppo B. Campioni di endometrio eutopico di don-\nne affette da endometriosi sono stati ottenuti da pazienti\ndi età compresa tra i 25 e 40 anni che si sottoponevano\nad interventi di laparoscopia operativa per cisti endo-\nmetriosica. Sono stati raccolti 5 campioni di endome-\ntrio prelevato durante l’intervento eseguito in fase pro-\nliferativa e 5 campioni prelevati in fase secretiva duran-\nte isteroscopia precedente l’intervento.\nGruppo C. Campioni di endometrio di donne con\ninfertilità inspiegata che si sottoponevano ad isterosco-\npia diagnostica prima di un ciclo di fecondazione in vi-\ntro. Abbiamo ottenuto 5 campioni di endometrio in fase\nproliferativa e 5 campioni di endometrio in fase secre-\ntiva per ogni paziente reclutata. \nSubito dopo la raccolta, i campioni tissutali, della gran-\ndezza di circa 1 cm, sono stati lavati in soluzione fisio-\nlogica, per eliminare sangue e coaguli, e fissati in for-\nmalina. Per un’adeguata valutazione immunoistochimica,\nle biopsie sono state disidratate attraverso passaggi in di-\nluizioni decrescenti di etanolo e chiarificate in xilene. Così\nsi è potuto procedere all’inclusione in paraffina.\nUna volta solidificato il blocchetto, sono state tagliate\nsezioni di 5 µm, montate su vetrino porta oggetto e asciu-\ngate durante la notte a 37°C, in seguito sono state co-\nlorate con ematossilina-eosina.\nT utte le sezioni sono state sparaffinate in xilene, rei-\ndratate attraverso passaggi in diluizioni di alcool crescenti\ne successivamente lavate in soluzione salina tamponata\ncon i fosfati (PBS). Le sezioni di tessuto, poste in una\ncamera umida per evitare che andassero incontro ad es-\nsiccamento, sono state estinte in perossido di idrogeno\nper 15 minuti per bloccare le perossidasi endogene. In\nseguito le sezioni sono state trattate al microonde in tam-\npone citrato (Citrato tribasico, Ac.Citrico, pH6,1) per\neffettuare lo smascheramento antigenico e successivamente\nincubate con il PBS-latte in polvere magro al 6% per 1\nora per bloccare i siti aspecifici di legame del tessuto. Sono\nstate, poi,  incubate durante la notte a 4°C con gli an-\nticorpi diretti contro Notch-1(hamster monoclonale IgG,\nUpstate), e VEGF (rabbit policlonale IgG, Santa Cruz\nBiotechnology), usati tutti a diluizione 1:100. Dopo 24\nore le sezioni sono state più volte lavate in PBS per ri-\nmuovere l’eccesso di anticorpo e, poi, nuovamente in-\ncubate, per 1 ora e a temperatura ambiente, con gli an-\nticorpi secondari (anti-hamster, anti-rabbit) diluiti 1:200.\nDi nuovo si sono effettuati più lavaggi in PBS. T utti i ve-\ntrini sono stati processati con il metodo ABC (Vector La-\nboratories) per 30 minuti. Come cromogeno è stata usa-\nta la DAB e come contrastante nucleare l’ematossilina.\nPer ogni anticorpo usato è stato effettuato un control-\nlo negativo, e un controllo positivo. Ai campioni è sta-\n88\nF . Caprio e Coll.\n© CIC Edizioni Internazionali\n\nto attribuito un punteggio in base alla percentuale di cel-\nlule positive. È stata osservata una media di 25 campi per\nogni campione. T utti i valori sono stati espressi come me-\ndia ± errore medio standard (SEM) e le differenze sono\nstate comparate usando il t-test di Student.\nRisultati\nAttraverso la tecnica immunoistochimica abbiamo no-\ntato che nell’endometrio fisiologico l’espressione di\nNotch-1 è molto marcata a livello delle ghiandole dello\nstroma e dei vasi sia in fase proliferativa che secretiva; l’e-\nspressione del VEGF nei campioni di endometrio fi-\nsiologico risulta lieve in fase proliferativa sia a livello sto-\nmale che ghiandolare, mentre in fase secretiva risulta mo-\nderata in tutte le componenti tissutali (Fig. 1).\nNell’endometrio eutopico di donne con endometriosi\nper Notch-1non si riscontra alcuna espressione né in fase\nproliferativa né in quella secretiva. In fase proliferativa\nl’espressione del VEGF risulta intensa a livello ghiandolare;\nin fase secretiva, invece, l’espressione del VEGF risulta\nlieve in entrambe le componenti (Fig. 2).\nNell’endometrio di donne con sterilità idiopatica, l’e-\nspressione di Notch-1è bassa sia in fase proliferativa che\nin fase secretiva, mostrando un pattern di espressione si-\nmile a quello riscontrato nell’endometrio di donne con\nendometriosi. Anche l’espressione del VEGF , durante la\nfase proliferativa, è lieve e l’espressione si mantiene bas-\nsa in fase secretiva (Fig. 3).\nDiscussione e conclusioni\nL ’endometrio va incontro ad una serie di trasforma-\nzioni cicliche che lo preparano ad accogliere la blasto-\ncisti tra le quali l’angiogenesi è sicuramente un fenomeno\ncruciale. È ormai noto che il VEGF ha un ruolo im-\nportante nell’angiogenesi a livello endometriale per la sua\ncapacità di regolare la crescita vascolare e la permeabi-\nlità nella mucosa uterina e della placenta (9). Negli ul-\ntimi anni molti Autori hanno evidenziato il ruolo del\npathway di Notch nel processo angiogenico, in partico-\nlare nel rimodellamento vascolare endometriale, dimo-\nstrando che esso è espresso ciclicamente nell’endometrio\ned è coinvolto nella differenziazione delle cellule endo-\nmetriali e nell’impianto della blastocisti (5-10). Nostri\nprecedenti studi confermano l’importanza di Notch nei\nprocessi di proliferazione, differenziazione e apoptosi nel-\nla placenta e del suo contributo nell’angiogenesi al fine\ndi garantire l’evoluzione della gravidanza (11). La nostra\nprecedente osservazione di una ridotta espressione di\nVEGF e di Notchin placente di donne con preeclampsia\nci suggerisce un ruolo nelle alterazioni della decidualiz-\nzazione (12). Da recenti studi è emerso che un’alterazione\ndella vasculogenesi potrebbe essere la causa dei difetti di\nimpianto e di una ridotta pregnancy rate(13) sia in con-\ndizioni idiopatiche che secondarie ad alcune patologie\ntra cui l’endometriosi. Secondo alcuni Autori, casi di ste-\nrilità inspiegate potrebbero essere causate da alterazio-\nni della funzione endometriale dovute a difetti nell’e-\nspressione di fattori angiogenici nella finestra d’impianto\n89\nModulazione dell’espressione endometriale del pathway di VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto\nFig. 1 - Espressione di VEGF e Notch1 nell’endometrio dei controlli sani.\n© CIC Edizioni Internazionali\n\n(14). Infatti è stato osservato in pazienti affette da en-\ndometriosi un’alterata espressione nell’endometrio eu-\ntopico delle integrine (15) e di fattori angiogenici tra cui\nil VEGF (16), a dimostrazione dell’ipotesi di un difet-\nto dell’impianto nella patogenesi della sterilità.\nL ’importanza dell’angiogenesi e del VEGF nell’im-\npianto è confermata dall’osservazione che un polimor-\nfismo del gene per il VEGF sarebbe un fattore di su-\nscettibilità per difetti di impianto e abortività ricorren-\nte (17) e da studi su animali che dimostrano che l’im-\npiego di anticorpi anti-VEGF nel periodo peri-impian-\nto inducono un fallimento dell’impianto e della gravi-\ndanza (18).\nI dati del nostro studio offrono un nuovo contribu-\nto nella comprensione dei meccanismi endometriali po-\ntenzialmente coinvolti nella patogenesi della sterilità idio-\npatica e da endometriosi. L ’intensa espressione nell’en-\ndometrio fisiologico di Notch-1, soprattutto in fase pro-\n90\nF . Caprio e Coll.\nFig. 2 - Espressione di VEGF e Notch-1 nell’endometrio in donne con endometriosi.\nFig. 3 - Espressione di VEGF e Notch-1 nell’endometrio di donne con sterilità primaria. \n© CIC Edizioni Internazionali\n\nliferativa, offre la possibilità di confermare i dati di let-\nteratura che ipotizzavano un ruolo per il recettore Not-\nch-1 nei processi di proliferazione e differenziamento im-\nplicati nella decidualizzazione e nell’impianto. I bassi li-\nvelli di espressione nell’endometrio eutopico di donne\ncon endometriosi e nell’endometrio di donne con ste-\nrilità idiopatica può far ipotizzare che l’alterazione del\npathwaydi Notch-1sia implicato nel determinismo di un\nbasso tasso di fertilità che caratterizza queste pazienti, pro-\nprio a causa di una deregolazione dei processi di deci-\ndualizzazione ed impianto.\nL ’espressione del VEGF  nell’endometrio eutopico di\ndonne con endometriosi è invertita in confronto al-\nl’endometrio fisiologico, cioè maggiore in fase prolife-\nrativa rispetto alla fase secretiva; dal momento che que-\nsta fase è caratterizzata dai processi di differenziamento\nculminanti nella decidualizzazione, possiamo ipotizza-\nre che la riduzione dell’espressione del VEGF giochi un\nruolo rilevante nell’alterazione della fase di preparazio-\nne all’impianto. Nelle donne con sterilità idiopatica, l’e-\nspressione del VEGF è lieve sia in fase proliferativa che\nin quella secretiva, dimostrando una potenziale inade-\nguadezza dell’endometrio di queste donne a sostenere una\ngravidanza sia in fase di preparazione che in quella d’im-\npianto.\nIn conclusione i dati del nostro studio suggeriscono\nun ruolo significativo del pathway di  Notch nella mo-\ndulazione del rimodellamento endometriale nei difetti\ndi impianto ed aprono nuove prospettive nello studio del-\nla sterilità primaria ed associata ad endometriosi.\n91\nModulazione dell’espressione endometriale del pathway di VEGF e Notch-1 nei difetti di impianto\n1. Nardo LG. Vascular endothelial growth factor expression in the\nendometrium during the menstrual cycle, implantation window\nand early pregnancy. Curr Opin Obstet Gynecol. 2005\nAug;17(4):419-23. Review\n2. Krüssel JS, Bielfeld P , Polan ML, Simón C. Regulation of em-\nbryonic implantation. 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Cobellis L, Mastrogiacomo A, Federico E, Schettino MT , De Fal-\nco M, Manente L, Coppola G, T orella M, Colacurci N, De Luca\nA. Distribution of Notch protein members in normal and pree-\nclampsia-complicated placentas. Cell Tissue Res. 2007\nDec;330(3):527-34. Epub 2007 Oct 23.\n13. T orry DS, Leavenworth J, Chang M, Maheshwari V , Groesch\nK, Ball ER, T orry RJ. Angiogenesis in implantation. J Assist Re-\nprod Genet. 2007 Jul;24(7):303-15.\n14. Achache H, Revel A. Endometrial receptivity markers, the journey\nto successful embryo implantation. Hum Reprod Update. 2006 Nov-\nDec;12(6):731-46. Epub 2006 Sep 18.\n15. Lessey BA. Implantation defects in infertile women with endome-\ntriosis.Ann N Y Acad Sci. 2002 Mar;955:265-80; discussion 293-\n5, 396-406. Review.\n16. Kao LC, Germeyer A, T ulac S, Lobo S, Yang JP , Taylor RN,\nOsteen K, Lessey BA, Giudice LC. 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