A expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos de endometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão lipídica carreadora de droga antiproliferativa

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 3 1.1 Endometriose ............................................................................................... 3 1.2 Lipoproteínas e apolipoproteínas ................................................................. 6 1.3 Receptores de LDL ...................................................................................... 8 1.4 Nanotecnologia em Medicina e o desenvolvimento das nanoemulsões lipídicas ............................................................................................................ 10 1.5 Hipótese do estudo .................................................................................... 13 2 OBJETIVOS .................................................................................................. 17 2.1 Objetivo principal ........................................................................................ 17 2.2 Objetivos específicos ................................................................................. 17 3 PACIENTES E MÉTODOS ........................................................................... 21 3.1 Tipo do estudo e cálculo da amostra .......................................................... 21 3.2 Local do estudo .......................................................................................... 21 3.3 Pacientes .................................................................................................... 22 3.4 Critérios de inclusão ................................................................................... 22 3.5 Dinâmica do estudo .................................................................................... 22 3.6 Procedimento cirúrgico e coleta das amostras ........................................... 25 3.7 Lípides plasmáticos .................................................................................... 26 3.8 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA) ...................... 26 3.9 Análise de expressão gênica por PCR em tempo real ............................... 27 3.10 Determinação proteica por imunoistoquímica .......................................... 28 3.11 Análise estatística .................................................................................... 29 4 RESULTADOS .............................................................................................. 33 4.1 Características físicas, fase do ciclo menstrual e quadro clínico ................ 33 4.2 Perfil lipídico ............................................................................................... 34 4.3 Expressão gênica de LDL-R e LRP-1 por PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) ................................................................................................ 35 4.4 Determinação proteica de LDL-R e LRP-1 por imunoistoquímica .............. 38 4.5 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corpórea (IMC), idade e fases do ciclo menstrual ........................................................... 41 5 DISCUSSÃO ................................................................................................. 47 5.1 Expressão de RNAm dos receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) ................. 50 5.2 Determinação proteica por imunoistoquímica dos receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) .............................................................................................. 55 5.3 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corpórea (IMC) ............................................................................................................... 57 6 CONCLUSÕES ............................................................................................. 61 7 ANEXOS ....................................................................................................... 65 7.1 Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo com Endometriose). ................................................................................................. 65 7.2 Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo sem Endometriose). ................................................................................................. 72 7.3 Anexo C – Tabela com os dados das pacientes e suas características físicas. .............................................................................................................. 79 7.4 Anexo D – Tabela com o perfil lipídico das pacientes ................................ 80 7.5 Anexo E – Tabela com os dados de expressão gênica .............................. 81 7.6 Anexo F – Tabela com os dados de determinação proteica. ...................... 82 7.7 Anexo G – Aprovação CAPPesq - HCFMUSP. .......................................... 83 9 REFERENCIAS ............................................................................................. 87 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS Apo Apolipoproteína EVA Escala Visual Analógica de Dor CT Colesterol total cDNA DNA complementar Ct Cycle threshold (Ciclo de amplificação) DAB Diaminobenzidina Ct Delta Ct DDS Drug Delivery Systems HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo HDL High-Density Lipoprotein (Lipoproteína de alta densidade) HDL-C HDL Colesterol IMC Índice de massa corpórea kDa KiloDaltons LCAT Lecitina Colesterol Acetil Transferase LDL Low-Density Lipoprotein (Lipoproteína de baixa densidade) LDL-C LDL Colesterol LDL-R Receptor de LDL LDE Nanoemulsão lipídica LPL Lipase lipoproteica LRP Proteína relacionada ao receptor de LDL MMPs Matriz Metaloproteinases Milli-Q Água deionizada e purificada. nm Nanômetro PBS Sais fosfato PCR Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) RNAm RNA mensageiro rpm Rotações por Minuto SR-B1 Scavenger Receptor Class B-1 STAR Proteína Ativa Reguladora de Esteroidogênese TG Triglicérides TE-4 Solução de Tris-EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) VLDL Very Low-Density Lipoprotein (Lipoproteína de densidade muito baixa) LISTA DE TABELAS Tabela 1 Caracterização das Apolipoproteínas Humanas (adaptação de Mahley et al., 1984). ................................................................. 8 Tabela 2 Características físicas e fases do ciclo menstrual em mulheres com e sem endometriose. ........................................... 33 Tabela 3 Quadro clínico de mulheres com e sem endometriose. .............. 34 Tabela 4 Determinação de lípides plasmáticos em mulheres com e sem endometriose. ...................................................................... 35 Tabela 5 Comparações múltiplas sob os níveis de RNAm para os receptores LDL-R e LRP-1 entre grupos com e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose), ............................................................................ 38 Tabela 6 Análise qualitativa da intensidade de marcação dos receptores LDL-R e LRP-1 por imunoistoquímica nos grupos com e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose). ........................................................... 40 Tabela 7 Comparações múltiplas sob o score de intensidade de marcação para LDL-R entre grupos com e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose). ............................................................................ 41 Tabela 8 Análise de correlação entre idade e IMC com o score de intensidade de marcação e níveis de expressão de RNAm de LDL-R e de LRP-1 nos grupos com e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose). ..... 41 Tabela 9 Expressão gênica de LDL-R e LRP-1 em cada grupo com e sem endometriose nas fases do ciclo menstrual. ........................ 42 Tabela 10 Análise qualitativa da intensidade de marcação para LDL-R e LRP-1 em cada grupo com e sem endometriose nas fases do ciclo menstrual. ...................................................................... 43 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Representação esquemática da LDL (Low-Density Lipoprotein) (Extraído de www.healthprotocols.com). ................. 11 Figura 2 Representação esquemática da LDL natural mostrando a semelhança da nanoemulsão lipídica LDE, exceto pela ausência da apolipoproteína B. ................................................... 13 Figura 3 Quadro explicativo da dinâmica do estudo. ................................. 24 Figura 4 Lesão de endometriose intestinal após ressecção segmentar. .................................................................................. 25 Figura 5 Fotomicrografias representativas de imunoistoquímica para LDL-R e para LRP-1.................................................................... 39 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Expressão gênica de LDL-R - Gráfico de barras mostrando o valor médio (erro padrão) dos níveis de RNAm para LDL-R em amostras de endométrio de mulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres com endometriose, sendo que uma amostra é proveniente do endométrio (endométrio COM EDT) e, a outra, da lesão de endometriose (Lesão EDT) da mesma paciente. O gráfico está representado em escala logarítmica na base 10. ................................................................................... 36 Gráfico 2 Expressão gênica de LRP-1 - Gráfico de barras mostrando o valor médio (erro padrão) dos níveis de RNAm para LRP-1 em amostras de endométrio de mulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres com endometriose, sendo que uma amostra é proveniente do endométrio (endométrio COM EDT) e, a outra, da lesão de endometriose (Lesão EDT) da mesma paciente. O gráfico está representado em escala logarítmica na base 10. ................................................................................... 37 RESUMO Gibran L. A expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos de endometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão lipídica carreadora de droga ant iproliferativa [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2016. Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica e a determinação proteica de receptores de LDL (LDL -R e LRP -1) na lesão de endometriose profunda e com parar com o endométrio de mulheres com e sem endometriose, assim como determinar o perfil lipídico de pacientes com e sem endometriose profunda. Pacientes e métodos: Realizamos estudo transversal, caso-controle, exploratório com 39 pacientes, sendo 20 paci entes com diagnóstico histológico de endometriose profunda com comprometimento intestinal e 19 pacientes sem endometriose submetidas à laqueadura tubária laparoscópica. Foram coletadas amostras de sangue periférico no dia do procedimento cirúrgico para aná lise do perfil lipídico por meio da determinação de Colesterol total, HDL, LDL, VLDL, Triglicérides, APO A I e APO B 100. Foram também coletadas amostras de tecido endometrial com cureta de Pipelle e lesão de endometriose como parte do tratamento cirúrgico laparoscópico. Todas as amostras foram enviadas para análise histológica e submetidas à pesquisa de expressão gênica por PCR Real Time e à determinação proteica por imunoistoquímica dos receptores de LDL (LDL -R e LRP-1). A fase do ciclo menstrual foi det erminada no momento do procedimento cirúrgico. Resultados: As pacientes com endometriose profunda apresentaram níveis séricos de LDL-c significativamente inferiores às pacientes sem a doença (119 ± 23 vs 156 ± 35; p=0,001). O mesmo não foi observado com o colesterol total (187 ± 27 vs 194 ± 37; p=0,562), HDL -c (42 ± 9 vs 43 ± 14; p=0,792), Triglicérides (130 ± 40 vs 119 ± 55; p=0,486), APO A I (128,1 ± 33,3 vs 136,5 ± 19,9; p=0,373) e APO B 100 (76 ± 20,9 vs 91,7 ± 30,8; p=0,085). A análise de expressão gênica por PCR Real Time dos receptores de LDL revelou que o LDL -R foi significativamente mais expresso na lesão de endometriose comparado ao endométrio da mesma paciente , mas não ao endométrio de mulheres sem endometriose (0,012 ± 0,009 vs 0,019 ± 0,01 vs 0,027 ± 0,022; p<0,001) e o LRP -1 foi significativamente mais expresso na lesão de endometriose tanto quando comparado ao endométrio da mesma paciente, quanto quando comparado ao endométrio das pacientes sem a doença (0,089 ± 0,076 vs 0,126 ± 0,072 vs 0,307 ± 0,207; p<0,001). A análise de determinação proteica por imunoistoquímica dos mesmos receptores revelou que o endométrio de mulheres sem a doença apresentou score de intensidade de marcação de LDL -R significativamente maior que o endométrio e a lesão de mulheres com endometriose (15 ± 78,9 vs 9 ± 45 vs 2 ± 10; p=0,026), porém a marcação para o receptor LRP -1 não apresentou diferença estatisticamente significativa (9 ± 47,4 vs 6 ± 30 vs 0 ± 0; p=0,073). O estudo também demonstrou que houve expressão signi ficativamente maior de RNAm do receptor LDL -R (p=0,001) na fase secretora do ciclo menstrual e o mesmo pode ser observado com relação à expressão de RNAm do receptor LRP -1, que foi superexpresso (p=0,008) no endométrio de mulheres sem a doença. Conclusões: De acordo com os resultados de nossa pesquisa , concluímos que há redução dos níveis séricos de LDL em pacientes com endometriose profunda. Além disso, observamos maior expressão gênica de receptores de LDL em membrana celular de focos de endometriose prof unda, comparado ao endométrio, tanto de mulheres sem endometriose quanto de mulheres com endometriose, achado não similar ao observado com a determinação proteica. Houve maior expressão de receptores de LDL em endométrio na fase secretora do ciclo. Este es tudo abre oportunidade para viabilização de nanoemulsões lipídicas para acoplamento e direcionamento de drogas antiproliferativas no tratamento da endometriose profunda. Descritores: Endometriose; Receptores de LDL; Proteína -1 Relacionada a Receptor de Li poproteína de Baixa Densidade; LDL-colesterol; Emulsões; Nanopartículas. .

Gibran L. LDL receptor expression in the cell membrane of foci of deep endometriosis suggests the feasibility of using lipid nanoemulsions as anti - proliferative drug car riers [Thesis]. São Paulo: "Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo"; 2016.

The objective of this study was to evaluate the gene expression and protein determination of LDL receptor (LDL -R and LRP -1) in deep endometriosis lesions and c ompare with the endometrium of women with and without endometriosis, as well as to profile lipid patients with and without deep endometriosis. Methods: We conducted an transversal, exploratory, case - control study with 39 patients: 20 patients with a histol ogical diagnosis of deep endometriosis with intestinal involvement and 19 women without endometriosis who underwent laparoscopic tubal ligation. Peripheral blood samples were collected on the day of surgery for analysis of lipid profile by determining tota l cholesterol, HDL, LDL, VLDL, triglycerides, APO AI and APO B 100. Specimens of endometrial tissue were collected using a Pipelle curette and endometriosis lesion specimens were obtains during therapeutic laparoscopic surgery. All samples were sent for hi stological evaluation and gene expression analysis by Real Time PCR and protein determination by immunohistochemistry of the LDL receptor (LDL-R and LRP-1). The phase of the menstrual cycle was determined at the time of surgery. Results: Patients with seve re endometriosis had serum LDL-C levels significantly lower than the patients without the disease (119 ± 23 vs 156 ± 35; p = 0.001). The same was not observed with total cholesterol (187 ± 27 vs 194 ± 37, p = 0.562), HDL-C (42 ± 9 vs 43 ± 14, p = 0.792), triglycerides (130 ± 40 vs 119 ± 55; p = 0.486), APO AI (128.1 ± 33.3 vs 136.5 ± 19.9; p = 0.373) and APO B 100 (76 ± 20.9 vs 91.7 ± 30.8, p = 0.085). The analysis of gene expression by Real Time PCR of LDL receptors revealed that there was significantly greater expression of LDL -R in endometriosis lesions as compared to the endometrium of the same patient, but not when compared to the endometrium of women without endometriosis (0.012 ± 0.009 vs 0.019 ± 0, 01 vs 0.027 ± 0.022, p <0.001). LRP -1 was signifi cantly expressed in endometriotic lesions both when compared to the endometrium of the same patient as compared to the endometrium of patients without the disease (0.089 ± 0.076 vs 0.126 ± 0.072 vs 0.307 ± 0.207, p <0.001). Protein determination by immunohistochemistry of the same receptors revealed that the endometrium of women without endometriosis had a significantly higher staining intensity score than the endometrium and the lesions of women with endometriosis (15 ± 78.9 vs 9 ± 2 vs 45 ± 10, p = 0.0 26) but the measurement for the LRP -1 receptor showed no statistically significant difference (9 ± 47.4 vs 6 ± 30 vs 0 ± 0; p = 0.073). The study also demonstrated that there was significantly higher mRNA expression of the LDL -R receptor (p = 0.001) in the secretory phase of the menstrual cycle, and the same can be observed with respect to the mRNA expression of LRP -1 receptor, which was overexpressed (p = 0.008) in the endometrium of women without the disease. Conclusion: Based on the findings of our resea rch, we concluded that there is a reduction of serum LDL levels in patients with deep endometriosis. Moreover, we observed higher gene expression of LDL receptors on the cell membrane of foci of deep endometriosis, compared to the endometrium, both in wome n without endometriosis and women with endometriosis, a finding unlike that observed with the protein determination. There was greater expression of LDL receptors in the endometrium during the secretory phase of the cycle. These findings suggest the feasib ility of using lipid nanoemulsions for coupling and targeted delivery of antiproliferative drugs in the treatment of deep endometriosis. Descriptors: Endometriosis; Receptors, LDL; Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1; Cholesterol, LDL; Emulsions; Nanoparticles. 1 INTRODUÇÃO 3 1 INTRODUÇÃO 1.1 Endometriose A endometriose, definida como presença de glândula e/ou estroma endometrial fora da cavidade uterina, pode ser classificada em superficia l ou profunda de acordo com sua capacidade de infiltração nos tecidos ( Benagiano et al. , 2014). Conforme descrito por Cornillie et al. em 1990, as lesões com profundidade acima de 5 mm situadas em fundo de saco de Douglas, reflexão vésico-uterina, ligament os pélvicos, vagina e/ou intestino, representam o tipo de doença em que as pacientes apresentaram mais queixas de dor, enquanto as lesões superficiais se relacionaram com maior frequência aos casos de infertilidade (Cornillie et al., 1990). Acomete cerca d e 10% das mulheres em idade reprodutiva ( Eskenazi et al., 1997; Viganò et al., 2004) e promove sintomatologia álgica muitas vezes incapacitante comprometendo significativamente a qualidade de vida das portadoras (Bassi et al., 2009; Donnez & Squifflet, 2010). Estima-se que 5,3% a 12% das mulheres com endometriose apresentam a forma mais grave da doença com comprometimento profundo do intestino, o que pode ocasionar, quando indicado tratamento cirúrgico, riscos determinados de complicações intra e pós -operatórias, contribuir para eventual persistência dos focos, além das possibilidades de recorrência das lesões ( Coronado et al., 1990; Jerby et al., 1999; Minelli et al., 2009; Koninckx et al., 2012). O tratamento medicamentoso disponível , atualmente, visa atro fia dos focos de endometriose, seja por interrupção da atividade ovariana ao induzir status de hipoestrogenismo, seja por pseudodecidualização do endométrio e da lesão de endometriose, deste modo , podendo amenizar significativamente os sintomas ( Practice C ommittee of the American Society for Reproductive Medicine, 2014) . Por ser doença crônica e requerer tratamento de longa duração, algumas opções da terapêutica clínica atual enfrentam limitações pelo alto potencial de efeitos colaterais, como sintomas climatéricos e diminuição da 4 densidade mineral óssea, além de não proporcionar o desaparecimento definitivo dos focos (Fernandez et al., 2004; Mettler et al., 2014). Embora seja considerada doença benigna, a endometriose possui características típicas de doença neoplásica, como a capacidade de invasão no estroma adjacente e associação com lesões a distância (Abrão et al., 2006). Como o câncer, a endometriose pode aderir em outros tecidos, invadi -los e deformá-los (Thomas e Campbell, 2000; Van Gorp et al., 2004). Além disso, os conceitos etiopatogênicos incluem fatores de crescimento e citocinas associados com a regulação de multiplicação celular e angiogênese, com função semelhante na carcinogênese (Podgaec et al., 2007; Pupo-Nogueira et al., 2007). Podgaec et a l. demonstraram que , na endometriose, doença de características inflamatórias, ocorre relativo aumento de citocinas representativas de padrão de resposta imune humoral (Podgaec et al., 2007; Podgaec et al., 2012). Pupo -Nogueira et al. observaram que o fato r de crescimento endotelial vascular evolui com variações cíclicas no fluido peritoneal (Pupo -Nogueira et al., 2007). Além disso, a distribuição e a densidade vascular estão significativamente mais altos em pacientes com endometriose profunda (Kuroda et al., 2010). Estas alterações imunológicas produzem um microambiente semelhante ao encontrado em tumores ovarianos. Células epiteliais do ovário com potencial maligno, diante dessas alterações moleculares e bioquímicas, aumentam a capacidade de proliferação c elular, reduzem mecanismos apoptóticos e, consequentemente, a imunovigilância. Como resultado, as células malignas, que normalmente deveriam ser eliminadas pela resposta imunológica, são capazes de sobreviver, proliferar e desenvolver tumores invasivos (Vlahos et al., 2010b). A principal questão fisiopatológica da endometriose parece implicar em perda de controle sobre a proliferação celular, uma característica semelhante à encontrada no desenvolvimento de lesões malignas ( Van Gorp et al., 2004). Em 2013, Abdalla-Ribeiro et al. demonstraram que o fator antiapoptótico Bcl2 está superexpresso em lesões de endometriose profunda de retossigm oide e ligamentos uterossacros quando comparados ao endométrio tópico da mesma paciente, enquanto o fator pró -apoptótico Ba x é nulo no reto e endométrio 5 tópico, e apresenta baixíssima expressão nos ligamentos uterossacros (Abdalla-Ribeiro et al., 2013). Há indícios de que o carcinoma endometri oide e de células claras do ovário estejam associados à endometriose. Os riscos parec em ser mais elevados em doença de longa data, influenciados pela alta concentração de ferro livre, que induz a stress oxidativo persistente (Koshiyama et al., 2014). No entanto, é importante reconhecer que estes tumores são raros. Kobayashi et al., em estudo de coorte de 6 .398 mulheres com endometrioma ovariano, em seguimento de 17 anos, demonstraram incidência de 0,7% (46 mulheres) com câncer de ovário (Kobayashi et al., 2007). Considerando a preocupação com a perda de controle de fatores associados ao cre scimento celular ( Van Gorp et al., 2004), especula-se que a exposição excessiva a estrogênios poderia estar relacionada a este fenômeno, colocando, deste modo, mulheres inférteis em risco aumentado para neoplasias ginecológicas, e qu e ovulações incessantes desempenhem um papel significativo no desenvolvimento do câncer do ovário (Vlahos et al., 2010a/b). De acordo com esta hipótese, cada ovulação cria uma ferida na superfície epitelial ovariana, que são submetidas a processo de reparação pelo aumento da pro liferação celular, o que poderia aumentar a probabilidade de danos ao DNA e promover mutações cancerígenas (Kobayashi et al., 2007). O estrogênio endógeno representa importante fonte de estímulo ao desenvolvimento da endometriose. Além da produção deste ho rmônio pelos ovários, tanto pela circulação quanto pela ruptura folicular durante a ovulação, que promove liberação de estradiol sobre os focos de endometriose, há a conversão de androstenediona em estrona e estradiol, catalisados pela aromatase, no tecido adiposo e pele, atingindo os focos de endometriose por meio da corrente sanguínea. Outra fonte é o colesterol sérico, que pode ser convertido em estradiol na própria lesão de endometriose, pois expressa um conjunto completo de genes esteroidogênicos, incl uindo o gene da aromatase, induzindo a conversão hormonal (Bulun et al., 2005). Há mais de cem anos, John Holden Webb investigou , pela primeira vez, a associação entre o metabolismo lipídico e progressão de tumores , e sugeriu que o câncer ocorria devido à cristalização do colesterol nas células ( Webb et 6 al., 1901). Desde aquela época, o envolvimento do metabolismo lipídico na tumorigênese foi exaustivamente investigado. O colesterol, como composição de membranas celulares, foi estabelecido como exigência me tabólica essencial para o processo de divisão celular ( Martinez-Botas et al., 1999; Martinez-Botas et al., 2001) e foi demonstrado que células em proliferação apresentam aumento da absorção de colesterol (Guo et al., 2011; Sundelin et al., 2012). Além disso, as células cancerosas se adaptam para manter níveis elevados de colesterol intracelular por meio de diferentes mecanismos que incluem a produção endógena acelerada de colesterol e ácidos graxos (Pitroda et al., 2009), alterações do efluxo de colesterol intracelular como demonstrado por Lee et al. no câncer de próstata (Lee et al., 2013), e pelo aumento da absorção de partículas de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) por superexpressão de receptores de membrana (Rudling et al., 1990). Considerando a re lação do colesterol com mecanismos celulares fundamentais na tumorigênese e , também, o seu papel como precursor de hormônios esteroides, admitimos a hipótese de seu envolvimento na etiopatogenia da endometriose profunda, principalmente no que diz respeito à participação na indução de proliferação de lesões, devido à endometriose profunda apresentar características fenotípicas semelhantes à neoplasia e por sua dependência ao estrogênio. Para compreensão dos mecanismos de envolvimento do metabolismo do colesterol e sua associação com a endometriose profunda , é de fundamental importância o entendimento das lipoproteínas, apolipoproteínas e o papel dos receptores de lipoproteínas. 1.2 Lipoproteínas e apolipoproteínas As lipoproteínas funcionam como veículos p ara transportar lipídios no sangue na forma de complexos de lipídios solúveis e proteínas. Os lipídios incluem triglicérides, ésteres de colesterol, colesterol livre e fosfolipídios (Henry et al., 2011). As diferentes classes de lipoproteínas executam funç ões distintas 7 no transporte de lipídios e as apolipoproteínas específicas na superfície determinam o destino das lipoproteínas. De acordo com suas características físicas e composição química, são classificadas em quatro grandes grupos:  quilomícrons, são as maiores partículas lipoproteicas e as menos densas;  VLDL são lipoproteínas de muito baixa densidade, com maior proporção de proteína;  LDL são lipoproteínas de baixa densidade, ricas em ésteres de colesterol;  HDL são lipoproteínas de alta densidade, que são as menores e as mais densas (Henry et al., 2011). Os níveis de colesterol no sangue são controlados , principalmente, pelo receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL), presente na superfície de todas as células do corpo, que faz a mediação da captação das lipoproteínas ricas em colesterol do sangue. Proteínas específicas na superfície de certas lipoproteínas (apolipoproteína B100 e apolipoproteína E) interagem com o receptor de LDL e facilitam a internalização da lipoproteína nas células ( Vitols et al., 1990). Apolipoproteínas são proteínas que se ligam a lipídios para formar lipoproteínas e facilitar o seu transporte no sistema linfático e circulatório. Atuam como ligantes, interagindo com receptores e, portanto, tem a capacidade de regular o metabolismo de lipoproteínas por determinação de absorção pelos tecidos (Brown et al., 1994). As apolipoproteínas específicas na superfície das lipoproteínas determinam o seu destino ( Johnson et al., 1997; Franklin et al., 2014). Para entender o metabolis mo da lipoproteína e a correlação com doenças associadas às anormalidades lipídicas, é necessário considerar as funções individuais das apolipoproteínas na regulação do metabolismo lipídico. Neste estudo, optamos por avaliar os níveis séricos de duas impor tantes apolipoproteínas: Apo AI, responsável pela ligação com os receptores de 8 lipoproteínas de alta densidade e Apo B100, responsável pela ligação com os receptores de lipoproteínas de baixa densidade (Breslow et al., 1994; Mahley et al., 1995) . Algumas das propriedades das apolipoproteínas estão resumidas na Tabela 1 (adaptação de Mahley et al., 1984). Tabela 1 - Caracterização das Apolipoproteínas Humanas (adaptação de Mahley et al., 1984). Apolipoproteína Principais locais de síntese Funções Principais A I Fígado, Intestino Proteína estrutural da HDL. Ligação para o receptor de HDL. A II Fígado Inibe a ligação da apo-E com os receptores A IV Intestino Pode facilitar o efluxo de colesterol das células. Possível função no metabolismo dos triglicérides. B 100 Fígado Proteína estrutural de VLDL e LDL. Ligação para receptor de LDL. B 48 Intestino Proteína estrutural dos quilomícrons. C I Fígado Ativador de LCAT, que esterifica o colesterol livre nas partículas do HDL. Modula a ligação de subprodutos aos receptores. C II Fígado Cofator da LPL C III Fígado Modula a ligação de subprodutos aos receptores. E Fígado, cérebro, pele, gônadas, baço Ligação de LDL a receptores restantes. Redistribuição local de lipídio. Transporte de colesterol reverso (HDL com Apo E) Apo (a) Fígado Modulador de fibrinólise D Fígado, Intestino Ativador de LCAT LCAT: lecitina colesterol acetiltransferase; LPL: lipase lipoproteica 1.3 Receptores de LDL O receptor de LDL (LDL -R) foi, inicialmente, identificado em 1973 e seu gene foi caracterizado em 1985 no Laboratório de Goldstein e Brown. Duas proteínas na superfície da lipoproteína, apo -B 100 e apo -E, se ligam ao receptor de LDL, e, por isso, pode também ser chamado de receptor apo -B100 9 e apo-E (Goldstein et al., 1995). O LDL -R é uma glicoproteína sintetizada no retículo endoplasmático e está expresso na superfície da maioria das células, especialmente no fígado. As células podem adquirir colesterol do plasma pela captação dessas lipoproteínas por meio de receptores de LDL (Brown e Goldstein, 1986). Depois que a lipoproteína se une ao LDL -R, o complexo permanece em uma área especializada da membrana da célula chamada fossa revestida. O “revestimento” é composto por um complexo de proteínas chama do clatrina, que agrupa os receptores em uma região da membrana da célula que pode invaginar e formar uma vesícula intracelular para conter a lipoproteína. À medida que essas vesículas internalizadas, ou endossomos, se movem para o citoplasma, o ambiente i nterno vai progressivamente se tornando mais ácido, causando dissociação entre o receptor e a lipoproteína. As lipoproteínas são degradadas nos lisossomos e os receptores não utilizados se reciclam para a superfície da célula (Herz et al., 1988). O número de receptores de LDL na superfície da célula é fortemente regulado. Se o conteúdo de colesterol de uma célula estiver elevado, há uma diminuição do número de receptores sintetizados. Por outro lado, se uma célula exigir colesterol, a expressão dos recepto res de LDL sobe e o número de receptores na superfície da célula aumenta. Este sistema mantém a concentração intracelular de colesterol relativamente constante e impede acúmulo excessivo e, possivelmente, tóxico ( Goldstein et al., 1995; Johnson et al., 1997). O receptor LRP (receptor de LDL relacionado à proteína) é um dos membros da família de receptores de LDL. É denominado LRP -1 devido à homologia estrutural da sequência de domínios rica em cisteína com a molécula do receptor de LDL ( Moestrup et al., 1992). É expresso , principalmente, no fígado, mas também está presente em outros tecidos humanos, como células musculares lisas, fibroblastos, neurônios e astrócitos, epitélio do trato gastrointestinal, células gonadais, placentárias e medula óssea (Strickland et al., 1995). 10 O LRP-1 é um receptor endocítico de amplo espectro e tem a função de intermediar o catabolismo de múltiplos ligantes como lipoproteínas e proteinases, além de toxinas bacterianas e alguns tipos de vírus ( Strickland et al., 1995). Ho e col aboradores associaram a leucemia com a hipocolesterolemia correlacionando com aumento da atividade de receptores para LDL, de três a cem vezes maior, em células leucêmicas do que em leucócitos normais (Ho et al., 1978). Este foi o principal impulso para o estudo da LDL como complexo capaz de transportar drogas ant ineoplásicas participando da revolução do uso da nanotecnologia em diversos setores da Medicina. Esse estado de hipocolesterolemia sérica também foi demonstrado em outras neoplasias (Maranhão et al. 2002; Kok et al., 2011; Simko et al., 2014). 1.4 Nanotecnologia em Medicina e o desenvolvimento das nanoemulsões lipídicas Partículas de dimensões variáveis, entre 1 e 100 nm, vêm sendo projetadas e progressivamente mais utilizadas para distribuição d irecionada de drogas ou agentes de imagem diretamente no tecido -alvo na quantidade desejada (Medina et al., 2007). Assim, este recurso tem sido empregado em diversas condições como câncer, diabetes, infecções fúngicas e virais , e terapia genética (Surendir an et al., 2009). Além disso, limitam os efeitos colaterais e previnem o desenvolvimento de resistência farmacológica (Minko et al., 2008). A proposta original do uso da nanotecnologia aplicada à M edicina visa incorporar moléculas estranhas à LDL original. Esse processo envolve a substituição dos lípides internos do núcleo da LDL por outros compostos hidrofóbicos (Saad et al. 2008). A LDL é uma grande partícula esférica (massa molecular 3 x 10 6 kDa e 22 nm de diâmetro), que contém em seu núcleo cerca de 1 .500 moléculas de ésteres de colesterol envoltas por uma proteína, a apolipoproteína B (apo - 11 B100), responsável pelo reconhecimento da estrutura pelo receptor de membrana específico (Vallabhajosula et al., 1990). Figura 1 - Representação esquemática da LDL ( Low-Density Lipoprotein ) (Extraído de www.healthprotocols.com). O uso da LDL natural obtida do plasma, no entanto, mostrou -se muito dispendioso. O processo de isolamento a partir do sangue é trabalhoso e a obtenção de grandes qu antidades, difícil. Isso fez com que fossem desenvolvidas emulsões lipídicas artificiais com comportamento metabólico similar à LDL e captação pelos mesmos receptores de membrana (Rudling et al., 1990). Um desdobramento importante nesta matéria teve lugar no Laboratório de Metabolismo e Lípides do Instituto do Coração da Universidade de São Paulo em artigos publicados a partir de 1992 (Maranhão et al., 1992; 1993; 1994). Usando conhecimentos básicos do metabolismo das lipoproteínas e de tecnologia de manufa tura de nanopartículas, o Prof. Dr. Raul C avalcante Maranhão e seu grupo conseguiram estruturar nanopartículas lipídicas capazes de concentrar-se em células neoplásicas , e, com isso, carrear quimioterápicos. Tratou-se de descoberta pioneira, já que foi a p rimeira vez que se demonstrou o direcionamento de partículas sólidas artificiais para o sítio de ação. A 12 invenção foi objeto de patentes concedidas pelo Departamento de Comércio dos Estados Unidos da América (n° 08/388.147). A emulsão lipídica denominada L DE assemelha-se, estruturalmente, com a porção lipídica da LDL original, porém não possui apolipoproteína B100. São produzidas por meio de tecnologia baseada em ultrassom, ultracentrifugação ou microfluidização sob alta pressão. Em contato com o plasma, LD E irá adquirir a apolipoproteína E, proteína presente na HDL, VLDL e quilomícrons, que, como outras apolipoproteínas, são móveis e migram das lipoproteínas originais para as partículas de LDE. Como a Apo E também pode ser reconhecida pelos receptores de LD L, permite que a LDE seja interiorizada pelas células pela mesma trajetória da LDL, por endocitose mediada pelos receptores de LDL (Ginsburg et al., 1982, Wilson et al., 1991, Maranhão et al., 1993). Desde então, o Laboratório de Metabolismo e Lípides tem demonstrado a capacidade de acoplamento de diversos quimioterápicos à LDE: carmustina (Maranhão et al., 2002), derivados de paclitaxel (Rodrigues et al., 2002; 2005), etoposídeo (Valduga et al., 2003), daunorrubicina (Teixeira et al., 2008) e metotrexato (Moura et al., 2011). Em estudos in vitro (Rodrigues et al., 2002; Valduga et al., 2003) e de farmacocinética em animais (Rodrigues et al., 2005) e em pacientes (Maranhão et al., 2002), foi demonstrado que as diversas preparações de LDE com quimioterápicos mantiveram-se estáveis, sendo que o fármaco transportado pelas nanopartículas não foi dissociado na circulação, permanecendo na LDE até a entrada nas células, condição indispensável para obtenção do efeito “drug-targeting”. Estudos in vivo mostraram que o processo de veiculação reduziu significativamente a toxicidade dos quimioterápicos (Dorlhiac -Llacer et al., 2001), na ordem de cinco a dez vezes (Valduga et al., 2003; Rodrigues et al., 2002). Modelos experimentais oncológicos tratados com LDE -quimioterápico tiveram crescimento tumoral inibido, aumento do tempo de sobrevida e redução acentuada de metástases (Lo Prete et al., 2006; Kretzer et al., 2012). 13 Figura 2 - Representação esquemática da LDL natural mostrando a semelhança da nanoemulsão lipídica LDE , exceto pela ausência da apolipoproteína B. Esta linha de pesquisa permitiu um avanço em direção a novas estratégias terapêuticas para artrite reumat oide (Mello et al., 2013), leucemia mieloide aguda (Maranhão et al., 1994; Dorlhiac-Llacer et al., 2001), mieloma múltiplo (Hungria et al., 2004), câncer de ovário (Ades et al., 2001; Azevedo et al., 2005), câncer de mama (Graziani et al., 2002), linfoma Hodgkin e nã o Hodgkin (Pinheiro et al., 2006), melanoma (Lo Prete et al., 2006; Contente et al., 2014), aterosclerose (Maranhão et al., 2008; Tavares et al., 2011; Bulgarelli et al., 2013), doença vascular do enxerto do transplante cardíaco (Lourenço - Filho et al., 2011) e, mais recentemente, o infarto agudo do miocárdio (Maranhão et al., dados não publicados). 1.5 Hipótese do estudo Considerando três pontos principais:  a importância da linha de pesquisa que determina o papel do colesterol como substrato necessário para proliferação celular em casos de neoplasias malignas pela obse rvação do aumento da expressão dos receptores de LDL em membrana de tumores 14 neoplásicos (Rudling et al., 1990; Martinez-Botas et al., 1999; Martinez-Botas et al., 2001; Pitroda et al., 2009; Guo et al., 2011; Sundelin et al., 2012; Lee et al., 2013).  os resultados encontrados em estudos que demonstram hipocolesterolemia em pacientes oncológicos, justificado pelo aumento do consumo de colesterol utilizado pela doença como combustível indutor de multiplicação celular (Ho et al., 1978; Maranhão et al., 2002; Kok et al.; Simko et al., 2014).  os conceitos etiopatogênicos na endometriose profunda que incluem fatores de crescimento e citocinas associados com a regulação de multiplicação celular e angiogênese, com função semelhante na carcinogênese (Abrão et al., 2006; Pupo-Nogueira et al.; Podgaec et al., 2007; Podgaec et al., 2012; Abdalla-Ribeiro et al., 2013). A partir desses conceitos, a hipótese desse estudo é que as lesões de endometriose profunda possam apresentar o mesmo comportamento e as mesmas necessidades que outras lesões tumorais, ou seja, tenham alta avidez pelo colesterol para composição de membrana celular, característica de lesões proliferativas. Para isso, devem superexpressar os receptores de colesterol, o que permitiria maior captação desse, r esultando em menores concentrações séricas. Assim, destacamos que os resultados esperados são a superexpressão, no tecido com endometriose, dos receptores de lipoproteínas LDL -R e LRP -1, quando comparado a tecido endometrial normal. Posteriormente, pretend emos testar a capacidade da nanoemulsão lipídica, denominada LDE, de interiorização celular e, no futuro, poder selecionar uma droga para acoplamento nesta emulsão que seja capaz de suprimir o foco da doença. 2 OBJETIVOS 17 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo principal Avaliar a expressão gênica e a determinação prot eica de receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) na lesão de endometriose profunda. 2.2 Objetivos específicos  Relacionar a expressão gênica e a determinação p roteica dos receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) no endométrio das pacientes com endometriose profunda com o endométrio de mulheres sem a doença;  Avaliar o perfil lipídico sérico de pacientes com e sem endometriose, por meio da dosagem de:  colesterol total;  LDL colesterol;  HDL colesterol;  triglicérides;  Apo A I;  Apo B 100. 3 PACIENTES E MÉTODOS 21 3 PACIENTES E MÉTODOS 3.1 Tipo do estudo e cálculo da amostra Trata-se de estudo transversal, caso -controle, expl oratório, com 39 pacientes, sendo 20 pacientes com diagnóstico histológico de endometriose profunda, todas com comprometimento intestinal, e 19 pacientes sem endometriose. Esse número de pacientes foi determinado pelo cálculo do tamanho da amostra. Visando encontrar diferenças entre os grupos e locais de avaliação na determinação proteica por imunoistoquímica e nas expressões do RNA mensageiro (RNAm), foram utilizados os 10 primeiros casos de cada grupo de mulheres como amostra-piloto e estabelecida a varia bilidade da expressão dos níveis de RNAm, sendo essas medidas as únicas objetivamente avaliadas. Supondo diferença média de , pelo menos , 1 desvio padrão entre as expressões na lesão endometriótica e no endométrio da paciente com endometriose ou da paciente sem endometriose, com poder de 80% e intervalo de confiança de 95%, a amostra necessária para a realização do estudo foi de 16 mulheres em cada grupo. 3.2 Local do estudo O estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão da Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas (HCFMUSP) e no Laboratório de Metabolismo e Lípides do Instituto do Coração, ambos da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e no Núcleo de Endoscopia Ginecológica e Endometriose do Hospital Pérola Byington. 22 3.3 Pacientes Todas as pacientes foram informadas previamente sobre os objetivos do estudo e as amostras foram coletadas somente após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. As coletas das amostras cumpriram com a ética e os princípios práticos de biossegurança estipulados pelo Ministério da Saúde. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Análise de Projetos de Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (# 0417/11) e pelo Comitê de Ética e Pesquisa d o Hospital Pérola Byington. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) contribuiu para a realização deste estudo com verba aprovada no Processo 2011/17245-0. 3.4 Critérios de inclusão Como critérios de inclusão, as pacientes de ambo s os grupos estavam no menacme, apresentavam ciclos eumenorreicos, não eram portadoras de dislipidemia, doenças aut oimunes, hormonais (SOP, tireoidopatias, outras) ou neoplasias malignas, e não utilizaram terapêutica antidislipidêmica ou hormonal nos três meses que antecederam a cirurgia. No caso de suspeita clínica de uma dessas condições, foram realizados exames laboratoriais e/ou de imagem para diagnóstico definitivo. Para o grupo com endometriose, houve confirmação histológica das lesões. Para o grupo sem endometriose, houve avaliação pélvica por vídeolaparoscopia que confirmou a ausência de lesões. 3.5 Dinâmica do estudo Foram obtidos os dados clínicos das pacien tes de ambos os grupos, incluindo os principais sintomas referidos por mulheres portador as de endometriose, quais sejam: dismenorr eia, dor pélvica acíclica, dispareunia de 23 profundidade, infertilidade, alterações urinárias cíclicas e alterações intestinais cíclicas. Considerou-se relevante a dismenorreia avaliada em escala visual analógica de dor, referida por nota igual ou acima de 7. Foram coletados também peso e altura das pacientes, para cálculo de índice de massa corpórea (IMC). Para o grupo com endometriose, o protocolo do Setor de Endometriose do HCFMUSP foi seguido: pacientes com quadro de dor pélvica e suspeita de endometriose em retossigm oide por exame de imagem (ultra ssom pélvico e transvaginal com preparo intestinal) usam terapêutica hormonal por 6 a 12 meses e são reavaliadas, nesse período, clinicamente e com novos exames de imagem. Na falha do tratamento, ou seja, diante da persistência de sintomas ou crescimento da lesão, há indicação de cirurgia. Em pacientes com quadro suboclusivo determinado por lesões intestinais profundas e extensas, a cirurgia é indicada de imediato. Este pr otocolo é seguido nas duas instituições participantes do estudo. As pacientes do grupo sem endometriose foram compostas por mulheres com prole constituída e com desejo de anticoncepção definitiva consentido pelo parceiro, registrado em cartório, de acordo com a aprovação do Setor de Planejamento Familiar da Divisão de Clínica Ginecológica de ambas as instituições (HCFMUSP e Hospital Pérola Byington). O procedimento realizado foi a laqueadura tubária laparoscópica. Foram realizados 54 videolaparoscopias con secutivas, sendo 28 para tratamento de endometriose profunda e 26 para laqueadura tubária. Devido ao achado de endometriose peritoneal incidental em laparoscopias para laqueadura tubária, foram excluídas do estudo 4 pacientes do grupo sem endometriose. Ainda, devido à necessidade de armazenamento do sangue periférico coletado no início de cada procedimento cirúrgico e posterior transporte dos tubos até o Laboratório de Metabolismo de Lípides do Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, ocorreu hemólise em 5 amostras de sangue das pacientes do grupo com endometriose e 2 amostras de pacientes do grupo sem endometriose, as quais foram retiradas do estudo. Foi verificado, no momento da extração do RNA e síntese de DNA 24 complementar, que quatro das amostras de RNA não estavam viáveis , e, por isso, foram excluídas do estudo, das quais três eram do grupo com endometriose e uma do grupo sem doença. Desta forma, o grupo com endometriose ficou composto por 20 pacientes e o grupo -controle (sem endometriose), por 19 mulheres. Figura 3 - Quadro explicativo da dinâmica do estudo. Foi registrado o dia do ciclo menstrual no momento da realização da cirurgia, sendo dividido em fase proliferativa quando a paciente estava entre o primeiro e o 14 o dia do ciclo e secretora, do 14 o ao último dia do ciclo menstrual (Ecochard & Gougeon, 2000). Esta divisão permitiu a análise de 11 pacientes (55%) na fase proliferativa e 9 (45%) na fase secretora no grupo com endometriose, e 10 mulheres (52,6%) na fase proliferativa e 9 (47,4%) na fase secretora, no grupo sem endometriose. 25 3.6 Procedimento cirúrgico e coleta das amostras Antes do início do procedimento cirúrgico, foram colhidos 20 ml de sangue periférico de cada paciente , coletado de punção venosa em membro superior, após jejum de 12 horas. As amostras de endométrio foram obtidas utilizando cureta de Pipelle ® nos dois grupos, imediatamente após indução anestésica e posicionamento da paciente. Os focos de endometriose pro funda foram totalmente ressecados como tempo obrigatório do tratamento cirúrgico proposto para erradicação da doença. Os fragmentos de endométrio e das lesões de endometriose profunda intestinal, determinados por meio de análise macroscópica (Figura 4), fo ram divididos em duas partes, uma delas armazenada em paraformaldeído 4% e encaminhada ao Laboratório de Anatomia Patológica do HCFMUSP e do Hospital Pérola Byington (de acordo com o local da coleta) para análise histológica. A outra parte foi armazenada e m solução de RNAlater® (Ambion Life Technologies , USA) e encaminhada ao laboratório de Metabolismo e Lípides do Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Figura 4 - Lesão de endometriose intestinal após ressecção segmentar. 26 As amostras de sangue foram encaminhadas imediatamente após a coleta ao Laboratório de Metabolismo e Lípides, em que foram centrifugadas a 3.000 rpm por 10 minutos para separação do soro, que , assim como os tecidos em solução de RNA later®, foram armazenados a -80°C para análises posteriores. 3.7 Lípides plasmáticos Para determinar o colesterol total (CT) e triglicerídeos (TG) , foi utilizado método enzimático colorimétrico comercial (Labtest, Brasil). O HDL colesterol (HDL-C) foi medido pelo mesmo método utilizado para o CT, após precipitação com fosfotungstato e cloreto de magnésio. O LDL colesterol (LDL-C) foi calculado pela fórmula de Friedewald (Friedewald et al.,1972), em que LDL = Colesterol Total – (VLDL + HDL) e VLDL, pela fórmula VLDL = TG/5. As concentrações séricas de apo AI e apo B 100 foram determinadas por método imunoturbidimétrico (Roche, Alemanha). 3.8 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA) Após procedimento cirúrgico, o tecido coletado foi ar mazenado em solução de RNA later® (Ambion Life Technologies , EUA) e seu RNA total foi extraído utilizando -se o reagente Trizol ® (Invitrogen Life Technologies , EUA), segundo instruções do fabricante . A qualidade das amostras foi verificada por meio de corrid a eletroforética em gel denaturante de agarose e as concentrações dessas foram determinadas por meio de leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 260/280 nm no aparelho NanoDrop 2000 Spectrophotometer (ThermoScientific, EUA), em que se consideraram satisfatórias razões que variavam de 1,8 a 2,0. Como já mencionado, quatro das amostras de RNA não estavam viáveis e por isso foram excluídas do estudo, das quais três eram do grupo com endometriose e 27 uma do grupo sem doença. As amostras -mãe foram estocadas a -80ºC e uma alíquota foi utilizada para a transcrição reversa. Para cada 16 µL (250 ng) de RNA a ser reversamente transcrito, acrescentou-se 4 µL do reagente Superscript® VILOTM Master Mix 5X (Invitrogen Life Technologies, EUA). Este produto foi incubado inicialmente por 10 minutos à temperatura de 25°C, por 60 minutos à temperatura de 42 °C e, por fim, por 5 minutos à temperatura de 85 °C. Após esta etapa, as amostras foram diluídas 5 vezes em solução TE-4 e armazenadas em - 80°C. 3.9 Análise de expressão gênica por PCR em tempo real A expressão gênica dos receptores LDL -R e LRP -1 foi analisada pela técnica de PCR em tempo real utilizando -se método de detecção Taqman com primers e sondas fluorescentes para a detecção do produto-alvo de PCR. Esse tipo de detecção é altamente específico, não necessitando padronização da reação. As reações de amplificação foram realizadas no equipamento StepOnePlus Real -Time PCR System (Applied Biosystems Life Technologies, EUA) em um volume final de 12 uL, constit uídos de 1,2 uL de cDNA (1:5), 4,2 uL de água Milli -Q, 6 uL de Taqman Universal PCR Master Mix , 0,6 uL de sonda Taqman 20x ( Taqman Gene Expression Assays ) específica de cada gene-alvo a ser analisado ou 0,6 uL do reagente Human GAPDH Pre - Developed TaqMan A ssay 20X, utilizado como gene normalizador (housekeeping gene ou endogenous control gene ). Os ensaios Taqman Gene Expression, tanto para o LDL -R ( Hs00181192_m1) quanto para o LRP -1 (Hs00233856_m1), bem como todos os reagentes utilizados para a reação foram adquiridos da Applied Biosystems Life Technologies, EUA). O programa gera um gráfico de intensidade de fluorescência em função do número de ciclos de amplificação. Um limiar ( threshold) é definido automaticamente, no qual a intensidade de fluorescência é estatisticamente diferente da fluorescência de fundo ( background) e a curva apresenta a fluorescência da amplificação aumentando exponencialmente. O número do 28 ciclo cuja fluorescência da amostra intercepta o threshold é chamado Ct ( cycle threshold). Os res ultados obtidos foram analisados de acordo com o software deste equipamento. Todas as reações foram realizadas em duplicata e consideradas aceitáveis as reações cujo desvio padrão foi menor que 0,4 ou menor que um Ct de diferença. A quantificação da expr essão gênica foi realizada com o cálculo da expressão bruta ou Ct comparativo demonstrado pelo algoritmo 2 -∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001). O valor de Ct equivale à diferença entre o Ct do gene de interesse e o Ct do gene normalizador. A diferença dos valores de Ct ( Ct) entre as amostras para cada gene (LDLR e LRP -1), após normalização pelo Ct do gene de expressão constante (GAPDH), reflete sua expressão diferencial. O resultado representa o número de vezes que o gene analisado tem a sua expressão aumentada ou diminuída nos tecidos estudados. Para este estudo , também foi calculada a expressão gênica relativa, utilizando-se o método 2 -∆∆ct, em que os Cts de GAPDH foram utilizados para normalização e o grupo -controle (endométrio de mulheres sem endometriose) foi utilizado como calibrador para cada receptor estudado. 3.10 Determinação proteica por imunoistoquímica Os blocos de tecido de biópsia foram solicitados ao Departamento de Anatomia Patológica do HCFMUSP e do Centro de Referência da Saúde da Mulher do Estado de São Paulo – Hospital Pérola Byington, em que foram realizadas as análises histológicas. Foram solicitadas lâminas dos b locos de material parafinado correspondentes aos tecidos de endométrio (grupo sem endometriose) e foco de endometriose (grupo com endometriose) para o preparo das lâminas de imunoistoquímica para análise dos receptores de LDL-R e LRP-1. A desparafinização das lâminas foi feita com 3 banhos de xilol de 10 minutos cada, seguidos de 3 banhos de etanol absoluto, 2 banhos de etanol 29 95% e um banho de etanol 75%. As lâminas com os cortes histológicos foram , então, lavadas em água corrente. Para realização da imunoistoquímica, a recuperação de antígenos foi realizada por calor úmido e pressão em câmara de pressão para recuperação antigênica Pascal (Dako, EUA) com tampão citrato 10 mM pH 6,0 para ambos os antígenos, anti-LDL-R e anti-LRP-1. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 4 banhos de 5 minutos de peróxido de hidrogênio a 3%. O bloqueio de reações inespecíficas foi feito com soro fetal bovino diluído em solução salina tamponada com sais fosfato (PBS) durante 1 hora em estufa umidificada a 37°C. Os anticorpos primários anti -LRP-1 (Calbiochem, Alemanha) e anti -LDL-R (Abcam, EUA) previamente padronizados, foram diluídos em PBS contendo 1% de albumina bovina. As lâminas foram incubadas por 18 horas a 4°C. O sistema de detecção foi o polímero SuperPicture (Dako, EUA), aplicado por 25 minutos nos tecidos. A reação foi revelada com diaminobenzidina (DAB) (Dako, EUA) e contracorado com hematoxilina de Harris. Os controles negativos foram feitos em tecido de fígado humano sem o uso do anticorpo primário. Os c ontroles positivos foram feitos em tecido de fígado humano seguindo todos os procedimentos descritos anteriormente. A análise qualitativa da expressão proteica foi feita em microscópio óptico Nikon Eclipse i80, acoplado a software de análise de imagem NIS-Elements AR 3.2 Imaging Software (Nikon Microscopy). A intensidade de cor do cromógeno DAB presente nos tecidos foi classificada de 1 a 4 (1:fraco, 2:médio, 3:forte, 4:muito forte) por 2 observadores independentes e cegos ao estudo. 3.11 Análise estatística As características físicas e perfil lipídico foram expressos em média e desvio padrão, comparados entre os grupos com e sem endometriose utilizando-se o Teste t-Student. 30 A fase do ciclo foi descrita com uso de frequências absolutas e relativas, e verificada associação entre os grupos com e sem endometriose, utilizando -se o teste qui-quadrado. Foi verificada a existência de correlações da idade e do IMC com a expressão gênica e com determinação proteica dos receptores LDL-R e LRP-1, em cada grupo, com e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose), por meio dos cálculos de correlação de Spearman. A expressão gênica e determinação proteica dos receptores LDL -R e do LRP-1 para cada grupo com e sem endometriose , e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose), foram comparadas entre as fases do ciclo menstrual, utilizando -se o teste Mann -Whitney, para verificar se há influência da fase do ciclo menstrual na expressão dos receptores. O score de intensidade de marcaç ão dos receptores LDL -R e LRP -1, avaliados por imunoistoquímica, foram comparados entre os grupos com e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose) com uso de equações de estimação generalizadas com distribuição marginal Poisson e função de ligação identidade, supondo matriz de correlações permutável entre os locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose) de uma mesma mulher. A expressão gênica dos receptores LDL -R e LRP -1 foram comparadas entre os grupos com e se m endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose) com uso de equações de estimação generalizadas com distribuição marginal gama e função de ligação identidade, supondo matriz de correlações permutável entre os locais de avaliação ( endométrio e lesão de endometriose) de uma mesma mulher. Ambas as análises foram ajustadas pelo IMC e pela fase do ciclo menstrual. Foram realizadas comparações múltiplas de Bonferroni para saber entre quais grupos (com e sem endometriose) ou locais de a valiação (endométrio ou lesão de endometriose) ocorreriam diferenças na expressão dos receptores LDL-R e LRP-1. Os testes foram realizados com nível de significância de 5%. 4 RESULTADOS 33 4 RESULTADOS 4.1 Características físicas, fase do ciclo menstrual e quadro clínico As mulheres selecionadas para o presente estudo, alocadas em dois grupos, o grupo com endometriose (20) e o grupo sem endometriose (19), foram pareadas por idade. Mulheres do grupo com endometriose apresentaram médias de peso (62,6 ± 10,5 vs. 73,7 ± 8,4; p = 0,001), altura (1,61 ± 0,07 vs. 1,65 ± 0,06; p = 0,046) e índice de massa corpórea (IMC) (24,1 ± 3,2 vs. 26,9 ± 2,9; p = 0,006) significativamente menores do que as mulheres do grupo sem endometriose, como pode ser observado na Tabela 2. Além disso, as mulheres que compõem os grupos deste estudo, com e sem endometriose, foram separadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em que se encontravam, fase proliferativa ou fase secretora. Do g rupo com endometriose, 11 mulheres se encontravam na fase proliferativa e nove na fase secretora. Das mulheres sem endometriose, nove se encontravam na fase proliferativa e nove na fase secretora (Tabela 2). Tabela 2 - Características físicas e fases do ciclo menstrual em mulheres com e sem endometriose. COM EDT (n = 20) SEM EDT (n = 19) p Características físicas Idade (anos) 35,7 ± 6,3 33,6 ± 5,7 0,288 Peso (Kg) 62,6 ± 10,5 73,7 ± 8,4 0,001 Altura (m) 1,61 ± 0,07 1,65 ± 0,06 0,046 IMC (Kg/m2) 24,1 ± 3,2 26,9 ± 2,9 0,006 Fase do ciclo menstrual n (%) 0,882* Proliferativa 11 (55) 10 (52,6) Secretora 9 (45) 9 (47,4) Dados expressos em média ± desvio padrão. EDT: endometriose. IMC: índice de massa corpórea. Teste t-Student; * Teste qui-quadrado. 34 O quadro clínico das pacientes selecionadas para o estudo do grupo com endometriose evidencia sintomatologia álgica exuberante, com prevalência de 55% de pacientes com dismenorreia severa (EVA >7), de acordo com a Escala Visual Analógica de Dor (EVA), que classifica de 0 a 10 os sintomas de acordo com a sua intensidade. Outros sintomas típicos da doença, como dor pélvica crônica (45%), dispareunia de profundidade (50%), alterações urinárias cíclicas (10%) e alterações intestin ais cíclicas (40%) também foram observados neste grupo. A infertilidade esteve presente na maioria das pacientes selecionadas, com prevalência de 60%. Não foram observados sintomas álgicos relevantes no grupo sem endometriose. Toda esta caracterização pode ser visualizada na Tabela 3. Tabela 3 - Quadro clínico de mulheres com e sem endometriose. Com EDT (n=20) Sem EDT (n=19) Sintomas P Dismenorreia Severa (EVA > 7)* 11 (55%) 1 (5,2%) 0,001 Dor Pélvica Crônica 9 (45%) 0 (0%) 0,001 Dispareunia de Profundidade 10 (50%) 0 (0%) <0,001 Sintomas Urinários Cíclicos 2 (10%) 0 (0%) 0,487 Sintomas Intestinais Cíclicos 8 (40%) 0 (0%) 0,003 Infertilidade 12 (60%) 0 (0%) <0,001 *EVA: Escala Visual Analógica de Dor; Teste qui-quadrado. 4.2 Perfil lipídico A concentração de LDL -colesterol das mulheres do grupo com endometriose foi, em média, mais baixa quando comparado às mulheres sem a doença (119 ± 23 vs.156 ± 35; p = 0,001), como pode ser observado na Tabela 4. Na Tabela 4 , pode -se notar qu e a concentração de apo B100 seguiu o mesmo padrão da concentração de LDL -colesterol: mulheres com endometriose apresentaram concentração de apo B100 menor que das 35 mulheres sem a doença (76 ± 20.9 vs. 91,7 ± 30,8). No entanto, esta diferença não foi estatisticamente significativa (p = 0,085). Os demais parâmetros não apresentaram diferenças significativas. Tabela 4 - Determinação de lípides plasmáticos em mulheres com e sem endometriose. COM EDT (n = 17) SEM EDT (n = 19) p Colesterol (mg/dL) Total 187 ± 27 194 ± 37 0,562 HDL 42 ± 9 43 ± 14 0,792 LDL 119 ± 23 156 ± 35 0,001 Triglicerídeos (mg/dL) 130 ± 40 119 ± 55 0,486 Apolipoproteínas (mg/dL) AI 128,1 ± 33,3 136,5 ± 19,9 0,373 B100 76 ± 20,9 91,7 ± 30,8 0,085 Dados expressos em média ± desvio padrão. EDT: endometriose. HDL: lipoproteína de alta densidade. LDL: lipoproteína de baixa densidade. Teste t-Student; 4.3 Expressão gênica de LDL -R e LRP -1 por PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) Na análise da expressão gênica dos receptores de LDL, determinada por qRT-PCR, foi comparado o endométrio tópico (endométrio COM EDT) e foco de endometriose (Lesão EDT) de mulheres com endometriose com o endométrio tópico de mulheres sem endometriose (SEM EDT). A expressão gênica foi calculada considerando-se o valor bruto, baseado no método 2-∆Ct. No Gráfico 1 e na Tabela 5, pode-se observar que a expressão gênica do LDL- R na lesão de endometriose aumentou cerca de 50% quando comparada com o endométrio da paciente com endometriose (p < 0,001). Esse aumento esteve presente em 85% das mulheres com endometriose (17 casos de 20). Quando comparada a lesão de endometriose com o endométrio de mulheres sem endometriose, não houve diferença na expressão do receptor em questão. 36 A expressão gênica do LRP-1 na lesão de endometriose aumentou na ordem de 5x, quando comparada ao endométrio de mulheres com endometriose (p < 0,001) e, na ordem de 2x, quando comparada ao endométrio de mulheres sem a doença (p = 0,004), como pode ser observado no Gráfico 2 e Tabela 5. Esse aumento esteve presente em 95% das mulheres com endometriose (19 casos de 20). Quando comparada a lesão de endometriose com o endométrio de mulheres sem endometriose, 90% das pacientes apresentaram aumento na expressão gênica do LRP-1 (18 casos de 20). Gráfico 1 – Expressão gênica de LDL-R. - Gráfico de barras mostrando o valor médio (erro padrão) dos níveis de RNAm para LDL -R em amostras de endométrio de mulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres com endometriose, sendo que uma amostra é proveniente do endométr io (endométrio COM EDT) e, a outra, da lesão de endometriose (Lesão EDT) da mesma paciente. O gráfico está representado em escala logarítmica na base 10. 37 Gráfico 2 – Expressão gênica de LRP -1 - Gráfico de barras mostrando o valor médio (erro padrão) dos níveis de RNAm para LRP -1 em amostras de endométrio de mulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres com endometriose, sendo que uma amostra é proveniente do endométrio (endométrio COM EDT) e, a outra, da lesão de endometr iose (Lesão EDT) da mesma paciente. O gráfico está representado em escala logarítmica na base 10. 38 Tabela 5 -Comparações múltiplas sob os níveis de RNAm para os receptores LDL-R e LRP-1 entre grupos com e sem endometriose , e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose), RNAm Comparação Diferença média Erro padrão p LDL-R Com EDT/Endométrio - Sem EDT/Endométrio -0,0064 0,0032 0,130 Com EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,0155 0,0039 <0,001 Sem EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,0092 0,0046 0,143 LRP-1 Com EDT/Endométrio - Sem EDT/Endométrio -0,0418 0,0277 0,392 Com EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,2208 0,0498 <0,001 Sem EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,1790 0,0555 0,004 Comparações múltiplas de Bonferroni (gl = 1). EDT: endometriose. 4.4 Determinação proteica de LDL-R e LRP-1 por imunoistoquímica A determinação proteica de LDL -R e LRP -1 foi realizada por meio da técnica de imunoistoquímica. A análise dos resultados foi realizada de ma neira qualitativa de acordo com a intensidade de marcação avaliada por dois observadores independentes. A intensidade de marcação variou de 1 a 4, sendo: 1 = fraca; 2 = média; 3 = forte; e 4 = muito forte. É possível visualizar essa variação de intensidade nas marcações das reações de imunoistoquímica para os receptores analisados, LDL -R e LRP -1, na Figura 4. 39 Figura 5 - Fotomicrografias representativas de imunoistoquímica para LDL-R e para LRP -1. A e D: endométrio de pacientes s em endometriose; B e E: endométrio de pacientes com endometriose; C e F: Lesão de endometriose . Aumento de 100X. Como mostrado na Figura 5, pode -se observar que houve maior intensidade de marcação no endométrio, principalmente de mulheres sem endometriose, tanto para LDL-R quanto para LRP-1. A Tabela 6 mostra este mesmo resultado de forma numérica por meio da leitura qualitativa ( score variando de 1 a 4) para cada receptor analisado em A B D C E F LDL-R LRP-1 40 ambos os grupos estudados, com e sem endometriose , e locais de avaliaçã o (endométrio e lesão de endometriose). Por esta análise, pôde -se observar que houve diferença entre os grupos, demonstrando maior intensidade de marcação para LDL -R (p = 0,026) em endométrio de mulheres sem endometriose comparado ao endométrio de mulheres com a doença e à lesão de endometriose. No entanto, a intensidade de marcação para LRP -1 não apresentou diferença entre os grupos com e sem endometriose , e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose) (p = 0,073). Tabela 6 - Análise qualitativa da intensidade de marcação dos receptores LDL- R e LRP-1 por imunoistoquímica nos grupos com e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose). Grupo/Local imunoistoquímica Sem EDT/ Endométrio Com EDT/ Endométrio Com EDT/ Lesão EDT p* n (%) n (%) n (%) LDL-R 0.026 2 0 (0) 2 (10) 10 (50) 3 4 (21,1) 9 (45) 8 (40) 4 15 (78,9) 9 (45) 2 (10) LRP-1 0.073 1 0 (0) 1 (5) 4 (20) 2 0 (0) 1 (5) 5 (25) 3 10 (52,6) 12 (60) 11 (55) 4 9 (47,4) 6 (30) 0 (0) Total 19 (100) 20 (100) 20 (100) Análise qualitativa, sendo: 1 = fraco; 2 = médio; 3 = forte; 4 = muito forte. * Resultados ajustados pelo IMC e pela fase do ciclo menstrual. EDT: endometriose Como foi observada diferença na inte nsidade de marcação para LDL -R, foi realizada uma análise de comparações múltiplas para este receptor comparando-se grupos (com e sem endometriose) e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose), conforme demonstrad o na Tabela 7. É possível obs ervar uma tendência de a intensidade de marcação para LDL -R ser maior no endométrio do que na lesão das mulheres com endometriose. Porém, não houve diferença estatística (p = 0,053). 41 Tabela 7 - Comparações múltiplas sob o score de intensidade de marcação para LDL-R entre grupos com e sem endometriose , e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose). Comparação Diferença média Erro padrão p Com EDT/Endométrio - Sem EDT/Endométrio -0.30 0.66 >0,999 Com EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT 0.75 0.32 0.053 Sem EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT 1.05 0.63 0.290 Comparações múltiplas de Bonferroni (gl = 1). EDT: endometriose. 4.5 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corp órea (IMC), idade e fases do ciclo menstrual De acordo com análise comparativa realizada no presente estudo (Tabela 8), foi observado que o IMC apresentou correlação direta com a expressão gênica de LRP-1 (níveis de RNAm) na lesão de endometriose (r = 0,501 e p = 0,024) e com a intensidade d e marcação para LDL -R (proteína) no endométrio de mulheres sem endometriose (r = 0,460 e p = 0,048). Tabela 8 – Análise de correlação entre idade e IMC com o score de intensidade de marcação e níveis de expressão de RNAm de LDL -R e de LRP- 1 nos grupos com e sem endometriose , e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose). Correlação Sem EDT/Endométrio Com EDT/Endométrio Com EDT/Lesão EDT Idade (anos) IMC (Kg/m2) Idade (anos) IMC (Kg/m2) Idade (anos) IMC (Kg/m2) proteína LDL-R r 0.000 0.460 0.030 0.116 -0.062 0.275 p >0,999 0.048 0.900 0.628 0.795 0.241 LRP-1 r -0.303 0.087 -0.357 -0.123 -0.258 -0.326 p 0.207 0.724 0.122 0.604 0.273 0.160 RNAm LDL-R r -0.003 0.204 -0.070 -0.076 0.039 0.372 p 0.991 0.401 0.769 0.750 0.870 0.107 LRP-1 r 0.098 0.107 -0.136 -0.284 0.078 0.501 p 0.690 0.663 0.566 0.224 0.743 0.024 Correlação de Spearman. EDT: endometriose. IMC: índice de massa corpórea. 42 Com relação à divisão da fase do ciclo menstrual, proliferativa ou secretora, foi encontrado que os níveis de expressão de RNAm de LDL -R no endométrio de mulheres com endometriose foram maiores na fase secretora (p = 0,001), assim como os níveis de expressão de RNAm do LRP -1 no endométrio de mulheres sem endometrios e (p = 0,008) também foram maiores na fase secretora, conforme pode ser visto na Tabela 9. Tabela 9 – Expressão gênica de LDL -R e LRP -1 em cada grupo com e sem endometriose nas fases do ciclo menstrual. Grupo/Local Expressão gênica Fase do Ciclo Total p Proliferativa Secretora Com EDT/ Endométrio LDL-R 0,007 ± 0,003 0,017 ± 0,01 0,012 ± 0,009 0,001 LRP-1 0,108 ± 0,097 0,067 ± 0,03 0,089 ± 0,076 0,710 Sem EDT/ Endométrio LDL-R 0,015 ± 0,008 0,024 ± 0,011 0,019 ± 0,01 0,065 LRP-1 0,093 ± 0,038 0,162 ± 0,085 0,126 ± 0,072 0,008 Com EDT/ Lesão EDT LDL-R 0,025 ± 0,023 0,029 ± 0,02 0,027 ± 0,022 0,261 LRP-1 0,291 ± 0,159 0,327 ± 0,264 0,307 ± 0,207 0,941 Dados expressos em média ± desvio padrão. Teste Mann-Whitney. EDT: endometriose A Tabela 10 mostra a correlação da fase do ciclo menstrual com a intensidade de marcação para LDL-R e LRP-1. Como pode ser observado, não houve diferença na intensidade de marcação para LDL -R e LRP -1 em cada grupo e local de avaliação, independentemente da fase do ciclo menstrual em que as mulheres se encontravam (p > 0,05). 43 Tabela 10 – Análise qualitativa da intensidade de marcação para LDL-R e LRP- 1 em cada grupo com e sem endometriose nas fases do ciclo menstrual. Fase do Ciclo Grupo/Local Imunoistoquímica Proliferativa Secretora Total p n (%) n (%) n (%) Sem EDT/ Endométrio LDL-R 0.497 3 3 (30) 1 (11,1) 4 (21,1) 4 7 (70) 8 (88,9) 15 (78,9) LRP-1 0.182 3 7 (70) 3 (33,3) 10 (52,6) 4 3 (30) 6 (66,7) 9 (47,4) Total 10 (100) 9 (100) 19 (100) Com EDT/ Endométrio LDL-R 0.941 2 1 (9,1) 1 (11,1) 2 (10) 3 5 (45,5) 4 (44,4) 9 (45) 4 5 (45,5) 4 (44,4) 9 (45) LRP-1 0.456 1 0 (0) 1 (11,1) 1 (5) 2 1 (9,1) 0 (0) 1 (5) 3 8 (72,7) 4 (44,4) 12 (60) 4 2 (18,2) 4 (44,4) 6 (30) Total 11 (100) 9 (100) 20 (100) Com EDT/ Lesão de endometriose LDL-R 0.766 2 5 (45,5) 5 (55,6) 10 (50) 3 5 (45,5) 3 (33,3) 8 (40) 4 1 (9,1) 1 (11,1) 2 (10) LRP-1 >0,999 1 2 (18,2) 2 (22,2) 4 (20) 2 3 (27,3) 2 (22,2) 5 (25) 3 6 (54,5) 5 (55,6) 11 (55) Total 11 (100) 9 (100) 20 (100) Análise qualitativa, sendo: 1 = fraco; 2 = médio; 3 = forte; 4 = muito forte. EDT: endometriose. 5 DISCUSSÃO 47 5 DISCUSSÃO Esse estudo representa a primeira fase de uma linha de pesquisa promissora para o tratamento da endometriose profunda e, de acordo com os resultados obtidos, poderá contribuir para a compreensão da progressão de lesões profundas; esta s consideradas temidas por sua capacidade proliferativa, podendo tomar proporções tumorais expressivas. Trata-se da investigação acerca da expressão de receptores de LDL em membrana celular de endometriose profunda, neste caso , realizado exclusivamente em lesões intestinais, com a finalidade de aventar a utilização de nanopartículas lipídicas para direcionamento de fármacos ao interior da lesão. O desenvolvimento de nanopartículas com aplicações em Drug Delivery Systems (DDS) tem grande destaque nas pesquisas médicas da atualidade (Davis et al.; Zhang et al., 2008). Partículas estáveis, nã o tóxicas e capazes de transportar os fármacos até seu local de ação, aumentando a seletiv idade e especificidade do trata mento, tem grande importância na otimização de terapias quimioterápicas (Contente et al., 2014). Os estudos que evidenciaram o papel do colesterol na oncogênese foram de extrema importância clínica, por demonstrarem que células tumorais apresentam maior ca ptação de LDL quando comparados às células normais. (Nomura et al., 1991; Swanson et al., 1994; Pandolfino et al., 1997; Tomiki et al., 2004). Considerando a influência direta da dieta rica em gordura saturada sobre os níveis de colesterol séricos ( Vartiainen et al., 2016), avaliamos as características físicas das pacientes em nosso estudo e os resultados demonstraram média de idade semelhantes nos dois grupos, sem endometriose e com endometriose (33,6±5,7 vs 35±6,3, p=0,288), respectivamente. 48 Observamos que o grupo de mulheres sem endometriose, formado por multíparas com desejo de submeterem -se à laqueadura tubária laparoscópica, apresentaram valores maiores de peso (73,7±8,4 vs 62,6±10,5, p=0,001), de altura (1,65±0,06 vs 1,61±0,07, p=0,046) e também de índice de massa corpórea (26,9±2,9 vs 24,1±3,2, p=0,006) comparado ao grupo de mulheres com endometriose. Analisando os sintomas clínicos entre os dois grupos , observamos que houve alta prevalência de pacientes com infertilidade (60%) , o que pode representar justificativa para a diferença observada em relação ao peso e IMC, uma vez que, segundo Paulino et al. (Paulino et al., 2016), multíparas são duas vezes mais propensas à obesidade comparado a nulíparas no início de uma gestação. O estudo observacional controlado, realizado com 130 primigestas e 160 multíparas, evidenciou que 54,62% das primigestas iniciaram o pré-natal com índice de massa corpórea de normalidade enquanto que, no grupo das multíparas, os índices compatíveis com obesidade foram registrados em 62,51% das mulheres (Paulino et al., 2016). Outra observação válida, ainda com relação à diferença do IMC entre os dois grupos, é qu e ambos estão distantes da classificação de obesidade que estipula valores de IMC entre 30 a 39,9 kg/m2 (Flegal et al., 2013). Desta feita, chamou -nos fortemente a atenção os resultados obtidos na avaliação do perfil lipídico, em que observamos que, de forma análoga aos resultados observados em alguns tumores, o grupo de pacientes com endometriose apresentou níveis inferio res estatisticamente significativos de LDL-c com relação ao grupo controle (119±23 vs 156±35mg/dL, p=0,001). Este resultado, pesquisado pela primeira vez em pacientes com endometriose profunda intestinal, sugere aumento do consumo de colesterol em mulheres com esta forma da doença. Diante deste resultado, considerando as evidências da literatura, que demonstra a associação de hipocolesterolemia em pacientes com câncer em diversos órgãos distintos, inclusive o intestino grosso (Nomura et al., 1991; Tomiki et al., 2004) e, ainda, determina o estado de hipocolesterolemia como marcador de atividade proliferativa em leucemia aguda (Pandolfino et al., 49 1997), consideramos haver a possibilidade deste tipo de associação em pacientes com endometriose profunda. Analisando o quadro clínico do grupo de mulheres com endometriose, observamos tratarem -se de pacientes muito sintomáticas, das quais 55% apresentavam a queixa de dismenorreia severa, ou seja, com score da escala visual analógica de dor > 7, 45% evoluíam com dor pélvica crônica, 50% com dispareunia de profundidade e 40% relatavam dor às evacuações no período menstrual. Deste modo, podemos inferir que nosso grupo foi constituído por pacientes com a doença em franca atividade inflamatória, considerando as características e a intensidade da sintomatologia. Não foram observadas diferenças entre os grupos, sem endometriose e com endometriose, nas concentrações de colesterol total (194±37 vs 187±27mg/dL; p=0,562), HDL -c (43±14 vs 42±9mg/dL; p=0,792), e triglicérides (11 9±55 vs 130±40mg/dL; p=0,486). Em relação às apolipoproteínas, também não houve diferença na concentração de apo A1 (136,5±19,9 vs 128,1±33,3 mg/dL) ou na concentração de Apo B100 (91,7±30,8 vs 76±20,9 mg/dL; p=0,085) entre os grupos. Em estudo realizado p or Melo et al. (Melo et al., 2010), foi observada diferença significativa nos níveis de LDL -c no grupo de mulheres com endometriose quando comparado com o grupo de mulheres denominadas sem endometriose, demonstrando perfil lipídico desfavorável, com aument o de 38% nos níveis de LDL -c em pacientes com a doença. Porém, nesta pesquisa, as pacientes consideradas sem endometriose não tinham confirmação da inexistência da doença, apenas o fato de não apresentarem infertilidade ou dor pélvica. Há descrição na lite ratura de até 22% de achados incidentais de endometriose em pacientes assintomáticas submetidas à laqueadura tubária (Cramer; Murphy, 2002) Além disso, não foi discriminado qual tipo de endometriose compunha o grupo de mulheres com a doença; se a forma sup erficial, ovariana ou profunda. Em nosso estudo, o objetivo foi avaliar exclusivamente a doença profunda em sua forma nodular, devido a sua semelhança com lesões expansivas tumorais, independente da presença de aderências ou outros achados como o endometrioma ovariano. 50 Com relação ao grupo controle de nosso estudo, todas as mulheres que apresentaram achados incidentais de endometriose peritoneal, superficial ou profunda, no momento da laqueadura, total de quatro pacientes, foram excluídas do estudo. Apesar da atividade física e da perda de peso em indivíduos obesos ter sido associada com redução da pressão arterial, dos níveis séricos de triglicérides e LDL -c e aumento dos níveis séricos de HDL -c (Ades et al. , 2014), em recente estudo publicado por Franklin et al. (Franklin et al., 2014), os autores afirmam a influência positiva da atividade física, superior à dieta de restrição, para redução de níveis de quilom ícrons e VLDL -c, porém não observa benefícios da atividade física para redução dos níveis de LDL -c. Embora em nosso estudo não terem sido investigados quais pacientes praticavam atividade física, e, diante de todas as evidências apresentadas, consideramos de grande relevância o fato das pacientes com endometriose profunda terem apresentado níveis inferiores de LDL-c comparados ao grupo- controle. Sugerimos que novos estudos, com metodologia semelhante com relação ao critério de seleção de pacientes e número maior de indivíduos , sejam realizados para observação desta associação. 5.1 Expressão de RNAm dos receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) O objetivo principal desse estudo foi avaliar a expressão gênica e a determinação proteica dos receptores de LDL (LDL -R e LRP-1), com o intuito de compreender o comportamento celular da lesão profunda de endometriose com relação ao consumo de colesterol, ou seja, se haveria ou não uma avidez por parte do nódulo deste metabólito. De acordo com os resultados obtidos , observamos que o nível médio de expressão do RNAm do LDL -R foi maior na lesão de endometriose que no endométrio de mulheres com EDT (p < 0,001), já o nível médio de expressão do RNAm do LRP -1 foi maior na lesão de endometriose de mulheres com 51 EDT que no endométrio de mulheres com e sem EDT (p < 0,001 e p = 0,004 , respectivamente). Conforme demonstraram Goldstein e Brown (Goldstein & Brown, 2009), se uma célula exigir colesterol haverá aumento da expressão de receptores de LDL em sua membrana enquanto, se o conteúdo de colesterol de uma célula estiver elevado, haverá uma diminuição do número de receptores sintetizados. Deste modo, admite -se que há um mecanismo regulatório de receptores de LDL na superfície da célula (Goldstein & Brown, 2009). O colesterol é um componente essencial de membrana plasmática de células e também o precursor para a fabricação de todos os hormônios esteroides e ácidos biliares, além de desempenhar papel crucial na formação da bainha de mielina que rodeia axônios (Goldstein & Brown, 2009). Dentro da célula, o colesterol derivado de LDL estabelece várias funções reguladoras, incluindo a inib ição da síntese do colesterol por mecanismo de feedback. Além disso, os estudos do receptor de LDL deram origem ao conceito de endocitose mediada pelo receptor (Goldstein & Brown, 2009). No contexto tumor, a expressão de LRP-1 deve responder positivamente à hip óxia ( Montel et al., 2007), porém os mecanismos regulatórios moleculares basais não foram bem caracterizados e compreendidos até agora (Emonard et al., 2014). Em tecidos normais, o LRP -1 é expresso por hepatócitos, macrófagos, fibroblastos, neurônios e células do músculo liso vascular , e há evidências que desempenha um papel importante na progressão do câncer ( Moestrup et al., 1992). Diversos estudos demonstraram que o LRP -1 foi superexpresso em vários tipos de câncer, como o de mama ( Catasus et al., 2011a; Li et al., 1998), de endométrio ( Catasus et al., 2011b), de próstata ( McGarvey et al., 1996) e glioblastoma (Lopes et al., 1994; Yamamoto et al., 1997; Gopal et al., 2011). Além disso, Baum et al. relataram que a amplificação do gene de LRP - 1 foi observada em alguns astrocitomas (Baum et al., 1998). Catasús et al. demonstraram também que a expressão de LRP -1 se associa aos carcinomas da mama triplo -negativo e HER-2/neu, mas não com o carcinoma dependente de hormônios, e que este receptor aumenta de 52 expressão de acordo com o grau de proliferação e invasão ( Catasus et al., 2011a). Observou-se, portanto, que a expressão de LRP -1 em células tumorais parece altamente dependente do tecido, o subtipo do câncer e o grau (Emonard et al., 2014). De modo contraditório, outros estudos mostraram que a baixa expressão de LRP-1 pode estar associada a um fenótipo mais agressivo de vários tipos de tumor e que o nível diminuiu significativamente nos tipos invasivos em comparação com não invasivos em células de melano ma e próstata ( Kancha et al., 1994; de Vries et al., 1996). Verificou-se, também, que um baixo nível de expressão LRP -1 foi associado com a agressividade e invasividade no carcinoma hepatocelular ( Huang et al., 2012), com evolução clínica desfavorável numa coorte de 439 pacientes com adenocarcinomas do pulmão (Meng et al., 2011) e alta atividade de metástase em carcinoma folicular de tireoide (Sid et al., 2006). Consideramos, portanto, que a superexpressão de receptores de LDL em focos de endometriose profu nda pode ter importante significado no que concerne a visão fisiopatológica do desenvolvimento e progressão deste tipo de doença. Além do colesterol atuar como substrato para divisão celular e componente de membrana, atua como precursor de hormônios ester oides, e esta função pode representar papel de grande impotância no contexto do crescimento de lesões profundas. Sabe-se que a atividade estrogênica desempenha papel etiopatogênico fundamental na endometriose contribuindo tanto na explicação de atividade de lesões quanto no mecanismo de dor (Brown e Farquar, 2014). A proteína ativa reguladora de esteroidogênese (STAR) é responsável pelo passo inicial da formação de estrogênios, isto é, a entrada de colesterol na mitocôndria. Em seguida, cinco proteínas catal isam etapas enzimáticas para converter o colesterol em estradiol biologicamente ativo. A etapa principal, a conversão dos ester oides C19 em estrogênios, é catalisada pela aromatase, a qual sua inibiçã o elimina de forma eficaz todo processo de produção de estrogênio (Bulun et al., 2005). 53 A produção de estrogênio em mulheres com endometriose origina -se de três possibilidades distintas: o estradiol secretado pelo ovário, a conversão de androstenediona em estrona e , posteriormente, em estradiol, fenômeno catalisado pela aromatase no tecido adiposo e pele, e o colesterol, que é convertido em estradiol localmente no tecido com endometriose porque expressa um conjunto completo de genes esteroidogênicos, incluindo o gene da aromatase. A atividade da aromatase perifé rica ou local, ou ambos, pode ser particularmente importante na persistência da endometriose ( Bulun et al., 2005). Existem claras diferenças moleculares entre o endométrio tópico e o tecido encontrado nos focos de endometriose, em que se observa o aumento da produção de estrogênio, prostaglandinas e citocinas, os quais determinam a inflamação presentes na endometriose. No endométrio tópico de mulheres sem endometriose , a atividade da enzima ciclo -oxigenase-2 (COX -2) e, consequentemente, a produção de prosta glandinas E 2 (PGE2) são baixas. O estrogênio não é produzido localmente, devido à ausência da enzima aromatase. No endométrio de mulheres com endometriose , observa-se aumento da atividade de COX-2 e atividade detectável de aromatase, levando à maior formaç ão de PGE 2, tanto no endométrio tópico quanto no foco de endometriose, causando cólicas menstruais severas e dor pélvica crônica (Bulun, 2009). Em estudo que avaliou a expressão de SR -B1 ( Scavenger Receptor Class B1), que regula a entrada nas células de li poproteínas de alta densidade (HDL -c), atuando como precursor de síntese de estrogênios, foi observado aumento da exp ressão tanto do gene quanto da proteína no endométrio e, mais intensamente, no tecido com endometriose. Deste modo , o autor propõe o uso de inibidores de SR -B1 associado a inibidores de aromatase como alternativa de tratamento clínico da endometriose (Ramachandran et al., 2001). Assim, entendemos que a superexpressão de receptores de LDL no foco de endometriose, com resultado significativamen te superior ao encontrado no endométrio, tanto de mulheres com a doença quanto nas mulheres sem endometriose, representa importante achado no que concerne à 54 internalização do colesterol , permitindo o desencadeamento da produção autóctone do estrogênio e , consequentemente, influenciando no mecanismo de progressão e inflamação. Do ponto de vista terapêutico , estes resultados são animadores no direcionamento a novas possibilidades como o uso das estatinas, inibidoras da 3 hidroxi 3 metilglutaril Coenzima A Red utase (HMG CoA), que visam reduzir os níveis séricos de colesterol. Estudos in vitro e in vivo iniciados em 2007 v êm demonstrando os benefícios das estatinas para o tratamento medicamentoso da endometriose por meio de sua ação antiproliferativa, anti - inflamatória, antioxidante, antiangiogênica e inibidora de matriz metaloproteinase (Gibran et al., 2014). Outra possibilidade promissora é o uso de nanoemulsão lipídica que permite o acoplamento de drogas antiproliferativas em seu interior e vem sendo utilizado no tratamento de diversos tipos de neoplasias (Valduga, 2003; Azevedo, 2005; Mendes; Pires, 2009). A nanoemulsão denominada LDE é rica em colesterol e absorvida pelos receptores de LDL ( Maranhão et al., 1992; Maranhão et al., 1993; Maranhão et al., 1994). É fabricada sem proteína , mas, em contato com o plasma, adquire apo E, que também é reconhecida pelos receptores de LDL permitindo a endocitose da nanoemulsão. Assim , pode ser utilizada para direcionar as drogas ant ineoplásicas contra células cancerosas que superexpressam o receptor de LDL (Ades et al., 2001). Foi demonstrado que, após a injeção intravenosa em pacientes, a nanoemulsão (LDE) pode se concentrar em células de leucemia e em tumores sólidos, tais como carcinomas dos ovários e de mama que superexpressam esses receptores ( Maranhão et al., 1994; Ades et al., 2001; Graziani et al., 2002). Recentemente, a associação de fármacos antineoplásicos com LDE, tais como carmustina e compostos derivatizados de etoposide e do paclitaxel, foram testados (Maranhão et al., 2002; Valduga et al., 2003; Rodrigues et al., 2005). A derivatização com ácido oleico foi utilizada como uma estratégia para melhorar o rendimento da associação e a estabilidade do fármaco, 55 quando associado a LDE (Maranhão et al., 2002; Valduga et al., 2003; Rodrigues et al., 2005). A associação com as drogas não altera as propriedades biológicas da nanoemulsão, tal como a capacidade de ligação a receptores de LDL. Complexos estáveis LDE -drogas com atividade citotóxica preservada das drogas associadas foram obtidos e foi demonstrado, em estudos in vitro e in vivo, que os efeitos secundários dos fármacos antineoplásicos foram notavelmente reduzidos (Maranhão et al., 2002; Valduga et al., 2003; Rodrigues et al., 2005). A associação LDE -paclitaxel comprovou ser muito menos tóxica e demonstrou capacidade de concentrar a droga nos locais tumorais (Dias et al., 2007). Deste modo, inferimos a hipótese de aplicação desta tecnologia e classe de fármacos no tratamento da endometriose profunda em sua form a mais agressiva, e, para isso, iniciamos a viabilização desta possibilidade por meio de pesquisa da presença de “porta de entrada” das nanoemulsões, que são os receptores de LDL. 5.2 Determinação proteica por imunoistoquímica dos receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) Os resultados observados por meio da análise qualitativa do score de intensidade de determinação proteica dos receptores LDL -R e LRP -1 foram diferentes da expressão gênica , pois demonstraram que não foi possível identificar entre quais grupos (com e sem endometriose) e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose) ocorreram diferenças no score de intensidade de marcação para LDL -R (p > 0,05), mas sugere que a intensidade de marcação para LDL -R é maior no endométrio do que na lesão das mulheres com EDT (p = 0,053). Embora as proteínas sejam moléculas funcionais para os processos fisiológicos mais relevantes, estudos que comparam o RNA mensageiro (RNAm) com a abordagem proteômic a podem apresentar diferentes resultados, pois as variações na quantidade de proteína nem sempre se 56 correlacionam com níveis de RNAm e as proteínas podem ser modificadas na sua estrutura em função de alterações pós -tradução, incluindo a maturação proteolítica, fosforilação, glicosilação, as quais só podem ser detec tadas por meio do estudo das proteínas diretamente (Evans et al., 2014). Em tecidos reprodutivos, LRP -1 é conhecido por ser expresso na placenta (Zheng et al.,1994; Fischer et al.,2001), nos ovários (Moestrup et al., 1992; Zheng et al. ,1994) e no endométri o (Moestrup et al. ,1992; Zheng et al.,1994; Sayegh et al.,1995; Foca et al., 2000). No estudo de Sayegh et al. , houve acentuada coloração por imunoistoquímica de LRP -1 em estroma endometrial tanto na fase proliferativa quanto na fase secretora (Sayegh et al., 1995), enquanto epitélio e glândulas endometriais resultaram uniformemente negativos (Moestrup et al., 1992, Sayegh et al. , 1995). Entretanto, Foca et al. observaram que a expressão de RNAm de LRP -1 no endométrio humano foi significativamente maior na fase secretora quando comparada com a fase proliferativa do ciclo menstrual (Foca et al., 2000). Em nosso estudo, dividimos , também, as pacientes em fase proliferativa e secretora, e essa divisão , apesar de aleatória, deu-se de forma homogênea com 52,6% das pacientes do grupo sem endometriose na fase proliferativa e 47,4% na fase secretora. No grupo com endometriose , havia 55% de pacientes na fase proliferativa e 45% na fase secretora. As pacientes foram classificadas por meio do dateamento determinado pe la data da última menstruação informada no dia do procedimento cirúrgico, o qual definimos como fase proliferativa do primeiro ao décimo quarto dia e como fase secretora, do décimo quarto ao vigésimo oitavo. De acordo com Ecochard e Gougeon, o ciclo menstr ual “normal” (intervalo entre o primeiro dia da menstruação para início da próxima menstruação) em mulheres jovens e saudáveis com fertilidade comprovada é de 28 dias, e os estudos de ultra ssom e hormonais mostram que mulheres com idade entre 19 -42 anos tê m fases foliculares de 14,6 dias de duração e fases lútea de 13,6 dias de duração (Ecochard & Gougeon 2000). Observamos, em nosso estudo , que, na análise de determinação proteica por imunoistoquímica dos receptores de LDL, não houve diferença na 57 intensidade de marcação influenciada pela fase do ciclo menstrual, porém , na análise por expressão de RNAm dos mesmos receptores, foi evidenciado que os níveis de RNAm de LDL -R no endométrio de mulheres com endometriose foram maiores na fase secretora (p = 0,001), a ssim como os níveis de RNAm do LRP -1 também foram maiores na fase secretora no endométrio de mulheres sem endometriose (p=0,008). Esses achados foram compatíveis com os resultados do estudo de Foca et al. (Foca et al., 2000). A ação do LRP -1 tem sido ampl amente estudada no mecanismo de remodelação endometrial durante todo o ciclo menstrual como responsável pelo clearance de MMPs (matriz metaloproteinases) por meio de sua capacidade de ligação e endocitose, promovendo internalização e dissociação em ambiente ácido (Emonard et al., 2004). Após a entrega do conteúdo de LRP-1 nos lisossomas para degradação, o receptor é reciclado para a superfície celular para novo ciclo de endocitose. Tal mecanismo de depuração é particularmente efetivo para eliminar as proteinases (Casslen et al., 1998). Isto diminui consideravelmente a atividade fibrinolítica no endométrio durante a fase secretora do ciclo (Lillis et al., 2008). Desta forma, a MMP -2 e MMP -9 são eficientemente eliminadas do estroma do endométrio durante as fa ses proliferativa e secretora. Esse controle é importante para estas gelatinases, em especial, a forma ativa de MMP-2, que estão presentes no endométrio durante o ciclo, isto é, durante períodos quando a degradação excessiva do estroma não deve ocorrer (Selvais et al., 2009). 5.3 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corpórea (IMC) De acordo com os resultados do nosso estudo , foi observado que o IMC apresentou correlação positiva com o score de intensidade de marcação para LDL-R no endomé trio de mulheres sem endometriose (p = 0,048) e, com os níveis de RNAm do LRP -1 na lesão de endometriose (p = 0,024), o que sugere que ind ivíduos com relação desfavorável de peso e altura podem 58 expressar mais intensamente esta família de receptores tanto n o endométrio de pacientes sem a doença quanto na lesão de endometriose, isto posto pela determinação proteica e expressão gênica, respectivamente. Não há na literatura qualquer estudo que tenha avaliado a associação do índice de massa corpórea com a expre ssão desta família de receptores em endométrio ou lesões de endometriose e , assim, abre-se oportunidade para nova linha de pesquisa. 6 CONCLUSÕES 61 6 CONCLUSÕES De acordo com os resultados de nossa pesquisa, concluímos que: a) Houve maior expressão Gênica de receptores de LDL (LDL -R e LRP-1) em membrana celular de focos de endometriose profunda intestinal. Este achado não teve similaridade com a determinação proteica; b) Não houve diferença na comparação da exp ressão Gênica, assim como na determinação proteica, dos receptores de LDL (LDL -R e LRP-1) no endométrio de mulheres com e sem endometriose; c) Houve redução dos níveis séricos de LDL colesterol em pacientes com endometriose profunda em comparação com mulhere s sem a doença. 7 ANEXOS 65 7 ANEXOS 7.1 Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo com Endometriose). HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO GRUPO COM ENDOMETRIOSE DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME: .:........................................... ............................................................................. DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ............................................ SEXO : M □ F □ DATA NASCIMENTO: ......../......../...... ENDEREÇO ......................................................................... Nº ........... APTO:.............. BAIRRO: ...................................................CIDADE ..................................................... CEP:.......................TELEFONE (DDD): (........)................................................................ 2.RESPONSÁVEL LEGAL ................................................................................................ NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) .......................................................................................................................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE :................................................... SEXO: M □ F □ DATA NASCIMENTO.: ......./......../....... ENDEREÇO: ..........................................................................Nº.............APTO:............. BAIRRO: ................................................... CIDADE:....................................................... CEP:.........................TELEFONE(DDD): (.......)................................................................ 66 DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA a. A expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos de endometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão lipídica carreadora de droga anti proliferativa. 2. PESQUISADOR: Dr. Luciano Gibran CARGO/FUNÇÃO: Pós-Graduando do Departamento da Gineco logia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº: 76.149 UNIDADE DO HCFMUSP: Disciplina de Ginecologia HCFMUSP 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: i. RISCO MÍNIMO X RISCO MÉDIO □ ii. RISCO BAIXO □ RISCO MAIOR □ 4. DURAÇÃO DA PESQUISA : 24 MESES 5. SOBRE A PESQUISA: 5.1 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA A endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da parte interna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do abdômen, tais como: ovário, intestino, bexiga e peritônio. Esta doença pode causar dores intensas no abdome, principalmente cólicas no período menstrual, comprometendo seriamente a qualidade de vida das mulheres. 67 A Senhora está sendo convidada a participar do estudo que vai avaliar a presença de receptores de LDL (células do sangue responsáveis pelo transporte de colesterol = gordura) em pessoas que tem endometriose. Algumas doenças podem causar aumento dos níveis de colesterol nos tecidos como “fonte de energia”, consequente mente, os níveis de colesterol do sangue podem apresentar-se diminuídos. Esse projeto tem como objetivo verificar se este fenômeno ocorre também em pacientes com endometriose. Sua participação neste estudo será como paciente controle (sem endometriose), pois é necessário comparar pacientes com endometriose e pacientes sem endometriose. A cirurgia de abdome para as pacientes controle será realizada nas pacientes que desejam realizar a laqueadura tubária como método anticoncepcional. Para isso, será feita um a pesquisa em laboratório para investigar no sangue e no

de biópsia removido durante a vídeolaparoscopia para laqueadura tubária, a qual a senhora será submetida, se o tecido sadio removido recebe menos colesterol comparado ao tecido acometido por endometriose. 5.2 – PROCEDIMENTOS QUE SERÃO UTILIZADOS E PROPÓSITOS: A senhora será submetida a uma videolaparoscopia, que é um tipo de cirurgia na qual são realizados 3 pequenos cortes na pele e os médicos realizarão a cirurgia observando o interior da barriga em uma televisão. Durante a cirurgia, o seu médico realizará a laqueadura tubária e removerá uma pequena amostra de tecido sadio chamado peritônio, que é um tecido de revestimento interno do abdômen, próximo a região das tubas uterinas e também uma pequena amostra de endométrio normal, tecido de revestimento que se localiza dentro do útero. Estes tecidos serão enviados ao Laboratório de Metabolismos de Lípides do INCOR para análise da presença de receptores de LDL (colesterol) para podermos realizar a pesquisa que estamos propondo. 68 5.3 – RISCOS RELACIONADOS AOS PROCEDIMENTOS: Os riscos da obtenção dos tecidos no intra -operatório da videolaparoscopia são mínimos e não causam transtornos à sua saúde. Antes da cirurgia, será retirada uma amostra de sa ngue para fazer outros exames relacionados com a gordura no sangue. Os riscos decorrentes desses exames são mínimos, relacionados à picada na veia que pode deixar uma m ancha roxa no local. Para a realização deste exame e da cirurgia laparoscópica é necessá rio estar 12 horas em jejum. 5.4 – DESCONFORTOS E RISCOS ESPERADOS: A pesquisa não oferece risco ou desconforto pois a remoção dos fragmentos de tecido sadio (peritônio e endométrio) serão representados por uma diminuta porção, as quais não oferecem qualquer dano à integridade do paciente. 5.5 – BENEFÍCIOS QUE PODERÃO SER OBTIDOS: Com esta pesquisa, a qual a senhora está participando, tentaremos descobrir se os achados encontrados poderão ajudar futuras pacientes em seu tratamento. Concordando com o uso deste material, do modo descrito, é necessário esclarecer que a senhora não terá quaisquer benefícios ou direitos financeiros sobre os eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Caso a senhora não concorde em doar o fragmento de tecido para pesquisa, nada influenciará o seu tratamento. Salientamos que a senhora tem a liberdade de retirar o consentimento em qualquer fase da pesquisa sem prejuízos a seu cuidado e que terá direito de acesso sobre os eventuais resultados desta pesquisa e toda assistência necessária caso assim o desejar. Os pesquisadores estarão à sua disposição para quaisquer esclarecimentos no endereço abaixo especificado.Se a senhora tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em P esquisa (CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5º andar – tel: 3069-6442 ramais 16, 17, 18 ou 20,FAX:3069-6442ramal26– e-mail:[email protected] 69 5.6 – CUSTOS A senhora não terá custos ao participar do estudo. 5.7 – TRATAMENTO ALTERNATIVO: Não existem diferenças nos tratamentos realizados em virtude de sua participação ou não neste estudo. 6 – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO: Sua participação no presente estudo é voluntária. A senhora pode optar por não participar ou interromper sua participação no estudo a qualquer momento sem sanção nem perda de benefícios aos quais pudesse ter direito. Se decidir interromper antes de terminar o estudo, será solicitado a voltar ao consultório/hospital para uma visita final. Havendo interesse subsequente da paciente, os pesquisadores se comprometem a descartar as amostra colhidas imediatamente após notificação oficial da paciente ou de seus representantes legais. O pesquisador assegura TOTAL sigilo e privacida de quanto aos dados armazenados e obtidos com este estudo. O Dr. Luciano Gibran pode retirar a senhora do estudo sem o seu consentimento por qualquer uma das seguintes razões: a) Com base em critérios para melhorar seu atendimento médico; b) Se a senhora deixar de seguir o esquema do estudo; c) Desenvolvimento de efeitos adversos graves. 70 7 – INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS. O Dr. Luciano Gibran estará à sua disposição a qualquer momento para discutir as dúvidas que a senhora possa ter a respeito deste estudo e sua participação. O consultório do Dr. Luciano Gibran fica a Rua Cotoxó, 611 cj. 103 e o número do telefone de seu consultório é (11) 3865-8319, durante o horário comercial. Se o desenho do estudo ou o uso da informação forem alterados ou se surgir alguma descoberta significativa durante o estudo que possam afetar seu desejo em participar, a senhora será informada e será obtido novamente o seu consentimento. Se tiver quaisquer dúvidas sobre seus direitos como indivíduo de pesquisa ou queixas referentes a este estudo, a senhora deverá telefonar para: Dr. Luciano Gibran End.: Rua Cotoxó no 611, conj. 103, Bairro Pompéia, São Paulo Tel. 11- 3865-8319 – CEP: 05020-010 8 – OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ 71 9 – CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO Ao assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, reconheço que li e compreendi a informação precedente descrevendo este estudo. Minhas dúvidas foram satisfatoriamente esclarecidas e estou assinando este termo de consentimento livre e esclarecido indicando meu desejo de participar. Compreendo que receberei uma cópia assinada deste termo. Ao assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, não abdiquei de nenhum de meus direitos legais aos quais eu pudesse fazer jus como participante de um estudo de pesquisa. São Paulo, ............de..........................de............. -------------------------------------------------------------- Assinatura do paciente/representante legal Data / / ----------------------------------------------------------------- Assinatura da testemunha Data / / para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semianalfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual. (Somente para o responsável do projeto) Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. --------------------------------------------------------------- Assinatura do responsável pelo estudo Data / / 72 7.2 Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo sem Endometriose). HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO GRUPO SEM ENDOMETRIOSE DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME: ............................................. ......................................................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ......................................... SEXO : M □ F □ DATA NASCIMENTO: ......../......../...... ENDEREÇO .................................................................... Nº ........... APTO:.............. BAIRRO: ...................................................CIDADE ................................................... CEP:.......................TELEFONE (DDD): (........)........................................................... 2.RESPONSÁVEL LEGAL ............................................................................................ NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) ..................................................................................................................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE :................................................ SEXO: M □ F □ DATA NASCIMENTO.: ......./......../....... ENDEREÇO: ......................................................................Nº.............APTO:............. BAIRRO: ................................................. CIDADE:..................................................... CEP:........................TELEFONE(DDD): (.......)............................................................ 73 DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA a. A expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos de endometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão lipídica carreadora de droga anti proliferativa. 2. PESQUISADOR: Dr. Luciano Gibran CARGO/FUNÇÃO: Pós-Graduando do Departamento da Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº: 76.149 UNIDADE DO HCFMUSP: Disciplina de Ginecologia HCFMUSP 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: i. RISCO MÍNIMOX RISCO MÉDIO □ ii. RISCO BAIXO □ RISCO MAIOR □ 4. DURAÇÃO DA PESQUISA : 24 MESES 5. SOBRE A PESQUISA: 5.1 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA A endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da parte interna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do abdômen, tais como: ovário, intestino, bexiga e peritônio. Esta doença pode causar dores intensas no abdome, principalmente cólicas no período menstrual, comprometendo seriamente a qualidade de vida das mulheres. 74 A Senhora está sendo convidada a participar do estudo que vai avaliar a presença de receptores de LDL (células do sangue responsáveis pelo transporte de colesterol = gordura) em pessoas que tem endometriose. Algumas doenças podem causar aumento dos níveis de colesterol nos tecidos como “fonte de energia”, consequentemente, os níveis de colesterol do sangu e podem apresentar-se diminuídos. Esse projeto tem como objetivo verificar se este fenômeno ocorre também em pacientes com endometriose. Sua participação neste estudo será como paciente controle (sem endometriose), pois é necessário comparar pacientes com endometriose e pacientes sem endometriose. A cirurgia de abdome para as pacientes controle será realizada nas pacientes que desejam realizar a laqueadura tubária como método anticoncepcional. Para isso, será feita uma pesquisa em laboratório para investig ar no sangue e no

de biópsia removido durante a vídeolaparoscopia para laqueadura tubária, a qual a senhora será submetida, se o tecido sadio removido recebe menos colesterol comparado ao tecido acometido por endometriose. 5.2 – PROCEDIMENTOS QUE SERÃO UTILIZADOS E PROPÓSITOS: A senhora será submetida a uma videolaparoscopia, que é um tipo de cirurgia na qual são realizados 3 pequenos cortes na pele e os médicos realizarão a cirurgia observando o interior da barriga em uma televisão. Durante a cir urgia, o seu médico realizará a laqueadura tubária e removerá uma pequena amostra de tecido sadio chamado peritônio, que é um tecido de revestimento interno do abdômen, próximo a região das tubas uterinas e também uma pequena amostra de endométrio normal, tecido de revestimento que se localiza dentro do útero. Estes tecidos serão enviados ao Laboratório de Metabolismos de Lípides do INCOR para análise da presença de receptores de LDL (colesterol) para podermos realizar a pesquisa que estamos propondo. 75 5.3 – RISCOS RELACIONADOS AOS PROCEDIMENTOS: Os riscos da obtenção dos tecidos no intra -operatório da videolaparoscopia são mínimos e não causam transtornos à sua saúde. Antes da cirurgia, será retirada uma amostra de sangue para fazer outros exames relacionados com a gordura no sangue. Os riscos decorrentes desses exames são mínimos, relacionados à picada na veia que pode deixar uma m ancha roxa no local. Para a realização deste exame e da cirurgia laparoscópica é necessário estar 12 horas em jejum. 5.4 – DESCONFORTOS E RISCOS ESPERADOS: A pesquisa não oferece risco ou desconforto pois a remoção dos fragmentos de tecido sadio (peritônio e endométrio) serão representados por uma diminuta porção, as quais não oferecem qualquer dano à integridade do paciente. 5.5 – BENEFÍCIOS QUE PODERÃO SER OBTIDOS: Com esta pesquisa, a qual a senhora está participando, tentaremos descobrir se os achados encontrados poderão ajudar futuras pacientes em seu tratamento. Concordando com o uso deste material, do modo descrito, é nec essário esclarecer que a senhora não terá quaisquer benefícios ou direitos financeiros sobre os eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Caso a senhora não concorde em doar o fragmento de tecido para pesquisa, nada influenciará o seu tratamento. Sali entamos que a senhora tem a liberdade de retirar o consentimento em qualquer fase da pesquisa sem prejuízos a seu cuidado e que terá direito de acesso sobre os eventuais resultados desta pesquisa e toda assistência necessária caso assim o desejar. Os pesq uisadores estarão à sua disposição para quaisquer esclarecimentos no endereço abaixo especificado.Se a senhora tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5º andar – tel: 3069-6442 ramais 16, 17, 18 ou 20,FAX:3069-6442ramal26– e-mail:[email protected] 76 5.6 – CUSTOS: A senhora não terá custos ao participar do estudo. 5.7 – TRATAMENTO ALTERNATIVO: Não existem diferenças nos tratamentos realizados em virtude de sua participação ou não neste estudo. 6 – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO: Sua participação no presente estudo é voluntária. A senhora pode optar por não participar ou interromper sua participação no estudo a qualquer momento sem sanção nem perda de benefícios aos quais pudesse ter direito. Se decidir interromper antes de terminar o estudo, será solicitado a voltar ao consultório/hospital para uma visita final. Havendo interesse subsequente da paciente, os pesquisadores se comprometem a descartar as amostra colhidas imediatamente após notificação oficial da paciente ou de seus representantes legais. O pesquisador assegura TOTAL sigilo e privacidade quanto aos dados armazenados e obtidos com este estudo. O Dr. Luciano Gibran pode retirar a senhora do estudo sem o seu consentimento por qualquer uma das seguintes razões: a) Com base em critérios para melhorar seu atendimento médico; b) Se a senhora deixar de seguir o esquema do estudo; c) Desenvolvimento de efeitos adversos graves. 77 7 – INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS. O Dr. Luciano Gibran estará à sua disposição a qualquer momento para discutir as dúvidas que a senhora possa ter a respeito deste estudo e sua participação. O consultório do Dr. Luciano Gibran fica a Rua Cotoxó, 611 cj. 103 e o número do telefone de seu consultório é (11) 3865-8319, durante o horário comercial. Se o desenho do estudo ou o uso da informação forem alterados ou se surgir alguma descoberta significativa durante o estudo que possam afetar seu desejo em participar, a senhora será informada e será obtido novamente o seu consentimento. Se tiver quaisquer dúvidas sobre seus direitos como indivíduo de pesquisa ou queixas referentes a este estudo, a senhora deverá telefonar para: Dr. Luciano Gibran End.: Rua Cotoxó no 611, conj. 103, Bairro Pompéia, São Paulo Tel. 11- 3865-8319 – CEP: 05020-010 8 – OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ 78 9 – CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO Ao assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, reconheço que li e compreendi a informação precedente descrevendo este estudo. Minhas dúvidas foram satisfatoriamente esclarecidas e estou assinando este termo de consentimento livre e esclarecido indicando meu desejo de participar. Compreendo que receberei uma cópia assinada deste termo. Ao assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, não abdiquei de nenhum de meus direitos legais aos quais eu pudesse fazer jus como participante de um estudo de pesquisa. São Paulo, ............de..........................de............. -------------------------------------------------------------- Assinatura do paciente/representante legal Data / / ----------------------------------------------------------------- Assinatura da testemunha Data / / para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semianalfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual. (Somente para o responsável do projeto) Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. --------------------------------------------------------------- Assinatura do responsável pelo estudo Data / / 79 7.3 Anexo C – Tabela com os dados das pacientes e suas características físicas. n n° caderno Paciente Nome Idade Peso (Kg) Estatura (cm) IMC Fase do Ciclo 1 1 Caso MARICELMA 32 65 154 27,4 secretora 2 4 Caso LUCIANA 29 64 172 21,6 proliferativa 3 5 Caso ANGELA 44 62 170 21,5 proliferativa 4 7 Controle ANA PAULA 32 85 168 30,1 secretora 5 15 Caso JULIANA 26 62 158 24,8 secretora 6 17 Caso ANDREA 35 67 165 24,6 proliferativa 7 21 Caso DEBORA 42 73 158 29,2 secretora 8 25 Caso CAROLY 48 93,5 172 31,6 proliferativa 9 26 Caso LIANE 32 54 152 23,4 proliferativa 10 27 Caso ALESSANDRA 35 57 153 24,3 secretora 11 28 Caso ANDREA 38 71 169 24,9 proliferativa 12 29 Caso JULIA 30 45,5 158 18,2 secretora 13 30 Caso GABRIELA 36 55,8 162 21,3 proliferativa 14 31 Caso PATRICIA 37 51 163 19,2 secretora 15 34 Caso DENISE 31 76 173 25,4 secretora 16 37 Caso GENI 47 63,5 153 27,1 proliferativa 17 38 Caso VERONICA 39 56,1 157 22,8 secretora 18 39 Caso FATIMA 41 63,9 162 24,4 secretora 19 40 Caso FLAVIA 31 53,6 153 22,9 proliferativa 20 41 Caso CINTIA 28 61,5 163 23,1 proliferativa 21 42 Caso PATRICIA 32 57 153 24,3 proliferativa 22 43 Controle DANIELA 35 67 165 24,6 secretora 23 44 Controle JOELMA 24 69 161 26,6 secretora 24 45 Controle LUANA 28 78 174 25,8 secretora 25 46 Controle FABIANA 29 75 165 27,5 proliferativa 26 47 Controle MARIVANEIDE 30 82 169 28,7 proliferativa 27 49 Controle TATIANA 33 80 180 24,7 proliferativa 28 50 Controle LUCIANA 32 60 169 21,0 secretora 29 51 Controle MARIA MELO 41 88 172 29,7 secretora 30 52 Controle LIDIA 28 67 159 26,5 proliferativa 31 53 Controle ELISABETE 43 73 167 26,2 proliferativa 32 54 Controle CLAUDIA 44 67 165 24,6 proliferativa 33 55 Controle ANA 32 60 166 21,8 proliferativa 34 56 Controle MARIA NOVAIS 32 80 165 29,4 secretora 35 57 Controle REGINA CÉLIA 44 72 158 28,8 proliferativa 36 59 Controle ROSA 31 73 152 31,6 proliferativa 37 60 Controle RENATA 32 65 160 25,4 secretora 38 61 Controle EDILENE 32 74 162 28,2 proliferativa 39 64 Controle LOURDES 36 86 167 30,8 secretora 80 7.4 Anexo D – Tabela com o perfil lipídico das pacientes n n° caderno Paciente CT HDL-C LDL-C TG APO A1 APO B100 1 1 Caso 174 39 114 102 197,1 134,7 2 4 Caso 186 39 120 137 96,9 79 3 5 Caso 191 46 114 153 149,4 70,7 4 7 Controle 179 46 121,6 57 154,1 79 5 15 Caso 144 34 94 79 97,3 61,3 6 17 Caso 177 47 103 137 157,8 62,7 7 21 Caso 145 37 91 85 99,9 59,5 8 25 Caso 220 47 129 222 167,9 86,2 9 26 Caso 10 27 Caso 189 49 111 140 149,3 62,5 11 28 Caso 189 54 116 94 146,3 83,1 12 29 Caso 182 48 108 128 137,6 71,1 13 30 Caso 179 54 105 99 158 55,5 14 31 Caso 15 34 Caso 194 54 116 123 135,4 72,9 16 37 Caso 255 39 180 183 81,8 108,9 17 38 Caso 185 31 123 154 107,8 69,3 18 39 Caso 155 41 99 74 98,1 51,6 19 40 Caso 221 25 162 170 86,1 93,5 20 41 Caso 21 42 Caso 195 32 136 139 111,3 68,8 22 43 Controle 191 22 155 71 102,4 66,1 23 44 Controle 195 40 133 113 121,1 75,3 24 45 Controle 197 54 118 124 127 77,3 25 46 Controle 215 35 162 90 118,9 92,1 26 47 Controle 196 52 171 123 157,7 92,7 27 49 Controle 173 52 161 62 146,8 65,3 28 50 Controle 141 40 131 52 125 64,8 29 51 Controle 161 32 145 82 117,7 88,5 30 52 Controle 185 90 176 47 171,1 42,7 31 53 Controle 306 37 254 259 125,3 161,5 32 54 Controle 248 45 217 155 155,8 128,4 33 55 Controle 180 44 154 129 156,8 77,8 34 56 Controle 168 39 130 189 125,2 143,5 35 57 Controle 210 39 182 138 140,5 121,5 36 59 Controle 148 38 116 160 131,4 65 37 60 Controle 184 48 163 106 169 80,7 38 61 Controle 225 35 152 188 136,8 124,5 39 64 Controle 176 32 120 119 111,3 95,8 81 7.5 Anexo E – Tabela com os dados de expressão gênica LDL-R LRP-1 n n° caderno Paciente Endométrio Endometriose Endométrio Endometriose 1 1 Caso 0,01 0,08 0,05 0,99 2 4 Caso 0,01 0,02 0,17 0,13 3 5 Caso 0,01 0,00 0,06 0,03 4 7 Controle 0,01 0,12 5 15 Caso 0,02 0,03 0,05 0,30 6 17 Caso 0,00 0,03 0,06 0,30 7 21 Caso 0,01 0,03 0,04 0,22 8 25 Caso 0,01 0,02 0,02 0,37 9 26 Caso 0,00 0,06 0,05 0,23 10 27 Caso 0,04 0,03 0,04 0,35 11 28 Caso 0,01 0,07 0,05 0,47 12 29 Caso 0,01 0,01 0,10 0,30 13 30 Caso 0,01 0,00 0,04 0,27 14 31 Caso 0,02 0,04 0,07 0,20 15 34 Caso 0,01 0,01 0,05 0,18 16 37 Caso 0,00 0,02 0,31 0,52 17 38 Caso 0,02 0,02 0,07 0,07 18 39 Caso 0,01 0,01 0,13 0,33 19 40 Caso 0,01 0,01 0,04 0,13 20 41 Caso 0,00 0,01 0,12 0,47 21 42 Caso 0,01 0,01 0,26 0,27 22 43 Controle 0,03 0,38 23 44 Controle 0,03 0,15 24 45 Controle 0,02 0,14 25 46 Controle 0,02 0,05 26 47 Controle 0,02 0,06 27 49 Controle 0,02 0,10 28 50 Controle 0,01 0,12 29 51 Controle 0,04 0,19 30 52 Controle 0,02 0,10 31 53 Controle 0,01 0,10 32 54 Controle 0,01 0,11 33 55 Controle 0,01 0,08 34 56 Controle 0,01 0,10 35 57 Controle 0,03 0,12 36 59 Controle 0,00 0,17 37 60 Controle 0,02 0,13 38 61 Controle 0,01 0,04 39 64 Controle 0,04 0,12 82 7.6 Anexo F – Tabela com os dados de determinação proteica. LDL-R LRP-1 n n° caderno Paciente Endométrio Endometriose Endométrio Endometriose 1 1 Caso 4 4 3 3 2 4 Caso 3 2 4 2 3 5 Caso 4 3 3 3 4 7 Controle 4 4 5 15 Caso 4 3 4 3 6 17 Caso 3 3 3 2 7 21 Caso 3 2 3 2 8 25 Caso 3 2 3 1 9 26 Caso 2 3 3 3 10 27 Caso 4 3 4 3 11 28 Caso 4 3 3 3 12 29 Caso 2 2 3 3 13 30 Caso 3 2 3 3 14 31 Caso 4 2 4 3 15 34 Caso 3 2 4 1 16 37 Caso 4 3 3 2 17 38 Caso 3 2 3 1 18 39 Caso 3 3 1 2 19 40 Caso 4 2 4 1 20 41 Caso 4 4 2 3 21 42 Caso 3 2 3 3 22 43 Controle 4 4 23 44 Controle 4 4 24 45 Controle 4 4 25 46 Controle 4 3 26 47 Controle 4 3 27 49 Controle 4 4 28 50 Controle 4 3 29 51 Controle 4 3 30 52 Controle 3 3 31 53 Controle 4 3 32 54 Controle 3 3 33 55 Controle 3 3 34 56 Controle 4 4 35 57 Controle 4 3 36 59 Controle 4 4 37 60 Controle 3 4 38 61 Controle 4 4 39 64 Controle 4 3 83 7.7 Anexo G – Aprovação CAPPesq - HCFMUSP. 86 9 REFERÊNCIAS 87 9 REFERENCIAS 1. Abdalla-Ribeiro HS , Galvāo MA , Aoki T , Aldrighi JM , Ribeiro PA . 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