{"paper_id":"46b9bb69-fc5d-40c6-a90e-3aa4125f8fc0","body_text":"LUCIANO GIBRAN \n \n \n \n \n \n \n \n \nA expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos \nde endometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão \nlipídica carreadora de droga antiproliferativa \n \n \nTese apresentada à Faculdade de \nMedicina da Universidade de São \nPaulo para obtenção do título de \nDoutor em Ciências \n \nPrograma de Obstetrícia e Ginecologia \n \nOrientador: Prof. Dr. Sérgio Podgaec \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSão Paulo \n2016\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) \nPreparada pela Biblioteca da \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \n \nreprodução autorizada pelo autor \n \n \n \n   \n                        \nGibran, Luciano \n      A expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos de endometriose \nprofunda para viabilização do uso de nanoemulsão lipídica carreadora de droga anti-\nproliferativa  /  Luciano Gibran.  --  São Paulo, 2016. \n \n Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. \nPrograma de Ginecologia e Obstetrícia. \n \n Orientador: Sergio Podgaec.  \n      \n   \n Descritores:  1.Endometriose  2.Receptores de LDL  3.Proteína-1 relacionada a \nreceptor de lipoproteína de baixa densidade  4.LDL-colesterol  5.Emulsões  \n6.Nanopartículas   \n \n  \n \n \n USP/FM/DBD-248/16  \n \n \n\nÀ minha mãe Tecla Gibran,  \nQue, com seu amor infinito e suas orações, \nme mantém vivo e forte para enfrentar os desafios de todos os dias. \n \nAo meu pai João Saad Gibran,  \nexemplo de ética, fé e humanismo,  \nque me inspira desde sempre e diariamente a vencer na vida.   \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nÀ minha esposa Denise, \npela compreensão, estímulo e amor incondicional.  \nPela certeza de que, sem você, nada haveria. \n \nAos meus filhos João e Bruno, \npresença divina, amizade sem fim,  \ntodo o meu amor. \n \n\n \nAos meus sogros \nRoberto Martins Freire e Maria Cecília dos Santos Freire (in memorian), \nque me acolheram como filho, concedendo toda a amizade e carinho possíveis. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nÀs minhas irmãs  \nJuciane Gibran Laino e Patrícia Gibran Lemos Nunes, \neternas amigas e companheiras, em todos os momentos da minha existência. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAos meus sobrinhos \nFernando Gibran Lemos Nunes e Vitor Gibran Lemos Nunes, \nJovens médicos de “homens e de almas”, orgulho e admiração. \n \n\nAGRADECIMENTOS \n \n \nAo Professor Sergio Podgaec, cientista e professor por excelência, pelo \nincentivo, confiança e contribuição inestimáveis. E pela amizade preciosa que \nsemeamos ao longo do caminho.  \nAo Professor Ma urício Simões Abrão, pelo exemplo, acolhimento, apoio \nirrestrito e incentivo à minha carreira acadêmica. \nAo Professor Edmund Chada Baracat, pel o incentivo e confiança desde o \ninício. \nAo Professor Raul Cavalcante Maranhão, por acreditar e orientar todas as \nfases desse projeto. \nAo Professor Luiz Henrique Gebrim e Doutor André Malavasi, diretores do \nHospital Pérola Byington, pela confiança e pelo incentivo em todos os meus \nprojetos. \nAo Doutores Marco Antonio Bassi, Flavia Fairbanks, Gil Kamergorodsky , \nJorge Mi lhem Haddad e Armando Romeo, pela amizade fraterna e \ncompanheirismo em todos os momentos. \nÀ Marta Privatto , pela amizade, pela contribuição técnica e incentivo \nconstantes. \nÀ Priscila O. Carvalho,  pela amizade,  pela paciência, pelo apoio e \ncontribuição inestimável na execução técnica do estudo. \nÀ Elaine R. Tavares e Débora Deus, pela contribuição na execução \ntécnica do estudo. \nAo Doutor Eidi Kumagai , pela parceria e contribuição na análise \nhistológica. \n\nÀ Denise Frediani , pelos ensinamentos fundamentais para a \ncompreensão científica. \nAo Sr. Rogério Prado, pela execução e pelos ensinamentos de análise \nestatística. \nAos Doutores Manoel Orlando Gonçalves e Leandro Accardo de Matos, \npela amizade, companheirismo e diagnósticos precisos. \nAos Doutores Alysson Zanatta,  Luiz Flavio Cordeiro Fernandes, Patrick \nBellelis, Tatiana Mandarino, Luiz Carvalho , Mateus Rosin, Roberta Ávila  e \nAndresa Paiva  pela amizade e parceria de trabalho, sempre dispostos a \ncolaborar. \nAos Doutores João Antonio Dias Jr ., Nicolau D’ Amico, Claudi o Severino \nJunior, Rogério Gomes, Daniel Caraça, Ana Paula Klautal Leite, Luiz Fernando \nHenrique, Lidia Myung,  Malu Marin e Maricí Rached,  exemplos de ética e \ncomprometimento, minha grande admiração.  \nA Sra. Valdenice Pereira Lopes, (Nice), personagem fund amental na \norganização de todo meu trabalho, minha eterna gratidão. \nAos colegas do Setor de Endometriose da Clínica Ginecológica do \nHCFMUSP e do Hospital Pérola Byington, pela ajuda constante, e por \nparticiparem do atendimento ambulatorial e dos procedimen tos cirúrgicos \nessenciais para a coleta de dados deste estudo. \nÀs pacientes, colaboradoras fundamentais para a realização deste \nestudo, meus sinceros agradecimentos. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Todo o trabalho é vazio a não ser que haja \namor”. \nKahlil Gibran \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”. \nCora Coralina \n\n\nNORMALIZAÇÃO ADOTADA \n \n \nEsta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento \ndesta publicação: \n \nReferências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors \n(Vancouver). Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de \nBiblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e \nmonografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de  A. L. \nFreddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos \nCardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e \nDocumentação; 2011. \n \nAbreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed \nin Index Medicus. \n \n\nSUMÁRIO \n \n \nLISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS \nLISTA DE TABELAS \nLISTA DE FIGURAS \nLISTA DE GRÁFICOS \nRESUMO \nABSTRACT \n1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 3 \n1.1 Endometriose ............................................................................................... 3 \n1.2 Lipoproteínas e apolipoproteínas ................................................................. 6 \n1.3 Receptores de LDL ...................................................................................... 8 \n1.4 Nanotecnologia em Medicina e o desenvolvimento das nanoemulsões \nlipídicas ............................................................................................................ 10 \n1.5 Hipótese do estudo .................................................................................... 13 \n2 OBJETIVOS .................................................................................................. 17 \n2.1 Objetivo principal ........................................................................................ 17 \n2.2 Objetivos específicos ................................................................................. 17 \n3 PACIENTES E MÉTODOS ........................................................................... 21 \n3.1 Tipo do estudo e cálculo da amostra .......................................................... 21 \n3.2 Local do estudo .......................................................................................... 21 \n3.3 Pacientes .................................................................................................... 22 \n3.4 Critérios de inclusão ................................................................................... 22 \n3.5 Dinâmica do estudo .................................................................................... 22 \n3.6 Procedimento cirúrgico e coleta das amostras ........................................... 25 \n3.7 Lípides plasmáticos .................................................................................... 26 \n3.8 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA) ...................... 26 \n3.9 Análise de expressão gênica por PCR em tempo real ............................... 27 \n3.10 Determinação proteica por imunoistoquímica .......................................... 28 \n3.11 Análise estatística .................................................................................... 29 \n4 RESULTADOS .............................................................................................. 33 \n4.1 Características físicas, fase do ciclo menstrual e quadro clínico ................ 33 \n4.2 Perfil lipídico ............................................................................................... 34 \n\n4.3 Expressão gênica de LDL-R e LRP-1 por PCR quantitativa em tempo \nreal (qRT-PCR) ................................................................................................ 35 \n4.4 Determinação proteica de LDL-R e LRP-1 por imunoistoquímica .............. 38 \n4.5 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corpórea \n(IMC), idade e fases do ciclo menstrual ........................................................... 41 \n5 DISCUSSÃO ................................................................................................. 47 \n5.1 Expressão de RNAm dos receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) ................. 50 \n5.2 Determinação proteica por imunoistoquímica dos receptores de LDL \n(LDL-R e LRP-1) .............................................................................................. 55 \n5.3 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corpórea \n(IMC)  ............................................................................................................... 57 \n6 CONCLUSÕES ............................................................................................. 61 \n7 ANEXOS ....................................................................................................... 65 \n7.1 Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo com \nEndometriose). ................................................................................................. 65 \n7.2 Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo sem \nEndometriose). ................................................................................................. 72 \n7.3 Anexo C – Tabela com os dados das pacientes e suas características \nfísicas. .............................................................................................................. 79 \n7.4 Anexo D – Tabela com o perfil lipídico das pacientes ................................ 80 \n7.5 Anexo E – Tabela com os dados de expressão gênica .............................. 81 \n7.6 Anexo F – Tabela com os dados de determinação proteica. ...................... 82 \n7.7 Anexo G – Aprovação CAPPesq - HCFMUSP. .......................................... 83 \n9 REFERENCIAS ............................................................................................. 87 \n \n\nLISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS \n \n \nApo Apolipoproteína \nEVA Escala Visual Analógica de Dor  \nCT Colesterol total \ncDNA DNA complementar \nCt Cycle threshold (Ciclo de amplificação) \nDAB Diaminobenzidina \nCt Delta Ct \nDDS Drug Delivery Systems  \nHCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade \nde São Paulo \nHDL High-Density Lipoprotein (Lipoproteína de alta densidade) \nHDL-C HDL Colesterol \nIMC Índice de massa corpórea  \nkDa KiloDaltons  \nLCAT Lecitina Colesterol Acetil Transferase  \nLDL Low-Density Lipoprotein (Lipoproteína de baixa densidade) \nLDL-C LDL Colesterol  \nLDL-R Receptor de LDL \nLDE Nanoemulsão lipídica \nLPL Lipase lipoproteica \nLRP Proteína relacionada ao receptor de LDL \nMMPs Matriz Metaloproteinases  \nMilli-Q Água deionizada e purificada. \nnm Nanômetro \nPBS Sais fosfato \nPCR Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) \nRNAm RNA mensageiro \nrpm Rotações por Minuto \n\nSR-B1  Scavenger Receptor Class B-1 \nSTAR Proteína Ativa Reguladora de Esteroidogênese  \nTG Triglicérides \nTE-4 Solução de Tris-EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) \nVLDL Very Low-Density Lipoprotein (Lipoproteína de densidade muito \nbaixa) \n \n\nLISTA DE TABELAS \n \n \nTabela 1 Caracterização das Apolipoproteínas Humanas (adaptação \nde Mahley et al., 1984). ................................................................. 8 \nTabela 2 Características físicas e fases do ciclo menstrual em \nmulheres com e sem endometriose. ........................................... 33 \nTabela 3 Quadro clínico de mulheres com e sem endometriose. .............. 34 \nTabela 4 Determinação de lípides plasmáticos em mulheres com e \nsem endometriose. ...................................................................... 35 \nTabela 5 Comparações múltiplas sob os níveis de RNAm para os \nreceptores LDL-R e LRP-1 entre grupos com e sem \nendometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de \nendometriose), ............................................................................ 38 \nTabela 6 Análise qualitativa da intensidade de marcação dos \nreceptores LDL-R e LRP-1 por imunoistoquímica nos grupos \ncom e sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio \ne lesão de endometriose). ........................................................... 40 \nTabela 7 Comparações múltiplas sob o score de intensidade de \nmarcação para LDL-R entre grupos com e sem \nendometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de \nendometriose). ............................................................................ 41 \nTabela 8 Análise de correlação entre idade e IMC com o score de \nintensidade de marcação e níveis de expressão de RNAm \nde LDL-R e de LRP-1 nos grupos com e sem endometriose, \ne locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose). ..... 41 \nTabela 9 Expressão gênica de LDL-R e LRP-1 em cada grupo com e \nsem endometriose nas fases do ciclo menstrual. ........................ 42 \nTabela 10 Análise qualitativa da intensidade de marcação para LDL-R \ne LRP-1 em cada grupo com e sem endometriose nas fases \ndo ciclo menstrual. ...................................................................... 43 \n \n \n\nLISTA DE FIGURAS \n \n \nFigura 1 Representação esquemática da LDL (Low-Density \nLipoprotein) (Extraído de www.healthprotocols.com). ................. 11 \nFigura 2 Representação esquemática da LDL natural mostrando a \nsemelhança da nanoemulsão lipídica LDE, exceto pela \nausência da apolipoproteína B. ................................................... 13 \nFigura 3 Quadro explicativo da dinâmica do estudo. ................................. 24 \nFigura 4 Lesão de endometriose intestinal após ressecção \nsegmentar. .................................................................................. 25 \nFigura 5 Fotomicrografias representativas de imunoistoquímica para \nLDL-R e para LRP-1.................................................................... 39 \n \n\nLISTA DE GRÁFICOS \n \n \nGráfico 1 Expressão gênica de LDL-R - Gráfico de barras \nmostrando o valor médio (erro padrão) dos níveis de \nRNAm para LDL-R em amostras de endométrio de \nmulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres \ncom endometriose, sendo que uma amostra é proveniente \ndo endométrio (endométrio COM EDT) e, a outra, da \nlesão de endometriose (Lesão EDT) da mesma paciente. \nO gráfico está representado em escala logarítmica na \nbase 10. ................................................................................... 36 \nGráfico 2 Expressão gênica de LRP-1 - Gráfico de barras \nmostrando o valor médio (erro padrão) dos níveis de \nRNAm para LRP-1 em amostras de endométrio de \nmulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres \ncom endometriose, sendo que uma amostra é proveniente \ndo endométrio (endométrio COM EDT) e, a outra, da \nlesão de endometriose (Lesão EDT) da mesma paciente. \nO gráfico está representado em escala logarítmica na \nbase 10. ................................................................................... 37 \n \n\nRESUMO \n \n \nGibran L. A expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos de \nendometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão lipídica \ncarreadora de droga ant iproliferativa [Tese]. São Paulo: Faculdade de \nMedicina, Universidade de São Paulo; 2016. \n \nObjetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica e a \ndeterminação proteica de receptores de LDL (LDL -R e LRP -1) na lesão de \nendometriose profunda e com parar com o endométrio de mulheres com e sem \nendometriose, assim como determinar o perfil lipídico de pacientes com e sem \nendometriose profunda. Pacientes e métodos: Realizamos estudo transversal, \ncaso-controle, exploratório com 39 pacientes, sendo 20 paci entes com \ndiagnóstico histológico de endometriose profunda com comprometimento \nintestinal e 19 pacientes sem endometriose submetidas à laqueadura tubária \nlaparoscópica. Foram coletadas amostras de sangue periférico no dia do \nprocedimento cirúrgico para aná lise do perfil lipídico por meio da determinação \nde Colesterol total, HDL, LDL, VLDL, Triglicérides, APO A I e APO B 100. \nForam também coletadas amostras de tecido endometrial com cureta de \nPipelle e lesão de endometriose como parte do tratamento cirúrgico  \nlaparoscópico. Todas as amostras foram enviadas para análise histológica e \nsubmetidas à pesquisa de expressão gênica por PCR Real Time e à \ndeterminação proteica  por imunoistoquímica dos receptores de LDL (LDL -R e \nLRP-1). A fase do ciclo menstrual foi det erminada no momento do \nprocedimento cirúrgico. Resultados: As pacientes com endometriose profunda \napresentaram níveis séricos de LDL-c significativamente inferiores às pacientes \nsem a doença (119 ± 23 vs 156 ± 35; p=0,001). O mesmo não foi observado \ncom o colesterol total (187 ± 27 vs 194 ± 37; p=0,562), HDL -c (42 ± 9 vs 43 ± \n14; p=0,792), Triglicérides (130 ± 40 vs 119 ± 55; p=0,486), APO A I (128,1 ± \n33,3 vs 136,5 ± 19,9; p=0,373) e APO B 100 (76 ± 20,9 vs 91,7 ± 30,8; \np=0,085). A análise de expressão gênica por PCR Real Time dos receptores de \nLDL revelou que o LDL -R foi significativamente mais expresso na lesão de \nendometriose comparado ao endométrio da mesma paciente , mas não ao \nendométrio de mulheres sem endometriose (0,012 ± 0,009 vs 0,019 ± 0,01 vs \n0,027  ± 0,022; p<0,001) e o LRP -1 foi significativamente mais expresso na \nlesão de endometriose tanto quando comparado ao endométrio da mesma \npaciente, quanto quando comparado ao endométrio das pacientes sem a \ndoença (0,089 ± 0,076 vs 0,126 ± 0,072 vs 0,307  ± 0,207; p<0,001). A análise \nde determinação proteica por imunoistoquímica dos mesmos receptores \nrevelou que o endométrio de mulheres sem a doença apresentou score de \nintensidade de marcação de LDL -R significativamente maior que o endométrio \ne a lesão de mulheres com endometriose  (15 ± 78,9 vs 9 ± 45 vs 2 ± 10; \np=0,026), porém a marcação para o receptor LRP -1 não apresentou diferença \nestatisticamente significativa (9 ± 47,4 vs 6 ± 30 vs 0 ± 0; p=0,073). O estudo \ntambém demonstrou que houve expressão signi ficativamente maior de RNAm \n\ndo receptor LDL -R (p=0,001) na fase secretora do ciclo menstrual e o mesmo \npode ser observado com relação à expressão de RNAm do receptor LRP -1, \nque foi superexpresso (p=0,008) no endométrio de mulheres sem a doença. \nConclusões: De acordo com os resultados de nossa pesquisa , concluímos \nque há redução dos níveis séricos de LDL em pacientes com endometriose \nprofunda. Além disso, observamos maior expressão gênica de receptores de \nLDL em membrana celular de focos de endometriose prof unda, comparado ao \nendométrio, tanto de mulheres sem endometriose quanto de mulheres com \nendometriose, achado não similar ao observado com a determinação proteica. \nHouve maior expressão de receptores de LDL em endométrio na fase secretora \ndo ciclo. Este es tudo abre oportunidade para viabilização de nanoemulsões \nlipídicas para acoplamento e direcionamento de drogas antiproliferativas no \ntratamento da endometriose profunda. \n \nDescritores: Endometriose; Receptores de LDL; Proteína -1 Relacionada a \nReceptor de Li poproteína de Baixa Densidade; LDL-colesterol; Emulsões; \nNanopartículas. \n \n.\n\nABSTRACT \n \n \nGibran L. LDL receptor expression in the cell membrane of foci of deep \nendometriosis suggests the feasibility of using lipid nanoemulsions as anti -\nproliferative drug car riers [Thesis]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, \nUniversidade de São Paulo\"; 2016. \n \nObjective: The objective of this study was to evaluate the gene expression and \nprotein determination of LDL receptor (LDL -R and LRP -1) in deep \nendometriosis lesions and c ompare with the endometrium of women with and \nwithout endometriosis, as well as to profile lipid patients with and without deep \nendometriosis. Methods: We conducted an transversal, exploratory, case -\ncontrol study with 39 patients: 20 patients with a histol ogical diagnosis of deep \nendometriosis with intestinal involvement and 19 women without endometriosis \nwho underwent laparoscopic tubal ligation. Peripheral blood samples were \ncollected on the day of surgery for analysis of lipid profile by determining tota l \ncholesterol, HDL, LDL, VLDL, triglycerides, APO AI and APO B 100. Specimens \nof endometrial tissue were collected using a Pipelle curette and endometriosis \nlesion specimens were obtains during therapeutic laparoscopic surgery. All \nsamples were sent for hi stological evaluation and gene expression analysis by \nReal Time PCR and protein determination by immunohistochemistry of the LDL \nreceptor (LDL-R and LRP-1). The phase of the menstrual cycle was determined \nat the time of surgery. Results: Patients with seve re endometriosis had serum \nLDL-C levels significantly lower than the patients without the disease (119 ± 23 \nvs 156 ± 35; p = 0.001). The same was not observed with total cholesterol (187 \n± 27 vs 194 ± 37, p = 0.562), HDL-C (42 ± 9 vs 43 ± 14, p = 0.792), triglycerides \n(130 ± 40 vs 119 ± 55; p = 0.486), APO AI (128.1 ± 33.3 vs 136.5 ± 19.9; p = \n0.373) and APO B 100 (76 ± 20.9 vs 91.7 ± 30.8, p = 0.085). The analysis of \ngene expression by Real Time PCR of LDL receptors revealed that there was \nsignificantly greater expression of LDL -R in endometriosis lesions as compared \nto the endometrium of the same patient, but not when compared to the \nendometrium of women without endometriosis (0.012 ± 0.009 vs 0.019 ± 0, 01 \nvs 0.027 ± 0.022, p &lt;0.001). LRP -1 was signifi cantly expressed in \nendometriotic lesions both when compared to the endometrium of the same \npatient as compared to the endometrium of patients without the disease (0.089 \n± 0.076 vs 0.126 ± 0.072 vs 0.307 ± 0.207, p &lt;0.001). Protein determination \nby immunohistochemistry of the same receptors revealed that the endometrium \nof women without endometriosis had a significantly higher staining intensity \nscore than the endometrium and the lesions of women with endometriosis (15 ± \n78.9 vs 9 ± 2 vs 45 ± 10, p = 0.0 26) but the measurement for the LRP -1 \nreceptor showed no statistically significant difference (9 ± 47.4 vs 6 ± 30 vs 0 ± \n0; p = 0.073). The study also demonstrated that there was significantly higher \nmRNA expression of the LDL -R receptor (p = 0.001) in the  secretory phase of \nthe menstrual cycle, and the same can be observed with respect to the mRNA \nexpression of LRP -1 receptor, which was overexpressed (p = 0.008) in the \n\nendometrium of women without the disease. Conclusion: Based on the \nfindings of our resea rch, we concluded that there is a reduction of serum LDL \nlevels in patients with deep endometriosis. Moreover, we observed higher gene \nexpression of LDL receptors on the cell membrane of foci of deep \nendometriosis, compared to the endometrium, both in wome n without \nendometriosis and women with endometriosis, a finding unlike that observed \nwith the protein determination. There was greater expression of LDL receptors \nin the endometrium during the secretory phase of the cycle. These findings \nsuggest the feasib ility of using lipid nanoemulsions for coupling and targeted \ndelivery of antiproliferative drugs in the treatment of deep endometriosis. \n \nDescriptors: Endometriosis; Receptors, LDL; Low Density Lipoprotein \nReceptor-Related Protein-1; Cholesterol, LDL; Emulsions; Nanoparticles. \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1 INTRODUÇÃO \n \n\n3 \n1  INTRODUÇÃO \n \n \n1.1 Endometriose \n \nA endometriose, definida como presença de glândula e/ou estroma \nendometrial fora da cavidade uterina, pode ser classificada em superficia l ou \nprofunda de acordo com sua capacidade de infiltração nos tecidos ( Benagiano \net al. , 2014). Conforme descrito por Cornillie et al. em 1990, as lesões com \nprofundidade acima de 5 mm situadas em fundo de saco de Douglas, reflexão \nvésico-uterina, ligament os pélvicos, vagina e/ou intestino, representam o tipo \nde doença em que as pacientes apresentaram mais queixas de dor, enquanto \nas lesões superficiais se relacionaram com maior frequência aos casos de \ninfertilidade (Cornillie et al., 1990). \nAcomete cerca d e 10% das mulheres em idade reprodutiva ( Eskenazi et \nal., 1997; Viganò et al.,  2004) e promove sintomatologia álgica muitas vezes \nincapacitante comprometendo significativamente a qualidade de vida das \nportadoras (Bassi et al., 2009; Donnez & Squifflet, 2010). Estima-se que 5,3% a \n12% das mulheres com endometriose apresentam a forma mais grave da \ndoença com comprometimento profundo do intestino, o que pode ocasionar, \nquando indicado tratamento cirúrgico, riscos determinados de complicações \nintra e pós -operatórias, contribuir para eventual persistência dos focos, além \ndas possibilidades de recorrência das lesões ( Coronado et al., 1990; Jerby et \nal., 1999; Minelli et al., 2009; Koninckx et al., 2012). \nO tratamento medicamentoso disponível , atualmente, visa atro fia dos \nfocos de endometriose, seja por interrupção da atividade ovariana ao induzir \nstatus de hipoestrogenismo, seja por pseudodecidualização do endométrio e da \nlesão de endometriose, deste modo , podendo amenizar significativamente os \nsintomas ( Practice C ommittee of the American Society for Reproductive \nMedicine, 2014) . Por ser doença crônica e requerer tratamento de longa \nduração, algumas opções da terapêutica clínica atual enfrentam limitações pelo \nalto potencial de efeitos colaterais, como sintomas climatéricos e diminuição da \n\n4 \ndensidade mineral óssea, além de não proporcionar o desaparecimento \ndefinitivo dos focos (Fernandez et al., 2004; Mettler et al., 2014). \nEmbora seja considerada doença benigna, a endometriose possui \ncaracterísticas típicas de doença neoplásica, como a capacidade de invasão no \nestroma adjacente e associação com lesões a distância (Abrão et al.,  2006). \nComo o câncer, a endometriose pode aderir em outros tecidos, invadi -los e \ndeformá-los (Thomas e Campbell, 2000; Van Gorp et al., 2004). Além disso, os \nconceitos etiopatogênicos incluem fatores de crescimento e citocinas \nassociados com a regulação de multiplicação celular e angiogênese, com \nfunção semelhante na carcinogênese (Podgaec et al., 2007; Pupo-Nogueira et \nal., 2007). Podgaec et a l. demonstraram que , na endometriose, doença de \ncaracterísticas inflamatórias, ocorre relativo aumento de citocinas \nrepresentativas de padrão de resposta imune humoral (Podgaec et al., 2007; \nPodgaec et al.,  2012). Pupo -Nogueira et al. observaram que o fato r de \ncrescimento endotelial vascular evolui com variações cíclicas no fluido \nperitoneal (Pupo -Nogueira et al.,  2007). Além disso, a distribuição e a \ndensidade vascular estão significativamente mais altos em pacientes com \nendometriose profunda (Kuroda et al., 2010). \nEstas alterações imunológicas produzem um microambiente semelhante \nao encontrado em tumores ovarianos. Células epiteliais do ovário com \npotencial maligno, diante dessas alterações moleculares e bioquímicas, \naumentam a capacidade de proliferação c elular, reduzem mecanismos \napoptóticos e, consequentemente, a imunovigilância. Como resultado, as \ncélulas malignas, que normalmente deveriam ser eliminadas pela resposta \nimunológica, são capazes de sobreviver, proliferar e desenvolver tumores \ninvasivos (Vlahos et al., 2010b). \nA principal questão fisiopatológica da endometriose parece implicar em \nperda de controle sobre a proliferação celular, uma característica semelhante à \nencontrada no desenvolvimento de lesões malignas ( Van Gorp et al.,  2004). \nEm 2013, Abdalla-Ribeiro et al. demonstraram que o fator antiapoptótico Bcl2 \nestá superexpresso em lesões de endometriose profunda de retossigm oide e \nligamentos uterossacros quando comparados ao endométrio tópico da mesma \npaciente, enquanto o fator pró -apoptótico Ba x é nulo no reto e endométrio \n\n5 \ntópico, e apresenta baixíssima expressão nos ligamentos uterossacros \n(Abdalla-Ribeiro et al., 2013). \nHá indícios de que o carcinoma endometri oide e de células claras do \novário estejam associados à endometriose. Os riscos parec em ser mais \nelevados em doença de longa data, influenciados pela alta concentração de \nferro livre, que induz a stress oxidativo persistente (Koshiyama et al., 2014). No \nentanto, é importante reconhecer que estes tumores são raros. Kobayashi et \nal., em estudo de coorte de 6 .398 mulheres com endometrioma ovariano, em \nseguimento de 17 anos, demonstraram incidência de 0,7% (46 mulheres) com \ncâncer de ovário (Kobayashi et al., 2007). \nConsiderando a preocupação com a perda de controle de fatores \nassociados ao cre scimento celular ( Van Gorp et al., 2004), especula-se que a \nexposição excessiva a estrogênios poderia estar relacionada a este fenômeno, \ncolocando, deste modo, mulheres inférteis em risco aumentado para \nneoplasias ginecológicas, e qu e ovulações incessantes  desempenhem um \npapel significativo no desenvolvimento do câncer do ovário (Vlahos et al.,  \n2010a/b). De acordo com esta hipótese, cada ovulação cria uma ferida na \nsuperfície epitelial ovariana, que são submetidas a processo de reparação pelo \naumento da pro liferação celular, o que poderia aumentar a probabilidade de \ndanos ao DNA e promover mutações cancerígenas (Kobayashi et al., 2007). \nO estrogênio endógeno representa importante fonte de estímulo ao \ndesenvolvimento da endometriose. Além da produção deste ho rmônio pelos \novários, tanto pela circulação quanto pela ruptura folicular durante a ovulação, \nque promove liberação de estradiol sobre os focos de endometriose, há a \nconversão de androstenediona em estrona e estradiol, catalisados pela \naromatase, no tecido  adiposo e pele, atingindo os focos de endometriose por \nmeio da corrente sanguínea. Outra fonte é o colesterol sérico, que pode ser \nconvertido em estradiol na própria lesão de endometriose, pois expressa um \nconjunto completo de genes esteroidogênicos, incl uindo o gene da aromatase, \ninduzindo a conversão hormonal (Bulun et al., 2005). \nHá mais de cem anos, John Holden Webb investigou , pela primeira vez, a \nassociação entre o metabolismo lipídico e progressão de tumores , e sugeriu \nque o câncer ocorria devido à cristalização do colesterol nas células ( Webb et \n\n6 \nal., 1901). Desde aquela época, o envolvimento do metabolismo lipídico na \ntumorigênese foi exaustivamente investigado. O colesterol, como composição \nde membranas celulares, foi estabelecido como exigência me tabólica essencial \npara o processo de divisão celular ( Martinez-Botas et al., 1999; Martinez-Botas \net al.,  2001) e foi demonstrado que células em proliferação apresentam \naumento da absorção de colesterol (Guo et al.,  2011; Sundelin et al.,  2012). \nAlém disso, as células cancerosas se adaptam para manter níveis elevados de \ncolesterol intracelular por meio de diferentes mecanismos que incluem a \nprodução endógena acelerada de colesterol e ácidos graxos (Pitroda et al.,  \n2009), alterações do efluxo de colesterol intracelular como demonstrado por \nLee et al. no câncer de próstata (Lee et al., 2013), e pelo aumento da absorção \nde partículas de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) por superexpressão de \nreceptores de membrana (Rudling et al., 1990). \nConsiderando a re lação do colesterol com mecanismos celulares \nfundamentais na tumorigênese e , também, o seu papel como precursor de \nhormônios esteroides, admitimos a hipótese de seu envolvimento na \netiopatogenia da endometriose profunda, principalmente no que diz respeito à \nparticipação na indução de proliferação de lesões, devido à endometriose \nprofunda apresentar características fenotípicas semelhantes à neoplasia e por \nsua dependência ao estrogênio. \nPara compreensão dos mecanismos de envolvimento do metabolismo do \ncolesterol e sua associação com a endometriose profunda , é de fundamental \nimportância o entendimento das lipoproteínas, apolipoproteínas e o papel dos \nreceptores de lipoproteínas. \n \n \n1.2 Lipoproteínas e apolipoproteínas \n \nAs lipoproteínas funcionam como veículos p ara transportar lipídios no \nsangue na forma de complexos de lipídios solúveis e proteínas. Os lipídios \nincluem triglicérides, ésteres de colesterol, colesterol livre e fosfolipídios (Henry \net al., 2011). As diferentes classes de lipoproteínas executam funç ões distintas \n\n7 \nno transporte de lipídios e as apolipoproteínas específicas na superfície \ndeterminam o destino das lipoproteínas.  \nDe acordo com suas características físicas e composição química, são \nclassificadas em quatro grandes grupos: \n \n quilomícrons, são  as maiores partículas lipoproteicas e as menos \ndensas;  \n VLDL são lipoproteínas de muito baixa densidade, com maior \nproporção de proteína;  \n LDL são lipoproteínas de baixa densidade, ricas em ésteres de \ncolesterol;  \n HDL são lipoproteínas de alta densidade, que são as menores e as \nmais densas (Henry et al., 2011). \n \nOs níveis de colesterol no sangue são controlados , principalmente, pelo \nreceptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL), presente na superfície de \ntodas as células do corpo, que faz a mediação da  captação das lipoproteínas \nricas em colesterol do sangue. Proteínas específicas na superfície de certas \nlipoproteínas (apolipoproteína B100 e apolipoproteína E) interagem com o \nreceptor de LDL e facilitam a internalização da lipoproteína nas células ( Vitols \net al., 1990).  \nApolipoproteínas são proteínas que se ligam a lipídios para formar \nlipoproteínas e facilitar o seu transporte no sistema linfático e circulatório. \nAtuam como ligantes, interagindo com receptores e, portanto, tem a \ncapacidade de regular o  metabolismo de lipoproteínas por determinação de \nabsorção pelos tecidos (Brown et al., 1994). \nAs apolipoproteínas específicas na superfície das lipoproteínas \ndeterminam o seu destino ( Johnson et al.,  1997; Franklin et al.,  2014). Para \nentender o metabolis mo da lipoproteína e a correlação com doenças \nassociadas às anormalidades lipídicas, é necessário considerar as funções \nindividuais das apolipoproteínas na regulação do metabolismo lipídico. \nNeste estudo, optamos por avaliar os níveis séricos de duas impor tantes \napolipoproteínas: Apo AI, responsável pela ligação com os receptores de \n\n8 \nlipoproteínas de alta densidade e Apo B100, responsável pela ligação com os \nreceptores de lipoproteínas de baixa densidade (Breslow et al., 1994; Mahley et \nal., 1995) . \nAlgumas das propriedades das apolipoproteínas estão resumidas na \nTabela 1 (adaptação de Mahley et al., 1984). \n \nTabela 1 - Caracterização das Apolipoproteínas Humanas (adaptação de \nMahley et al., 1984). \nApolipoproteína Principais locais \nde síntese Funções Principais \nA I Fígado, Intestino Proteína estrutural da HDL. Ligação para o receptor \nde HDL. \nA II Fígado Inibe a ligação da apo-E com os receptores \nA IV Intestino Pode facilitar o efluxo de colesterol das células. \nPossível função no metabolismo dos triglicérides. \nB 100 Fígado Proteína estrutural de VLDL e LDL. Ligação para \nreceptor de LDL. \nB 48 Intestino Proteína estrutural dos quilomícrons. \nC I Fígado \nAtivador de LCAT, que esterifica o colesterol livre nas \npartículas do HDL. Modula a ligação de subprodutos \naos receptores. \nC II Fígado Cofator da LPL \nC III Fígado Modula a ligação de subprodutos aos receptores. \nE \nFígado, cérebro, \npele, gônadas, \nbaço \nLigação de LDL a receptores restantes. \nRedistribuição local de lipídio. Transporte de \ncolesterol reverso (HDL com Apo E) \nApo (a) Fígado Modulador de fibrinólise \nD Fígado, Intestino Ativador de LCAT \nLCAT: lecitina colesterol acetiltransferase; LPL: lipase lipoproteica \n \n \n1.3 Receptores de LDL \n \nO receptor de LDL (LDL -R) foi, inicialmente, identificado em 1973 e seu \ngene foi caracterizado em 1985 no Laboratório de Goldstein e Brown. Duas \nproteínas na superfície da lipoproteína, apo -B 100 e apo -E, se ligam ao \nreceptor de LDL, e, por isso, pode também ser chamado de receptor apo -B100 \n\n9 \ne apo-E (Goldstein et al., 1995). O LDL -R é uma glicoproteína sintetizada no \nretículo endoplasmático e está expresso na superfície da maioria das células, \nespecialmente no fígado.  As células podem adquirir colesterol do plasma pela \ncaptação dessas lipoproteínas por meio de receptores de LDL (Brown e \nGoldstein, 1986). \nDepois que a lipoproteína se une ao LDL -R, o complexo permanece em \numa área especializada da membrana da célula chamada fossa revestida. O \n“revestimento” é composto por um complexo de proteínas chama do clatrina, \nque agrupa os receptores em uma região da membrana da célula que pode \ninvaginar e formar uma vesícula intracelular para conter a lipoproteína. À \nmedida que essas vesículas internalizadas, ou endossomos, se movem para o \ncitoplasma, o ambiente i nterno vai progressivamente se tornando mais ácido, \ncausando dissociação entre o receptor e a lipoproteína. As lipoproteínas são \ndegradadas nos lisossomos e os receptores não utilizados se reciclam para a \nsuperfície da célula (Herz et al., 1988).  \nO número  de receptores de LDL na superfície da célula é fortemente \nregulado. Se o conteúdo de colesterol de uma célula estiver elevado, há uma \ndiminuição do número de receptores sintetizados. Por outro lado, se uma célula \nexigir colesterol, a expressão dos recepto res de LDL sobe e o número de \nreceptores na superfície da célula aumenta. Este sistema mantém a \nconcentração intracelular de colesterol relativamente constante e impede \nacúmulo excessivo e, possivelmente, tóxico ( Goldstein et al., 1995; Johnson et \nal., 1997). \nO receptor LRP (receptor de LDL relacionado à proteína) é um dos \nmembros da família de receptores de LDL. É denominado LRP -1 devido à \nhomologia estrutural da sequência de domínios rica em cisteína com a \nmolécula do receptor de LDL ( Moestrup et al.,  1992). É expresso , \nprincipalmente, no fígado, mas também está presente em outros tecidos \nhumanos, como células musculares lisas, fibroblastos, neurônios e astrócitos, \nepitélio do trato gastrointestinal, células gonadais, placentárias e medula óssea \n(Strickland et al., 1995). \n\n10 \nO LRP-1 é um receptor endocítico de amplo espectro e tem a função de \nintermediar o catabolismo de múltiplos ligantes como lipoproteínas e \nproteinases, além de toxinas bacterianas e alguns tipos de vírus ( Strickland et \nal., 1995). \nHo e col aboradores associaram a leucemia com a hipocolesterolemia \ncorrelacionando com aumento da atividade de receptores para LDL, de três a \ncem vezes maior, em células leucêmicas do que em leucócitos normais (Ho et \nal., 1978). Este foi o principal impulso para o estudo da LDL como complexo \ncapaz de transportar drogas ant ineoplásicas participando da revolução do uso \nda nanotecnologia em diversos setores da Medicina. Esse estado de \nhipocolesterolemia sérica também foi demonstrado em outras neoplasias \n(Maranhão et al. 2002; Kok et al., 2011; Simko et al., 2014). \n \n \n1.4 Nanotecnologia em Medicina e o desenvolvimento das \nnanoemulsões lipídicas \n \nPartículas de dimensões variáveis, entre 1 e 100 nm, vêm sendo \nprojetadas e progressivamente mais utilizadas para distribuição d irecionada de \ndrogas ou agentes de imagem diretamente no tecido -alvo na quantidade \ndesejada (Medina et al.,  2007). Assim, este recurso tem sido empregado em \ndiversas condições como câncer, diabetes, infecções fúngicas e virais , e \nterapia genética (Surendir an et al.,  2009). Além disso, limitam os efeitos \ncolaterais e previnem o desenvolvimento de resistência farmacológica (Minko \net al., 2008). \nA proposta original do uso da nanotecnologia aplicada à M edicina visa \nincorporar moléculas estranhas à LDL original.  Esse processo envolve a \nsubstituição dos lípides internos do núcleo da LDL por outros compostos \nhidrofóbicos (Saad et al. 2008). \nA LDL é uma grande partícula esférica (massa molecular 3 x 10 6 kDa e 22 \nnm de diâmetro), que contém em seu núcleo cerca de 1 .500 moléculas de \nésteres de colesterol envoltas por uma proteína, a apolipoproteína B (apo -\n\n11 \nB100), responsável pelo reconhecimento da estrutura pelo receptor de \nmembrana específico (Vallabhajosula et al., 1990). \n \n \nFigura 1 - Representação esquemática da LDL ( Low-Density Lipoprotein ) \n(Extraído de www.healthprotocols.com). \n \nO uso da LDL natural obtida do plasma, no entanto, mostrou -se muito \ndispendioso. O processo de isolamento a partir do sangue é trabalhoso e a \nobtenção de grandes qu antidades, difícil. Isso fez com que fossem \ndesenvolvidas emulsões lipídicas artificiais com comportamento metabólico \nsimilar à LDL e captação pelos mesmos receptores de membrana (Rudling et \nal., 1990). \nUm desdobramento importante nesta matéria teve lugar no Laboratório de \nMetabolismo e Lípides do Instituto do Coração da Universidade de São Paulo \nem artigos publicados a partir de 1992 (Maranhão et al.,  1992; 1993; 1994). \nUsando conhecimentos básicos do metabolismo das lipoproteínas e de \ntecnologia de manufa tura de nanopartículas, o Prof. Dr. Raul C avalcante \nMaranhão e seu grupo conseguiram estruturar nanopartículas lipídicas capazes \nde concentrar-se em células neoplásicas , e, com isso, carrear quimioterápicos. \nTratou-se de descoberta pioneira, já que foi a p rimeira vez que se demonstrou \no direcionamento de partículas sólidas artificiais para o sítio de ação. A \n\n\n12 \ninvenção foi objeto de patentes concedidas pelo Departamento de Comércio \ndos Estados Unidos da América (n° 08/388.147). \nA emulsão lipídica denominada L DE assemelha-se, estruturalmente, com \na porção lipídica da LDL original, porém não possui apolipoproteína B100. São \nproduzidas por meio de tecnologia baseada em ultrassom, ultracentrifugação \nou microfluidização sob alta pressão. Em contato com o plasma, LD E irá \nadquirir a apolipoproteína E, proteína presente na HDL, VLDL e quilomícrons, \nque, como outras apolipoproteínas, são móveis e migram das lipoproteínas \noriginais para as partículas de LDE. Como a Apo E também pode ser \nreconhecida pelos receptores de LD L, permite que a LDE seja interiorizada \npelas células pela mesma trajetória da LDL, por endocitose mediada pelos \nreceptores de LDL (Ginsburg et al., 1982, Wilson et al., 1991, Maranhão et al., \n1993). \nDesde então, o Laboratório de Metabolismo e Lípides tem demonstrado a \ncapacidade de acoplamento de diversos quimioterápicos à LDE: carmustina \n(Maranhão et al., 2002), derivados de paclitaxel (Rodrigues et al., 2002; 2005), \netoposídeo (Valduga et al.,  2003), daunorrubicina (Teixeira et al.,  2008) e \nmetotrexato (Moura et al., 2011). \nEm estudos in vitro  (Rodrigues et al.,  2002; Valduga et al.,  2003) e de \nfarmacocinética em animais (Rodrigues et al., 2005) e em pacientes (Maranhão \net al.,  2002), foi demonstrado que as diversas preparações de LDE com \nquimioterápicos mantiveram-se estáveis, sendo que o fármaco transportado \npelas nanopartículas não foi dissociado na circulação, permanecendo na LDE \naté a entrada nas células, condição indispensável para obtenção do efeito \n“drug-targeting”.  \nEstudos in vivo  mostraram que o  processo de veiculação reduziu \nsignificativamente a toxicidade dos quimioterápicos (Dorlhiac -Llacer et al.,  \n2001), na ordem de cinco a dez vezes (Valduga et al., 2003; Rodrigues et al., \n2002). Modelos experimentais oncológicos tratados com LDE -quimioterápico \ntiveram crescimento tumoral inibido, aumento do tempo de sobrevida e redução \nacentuada de metástases (Lo Prete et al., 2006; Kretzer et al., 2012).  \n\n13 \n \nFigura 2 - Representação esquemática da LDL natural mostrando a \nsemelhança da nanoemulsão lipídica LDE , exceto pela ausência da \napolipoproteína B. \n \nEsta linha de pesquisa permitiu um avanço em direção a novas \nestratégias terapêuticas para artrite reumat oide (Mello et al.,  2013), leucemia \nmieloide aguda (Maranhão et al., 1994; Dorlhiac-Llacer et al., 2001), mieloma \nmúltiplo (Hungria et al., 2004), câncer de ovário (Ades et al., 2001; Azevedo et \nal., 2005), câncer de mama (Graziani et al.,  2002), linfoma Hodgkin e nã o \nHodgkin (Pinheiro et al., 2006), melanoma (Lo Prete et al., 2006; Contente et \nal., 2014), aterosclerose (Maranhão et al., 2008; Tavares et al., 2011; Bulgarelli \net al.,  2013), doença vascular do enxerto do transplante cardíaco (Lourenço -\nFilho et al.,  2011) e, mais recentemente, o infarto agudo do miocárdio \n(Maranhão et al., dados não publicados). \n \n \n1.5 Hipótese do estudo \n \nConsiderando três pontos principais: \n \n a importância da linha de pesquisa que determina o papel do \ncolesterol como substrato necessário para proliferação celular em \ncasos de neoplasias malignas pela obse rvação do aumento da \nexpressão dos receptores de LDL em membrana de tumores \n\n\n14 \nneoplásicos (Rudling et al.,  1990; Martinez-Botas et al.,  1999;  \nMartinez-Botas et al.,  2001; Pitroda et al.,  2009; Guo et al.,  2011; \nSundelin et al., 2012; Lee et al., 2013). \n  os resultados encontrados em estudos que demonstram \nhipocolesterolemia em pacientes oncológicos, justificado pelo \naumento do consumo de colesterol utilizado pela doença como \ncombustível indutor de multiplicação celular (Ho et al.,  1978; \nMaranhão et al., 2002; Kok et al.; Simko et al., 2014). \n os conceitos etiopatogênicos na endometriose profunda que incluem \nfatores de crescimento e citocinas associados com a regulação de \nmultiplicação celular e angiogênese, com função semelhante na \ncarcinogênese (Abrão et al., 2006; Pupo-Nogueira et al.; Podgaec et \nal., 2007; Podgaec et al., 2012; Abdalla-Ribeiro et al., 2013). \n \nA partir desses conceitos, a hipótese desse estudo é que as lesões de \nendometriose profunda possam apresentar o mesmo comportamento e as \nmesmas necessidades que outras lesões tumorais, ou seja, tenham alta avidez \npelo colesterol para composição de membrana celular, característica de lesões \nproliferativas. Para isso, devem superexpressar os receptores de colesterol, o \nque permitiria maior captação desse, r esultando em menores concentrações \nséricas. \nAssim, destacamos que os resultados esperados são a superexpressão, \nno tecido com endometriose, dos receptores de lipoproteínas LDL -R e LRP -1, \nquando comparado a tecido endometrial normal. \nPosteriormente, pretend emos testar a capacidade da nanoemulsão \nlipídica, denominada LDE, de interiorização celular e, no futuro, poder \nselecionar uma droga para acoplamento nesta emulsão que seja capaz de \nsuprimir o foco da doença. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2 OBJETIVOS \n\n17 \n2 OBJETIVOS \n \n \n2.1 Objetivo principal \n \nAvaliar a expressão gênica e a determinação prot eica de receptores de \nLDL (LDL-R e LRP-1) na lesão de endometriose profunda. \n \n \n2.2 Objetivos específicos \n \n Relacionar a expressão gênica e a determinação p roteica dos \nreceptores de LDL (LDL-R e LRP-1) no endométrio das pacientes com \nendometriose profunda com o endométrio de mulheres sem a doença; \n \n Avaliar o perfil lipídico sérico de pacientes com e sem endometriose, \npor meio da dosagem de: \n colesterol total; \n LDL colesterol; \n HDL colesterol; \n triglicérides; \n Apo A I; \n Apo B 100. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3 PACIENTES E MÉTODOS \n \n\n21 \n3 PACIENTES E MÉTODOS \n \n \n3.1 Tipo do estudo e cálculo da amostra \n \nTrata-se de estudo transversal, caso -controle, expl oratório, com 39 \npacientes, sendo 20 pacientes com diagnóstico histológico de endometriose \nprofunda, todas com comprometimento intestinal, e 19 pacientes sem \nendometriose. Esse número de pacientes foi determinado pelo cálculo do \ntamanho da amostra. \nVisando encontrar diferenças entre os grupos e locais de avaliação na \ndeterminação proteica por imunoistoquímica e nas expressões do RNA \nmensageiro (RNAm), foram utilizados os 10 primeiros casos de cada grupo de \nmulheres como amostra-piloto e estabelecida a varia bilidade da expressão dos \nníveis de RNAm, sendo essas medidas as únicas objetivamente avaliadas.  \nSupondo diferença média de , pelo menos , 1 desvio padrão entre as \nexpressões na lesão endometriótica e no endométrio da paciente com \nendometriose ou da paciente sem endometriose, com poder de 80% e intervalo \nde confiança de 95%, a amostra necessária para a realização do estudo foi de \n16 mulheres em cada grupo.  \n \n \n3.2 Local do estudo \n \nO estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão da Clínica \nGinecológica do Hospital das Clínicas (HCFMUSP) e no Laboratório de \nMetabolismo e Lípides do Instituto do Coração, ambos da Faculdade de \nMedicina da Universidade de São Paulo e no Núcleo de Endoscopia \nGinecológica e Endometriose do Hospital Pérola Byington.  \n \n \n\n22 \n3.3 Pacientes \n \nTodas as pacientes foram informadas previamente sobre os objetivos do \nestudo e as amostras foram coletadas somente após a assinatura do Termo de \nConsentimento Livre e Esclarecido. As coletas das amostras cumpriram com a \nética e os princípios práticos de biossegurança estipulados pelo Ministério da \nSaúde. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Análise de Projetos de Pesquisa \ndo Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São \nPaulo (# 0417/11)  e pelo Comitê de Ética e Pesquisa d o Hospital Pérola \nByington. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo \n(FAPESP) contribuiu para a realização deste estudo com verba aprovada no \nProcesso 2011/17245-0. \n \n \n3.4 Critérios de inclusão \n \nComo critérios de inclusão, as pacientes de ambo s os grupos estavam no \nmenacme, apresentavam ciclos eumenorreicos, não eram portadoras de \ndislipidemia, doenças aut oimunes, hormonais (SOP, tireoidopatias, outras) ou \nneoplasias malignas, e não utilizaram terapêutica antidislipidêmica ou hormonal \nnos três meses que antecederam a cirurgia. No caso de suspeita clínica de \numa dessas condições, foram realizados exames laboratoriais e/ou de imagem \npara diagnóstico definitivo.  \nPara o grupo com endometriose, houve confirmação histológica das \nlesões. Para o grupo sem endometriose, houve avaliação pélvica por \nvídeolaparoscopia que confirmou a ausência de lesões. \n \n \n3.5 Dinâmica do estudo \n \nForam obtidos os dados clínicos das pacien tes de ambos os grupos, \nincluindo os principais sintomas referidos por mulheres portador as de \nendometriose, quais sejam: dismenorr eia, dor pélvica acíclica, dispareunia de \n\n23 \nprofundidade, infertilidade, alterações urinárias cíclicas e alterações intestinais \ncíclicas. Considerou-se relevante a dismenorreia avaliada em escala visual \nanalógica de dor, referida por nota igual ou acima de 7. Foram coletados \ntambém peso e altura das pacientes, para cálculo de índice de massa corpórea \n(IMC). \nPara o grupo com endometriose, o protocolo do Setor de Endometriose \ndo HCFMUSP foi seguido: pacientes com quadro  de dor pélvica e suspeita de \nendometriose em retossigm oide por exame de imagem (ultra ssom pélvico e \ntransvaginal com preparo intestinal) usam terapêutica hormonal por 6 a 12 \nmeses e são reavaliadas, nesse período, clinicamente e com novos exames de \nimagem. Na falha do tratamento, ou seja, diante da persistência de sintomas ou \ncrescimento da lesão, há indicação de cirurgia. Em pacientes com quadro \nsuboclusivo determinado por lesões intestinais profundas e extensas, a cirurgia \né indicada de imediato. Este pr otocolo é seguido nas duas instituições \nparticipantes do estudo.  \nAs pacientes do grupo sem endometriose foram compostas por mulheres \ncom prole constituída e com desejo de anticoncepção definitiva consentido pelo \nparceiro, registrado em cartório, de acordo  com a aprovação do Setor de \nPlanejamento Familiar da Divisão de Clínica Ginecológica de ambas as \ninstituições (HCFMUSP e Hospital Pérola Byington). O procedimento realizado \nfoi a laqueadura tubária laparoscópica. \nForam realizados 54 videolaparoscopias con secutivas, sendo 28 para \ntratamento de endometriose profunda e 26 para laqueadura tubária.  \nDevido ao achado de endometriose peritoneal incidental em \nlaparoscopias para laqueadura tubária, foram excluídas do estudo 4 pacientes \ndo grupo sem endometriose.  \nAinda, devido à necessidade de armazenamento do sangue periférico \ncoletado no início de cada procedimento cirúrgico e posterior transporte dos \ntubos até o Laboratório de Metabolismo de Lípides do Instituto do Coração da \nFaculdade de Medicina da Universidade  de São Paulo, ocorreu hemólise em 5 \namostras de sangue das pacientes do grupo com endometriose e 2 amostras \nde pacientes do grupo sem endometriose, as quais foram retiradas do estudo. \nFoi verificado, no momento da extração do RNA e síntese de DNA \n\n24 \ncomplementar, que quatro das amostras de RNA não estavam viáveis , e, por \nisso, foram excluídas do estudo, das quais três eram do grupo com \nendometriose e uma do grupo sem doença. Desta forma, o grupo com \nendometriose ficou composto por 20 pacientes e o grupo -controle (sem \nendometriose), por 19 mulheres. \n \n \nFigura 3 - Quadro explicativo da dinâmica do estudo. \n \nFoi registrado o dia do ciclo menstrual no momento da realização da \ncirurgia, sendo dividido em fase proliferativa quando a paciente estava entre o \nprimeiro e o 14 o dia do ciclo e secretora, do 14 o ao último dia do ciclo \nmenstrual (Ecochard & Gougeon, 2000). Esta divisão permitiu a análise de 11 \npacientes (55%) na fase proliferativa e 9 (45%) na fase secretora no grupo \ncom endometriose, e 10 mulheres (52,6%) na fase proliferativa e 9 (47,4%) na \nfase secretora, no grupo sem endometriose. \n \n \n\n\n25 \n3.6 Procedimento cirúrgico e coleta das amostras \n \nAntes do início do procedimento cirúrgico, foram colhidos 20 ml de sangue \nperiférico de cada paciente , coletado de punção venosa em membro superior, \napós jejum de 12 horas.  \nAs amostras de endométrio foram obtidas utilizando cureta de Pipelle ® \nnos dois grupos, imediatamente após indução anestésica e posicionamento da \npaciente. Os focos de endometriose pro funda foram totalmente ressecados \ncomo tempo obrigatório do tratamento cirúrgico proposto para erradicação da \ndoença. \nOs fragmentos de endométrio e das lesões de endometriose profunda \nintestinal, determinados por meio  de análise macroscópica (Figura 4), fo ram \ndivididos em duas partes, uma delas armazenada em paraformaldeído 4% e \nencaminhada ao Laboratório de Anatomia Patológica do HCFMUSP e do \nHospital Pérola Byington (de acordo com o local da coleta) para análise \nhistológica. A outra parte foi armazenada e m solução de RNAlater® (Ambion \nLife Technologies , USA) e encaminhada ao laboratório de Metabolismo e \nLípides do Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de \nSão Paulo. \n \n \nFigura 4 - Lesão de endometriose intestinal após ressecção segmentar. \n\n\n26 \nAs amostras de sangue foram encaminhadas imediatamente após a \ncoleta ao Laboratório de Metabolismo e Lípides, em que foram centrifugadas a \n3.000 rpm por 10 minutos para separação do soro, que , assim como os tecidos \nem solução de RNA later®, foram armazenados a -80°C para análises \nposteriores.  \n \n \n3.7 Lípides plasmáticos \n \nPara determinar o colesterol total (CT) e triglicerídeos (TG) , foi utilizado \nmétodo enzimático colorimétrico comercial (Labtest, Brasil). O HDL colesterol \n(HDL-C) foi medido pelo mesmo método utilizado para o CT, após precipitação \ncom fosfotungstato e cloreto de magnésio. O LDL colesterol  (LDL-C) foi \ncalculado pela fórmula de Friedewald (Friedewald et al.,1972), em que LDL = \nColesterol Total – (VLDL + HDL) e VLDL,  pela fórmula VLDL = TG/5. As \nconcentrações séricas de apo AI e apo B 100 foram determinadas por método \nimunoturbidimétrico (Roche, Alemanha). \n \n \n3.8 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA) \n \nApós procedimento cirúrgico, o tecido coletado foi ar mazenado em \nsolução de RNA later® (Ambion Life Technologies , EUA) e seu RNA total foi \nextraído utilizando -se o reagente Trizol ® (Invitrogen Life Technologies , EUA), \nsegundo instruções do fabricante . A qualidade das amostras foi verificada por \nmeio de corrid a eletroforética em gel denaturante de agarose e as \nconcentrações dessas foram determinadas por meio de leitura em \nespectrofotômetro em comprimento de onda de 260/280 nm no aparelho \nNanoDrop 2000 Spectrophotometer (ThermoScientific, EUA), em que se \nconsideraram satisfatórias razões que variavam de 1,8 a 2,0. Como já \nmencionado, quatro  das amostras de RNA não estavam viáveis e por isso \nforam excluídas do estudo, das quais três eram do grupo com endometriose e \n\n27 \numa do grupo sem doença. As amostras -mãe foram estocadas a -80ºC e uma \nalíquota foi utilizada para a transcrição reversa.  \nPara cada 16 µL (250 ng) de RNA a ser reversamente transcrito, \nacrescentou-se 4 µL do reagente Superscript® VILOTM Master Mix  5X \n(Invitrogen Life Technologies, EUA). Este produto foi incubado inicialmente por \n10 minutos à temperatura de 25°C, por 60 minutos à temperatura de 42 °C e, \npor fim, por 5 minutos à temperatura de 85 °C. Após esta etapa, as amostras \nforam diluídas 5 vezes em solução TE-4 e armazenadas em - 80°C. \n \n \n3.9 Análise de expressão gênica por PCR em tempo real \n \nA expressão gênica dos receptores LDL -R e LRP -1 foi analisada pela \ntécnica de PCR em tempo real utilizando -se método de detecção Taqman com \nprimers e sondas fluorescentes para a detecção do produto-alvo de PCR. Esse \ntipo de detecção é altamente específico, não necessitando padronização da \nreação.  \nAs reações de amplificação foram realizadas no equipamento \nStepOnePlus Real -Time PCR System  (Applied Biosystems Life Technologies, \nEUA) em um volume final de 12 uL, constit uídos de 1,2 uL de cDNA (1:5), 4,2 \nuL de água Milli -Q, 6 uL de Taqman Universal PCR Master Mix , 0,6 uL de \nsonda Taqman 20x ( Taqman Gene Expression Assays ) específica de cada \ngene-alvo a ser analisado ou 0,6 uL do reagente Human GAPDH Pre -\nDeveloped TaqMan A ssay 20X, utilizado como gene normalizador \n(housekeeping gene ou endogenous control gene ). Os ensaios Taqman Gene \nExpression, tanto para o LDL -R ( Hs00181192_m1) quanto para o LRP -1 \n(Hs00233856_m1), bem como todos os reagentes utilizados para a reação \nforam adquiridos da Applied Biosystems Life Technologies, EUA). \nO programa gera um gráfico de intensidade de fluorescência em função \ndo número de ciclos de amplificação. Um limiar ( threshold) é definido \nautomaticamente, no qual a intensidade de fluorescência é estatisticamente \ndiferente da fluorescência de fundo ( background) e a curva apresenta a \nfluorescência da amplificação aumentando exponencialmente. O número do \n\n28 \nciclo cuja fluorescência da amostra intercepta o threshold é chamado Ct ( cycle \nthreshold). Os res ultados obtidos foram analisados de acordo com o software \ndeste equipamento.  \nTodas as reações foram realizadas em duplicata e consideradas \naceitáveis as reações cujo desvio padrão foi menor que 0,4 ou menor que um \nCt de diferença.  \nA quantificação da expr essão gênica foi realizada com o cálculo da \nexpressão bruta ou Ct comparativo demonstrado pelo algoritmo 2 -∆Ct (Livak & \nSchmittgen, 2001). O valor de Ct equivale à diferença entre o Ct do gene de \ninteresse e o Ct do gene normalizador. A diferença dos valores de Ct ( Ct) \nentre as amostras para cada gene (LDLR e LRP -1), após normalização pelo Ct \ndo gene de expressão constante (GAPDH), reflete sua expressão diferencial. O \nresultado representa o número de vezes que o gene analisado tem a sua \nexpressão aumentada ou diminuída nos tecidos estudados. \nPara este estudo , também foi calculada a expressão gênica relativa, \nutilizando-se o método 2 -∆∆ct, em que os Cts de GAPDH foram utilizados para \nnormalização e o grupo -controle (endométrio de mulheres sem endometriose) \nfoi utilizado como calibrador para cada receptor estudado. \n \n \n3.10 Determinação proteica por imunoistoquímica \n \nOs blocos de tecido de biópsia foram solicitados ao Departamento de \nAnatomia Patológica do HCFMUSP e do Centro de Referência da Saúde da \nMulher do Estado de São Paulo – Hospital Pérola Byington, em que  foram \nrealizadas as análises histológicas. \nForam solicitadas lâminas dos b locos de material parafinado \ncorrespondentes aos tecidos de endométrio (grupo sem endometriose) e foco \nde endometriose (grupo com endometriose) para o preparo das lâminas de \nimunoistoquímica para análise dos receptores de LDL-R e LRP-1. \nA desparafinização das lâminas foi feita com 3 banhos de xilol de 10 \nminutos cada, seguidos de 3 banhos de etanol absoluto, 2 banhos de etanol \n\n29 \n95% e um banho de etanol 75%. As lâminas com os cortes histológicos foram , \nentão, lavadas em água corrente. \nPara realização da imunoistoquímica, a recuperação de antígenos foi \nrealizada por calor úmido e pressão em câmara de pressão para recuperação \nantigênica Pascal (Dako, EUA) com tampão citrato 10 mM pH 6,0 para ambos \nos antígenos, anti-LDL-R e anti-LRP-1. \nA atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 4 banhos de 5 \nminutos de peróxido de hidrogênio a 3%. O bloqueio de reações inespecíficas \nfoi feito com soro fetal bovino diluído em solução salina tamponada com sais \nfosfato (PBS) durante 1 hora em estufa umidificada a 37°C. Os anticorpos \nprimários anti -LRP-1 (Calbiochem, Alemanha) e anti -LDL-R (Abcam, EUA) \npreviamente padronizados, foram diluídos em PBS contendo 1% de albumina \nbovina. As lâminas foram incubadas por 18 horas a 4°C. O sistema de \ndetecção foi o polímero SuperPicture (Dako, EUA), aplicado por 25 minutos nos \ntecidos. A reação foi revelada com diaminobenzidina (DAB) (Dako, EUA) e \ncontracorado com hematoxilina de Harris. Os controles negativos foram feitos \nem tecido de fígado humano sem o uso do anticorpo primário. Os c ontroles \npositivos foram feitos em tecido de fígado humano seguindo todos os \nprocedimentos descritos anteriormente. \nA análise qualitativa da expressão proteica foi feita em microscópio óptico \nNikon Eclipse i80, acoplado a software de análise de imagem NIS-Elements AR \n3.2 Imaging Software  (Nikon Microscopy). A intensidade de cor do cromógeno \nDAB presente nos tecidos foi classificada de 1 a 4 (1:fraco, 2:médio, 3:forte, \n4:muito forte) por 2 observadores independentes e cegos ao estudo. \n \n \n3.11 Análise estatística \n \nAs características físicas e perfil lipídico foram expressos em média e \ndesvio padrão, comparados entre os grupos com e sem endometriose \nutilizando-se o Teste t-Student. \n\n30 \nA fase do ciclo foi descrita com uso de frequências absolutas e relativas, e \nverificada associação entre os grupos com e sem endometriose, utilizando -se o \nteste qui-quadrado. \nFoi verificada a existência de correlações da idade e do IMC com a \nexpressão gênica e com determinação proteica dos receptores LDL-R e LRP-1, \nem cada grupo, com e  sem endometriose, e locais de avaliação (endométrio e \nlesão de endometriose), por meio dos cálculos de correlação de Spearman.  \nA expressão gênica e determinação proteica dos receptores LDL -R e do \nLRP-1 para cada grupo com e sem endometriose , e locais de avaliação \n(endométrio e lesão de endometriose), foram comparadas entre as fases do \nciclo menstrual, utilizando -se o teste Mann -Whitney, para verificar se há \ninfluência da fase do ciclo menstrual na expressão dos receptores. \nO score de intensidade de marcaç ão dos receptores LDL -R e LRP -1, \navaliados por imunoistoquímica, foram comparados entre os grupos com e sem \nendometriose, e locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose) com \nuso de equações de estimação generalizadas com distribuição marginal \nPoisson e função de ligação identidade, supondo matriz de correlações \npermutável entre os locais de avaliação (endométrio e lesão de endometriose) \nde uma mesma mulher.  \nA expressão gênica dos receptores LDL -R e LRP -1 foram comparadas \nentre os grupos com e se m endometriose, e locais de avaliação (endométrio e \nlesão de endometriose) com uso de equações de estimação generalizadas com \ndistribuição marginal gama e função de ligação identidade, supondo matriz de \ncorrelações permutável entre os locais de avaliação ( endométrio e lesão de \nendometriose) de uma mesma mulher.  \nAmbas as análises foram ajustadas pelo IMC e pela fase do ciclo \nmenstrual.  \nForam realizadas comparações múltiplas de Bonferroni para saber entre \nquais grupos (com e sem endometriose) ou locais de a valiação (endométrio ou \nlesão de endometriose) ocorreriam diferenças na expressão dos receptores \nLDL-R e LRP-1. \nOs testes foram realizados com nível de significância de 5%. \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4 RESULTADOS \n\n33 \n4 RESULTADOS \n \n \n4.1 Características físicas, fase do ciclo menstrual e quadro clínico \n \nAs mulheres selecionadas para o presente estudo, alocadas em dois \ngrupos, o grupo com endometriose (20) e o grupo sem endometriose (19), \nforam pareadas por idade. Mulheres do grupo com endometriose apresentaram \nmédias de peso (62,6 ± 10,5 vs. 73,7 ± 8,4; p = 0,001), altura (1,61 ± 0,07 vs. \n1,65 ± 0,06; p = 0,046) e índice de massa corpórea (IMC) (24,1 ± 3,2 vs. 26,9 ± \n2,9; p = 0,006) significativamente menores do que as mulheres do grupo sem \nendometriose, como pode ser observado na Tabela 2. \nAlém disso, as mulheres que compõem os grupos deste estudo, com e \nsem endometriose, foram separadas de acordo com a fase do ciclo menstrual \nem que se encontravam, fase proliferativa ou fase secretora. Do g rupo com \nendometriose, 11 mulheres se encontravam na fase proliferativa e nove na fase \nsecretora. Das mulheres sem endometriose, nove se encontravam na fase \nproliferativa e nove na fase secretora (Tabela 2).  \n \nTabela 2 - Características físicas e fases do ciclo menstrual em mulheres com \ne sem endometriose. \n COM EDT \n(n = 20) \nSEM EDT \n(n = 19) p \nCaracterísticas físicas    \nIdade (anos) 35,7 ± 6,3 33,6 ± 5,7 0,288 \nPeso (Kg) 62,6 ± 10,5 73,7 ± 8,4 0,001 \nAltura (m) 1,61 ± 0,07 1,65 ± 0,06 0,046 \nIMC (Kg/m2) 24,1 ± 3,2 26,9 ± 2,9 0,006 \nFase do ciclo menstrual n (%)   0,882* \nProliferativa 11 (55) 10 (52,6)  \nSecretora 9 (45) 9 (47,4)  \nDados expressos em média ± desvio padrão. EDT: endometriose. IMC: índice de massa \ncorpórea. Teste t-Student; * Teste qui-quadrado. \n \n \n\n34 \nO quadro clínico das pacientes selecionadas para o estudo do grupo com \nendometriose evidencia sintomatologia álgica exuberante, com prevalência de \n55% de pacientes com dismenorreia severa (EVA >7), de acordo com a Escala \nVisual Analógica de Dor (EVA), que classifica de 0 a 10 os sintomas de acordo \ncom a sua intensidade. Outros sintomas típicos da doença, como dor pélvica \ncrônica (45%), dispareunia de profundidade (50%), alterações urinárias cíclicas \n(10%) e alterações intestin ais cíclicas (40%) também foram observados neste \ngrupo. A infertilidade esteve presente na maioria das pacientes selecionadas, \ncom prevalência de 60%.  \nNão foram observados sintomas álgicos relevantes no grupo sem \nendometriose. \nToda esta caracterização pode ser visualizada na Tabela 3. \n \nTabela 3 - Quadro clínico de mulheres com e sem endometriose. \n \nCom EDT \n(n=20)  \nSem EDT \n(n=19) \n \nSintomas P \n  \nDismenorreia Severa (EVA > 7)* 11 (55%) 1 (5,2%) 0,001 \nDor Pélvica Crônica 9 (45%) 0 (0%) 0,001 \nDispareunia de Profundidade 10 (50%) 0 (0%) <0,001 \nSintomas Urinários Cíclicos 2 (10%) 0 (0%) 0,487 \nSintomas Intestinais Cíclicos 8 (40%) 0 (0%) 0,003 \nInfertilidade 12 (60%) 0 (0%) <0,001 \n*EVA: Escala Visual Analógica de Dor; Teste qui-quadrado.  \n \n \n4.2 Perfil lipídico \n \nA concentração de LDL -colesterol das mulheres do grupo com \nendometriose foi, em média, mais baixa quando comparado às mulheres sem a \ndoença (119 ± 23 vs.156 ± 35; p = 0,001), como pode ser observado na Tabela \n4. \nNa Tabela 4 , pode -se notar qu e a concentração de apo B100 seguiu o \nmesmo padrão da concentração de LDL -colesterol: mulheres com \nendometriose apresentaram concentração de apo B100 menor que das \n\n35 \nmulheres sem a doença (76 ± 20.9 vs. 91,7 ± 30,8). No entanto, esta diferença \nnão foi estatisticamente significativa (p = 0,085). \nOs demais parâmetros não apresentaram diferenças significativas. \n \nTabela 4 - Determinação de lípides  plasmáticos em mulheres com e sem \nendometriose. \n COM EDT \n(n = 17) \nSEM EDT \n(n = 19) p \nColesterol (mg/dL)    \nTotal 187 ± 27 194 ± 37 0,562 \nHDL 42 ± 9 43 ± 14 0,792 \nLDL 119 ± 23 156 ± 35 0,001 \nTriglicerídeos (mg/dL) 130 ± 40 119 ± 55 0,486 \nApolipoproteínas (mg/dL)    \nAI 128,1 ± 33,3 136,5 ± 19,9 0,373 \nB100 76 ± 20,9 91,7 ± 30,8 0,085 \nDados expressos em média ± desvio padrão. EDT: endometriose. HDL: lipoproteína de alta \ndensidade. LDL: lipoproteína de baixa densidade. Teste t-Student;  \n \n \n4.3 Expressão gênica de LDL -R e LRP -1 por PCR quantitativa em tempo \nreal (qRT-PCR) \n \nNa análise da expressão gênica dos receptores de LDL, determinada por \nqRT-PCR, foi comparado o endométrio tópico (endométrio COM EDT) e foco \nde endometriose (Lesão EDT) de mulheres com endometriose com o \nendométrio tópico de mulheres sem endometriose (SEM EDT). A expressão \ngênica foi calculada considerando-se o valor bruto, baseado no método 2-∆Ct. \nNo Gráfico 1 e na Tabela 5, pode-se observar que a expressão gênica do LDL-\nR na lesão de endometriose aumentou cerca de 50% quando comparada com \no endométrio da paciente com endometriose (p < 0,001). Esse aumento esteve \npresente em 85% das mulheres com endometriose (17 casos de 20). Quando \ncomparada a lesão de endometriose com o endométrio de mulheres sem \nendometriose, não houve diferença na expressão do receptor em questão. \n\n36 \nA expressão gênica do LRP-1 na lesão de endometriose aumentou na \nordem de 5x, quando comparada ao endométrio de mulheres com \nendometriose (p < 0,001) e, na ordem de 2x, quando comparada ao endométrio \nde mulheres sem a doença (p = 0,004), como pode ser observado no Gráfico 2 \ne Tabela 5. Esse aumento esteve presente em 95% das mulheres com \nendometriose (19 casos de 20). Quando comparada a lesão de endometriose \ncom o endométrio de mulheres sem endometriose, 90% das pacientes \napresentaram aumento na expressão gênica do LRP-1 (18 casos de 20). \n \nGráfico 1 – Expressão gênica de LDL-R. - Gráfico de barras mostrando o valor \nmédio (erro padrão) dos níveis de RNAm para LDL -R em amostras de \nendométrio de mulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres com \nendometriose, sendo que uma amostra é proveniente do endométr io \n(endométrio COM EDT) e, a outra, da lesão de endometriose (Lesão EDT) da \nmesma paciente. O gráfico está representado em escala logarítmica na base \n10. \n \n \n \n \n\n\n37 \nGráfico 2 – Expressão gênica de LRP -1 - Gráfico de barras mostrando o valor \nmédio (erro padrão) dos níveis de RNAm para LRP -1 em amostras de \nendométrio de mulheres sem endometriose (SEM EDT) e de mulheres com \nendometriose, sendo que uma amostra é proveniente do endométrio \n(endométrio COM EDT) e, a outra, da lesão de endometr iose (Lesão EDT) da \nmesma paciente. O gráfico está representado em escala logarítmica na base \n10. \n \n \n\n\n38 \nTabela 5 -Comparações múltiplas sob os níveis de RNAm para os receptores \nLDL-R e LRP-1 entre grupos com e sem endometriose , e locais de avaliação \n(endométrio e lesão de endometriose), \nRNAm Comparação Diferença \nmédia \nErro \npadrão p \nLDL-R  \nCom EDT/Endométrio - Sem EDT/Endométrio -0,0064 0,0032 0,130 \nCom EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,0155 0,0039 <0,001 \nSem EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,0092 0,0046 0,143 \nLRP-1  \nCom EDT/Endométrio - Sem EDT/Endométrio -0,0418 0,0277 0,392 \nCom EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,2208 0,0498 <0,001 \nSem EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT -0,1790 0,0555 0,004 \nComparações múltiplas de Bonferroni (gl = 1). EDT: endometriose. \n \n \n4.4 Determinação proteica de LDL-R e LRP-1 por imunoistoquímica \n \nA determinação proteica de LDL -R e LRP -1 foi realizada por meio  da \ntécnica de imunoistoquímica. A análise dos resultados foi realizada de ma neira \nqualitativa de acordo com a intensidade de marcação avaliada por dois \nobservadores independentes.  A intensidade de marcação variou de 1 a 4, \nsendo: 1 = fraca; 2 = média; 3 = forte; e 4 = muito forte. \nÉ possível visualizar essa variação de intensidade  nas marcações das \nreações de imunoistoquímica para os receptores analisados, LDL -R e LRP -1, \nna Figura 4.  \n \n\n39 \n \nFigura 5 - Fotomicrografias representativas de imunoistoquímica para LDL-R e \npara LRP -1. A e D: endométrio de pacientes s em endometriose; B e E: \nendométrio de pacientes com endometriose; C e F: Lesão  de endometriose . \nAumento de 100X. \n \nComo mostrado na Figura 5, pode -se observar que houve maior \nintensidade de marcação no  endométrio, principalmente de mulheres sem \nendometriose, tanto para LDL-R quanto para LRP-1. \nA Tabela 6 mostra este mesmo resultado de forma numérica por meio da \nleitura qualitativa ( score variando de 1 a 4) para cada receptor analisado em \nA\nB\nD\nC\nE\nF\nLDL-R LRP-1\n\n40 \nambos os grupos estudados, com e sem endometriose , e locais de avaliaçã o \n(endométrio e lesão de endometriose). Por esta análise, pôde -se observar que \nhouve diferença entre os grupos, demonstrando maior intensidade de \nmarcação para LDL -R (p = 0,026) em endométrio de mulheres sem \nendometriose comparado ao endométrio de mulheres  com a doença e à lesão \nde endometriose. No entanto, a intensidade de marcação para LRP -1 não \napresentou diferença entre os grupos com e sem endometriose , e locais de \navaliação (endométrio e lesão de endometriose) (p = 0,073). \n \nTabela 6 - Análise qualitativa da intensidade de marcação dos receptores LDL-\nR e LRP-1 por imunoistoquímica nos grupos com e sem endometriose, e locais \nde avaliação (endométrio e lesão de endometriose). \n Grupo/Local  \nimunoistoquímica Sem EDT/ \nEndométrio \nCom EDT/ \nEndométrio \nCom EDT/ Lesão \nEDT p* \n n (%) n (%) n (%)  \nLDL-R    0.026 \n2 0 (0) 2 (10) 10 (50)  \n3 4 (21,1) 9 (45) 8 (40)  \n4 15 (78,9) 9 (45) 2 (10)  \nLRP-1    0.073 \n1 0 (0) 1 (5) 4 (20)  \n2 0 (0) 1 (5) 5 (25)  \n3 10 (52,6) 12 (60) 11 (55)  \n4 9 (47,4) 6 (30) 0 (0)  \nTotal 19 (100) 20 (100) 20 (100)  \nAnálise qualitativa, sendo: 1 = fraco; 2 = médio; 3 = forte; 4 = muito forte. * Resultados \najustados pelo IMC e pela fase do ciclo menstrual. EDT: endometriose \n \nComo foi observada diferença na inte nsidade de marcação para LDL -R, \nfoi realizada uma análise de comparações múltiplas para este receptor \ncomparando-se grupos (com e sem endometriose) e locais de avaliação \n(endométrio e lesão de endometriose), conforme demonstrad o na Tabela 7. É \npossível obs ervar uma tendência de a intensidade de marcação para LDL -R \nser maior no endométrio do que na lesão das mulheres com endometriose. \nPorém, não houve diferença estatística (p = 0,053). \n\n41 \nTabela 7 - Comparações múltiplas sob o score de intensidade de marcação \npara LDL-R entre grupos com e sem endometriose , e locais de avaliação \n(endométrio e lesão de endometriose). \nComparação  Diferença \nmédia \nErro \npadrão p \nCom EDT/Endométrio - Sem EDT/Endométrio -0.30 0.66 >0,999 \nCom EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT 0.75 0.32 0.053 \nSem EDT/Endométrio - Com EDT/Lesão EDT 1.05 0.63 0.290 \nComparações múltiplas de Bonferroni (gl = 1). EDT: endometriose. \n \n \n4.5 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corp órea \n(IMC), idade e fases do ciclo menstrual \n \nDe acordo com análise comparativa realizada no presente estudo (Tabela \n8), foi observado que o IMC apresentou correlação direta com a expressão \ngênica de LRP-1 (níveis de RNAm) na lesão de endometriose (r = 0,501 e p = \n0,024) e com a intensidade d e marcação para LDL -R (proteína) no endométrio \nde mulheres sem endometriose (r = 0,460 e p = 0,048). \n \nTabela 8 – Análise de correlação entre idade e IMC com o score de \nintensidade de marcação e níveis de expressão de RNAm de LDL -R e de LRP-\n1 nos grupos com e sem endometriose , e locais de avaliação (endométrio e \nlesão de endometriose). \nCorrelação \nSem EDT/Endométrio Com EDT/Endométrio Com EDT/Lesão EDT \nIdade \n(anos) \nIMC \n(Kg/m2) \nIdade \n(anos) \nIMC \n(Kg/m2) \nIdade \n(anos) \nIMC \n(Kg/m2) \nproteína        \nLDL-R r 0.000 0.460 0.030 0.116 -0.062 0.275 \n p >0,999 0.048 0.900 0.628 0.795 0.241 \nLRP-1 r -0.303 0.087 -0.357 -0.123 -0.258 -0.326 \n p 0.207 0.724 0.122 0.604 0.273 0.160 \nRNAm        \nLDL-R r -0.003 0.204 -0.070 -0.076 0.039 0.372 \n p 0.991 0.401 0.769 0.750 0.870 0.107 \nLRP-1 r 0.098 0.107 -0.136 -0.284 0.078 0.501 \n p 0.690 0.663 0.566 0.224 0.743 0.024 \nCorrelação de Spearman. EDT: endometriose. IMC: índice de massa corpórea.  \n\n42 \nCom relação à divisão da fase do ciclo menstrual, proliferativa ou \nsecretora, foi encontrado que os níveis de expressão de RNAm de LDL -R no \nendométrio de mulheres com endometriose foram maiores na fase secretora (p \n= 0,001), assim como os níveis de expressão de RNAm do LRP -1 no \nendométrio de mulheres sem endometrios e (p = 0,008) também foram maiores \nna fase secretora, conforme pode ser visto na Tabela 9. \n \nTabela 9 – Expressão gênica de LDL -R e LRP -1 em cada grupo com e sem \nendometriose nas fases do ciclo menstrual. \nGrupo/Local Expressão \ngênica \nFase do Ciclo \nTotal p \nProliferativa Secretora \nCom EDT/   \nEndométrio \nLDL-R 0,007  ±  0,003 0,017 ±  0,01 0,012 ±  0,009 0,001 \nLRP-1 0,108 ±  0,097 0,067 ±  0,03 0,089 ±  0,076 0,710 \nSem EDT/   \nEndométrio \nLDL-R 0,015 ±  0,008 0,024 ±  0,011 0,019 ±  0,01 0,065 \nLRP-1 0,093 ±  0,038 0,162 ±  0,085 0,126 ±  0,072 0,008 \nCom EDT/          \nLesão EDT \nLDL-R 0,025 ±  0,023 0,029 ±  0,02 0,027 ±  0,022 0,261 \nLRP-1 0,291 ±  0,159 0,327 ±  0,264 0,307 ±  0,207 0,941 \nDados expressos em média ± desvio padrão. Teste Mann-Whitney. EDT: endometriose \n \nA Tabela 10 mostra a correlação da fase do ciclo menstrual com a \nintensidade de marcação para LDL-R e LRP-1. Como pode ser observado, não \nhouve diferença na intensidade de marcação para LDL -R e LRP -1 em cada \ngrupo e local de avaliação, independentemente da fase do ciclo menstrual em \nque as mulheres se encontravam (p > 0,05). \n \n\n43 \nTabela 10 – Análise qualitativa da intensidade de marcação para LDL-R e LRP-\n1 em cada grupo com e sem endometriose nas fases do ciclo menstrual. \n  Fase do Ciclo   \nGrupo/Local Imunoistoquímica Proliferativa Secretora Total p \n  n (%) n (%) n (%)  \nSem EDT/   \nEndométrio LDL-R    0.497 \n 3 3 (30) 1 (11,1) 4 (21,1)  \n 4 7 (70) 8 (88,9) 15 (78,9)  \n LRP-1    0.182 \n 3 7 (70) 3 (33,3) 10 (52,6)  \n 4 3 (30) 6 (66,7) 9 (47,4)  \n Total 10 (100) 9 (100) 19 (100)  \nCom EDT/   \nEndométrio LDL-R    0.941 \n 2 1 (9,1) 1 (11,1) 2 (10)  \n 3 5 (45,5) 4 (44,4) 9 (45)  \n 4 5 (45,5) 4 (44,4) 9 (45)  \n LRP-1    0.456 \n 1 0 (0) 1 (11,1) 1 (5)  \n 2 1 (9,1) 0 (0) 1 (5)  \n 3 8 (72,7) 4 (44,4) 12 (60)  \n 4 2 (18,2) 4 (44,4) 6 (30)  \n Total 11 (100) 9 (100) 20 (100)  \nCom EDT/       \nLesão de \nendometriose \nLDL-R    0.766 \n 2 5 (45,5) 5 (55,6) 10 (50)  \n 3 5 (45,5) 3 (33,3) 8 (40)  \n 4 1 (9,1) 1 (11,1) 2 (10)  \n LRP-1    >0,999 \n 1 2 (18,2) 2 (22,2) 4 (20)  \n 2 3 (27,3) 2 (22,2) 5 (25)  \n 3 6 (54,5) 5 (55,6) 11 (55)  \n Total 11 (100) 9 (100) 20 (100)  \nAnálise qualitativa, sendo: 1 = fraco; 2 = médio; 3 = forte; 4 = muito forte. EDT: endometriose.  \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5 DISCUSSÃO \n\n47 \n5 DISCUSSÃO \n \n \nEsse estudo representa a primeira fase de uma linha de pesquisa \npromissora para o tratamento da endometriose profunda e, de acordo com os \nresultados obtidos, poderá contribuir para a compreensão da progressão de \nlesões profundas; esta s consideradas temidas por sua capacidade \nproliferativa, podendo tomar proporções tumorais expressivas. \nTrata-se da investigação acerca da expressão de receptores de LDL em \nmembrana celular de endometriose  profunda, neste caso , realizado \nexclusivamente em lesões intestinais, com a finalidade de aventar a utilização \nde nanopartículas lipídicas para direcionamento de fármacos ao interior da \nlesão. \nO desenvolvimento de nanopartículas com aplicações em Drug Delivery \nSystems (DDS) tem grande destaque nas pesquisas médicas da atualidade \n(Davis et al.; Zhang et al., 2008). Partículas estáveis, nã o tóxicas e capazes \nde transportar os fármacos até seu local de ação, aumentando a seletiv idade \ne especificidade do trata mento, tem grande importância na otimização de \nterapias quimioterápicas (Contente et al., 2014). \nOs estudos que evidenciaram o papel do colesterol na oncogênese \nforam de extrema importância clínica, por demonstrarem que células tumorais \napresentam maior ca ptação de LDL quando comparados às células normais. \n(Nomura et al., 1991; Swanson et al., 1994; Pandolfino et al., 1997; Tomiki et \nal., 2004).  \nConsiderando a influência direta da dieta rica em gordura saturada sobre \nos níveis de colesterol séricos ( Vartiainen et al.,  2016), avaliamos as \ncaracterísticas físicas das pacientes em nosso estudo e os resultados \ndemonstraram média de idade semelhantes nos dois grupos, sem \nendometriose e com endometriose (33,6±5,7 vs 35±6,3, p=0,288), \nrespectivamente.  \n\n48 \nObservamos que o grupo de mulheres sem endometriose, formado por \nmultíparas com desejo de submeterem -se à laqueadura tubária \nlaparoscópica, apresentaram valores maiores de peso (73,7±8,4 vs 62,6±10,5, \np=0,001), de altura (1,65±0,06 vs 1,61±0,07, p=0,046) e também de  índice de \nmassa corpórea (26,9±2,9 vs 24,1±3,2, p=0,006) comparado ao grupo de \nmulheres com endometriose. \nAnalisando os sintomas clínicos entre os dois grupos , observamos que \nhouve alta prevalência de pacientes com infertilidade (60%) , o que pode \nrepresentar justificativa para a diferença observada em relação ao peso e \nIMC, uma vez que, segundo Paulino et al. (Paulino et al., 2016), multíparas \nsão duas vezes mais propensas à obesidade comparado a nulíparas no início \nde uma gestação. O estudo observacional controlado, realizado com 130 \nprimigestas e 160 multíparas, evidenciou que 54,62% das primigestas \niniciaram o pré-natal com índice de massa corpórea de normalidade enquanto \nque, no grupo das multíparas, os índices compatíveis com obesidade foram \nregistrados em 62,51% das mulheres (Paulino et al., 2016). \nOutra observação válida, ainda com relação à diferença do IMC entre os \ndois grupos, é qu e ambos estão distantes da classificação de obesidade que \nestipula valores de IMC entre 30 a 39,9 kg/m2 (Flegal et al., 2013). \nDesta feita, chamou -nos fortemente a atenção os resultados obtidos na \navaliação do perfil lipídico, em que  observamos que, de forma análoga aos \nresultados observados em alguns tumores,  o grupo de pacientes com \nendometriose apresentou níveis inferio res estatisticamente significativos de \nLDL-c com relação ao grupo controle  (119±23 vs 156±35mg/dL, p=0,001). \nEste resultado, pesquisado pela primeira vez em pacientes com endometriose \nprofunda intestinal, sugere aumento do consumo de colesterol em mulheres  \ncom esta forma da doença.  \nDiante deste resultado, considerando as evidências da literatura, que \ndemonstra a associação de hipocolesterolemia em pacientes com câncer em \ndiversos órgãos distintos, inclusive o intestino grosso (Nomura et al.,  1991; \nTomiki et al., 2004) e, ainda, determina o estado de hipocolesterolemia como \nmarcador de atividade proliferativa em leucemia aguda (Pandolfino et al.,  \n\n49 \n1997), consideramos haver a possibilidade deste tipo de associação em \npacientes com endometriose profunda.  \nAnalisando o quadro clínico do grupo de mulheres com endometriose, \nobservamos tratarem -se de pacientes muito sintomáticas, das quais 55% \napresentavam a queixa de dismenorreia severa, ou seja, com score da escala \nvisual analógica de dor > 7, 45% evoluíam com dor  pélvica crônica, 50% com \ndispareunia de profundidade e 40% relatavam dor às evacuações no período \nmenstrual. Deste modo, podemos inferir que nosso grupo foi constituído por \npacientes com a doença em franca atividade inflamatória, considerando as \ncaracterísticas e a intensidade da sintomatologia. \nNão foram observadas diferenças entre os grupos, sem endometriose e \ncom endometriose, nas concentrações de colesterol total (194±37 vs \n187±27mg/dL; p=0,562), HDL -c (43±14 vs 42±9mg/dL; p=0,792), e \ntriglicérides (11 9±55 vs 130±40mg/dL; p=0,486). Em relação às \napolipoproteínas, também não houve diferença na concentração de apo A1 \n(136,5±19,9 vs 128,1±33,3 mg/dL) ou na concentração de Apo B100 \n(91,7±30,8 vs 76±20,9 mg/dL; p=0,085) entre os grupos. \nEm estudo realizado p or Melo et al. (Melo et al.,  2010), foi observada \ndiferença significativa nos níveis de LDL -c no grupo de mulheres com \nendometriose quando comparado com o grupo de mulheres denominadas \nsem endometriose, demonstrando perfil lipídico desfavorável, com aument o \nde 38% nos níveis de LDL -c em pacientes com a doença. Porém, nesta \npesquisa, as pacientes consideradas sem endometriose não tinham \nconfirmação da inexistência da doença, apenas o fato de não apresentarem \ninfertilidade ou dor pélvica. Há descrição na lite ratura de até 22% de achados \nincidentais de endometriose em pacientes assintomáticas submetidas à \nlaqueadura tubária (Cramer; Murphy, 2002) \nAlém disso, não foi discriminado qual tipo de endometriose compunha o \ngrupo de mulheres com a doença; se a forma sup erficial, ovariana ou \nprofunda. Em nosso estudo, o objetivo foi avaliar exclusivamente a doença \nprofunda em sua forma nodular, devido a sua semelhança com lesões \nexpansivas tumorais, independente da presença de aderências ou outros \nachados como o endometrioma ovariano. \n\n50 \nCom relação ao grupo controle de nosso estudo, todas as mulheres que \napresentaram achados incidentais de endometriose peritoneal, superficial ou \nprofunda, no momento da laqueadura, total de quatro pacientes, foram \nexcluídas do estudo. \nApesar da atividade física e da perda de peso em indivíduos obesos ter \nsido associada com redução da pressão arterial, dos níveis séricos de \ntriglicérides e LDL -c e aumento dos níveis séricos de HDL -c (Ades et al. , \n2014), em recente estudo publicado por Franklin et al. (Franklin et al., 2014), \nos autores afirmam a influência positiva da atividade física, superior à dieta de \nrestrição, para redução de níveis de quilom ícrons e VLDL -c, porém não \nobserva benefícios da atividade física para redução dos níveis de LDL -c. \nEmbora em nosso estudo não terem sido investigados  quais pacientes \npraticavam atividade física, e, diante de todas as evidências apresentadas, \nconsideramos de grande relevância o fato das pacientes com endometriose \nprofunda terem apresentado níveis inferiores de LDL-c comparados ao grupo-\ncontrole. \nSugerimos que novos estudos, com metodologia semelhante com \nrelação ao critério de seleção de pacientes e número maior de indivíduos , \nsejam realizados para observação desta associação. \n \n \n5.1 Expressão de RNAm dos receptores de LDL (LDL-R e LRP-1) \n \nO objetivo principal desse estudo foi avaliar a expressão gênica e a \ndeterminação proteica dos receptores de LDL (LDL -R e LRP-1), com o intuito \nde compreender o comportamento celular da lesão profunda de endometriose \ncom relação ao consumo de colesterol, ou seja, se haveria ou não uma avidez \npor parte do nódulo deste metabólito. \nDe acordo com os resultados obtidos , observamos que o nível médio de \nexpressão do RNAm do LDL -R foi maior na lesão de endometriose que no \nendométrio de mulheres com EDT (p < 0,001), já o nível médio de expressão \ndo RNAm do LRP -1 foi maior na lesão de endometriose de mulheres com \n\n51 \nEDT que no endométrio de mulheres com e sem EDT (p < 0,001 e p = 0,004 , \nrespectivamente). \nConforme demonstraram Goldstein e Brown (Goldstein & Brown, 2009), \nse uma célula exigir colesterol haverá aumento da expressão de receptores \nde LDL em sua membrana enquanto, se o conteúdo de colesterol de uma \ncélula estiver elevado, haverá uma diminuição do número de receptores \nsintetizados. Deste modo, admite -se que há um mecanismo regulatório de \nreceptores de LDL na superfície da célula (Goldstein & Brown, 2009).  \nO colesterol é um componente essencial de membrana plasmática de \ncélulas e também o precursor para a fabricação de todos os  hormônios \nesteroides e ácidos biliares, além de desempenhar papel crucial na formação \nda bainha de mielina que rodeia axônios (Goldstein & Brown, 2009). \nDentro da célula, o colesterol derivado de LDL estabelece várias funções \nreguladoras, incluindo a inib ição da síntese do colesterol por mecanismo de \nfeedback. Além disso, os estudos do receptor de LDL deram origem ao \nconceito de endocitose mediada pelo receptor (Goldstein & Brown, 2009). \nNo contexto tumor, a expressão de LRP-1 deve responder positivamente \nà hip óxia ( Montel et al.,  2007), porém os mecanismos regulatórios \nmoleculares basais não foram bem caracterizados e compreendidos até agora \n(Emonard et al., 2014). \nEm tecidos normais, o LRP -1 é expresso por hepatócitos, macrófagos, \nfibroblastos, neurônios e células do músculo liso vascular , e há evidências \nque desempenha um papel importante na progressão do câncer ( Moestrup et \nal., 1992).  \nDiversos estudos demonstraram que o LRP -1 foi superexpresso em \nvários tipos de câncer, como o de mama ( Catasus et al.,  2011a; Li et al.,  \n1998), de endométrio ( Catasus et al., 2011b), de próstata ( McGarvey et al.,  \n1996) e glioblastoma (Lopes et al., 1994; Yamamoto et al., 1997; Gopal et al., \n2011). Além disso, Baum et al. relataram que a amplificação do gene de LRP -\n1 foi observada em alguns astrocitomas (Baum et al., 1998).   \nCatasús et al.  demonstraram também que a expressão de LRP -1 se \nassocia aos carcinomas da mama triplo -negativo e HER-2/neu, mas não com \no carcinoma dependente de hormônios, e que este receptor aumenta de  \n\n52 \nexpressão de acordo com o grau de proliferação e invasão ( Catasus et al., \n2011a).  \nObservou-se, portanto, que a expressão de LRP -1 em células tumorais \nparece altamente dependente do tecido, o subtipo do câncer e o grau \n(Emonard et al., 2014). \nDe modo contraditório, outros estudos mostraram que a baixa expressão \nde LRP-1 pode estar associada a um fenótipo mais agressivo de vários tipos \nde tumor e que o nível diminuiu significativamente nos tipos invasivos em \ncomparação com não invasivos em células de melano ma e próstata ( Kancha \net al., 1994; de Vries et al., 1996). Verificou-se, também, que um baixo nível \nde expressão LRP -1 foi associado com a agressividade e invasividade no \ncarcinoma hepatocelular ( Huang et al.,  2012), com evolução clínica \ndesfavorável numa coorte de 439 pacientes com adenocarcinomas do pulmão \n(Meng et al., 2011) e alta atividade de metástase em carcinoma folicular de \ntireoide (Sid et al., 2006). \nConsideramos, portanto, que a superexpressão de receptores de LDL \nem focos de endometriose profu nda pode ter importante significado no que \nconcerne a visão fisiopatológica do desenvolvimento e progressão deste tipo \nde doença. Além do colesterol atuar como substrato para divisão celular e \ncomponente de membrana, atua como precursor de hormônios ester oides, e \nesta função pode representar papel de grande impotância no contexto do \ncrescimento de lesões profundas. \nSabe-se que a  atividade estrogênica desempenha papel etiopatogênico \nfundamental na endometriose contribuindo tanto na explicação de atividade \nde lesões quanto no mecanismo de dor (Brown e Farquar, 2014). \nA proteína ativa reguladora de esteroidogênese (STAR) é responsável \npelo passo inicial da formação de estrogênios, isto é, a entrada de colesterol \nna mitocôndria. Em seguida, cinco proteínas catal isam etapas enzimáticas \npara converter o colesterol em estradiol biologicamente ativo. A etapa \nprincipal, a conversão dos ester oides C19 em estrogênios, é catalisada pela \naromatase, a qual sua inibiçã o elimina de forma eficaz todo processo de \nprodução de estrogênio (Bulun et al., 2005). \n\n53 \nA produção de estrogênio em mulheres com endometriose origina -se de \ntrês possibilidades distintas: o estradiol secretado pelo ovário, a conversão de \nandrostenediona em estrona e , posteriormente, em estradiol, fenômeno \ncatalisado pela aromatase no tecido adiposo e pele, e o colesterol, que é \nconvertido em estradiol localmente no tecido com endometriose porque \nexpressa um conjunto completo de genes esteroidogênicos, incluindo o gene \nda aromatase. A atividade da aromatase perifé rica ou local, ou ambos, pode \nser particularmente importante na persistência da endometriose ( Bulun et al., \n2005). \nExistem claras diferenças moleculares entre o endométrio tópico e o \ntecido encontrado nos focos de endometriose, em que se observa o aumento \nda produção de estrogênio, prostaglandinas e citocinas, os quais determinam \na inflamação presentes na endometriose. No endométrio tópico de mulheres \nsem endometriose , a atividade da enzima ciclo -oxigenase-2 (COX -2) e, \nconsequentemente, a produção de prosta glandinas E 2 (PGE2) são baixas. O \nestrogênio não é produzido localmente, devido à ausência da enzima \naromatase. No endométrio de mulheres com endometriose , observa-se \naumento da atividade de COX-2 e atividade detectável de aromatase, levando \nà maior formaç ão de PGE 2, tanto no endométrio tópico quanto no foco de \nendometriose, causando cólicas menstruais severas e dor pélvica crônica \n(Bulun, 2009). \nEm estudo que avaliou a expressão de SR -B1 ( Scavenger Receptor \nClass B1), que regula a entrada nas células de li poproteínas de alta \ndensidade (HDL -c), atuando como precursor de síntese de estrogênios, foi \nobservado aumento da exp ressão tanto do gene quanto da proteína no \nendométrio e, mais intensamente, no tecido com endometriose. Deste modo , \no autor propõe o uso de  inibidores de SR -B1 associado a inibidores de \naromatase como alternativa de tratamento clínico da endometriose \n(Ramachandran et al., 2001). \nAssim, entendemos que a superexpressão de receptores de LDL no foco \nde endometriose, com resultado significativamen te superior ao encontrado no \nendométrio, tanto de mulheres com a doença quanto nas mulheres sem \nendometriose, representa importante achado no que concerne à \n\n54 \ninternalização do colesterol , permitindo o desencadeamento da produção \nautóctone do estrogênio e , consequentemente, influenciando no mecanismo \nde progressão e inflamação. \nDo ponto de vista terapêutico , estes resultados são animadores no \ndirecionamento a novas possibilidades como o uso das estatinas, inibidoras \nda 3 hidroxi 3 metilglutaril Coenzima A Red utase (HMG CoA), que visam \nreduzir os níveis séricos de colesterol. Estudos in vitro e in vivo iniciados em \n2007 v êm demonstrando os benefícios das estatinas para o tratamento \nmedicamentoso da endometriose por meio de sua ação antiproliferativa, anti -\ninflamatória, antioxidante, antiangiogênica e inibidora de matriz \nmetaloproteinase (Gibran et al., 2014). \nOutra possibilidade promissora é o uso de nanoemulsão lipídica que \npermite o acoplamento de drogas antiproliferativas em seu interior e vem \nsendo utilizado no tratamento de diversos tipos de neoplasias (Valduga, 2003; \nAzevedo, 2005; Mendes; Pires, 2009).  \nA nanoemulsão denominada LDE é rica em colesterol e absorvida pelos \nreceptores de LDL ( Maranhão et al., 1992; Maranhão et al., 1993; Maranhão \net al.,  1994). É fabricada sem proteína , mas, em contato com o plasma, \nadquire apo E, que também é reconhecida pelos receptores de LDL \npermitindo a endocitose da nanoemulsão. Assim , pode ser utilizada para \ndirecionar as drogas ant ineoplásicas contra células cancerosas que \nsuperexpressam o receptor de LDL (Ades et al., 2001). \nFoi demonstrado que, após a injeção intravenosa em pacientes, a \nnanoemulsão (LDE) pode se concentrar em células de leucemia e em \ntumores sólidos, tais como carcinomas dos ovários e de mama que \nsuperexpressam esses receptores ( Maranhão et al., 1994; Ades et al., 2001; \nGraziani et al., 2002).  \nRecentemente, a associação de fármacos antineoplásicos com LDE, tais \ncomo carmustina e compostos derivatizados de etoposide e do paclitaxel, \nforam testados (Maranhão et al., 2002; Valduga et al., 2003; Rodrigues et al., \n2005). A derivatização com ácido oleico foi utilizada como uma estratégia \npara melhorar o rendimento da associação e a estabilidade do fármaco, \n\n55 \nquando associado a LDE (Maranhão et al.,  2002; Valduga et al.,  2003; \nRodrigues et al., 2005).  \nA associação com as drogas não altera as propriedades biológicas da \nnanoemulsão, tal como a capacidade de ligação a receptores de LDL. \nComplexos estáveis LDE -drogas com atividade citotóxica preservada das \ndrogas associadas foram obtidos e foi demonstrado, em estudos in vitro e in \nvivo, que os efeitos secundários dos fármacos antineoplásicos foram \nnotavelmente reduzidos (Maranhão et al.,  2002; Valduga et al.,  2003; \nRodrigues et al.,  2005). A associação LDE -paclitaxel comprovou ser muito \nmenos tóxica e demonstrou capacidade de concentrar a droga nos locais \ntumorais (Dias et al., 2007).  \nDeste modo, inferimos a hipótese de aplicação desta tecnologia e classe \nde fármacos no tratamento da endometriose profunda em sua form a mais \nagressiva, e, para isso, iniciamos a viabilização desta possibilidade por meio \nde pesquisa da presença de “porta de entrada” das nanoemulsões, que são \nos receptores de LDL. \n \n \n5.2 Determinação proteica por imunoistoquímica dos receptores  de \nLDL (LDL-R e LRP-1) \n \nOs resultados observados por meio  da análise qualitativa do score de \nintensidade de determinação proteica dos receptores LDL -R e LRP -1 foram \ndiferentes da expressão gênica , pois demonstraram  que não foi possível \nidentificar entre quais grupos (com e sem endometriose) e locais de avaliação \n(endométrio e lesão de endometriose) ocorreram diferenças no score de \nintensidade de marcação para LDL -R (p > 0,05), mas sugere que a \nintensidade de marcação para LDL -R é maior no endométrio do que na lesão \ndas mulheres com EDT (p = 0,053). \nEmbora as proteínas sejam moléculas funcionais para os processos \nfisiológicos mais relevantes, estudos que comparam o RNA mensageiro \n(RNAm) com a abordagem proteômic a podem apresentar diferentes \nresultados, pois as variações na quantidade de proteína nem sempre se \n\n56 \ncorrelacionam com níveis de RNAm e as proteínas podem ser modificadas na \nsua estrutura em função de alterações pós -tradução, incluindo a maturação \nproteolítica, fosforilação, glicosilação, as quais só podem ser detec tadas por \nmeio do estudo das proteínas diretamente (Evans et al., 2014). \nEm tecidos reprodutivos, LRP -1 é conhecido por ser expresso na \nplacenta (Zheng et al.,1994; Fischer et al.,2001), nos ovários (Moestrup et al., \n1992; Zheng et al. ,1994) e no endométri o (Moestrup et al. ,1992; Zheng et \nal.,1994; Sayegh et al.,1995; Foca et al., 2000).  \nNo estudo de Sayegh et al. , houve acentuada coloração por \nimunoistoquímica de LRP -1 em estroma endometrial tanto na fase \nproliferativa quanto na fase secretora (Sayegh et al., 1995), enquanto epitélio \ne glândulas endometriais resultaram uniformemente negativos (Moestrup et \nal., 1992, Sayegh et al. , 1995). Entretanto, Foca et al.  observaram que a \nexpressão de RNAm de LRP -1 no endométrio humano foi significativamente \nmaior na fase secretora quando comparada com a fase proliferativa do ciclo \nmenstrual (Foca et al., 2000).  \nEm nosso estudo, dividimos , também, as pacientes em fase proliferativa \ne secretora, e essa divisão , apesar de aleatória, deu-se de forma homogênea \ncom 52,6% das pacientes do grupo sem endometriose na fase proliferativa e \n47,4% na fase secretora. No grupo com endometriose , havia 55% de \npacientes na fase proliferativa e 45% na fase secretora. As pacientes foram \nclassificadas por meio  do dateamento determinado pe la data da última \nmenstruação informada no dia do procedimento cirúrgico, o qual definimos \ncomo fase proliferativa do primeiro ao décimo quarto dia e como fase \nsecretora, do décimo quarto ao vigésimo oitavo. \nDe acordo com Ecochard e Gougeon, o ciclo menstr ual “normal” \n(intervalo entre o primeiro dia da menstruação para início da próxima \nmenstruação) em mulheres jovens e saudáveis com fertilidade comprovada é \nde 28 dias, e os estudos de ultra ssom e hormonais mostram que mulheres \ncom idade entre 19 -42 anos tê m fases foliculares de 14,6 dias de duração e \nfases lútea de 13,6 dias de duração (Ecochard & Gougeon 2000). \nObservamos, em nosso estudo , que, na análise de determinação \nproteica por imunoistoquímica dos receptores de LDL, não houve diferença na \n\n57 \nintensidade de marcação influenciada pela fase do ciclo menstrual, porém , na \nanálise por expressão de RNAm dos mesmos receptores, foi evidenciado  que \nos níveis de RNAm de LDL -R no endométrio de mulheres com endometriose \nforam maiores na fase secretora (p = 0,001), a ssim como os níveis de RNAm \ndo LRP -1 também foram maiores na fase secretora no endométrio de \nmulheres sem endometriose (p=0,008). Esses achados foram compatíveis \ncom os resultados do estudo de Foca et al. (Foca et al., 2000).  \nA ação do LRP -1 tem sido ampl amente estudada no mecanismo de \nremodelação endometrial durante todo o ciclo menstrual como responsável \npelo clearance de MMPs (matriz metaloproteinases) por meio  de sua \ncapacidade de ligação e endocitose, promovendo internalização e dissociação \nem ambiente ácido (Emonard et al., 2004).  \nApós a entrega do conteúdo de LRP-1 nos lisossomas para degradação, \no receptor é reciclado para a superfície celular para novo ciclo de endocitose. \nTal mecanismo de depuração é particularmente efetivo para eliminar as \nproteinases (Casslen et al., 1998). Isto diminui consideravelmente a atividade \nfibrinolítica no endométrio durante a fase secretora do ciclo (Lillis et al., 2008). \nDesta forma, a MMP -2 e MMP -9 são eficientemente eliminadas do \nestroma do endométrio durante as fa ses proliferativa e secretora. Esse \ncontrole é importante para estas gelatinases, em especial, a forma ativa de \nMMP-2, que estão presentes no endométrio durante o ciclo, isto é, durante \nperíodos quando a degradação excessiva do estroma não deve ocorrer \n(Selvais et al., 2009). \n \n \n5.3 Correlação de receptores de LDL com o índice de massa corpórea \n(IMC) \n \nDe acordo com os resultados do nosso estudo , foi observado que o IMC \napresentou correlação positiva com o score de intensidade de marcação para \nLDL-R no endomé trio de mulheres sem endometriose (p = 0,048) e, com os \nníveis de RNAm do LRP -1 na lesão de endometriose (p = 0,024), o que \nsugere que ind ivíduos com relação desfavorável de peso e altura podem \n\n58 \nexpressar mais intensamente esta família de receptores tanto n o endométrio \nde pacientes sem a doença quanto na lesão de endometriose, isto posto pela \ndeterminação proteica e expressão gênica, respectivamente.  \nNão há na literatura qualquer estudo que tenha avaliado a associação do \níndice de massa corpórea com a expre ssão desta família de receptores em \nendométrio ou lesões de endometriose e , assim, abre-se oportunidade para \nnova linha de pesquisa. \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6 CONCLUSÕES \n\n61 \n6 CONCLUSÕES \n \n \nDe acordo com os resultados de nossa pesquisa, concluímos que: \n \na) Houve maior expressão Gênica de receptores de LDL (LDL -R e \nLRP-1) em membrana celular de focos de endometriose profunda \nintestinal. Este achado não teve similaridade com a determinação \nproteica; \nb) Não houve diferença na comparação da exp ressão Gênica, assim \ncomo na determinação proteica, dos receptores de LDL (LDL -R e \nLRP-1) no endométrio de mulheres com e sem endometriose; \nc)  Houve redução dos níveis séricos de LDL colesterol em pacientes \ncom endometriose profunda em comparação com mulhere s sem a \ndoença.  \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7 ANEXOS \n\n65 \n7 ANEXOS \n \n \n7.1  Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo com \nEndometriose). \n \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP \n \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \nGRUPO COM ENDOMETRIOSE \n \nDADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL \nLEGAL \n1. NOME: .:........................................... ............................................................................. \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ............................................ SEXO :    M □   F  □ \nDATA NASCIMENTO: ......../......../......  \nENDEREÇO ......................................................................... Nº ........... APTO:.............. \nBAIRRO:  ...................................................CIDADE  ..................................................... \nCEP:.......................TELEFONE (DDD): (........)................................................................ \n2.RESPONSÁVEL LEGAL ................................................................................................ \nNATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.)  \n.......................................................................................................................................... \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE :................................................... SEXO:    M □   F □ \nDATA NASCIMENTO.: ......./......../....... \nENDEREÇO: ..........................................................................Nº.............APTO:............. \nBAIRRO: ................................................... CIDADE:....................................................... \nCEP:.........................TELEFONE(DDD): (.......)................................................................ \n\n66 \n \nDADOS SOBRE A PESQUISA \n \n1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA \na. A expressão de receptores de LDL em membrana celular de focos \nde endometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão \nlipídica carreadora de droga anti proliferativa. \n \n2. PESQUISADOR: Dr. Luciano Gibran \nCARGO/FUNÇÃO: Pós-Graduando do Departamento da Gineco logia da \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.  \nINSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº: 76.149 \nUNIDADE DO HCFMUSP: Disciplina de Ginecologia HCFMUSP \n \n3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: \ni. RISCO MÍNIMO X  RISCO MÉDIO □ \nii. RISCO BAIXO □  RISCO MAIOR □ \n \n4. DURAÇÃO DA PESQUISA : 24 MESES \n \n5. SOBRE A PESQUISA: \n \n5.1 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA \nA endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da \nparte interna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do \nabdômen, tais como:  ovário, intestino, bexiga e peritônio. Esta doença pode \ncausar dores intensas no abdome, principalmente cólicas no período menstrual, \ncomprometendo seriamente a qualidade de vida das mulheres. \n\n67 \nA Senhora está sendo convidada a participar do estudo que vai avaliar a presença \nde receptores de LDL (células do sangue responsáveis pelo transporte de \ncolesterol = gordura) em pessoas que tem endometriose. \nAlgumas doenças podem causar aumento dos níveis de colesterol nos tecidos \ncomo “fonte de energia”, consequente mente, os níveis de colesterol do sangue \npodem apresentar-se diminuídos. Esse projeto tem como objetivo verificar se este \nfenômeno ocorre também em pacientes com endometriose.  \nSua participação neste estudo será como paciente controle (sem endometriose), \npois é necessário comparar pacientes com endometriose e pacientes sem \nendometriose. A cirurgia de abdome para as pacientes controle será realizada nas \npacientes que desejam realizar a laqueadura tubária como método \nanticoncepcional. \nPara isso, será feita um a pesquisa em laboratório para investigar no sangue e no \nmaterial de biópsia removido durante a vídeolaparoscopia para laqueadura \ntubária, a qual a senhora será submetida, se o tecido sadio removido recebe \nmenos colesterol comparado ao tecido acometido por endometriose. \n \n5.2 – PROCEDIMENTOS QUE SERÃO UTILIZADOS E PROPÓSITOS: \nA senhora será submetida a uma videolaparoscopia, que é um tipo de cirurgia na \nqual são realizados 3 pequenos cortes na pele e os médicos realizarão a cirurgia \nobservando o interior da barriga em uma televisão. Durante a cirurgia, o seu \nmédico realizará a laqueadura tubária e removerá uma pequena amostra de tecido \nsadio chamado peritônio, que é um tecido de revestimento interno do abdômen, \npróximo a região das tubas uterinas e também uma  pequena amostra de \nendométrio normal, tecido de revestimento que se localiza dentro do útero. Estes \ntecidos serão enviados ao Laboratório de Metabolismos de Lípides do INCOR \npara análise da presença de receptores de LDL (colesterol) para podermos \nrealizar a pesquisa que estamos propondo. \n \n\n68 \n5.3 – RISCOS RELACIONADOS AOS PROCEDIMENTOS: \nOs riscos da obtenção dos tecidos no intra -operatório da videolaparoscopia são \nmínimos e não causam transtornos à sua saúde. \nAntes da cirurgia, será retirada uma amostra de sa ngue para fazer outros exames \nrelacionados com a gordura no sangue. Os riscos decorrentes desses exames são \nmínimos, relacionados à picada na veia que pode deixar uma m ancha roxa no \nlocal. Para a realização deste exame e da cirurgia laparoscópica é necessá rio \nestar 12 horas em jejum. \n \n5.4 – DESCONFORTOS E RISCOS ESPERADOS: \nA pesquisa não oferece risco ou desconforto pois a remoção dos fragmentos de \ntecido sadio (peritônio e endométrio) serão representados por uma diminuta \nporção, as quais não oferecem qualquer dano à integridade do paciente.  \n \n5.5 – BENEFÍCIOS QUE PODERÃO SER OBTIDOS: \nCom esta pesquisa, a qual a senhora está participando, tentaremos descobrir se \nos achados encontrados poderão ajudar futuras pacientes em seu tratamento. \nConcordando com o uso deste material, do modo descrito, é necessário \nesclarecer que a senhora não terá quaisquer benefícios ou direitos financeiros \nsobre os eventuais resultados decorrentes da pesquisa.  \nCaso a senhora não concorde em doar o fragmento de tecido para pesquisa, nada \ninfluenciará o seu tratamento. Salientamos que a senhora tem a liberdade de \nretirar o consentimento em qualquer fase da pesquisa sem prejuízos a seu \ncuidado e que terá direito de acesso sobre os eventuais resultados desta pesquisa \ne toda assistência necessária caso assim o desejar.  \nOs pesquisadores estarão à sua disposição para quaisquer esclarecimentos no \nendereço abaixo especificado.Se a senhora tiver alguma consideração ou dúvida \nsobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em P esquisa \n(CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5º andar – tel: 3069-6442 ramais 16, \n17, 18 ou 20,FAX:3069-6442ramal26– e-mail:cappesq@hcnet.usp.br \n\n69 \n5.6 – CUSTOS  \n A senhora não terá custos ao participar do estudo. \n \n5.7 – TRATAMENTO ALTERNATIVO: \nNão existem diferenças nos tratamentos realizados em virtude de sua participação \nou não neste estudo. \n \n6 – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS \nDO SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO: \nSua participação no presente estudo é voluntária. \nA senhora pode optar por não participar ou interromper sua participação no estudo \na qualquer momento sem sanção nem perda de benefícios aos quais pudesse ter \ndireito. Se decidir interromper antes de terminar o estudo, será solicitado a voltar \nao consultório/hospital para uma visita final. \nHavendo interesse subsequente da paciente, os pesquisadores se comprometem \na descartar as amostra colhidas imediatamente após notificação oficial da \npaciente ou de seus representantes legais. \nO pesquisador assegura TOTAL sigilo e privacida de quanto aos dados \narmazenados e obtidos com este estudo. \nO Dr. Luciano Gibran pode retirar a senhora do estudo sem o seu consentimento \npor qualquer uma das seguintes razões: \na) Com base em critérios para melhorar seu atendimento médico;  \nb) Se a senhora deixar de seguir o esquema do estudo;  \nc) Desenvolvimento de efeitos adversos graves. \n \n\n70 \n7 – INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS \nRESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA \nCONTATO EM CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES \nADVERSAS. \nO Dr. Luciano Gibran estará à sua disposição a qualquer momento para discutir as \ndúvidas que a senhora possa ter a respeito deste estudo e sua participação. \nO consultório do Dr. Luciano Gibran fica a Rua Cotoxó, 611 cj. 103 e o número do \ntelefone de seu consultório é (11) 3865-8319, durante o horário comercial.  \nSe o desenho do estudo ou o uso da informação forem alterados ou se surgir \nalguma descoberta significativa durante o estudo que possam afetar seu desejo \nem participar, a senhora será informada e será  obtido novamente o seu \nconsentimento. \nSe tiver quaisquer dúvidas sobre seus direitos como indivíduo de pesquisa ou \nqueixas referentes a este estudo, a senhora deverá telefonar para: \n \n \nDr. Luciano Gibran \nEnd.: Rua Cotoxó no 611, conj. 103, Bairro Pompéia, São Paulo \nTel. 11- 3865-8319 – CEP: 05020-010 \n \n8 – OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES: \n \n__________________________________________________________________\n__________________________________________________________________\n____________________________________ \n \n\n71 \n9 – CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO \nAo assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, reconheço que li e \ncompreendi a informação precedente descrevendo este estudo. Minhas dúvidas \nforam satisfatoriamente esclarecidas e estou assinando este termo de \nconsentimento livre e esclarecido indicando meu desejo de participar. \nCompreendo que receberei uma cópia assinada deste termo. \nAo assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, não abdiquei de \nnenhum de meus direitos legais aos quais eu pudesse fazer  jus como participante \nde um estudo de pesquisa. \nSão Paulo, ............de..........................de.............               \n \n-------------------------------------------------------------- \nAssinatura do paciente/representante legal \n \n \nData         /       /        \n \n----------------------------------------------------------------- \nAssinatura da testemunha                 Data         /       /        \npara casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semianalfabetos ou \nportadores de deficiência auditiva ou visual. \n(Somente para o responsável do projeto) \nDeclaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e \nEsclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste \nestudo. \n \n--------------------------------------------------------------- \nAssinatura do responsável pelo estudo           Data         /       /        \n \n \n\n72 \n7.2  Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Grupo sem \nEndometriose). \n \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP \n \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \nGRUPO SEM ENDOMETRIOSE \n \nDADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL \nLEGAL \n \n1. NOME: ............................................. ......................................................................... \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ......................................... SEXO :    M □   F  □ \nDATA NASCIMENTO: ......../......../......  \nENDEREÇO .................................................................... Nº ........... APTO:.............. \nBAIRRO: ...................................................CIDADE  ................................................... \nCEP:.......................TELEFONE (DDD): (........)........................................................... \n2.RESPONSÁVEL LEGAL ............................................................................................ \nNATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.)  \n..................................................................................................................................... \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE :................................................ SEXO:    M □   F □ \nDATA NASCIMENTO.: ......./......../....... \nENDEREÇO: ......................................................................Nº.............APTO:............. \nBAIRRO: ................................................. CIDADE:..................................................... \nCEP:........................TELEFONE(DDD): (.......)............................................................ \n\n73 \n \nDADOS SOBRE A PESQUISA \n \n1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA \na. A expressão de receptores de LDL em membrana  celular de focos \nde endometriose profunda para viabilização do uso de nanoemulsão \nlipídica carreadora de droga anti proliferativa. \n \n2. PESQUISADOR: Dr. Luciano Gibran \nCARGO/FUNÇÃO: Pós-Graduando do Departamento da Ginecologia da \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.  \nINSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº: 76.149 \nUNIDADE DO HCFMUSP: Disciplina de Ginecologia HCFMUSP \n \n3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: \ni. RISCO MÍNIMOX  RISCO MÉDIO □ \nii. RISCO BAIXO □  RISCO MAIOR □ \n \n4. DURAÇÃO DA PESQUISA : 24 MESES \n \n5. SOBRE A PESQUISA: \n \n5.1 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA \nA endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da \nparte interna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do \nabdômen, tais como: ovário, intestino, bexiga e peritônio.  Esta doença pode \ncausar dores intensas no abdome, principalmente cólicas no período menstrual, \ncomprometendo seriamente a qualidade de vida das mulheres. \n\n74 \nA Senhora está sendo convidada a participar do estudo que vai avaliar a presença \nde receptores de LDL  (células do sangue responsáveis pelo transporte de \ncolesterol = gordura) em pessoas que tem endometriose. \nAlgumas doenças podem causar aumento dos níveis de colesterol nos tecidos \ncomo “fonte de energia”, consequentemente, os níveis de colesterol do sangu e \npodem apresentar-se diminuídos. Esse projeto tem como objetivo verificar se este \nfenômeno ocorre também em pacientes com endometriose.  \nSua participação neste estudo será como paciente controle (sem endometriose), \npois é necessário comparar pacientes com  endometriose e pacientes sem \nendometriose. A cirurgia de abdome para as pacientes controle será realizada nas \npacientes que desejam realizar a laqueadura tubária como método \nanticoncepcional. \nPara isso, será feita uma pesquisa em laboratório para investig ar no sangue e no \nmaterial de biópsia removido durante a vídeolaparoscopia para laqueadura \ntubária, a qual a senhora será submetida, se o tecido sadio removido recebe \nmenos colesterol comparado ao tecido acometido por endometriose. \n \n5.2 – PROCEDIMENTOS QUE SERÃO UTILIZADOS E PROPÓSITOS: \nA senhora será submetida a uma videolaparoscopia, que é um tipo de cirurgia na \nqual são realizados 3 pequenos cortes na pele e os médicos realizarão a cirurgia \nobservando o interior da barriga em uma televisão. Durante a cir urgia, o seu \nmédico realizará a laqueadura tubária e removerá uma pequena amostra de tecido \nsadio chamado peritônio, que é um tecido de revestimento interno do abdômen, \npróximo a região das tubas uterinas e também uma pequena amostra de \nendométrio normal, tecido de revestimento que se localiza dentro do útero. Estes \ntecidos serão enviados ao Laboratório de Metabolismos de Lípides do INCOR \npara análise da presença de receptores de LDL (colesterol) para podermos \nrealizar a pesquisa que estamos propondo. \n \n\n75 \n5.3 – RISCOS RELACIONADOS AOS PROCEDIMENTOS: \nOs riscos da obtenção dos tecidos no intra -operatório da videolaparoscopia são \nmínimos e não causam transtornos à sua saúde. \nAntes da cirurgia, será retirada uma amostra de sangue para fazer outros exames \nrelacionados com a gordura no sangue. Os riscos decorrentes desses exames são \nmínimos, relacionados à picada na veia que pode deixar uma m ancha roxa no \nlocal. Para a realização deste exame e da cirurgia laparoscópica é necessário \nestar 12 horas em jejum. \n \n5.4 – DESCONFORTOS E RISCOS ESPERADOS: \nA pesquisa não oferece risco ou desconforto pois a remoção dos fragmentos de \ntecido sadio (peritônio e endométrio) serão representados por uma diminuta \nporção, as quais não oferecem qualquer dano à integridade do paciente.  \n \n5.5 – BENEFÍCIOS QUE PODERÃO SER OBTIDOS: \nCom esta pesquisa, a qual a senhora está participando, tentaremos descobrir se \nos achados encontrados poderão ajudar futuras pacientes em seu tratamento. \nConcordando com o uso deste material, do modo descrito, é nec essário \nesclarecer que a senhora não terá quaisquer benefícios ou direitos financeiros \nsobre os eventuais resultados decorrentes da pesquisa.  \nCaso a senhora não concorde em doar o fragmento de tecido para pesquisa, nada \ninfluenciará o seu tratamento. Sali entamos que a senhora tem a liberdade de \nretirar o consentimento em qualquer fase da pesquisa sem prejuízos a seu \ncuidado e que terá direito de acesso sobre os eventuais resultados desta pesquisa \ne toda assistência necessária caso assim o desejar.  \nOs pesq uisadores estarão à sua disposição para quaisquer esclarecimentos no \nendereço abaixo especificado.Se a senhora tiver alguma consideração ou dúvida \nsobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa \n(CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5º andar – tel: 3069-6442 ramais 16, \n17, 18 ou 20,FAX:3069-6442ramal26– e-mail:cappesq@hcnet.usp.br \n\n76 \n5.6 – CUSTOS: \n A senhora não terá custos ao participar do estudo. \n \n5.7 – TRATAMENTO ALTERNATIVO: \nNão existem diferenças nos tratamentos realizados em virtude de sua participação \nou não neste estudo. \n \n6 – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS \nDO SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO: \nSua participação no presente estudo é voluntária. \nA senhora pode optar por não participar ou interromper sua participação no estudo \na qualquer momento sem sanção nem perda de benefícios aos quais pudesse ter \ndireito. Se decidir interromper antes de terminar o estudo, será solicitado a voltar \nao consultório/hospital para uma visita final. \nHavendo interesse subsequente da paciente, os pesquisadores se comprometem \na descartar as amostra colhidas imediatamente após notificação oficial da \npaciente ou de seus representantes legais. \nO pesquisador assegura TOTAL sigilo e privacidade quanto aos dados \narmazenados e obtidos com este estudo. \nO Dr. Luciano Gibran pode retirar a senhora do estudo sem o seu consentimento \npor qualquer uma das seguintes razões: \na) Com base em critérios para melhorar seu atendimento médico;  \nb) Se a senhora deixar de seguir o esquema do estudo;  \nc) Desenvolvimento de efeitos adversos graves. \n \n\n77 \n7 – INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS \nRESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA \nCONTATO EM CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES \nADVERSAS. \nO Dr. Luciano Gibran estará à sua disposição a qualquer momento para discutir as \ndúvidas que a senhora possa ter a respeito deste estudo e sua participação. \nO consultório do Dr. Luciano Gibran fica a Rua Cotoxó, 611 cj. 103 e o número do \ntelefone de seu consultório é (11) 3865-8319, durante o horário comercial.  \nSe o desenho do estudo ou o uso da informação forem alterados ou se surgir \nalguma descoberta significativa durante o estudo que possam afetar seu desejo \nem participar, a senhora será informada e será obtido novamente o seu \nconsentimento. \nSe tiver quaisquer dúvidas sobre seus direitos como indivíduo de pesquisa ou \nqueixas referentes a este estudo, a senhora deverá telefonar para: \n \n \nDr. Luciano Gibran \nEnd.: Rua Cotoxó no 611, conj. 103, Bairro Pompéia, São Paulo \nTel. 11- 3865-8319 – CEP: 05020-010 \n \n8 – OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES: \n \n__________________________________________________________________\n__________________________________________________________________\n____________________________________ \n \n\n78 \n9 – CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO \nAo assinar  este termo de consentimento livre e esclarecido, reconheço que li e \ncompreendi a informação precedente descrevendo este estudo. Minhas dúvidas \nforam satisfatoriamente esclarecidas e estou assinando este termo de \nconsentimento livre e esclarecido indicando  meu desejo de participar. \nCompreendo que receberei uma cópia assinada deste termo. \nAo assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, não abdiquei de \nnenhum de meus direitos legais aos quais eu pudesse fazer jus como participante \nde um estudo de pesquisa. \nSão Paulo, ............de..........................de.............               \n \n-------------------------------------------------------------- \nAssinatura do paciente/representante legal \n \n \nData         /       /        \n \n----------------------------------------------------------------- \nAssinatura da testemunha                 Data         /       /        \npara casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semianalfabetos ou \nportadores de deficiência auditiva ou visual. \n(Somente para o responsável do projeto) \nDeclaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e \nEsclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste \nestudo. \n \n--------------------------------------------------------------- \nAssinatura do responsável pelo estudo           Data         /       /        \n \n\n79 \n7.3 Anexo C – Tabela com os dados das pacientes e suas características \nfísicas. \nn n° \ncaderno Paciente Nome Idade Peso \n(Kg) \nEstatura \n(cm) IMC Fase do \nCiclo \n1 1 Caso MARICELMA 32 65 154 27,4 secretora \n2 4 Caso LUCIANA 29 64 172 21,6 proliferativa \n3 5 Caso ANGELA 44 62 170 21,5 proliferativa \n4 7 Controle ANA PAULA 32 85 168 30,1 secretora \n5 15 Caso JULIANA 26 62 158 24,8 secretora \n6 17 Caso ANDREA 35 67 165 24,6 proliferativa \n7 21 Caso DEBORA 42 73 158 29,2 secretora \n8 25 Caso CAROLY 48 93,5 172 31,6 proliferativa \n9 26 Caso LIANE 32 54 152 23,4 proliferativa \n10 27 Caso ALESSANDRA 35 57 153 24,3 secretora \n11 28 Caso ANDREA 38 71 169 24,9 proliferativa \n12 29 Caso JULIA 30 45,5 158 18,2 secretora \n13 30 Caso GABRIELA 36 55,8 162 21,3 proliferativa \n14 31 Caso PATRICIA 37 51 163 19,2 secretora \n15 34 Caso DENISE 31 76 173 25,4 secretora \n16 37 Caso GENI 47 63,5 153 27,1 proliferativa \n17 38 Caso VERONICA 39 56,1 157 22,8 secretora \n18 39 Caso FATIMA 41 63,9 162 24,4 secretora \n19 40 Caso FLAVIA 31 53,6 153 22,9 proliferativa \n20 41 Caso CINTIA 28 61,5 163 23,1 proliferativa \n21 42 Caso PATRICIA 32 57 153 24,3 proliferativa \n22 43 Controle DANIELA 35 67 165 24,6 secretora \n23 44 Controle JOELMA 24 69 161 26,6 secretora \n24 45 Controle LUANA 28 78 174 25,8 secretora \n25 46 Controle FABIANA 29 75 165 27,5 proliferativa \n26 47 Controle MARIVANEIDE 30 82 169 28,7 proliferativa \n27 49 Controle TATIANA 33 80 180 24,7 proliferativa \n28 50 Controle LUCIANA 32 60 169 21,0 secretora \n29 51 Controle MARIA MELO 41 88 172 29,7 secretora \n30 52 Controle LIDIA 28 67 159 26,5 proliferativa \n31 53 Controle ELISABETE 43 73 167 26,2 proliferativa \n32 54 Controle CLAUDIA 44 67 165 24,6 proliferativa \n33 55 Controle ANA 32 60 166 21,8 proliferativa \n34 56 Controle MARIA NOVAIS 32 80 165 29,4 secretora \n35 57 Controle REGINA CÉLIA 44 72 158 28,8 proliferativa \n36 59 Controle ROSA 31 73 152 31,6 proliferativa \n37 60 Controle RENATA 32 65 160 25,4 secretora \n38 61 Controle EDILENE 32 74 162 28,2 proliferativa \n39 64 Controle LOURDES 36 86 167 30,8 secretora \n \n\n80 \n7.4  Anexo D – Tabela com o perfil lipídico das pacientes \nn n° \ncaderno Paciente CT HDL-C LDL-C TG APO A1 APO B100 \n1 1 Caso 174 39 114 102 197,1 134,7 \n2 4 Caso 186 39 120 137 96,9 79 \n3 5 Caso 191 46 114 153 149,4 70,7 \n4 7 Controle 179 46 121,6 57 154,1 79 \n5 15 Caso 144 34 94 79 97,3 61,3 \n6 17 Caso 177 47 103 137 157,8 62,7 \n7 21 Caso 145 37 91 85 99,9 59,5 \n8 25 Caso 220 47 129 222 167,9 86,2 \n9 26 Caso       \n10 27 Caso 189 49 111 140 149,3 62,5 \n11 28 Caso 189 54 116 94 146,3 83,1 \n12 29 Caso 182 48 108 128 137,6 71,1 \n13 30 Caso 179 54 105 99 158 55,5 \n14 31 Caso       \n15 34 Caso 194 54 116 123 135,4 72,9 \n16 37 Caso 255 39 180 183 81,8 108,9 \n17 38 Caso 185 31 123 154 107,8 69,3 \n18 39 Caso 155 41 99 74 98,1 51,6 \n19 40 Caso 221 25 162 170 86,1 93,5 \n20 41 Caso       \n21 42 Caso 195 32 136 139 111,3 68,8 \n22 43 Controle 191 22 155 71 102,4 66,1 \n23 44 Controle 195 40 133 113 121,1 75,3 \n24 45 Controle 197 54 118 124 127 77,3 \n25 46 Controle 215 35 162 90 118,9 92,1 \n26 47 Controle 196 52 171 123 157,7 92,7 \n27 49 Controle 173 52 161 62 146,8 65,3 \n28 50 Controle 141 40 131 52 125 64,8 \n29 51 Controle 161 32 145 82 117,7 88,5 \n30 52 Controle 185 90 176 47 171,1 42,7 \n31 53 Controle 306 37 254 259 125,3 161,5 \n32 54 Controle 248 45 217 155 155,8 128,4 \n33 55 Controle 180 44 154 129 156,8 77,8 \n34 56 Controle 168 39 130 189 125,2 143,5 \n35 57 Controle 210 39 182 138 140,5 121,5 \n36 59 Controle 148 38 116 160 131,4 65 \n37 60 Controle 184 48 163 106 169 80,7 \n38 61 Controle 225 35 152 188 136,8 124,5 \n39 64 Controle 176 32 120 119 111,3 95,8 \n \n\n81 \n7.5 Anexo E – Tabela com os dados de expressão gênica \n   LDL-R LRP-1 \nn n° \ncaderno Paciente Endométrio Endometriose Endométrio Endometriose \n1 1 Caso 0,01 0,08 0,05 0,99 \n2 4 Caso 0,01 0,02 0,17 0,13 \n3 5 Caso 0,01 0,00 0,06 0,03 \n4 7 Controle 0,01  0,12  \n5 15 Caso 0,02 0,03 0,05 0,30 \n6 17 Caso 0,00 0,03 0,06 0,30 \n7 21 Caso 0,01 0,03 0,04 0,22 \n8 25 Caso 0,01 0,02 0,02 0,37 \n9 26 Caso 0,00 0,06 0,05 0,23 \n10 27 Caso 0,04 0,03 0,04 0,35 \n11 28 Caso 0,01 0,07 0,05 0,47 \n12 29 Caso 0,01 0,01 0,10 0,30 \n13 30 Caso 0,01 0,00 0,04 0,27 \n14 31 Caso 0,02 0,04 0,07 0,20 \n15 34 Caso 0,01 0,01 0,05 0,18 \n16 37 Caso 0,00 0,02 0,31 0,52 \n17 38 Caso 0,02 0,02 0,07 0,07 \n18 39 Caso 0,01 0,01 0,13 0,33 \n19 40 Caso 0,01 0,01 0,04 0,13 \n20 41 Caso 0,00 0,01 0,12 0,47 \n21 42 Caso 0,01 0,01 0,26 0,27 \n22 43 Controle 0,03  0,38  \n23 44 Controle 0,03  0,15  \n24 45 Controle 0,02  0,14  \n25 46 Controle 0,02  0,05  \n26 47 Controle 0,02  0,06  \n27 49 Controle 0,02  0,10  \n28 50 Controle 0,01  0,12  \n29 51 Controle 0,04  0,19  \n30 52 Controle 0,02  0,10  \n31 53 Controle 0,01  0,10  \n32 54 Controle 0,01  0,11  \n33 55 Controle 0,01  0,08  \n34 56 Controle 0,01  0,10  \n35 57 Controle 0,03  0,12  \n36 59 Controle 0,00  0,17  \n37 60 Controle 0,02  0,13  \n38 61 Controle 0,01  0,04  \n39 64 Controle 0,04  0,12  \n \n\n82 \n7.6 Anexo F – Tabela com os dados de determinação proteica. \n   LDL-R LRP-1 \nn n° caderno Paciente Endométrio Endometriose Endométrio Endometriose \n1 1 Caso 4 4 3 3 \n2 4 Caso 3 2 4 2 \n3 5 Caso 4 3 3 3 \n4 7 Controle 4  4  \n5 15 Caso 4 3 4 3 \n6 17 Caso 3 3 3 2 \n7 21 Caso 3 2 3 2 \n8 25 Caso 3 2 3 1 \n9 26 Caso 2 3 3 3 \n10 27 Caso 4 3 4 3 \n11 28 Caso 4 3 3 3 \n12 29 Caso 2 2 3 3 \n13 30 Caso 3 2 3 3 \n14 31 Caso 4 2 4 3 \n15 34 Caso 3 2 4 1 \n16 37 Caso 4 3 3 2 \n17 38 Caso 3 2 3 1 \n18 39 Caso 3 3 1 2 \n19 40 Caso 4 2 4 1 \n20 41 Caso 4 4 2 3 \n21 42 Caso 3 2 3 3 \n22 43 Controle 4  4  \n23 44 Controle 4  4  \n24 45 Controle 4  4  \n25 46 Controle 4  3  \n26 47 Controle 4  3  \n27 49 Controle 4  4  \n28 50 Controle 4  3  \n29 51 Controle 4  3  \n30 52 Controle 3  3  \n31 53 Controle 4  3  \n32 54 Controle 3  3  \n33 55 Controle 3  3  \n34 56 Controle 4  4  \n35 57 Controle 4  3  \n36 59 Controle 4  4  \n37 60 Controle 3  4  \n38 61 Controle 4  4  \n39 64 Controle 4  3  \n \n\n83 \n7.7 Anexo G – Aprovação CAPPesq - HCFMUSP. \n \n \n \n\n\n86 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n9 REFERÊNCIAS \n \n\n87 \n9 REFERENCIAS  \n \n \n1. Abdalla-Ribeiro HS , Galvāo MA , Aoki T , Aldrighi JM , Ribeiro PA . Anti-\napoptotic activity in deep pelvic endometriosis. Histol Histopathol . \n2013;29(9):1129-33. \n2. Abrao MS, Podgaec S, Dias JA Jr, Averbach M, Garry R, Ferraz Silva LF, \nCarvalho FM. Deeply infiltrating endometriosis affecting the rec tum and \nlymph nodes. Fertil Steril. 2006;86(3):543-7.  \n3. Ades A, Carvalho JP, Graziani SR, Amancio RF, Souen JS, Pinotti JA, \nMaranhão RC. Uptake of a cholesterol-rich emulsion by neoplastic ovarian \ntissues. Gynecol Oncol. 2001;82(1):84-7. \n4. Ades PA, Savage PD.  Potential benefits of weight loss in coronary heart \ndisease. Prog Cardiovasc Dis. 2014;56(4):448–56. \n5. Azevedo CH, Carvalho JP, Valduga CJ, Maranhão RC. Plasma kinetics \nand uptake by the tumor of a cholesterol -rich microemulsion (LDE) \nassociated to etoposide oleate in patients with ovarian carcinoma. Gynecol \nOncol. 2005;97(1):178-82. \n6. 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Brown J, Farquhar C. Endometriosis: an overview of cochrane reviews. \nCochrane Database Syst Rev. 2014 Mar 10;3:CD009590. \n13. Bulgarelli A, Leite AC Jr, Dias AA, Maranhão RC. Anti-atherogenic effects \nof methotrexate carried by a lipid nanoemulsion that binds to LDL \nreceptors in chol esterol-fed rabbits. Cardiovasc Drugs Ther . \n2013;27(6):531-9.  \n14. Bulun SE, Lin Z, Imir G, Amin S, Demura M, Yilmaz B, Martin R, \nUtsunomiya H, Thung S, Gurates B, Tamura M, Langoi D, Deb S. \nRegulation of aromatase expression in estrogen -responsive breast and \nuterine disease: from bench to treatment. Pharmacol Rev. 2005;57(3):359-\n83. \n15. Casslen B, Gustavsson B, Angelin B, Gafvels M. Degradation of urokinase \nplasminogen activator (UPA) in endometrial stromal cells requires both the \nUPA receptor and the low -density lipoprotein receptor -related \nprotein/alpha2-macroglobulin receptor . Mol Hum Reprod . 1998;4(6)585–\n93. \n16. 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