Avaliação do potencial de peroxidação lipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose pélvica

- The objective of the present stuciy was to evaluate lipici peroxidation capacity in the peritoneal fluid of infertile women with pelvic enciometriosis and fertile women. CASES AND METHODS - Thirty - two women were selecteci anci ciivicieci into two groups: enciometriosis Group , consisting of 17 infertile women with pelvic enciometriosis confirmeci by laparoscopy anci biopsy, and control Group, consisting of 15 women without endometriosis, as confirmed by laparosopy, and submitted to bilateral tube ligation. Lipid peroxidation potencial were determined from thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and were expressed as MOA nm/ml anci µL/ml. Peritoneal fluid was collected during laparoscopy in the follicular phase. RESUL TS - No significant ciifference in MOA levels was detected between endometriosis Group and control B, with respectiva median values of 0.07 nmol/ml and 0.04 nmol/ml (p=0.09). Median MDA/Cu2+ levels were 0.34 nmol/mL in enciometriosis Group and 0.21 nmol/ml in control Group. When MOA and MDA/Cu2+ leveis were compareci, MOA/Cu2+ were founci to be higher intragroup in both enciometriosis Group anci control Group (p<0.01 ). No significant difference in CSO levels were found between Group A anci Group B, with respectiva median values of 0.24 and 0.25 ug/ml (p=0.50).

- The present study ciid not ciemonstrate an increase in lipid peroxidation potencial in the peritoneal fluici of infertile women with pelvic enciometriosis when compareci to fertile women. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA NO FLUIDO PERITONEAL DE MULHERES INFÉRTEIS COM ENDOMETRIOSE PÉLVICA OBJETIVO - A meta do presente estudo foi avaliar a capacidade de peroxidação lipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose pélvica e mulheres normais. CASUÍSTICA E MÉTODOS - Foram selecionadas prospectivamente 32 mulheres, distribuídas em dois grupos, dispostos em Grupo endometriose, composto por 17 mulheres inférteis com endometriose pélvica, comprovada por laparoscopia e biópsia, e Grupo controle, determinado por 15 mulheres sem endometriose pélvica, comprovada por laparoscopia e submetidas à laqueadura tubárea bilateral. A peroxidação lipídica foi avaliada através da peroxidação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) determinados pelo malondialdeído (MOA), malondialdeído com adição de cobre (MDA/Cu2+ ) e pelo colest- 3,5- dieno- 7- ona (CSD) expressos em nmol/mL e µg/mL respectivamente. As amostras de fluido peritoneal foram colhidas durante a laparoscopia, na fase folicular do ciclo menstrual. RESULTADOS - Não encontramos diferença estatística nos níveis de MOA entre os Grupos endometriose (mediana de 0.07 nmol/mL) e controle (mediana de 0.04 nmol/mL) (p=0.09). Após a peroxidação provocada pelo cobre também não houve diferença entre os grupos endometriose (0.34 nmol/mL) e controle (0.21 nmol/mL) mas houve uma elevação intragrupo (p<0.01). Não encontramos diferença estatística dos níveis de CSD nos Grupos endometriose e controle (mediana de 0.24 e 0.25 µg/mL, respectivamente) (p=0.50). CONCLUSÃO- Nosso estudo não demonstrou aumento do potencial de peroxidação lipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose pélvica comparadas a mulheres férteis. Unitermos endometriose, peroxidação lipídica,oxisterol, malondialdeído INTRODUÇÃO A infert ilidade acomete entre 20 e 50% de mulheres portadoras de endometriose pélvica (Wheeller & Malinak,1988;Thomas,1993). O fluido peritoneal é um dos fatores relevantes envolvidos neste mecanismo. Em mulheres com endometriose pélvica ocorre um processo infla matório crônico intraperitoneal associado à infertilidade mesmo na vigência de função ovulatória normal e evidente alteração anatômica em tuba uterina, local, onde ocorre a fertilização (Halme et ai., 1982; Khamse et al.,2001 ). Alguns estudos sugerem que mulheres com endometriose pélvica são predispostas a um aumento do estresse oxidativo devido processo inflamatório. Com isso estariam predispostas a maior quantidade de radicais livres e reduzidas concentrações de seu varredor, a enzima superóxido dismutase (SOO). Esta alteração resulta da interação dos peróxidos lipídicos com as proteínas (lshikawa et ai., 1993; Shanti et ai., 1999). Necessitam-se de estudos prospectivos e randomizados para elucidar a participação dos radicais livres nos distúrbios da fertilidade para se determinar a verdadeira alteração por eles gerados na função reprodutiva CASUÍSTICA E MÉTODOS Foram selecionadas prospectivamente 32 mulheres distribuídas em 2 grupos. Grupo endometriose composto por 17 mulheres com infertilidade e endometriose pélvica e o Grupo controle representado por 15 mulheres sem endometriose pélvica submetidas a laqueadura tubária bilateral. Foram critérios de inclusão do Grupo Endometriose: presença de infertilidade por fator feminino de pelo menos 2 anos de duração, ausência de qualquer tratamento clínico prévio a laparoscopia num período de no mínimo 6 meses;ausência de tratamento clínico ou cirúrgico da endometriose; ausência de uso de antiinflamatório (hormonal e não hormonal) por pelo menos 7 dias antes da coleta do fluido; diagnóstico de endometriose pélvica comprovada por laparoscopia e biópsia; presença de fluido peritoneal em cavidade abdominal durante a laparoscopia; idade superior a 18 anos e inferior a 40 anos. Grupo controle: ausência de endometriose pélvica ou patologias ginecológicas no momento da laparoscopia , presença de fluido peritoneal em cavidade abdominal durante a laparoscopia e ausência de uso de antiinflamatório (hormonal e não hormonal) por pelo menos 7 dias antes da coleta do fluido. As amostras de fluido peritoneal foram obtidas durante a laparoscopia realizada durante a fase folicular do ciclo menstrual. O fluido peritoneal será centrifugado a 2 500 rpm, (1 900 x g) durante 1 O minutos. Em seguida, o sobren adante era pipetado e aliquotado em tubos de ensaio secos e estocados a -80° C até o momento da análise laboratorial. As mulheres com endometriose pélvica foram estadiadas de acordo com a Classificação da American Society for Reproductive Medicine (1997) das quais 7 mulheres eram do estádio 1, 5 do estádio 11, 7 do estádio li e 2 do estádio IV. O potencial de peroxidação lipídica (PLPP) foi avaliado a partir da utilização do cobre na formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A peroxidação foi determinada por método enzimático pelo malondialdeído (MOA), malondialdeído com adição de cobre (MDA/Cu2+ ) e pelo Colest- 3,5- dieno- 7- ona (CSD) expressos em nmol/ml e ug/ml respectivamente. A análise estatística foi realizada com o programa Stata. Os testes utilizados de acordo com as variáveis foram o Mann Whitney e o Wilcoxon. Foi considerado estatisticamente significativo o p<0.05. RESULTADOS Os níveis de MOA no fluido peritoneal das mulheres com endometriose pélvica variaram de 0.01 a 0.55 nmol/ml, sendo a mediana de 0.07 nmol/ml. Nas mulheres do Grupo controle os valores do MOA demonstraram uma variação de 0.007 a 0.27 nmol/ml e uma mediana de 0.04 nmol/ml (p=0.09). O valor mínimo do MOA com adição de cobre (MONCu 2+) obtido em mulheres com endometriose pélvica foi de 0.02 nmol/ml e o máximo foi de 0.79 nmol/ml, sendo a mediana de 0.34 nmol/ml. Em mulheres do Grupo controle os níveis de MOA com adição de cobre (MONCu 2+) foram semelhantes ao Grupo endometriose (p=0.50), sendo o valor mínimo de 0.006 nmol/ml e o máximo de 0.73 nmol /ml com mediana de 0.21 nmol/ml (p=0.028). Ao compararmos intragrupo a equivalência do MOA e MDNCu2+ em ambos os grupos, observamos um aumento dos níveis com adição do cobre (p<0.01). Os níveis de CSO no Grupo endometriose variaram de 0.07 a 0.60 µg/ml, sendo a mediana encontrada de 0.24 µg/ml. Nas mulheres do Grupo controle os valores do CSD apresentaram uma variação de 0.09 a 0.50 µg/ml e uma mediana de 0.25 µg/ml, sem diferença estatística (p=0.50). Comparando-se os níveis de MOA em mulheres portadoras de endometriose pélvica com o estadiamento da doença, observou-se que a mediana foi de 0.07 nmol/ml em mulheres com endometriose estádio 1, 0.09 nmol/ml em casos de endometriose estádio 11, O .04 nmol/ml em casos de endometriose estádio Ili e 0.31 nmol/ml em endometriose estádio IV, sem diferença estatística entre os níveis de MOA nos diferentes estádios da doença. Ao correlacionarmos os níveis de MONCu 2+ e CSD no fluido peritoneal de mulheres com endometriose pélvica e o estadiamento da doença observamos que a mediana deste marcador foi de 0.48 nmol/ml e 0.12 µg/ml respectivamente no estádio I da doença, 0.52 nmol/ml e 0.24 µg/ml no estádio 11, foi de 0.15 nmol/ml e 0.23 µg/ml no estádio Ili e 0.22 nmol/ml e 0.30 µg/ml respectivamente no estádio IV sem diferença estatística nos diferentes estádios da endometriose (p=0.27 e p=0.16). Avaliamos separadamente a presença de lesões típicas ou pigmentadas (negras) sugestivas de doença crônica e atípicas ou não pigmentadas (vermelha) sugestivas de doença ativa. Não observamos relação de lesões predominantes (típicas ou atípicas) com os níveis de CSD, MOA e MDA/Cu2+ (p = ns). Não encontramos relação dos níveis de MOA com a idade de mulheres com endometr iose pélvica (p=ns). Em relação ao CSD observamos uma relação negativa (p=0.02). Em mulheres do Grupo controle, houve uma relação positiva da idade com níveis de MOA e nenhuma relação com os níveis de CSD (p=0.02 e p=0.39 respectivamente). DISCUSSÃO O fluido peritoneal um papel importante nos processos de fertilidade, por esta razão diversas pesquisas se destacam neste campo. Um dos campos que tem sido destaque é o papel do estresse oxidativo e de algumas espécies reativas ao oxigênio (ROS) (Wang et ai. 1997; Murphy et ai., 1998a; Shanti et ai., 1999; Ota et ai., 1999; Polak et ai., 2000). Murphy et ai. (1998b), levantaram a possibilidade do desenvolvimento da endometriose a partir do estresse oxidativo. Como conseqüência , haveria danos oxidativos das células vermelhas sanguíneas e das células endometriais em processo de apoptose. Os restos de tecidos endometriais agiriam como um recrutamento e ativação de fagócitos mononucleares . Na vigência de endometriose pélvica, haveria uma resposta inadequada a estes estímulos em nível de receptores de macrófagos varredores sem comprometer sua resposta secretora (Murphy et ai., 1998a). A ativação dos macrófagos na cavidade peritoneal seria responsável pelo estresse oxidativo determinado pela peroxidação dos lipídeos, seus produtos de degradação e os produtos formados pela sua interação com o LDL e outras proteínas (Murphy et al.,1998b). Os lipídeos peroxidados ao se submeter à decomposição, geram produtos como o malondialdeído. Estes produtos reagem com os grupos aminas dos resíduos de lisina das proteínas. Os grupos amina dos lipídeos também são vulneráveis a estas alterações.Com isso, estes lipídeos passam a ser estranhos e começam a desencadear uma resposta antigênica formando então anticorpos (Murphy et al.,1998b ;Polak et al.,2000). Avaliarmos o potencial de peroxidação lipídica representado pelo MOA e MDA/Cu2+ com o estadiamento da doença, não encontramos relação com os mesmos. Shanti et ai (1999) estudaram a presença de autoanticorpos para MOA e LDL colesterol no soro de 36 mulheres com endometriose pélvica e 16 mulheres normais submetidas à laqueadura tubárea bilateral. Não encontraram correlação dos autoanticorpos com o estádio, morfologia ou sintomas da endometriose. Estes dados são semelhantes aos nossos achados embora a técnica utilizada tenha sido diferente. Com relação ao fluido peritoneal, não encontraram autoanticorpos para três antígenos presentes no fluido. Os autoanticorpos dos marcadores de estresse oxidativo estavam aumentados em mulheres com endometriose pélvica comprovando a participação desta enfermidade. Ao avaliarmos os níveis de CSD comparados à severidade da doença, também não encontramos relação. Não há relatos na literatura para discutirmos estes achados. A coloração dos implantes reflete os achados hemorrágicos, vasculares, hemopigmentados e fibrose (Brosens, 1997). As lesões negras e brancas têm sido representadas como evolução da lesão vermelha, caracterizando assim a presença de endometriose crônica além da reação inflamatória local, após sangramento recorrente e conseqüente fibrose. Diversos estudos sugerem que, com o passar dos anos, ocorre um decréscimo na incidência de lesões não pigmentadas, principalmente as vermelhas (Redwine, 1987b; Nisolle et ai., 1993; Brosens et ai., 1994; Abrão e lkeda.,2000). Em nosso estudo, ao avaliarmos os níveis do MOA no fluido peritoneal, não observamos diferença entre os Grupos endometriose e controle. Ao compararmos os valores do MOA e MOAfCu2+ no Grupo endometriose observamos que os níveis do MOAfCu2+ foram significativamente mais elevados. Quanto ao Grupo controle, encontramos resultados semelhantes, mas ao compararmos os níveis individuais em ambos os grupos sem diferença estatística (Figura 1). Não podemos comparar estes achados com a literatura pois os trabalhos que avaliaram radicais livres, espécies reativas ao oxigênio ou peroxidação lipídica utilizaram métodos diferentes. Estudos avaliando níveis séricos, utilizaram o MOA já oxidado pelo cobre (MOAfCu2+ ) pelos TBARS em mulheres com endometriose pélvica e laqueadura tubárea (Murphy et ai., 1998b) ou observaram o MOAfCu2+ e vitamina E em mulheres com outras patologias (Tang et ai, 1997). Baseado neste dados inéditos na literatura, calcularmos também a porcentagem de incremento com adição de cobre nas amostras com MDA. Não observamos diferença estatística em qualquer dos Grupos. O trabalho descrito a respeito de status antioxidante totais e malondialdeído por método Elisa no fluido peritoneal de mulheres inférteis utilizou apenas mulheres com endometriose mínima e leve como controle (Polak et ai, 2000). O objetivo deste trabalho foi avaliar as pacientes com infertilidade sem causa aparente (ISCA). Encontraram, apesar da casuística limitada, valores significativamente elevados em pacientes com ISCA e endometriose comparados ao grupo controle determinado por pacientes com tumor ovariano não inflamatório. Não encontraram diferença do status antioxidante total. Concluíram que o desequilíbrio entre a lipoperoxidação e o sistema antioxidade é um dos fatores determinantes da ESCA. Em casos de endometriose associada à inferti lidade, fator imunológico e predisposição genética, ainda há muitas perguntas sem respostas. A presença de um fator preditivo da doença facilitaria seu seguimento em casos de dor pélvica importante e infertilidade. Mesmo com os métodos mais sofisticados de leitura por espectofotometria spin as limitações ainda existem pois as espécies reativas ao oxigênio têm uma vida média muito curta. A possível detecção dos mesmos e posterior terapêutica direcionada aos achados, seriam de grande valia para as mulheres inférteis com endometriose pélvica. Não encontramos nos níveis de peroxidação lipídica pelos TBARS um bom parâmetro de avaliação do fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose pélvica. Nosso estudo não descarta a possibilidade de outras espécies reativas ao oxigênios estarem envolvidas nesta patologia sugerindo , portanto, novas investigações nesta área. 0.8 ,, 0.7 ♦ ,, ,, 0.6 ♦ ,, ,, 0,5 ,, • ♦ ♦ 0.4 • ♦ ♦ 0.3 0.2 • ,, ♦ A ♦ 0.1 A ,, ,, • • .... ... •••• •• A Â ,, ,, ♦ o.o Endometriose(MDA/Cu 2+>1 Endometriose (MOA} Controle (MOA} Controle (MOA/Cu2♦ • Figura 1- Comparação entre os níveis de MOA com e sem adição de cobre, no Grupos endometriose e controle (p<0.01)