{"paper_id":"dc6988ed-a729-4fec-971e-3481064a6140","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nAVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA \nNO FLUIDO PERITONEAL DE MULHERES INFÉRTEIS COM \nENDOMETRIOSE PÉLVICA \nTRABALHO REALIZADO NO \nDEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA \nE OBSTETRÍCIA DA FACULDADE DE \nMEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DA \n• UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO .\nTESE DE DOUTORADO.\nAluna - Vivian Ferreira do Amaral \nOrientador - Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani \n2001 \n\nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nAVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEROXIDAÇÃO \nLIPÍDICA NO FLUIDO PERITONEAL DE MULHERES \nINFÉRTEIS COM ENDOMETRIOSE PÉLVICA \nAluna - Vivian Ferreira do Amaral \nOrientador - Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani \nNível - Doutorado \nRibeirão Preto \n2001 \n\nFICHA CATALOGRÁFICA \nPreparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo \nde Ribeirão Preto / USP \nAmaral, Vivian Ferreira do \nAvaliação do potencial de peroxidação lipídica no fluido \nperitoneal de mulheres inférteis com endometriose pélvica. \nRibeirão Preto, 2001. \n127 p. : il.; 30cm \nTese de Doutorado, apresentada à Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto/USP - Área de concentração: \nTocoginecologia. \nOrientador: Ferriani, Rui Alberto \n1.endometriose,fluido peritoneal , infertilidade \n- Peroxidação lipídica\n\nAos meus pais pelo amor incondicional, que me traz \nforça e coragem na realização de todos os meus \nsonhos. \nAo Victor, irmão e colega \nde profissão e exemplo de \nhonestidade e integridade. \nE, principalmente, \nà Thayana, \npresente de Deus na minha vida, \nminha inspiração e grande \ncompanheira na execução desta \nobra. Dedico-lhe todo o meu amor e \nagradecimento pela compreensão em \ntodos os necessários momentos em \nque ficamos distantes para a \nrealização desta nossa conquista. \n\n\"La pensée a des ailes \nNul ne peut arréter son envol\" \nYoussef Chahine \n\"As idéias tem asas \nNinguém pode deter seu vôo ... \" \nYoussef Chahine \n\nAgradecimentos \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto - USP, pelas oportunidades recebidas e pela realização desse \ntrabalho. \nAo Prof. Dr. Marcos Dias de Moura, pela valiosa contribuição na minha formação \ncientífica. \nAo Prof. Dr. Geraldo Duarte, pela amizade e incentivo na realização deste \ntrabalho. \nAo Prof. Dr. Jurandyr Moreira de Andrade, pela importante colaboração \ncientífica. \nÀ Tereza Maria Peranovich, pela amizade, disponibilidade e auxílio indispensável \nnas dosagens laboratoriais. \nAo Prof. Luiz de Souza, pela colaboração na análise estatística. \nAos colegas de pós-graduação, pela amizade e carinho. \n'As funcionárias do Laboratório de Reprodução Humana, Maria Cristina, Maria \nAparecida Marilda, Maria Albina, Sandra, Renata e Auxiliadora, pelo carinho e \npelo convívio diário. \n'A llza Alves Rezende Mazzocato, pelo exemplo de dedicação profissional, \namizade e solidariedade durante toda a minha trajetória. \n'A Iara Maria Correia, pela disponibilidade e colaboração. \nAos funcionários do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Claire Tais, Rosane, \nValéria e Ricardo, pela colaboração durante toda esta jornada e, em especial , à \nSra. Elettra Green e Reinaldo Vicente Tavares, pela amizade e disponibilidade. \nÀ CAPES, pelo auxílio recebido. \n\nAgradecimentos especiais \nAo Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani, pelo privilégio de tê-lo como \norientador, pela confiança, incentivo e compreensão durante toda \ntrajetória. \nAo Prof. Dr. Sérgio Paulo Bydlowski, pela disponibilidade, amizade \ne participação indispensável na realização desta tese. \nAo Dr Ravi Subbiah, do Lipid Research Center, Ohio, pela valiosa \ncolaboração e suporte técnico \nAo Prof. Dr. Laerte Justino de Oliveira, pelo incentivo e \ndisponibilização de oportunidades para a realização deste trabalho. \nAo Prof. Dr. Marcos Felipe Silva de Sá, pelas primorosas \ncontribuições no meu desenvolvimento científico. \n\nA Prof. Ora. Maria Matheus de Sala pela disponibilidade e incentivo \nem todas as etapas percorridas. \nAo Prof. Dr. Maurício Simões Abrão, pela amizade e incentivo \nrecebido deste o início desta caminhada. \nAo Prof. Dr. Carlos Alberto Petta, pelos valiosos comentários a \nrespeito deste trabalho. \n\n\"SÓ fazemos melhor aquilo que repetidamente \ninsistimos em melhorar.A busca da excelência \nnão deve ser um objetivo,e,sim, um hábito.\" \nAristóteles 384-322 A.C. \n\nSUMÁRIO \nLISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS \nLISTA DE UNIDADES DE MEDIDA \nRESUMO \n1 INTRODUÇAO ............................................................................... 01 \n2 OBJETIVO ..................................................................................... 20 \n3 CASUÍSTICA E MÉTODOS .......................................................... 22 \n4 RESULTADOS .............................................................................. 31 \n5 DISCUSSAO .................................................................................. 39 \n6 CONCLUSOES .............................................................................. 54 \n7 ANEXOS ............................................................................ ............ 56 \n8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................. 67 \nSUMMARY \n\nLISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS \nASRM -American Society for Reproductive Medicine \nCélula NK -célula natural killer \nCSD - Colest-3, 5 - dieno -7-ona \nE2 - 17 f3 estradiol \nFIV -fertilização in vitro \nFP - fluido peritoneal \nIL- interleucina \nISCA - Infertilidade sem causa aparente \nMDA - malondialdeído \nMDA/Cu 2+ \n- Malonaldialdeído com adição de cobre\nn -número de pacientes \nPLPP- potencial de peroxidação lipídica \nRL-Radicais livres \nROS-Espécies reativas ao oxigênio \nSOD-superóxido dismutase \nTBARS - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico \n\nLISTA DE UNIDADES DE MEDIDA \nml - mililitro \nnmol - nanomol \nnm - nanômetro \nµg - micrograma \npg - Picograma \n% - Porcentagem \nrpm - Rotações por minuto \nUI - Unidades Internacionais \np - Probabilidade da hipótese de nulidade ser verdadeira \n\nRESUMO \n\nVivian Ferreira do Amaral \nResumo \nOBJETIVO - A meta do presente estudo foi avaliar a capacidade de \nperoxidação lipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com \nendometriose pélvica e mulheres normais. \nCASUÍSTICA E MÉTODOS - Foram selecionadas prospectivamente 32 \nmulheres, distribuídas em dois grupos, dispostos em Grupo endometriose, \ncomposto por 17 mulheres inférteis com endometriose pélvica, comprovada \npor laparoscopia e biópsia, e Grupo controle, determinado por 15 mulheres \nsem endometriose pélvica, comprovada por laparoscopia e submetidas à \nlaqueadura tubária bilateral. A peroxidação lipídica foi avaliada através da \nperoxidação de TBARS ( substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico ), \ndeterminados pelo malondialdeído (MOA), malondialdeído com adição de \ncobre (MDA/Cu2+\n) e pelo Colest-3,5-dieno-7-ona (CSD), expressos em \nnmol/mL e µg/mL, respectivamente. As amostras de fluido peritoneal foram \ncolhidas durante a laparoscopia, na fase folicular do ciclo menstrual. \nRESULTADOS - Não foram encontradas diferenças estatísticas nos níveis \nde MOA entre os Grupos endometriose (mediana de 0.07 nmol/mL) e \ncontrole (mediana de 0.04 nmol/ml) (p=0.09). Após a peroxidação \nprovocada pelo cobre também não houve diferença entre os grupos \nendometriose (0.34 nmol/mL) e controle (0.21 nmol/mL), mas houve \nelevação intragrupo (p<0.01 ). Diferenças estatísticas dos níveis de CSD nos \nGrupos endometriose e controle (mediana de 0.24 e 0.25 ug/mL) \nrespectivamente (p=0.50), não foram encontradas. \n\nVivian Ferreira do Amaral \nResumo \nCONCLUSÃO- Nosso estudo não demonstrou aumento do potencial de \nperoxidação lipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com \nendometriose pélvica quando comparado a mulheres férteis. \nUnitermos - endometriose, peroxidação lipídica, oxisterol, malondialdeído \n\n1 INTRODUÇÃO \n\nVivian Ferreira do Amaral 2 \nIntrodução \nA endometriose é uma patologia multifatorial caracterizada pela \nimplantação heterotópica de tecido endometrial, composto por \nglândulas e/ou estrema. A prevalência em mulheres inférteis pode \natingir de 10 a 50%, (HOUSTON et ai., 1988; MALINAK, 1988; \nWHEELER, 1992; THOMAS, 1993). \nA etiologia ainda é desconhecida, sendo aquela do fluxo \nretrógrado, descrita por SAMPSON, em 1921, (SAMPSON, 1994), \nentre as mais discutidas, atribuindo sua ocorrência ao regurgitamento \nde sangue menstrual através das trompas e ao implante de células \nendometriais no nível dos ovários e fundo de saco de Douglas. A \nteoria da metaplasia celômica, descrita em 1919 por Meyer apud WITZ \ne SCHENKEN (1997), refere irritação crônica sobre o epitélio \ncelômico, transformando células pluripotentes em tecido endometrial, \n\nVivian Ferreira do Amaral 3 \nIntrodução \nsem que haja refluxo endometrial, diferenciando-se o endotélio \ncelômico em elementos Müllerianos do endométrio . \nA metaplasia celômica e a menstruação retrógrada são as \nteorias mais aceitas atualmente e ocorrem em cerca de 76 a 90% das \nmulheres submetidas à laparoscopia por diversas afecções \nginecológicas (BLUMENKRANTZ et ai., 1981; HALME et ai., 1984b). \nEsse fenômeno, associado às alterações imunológicas, genéticas e \nfatores peritoneais inadequados, favorece a implantação das células \nendometriais e o crescimento celular, aumentando a prevalência da \ndoença entre 6,2 e 8,2% (LAMB et ai., 1986; WEED e \nARGUEMBOURG, 1980; HOUSTON et ai., 1987; KJERULFF et \nai., 1996). \nAlgumas mulheres são mais suscetíveis à implantação dessas \ncélulas endometriais, mas não se sabe aquelas predispostas ao \ndesenvolvimento da doença. WOODWORTH et ai. ( 1995) sugeriram \nque as alterações imunológicas, envolvendo o terceiro componente do \nComplemento (C3), poderiam ser predisponentes da doença. A \nresposta imune inadequada altera a função de remover os debris \nmenstruais oriundos do refluxo, propiciando o desenvolvimento e \nprogressão da doença, estimulando os fatores peritoneais \n(SENTURCK e ARICI, 1999). \n\nVivian Ferreira do Amaral 4 \nIntrodução \nA infertilidade associada à endometriose ainda é alvo de muitas \ndivergências. \nA disfunção ovulatória está presente em 10% dessas pacientes \ndevido à alteração das prostaglandinas e outras substâncias presentes \nno tecido endometrial, originadas a partir de alterações de secreção de \ngonadotrofinas, principalmente na primeira fase do ciclo menstrual \n(SOULES et ai., 1976; LESORGEN et ai., 1984). Encontra-se, \neventualmente, níveis elevados de prolactina em estágios mais leves \nda doença. Diversos estudos relatam interferência com o \ndesenvolvimento da gestação, com alteração da clivagem e do \ndesenvolvimento embrionário, com conseqüente elevação do risco de \nabortamentos espontâneos (THOMAS, 1991; GARCIA-VELASCO e \nARICI, 1999; BUYALOS e AGARWAL, 2000). \nEm 1982, HALME et ai. levantaram a hipótese de que a \ninfertilidade originar-se-ia a partir de alterações dos fatores mecânicos \nresponsáveis pela motilidade tubária. Essa motilidade inadequada \nocorre em função de fibrose e processos aderenciais, além de \ncomprometimento ovariano. Focos mínimos de endometriose podem \nalterar a função tubária em virtude do aumento das prostaglandinas, \nprincipalmente as E2 e F 2a, presentes em altas concentrações no \n\nVivian Ferreira do Amaral 5 \nIntrodução \nfluido peritoneal (MORCOS et ai., 1985; SOLDA T et ai., 1989; \nBUYALOS e AGARWAL, 2000). \nHá também deficiência na captação ovular pela fímbria e, ainda, \nno seu transporte em mulheres com endometriose pélvica (INOUE, \n1992; PAL et ai., 1998). \nAinda há controvérsia se a endometriose é a principal causadora \nda infertilidade ou se é secundária ao processo inflamatório presente \nno fluido peritoneal dessas pacientes (KONINCKX, 1994; HANEY, \n1997; MULAYM e ARICI, 1999). A presença de macrófagos em altas \nconcentrações no fluido peritoneal de pacientes com endometriose é \nrelevante quando comparado com pacientes inférteis sem causa \naparente ou pacientes normais (HALME et ai., 1982; HANEY et ai., \n1984; BADAWY et ai., 1984). Esses macrófagos possuem maior \nativação e capacidade de fagocitose, prejudicando a sobrevida, a \nmotilidade e o transporte dos espermatozóides, quando comparado a \npacientes normais. Ainda há aumento dos níveis de interleucina 1 (IL-\n1) e do fator de crescimento dos macrófagos, originando meio hostil e\nprejudicando o transporte dos gametas e a captação de oócitos pelas \nfímbrias, reduzindo a taxa de fertilização, além de promover toxicidade \naos embriões desde suas fases iniciais, prejudicando, assim, sua \nsobrevivência (HALME et ai., 1982; MORCOS et ai., 1985; FAKIH et \nai., 1987; SOLDAT et ai., 1989; GARCIA-VELASCO e ARICl,1999). \n\nVivian Ferreira do Amaral 6 \nIntrodução \nO fator auto-imune também é considerado como causa de \ninfertilidade em pacientes com endometriose. Acredita-se que a \npresença de auto-anticorpos, relacionada a taxas inferiores de \nimplantação, fertilização e conseqüentemente gravidez nos ciclos \ninduzidos, independe do grau de severidade da endometriose \n(DMOWSKI et ai., 1995; ARICI et ai., 1996; FERRIANI et ai., 2000). \nEm 1995, DMOWSKI et ai. realizaram estudo caracterizando \npacientes portadoras de endometriose como auto-anticorpos positivos \ne negativos após análise de 20 anticorpos diferentes. Após indução do \nciclo para fertilização in vitro (FIV), observaram 80% de taxa de \ngravidez independente do estádio da endometriose. Esse estudo, \nporém, obteve algumas críticas devido ao uso de corticóide prévio a \nFIV. PAL et ai. (1998) avaliaram pacientes com endometriose \nmínima/leve e moderada/severa durante os ciclos de FIV e concluíram \nque a endometriose severa, na ausência de fator masculino, promove \nalteração biológica que interfere na união dos gametas, possivelmente \ncompensada pela FIV. Comparando-se as taxas de implantação, \ngravidez e abortamento entre os dois grupos, não encontraram \ndiferença estatisticamente significativa. ARICI et ai. (1996) obtiveram \nmelhores respostas nos ciclos de FIV em estádios mais graves da \ndoença. \n\nVivian Ferreira do Amaral 7 \nIntrodução \nTUMMON et ai. (1998) correlacionaram as taxas de insucesso \nao maior tempo da doença. Alguns.autores acreditam que os estádios \n1 e li da endometriose, associados à infertilidade, parecem ter o \nmesmo resultado na FIV, independente de tratamento prévio, \nenquanto que em estádios Ili e IV a terapia medicamentosa ou \ncirúrgica prévia à FIV parece contribuir positivamente para as taxas de \ngravidez (DMOWSKI et ai., 1995; ARICI et ai., 1996). \nCHILIK et ai. (1996) estudaram 3 grupos: grupo 1, com \nendometriose diagnosticada previamente, mas não encontrada no \nmomento da FIV; grupo 2 ,com estádio I e li (American Fertility \nSociety, 1985); e grupo 3, com endometriose estádio Ili e IV. Não \nhouve diferença quanto ao número de oócitos coletados entre os \ngrupos 1 e 2, mas, comparados ao grupo 3, houve decréscimo do \nnúmero desses, assim como a taxa de gravidez, devido à qualidade do \nembrião. \nESTRESSE OXIDA TIVO \nO estresse oxidativo ocorre quando há o desequilíbrio entre a \ntaxa de radicais livres intracelulares comparada com a capacidade da \ncélula em eliminar estes radicais (MURPHY, 1998). Todo estresse \noxidativo corresponde a alteração do sistema imunológico. No \n\nVivian Ferreira do Amaral 8 \nIntrodução \nestresse oxidativo, o aumento de RL modifica os meios intra e \nextracelulares, provocando lesões múltiplas em diversas estruturas e \nconseqü ente alteração imunológica. O sistema imune é responsável \npor identificar e destruir antígenos estranhos. A implantação \nembrionária e subseqüente gestação são dependentes da habilidade \ndo sistema imune em diferenciar o concepto dos tecidos maternos e \npermitir seu desenvolvimento (GLEICHER et ai., 1994; DMOWSKI, \n1995; MATHUR, 2000). \nO estresse oxidativo nas células endoteliais, macrófagos e \ncélulas do músculo liso ocorre como resultado da depleção do \nconteúdo celular da glutationa reduzida. A oxidação ocorre em \nresposta ao acúmulo de lipídeos oxidados, a formação das espécies \nreativas ao oxigênio (ROS) liberadas pela mitocôndria (RILEY e \nBEHRMAN, 1991; ROSENFELD, 1998). \nConsiderando-se que as tubas e ovários apresentam-se, \ninvariavelmente, em contato com o líquido peritoneal, alguns estudos \nsugerem que possíveis alterações peritoneais poderiam explicar a \nrelação entre endometriose e infertilidade. O fluido peritoneal é \nformado principalmente a partir de exsudato ovariano (VOLARCIK et \nal.,1998; KONINCKX et ai., 1998,1999), mais especificamente a partir \nda foliculogênese ovariana e do aumento da permeabilidade vascular \nem decorrência de alta concentração estrogênica local. Algumas \n\nVivian Ferreira do Amaral 9 \nIntrodução \nsubstâncias presentes no fluido peritoneal, esteróides, citocinas, \nfatores de crescimento e fatores angiogênicos, podem interferir na \nfunção reprodutiva através de alteração da motilidade tubárea, \ncaptação ovular ou ovulação. A produção de fatores embriotóxicos \npelos implantes de endometriose pode estar relacionada com o \nestádio da doença (IZZO et al.,2000). \nAlterações inflamatórias observadas no fluido peritoneal de \nmulheres com endometriose incluem aumento do volume (MAHMOOD \net ai., 1991), elevação na população e atividade dos macrófagos \n(WEIL et ai., 1997; AKOUM et ai., 1995), assim como elevação nos \nníveis de citocinas e prostaglandinas (HALME et ai., 1989; RANA et \nai., 1996). \nAlguns estudos mostraram a ocorrência de variação desse \nvolume durante o ciclo menstrual (pico de 20ml no período ovulatório), \nnão tendo sido encontradas diferenças, quando essa medida foi \nrealizada na fase folicular média em pacientes férteis e naquelas \nportadoras de endometriose pélvica (DE LEON et ai., 1986, HANEY et \nai., 1991, KONINCKX et ai., 1998). \nSegundo ISHIKAWA et ai. (1993), o fluido peritoneal de \npacientes com endometriose contém grandes quantidades de radicais \nlivres e reduzidas concentrações de seu varredor, a enzima \nsuperóxido dismutase (SOO). Mulheres portad oras de endometriose \n\nVivian Ferreira do Amaral 10 \nIntrodução \ntêm consideráveis quantidades de eritrócitos (glóbulos vermelhos) no \nfluido peritoneal e, devido à isso, grande quantidade de heme \nproteínas e ferro, que catalisam a formação de radicais peróxido nos \ntecidos. Conforme referido por PORTZ et ai. (1991), injeção \nintraperitoneal de SOO é capaz de bloquear a toxidade dos radicais \nlivres e prevenir aderências em modelo animal. Baseando-se nessas \ninformações, TZENG et ai. (1997) construíram um experimento que \nconsistiu em cultivar embriões de rato em meio de cultura, \nsuplementado com concentrações de 10% de fluido peritoneal de \npacientes com endometriose em diferentes estádios e suplementados \nou não com SOO. As conclusões sugerem uma nítida correlação entre \no estádio da endometriose e o desenvolvimento embrionário. Quando\ncultivados com fluido de estádio Ili, ainda que suplementados com \nSOO, somente 60% dos embriões atingiram o estágio de blastocisto e \n83% no grupo controle normal; cultura com fluido do estádio Ili sem \nsuplementação de SOO não evidenciou nenhum embrião com \ndesenvolvimento adequado. Estudo realizado por SHANTI et al.(1999) \nconstatou que mulheres com endometriose pélvica são predispostas \nao aumento do estresse oxidativo. Esta alteração resulta da interação \ndos peróxidos lipídicos com as proteínas. Devido à maior ativação dos \nmacrófagos pelo processo inflamatório, decorrente da endometriose, \nacredita-se na possibilidade de importante alteração do mecanismo de \n\nVivian Ferreira do Amaral 11 \nIntrodução \noxidação pela presença de leucócitos no estrema endometrial, \noriginados pelos macrófagos (MURPHY et ai., 1998). \nRADICAIS LIVRES \nOs radicais livres (RL) são bioprodutos caracterizados pela \npresença de um número ímpar de elétrons desemparelhados na sua \nórbita externa. Com a perda desse elétron cria-se um novo RL, que irá \ndeflagrar uma reação em cadeia, lesando seriamente várias estruturas \ncelulares. São capazes de causar danos irreversíveis à membrana \nlipídica, às proteínas e aos ácidos nucleicos, acarretando acúmulo de \nmalondialdeídos, lipofuccina e ditirosina dentro das células (RILEY e \nBEHRMAN, 1991). \nCada molécula de RL é formada nas reações de óxido-redução \ne nas mitocôndrias das células (TAYLOR et al.,1986). Uma vez \nliberada a energia, o ATP regenera-se dentro da mitocôndria, por \nprocesso de redução do oxigênio, a respiração celular, que incorpora 4 \nátomos de hidrogênio e 4 elétrons ao 02, formando H20. Apesar de 95 \na 98% do oxigênio ser consumido dessa forma, durante o curso do seu \nmetabolismo normal, ele pode aceitar menos de 4 elétrons para formar \nmetabólicos oxigenados que são citotóxicos, em 2 a 5%, determinando \nassim a formação dos RL (Figura 1) . As reações de Haber-Weiss ou \n\nVivian Ferreira do Amaral 12 \nIntrodução \nde Fenton participam deste processo dependendo respectivamente da \npresença de ferro ou cobre ou a partir do superóxido não metabolizado \npelas enzimas SOO, catalase e glutationa peroxidase que aceleram \nesse mecanismo.(WATANABE, 1990; BABBS e STEINER, 1990). \n\nVivian Ferreira do Amaral 13 \nIntrodução \n2a5% \nFe+2\n95 a 98% \n(S U PERÓXIDO) \nSOD (Zn/Cu ou Mn) \nGSH-PEROXlDASE \nH20+GS-S \n1 < \n� (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO) \nCATALASE \nH20 \nREAÇÃ�FENTON \n(RADICAL HIDROXILA) \n0 \nFigura 1 - Seqüência de formação dos RL responsáveis pela \ninflamação e utilizados pelo organismo para matar bactérias dentro \ndas células \"varredoras\" do sistema imunológico (fagócitos). Sua \npresença em excesso nos processos inflamatórios, angiogênicos entre \noutros, acrescenta maior dano aos tecidos. Com isso, as ligações \nentre os átomos deixam os elétrons não pareados a partir de reações \nbioquímicas (Fenton ou Haber Weiss). A figura também demonstra a \nação das enzimas superóxido dismutase (SOO) que transforma os \nradicais superóxido em peróxido de hidrogênio, a glutationa \nperoxidase (GSH) que reduz o peróxido de hidrogênio em água e, a \ncatalase decompõe o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. \n\nVivian Ferreira do Amaral 14 \nIntrodução \nMETABOLISMO DOS RADICAIS LIVRES E PEROXIDAÇÃO \nLIPÍDICA \nOs principais RL gerados são: o radical superóxido (-02), \nperóxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (-OH) e o oxigênio \nsinglet (102). \nO radical superóxido tem como fonte os ácidos graxos \npoliinsaturados presentes na dupla camada de lipídios das membranas \ncelulares que, perdendo elétrons, propiciam lesões nessa membranas \ne levando à morte celular (apoptose). Essas alterações na estrutura \nlipídica denominam-se lipoperoxidação ou peroxidação lipídica e são \naceleradas pela enzima superóxido dismutase (SOO) (YUTTING et ai., \n1990; HALLIWELL et ai., 1991). \nOs RL em contato com os fosfolipídios e os ácidos graxos \npoliinsaturados das membranas celulares, as lipoproteínas e o \ncolesterol provocam diversas alterações na estrutura e no \nmetabolismo daquelas membranas e da própria célula. Além disso, \nalterações em moléculas de proteínas e polissacarídeos influem \nnegativamente em diversos processos vitais como as ligações de \nproteínas e lipídios, inativação de receptores e enzimas da membrana, \n\nVivian Ferreira do Amaral 15 \nIntrodução \nlesões na estrutura do DNA entre outros (CASCIO e \nWASSERMAN,1981; BRANDYe DAVIDSON,1990). \nA peroxidação lipídica é conhecida pela atuação nos processos \ninflamatórios e de aterogênese entre outros (A YRES et ai., 1998; \nMURPHY et ai., 1998). \nA mensuração da capacidade de oxidação de LDL, após \nisolamento do fluido peritoneal, determina a susceptibilidade aos \nmetais pesados. Após oxidação, as proteínas de baixa densidade \n(LDL), a partir dos macrófagos ativados, são convertidas em células \nesponjosas (SHANTI et ai., 1999). \nOs resultantes de peroxidação de ácidos graxos ou colesterol \nsão mensurados através da fração do malondialdeído (MOA) e do \noxisterol determinado pelo Colest - 3,5 - dieno - 7 - ona (CSD) \n(SUBBIAH et ai., 1993; TANG et ai., 1996). \nApesar de ser a lipoperoxidação a lesão mais devastadora \nprovocada pelos RL, inúmeras outras surgem após o aumento \ndaquelas espécies oxigenadas. Como a lipoperoxida ção destrói \ndiretamente os fosfolipídios da membrana celular, provocando \nextravasamento do conteúdo citoplasmático, disfunção do transporte \ntransmembrana, culminando com a morte celular, seus efeitos são \nreconhecidamente patogênicos, a curto e a longo prazo. \n\nVivian Ferreira do Amaral \nE$ \nLIPOXIGENASE-15 � \n1t \nPeroxidação \nlipídico \nOxister6is \n16 \nIntrodução \n1 PEROXINITRITO \nÓxido \nNítrico \niliJD lsuPERÓXIDO 1 \nRAt>ICAL \nTIROSINA\n4'Ghr li MIELOPEROXIt>ASE \nFigura 2 - Alterações decorrentes do estresse oxidativo levando ao \naumento da capac idade de peroxidação de ácidos graxos e \ncolesterol \nDiante das evidências que confirmam a importância dos radicais \nlivres e do estresse oxidativo na etiologia de inúmeros processos \npatológicos, a determinação do perfil oxidativo de cada paciente é de \ngrande valia para se estabelecer a terapêutica adequada e controle da \npatologia (RIHLEY e BEHRMAN, 1991; ROSENFELD, 1998). \n\nVivian Ferreira do Amaral 17 \nIntrodução \nASPECTOS REPRODUTIVOS E ROS \nUm ambiente oxidativo, promovido pela presença de RL, pode, \nteoricamente, inibir reações importantes para o processo reprodutivo \nlevando ao prematuro envelhecimento oocitário (RILEY e \nBEHRMAN, 1981). \nEstudos específicos sobre os efeitos fisiológicos da idade da \nmulher na qualidade dos oócitos vêm sendo realizados a partir da \nteoria proposta por HARMAN (1972). Segundo o autor, o \nenvelhecimento dos organismos ocorre devido ao acúmulo de RL que \ninduz danos celulares irreversíveis. De fato, os efeitos da idade sobre \nos índices de sucesso dos programas de fertilização in vitro (HUGHES \net ai., 1989; CORTOPASSl,1990) e as evidências da senescência \noocitária contornada nos programas de ovodoação (SAUER et ai., \n1990), colocou em foco a fisiologia do envelhecimento oocitário como \nevento inexorável, que, no entanto não afeta todas as mulheres nem \nos oócitos de uma mesma mulher. Pode afetar mulheres jovens que \ninexplicavelmente apresentam índices de gestação semelhantes \nàqueles de mulheres próximas do fim da vida reprodutiva (EZRA et ai., \n1992). Nesse sentido, estudos sobre a senescência celular em vários \ntecidos humanos têm demonstrado numerosos mecanismos universais \nenvolvidos no envelhecimento, trazendo evidências em relação à \n\nVivian Ferreira do Amaral 18 \nIntrodução \nimportância dos RL nesse processo (RILEY e BEHRMAN,1981; EZRA \net ai., 1992; FUJIWARA et ai.; 1993) \nAs mitocôndrias contêm os complexos respiratórios e as \nenzimas da oxidação de ácidos graxos. Desempenham papel central \nna geração de RL durante a produção de energia na fosforilação \noxidativa. Segundo TURRENS e BOVERIS (1980), cada mitocôndria é \ncapaz de gerar RL/dia durante a fosforilação oxidativa normal, e \nqualquer alteração nesse mecanismo irá comprometer o transporte \ndos elétrons ao receptor final - o oxigênio, propiciando maior elevação \ndos níveis de RL dentro da mitocôndria. Acredita-se que a idade pode \nestar relacionada a essas alterações (COOPER et ai., 1992). \nA hipótese de renovação celular nesses tecidos estar associada \ntambém à renovação das mitocôndrias e conseqüente \ncomprometimento da varredura dos RL gerados, conduziu a estudos \nsobre o DNA mitocondrial (mtDNA) (CORTOPASSI e ARNHEIM, \n1990). Esses estudos revelaram que o mtDNA acumula mutações com \na idade em várias espécies. Essas mutações, em grande parte \ndeleções, afetam a função dos complexos enzimáticos envolvidos na \nfosforilação oxidativa e a produção de RNA transportador e RNA \nribossômico necessários para a expressão do mtDNA. \nEm mulheres com endometriose pélvica, ocorre processo \ninflamatório crônico intraperitoneal associado à infertilidade mesmo na \n\nVivian Ferreira do Amaral 19 \nIntrodução \nvigência de função ovulatória normal e evidente alteração anatômica \nem tuba uterina, local, onde ocorre a fertilização (EVERS, 1995; ARICI \net ai, 1999; IZZO et al.,2000). O contato do fluido peritoneal com os \nimplantes de endometriose, ocasionando alterações súbitas desse \nfluido e das células constituintes do mesmo, parecem influenciar a \nfunção reprodutiva (BADAWY et ai., 1984; BARTOSIK, 1985; \nARICI, 1999). São necessários estudos prospectivos e randomizados \npara determinar as alterações da peroxidação lipídica e dos RL nos \ndistúrbios da fertilidade para se determinar a verdadeira alteração por \neles gerados na função reprodutiva. \n\n2 OBJETIVO \n\nVivian Ferreira do Amaral 21 \nObjetivo \nO objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de peroxidação \nlipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose \npélvica comparado àquele obtido em mulheres normais através dos \nníveis de CSD, MOA e MDA/Cu2+_ \n\n3 CASUÍSTICA E MÉTODOS \n\nVivian Ferreira do Amaral 23 \nCasuística e métodos \nA. CASUÍSTICA\nForam selecionadas 32 mulheres atendidas nos ambulatórios da \nClínica Ginecológica do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, \nHospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da \nUniversidade de São Paulo (HC-FMRP). Todas as mulheres \nselecionadas foram informadas dos procedimentos antes da sua \nrealização, das quais se obteve autorização prévia por escrito. Foi \nmantido sigilo de sua identidade. O presente estudo foi autorizado pela \nComissão de Normas Éticas e Regulamentares dessa instituição de \nacordo com o Processo HCRP número 5775/99. \nO estudo foi prospectivo, com 2 grupos de pacientes: \nGrupo endometriose - Composto por 17 mulheres portadoras \nde endometriose pélvica e infertilidade. \n\nVívían Ferreira do Amaral 24 \nCasuística e métodos \nGrupo controle - Representado por 15 mulheres sem \nendometriose pélvica submetidas a laqueadura tubária bilateral \nA 2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO \nGrupo endometriose \n• ausência de qualquer tratamento clínico prévio à laparoscopia\nnum período de, no mínimo, 6 meses;\n• ausência de tratamento clínico ou cirúrgico da endometriose;\n• presença de infertilidade feminina;\n• diagnóstico de endometriose pélvica comprovada por \nlaparoscopia e por biópsia;\n• presença de fluido peritoneal em cavidade abdominal durante a\nlaparoscopia;\n• idade superior a 18 anos e inferior a 40 anos;\n• Ausência de uso de antiinflamatório (hormonal e não hormonal)\npelo menos 1 semana antes da coleta do fluido peritoneal.\n\nVivian Ferreira do Amaral 25 \nCasuística e métodos \nGrupo controle \n• ausência de endometriose pélvica no momento da laparoscopia;\n• ausência de patologias ginecológicas;\n• ausência de dor pélvica na forma de dismenorréia ou algia\npélvica crônica;\n• presença de fluido peritoneal em cavidade abdominal durante a\nlaparoscopia;\n• Ausência de uso de antiinflamatório (hormonal e não hormonal)\npelo menos 1 semana antes da coleta do fluido peritoneal.\nA.3 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA POPULACIONAL\nA idade das mulheres portadoras de endometr iose pélvica \nvariou de 22 a 37 anos, com média de 31.1± 4.7 anos. A idade das \nmulheres do grupo controle variou de 27 a 38 anos, com média de \n34.4 ± 3.0 anos (p>0.05). \n\nVivian Ferreira do Amaral 26 \nCasuística e métodos \nB. MÉTODOS\nB.1 LAPAROSCOPIA\nAs amostras de fluido peritoneal eram obtidas durante a \nlaparoscopia realizada na fase folicular do ciclo menstrual. O fluido \nperitoneal era aspirado do espaço uterovesical anterior e fundo de \nsaco posterior com cânula específica. Todo fluido peritoneal presente \nera aspirado, objetivando-se obter pelo menos 4 mL de fluido. Não \nhouve nenhuma instilação de líquido em cavidade abdominal. Após \ncoleta, o fluido peritoneal era centrifugado a 2500 rpm (1900 x g), \ndurante 1 O minutos, de acordo com a padronização técnica do \nlaboratório de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia \ne Obstetrícia (FMRP-USP). Em seguida, o sobrenadante era pipetado \ne aliquotado em tubos de ensaio (vacuteinel) secos e estocados a \n- aoºc até o momento da análise laboratorial.\n\nVivian Ferreira do Amaral 27 \nCasuística e métodos \nB.2 - ESTADIAMENTO DA ENDOMETRIOSE PÉLVICA DA\nAMERICAN SOCIETY FOR REPRODUCTIVE MEDICINE (ASRM) \nREVISADA EM 1996 \nEm mulheres com endometriose pélvica, a doença era estadiada \nem quatro graus diferentes de acordo com a Classificação da \nAmerican Society for Reproductive Medicine, revisada em 1996 \n(Figura 3). Em seguida, foram biopsiados fragmentos de lesões \ncaracterísticas, os quais eram submetidos à avaliação histológica \nposteriormente. \nCom relação ao estadiamento da doença o Grupo endometriose \nera composto por oito mulheres com endometriose estádio 1, quatro \nmulheres estádio li, sete mulheres estádio Ili e duas mulheres estádio \nIV (Figura 4). \nNo Grupo controle, a laqueadura tubária bilateral, via \nlaparoscópica, era realizada pela técnica do anel de YON somente \napós a coleta do fluido peritoneal. O fluido era aspirado antes de \nqualquer procedimento para evitar a presença de sangue e era \ncentrifugado e estocado a -B0ºC. \n\nVivían Ferreira do Amaral \nEstádio I (mínima) 1-5\nEstádio II (leve) 6-15\nEstádio m (moderada) 16-40\nEstádio IV (grave) >40\n1 \nENDOMEI'RI� <lcm \nSuperfiàal 1 \nProfunda 2 \nD superficial 1 \n_j \nProfuma 4 \n6 Esuperfidal 1 \nProfunda 4 \nOBIJ'IERAÇÃO DO \nFUNDO \nDE SAa> PO!ITERIOR \nADERÊNCIAS < 1/3 Envoh-ido \nDMembranosa 1 \n-�\nDensa 4 \n5 E Membrnnosa 1 \nDensa 4 \nDMembranosa 1 \n1 \nDensa 4* \nE Membrnnosa 1 \nDensa 4* \nCasuística e métodos \nEscore: Estadiamento:\nObs:\nTratamento cirúrgico\nSeguimento proposto:\n1-3cm >3cm \n2 4 \n4 6 \n2 4 \n16 20 \n2 4 \n16 20 \nPardal 1 \n4 1 40 \n1/3 - '1/3 Fnvdvidos > 113 Envolvidos \n2 4 \n8 16 \n2 4 \n8 16 \n2 4 \n8* 16 \n2 4 \n8* 16 \n*Se as fimbrias tubáreas estiverem totahnente envolvidas por aderências, mude o escore para 16.\nPorcentagem de implantes : \n• Lesões Vermelhas (lesões claras, vermelhas, rosadas, em chama, vesículas) ...\n28 \n• Lesões Brancas ( brancas, amareladas, marrons, defeitos peritoneais).... Total 100% \n• Lesões Pretas (pretas, depósito de hemossiderina e azuis) ...\nEndometriose adicional: ________ _ \nE Usar em caso de trompas D \ne ovários normais \nPatologias associadas: _______ _ \nE Usar em caso de trompas D \n� \n-J)Á \nFigura 3 - Classificação da ASRM, revisada em 1996. \n\nVivian Ferreira do Amaral \n10% \n33% \n19% \n29 \nCasuística e métodos \n0 Estádio I \nO Estádio II \nD Estádio III \nO Estádio IV \nFigura 4 - Classificação das mulheres com endometriose pélvica \n(Grupo endometriose) \n8.3 BIÓPSIAS \nAs lesões suges tivas de endometriose pélvica foram biopsiadas \ndurante o procedimento la paroscópico. A seguir, o material era imerso \nem formal e analisado no setor de Patologia do HCFMRP-USP para \nconfirmação diagnóstica o seja, a presença, entre outros, de \nglândulas e/ou estromas e'ldomet i ais (Figura 5 ). \n\nVivian Ferreira do Amaral 30 \nCasuística e métodos \nFigura 5 - A seta delimitada pela letra A, ilustra a presença de \nestroma em tecido de endometriose. A letra B, ilustra a presença de \nglândula bem diferenciada e a C , depósito de hemossiderina. \nB.4 ANÁLISE DO FLUIDO PERITONEAL\n. A análise do fluido peritoneal foi realizada na Superintendência \nde Pesquisa do Pró Sangue da Universidade de São Paulo (USP). O \npotencial de peroxidação lipídica (PLPP) foi avaliado a partir da \nutilização do cobre na formação de substâncias reativas ao ácido \ntiobarbitúrico (TBARS). \n\n4 RESULTADOS \n\nVivian Ferreira do Amaral 32 \nResultados \n4.1 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA PELOS TBARS \nNa tabela I são mostrados os valores percentis dos níveis de CSD, \nMOA e MDA/Cu\n+2. Não observamos diferença nos níveis de MOA em \nquaisquer dos grupos (p=0.09). \nA adição de cobre (MDA/Cu +2) promoveu aumento significativo do \nfenômeno oxidativo em ambos os grupos conforme observado nas Figuras 5 \ne 6. Entretanto esse aumento foi similar nos 2 grupos conforme se observa \npela inclinação das retas presentes nas respectivas Figuras e pela \nporcentagem de incremento individual (Figura 7). \nOs níveis de CSD não foram diferentes entre os Grupos endometriose e \ncontrole (Tabela I e Figura 8). \n\nVivian Ferreira do Amaral 33 \nResultados \nTabela 1 - Distribuição das variáveis conforme os percentis (P25, PSO e P75) \ne valores de p dos testes de Mann-Whitney para os Grupos endometriose e \ncontrole \nVARIÁVEL GRUPO ENDOMETRIOSE GRUPO CONTROLE p \nP25 P50 P75 P25 P50 P75 \nCSD O.II\nl\\,ID\nA 0.05\nl\\,IDA/Cu2+ O. 10\n1,00 \n0,80 \n0,60 \n0,40 \n0,20 \n0,00 \n0,00 \n0.24 0.32 \n0.07 0.36 \n0.34 0.54 \n0.14 0.25 \n0.02 0.04 \n0.03 0.21 \n0.30 \n0.10 \n0.47 \n0.50 \n0.09 \n0.50 \n♦ \ny \n= 0,7481x + 0,2147 \nR = 0,3028 \n0,20 0,40 0,60 \nMDA (nmol/ml) \nFigura 5 - Correlação positiva entre os níveis de MOA e MDA/Cu2+ \nno \nGrupo endometriose (p<0.01) \n\nVívian Ferreira do Amaral 34 \nResultados \n0,80 y = 1,9604x + 0,151 \nà R2 = 0,3161 \nP<0.01 \n:J' 0,60 \nz -\nN 0,40 \n0,20 � \n4 \n0,00 \n0,00 0,10 0,20 0,30 \nMDA(Nm/ml) \nFigura 6 - Correlação positiva entre os níveis de MOA e MDA/Cu2+ no \nGrupo controle (p<0.01) \n\nVivian Ferreira do Amaral 35 \nE ::::: o E \nResultados \n0.8 \n0.7 À \n....\n0.6 \n♦ .... 0.5 •• ... ...  \n \n0.4 \n♦ \n0.3  \n♦ \n0.2 ... ♦ ...... \n♦ ... \n0.1 ♦ \n•• ... ... ... \n•f•:·\n♦ \no.o ♦ ♦ À .... A ... \nEndometriose Controle Endometriose Controle \nMDA MDA/Cu2+ \nFigura 7 - Distribuição dos níveis de MDA e MDA/Cu2+ nos Grupos \nendometriose e controle \n\nVívían Ferreira do Amaral 36 \nResultados \n• \n2000 • \n-\n� o \ne 1500 • \nQ) \nC) \nQ) \no a. \n• \n1000 • \n• • \n500 • \n••• • \no •• • \nGrupo A Grupo B \nFigura 8 - Porcentagem de incremento do MOA com adição do cobre \nentre as mulheres do Grupo endometriose e controle (p==0.37) \nObs: o traço horizontal representa a mediana \n\nVivian Ferreira do Amaral 37 \nResultados \n0.75 \n_ 0.50 \nE \n0.25 \n■ ■ ■ \n••••• ■ \n•••••• \nEndometriose \ns Controle \n0.00----------------\nCSD \nFigura 9 - Níveis de CSD nos Grupos endometriose e controle \nObs: o traço horizontal representa a mediana \nComparando-se os níveis de MOA em mulheres portadoras de \nendometriose pélvica com o estadiamento da doença, observou-se que a \nmediana foi de 0.07 nmol/mL em mulheres com endometriose estádio 1, 0.09 \nnmol/mL em casos de endometriose estádio li, 0.04 nmol/mL em casos de \nendometriose estádio Ili e 0.31 nmol/mL em endometriose estádio IV, sem \n\nVivian Ferreira do Amaral 38 \nResultados \ndiferença estatística entre os níveis de MOA nos diferentes estádios da \ndoença. \nAo correlacionarmos os níveis de MOA/Cu2+ e CSO no fluido peritoneal \nde mulheres com endometriose pélvica e o estadiamento da doença, \nobservamos que a mediana desse marcador foi de 0.48 nmol/mL e 0.12 \nµg/mL, respectivamente, no estádio I da doença, 0.52 nmol/mL e 0.24 µg/mL \nno estádio li, foi de 0.15 nmol/mL e 0.23 µg/mL no estádio Ili e 0.22 nmol/mL \ne 0.30 µg/mL, respectivamente, no estádio IV sem diferença estatística nos \ndiferentes estádios da endometriose (p=0.27 e p=0.16). \nAvaliamos separadamente a presença de lesões típicas ou \npigmentadas (negras), sugestivas de doença crônica e atípicas ou não \npigmentadas (vermelha), sugestivas de doença ativa. Não observamos \nrelação de lesões predominantes (típicas ou atípicas) com os níveis de CSD, \nMOA e MOA/Cu2+ (p = ns).\nNão encontramos relação dos níveis de MOA com a idade de mulheres \ncom endometriose pélvica (p=0.33). Em relação ao CSO, observamos relação \nnegativa (p=0.02). \nEm mulheres do Grupo controle, houve relação positiva da idade com \nníveis de MOA e nenhuma relação com os níveis de CSO (p=0.02 e p=0.39, \nrespectivamente). \n\n5 DISCUSSÃO \n\nVívían Ferreira do Amaral 40 \nDiscussão \nOs principais fatores que levam as mulheres com endometriose \npélvica à infertilidade ainda não estão bem determinados (ARICI et \nal.,1997; MURPHYet al.,1998). \nÉ evidente que a presença dessa moléstia em estádios mais \navançados leva a alterações mecânicas da anatomia pélvica e \nconseqüentemente à infertilidade. Porém em estádios mais leves da \ndoença ainda existem muitas controvérsias (BUYALOS e AGARWAL, \n2000). \nA avaliação destas mulheres deve ser individualizada de acordo \ncom o estádio da doença, localização, idade e duração da infertilidade. \nA diminuição do potencial reprodutivo da mulher com a idade \npode ser explicada pelas alterações na foliculogênese e crescimento \noocitário, resultando alterações das divisões meióticas e obtendo-se, \nentão, baixa qualidade oócitária e embrionária (JAMMY e \n\nVivian Ferreira do Amaral 41 \nDiscussão \nMENEZZO.,1996; VOLARCIK et ai., 1998; SELAM e ARICI, 2000; \nPELLICER et ai., 2000). \nPesquisas recentes sugerem que a diminuição do potencial \nreprodutivo começa a partir de 30 anos com declínio gradual até os 35 \nanos e se intensifica após os 37 anos de idade (SCOTT et ai., 1996; \nTEMPLETON., 1998). \nCom as novas teorias envolvendo o estresse oxidativo e \nenvelhecimento celular, a participação das espécies reativas ao \noxigênio poderia ser um dos fatores determinantes do menor resultado \nreprodutivo de algumas pacientes, independente de idade mais \navançada. A comprovação da participação dos mesmos em mulheres \ninférteis com endometriose pélvica possibilitaria nova terapêutica em \nnível enzimático independente da severidade da doença. Com isso, as \nmulheres inférteis com idade abaixo de 35 anos e com insucessos \nrepetidos em relação a tentativas de gravidez, independente do \nestadiamento e localização da doença, seriam favorecidas. Em nosso \nestudo, a idade das mulheres inférteis com endometriose pélvica não \ndemonstrou relação direta com o potencial de peroxidação lipídica. \nNossa casuística é pequena, mas, a partir desses achados, não se \npode predizer que o processo inflamatório seja o principal responsável \npor lesões teciduais e envelhecimento celular. Não há relatos na \nliteratura para compararmos nossos achados. \n\nVivian Ferreira do Amaral 42 \nDiscussão \nEm 1999, OTA et ai. pesquisaram o papel dos radicais livres no \nendométrio de mulheres com endometriose pélvica. A enzima óxido \nnítrico sintase (NOS) endotelial foi encontrada nas células epiteliais \nglandulares do endométrio, principalmente na fase secretória média. \nObservaram que a enzima superóxido dismutase (SOO) era \nencontrada de maneira diferente no endométrio de tais pacientes, \nconforme a fase do ciclo. Sugeriram que o aumento de radicais livres \ntem um papel importante no desenvolvimento da endometriose. Ainda \nsão necessários estudos para elucidar o papel dessas enzimas na \ninfertilidade. \nKONINCKX (1994) descreveu a endometriose superficial como \nfenômeno habitual e normal na vida da mulher, e o desenvolvimento e \nevolução dessa doença ocorreriam, em algumas mulheres, mediante \nalterações imunológicas. \nA resposta imune inadequada altera a função de remover os \ndebris menstruais oriundos do refluxo, propiciando o desenvolvimento \ne progressão da doença, estimulando os fatores peritoneais \n(SENTURCK e ARICI, 1999). \nA resposta celular imune inicia-se pelos antígenos processados \npelos macrófagos, ativando linfócitos T (DMOWSKI, 1995; FERRIANI \net al.,2000). Após a diferenciação e crescimento dessas células, \norigina-se uma população de linfócitos citolíticos capaz de atacar e \n\nVivian Ferreira do Amaral 43 \nDiscussão \ndestruir diretamente os antígenos estranhos. Alguns estudos segerem \nque a citotoxicidade celular do fluido peritoneal de mulheres com \nendometriose pélvica está aumentada nos estádios I e li da doença, e \ndiminuída nos estádios Ili e IV devido ao processo inflamatório crônico \npresente em estádios mais avançados (HALME et ai, 1984; HANEY et \nai, 1987; D'HOOGE et ai.; 2001). Essa reação de defesa é amplificada \npela produção de diversos fatores inflamatórios locais como as \nprostaglandinas, interleucinas, leucotrienos e outros fatores que \naumentam a resposta imunológica, tendo implicação na fisiopatologia \nda infertilidade em mulheres portadoras de endometriose \n(DUNSELMAN et al.,1988; MULAYIM e ARICl.,1999; 1220 et al.;2000; \nD'HOOGHE et al.;2001) \nPermanece ainda sem resposta a partir de qual estádio a \nendometriose começa a ser considerada doença, manifestando \nsintomas e necessitando de terapêutica adequada (BROSENS, 1997). \nAtualmente acredita-se que a endometriose superficial é condição \nfisiológica e intermitente da mulher no menacme, enquanto que a \nevolução da doença, caracterizada como endometriose profunda, e os \ncistos ovarianos endometrióticos seriam abordados como doença \nverdadeira (VERCELLINI et ai., 1996; KONINCKX, 1994,1998). \nA presença da doença em mulheres assintomáticas e sem a \nvisualização de seus implantes, durante o procedimento cirúrgico, \n\nVivian Ferreira do Amaral 44 \nDiscussão \nforam descritas por MURPHY et ai. (1986) e NISOLLE e DONNEZ \n(1997). Esses autores biopsiaram peritônio considerado normal \ndurante o ato operatório e observaram resultados compatíveis com a \ndoença, sugerindo, assim, incidência mais elevada da endometriose \ndo que se supõe. As divergências persistem, envolvendo a história \nnatural da endometriose, a sua sintomatologia, extensão, localização e \nestadiamento da doença (JANSEN e RUSSEL, 1986; REDWINE et ai., \n1987; HOUSTON et ai., 1988; FEDELE et ai., 1992; EVERS, 1998; \nBATT, 1999). \nO fluido peritoneal é relevante nas pacientes portadoras de \nendometriose principalmente na fase folicular, pois revela aumento do \nnúmero de macrófagos mais acentuado nesta fase (ARICI et ai., 1997; \nKONINCKX, 1998). O aumento da ativação no nível dos macrófagos \npromove maior secreção local de diversos produtos, entre eles, fatores \nde crescimento e citocinas, os quais estariam envolvidos no \nmecanismo de implantação e posterior desenvolvimento e proliferação \ndos implantes de endometriose. Tais alterações poderiam contribuir no \nmecanismo da infertilidade devido ao exsudato intraperitonial de causa \ndesconhecida, mesmo na presença de função ovulatória normal \n(HALME et ai., 1982; DUNSELMAN et ai., 1988; KHAMSE et ai; 2001). \nAs células natural killer teriam a função diminuída, explicando, assim, \no aparecimento de lesões não pigmentadas em estádios iniciais da\n\nVívían Ferreira do Amaral 45 \nDiscussão \ndoença. Essas lesões não possuem áreas de esclerose circundando­\nas. São morfologicamente ativas e sua incidência regride com o \navançar da idade (REDWINE, 1987b; KONINCKX et ai., 1991; \nOOSTERLY NCK et ai., 1992). \nA extensão dos implantes endometriais são inversamente \nproporcionais ao processo inflamatório crônico intraperitoneal \ncaracterizado pela quantidade de fluido peritoneal, e número de \nleucócitos polimorfonucleares (HANEY et ai., 1984; ARICI et ai., 1997). \nO fluido peritoneal normal contém entre 0,5 a 2,0 x 10 6/ ml de \nleucócitos, dos quais mais de 85% são macrófagos (fagócitos \nmononucleares), 8% leucócitos e 2% polimorfonuclear leucócitos. Os \nmacrófagos denotam ação efetora de células mediadores de \ncitotoxidade de diferentes células alvo (HANEY et ai., 1984; BADA WY \net al.,1984; HO et ai., 1997; KONINCKX et ai., 1998; 1220, 2000). Em \nestudo anterior (AMARAL, 1999) pudemos comprovar que o volume de \nfluido peritoneal nas pacientes com endometriose pélvica foi \ninversamente proporcional ao estadiamento da doença, enquanto que, \nno Grupo controle, muitas vezes tivemos que excluir pacientes do \nestudo pela ausência de fluido peritoneal. Alguns estudos também \nobservaram essa correlação inversa (HANEY et ai., 1984; BADAWY et \nai., 1984; FISK e TAN, 1988). \n\nVívían Ferreira do Amaral 46 \nDiscussão \nPela importante participação do fluido peritoneal na fertilidade, \nforam realizadas novas pesquisas abordando o papel do estresse \noxidativo e algumas espécies reativas ao oxigênio nesse \ncompartimento tem sido publicadas (WANG et ai., 1997; MURPHY et \nai., 1998a; SHANTI et ai., 1999). \nMURPHY et ai. (1998b), levantaram a possibilidade do \ndesenvolvimento da endometriose a partir do estresse oxidativo. \nComo conseqüência, haveria danos oxidativos das células vermelhas \nsangüíneas e das células endometriais em processo de apoptose. Os \nrestos de tecidos endometriais agiriam como recrutamento e ativação \nde fagócitos mononucleares. Na vigência de endometriose pélvica, \nhaveria resposta inadequada a esses estímulos em nível de \nreceptores de macrófagos varredores sem comprometer sua resposta \nsecretora. \nA ativação dos macrófagos na cavidade peritoneal seria \nresponsável pelo estresse oxidativo determinado pela peroxidação dos \nlipídeos, seus produtos de degradação e os produtos formados pela \nsua interação com o LDL e outras proteínas. Os lipídeos peroxidados, \nao se submeterem à decomposição, geram produtos como o \nmalondialdeído (MOA). Esses produtos reagem com os grupos aminas \ndos resíduos de lisina das proteínas. Os grupos amina dos lipídeos \ntambém são vulneráveis a estas alterações. Com isso, estes lipídeos \n\nVivian Ferreira do Amaral 47 \nDiscussão \npassam a ser estranhos e começam a desencadear resposta \nantigênica formando então anticorpos (HALLIWEL, 1989; \nLIPPMAN, 1989). \nAs lipoproteínas presentes no fluido peritoneal apresentam \nbaixos níveis de vitamina E que é uma potente agente antioxidante \n(MURPHYa et ai., 1998). \nConsiderando as múltiplas teorias sobre a etiopatogenia da \ndoença, aliados à diversidade de comportamento, NISOLLE e \nDONNEZ (1997) propuseram a subdivisão da endometriose em três \nformas diferentes que podem se correlacionar. \nA endometriose peritoneal, determinada a partir da regurgitação \ntubária de fragmentos endometriais e posterior implantação no \nperitônio, teria, como conseqüência, neovascularização local, \nproliferação e migração celular, originando as lesões vermelhas. A \nseguir, o processo inflamatório e a fibrose decorrentes determinariam \na formação das lesões negras. Subseqüentemente, as glândulas e/ou \nestromas residuais, subperitoneais originariam as lesões brancas, \ncicatriciais. A segunda forma proposta seria a endometriose ovariana, \noriginada em 90% dos casos pela invaginação do córtex, após \nacúmulo de debris menstruais e sangramento dos implantes \nlocalizados em peritônio e ovário (NISOLLE e DONNEZ, 1997). \nReferem que a doença ovariana é representada pela invaginação da \n\nVivian Ferreira do Amaral 48 \nDiscussão \nmetaplasia do epitélio celômico. BROSENS et ai (1994) acreditam que \na endometriose ovariana tem sua origem nos implantes superficiais \nque em contato com a superfície ovariana através das aderências, e \nmantêm-se nesse local. Posteriormente, ocorre o sangramento desses \nimplantes e a progressiva invaginação do córtex ovariano. A terceira \nforma seria a endometriose de septo retovaginal, também denominada \nadenomiose externa. Muitas vezes surge como a ponta de um iceberg \nna visualização do fundo de saco de Douglas. É a forma mais \nprofunda e infiltrativa da doença e tem sua origem a partir da \nproliferação e fibrose da musculatura lisa. Sendo assim, originar-se-ia \nde remanescentes müllerianos existentes naquela musculatura, que se \ntransformariam em glândulas e/ou estrema, formando nódulos locais. \nEssas diferentes formas da doença apresentam comportamento clínico \nvariado (ABRÃO et al.,1998, KONINCKX, 1998). Em nosso estudo não \nobtivemos nenhum caso de endometriose de septo retovaginal, \napenas as peritoniais e ovarianas. \nO desenvolvimento progressivo da endometriose, nos diversos \nlocais da pelve, com o passar dos anos inspirou REDWINE (1987a) a \navaliar a disseminação da doença entre grupos com faixa etária \nvariando de 16 a 52 anos. Não encontrou acometimento da doença em \nmulheres de idade mais avançada, mas observou maior incidência em \nnulíparas. A faixa etária das mulheres inférteis selecionadas para o \n\nVivian Ferreira do Amaral 49 \nDiscussão \nnosso estudo, variou de 22 a 37 anos, comprovando o estudo desse \nautor. A não correlação da intensidade da algia pélvica, infertilidade \ncom a localização e extensão da doença, continua alvo de inúmeras \ndiscussões (BUTTRAM, 1979; PERPER et al.,1995; DMOWSKl,1995, \nMATORRAS et ai., 1996; SCENKEN, 1992; VERCELLINI et ai., 1996; \nARICI et al,1997; BATT, 1999). \nA correlação entre a infertilidade, o estadiamento e a presença de \ndeterminados implantes ainda necessitam de maiores estudos, pois a \nnova classificação da ASRM foi proposta em 1997, portanto, muitos \nestudos encontram-se em seguimento. Canis et ai. (2000) encontrou \npredomínio de lesões vermelhas em mulheres inférteis e no menacme. \nConsideraram a presença desses implantes em maior porcentagem \ncomo bom prognóstico, ou seja, boa resposta no tratamento da \ninfertilidade. Em nosso trabalho não encontramos correlação da \ninfertilidade com qualquer dos diferentes tipos de implante \nendometriótico. Alguns pesquisadores (FEDELE et ai. 1990; \nBROSENS et ai.; 1994; PERPER et ai. 1995) não encontraram relação \nentre o estadiamento e o número de implantes endometrióticos, pois, \nna vigência de endometriose estádio 1 (mínima), pode-se encontrar \núnica ou diversas lesões atípicas disseminadas ou implantes não \nativos. Em nosso estudo também não encontramos correlação entre o \nnúmero dos implantes endometrióticos e o estadiamento da \n\nVivian Ferreira do Amaral 50 \nDiscussão \nendom etriose da ASRM (1997). Ao avaliarmos o potencial de \nperoxidação lipídica, representado pelo MOA e MOA/Cu2+ com o \nestadiam ento da doença, não encontramos relação entre ambos. \nSHANTI et ai. ( 1999) estudaram a presença de auto-anticorpos para \nMOA e LOL colesterol no soro de 36 mulheres com endometriose \npélvica e 16 mulheres normais submetidas a laqueadura tubária. Não \nencontraram correlação dos auto-anticorpos com o estádio, morfologia \nou sintomas da endometriose. Esses dados são semelhantes aos \nnossos achados. Com relação ao fluido peritoneal, não encontraram \nauto-anticorpos para três antígenos presentes no fluido. Os auto­\nanticorpos dos marcadores de estresse oxidativo estavam aumentados \nem mulheres com endometriose pélvica, comprovando o aumento do \nestresse oxidativo diante dessa enferm idade. Ao avaliarmos os níveis \nde CSO comparados à severidade da doença, não encontramos \nrelação. Não temos dados da literatura para discutir nossos achados. \nOs diferentes tipos de implante podem sugerir estádios diferentes \nda doença associados a fisiopatologias diferentes (FEDELE, 1990; \nVERCELLINI et ai., 1996; NISOLLE et al.,1993). \nAs fases do ciclo menstrual mais fidedignas em relação à \nvisualização de implantes parecem estar na fase folicular e na fase \nlútea precoces (KONINCKX et ai., 1991; REDWINE et ai., 1987a; \nMUZII et ai., 1997). \n\nVívian Ferreira do Amaral 51 \nDiscussão \nA coloração dos implantes refletem os achados hemorrágicos, \nvasculares, hemopigmentados e fibrose (BROSENS, 1997). As lesões \nnegras e brancas têm sido representadas como evolução da lesão \nvermelha, caracterizando assim um estágio mais crônico da doença \nalém da reação inflamatória local, após sangramento recorrente e \nconseqüente fibrose. Diversos estudos sugerem que, com o passar \ndos anos, ocorre decréscimo na incidência de lesões não \npigmentadas, principalmente as vermelhas (REDWINE, 1987b; \nNISOLLE et ai., 1993; BROSENS et ai., 1994). \nEm nosso estudo, ao avaliarmos os níveis do MOA e MDA/Cu2+\nno fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose pélvica e \nmulheres férteis sem endometriose, não observamos diferença entre \nos grupos. Entretanto encontramos intragrupo aumento dos níveis de \nMOA após adição do cobre MDA/Cu2+. O MOA é de extrema \nimportância na peroxidação lipídica pela sua toxicidade e capacidade \nde ligação entre lipídeos, proteínas e carboidratos. Portanto, a sua \ndetecção independente da adição de cobre em quantidades que levam \nà capacidade máxima de oxidação, reflete a capacidade de \nperoxidação decorrente das alterações ocasionadas pela própria \npatologia. Nosso estudo não revelou significância estatística, mas, \npelos resultados obtidos, observamos que o MOA demonstrou melhor \nas alterações fisiológicas pelos TBARS. Ao calcularmos a \n\nVivian Ferreira do Amaral 52 \nDiscussão \nporcentagem de incremento da adição de cobre nas amostras com \nMDA nos Grupos endometriose e controle, também não observamos \ndiferença estatística. Não há relatos na literatura para comparar \nnossos dados. Os trabalhos envolvendo endometriose e peroxidação \nlipídica utilizaram método diferente de avaliação de peroxidação \nlipídica pelos TBARS, embora sem significância estatística com \nrelação à endometriose (MURPHY et al.,1998c; POLAK et ai., 2000). \nOs estudos que avaliaram o MDA sérico, já utilizaram a adição do \ncobre em mulheres com e sem endometriose (MURPHY et al.;1998b) \nou em atletas amenorréicas e eumenorréicas pelos TBARS (TANG et \nai., 1998). \nEm 1999, POLAK et ai. realizou um estudo com avaliação do \nstatus antioxidante total (TAS) e MDA por outro método, embora com \no intuito de acelerar o processo de peroxidação no fluido peritoneal.\nOs grupos estudados foram mulheres inférteis com endometriose \nmínima e leve, mulheres com tumor ovariano benigno não inflamatório \ne mulheres com infertilidade sem causa aparente (ISCA). Encontraram \ndesequilíbrio entre a peroxidação lipídica e o sistema antioxidante no \nfluido peritoneal. Relataram aumento dos níveis de MDA tanto no \nGrupo com endometriose pélvica como no Grupo ISCA. Com relação \nao TAS, encontraram aumento do Grupo ISCA, mas sem diferença \nquando comparado com os demais grupos. \n\nVivian Ferreira do Amaral 53 \nDiscussão \nEncontraram, apesar da casuística limitada, valores \nsignificativamente elevados em pacientes com ISCA. Não encontraram \nno status antioxidante total um bom parâmetro para avaliação da \ninfertilidade. Concluíram que o desequilíbrio entre a lipoperoxidação e \no sistema antioxidade é um dos fatores determinantes da ISCA.\nEm casos de endometriose associada à infertilidade, fator \nimunológico e fatores genéticos ainda há muitas perguntas sem \nrespostas. Estudos experimentais têm procurado correlacionar o \nestresse oxidativo e as espécies reativas ao oxigênio com a toxicidade \nembrionária (GUÉRIN et ai., 2001 ). A presença de um fator preditivo \nda doença seria de grande valia nos casos de algia pélvica da e na \nobtenção de melhores alternativas em casos de infertilidade. \nAs espécies reativas ao oxigênio têm vida média muito curta. \nMesmo com os métodos mais sofisticados de leitura por \nespectofotometria spin as limitações ainda existem. A possível \navaliação da participação dos mesmos e posterior terapêutica \ndirecionada aos achados seria de grande valia para mulheres inférteis \ncom endometriose pélvica. \n\n6 CONCLUSÕES \n\nVivian Ferreira do Amaral \nA avaliação deste estudo permitiu-nos as conclusões \nrelacionadas abaixo. \n55 \nConclusões \n1 - O estádio da endometriose não demonstrou relação com o \npotencial de peroxidação lipídica (MOA, MDA/Cu2+, CSD). \n2 - A localização e a presença de implantes típicos ou atípicos, \nobservados nos casos de endometriose pélvica, não afetaram a \ncapacidade de peroxidação lipídica. \n3 -Os níveis de peroxidação lipídica pelos TBARS não são bons \nparâmetros de avaliação do fluido peritoneal. \n\n7 ANEXOS \n\nVivian Ferreira do Amaral 57 \nAnexos \nAnexo 1 \nPROTOCOLO PARA O PREPARO DOS TBARS \nMALONALDEÍDO (MDA) \n• Reagente TCA (àcido tricloroacético) a 20% para 100ml\nÁcido tricloroacético 20 gm \nDissolver o reagente em 100 mL de água destilada. A solução foi \nmantida em temperatura ambiente. \n• Solução de Sulfato de Cobre - 50 mM (Cu2+)\nDissolver 798 mg CuSO4 em 100ml de água. \nA solução é pouco sensível e foi estocada em garrafa de coloração \nâmbar para proteger da luz. \n• O.OS M de ácido sulfúrico (H2SO4)\nDiluir 2.8 mL de H2SO 4 com o reagente em água destilada. A seguir \nsão estocados à temperatura ambiente. \nPROTOCOLO METODOLÓGICO \nMALONDIALDEÍDO (MDA) \n♦ Pipetar 1 mL de fluido peritoneal (FP) em tubo de ensaio estéril\n(16 x 100 mm - 0.2 mL). As amostras devem ser analisadas ·em \ntriplicata 3 tubos/paciente. \n\nVivian Ferreira do Amaral 58 \nAnexos \n♦ Adicionar 1 OOµL de solução de sulfato de cobre a cada tubo\naliquotado e agitar.\n♦ Colocar em banho - maria à temperatura de 37ºC, durante 1 hora.\nEm seguida, retirá-las e deixar esfriar à temperatura ambiente.\n♦ Adicionar 2.5 ml do reagente de TCA a 20% para precipitar as\nproteínas (precipitado de coloração esbranquiçada). Misturar e\ndeixar à temperatura ambiente durante 5 -10 minutos.\n♦ Centrifugar a 3000 rpm, durante 6 minutos. Decantar o\nsobre nadante.\n♦ Adicionar 2.5 ml de 0,5 M de H2SO4 e agitar. Colocar em banho­\nmaria (0.5 ml) até fervura.\n♦ Preparar o Acetil bis dietil monoaldeído (TEOP) que é o composto\nformado na reação de peroxidação lipídica. É usado para fazer a\ncurva padrão.\nSOLUÇÃO STANDARD nos tubos -\nEtiquetar 2 tubos O, três tubos 200 e três tubos 400. \n♦ Acrescentar 400ml DE H2O NOS TUBOS O\n♦ Acrescentar 200ml de TEOP e 200ml H2O nos tubos 200\n♦ Acrescentar 400ml de TEOP nos tubos 400\n♦ Agitar todos os tubos.\n♦ Acrescentar 2.5 ml de 0.05M H 2SO4 a cada tubo standard acima.\n\nVivian Ferreira do Amaral 59 \nAnexos \n♦ Acrescentar 1.0 mL de reagente TBA à fresco a todos os tubos e\nagitar.\n♦ Colocar para ferver durante 30 minutos. Esfriar em temperatura\nambiente.\n♦ Acrescentar 4.0 mL de álcool butílico, fechar o tubo e agitar\nvigorosamente. Essa etapa tem a finalidade de extrair as\nsubstancias que reagiram com o tiobarbitúrico ( extração com\nsolvente orgânico).\n+ Centrifugar a 3000 rpm, durante 1 O minutos.\n♦ Realizar a leitura da absorção da fase orgânica (superior) pelo\nespectofotômeto (marca Beckman e modelo OU -70) a 530 nm.\nOXISTEROL - COLEST - 3,5 - DIENO - 7- ONA (CSD) \n1. Colocar 1.0 mL de fluido peritoneal (FP) e adicionar 100 µL de\nsolução de sulfato de cobre a cada tubo e diluir com 1 mL de salina\n(fazer alíquotas de salina com 40 mL).\nObs- O experimento foi feito em duplicatas. Como não havia fluido \nsuficiente usamos 400 µL e o cobre foi colocado proporcionalmente a \nesse volume, ou seja, 40 µL e diluídos em 400 µL de salina. A seguir, \nutilizamos 1 litro de salina e aliquotamos para abrir um frasco por \nexperimento para manter os outros frascos em boas condições. O \n\nVivian Ferreira do Amaral 60 \nAnexos \nvolume escolhido foi 40 mi de salina por tubo porque era mais ou \nmenos o seria usado por experimento. \n2. Incubar por 16 horas em banho maria a 37ºC\nFP cu\n+2 salina \n150µL \n1.0 100µL \n80µL \n0.5 S0µL 1 OOµL de Cu 2+\n30µL \n0.3 10µL \n3. Saponifi cação - Acrescentar 50µL de Hidroxi tolueno butilado,\nSigma 81378 (BHT), 2 ml de hidróxido de sódio (NaOH) etanólico e \n1 ml de H20. Incubar a 60ºC por 1 hora. O BHT é um antioxidante. \nutilizado acima para interromper a reação de oxidação. \n4. Deixar esfriar à temperatura ambiente.\nExtrair com Clorofórmio : Metanol (2:1), (28:14ml) para solubilizar \npara realização da leitura. Começar acrescentando 3 ml e misturar. \nContinuar acrescentando 3 ml até atingir um total de 9 mL (agitar em \napós cada adição). Centrifugar 1500 rpm, durante 5 minutos, \npermitindo a separação das camadas. \n5. Remover a camada inferior e transferir para um tubo de ensaio de\nvidro estéril. Desprezar a camada superior. \n\nVivian Ferreira do Amaral 61 \nAnexos \n6. Secar as amostras na temperatura de 37ºC sob um vapor de N2 ( se\ndeixar secar em 0 2, aumenta ainda mais a oxidação por isso é usado \no N2).\n7. Reconstituir amostra em 2 ml de hexano.\n8. Transferir amostra para um tubo de vidro contendo 250 mg de\nDigitonin® (Sigma) tamponada - sílica gel G. Agitar. A digitonina é \ndeterminante do colesterol \n9. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos.\n10. Preparo da curva standard-\nPreparar, em duplicata, tubos contendo O µL, 5µL, 1 0µL, 15µL, 20 µL e \n25 µL de estocagem de solução de CSD. Adicionar hexano a cada \ntubo para completá-lo com 2 ml. Utiliza-se 150µL para cada curva e \narmazena-se em um único tubo com 1 O ml, na geladeira. Retira-se o \nsobrenadante e realiza-se a leitura no espectofotômetro a 283 nm. \nPara o cálculo dos resultados utiliza-se uma curva de calibre plot \nutilizando absorção dos padrões contra suas concentrações. Não \nexistem taxas de normalidade descritas. Os resultados são \ninterpretados com a comparação do grupo controle. A partir da \npresença de lipídeos pode-se obter o colesterol oxidado e portanto \ndetectar-se a presença do CSD. \n\nVivian Ferreira do Amaral 62 \nAnexos \nAnexo 2 \nTabela 1 - Níveis de CSD, Malondaldeído (MOA), Malondialdeído com \nadição de cobre (MDA/Cu2+) no fluido peritoneal de mulheres do Grupo \nendometriose \nENDOMETRIOSE CSD MDA MDA/Cu2+\n-\n················-··--·-.... -·····----·---· (µg/ml)_ ____ (nmol/ml) _______ (n�ol/ml) \n1 0,09 0,05 O, 11 \n2 0,23 0,05 0,54 \n3 0,60 \n4 0,32 0,02 0,04 \n5 O, 1 O 0,20 0,48 \n6 0,25 0,36 O, 79 \n7 0,34 0,07 O, 1 O \n8 0,07 0,05 0,65 \n9 0,24 0,05 0,03 \n1 O 0,36 0,49 0,64 \n11 0,40 \n12 0,12 0,07 0,18 \n13 0,25 0,47 0,51 \n14 0,21 0,01 0,02 \n15 O, 10 0,03 0,20 \n16 0,26 0,55 0,34 \n17 O, 11 O, 13 O, 54 \n\nVivian Ferreira do Amaral 63 \nAnexos \nAnexo 3 \nTabela 2 - Níveis de CSD, Malondialdeído (MOA), Malondialdeído \ncom adição de cobre (MDA/Cu2+) no fluido peritoneal de mulheres do \nGrupo controle \nCONTROLE CSO MOA MOA / Cu2+\n____________________________________________________________ (µglml ) _________________ (nmol/ml ) _______________ (nmol/ml ) ________ \n1 0,25 0,01 0,32 \n2 0,45 0,01 0,01 \n3 0,30 0,02 0,03 \n4 0,18 0,03 0,15 \n5 0,29 0,01 0,01 \n6 0,14 0,27 0,19 \n7 0,24 0,02 0,44 \n8 0,10 0,11 0,47 \n9 0,22 0,07 0,23 \n10 0,13 0,16 0,59 \n11 0,12 0,10 0,73 \n12 0,28 0,04 0,70 \n13 0,45 0,04 0,12 \n14 0,50 0,06 0,03 \n15 0,30 \n,_..,... .» ,_..,..,,......__ ... ? . ..♦....,....,.. Y.,.-.- ..,...,. ,.,..,... ·· ,. �--\"\"\" V ,,.� \"'\"' •,,.;+-..e - ,._..-.,.., .,.,.,._,...,.,.-,, \n\nViuian Ferreira do Amaral 64 \nAnexos \nAnexo 4 \nTabela 3 - Porcentagem de incremento com adição de cobre ao MOA \nnos Grupos endometriose e controle \nEDT EDT INCREMENTO INCREMENTO CONTROLE CONTROLE \nMOA MDA/Cu2+ (%) (%) MOA MDA/Cu2+ \n(nmol/ml) (nmol/ml) (nmol/ml) (nmol/mL) \n0,05 0,11 120,0% 2150,0% 0,01 0,32 \n0,05 0,54 980,0% -57, 1 % 0,01 0,01 \n0,02 0,04 100,0% 50,0% 0,02 0,03 \n0,20 0,48 140,0% 504,0% 0,03 O, 15 \n0,36 0,79 119,4% 42,9% 0,01 0,01 \nO, 07 O, 1 O 42, 9% -32,2% 0,27 O, 19 \n0,05 0,65 1200,0% 1995,2% 0,02 0,44 \n0,05 0,03 -40,0% 327,3% O, 11 0,47 \n0,49 0,64 30,6% 260,0% 0,07 0,23 \n0,07 0,18 157,1% 268,8% 0,16 0,59 \n0,47 0,51 8,5% 633,0% 0,10 0,73 \n0,01 0,02 100,0% 1566,7% 0,04 0,70 \n0,03 0,20 650,0% 200,0% 0,040 O, 120 \n0,55 0,34 -38,2% -45,0% 0,060 0,033 \n_o, 13 OJ54 3!5J4% · \" ...... , .... ., m, m, \nObs-EDT ( endometriose) \n\nVivian Ferreira do Amaral 65 \nAnexos \nAnexo 5 \nTabela 4 - Distribuição das pacientes do Grupo endometriose \nconforme idade, idade da menarca,classificação da ASRM (1997), \nescore e tipo de lesões visualizadas à laparoscopia (%) \nENDOMETRIOSE IDADE MENARCA ESTADIAMENTO ESCORE \n(ASRM,1997) \n1 37 14 Moderada 30 \n2 23 12 Moderada 32 \n3 34 13 Leve 8 \n4 33 12 Mínima 2 \n5 22 12 Moderada 30 \n6 35 16 Mínima 5 \n7 35 13 Moderada 29 \n8 25 12 Severa 116 \n9 34 14 Mínima 2 \n10 30 15 Mínima 2 \n11 29 14 Leve 1 O \n12 26 12 Moderada 19 \n13 25 11 Mínima 2 \n14 37 13 Mínima 2 \n15 33 11 Mínima 4 \n16 28 12 Leve 8 \n17 36 14 Moderada 36 \n18 35 11 Moderada 32 \n19 31 13 Severa 44 \n20 37 15 Leve 8 \n21 28 12 Mínima 2 \n% DE LESÕES \nVISUALIZADAS \nV=37,5;P=62,5; 8=20 \nV=O; P=85;8=15 \nV=17; P=33; 8=50 \nV=25; P=75;8=0 \nV=5; P=10;8=75 \nV=7,5; P=93,5; 8=0 \nV=18,2;P=29, 1 ;8=52, 7 \nV=O; P=O; 8=100 \nV=O; P=O; 8=100 \nV=11; P=22; 8=67 \nV=O; P=O; 8=100 \n8=100 \nV=11; P=22; 8=67 \nP=25,8=75 \nV=5, P=10, 8=20 \nV=25; P=O; 8=75 \nV=12,5;P=20;8=67,5 \nV=O; P=O; 8=100 \nV=O, P=75;8=75 \nV=15; P=35; 8=50 \n8=100 \n\nVivian Ferreira do Amaral 66 \nAn�s \nAnexo 6 \nTabela 5 - Distribuição das pacientes do grupo controle conforme \nidade (anos), idade da menarca (anos) e antecedentes obstétricos \n·coFffROLE • IDADE •• IDADE DA •• NÚMERO • PARIDADE •• • • NÚMERO DE\n(GRUPO B) (anos) MENARCA DE ABORTAMENTOS \n(anos) GESTAÇÕES \n1 33 12 3 2 1 \n2 32 11 3 3 O \n3 35 10,5 4 3 1 \n4 31 12 3 3 O \n5 37 11 2 2 O \n6 38 11 3 3 O \n7 35 12 2 2 O \n8 37 13 4 4 O \n9 34 11 4 3 1 \n10 33 12 3 3 O \n11 38 11 4 3 1 \n12 35 12 3 3 O \n13 37 11 2 2 O \n14 36 13 4 2 2 \n15 27 12 3 3 O \n16 28 11 3 3 O \n17 33 12 4 3 1 \n18 35 12 4 3 1 \n19 37 11 2 2 O \n20 38 12 3 3 O \n21 34 12 5 3 2 \n\n8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS \n\nVivian Ferreira do Amaral 68 \nReferências Bibliográficas \nABRÃO, M.S.; AMARAL, V.F.; RAMOS, L.O. 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Peritoneal fluid \nwas collected during laparoscopy in the follicular phase. \nRESUL TS - No significant ciifference in MOA levels was detected between \nendometriosis Group and control B, with respectiva median values of 0.07 \nnmol/ml and 0.04 nmol/ml (p=0.09). Median MDA/Cu2+ levels were 0.34\nnmol/mL in enciometriosis Group and 0.21 nmol/ml in control Group. When \nMOA and MDA/Cu2+ leveis were compareci, MOA/Cu2+ \nwere founci to be\nhigher intragroup in both enciometriosis Group anci control Group (p<0.01 ). \nNo significant difference in CSO levels were found between Group A anci \nGroup B, with respectiva median values of 0.24 and 0.25 ug/ml (p=0.50). \nCONCLUSION - The present study ciid not ciemonstrate an increase in lipid \nperoxidation potencial in the peritoneal fluici of infertile women with pelvic \nenciometriosis when compareci to fertile women. \n\nAVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA NO \nFLUIDO PERITONEAL DE MULHERES INFÉRTEIS COM \nENDOMETRIOSE PÉLVICA \nOBJETIVO - A meta do presente estudo foi avaliar a capacidade de \nperoxidação lipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com \nendometriose pélvica e mulheres normais. \nCASUÍSTICA E MÉTODOS - Foram selecionadas prospectivamente 32 \nmulheres, distribuídas em dois grupos, dispostos em Grupo endometriose, \ncomposto por 17 mulheres inférteis com endometriose pélvica, comprovada por \nlaparoscopia e biópsia, e Grupo controle, determinado por 15 mulheres sem \nendometriose pélvica, comprovada por laparoscopia e submetidas à \nlaqueadura tubárea bilateral. A peroxidação lipídica foi avaliada através da \nperoxidação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) \ndeterminados pelo malondialdeído (MOA), malondialdeído com adição de \ncobre (MDA/Cu2+\n) e pelo colest- 3,5- dieno- 7- ona (CSD) expressos em \nnmol/mL e µg/mL respectivamente. As amostras de fluido peritoneal foram \ncolhidas durante a laparoscopia, na fase folicular do ciclo menstrual. \nRESULTADOS - Não encontramos diferença estatística nos níveis de MOA \nentre os Grupos endometriose (mediana de 0.07 nmol/mL) e controle (mediana \nde 0.04 nmol/mL) (p=0.09). Após a peroxidação provocada pelo cobre também \nnão houve diferença entre os grupos endometriose (0.34 nmol/mL) e controle \n(0.21 nmol/mL) mas houve uma elevação intragrupo (p<0.01). Não \nencontramos diferença estatística dos níveis de CSD nos Grupos endometriose \ne controle (mediana de 0.24 e 0.25 µg/mL, respectivamente) (p=0.50). \nCONCLUSÃO- Nosso estudo não demonstrou aumento do potencial de \nperoxidação lipídica no fluido peritoneal de mulheres inférteis com \nendometriose pélvica comparadas a mulheres férteis. \nUnitermos endometriose, peroxidação lipídica,oxisterol, malondialdeído \n\nINTRODUÇÃO \nA infert ilidade acomete entre 20 e 50% de mulheres portadoras de \nendometriose pélvica (Wheeller & Malinak,1988;Thomas,1993). O fluido \nperitoneal é um dos fatores relevantes envolvidos neste mecanismo. Em \nmulheres com endometriose pélvica ocorre um processo infla matório crônico \nintraperitoneal associado à infertilidade mesmo na vigência de função \novulatória normal e evidente alteração anatômica em tuba uterina, local, onde \nocorre a fertilização (Halme et ai., 1982; Khamse et al.,2001 ). \nAlguns estudos sugerem que mulheres com endometriose pélvica são \npredispostas a um aumento do estresse oxidativo devido processo inflamatório. \nCom isso estariam predispostas a maior quantidade de radicais livres e \nreduzidas concentrações de seu varredor, a enzima superóxido dismutase \n(SOO). Esta alteração resulta da interação dos peróxidos lipídicos com as \nproteínas (lshikawa et ai., 1993; Shanti et ai., 1999). \nNecessitam-se de estudos prospectivos e randomizados para elucidar a \nparticipação dos radicais livres nos distúrbios da fertilidade para se determinar \na verdadeira alteração por eles gerados na função reprodutiva \nCASUÍSTICA E MÉTODOS \nForam selecionadas prospectivamente 32 mulheres distribuídas em 2 \ngrupos. Grupo endometriose composto por 17 mulheres com infertilidade e \nendometriose pélvica e o Grupo controle representado por 15 mulheres sem \nendometriose pélvica submetidas a laqueadura tubária bilateral. \nForam critérios de inclusão do Grupo Endometriose: presença de infertilidade \npor fator feminino de pelo menos 2 anos de duração, ausência de qualquer \ntratamento clínico prévio a laparoscopia num período de no mínimo 6 \nmeses;ausência de tratamento clínico ou cirúrgico da endometriose; ausência \n\nde uso de antiinflamatório (hormonal e não hormonal) por pelo menos 7 dias \nantes da coleta do fluido; diagnóstico de endometriose pélvica comprovada por \nlaparoscopia e biópsia; presença de fluido peritoneal em cavidade abdominal \ndurante a laparoscopia; idade superior a 18 anos e inferior a 40 anos. \nGrupo controle: ausência de endometriose pélvica ou patologias ginecológicas \nno momento da laparoscopia , presença de fluido peritoneal em cavidade \nabdominal durante a laparoscopia e ausência de uso de antiinflamatório \n(hormonal e não hormonal) por pelo menos 7 dias antes da coleta do fluido. As \namostras de fluido peritoneal foram obtidas durante a laparoscopia realizada \ndurante a fase folicular do ciclo menstrual. O fluido peritoneal será centrifugado \na 2 500 rpm, (1 900 x g) durante 1 O minutos. Em seguida, o sobren adante era \npipetado e aliquotado em tubos de ensaio secos e estocados a -80° C até o \nmomento da análise laboratorial. \nAs mulheres com endometriose pélvica foram estadiadas de acordo com \na Classificação da American Society for Reproductive Medicine (1997) das \nquais 7 mulheres eram do estádio 1, 5 do estádio 11, 7 do estádio li e 2 do \nestádio IV. \nO potencial de peroxidação lipídica (PLPP) foi avaliado a partir da \nutilização do cobre na formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico \n(TBARS). A peroxidação foi determinada por método enzimático pelo \nmalondialdeído (MOA), malondialdeído com adição de cobre (MDA/Cu2+\n) e pelo \nColest- 3,5- dieno- 7- ona (CSD) expressos em nmol/ml e ug/ml \nrespectivamente. \nA análise estatística foi realizada com o programa Stata. Os testes \nutilizados de acordo com as variáveis foram o Mann Whitney e o Wilcoxon. Foi \nconsiderado estatisticamente significativo o p<0.05. \n\nRESULTADOS \nOs níveis de MOA no fluido peritoneal das mulheres com endometriose \npélvica variaram de 0.01 a 0.55 nmol/ml, sendo a mediana de 0.07 nmol/ml. \nNas mulheres do Grupo controle os valores do MOA demonstraram uma \nvariação de 0.007 a 0.27 nmol/ml e uma mediana de 0.04 nmol/ml (p=0.09). \nO valor mínimo do MOA com adição de cobre (MONCu 2+) obtido em \nmulheres com endometriose pélvica foi de 0.02 nmol/ml e o máximo foi de \n0.79 nmol/ml, sendo a mediana de 0.34 nmol/ml. Em mulheres do Grupo \ncontrole os níveis de MOA com adição de cobre (MONCu 2+) foram \nsemelhantes ao Grupo endometriose (p=0.50), sendo o valor mínimo de 0.006 \nnmol/ml e o máximo de 0.73 nmol /ml com mediana de 0.21 nmol/ml \n(p=0.028). Ao compararmos intragrupo a equivalência do MOA e MDNCu2+ em \nambos os grupos, observamos um aumento dos níveis com adição do cobre \n(p<0.01). Os níveis de CSO no Grupo endometriose variaram de 0.07 a 0.60 \nµg/ml, sendo a mediana encontrada de 0.24 µg/ml. Nas mulheres do Grupo \ncontrole os valores do CSD apresentaram uma variação de 0.09 a 0.50 µg/ml \ne uma mediana de 0.25 µg/ml, sem diferença estatística (p=0.50). \nComparando-se os níveis de MOA em mulheres portadoras de \nendometriose pélvica com o estadiamento da doença, observou-se que a \nmediana foi de 0.07 nmol/ml em mulheres com endometriose estádio 1, 0.09 \nnmol/ml em casos de endometriose estádio 11, O .04 nmol/ml em casos de \nendometriose estádio Ili e 0.31 nmol/ml em endometriose estádio IV, sem \ndiferença estatística entre os níveis de MOA nos diferentes estádios da \ndoença. Ao correlacionarmos os níveis de MONCu 2+ \ne CSD no fluido \nperitoneal de mulheres com endometriose pélvica e o estadiamento da doença \nobservamos que a mediana deste marcador foi de 0.48 nmol/ml e 0.12 µg/ml \nrespectivamente no estádio I da doença, 0.52 nmol/ml e 0.24 µg/ml no \n\nestádio 11, foi de 0.15 nmol/ml e 0.23 µg/ml no estádio Ili e 0.22 nmol/ml e \n0.30 µg/ml respectivamente no estádio IV sem diferença estatística nos \ndiferentes estádios da endometriose (p=0.27 e p=0.16). Avaliamos \nseparadamente a presença de lesões típicas ou pigmentadas (negras) \nsugestivas de doença crônica e atípicas ou não pigmentadas (vermelha) \nsugestivas de doença ativa. Não observamos relação de lesões predominantes \n(típicas ou atípicas) com os níveis de CSD, MOA e MDA/Cu2+ \n(p = ns).\nNão encontramos relação dos níveis de MOA com a idade de mulheres \ncom endometr iose pélvica (p=ns). Em relação ao CSD observamos uma \nrelação negativa (p=0.02). Em mulheres do Grupo controle, houve uma relação \npositiva da idade com níveis de MOA e nenhuma relação com os níveis de \nCSD (p=0.02 e p=0.39 respectivamente). \nDISCUSSÃO \nO fluido peritoneal um papel importante nos processos de fertilidade, por \nesta razão diversas pesquisas se destacam neste campo. Um dos campos que \ntem sido destaque é o papel do estresse oxidativo e de algumas espécies \nreativas ao oxigênio (ROS) (Wang et ai. 1997; Murphy et ai., 1998a; Shanti et \nai., 1999; Ota et ai., 1999; Polak et ai., 2000). \nMurphy et ai. (1998b), levantaram a possibilidade do desenvolvimento da \nendometriose a partir do estresse oxidativo. Como conseqüência , haveria \ndanos oxidativos das células vermelhas sanguíneas e das células endometriais \nem processo de apoptose. Os restos de tecidos endometriais agiriam como um \nrecrutamento e ativação de fagócitos mononucleares . Na vigência de \nendometriose pélvica, haveria uma resposta inadequada a estes estímulos em \nnível de receptores de macrófagos varredores sem comprometer sua resposta \nsecretora (Murphy et ai., 1998a). \nA ativação dos macrófagos na cavidade peritoneal seria responsável \npelo estresse oxidativo determinado pela peroxidação dos lipídeos, seus \n\nprodutos de degradação e os produtos formados pela sua interação com o LDL \ne outras proteínas (Murphy et al.,1998b). Os lipídeos peroxidados ao se \nsubmeter à decomposição, geram produtos como o malondialdeído. Estes \nprodutos reagem com os grupos aminas dos resíduos de lisina das proteínas. \nOs grupos amina dos lipídeos também são vulneráveis a estas alterações.Com \nisso, estes lipídeos passam a ser estranhos e começam a desencadear uma \nresposta antigênica formando então anticorpos (Murphy et al.,1998b ;Polak et \nal.,2000). \nAvaliarmos o potencial de peroxidação lipídica representado pelo MOA e \nMDA/Cu2+ \ncom o estadiamento da doença, não encontramos relação com os \nmesmos. Shanti et ai (1999) estudaram a presença de autoanticorpos para \nMOA e LDL colesterol no soro de 36 mulheres com endometriose pélvica e 16 \nmulheres normais submetidas à laqueadura tubárea bilateral. Não encontraram \ncorrelação dos autoanticorpos com o estádio, morfologia ou sintomas da \nendometriose. Estes dados são semelhantes aos nossos achados embora a \ntécnica utilizada tenha sido diferente. Com relação ao fluido peritoneal, não \nencontraram autoanticorpos para três antígenos presentes no fluido. Os \nautoanticorpos dos marcadores de estresse oxidativo estavam aumentados em \nmulheres com endometriose pélvica comprovando a participação desta \nenfermidade. Ao avaliarmos os níveis de CSD comparados à severidade da \ndoença, também não encontramos relação. Não há relatos na literatura para \ndiscutirmos estes achados. \nA coloração dos implantes reflete os achados hemorrágicos, vasculares, \nhemopigmentados e fibrose (Brosens, 1997). As lesões negras e brancas têm \nsido representadas como evolução da lesão vermelha, caracterizando assim a \npresença de endometriose crônica além da reação inflamatória local, após \nsangramento recorrente e conseqüente fibrose. Diversos estudos sugerem \nque, com o passar dos anos, ocorre um decréscimo na incidência de lesões \nnão pigmentadas, principalmente as vermelhas (Redwine, 1987b; Nisolle et ai., \n1993; Brosens et ai., 1994; Abrão e lkeda.,2000). \n\nEm nosso estudo, ao avaliarmos os níveis do MOA no fluido peritoneal, \nnão observamos diferença entre os Grupos endometriose e controle. Ao \ncompararmos os valores do MOA e MOAfCu2+ no Grupo endometriose \nobservamos que os níveis do MOAfCu2+ foram significativamente mais \nelevados. Quanto ao Grupo controle, encontramos resultados semelhantes, \nmas ao compararmos os níveis individuais em ambos os grupos sem diferença \nestatística (Figura 1). Não podemos comparar estes achados com a literatura \npois os trabalhos que avaliaram radicais livres, espécies reativas ao oxigênio \nou peroxidação lipídica utilizaram métodos diferentes. Estudos avaliando níveis \nséricos, utilizaram o MOA já oxidado pelo cobre (MOAfCu2+\n) pelos TBARS em\nmulheres com endometriose pélvica e laqueadura tubárea (Murphy et \nai., 1998b) ou observaram o MOAfCu2+ e vitamina E em mulheres com outras \npatologias (Tang et ai, 1997). Baseado neste dados inéditos na literatura, \ncalcularmos também a porcentagem de incremento com adição de cobre nas \namostras com MDA. Não observamos diferença estatística em qualquer dos \nGrupos. O trabalho descrito a respeito de status antioxidante totais e \nmalondialdeído por método Elisa no fluido peritoneal de mulheres inférteis \nutilizou apenas mulheres com endometriose mínima e leve como controle \n(Polak et ai, 2000). O objetivo deste trabalho foi avaliar as pacientes com \ninfertilidade sem causa aparente (ISCA). Encontraram, apesar da casuística \nlimitada, valores significativamente elevados em pacientes com ISCA e \nendometriose comparados ao grupo controle determinado por pacientes com \ntumor ovariano não inflamatório. Não encontraram diferença do status\nantioxidante total. Concluíram que o desequilíbrio entre a lipoperoxidação e o \nsistema antioxidade é um dos fatores determinantes da ESCA. \nEm casos de endometriose associada à inferti lidade, fator imunológico e \npredisposição genética, ainda há muitas perguntas sem respostas. A presença \nde um fator preditivo da doença facilitaria seu seguimento em casos de dor \npélvica importante e infertilidade. \n\nMesmo com os métodos mais sofisticados de leitura por \nespectofotometria spin as limitações ainda existem pois as espécies reativas \nao oxigênio têm uma vida média muito curta. A possível detecção dos mesmos \ne posterior terapêutica direcionada aos achados, seriam de grande valia para \nas mulheres inférteis com endometriose pélvica. \nNão encontramos nos níveis de peroxidação lipídica pelos TBARS um \nbom parâmetro de avaliação do fluido peritoneal de mulheres inférteis com \nendometriose pélvica. Nosso estudo não descarta a possibilidade de outras \nespécies reativas ao oxigênios estarem envolvidas nesta patologia sugerindo , \nportanto, novas investigações nesta área. \n\n0.8 ,, \n0.7 ♦ \n,, ,, \n0.6 ♦ \n,, ,, \n0,5 ,, • ♦ \n♦ \n0.4 \n• \n♦ \n♦ \n0.3 \n0.2 • ,, ♦ \nA \n♦ \n0.1 A ,, ,, • • .... ... •••• •• A  ,, ,, ♦ \no.o\nEndometriose(MDA/Cu\n2+>1 Endometriose (MOA} Controle (MOA} Controle (MOA/Cu2♦\n• \nFigura 1- Comparação entre os níveis de MOA com e sem adição de cobre, no \nGrupos endometriose e controle (p<0.01)","source_license":"CC0","license_restricted":false}