Soluble factors formed during the healing of the endometrium suppress its "fibrosis” in vitro

Full Text Введение Эндометрий здоровых женщин репродуктивного возраста регулярно повреждается во время менструации и заживает путем полной регенерации без фиброзирова-ния [1]. Быстрое восстановление нормальной структуры ткани делает возможной эффективную подготовку слизистой оболочки матки к беременности в последующих фазах менструального цикла. Однако при некоторых гинекологических заболеваниях, таких как синдром Ашермана, аденомиоз и др. [2-4], которые, как правило, протекают хронически и плохо поддаются лечению, развивается фиброз эндометрия. В подобных случаях при заживлении слизистой оболочки матки происходит трансдифференцировка1 ча- 1 примечание от редактора: использован термин в интерпретации авторов; с позиции классической гистологической школы, в данном случае более корректен термин «дифференцировка» сти мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК) в миофибробласты. Данные клетки приобретают способность к контракции, начиная экспрессировать а-гладкомышечный актин (а-SMA), а также продуцируют большое количество белков межклеточного матрикса (коллаген I, ED-A фибронектин и др.), ремоделируя ткани и приводя к их фиброзированию [5-7]. Это общее для большинства органов человеческого организма и ключевой эффекторное звено в механизмах фиброзирова-ния тканей [8-11]. У здоровых женщин во время заживления эндометрия не происходит трансдифференцировки эМСК в миофибробласты, что может быть связано со специфическим микрокружением, которое возникает в ходе данного процесса. Помимо компонентов межклеточного матрикса и клеточных элементов оно содержит растворимые факторы. Вероятно, это микроокружение способно не только стимулировать заживление, но и подавлять фиброзирование эндометрия. Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Ранее мы показали, что культивирование эМСК в присутствии сыворотки менструальной крови (СМК) здоровых женщин приводит к значительному снижению содержания а-гладкомышечного актина (a-SMA, маркера миофибробластов) по сравнению с культивированием в присутствии сыворотки периферической крови (СПК) тех же доноров [12]. Более специфичным с позиции механизма развития фиброза является изучение индуцированного процесса в модели in vitro. TGF-ß1 - один из основных растворимых факторов, запускающих трансдифференцировку эМСК в миофибробласты как in vivo, так и in vitro, что позволяет использовать его в качестве профиброгенного стимула в различных моделях фиброза [13, 14]. Задачей данной работы стала проверка влияния СМК здоровых женщин на миофибробласты, полученные из эМСК путем индуцированной TGF-ß1 трансдифференцировки, с целью оценки противофиброзного потенциала содержащихся в ней растворимых факторов. Материал и методы Выделение эМСК и образцов сывороток В один день от одного здорового донора после получения информированного согласия были собраны образцы менструальной и периферической (из кубитальной вены) крови. Образцы хранили при +4 °С в течение 12 ч. и затем центрифугировали при 300 g в течение 20 мин. Супернатанты (СМК и СПК) собирали, пропускали через фильтр 0,22 мкм и хранили при -20 °С до дальнейшего использования. Осадок клеток менструальной крови ресуспендировали в 5-ти объемах раствора Хенкса, содержащего 2 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Life Technologies Corporation, США) и 1 % 0,5 M ЭДТА. После фильтрации через 1 00 мкм фильтр взвесь аккуратно наслаивали на 15 мл 15 % раствора йодиксанола (Life Technologies Corporation, США) и центрифугировали при 500 g в течение 40 мин. Слой клеток, оставшийся на поверхности раствора йодиксанола собирали, ресуспенди-ровали в 1 0 мл раствора Хенкса и центрифугировали при 100 g в течение 10 мин. Полученный осадок клеток ресуспендировали в ростовой среде DMEM/F12 (Life Technologies Corporation, США), содержащей 10 % ФБС и 1 % пенициллина и стрептомицина, затем переносили на адгезивные чашки Петри на 24 ч. Прикрепившиеся клетки культивировали в той же ростовой среде. Смену среды проводили каждые 3-4 сут. Оценка противофиброзной активности СМК на культуре эМСК СМК и СПК размораживали, разводили средой DMEM/F12, выравнивая по концентрации белка, и культивировали эМСК 4 пассажа в подготовленных растворах в течение 2 сут., после чего проводили иммуноцитоф-луоресцентный анализ a-SMA. Моделирование фиброза эндометрия in vitro эМСК 4 пассажа высаживали в лунки 48-луночного планшета в ростовой среде DMEM/F12 без ФБС. Через 1 сут. среду заменяли на аналогичную среду, содержащую 5 нг/мл TGF-ß1 (R&D Systems, США), культивировали в течение 4 сут. и затем проводили иммуноцитофлу-оресцентный анализ a-SMA в эМСК. Оценка противофиброзной активности СМК на модели фиброза эндометрия in vitro СМК и СПК размораживали и разводили средой DMEM/F12, выравнивая по концентрации белка. Миофибробласты, полученные при моделировании фиброза эндометрия, культивировали в подготовленных растворах в течение 2 сут., после чего проводили имму-ноцитофлуоресцентный анализ a-SMA. Иммуноцитофлуоресцентный анализ По завершении эксперимента клетки фиксировали 4 % формалином в течение 10 мин., 3 раза отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) инкубировали с 10 % козьей сывороткой и снова отмывали ФСБ 3 раза. Для выявления целевого белка клетки инкубировали в течение ночи при температуре +4 °С с моноклональными мышиными антителами против a-SMA человека (DAKO, США), отмывали ФСБ 3 раза и инкубировали с вторыми антителами, реактивными к IgG мыши и конъюгированными с AlexaFluor594 (Invitrogen, США). Ядра клеток метили флуоресцентным красителем DAPI (DAKO, США). Изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM6000B, снабженного камерой Leica DFC 360FX (Leica Microsystems GmbH, Германия). Подсчет ядер и площади флуоресцентного сигнала на полученных изображениях проводили в программе Fiji. Статистический анализ Эксперимент был выполнен в дупликатах. При имму-ноцитофлуоресцентном анализе использовали объектив с минимальным увеличением для захвата наибольшей площади поверхности препаратов и получали не менее 2 изображений с каждого из них. Общую площадь a-SMA-позитивных стресс-фибрилл нормировали на количество ядер и по полученному показателю сравнивали группы изображений, применяя критерий Манна-Уитни. Результаты Исследование противофиброзного действия СМК на культуру эМСК МСК, выделенные из различных источников, при культивировании в содержащих ФБС средах медленно транс-дифференцируются в миофибробласты, в результате чего клеточная популяция становится гетерогенной по содержанию a-SMA, локализованного в стресс-фибриллах [15]. Наличие и степень выраженности данного феномена может зависеть от множества факторов: источника клеток, характеристик сыворотки, протокола культивирования клеток и др. В наших экспериментах при культивировании эМСК в среде DMEM/F12 с 10 % ФБС значительная часть клеток на 4 пассаже содержала стресс-фибриллы, положительные на a-SMA (рис. 1а), что свидетельствовало об их трансдифференцировке в миофибробласты. Важно отметить, что культивирование эМСК 4 пассажа в присутствии СПК не влияло на количество a-SMA-позитивных стресс-фибрилл в клетках (рис. 1в), в то время как культивирование в присутствии СМК - уменьшало их количество (рис. 1б). На основании приведенных, а также полученных нами ранее данных [12], можно предположить противофиброзное действие СМК на культуру эМСК. Оценка влияния СМК на фиброз эндометрия, смоделированный in vitro После 4 сут. культивирования с TGF-ß1 (5 нг/мл) большинство эМСК в культуре приобретали характерную для миофибробластов морфологию с четко выраженными a-SMA-позитивными стресс-фибриллами (рис. 2), что коррелирует с результатами других авторов, использовавших данную методику [7]. Последующее культивирование полученных миофибробластов, в присутствии СПК не приводило к выраженным изменениям, в то время как СМК значимо (p=0,03) уменьшала общую площадь a-SMA-позитивных стресс-фибрилл (рис. 3). Полученные Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 65 А I Б I В Рис. 1. Культура мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК): А - эМСК при культивировании с фетальной бычьей сывороткой; Б - эМСК при культивировании с сывороткой менструальной крови (2 сут.); В - эМСК при культивировании с сывороткой периферической крови (2 сут.). Иммуноцитохимическая реакция с антителами к а-гладкомышечному актину (красный цвет). Окраска ядер - dapi. Масштабный отрезок - 100 мкм А Б Рис. 2. Миофибробласты в культуре мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК) после моделирования «фиброза» эндометрия in vitro: А - эМСК при культивировании в DMEM/F12; Б - миофибробласты, полученные из эМСК при культивировании в DMEM/F12 с TGF-ß1. Иммуноцитохимическая реакция с антителами к а-гладкомышечному актину (красный цвет). Окраска ядер - dapi. Масштабный отрезок - 100 мкм А Б Рис. 3. Культура мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК) после воздействия сыворотки менструальной крови: А - миофибробласты после 2 сут. культивирования с сывороткой периферической крови (СПК); Б -миофибробласты через 2 сут. культивирования с сывороткой менструальной крови; в - диаграмма размаха, отражающая различия в общей площади a-SMA-позитивных (a-SMA+) стресс-фибрилл (медиана, верхний и нижний квартили, минимум и максимум). Иммуноцитохимическая реакция с антителами к a-гладкомышечному актину (красный цвет). Окраска ядер - dapi. Масштабный отрезок - 100 мкм результаты свидетельствуют о наличии в составе СМК растворимых факторов, обладающих противофиброз-ным действием in vitro. Обсуждение Повреждение слизистой оболочки матки (эндометрия) регулярно происходит при менструации, а также при ряде хирургических вмешательств, рутинно выполняемых у женщин репродуктивного возраста в акушерско-гинекологической практике [1]. Несмотря на то, что происходящая при этом гибель клеток сопровождается выбросом целого спектра биологически активных компонентов, которые создают мощный про-фиброгенный стимул [16], заживление эндометрия не сопровождается фиброзированием. Мы предполагаем, что это может быть обусловлено продукцией Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 66 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ противофиброзных факторов в тканях слизистой оболочки матки во время заживления. В нашей предыдущей работе мы использовали СМК в качестве модельного объекта, содержащего растворимые факторы, регулирующие заживление эндометрия, и показали, что СМК поддерживает пролиферацию эМСК, а также снижает содержание в культуре этих клеток a-SMA. В настоящей работе при помощи иммуноцитофлуорес-центного анализа мы обнаружили, что под влиянием СМК количество a-SMA-позитивных стресс-фибрилл в эМСК снижается по сравнению с воздействием СПК или ФБС (рис. 1). Вместе с полученными ранее результатами Вестерн-блот-анализа [12] это свидетельствовало о способности содержащихся в составе СМК растворимых компонентов оказывать противофиброзное действие на культуру эМСК. Следующим этапом стала оценка противофиброз-ного действия СМК на in vitro модели фиброза эндометрия. Наши эксперименты показали, что после смены профиброгенного микроокружения, смоделированного при помощи TGF-ß1, на СМК происходило уменьшение количества a-SMA-позитивных стресс-фибрилл (рис. 3). Вероятнее всего, добавление СМК позволяет до определенной степени повернуть вспять процесс трансдиффе-ренцировки эМСК в миофибробласты. Обратимый характер сборки a-SMA-позитивных стресс-фибрилл в МСК под действием профиброгенных и противофиброзных стимулов описан в литературе [17, 18]. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о продукции в слизистой оболочке матки растворимых факторов, способных подавлять фибро-зирование при её заживлении. Для объяснения этого феномена необходимо идентифицировать содержащиеся в СМК регуляторные молекулы, обладающие проти-вофиброзным действием. В дальнейшем это позволит установить не только механизмы заживления эндометрия, но и причины его фиброзирования при неинфекционных гинекологических заболеваниях, что может стать основой для разработки новых методов предотвращения их неблагоприятных исходов. конфликт интересов Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов. финансирование исследования Работа выполнена с использованием биоматериала человека, собранного и сохраняемого в рамках научной программы Научные основы создания национального банка-депозитария живых систем (соглашение РНФ № 14-50-00029). Работы по созданию модели фиброза поддержаны грантом РФФИ (грант № 18-015-00525), эксперименты по оценке противофиброзного действия сыворотки менструальной крови выполнены в рамках государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова.About the authors R. Y Eremichev Institute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University O. A Grigorieva Institute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University K. Y Kulebyakin Institute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University A. Yu Efimenko Institute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University P. I Makarevich Institute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University Email: [email protected]

- R., Hart R., Karthigasu K.A. et al. A re-appraisal of the morphological changes within the endometrium during menstruation: A hysteroscopic, histological and scanning electron microscopic study. Hum Reprod. 2009; 24(6): 1393-401. - Zhou Q., Wu X., Dai X. et al. The different dosages of estrogen affect endometrial fibrosis and receptivity, but not sdf-1/cxcr4 axis in the treatment of intrauterine adhesions. Gynecol Endocrinol. 2018; 34(1): 49-55. - Zhu H.Y., Ge T.X., Pan Y.B. et al. Advanced role of hippo signaling in endometrial fibrosis: Implications for intrauterine adhesion. Chin Med J (Engl). 2017; 130(22): 2732-7. - Shen M., Liu X., Zhang H. et al. Transforming growth factor beta1 signaling coincides with epithelial-mesenchymal transition and fibroblast-tomyofibroblast transdifferentiation in the development of adenomyosis in mice. Hum Reprod. 2016; 31(2): 355-69. - Ibrahim M.G., Sillem M., Plendl J. et al. Myofibroblasts are evidence of chronic tissue microtrauma at the endometrial-myometrial junctional zone in uteri with adenomyosis. Reprod Sci. 2017; 24(10): 1410-1418. - Li J., Du S., Sheng X. et al. Microrna-29b inhibits endometrial fibrosis by regulating the sp1-tgf-beta1/smad-ctgf axis in a rat model. Reprod Sci. 2016; 23(3): 386-94. - Li J., Cen B., Chen S. et al. Microrna-29b inhibits tgf-beta1-induced fibrosis via regulation of the tgf-beta1/smad pathway in primary human endometrial stromal cells. Mol Med Rep. 2016; 13(5): 4229-37. - Falke L.L., Gholizadeh S., Goldschmeding R. et al. Diverse origins of the myofibroblast-implications for kidney fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2015; 11(4): 233-44. - Pellicoro A., Ramachandran P., Iredale J.P. et al. Liver fibrosis and repair: Immune regulation of wound healing in a solid organ. Nat Rev Immunol. 2014; 14(3): 181-94. - Kong P., Christia P.,Frangogiannis N.G. The pathogenesis of cardiac fibrosis. Cell Mol Life Sci. 2014; 71(4): 549-74. - Wynn T.A.,Ramalingam T.R. Mechanisms of fibrosis: Therapeutic translation for fibrotic disease. Nat Med. 2012; 18(7): 1028-40. - Еремичев Р.Ю. М.О.А., Александрушкина Н.А., Кулебякин К.Ю., Дыйканов Д.Т., Макаревич П.И. Сыворотка менструальной крови оказывает противофиброзное действие на мезенхимные стромальные клетки эндометрия человека. Цитология 2018; 60(2): 96-103. - Ferguson M.W.,O'Kane S. Scar-free healing: From embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2004; 359(1445): 839-50. - Chen C.Z., Peng Y.X., Wang Z.B. et al. The scar-in-a-jar: Studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 2009; 158(5): 1196-209. - Talele N.P., Fradette J., Davies J.E. et al. Expression of alpha-smooth muscle actin determines the fate of mesenchymal stromal cells. Stem Cell Reports. 2015; 4(6): 1016-30. - Anders H.J.,Schaefer L. Beyond tissue injury-damage-associated molecular patterns, toll-like receptors, and inflammasomes also drive regeneration and fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2014; 25(7): 1387-400. - Desai V.D., Hsia H.C.,Schwarzbauer J.E. Reversible modulation of myofibroblast differentiation in adipose-derived mesenchymal stem cells. PLoS One. 2014; 9(1): e86865. - Yang X., Chen B., Liu T. et al. Reversal of myofibroblast differentiation: A review. Eur J Pharmacol. 2014; 734: 83-90.