{"paper_id":"d1a7b078-a00b-452b-807e-2d8d7f3b6129","body_text":"Soluble factors formed during the healing of the endometrium suppress its \"fibrosis” in vitro\n- Authors: Eremichev R.Y1, Grigorieva O.A1, Kulebyakin K.Y1, Efimenko A.Y.1, Makarevich P.I1\n-\nAffiliations:\n- Institute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University\n- Issue: Vol 13, No 2 (2018)\n- Pages: 63-66\n- Section: Articles\n- Submitted: 05.01.2023\n- Published: 15.06.2018\n- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/120738\n- DOI: https://doi.org/10.23868/201808021\n- ID: 120738\nCite item\nFull Text\nAbstract\nFull Text\nВведение Эндометрий здоровых женщин репродуктивного возраста регулярно повреждается во время менструации и заживает путем полной регенерации без фиброзирова-ния [1]. Быстрое восстановление нормальной структуры ткани делает возможной эффективную подготовку слизистой оболочки матки к беременности в последующих фазах менструального цикла. Однако при некоторых гинекологических заболеваниях, таких как синдром Ашермана, аденомиоз и др. [2-4], которые, как правило, протекают хронически и плохо поддаются лечению, развивается фиброз эндометрия. В подобных случаях при заживлении слизистой оболочки матки происходит трансдифференцировка1 ча- 1 примечание от редактора: использован термин в интерпретации авторов; с позиции классической гистологической школы, в данном случае более корректен термин «дифференцировка» сти мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК) в миофибробласты. Данные клетки приобретают способность к контракции, начиная экспрессировать а-гладкомышечный актин (а-SMA), а также продуцируют большое количество белков межклеточного матрикса (коллаген I, ED-A фибронектин и др.), ремоделируя ткани и приводя к их фиброзированию [5-7]. Это общее для большинства органов человеческого организма и ключевой эффекторное звено в механизмах фиброзирова-ния тканей [8-11]. У здоровых женщин во время заживления эндометрия не происходит трансдифференцировки эМСК в миофибробласты, что может быть связано со специфическим микрокружением, которое возникает в ходе данного процесса. Помимо компонентов межклеточного матрикса и клеточных элементов оно содержит растворимые факторы. Вероятно, это микроокружение способно не только стимулировать заживление, но и подавлять фиброзирование эндометрия. Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Ранее мы показали, что культивирование эМСК в присутствии сыворотки менструальной крови (СМК) здоровых женщин приводит к значительному снижению содержания а-гладкомышечного актина (a-SMA, маркера миофибробластов) по сравнению с культивированием в присутствии сыворотки периферической крови (СПК) тех же доноров [12]. Более специфичным с позиции механизма развития фиброза является изучение индуцированного процесса в модели in vitro. TGF-ß1 - один из основных растворимых факторов, запускающих трансдифференцировку эМСК в миофибробласты как in vivo, так и in vitro, что позволяет использовать его в качестве профиброгенного стимула в различных моделях фиброза [13, 14]. Задачей данной работы стала проверка влияния СМК здоровых женщин на миофибробласты, полученные из эМСК путем индуцированной TGF-ß1 трансдифференцировки, с целью оценки противофиброзного потенциала содержащихся в ней растворимых факторов. Материал и методы Выделение эМСК и образцов сывороток В один день от одного здорового донора после получения информированного согласия были собраны образцы менструальной и периферической (из кубитальной вены) крови. Образцы хранили при +4 °С в течение 12 ч. и затем центрифугировали при 300 g в течение 20 мин. Супернатанты (СМК и СПК) собирали, пропускали через фильтр 0,22 мкм и хранили при -20 °С до дальнейшего использования. Осадок клеток менструальной крови ресуспендировали в 5-ти объемах раствора Хенкса, содержащего 2 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Life Technologies Corporation, США) и 1 % 0,5 M ЭДТА. После фильтрации через 1 00 мкм фильтр взвесь аккуратно наслаивали на 15 мл 15 % раствора йодиксанола (Life Technologies Corporation, США) и центрифугировали при 500 g в течение 40 мин. Слой клеток, оставшийся на поверхности раствора йодиксанола собирали, ресуспенди-ровали в 1 0 мл раствора Хенкса и центрифугировали при 100 g в течение 10 мин. Полученный осадок клеток ресуспендировали в ростовой среде DMEM/F12 (Life Technologies Corporation, США), содержащей 10 % ФБС и 1 % пенициллина и стрептомицина, затем переносили на адгезивные чашки Петри на 24 ч. Прикрепившиеся клетки культивировали в той же ростовой среде. Смену среды проводили каждые 3-4 сут. Оценка противофиброзной активности СМК на культуре эМСК СМК и СПК размораживали, разводили средой DMEM/F12, выравнивая по концентрации белка, и культивировали эМСК 4 пассажа в подготовленных растворах в течение 2 сут., после чего проводили иммуноцитоф-луоресцентный анализ a-SMA. Моделирование фиброза эндометрия in vitro эМСК 4 пассажа высаживали в лунки 48-луночного планшета в ростовой среде DMEM/F12 без ФБС. Через 1 сут. среду заменяли на аналогичную среду, содержащую 5 нг/мл TGF-ß1 (R&D Systems, США), культивировали в течение 4 сут. и затем проводили иммуноцитофлу-оресцентный анализ a-SMA в эМСК. Оценка противофиброзной активности СМК на модели фиброза эндометрия in vitro СМК и СПК размораживали и разводили средой DMEM/F12, выравнивая по концентрации белка. Миофибробласты, полученные при моделировании фиброза эндометрия, культивировали в подготовленных растворах в течение 2 сут., после чего проводили имму-ноцитофлуоресцентный анализ a-SMA. Иммуноцитофлуоресцентный анализ По завершении эксперимента клетки фиксировали 4 % формалином в течение 10 мин., 3 раза отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) инкубировали с 10 % козьей сывороткой и снова отмывали ФСБ 3 раза. Для выявления целевого белка клетки инкубировали в течение ночи при температуре +4 °С с моноклональными мышиными антителами против a-SMA человека (DAKO, США), отмывали ФСБ 3 раза и инкубировали с вторыми антителами, реактивными к IgG мыши и конъюгированными с AlexaFluor594 (Invitrogen, США). Ядра клеток метили флуоресцентным красителем DAPI (DAKO, США). Изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM6000B, снабженного камерой Leica DFC 360FX (Leica Microsystems GmbH, Германия). Подсчет ядер и площади флуоресцентного сигнала на полученных изображениях проводили в программе Fiji. Статистический анализ Эксперимент был выполнен в дупликатах. При имму-ноцитофлуоресцентном анализе использовали объектив с минимальным увеличением для захвата наибольшей площади поверхности препаратов и получали не менее 2 изображений с каждого из них. Общую площадь a-SMA-позитивных стресс-фибрилл нормировали на количество ядер и по полученному показателю сравнивали группы изображений, применяя критерий Манна-Уитни. Результаты Исследование противофиброзного действия СМК на культуру эМСК МСК, выделенные из различных источников, при культивировании в содержащих ФБС средах медленно транс-дифференцируются в миофибробласты, в результате чего клеточная популяция становится гетерогенной по содержанию a-SMA, локализованного в стресс-фибриллах [15]. Наличие и степень выраженности данного феномена может зависеть от множества факторов: источника клеток, характеристик сыворотки, протокола культивирования клеток и др. В наших экспериментах при культивировании эМСК в среде DMEM/F12 с 10 % ФБС значительная часть клеток на 4 пассаже содержала стресс-фибриллы, положительные на a-SMA (рис. 1а), что свидетельствовало об их трансдифференцировке в миофибробласты. Важно отметить, что культивирование эМСК 4 пассажа в присутствии СПК не влияло на количество a-SMA-позитивных стресс-фибрилл в клетках (рис. 1в), в то время как культивирование в присутствии СМК - уменьшало их количество (рис. 1б). На основании приведенных, а также полученных нами ранее данных [12], можно предположить противофиброзное действие СМК на культуру эМСК. Оценка влияния СМК на фиброз эндометрия, смоделированный in vitro После 4 сут. культивирования с TGF-ß1 (5 нг/мл) большинство эМСК в культуре приобретали характерную для миофибробластов морфологию с четко выраженными a-SMA-позитивными стресс-фибриллами (рис. 2), что коррелирует с результатами других авторов, использовавших данную методику [7]. Последующее культивирование полученных миофибробластов, в присутствии СПК не приводило к выраженным изменениям, в то время как СМК значимо (p=0,03) уменьшала общую площадь a-SMA-позитивных стресс-фибрилл (рис. 3). Полученные Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 65 А I Б I В Рис. 1. Культура мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК): А - эМСК при культивировании с фетальной бычьей сывороткой; Б - эМСК при культивировании с сывороткой менструальной крови (2 сут.); В - эМСК при культивировании с сывороткой периферической крови (2 сут.). Иммуноцитохимическая реакция с антителами к а-гладкомышечному актину (красный цвет). Окраска ядер - dapi. Масштабный отрезок - 100 мкм А Б Рис. 2. Миофибробласты в культуре мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК) после моделирования «фиброза» эндометрия in vitro: А - эМСК при культивировании в DMEM/F12; Б - миофибробласты, полученные из эМСК при культивировании в DMEM/F12 с TGF-ß1. Иммуноцитохимическая реакция с антителами к а-гладкомышечному актину (красный цвет). Окраска ядер - dapi. Масштабный отрезок - 100 мкм А Б Рис. 3. Культура мезенхимальных стромальных клеток эндометрия (эМСК) после воздействия сыворотки менструальной крови: А - миофибробласты после 2 сут. культивирования с сывороткой периферической крови (СПК); Б -миофибробласты через 2 сут. культивирования с сывороткой менструальной крови; в - диаграмма размаха, отражающая различия в общей площади a-SMA-позитивных (a-SMA+) стресс-фибрилл (медиана, верхний и нижний квартили, минимум и максимум). Иммуноцитохимическая реакция с антителами к a-гладкомышечному актину (красный цвет). Окраска ядер - dapi. Масштабный отрезок - 100 мкм результаты свидетельствуют о наличии в составе СМК растворимых факторов, обладающих противофиброз-ным действием in vitro. Обсуждение Повреждение слизистой оболочки матки (эндометрия) регулярно происходит при менструации, а также при ряде хирургических вмешательств, рутинно выполняемых у женщин репродуктивного возраста в акушерско-гинекологической практике [1]. Несмотря на то, что происходящая при этом гибель клеток сопровождается выбросом целого спектра биологически активных компонентов, которые создают мощный про-фиброгенный стимул [16], заживление эндометрия не сопровождается фиброзированием. Мы предполагаем, что это может быть обусловлено продукцией Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 66 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ противофиброзных факторов в тканях слизистой оболочки матки во время заживления. В нашей предыдущей работе мы использовали СМК в качестве модельного объекта, содержащего растворимые факторы, регулирующие заживление эндометрия, и показали, что СМК поддерживает пролиферацию эМСК, а также снижает содержание в культуре этих клеток a-SMA. В настоящей работе при помощи иммуноцитофлуорес-центного анализа мы обнаружили, что под влиянием СМК количество a-SMA-позитивных стресс-фибрилл в эМСК снижается по сравнению с воздействием СПК или ФБС (рис. 1). Вместе с полученными ранее результатами Вестерн-блот-анализа [12] это свидетельствовало о способности содержащихся в составе СМК растворимых компонентов оказывать противофиброзное действие на культуру эМСК. Следующим этапом стала оценка противофиброз-ного действия СМК на in vitro модели фиброза эндометрия. Наши эксперименты показали, что после смены профиброгенного микроокружения, смоделированного при помощи TGF-ß1, на СМК происходило уменьшение количества a-SMA-позитивных стресс-фибрилл (рис. 3). Вероятнее всего, добавление СМК позволяет до определенной степени повернуть вспять процесс трансдиффе-ренцировки эМСК в миофибробласты. Обратимый характер сборки a-SMA-позитивных стресс-фибрилл в МСК под действием профиброгенных и противофиброзных стимулов описан в литературе [17, 18]. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о продукции в слизистой оболочке матки растворимых факторов, способных подавлять фибро-зирование при её заживлении. Для объяснения этого феномена необходимо идентифицировать содержащиеся в СМК регуляторные молекулы, обладающие проти-вофиброзным действием. В дальнейшем это позволит установить не только механизмы заживления эндометрия, но и причины его фиброзирования при неинфекционных гинекологических заболеваниях, что может стать основой для разработки новых методов предотвращения их неблагоприятных исходов. конфликт интересов Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов. финансирование исследования Работа выполнена с использованием биоматериала человека, собранного и сохраняемого в рамках научной программы Научные основы создания национального банка-депозитария живых систем (соглашение РНФ № 14-50-00029). Работы по созданию модели фиброза поддержаны грантом РФФИ (грант № 18-015-00525), эксперименты по оценке противофиброзного действия сыворотки менструальной крови выполнены в рамках государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова.About the authors\nR. Y Eremichev\nInstitute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University\nO. A Grigorieva\nInstitute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University\nK. Y Kulebyakin\nInstitute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University\nA. Yu Efimenko\nInstitute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University\nP. I Makarevich\nInstitute of Regenerative Medicine, Medical Research Centre of M.V. Lomonosov Moscow State University\nEmail: pavel.makarevich@gmail.com\nReferences\n- R., Hart R., Karthigasu K.A. et al. A re-appraisal of the morphological changes within the endometrium during menstruation: A hysteroscopic, histological and scanning electron microscopic study. Hum Reprod. 2009; 24(6): 1393-401.\n- Zhou Q., Wu X., Dai X. et al. The different dosages of estrogen affect endometrial fibrosis and receptivity, but not sdf-1/cxcr4 axis in the treatment of intrauterine adhesions. Gynecol Endocrinol. 2018; 34(1): 49-55.\n- Zhu H.Y., Ge T.X., Pan Y.B. et al. Advanced role of hippo signaling in endometrial fibrosis: Implications for intrauterine adhesion. Chin Med J (Engl). 2017; 130(22): 2732-7.\n- Shen M., Liu X., Zhang H. et al. Transforming growth factor beta1 signaling coincides with epithelial-mesenchymal transition and fibroblast-tomyofibroblast transdifferentiation in the development of adenomyosis in mice. Hum Reprod. 2016; 31(2): 355-69.\n- Ibrahim M.G., Sillem M., Plendl J. et al. Myofibroblasts are evidence of chronic tissue microtrauma at the endometrial-myometrial junctional zone in uteri with adenomyosis. Reprod Sci. 2017; 24(10): 1410-1418.\n- Li J., Du S., Sheng X. et al. Microrna-29b inhibits endometrial fibrosis by regulating the sp1-tgf-beta1/smad-ctgf axis in a rat model. Reprod Sci. 2016; 23(3): 386-94.\n- Li J., Cen B., Chen S. et al. Microrna-29b inhibits tgf-beta1-induced fibrosis via regulation of the tgf-beta1/smad pathway in primary human endometrial stromal cells. Mol Med Rep. 2016; 13(5): 4229-37.\n- Falke L.L., Gholizadeh S., Goldschmeding R. et al. Diverse origins of the myofibroblast-implications for kidney fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2015; 11(4): 233-44.\n- Pellicoro A., Ramachandran P., Iredale J.P. et al. Liver fibrosis and repair: Immune regulation of wound healing in a solid organ. Nat Rev Immunol. 2014; 14(3): 181-94.\n- Kong P., Christia P.,Frangogiannis N.G. The pathogenesis of cardiac fibrosis. Cell Mol Life Sci. 2014; 71(4): 549-74.\n- Wynn T.A.,Ramalingam T.R. Mechanisms of fibrosis: Therapeutic translation for fibrotic disease. Nat Med. 2012; 18(7): 1028-40.\n- Еремичев Р.Ю. М.О.А., Александрушкина Н.А., Кулебякин К.Ю., Дыйканов Д.Т., Макаревич П.И. Сыворотка менструальной крови оказывает противофиброзное действие на мезенхимные стромальные клетки эндометрия человека. Цитология 2018; 60(2): 96-103.\n- Ferguson M.W.,O'Kane S. Scar-free healing: From embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2004; 359(1445): 839-50.\n- Chen C.Z., Peng Y.X., Wang Z.B. et al. The scar-in-a-jar: Studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 2009; 158(5): 1196-209.\n- Talele N.P., Fradette J., Davies J.E. et al. Expression of alpha-smooth muscle actin determines the fate of mesenchymal stromal cells. Stem Cell Reports. 2015; 4(6): 1016-30.\n- Anders H.J.,Schaefer L. Beyond tissue injury-damage-associated molecular patterns, toll-like receptors, and inflammasomes also drive regeneration and fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2014; 25(7): 1387-400.\n- Desai V.D., Hsia H.C.,Schwarzbauer J.E. Reversible modulation of myofibroblast differentiation in adipose-derived mesenchymal stem cells. PLoS One. 2014; 9(1): e86865.\n- Yang X., Chen B., Liu T. et al. Reversal of myofibroblast differentiation: A review. Eur J Pharmacol. 2014; 734: 83-90.","source_license":"CC0","license_restricted":false}