The use of the dopamine agonist cabergoline in the therapy of surgically induced endometriosis in rats

Введение Эндометриоз — распространенное среди женщин репродуктивного возраста гинекологическое заболевание, частота встречаемости которого, по некоторым данным, достигает 10% [1]. Основу патофизиологии данного заболевания составляют воспалительная реакция, сниженный апоптоз, пролиферация и адгезия клеток, а также инвазия эктопического эндометрия в подлежащие ткани и неоангиогенез [2]. Следует отметить, что неоангиогенез играет ключевую роль в развитии и росте эндометриоидных гетеротопий. Известно, что экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) значительно повышена в эндометриоидных гетеротопиях красного цвета, а также при глубоком инфильтративном эндометриозе [3, 4].Анализ литературных данных свидетельствует о том, что современные методы терапии эндометриоза не всегда обеспечивают достижение стойких клинических эффектов и гарантированно положительных результатов. Несмотря на высокую частоту бесплодия у больных эндометриозом, большинство схем специфической терапии заболевания несовместимы с планированием беременности. В связи с наличием побочных эффектов различной степени выраженности у существующих препаратов остается нерешенным вопрос о возможности назначения терапии для длительного непрерывного приема в качестве противорецидивного лечения. Вышесказанное подчеркивает актуальность поиска новых направлений в медикаментозной терапии эндометриоза, но исследования включают этические ограничения на проведение повторных операций для оценки эффективности терапии и использование экспериментальных препаратов. Моделирование эндометриоза на животных позволяет в определенной степени решить эти проблемы. Помимо этого, такие модели позволяют ставить эксперименты, исключающие внешние влияния: индивидуальную вариабельность в возрасте, стадии менструального цикла, использование дополнительных препаратов, разнообразную пищу и воздействие окружающей среды. Первые успешные попытки моделирования эндометриоза были проведены в 1920 г. V. Jacobson на кроликах и приматах [5]. С этого момента было разработано множество хирургических методов для индукции эндометриоза у разных видов животных. Наиболее сопоставимой с развитием заболевания у человека является модель эндометриоза у приматов, многие виды которых имеют циклический характер менструации, более того, только у них возможно спонтанное развитие эндометриоза с появлением эктопических поражений, гистологически идентичных человеческим и возникающих в аналогичных областях. Тем не менее частота спонтанного эндометриоза в популяции приматов невелика, что побуждает исследователей индуцировать эндометриоз путем увеличения объема ретроградной менструации или внутрибрюшинной инъекции эндометрия. Этические соображения и высокая стоимость проведения экспериментов с использованием приматов ограничивают применение этой модели в исследовании эндометриоза, поэтому в основном экспериментальные модели эндометриоза разрабатываются на мелких лабораторных животных, чаще всего на грызунах. Такие модели разделяют на два типа: гомологичные и гетерологичные в зависимости от происхождения прививаемой ткани [2]. В гомологичной модели ткань эндометрия получают из матки животного и трансплантируют или диспергируют в брюшную полость иммунокомпетентных животных. В гетерологичной модели эксплантаты эндометрия человека прививают внутрибрюшинно или подкожно мышам с иммунодефицитом или иммуносупрессией. В настоящее время большинство экспериментальных моделей эндометриоза выполняется с использованием крыс. Методом выбора для индукции эндометриоза в этой модели является аутотрансплантация участков маточной ткани в брюшную полость. Маточную ткань получают при удалении одного из двух рогов матки. Крысы имеют бикорнеальную матку, состоящую из двух равных частей, что позволяет сравнить эндометриоидные имплантаты с оставшейся маточной тканью. Данная модель обладает рядом преимуществ. Для лабораторных крыс характерен 4–5-дневный эстральный цикл, следовательно, за год можно наблюдать 70–80 репродуктивных циклов по сравнению с 12 циклами у приматов. Репродуктивный цикл хорошо охарактеризован и может контролироваться путем забора и анализа мазков из влагалища. Половое созревание крысы происходит в течение 2 мес. после родов, а продолжительность жизни составляет около 2 лет. Репродуктивная эндокринная картина крысы аналогична человеческой, но характеризуется более короткой лютеиновой фазой. Хирургическая индукция эндометриоза у крыс достаточно хорошо отработана и в большинстве случаев позволяет сформировать эндометриоидные гетеротопии. Недостатки использования крысы в качестве модели эндометриоза включают широкий межвидовой разрыв между крысами и людьми. Эндометрий крыс не подвергается расщеплению тканей, поэтому в эстральной фазе цикла, аналогичной менструальной реакции у человека, у крыс не наблюдается кровотечения, что обусловливает иной вид хирургически сформированных эндометриоидных гетеротопий. Однако пересаженная маточная ткань у крысы растет и ведет себя аналогично эндометриоидным гетеротопиям у человека, она реагирует на лечение стероидами и содержит эндометриальные железы и строму, что подтверждается данными гистологического исследования. Было отмечено, что эндометриоидоподобные имплантаты у крысы демонстрируют регрессию эпителиальных клеток и стромальную фибробластную трансформацию, аналогичную гистологическим данным в эндометриоидных поражениях человека. В настоящее время доказана эффективность применения агониста дофамина каберголина в профилактике синдрома гиперстимуляции яичников как у животных, так и у людей посредством блокирования неоангиогенеза и сосудистой проницаемости за счет нарушения связывания VEGF с рецептором VEGF2 [6–8]. Проведенное в 2009 г. исследование позволило оценить антиангиогенный эффект каберголина в эндометриоидных имплантатах в экспериментальной модели эндометриоза у мышей и уточнить молекулярные механизмы, с помощью которых каберголин оказывает свое действие [9]. Лабораторным животным моделировали эндометриоз, подсаживая на брюшину эндометриоидные гетеротопии, полученные при операциях у женщин с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ). Мышам с хирургически индуцированным эндометриозом брюшины проводили лечение каберголином (перорально) в дозе 0,5 мг/кг и 0,1 мг/кг ежедневно в течение 14 дней. Группу контроля составили животные, получавшие плацебо. После лечения оценивались размеры поражений, клеточная пролиферация на основании маркера Кi67, ангиогенез и фосфорилирование VEGFR, а также экспрессия генов ангиогенеза. Было получено значительное снижение доли активных эндометриоидных поражений в группе животных, получавших лечение каберголином. Также был значительно снижен неоангигенез и выявлены изменения в экспрессии генов ангиогенеза [10]. Степень фосфорилирования VEGFR-2 была достоверно ниже у животных, получавших каберголин, чем в контрольной группе. В исследовании, проведенном в 2011 г., была оценена эффективность применения эрголиновых (каберголина) и неэрголиновых (хинаголида) агонистов дофамина в экспериментальной модели эндометриоза у мышей. Модель эндометриоза была аналогична описанной ранее. Животных поделили на группы в зависимости от препаратов, используемых в качестве терапии: получавшие перорально 0,5 мг/сут каберголина и получавшие хинаголид в дозе 50 мкг/сут и 200 мкг/сут в течение 14 дней. Как и в предыдущем исследовании 2009 г., оценивались такие показатели, как размеры гетеротопий, маркер клеточной пролиферации, ангиогенез и фосфорилирование VEGFR, а также экспрессия генов ангиогенеза. Следует отметить, что неэрголиновые агонисты дофамина показали такую же эффективность, как и эрголиновые, что говорит о возможности применения обеих групп препаратов для лечения НГЭ [12]. В 2014 г. была предпринята попытка сравнения эффективности различных препаратов (лейпрорелин, бромокриптин, каберголин) у крыс с хирургически индуцированным эндометриозом (метод индукции эндометриоза — аутотрансплантация эндометрия на брюшину). Для подтверждения наличия эндометриоза у грызунов была проведена повторная лапаротомия через 30 дней. Далее в течение 30 дней крысы получали терапию соответствующими препаратами. В работе была показана схожая эффективность агонистов гонадотропин-рилизинг гормонов и агонистов дофамина в уменьшении размеров эндометриоидных гетеротопий [13]. Цель исследования: определить влияние агониста дофамина каберголина на эндометриоидные гетеротопии на основании хирургически индуцированной модели эндометриоза у крыс. Материал и методы В нашей работе эксперименты выполнены на 20 крысах-самках линии Вистар массой 200±50 г. Все лабораторные животные были выведены в ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д. О. Отта» при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день/ночь»). Уход за животными и проведение экспериментов осуществлялись согласно основным морально-этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» (Good Laboratory Practice), утвержденные приказом Министерства здравоохранения и социального развития от 23.08.2010 № 708н, и «Международные рекомендации по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятые Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г. Подготовка. Для оценки репродуктивной функции у крыс исследовали длительность эстрального цикла и его фаз. С этой целью у крыс в утренние часы в течение 7 и более дней перед операцией проводили забор влагалищных мазков, которые оценивали после окраски метиленовым синим. Первый этап — создание модели. Первое оперативное вмешательство проводилось в фазу эструса, аналогичную менструальной реакции у человека. С целью анестезии при операции использовался золазепама гидрохлорид 100 в дозировке 30 мг/кг, после операции проводилась профилактика инфекционных осложнений путем внутримышечного введения цефтриаксона, обезболивание выполнялось 2% раствором кеторолака внутримышечно. Ход операции: после обработки передней брюшной стенки проводили послойный срединный разрез, затем выполняли ревизию брюшной полости. После выделения левого рога матки проводились перевязка на уровне бифуркации маточных рогов и удаление левого рога и левого яичника, после этого выполнялась овариоэктомия справа. Затем удаленный рог матки рассекали продольно и из полученного участка вырезали 2 фрагмента размером 3×3 мм. Вырезанные фрагменты подшивали справа и слева на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки, на область бифуркации сосудов с ориентацией эндометрия к сосуду, а миометрия — в брюшную полость. В качестве шовного материала был использован викрил марки Ethicon. Остаток маточной ткани фиксировали в 10% растворе формалина и направляли на гистологическое исследование. С целью создания сопоставимого эстрогенного фона все крысы дважды в неделю получали масляный раствор эстрадиола внутримышечно с момента овариоэктомии до конца исследования. Контроль эффективности заместительной гормональной терапии также осуществлялся путем анализа влагалищных мазков. Также на первом этапе была проведена рандомизация крыс в основную и контрольную группы. Второй этап — оценка результатов моделирования. Через 14±2 дня после операции у крыс проводили лапароскопию, визуализировали и измеряли сформировавшиеся эндометриоидноподобные очаги. Схема анестезии и антибактериальной терапии была аналогична таковой при первой операции. На следующий день после лапароскопии крысы из основной группы получали каберголин в дозировке 0,1 мг/кг/сут перорально. Продолжительность введения препарата составила 21±3 дня. Третий этап — оценка эффективности терапии. В конце животные выводились из эксперимента, выполнялись аутопсия, оценка и измерение эндометриоидных очагов. При сохранении эндометриоидной гетеротопии проводились ее иссечение и фиксация в нейтральном формалине для последующего гистологического исследования. Также для гистологического исследования удалялся оставшийся рог матки. Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывались в электронных таблицах Microsoft Excel с использованием статистических методов (стандартное отклонение, критерий Стьюдента). Результаты и обсуждение В 83% случаев при моделировании заболевания были сформированы эндометриоидные имплантаты. В одном случае при лапароскопии была обнаружена полная редукция имплантата с одной стороны, в одном — измерения имплантата были невозможны в связи со спаечным процессом. В начале лечения средние площади поверхности эндометриоидных имплантатов были сопоставимы в обеих группах — 13,6±4,5 мм2 в группе контроля и 16,3±2,3 мм2 в основной группе. В основной группе после 3 нед. применения каберголина в 22% случаев была обнаружена полная резорбция эндометриоидных гетеротопий (рис. 1). В одном случае отмечались инфекционные осложнения с образованием инкапсулированного абсцесса на месте имплантата. Во всех остальных случаях наблюдалось достоверное уменьшение площади гетеротопии на 64±11%. В контрольной группе было отмечено увеличение размеров очагов эндометриоза на 26±7%. Средняя площадь эндометриоидных гетеротопий после терапии каберголином в основной группе составила 7,8±1,9 мм2 и была достоверно меньше, чем в группе контроля (18,3±5,2 мм2) (p<0,05).Аутотрансплантация маточных фрагментов в перитонеальную полость является хорошо известным методом индукции эндометриоза у крыс, и эти имплантаты подобны человеческим эндометриоидным гетеротопиям. Они реагируют аналогично эндометриоидным очагам и клеткам в изолированных клеточных культурах. Поэтому представленная в нашей работе экспериментальная модель позволяет оценивать эффективность новых терапевтических подходов в терапии эндометриоза. Большинство традиционных медикаментозных методов лечения эндометриоза направлены на снижение эндогенного производства стероидов. Хотя они эффективны в уменьшении размеров эндометриоидных поражений и интенсивности болевого синдрома, их неблагоприятные эффекты ограничивают их долгосрочное использование, а частота рецидивов после прекращения терапии достаточно высока. Кроме того, существующие препараты не позволяют совмещать эффективнуютерапию эндометриоза с планированием беременности, т. к. для эффективного лечения эндометриоза необходимы антигонадотропное влияние препарата и, следовательно, подавление овуляции. По этим причинам лечение эндометриоза требует новых подходов, которые могут быть эффективны в отношении различных патогенетических механизмов. Неоангиогенез является одним из основополагающих звеньев патогенеза многих заболеваний, таких как рак, атеросклероз и эндометриоз. Доказано, что эндометриоидные поражения характеризуются повышенной васкуляризацией, и признано, что ангиогенез является необходимым для их возникновения и роста в эктопических сайтах [2]. Таким образом, подавление развития кровеносных сосудов путем ингибирования VEGF может быть новым терапевтическим подходом к лечению эндометриоза. В исследовании С. Becker et al. было установлено, что лечение эндометриоидных поражений антиангиогенными препаратами не влияет на фертильность (эстральный цикл, образование желтого тела, уровни гормонов в сыворотке и время спаривания), а также на беременность экспериментального животного (продолжительность беременности, количество плодов, их жизнеспособность и фертильность) [14]. Влияние ангиостатических агентов на эндометриоидные имплантаты было также продемонстрировано M. Hull et al. Авторы пришли к выводу, что антиангиогенные агенты ингибируют рост имплантатов, уменьшая объем поступающей крови [3], показали, что блокировка рецептора VEGF у обезьян приводила к подавлению очагов эндометриоза [15]. Кроме того, Ö. Moraloglu et al. продемонстрировали, что антиангиогенный агент уменьшает образование и адгезионную способность очагов, в связи с чем можно сделать вывод, что антиангиогенные агенты могут благотворно влиять на фертильность, устраняя бесплодие [16]. В нашем исследовании была отмечена достоверная регрессия, а в ряде случаев — полная резорбция эндометриоидных имплантатов на фоне применения каберголина в экспериментальной модели эндометриоза у крыс, что обосновывает целесообразность применения данной медикаментозной терапии в клинической практике у пациенток с эндометриозом. Заключение Представленные в нашей работе результаты демонстрируют высокую эффективность каберголина, что свидетельствует о необходимости продолжения экспериментальных исследований в данном направлении для уточнения наиболее эффективных дозировок и длительности терапии и является важным шагом на пути разработки клинических рекомендаций по применению каберголина в лечении эндометриоза. В нашей работе мы оценивали эффективность проводимой терапии на основании уменьшения площади гетеротопий, однако для уточнения механизма действия данной терапии необходима оценка маркеров пролиферации, ангиогенеза, апоптоза, что и планируется в наших последующих исследованиях.Сведения об авторах: 1,2Ярмолинская Мария Игоревна — д.м.н., профессор, руководитель отделения эндокринологии и репродукции, профессор кафедры акушерства и гинекологии; 1Суслова Елена Владимировна — аспирант; 1Флорова Маргарита Сергеевна — аспирант; 1Молотков Арсений Сергеевич — к.м.н., научный сотрудник отделения эндокринологии и репродукции. 1ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д. О. Отта». 199034, Россия, г. Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. 2ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И. И. Мечникова Минздрава России. 191015, Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41. Контактная информация: Флорова Маргарита Сергеевна, е-mail: [email protected]. Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Конфликт интересов отсутствует. Статья поступила 09.07.2018. About the authors: 1,2Mariya I. Yarmolinskaya — MD, PhD, Professor, Head of the Department of Endocrinology and Reproduction, Professor of the Department of Obstetrics and Gynecology; 1Elena V. Suslova — graduate student; 1Margarita S. Florova — graduate student; 1Arseniy S. Molotkov — MD, PhD, Researcher of the Department of Endocrinology and Reproduction. 1Research Institute Of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D. O. Ott. 3, Mendeleevskaya line, St. Petersburg, 199034, Russian Federation. 2North-western State Medical University named after I.I. Mechnikov. 41, Kirochnaya str., St. Petersburg, 191015, Russian Federation. Contact information: Margarita S. Florova, e-mail: [email protected]. Financial Disclosure: no author has a financial or property interest in any material or method mentioned. There is no conflict of interests. Received 09.07.2018.