Avaliação do tamanho, quantidade e microRNAs de vesículas extracelulares do fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose avançada submetidas à estimulação ovariana e fertilização >i/i<

Andozia, MB. Determination of s ize, quantity and microRNAs of extracellular vesicles from follicular fluid of infertile women with and without advanced endometriosis undergoing ovarian stimulation and in vitro fertilization. Thesis (Doctorate Degree in Sciences) – Graduated Program in Gynecology and Obstetrics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2024. Endometriosis is a highly prevalent disease among women of reproductive age , strongly, associated with infertility . However, the mechanisms involved have not yet been fully elucidated, although several studies propose an i mpairment effect of endometriosis on oocyte quality. In recent years, the role of extracellular vesicles (EV), as mediators of cellular communication, has been investigated at all stages of oocyte development. Although, no study to date has evaluated EV in the serum and follicular fluid (F F) of infertile women with endometriosis. In order to expand the understanding of the extracellular vesicles and oocyte quality, we aimed to isolate and characterize the size and quantity of EV from serum and FF of infertile women with and without advanced endometriosis, as well as to compare the expression of 82 EV miRNAs from FF of these same women. Therefore, a case-control study was carried out using serum and follicular fluid samples obtained from 30 infertile women (10 with moderate and severe endometriosis without endometrioma and 20 with male factor infertility) who underwent controlled ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Serum and FF samples were collected at the time of oocyte capture and characterized regarding the quantification of extracellular vesicles per ml and size in nanometers by Nanoparticle Tracking Analysis. Comparison of the expression of 82 miRNAs in FF-EV was performed by Real Time – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The comparison between the groups with and without endometriosis, we did not observe any difference in the size or quantity of serum-EV. However, we observed an increase in FF-VE size in women with infertility associated with advanced endometriosis compared to controls, with no difference in quantity. By comparison between follicular fluid and serum from advanced endometriosis group, FF-EV size and quantification were increased in relation to serum, which was not observed in control group. These results may indicate greater release of EV with increased size, as an attempt to combat stress factors and reestablish follicular balance in the advanced endometriosis group. The expression comparison of 82 miRNAs extracted from FF-EV of infertile women without and with advanced endometriosis, it was detected 73 miRNAs, one being exclusive in control group, thirteen exclusive in advanced endometriosis and 25 miRNAs present in both groups, but differentially expressed between them, of which 24 showed higher expression in advanced endometriosis infertile women . Among the main exclusive and overexpressed miRNAs in comparisons between the groups with a dvanced endometriosis and control, changes were evidenced in miRNAs related to focal adhesion and regulation of the reorganization of the actin cytoskeleton, as well as in signaling pathways, including ErbB, Ras, MAPK, Hippo, Rap1, cAMP and WNT which are related to follicular development and the acquisition of oocyte competence, whose deregulation could favor the worsening of gametic quality. Therefore, our data deepens the understanding of the mechanisms involved in compromising fertility in women with advanced endometriosis, highlighting potential altered pathways, mediated by EV- FF miRNA in these women.

endometriosis, female infertility, oocyte quality, extracellular vesicles, microRNA. 11 Lista de figuras Figura 1: Mecanismos de comunicação intercelular entre vesículas extracelulares e célula-alvo.....................................................................................................................24 Figura 2: Vesículas extracelulares no folículo ovariano..............................................26 Figura 3: Figura esquemática representando o protocolo de centrifugações seriadas para preparo de fluidos para posterior isolamento de vesículas extracelulares....................36 Figura 4: Fluxograma do estudo..................................................................................41 Figura 5: Diagrama de Venn representando a intersecção dos 73 microRNAs provenientes das comparações entre as vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose..............................................45 Figura 6: microRNAs diferencialmente expressos em mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle) e inférteis com endometriose avançada (grupo Endometriose)...............................................................................................................48 Figura 7: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas modulada pelo microRNA proveniente de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle)................................................49 Figura 8: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos microRNAs provenientes de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose avançada (grupo Endometriose).......................50 Figura 9: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos microRNAs provenientes de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular diferencialmente expressos entre mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle) e com endometriose avançada (grupo Endometriose)..................................................51 12 Lista de tabelas Tabela 1: Características clínicas das participantes da pesquisa do grupo controle e do grupo endometriose avançada................................................................................ 42 Tabela 2: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no soro dos grupos Controle e Endometriose avançada............................................................................. 43 Tabela 3: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no fluido folicular dos grupos Controle e Endometriose avançada.................................................................. 43 Tabela 4: Quantificação e diâmetro das Vesículas Extracelulares entre soro e fluido folicular do grupo Endometriose avançada................................................................. 44 Tabela 5: microRNAs diferencialmente expressos em vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose avançada comparadas aos controles inférteis sem endometriose........................................................................... 45 13 Lista de siglas AMH Hormônio Anti-mülleriano ASRM American Society of Reproductive Medicine ATP Adenosina Trifosfato cAMP Adenosina Monocíclica Fosfato CC Células do Cumulus CEP Comissão de Ética em Pesquisa CFA Contagem de Folículos Antrais CG Células da Granulosa cGMP Guanosina Monocíclica Fosfato COC Complexo Cumulus-Oócito CRH Centro de Reprodução Humana CT Cycle threshold CTEP Contagem Total de Espermatozoides Móveis DGO Departamento de Ginecologia e Obstetrícia DNA Ácido Desoxirribonucleico DNAse Desoxirribonuclease DP Desvio Padrão EGF Fator de Crescimento Epidérmico EGFR Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico EO Estresse Oxidativo EOC Estimulação Ovariana Controlada Epac Proteína de troca diretamente ativada por cAMP ErbB Receptores Tirosina Quinase ERK1/2 Quinases reguladas por sinal extracelular 1/2 ESHRE European Society of Human Reproduction and Embryology FC Fold Change FF Fluido Folicular FMRP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto FP Fluido Peritoneal FSH Hormônio Folículo Estimulante FSHr Hormônio Folículo Estimulante recombinante 14 FZ Receptor Frizzled FZEA Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos GnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas HC Hospital das Clínicas hCG Gonadotrofina Coriônica Humana HIF-1a Fator Induzido por Hipóxia Hippo Protein Kinase Hpo HIV Vírus da Imunodeficiência humana Hm/Ms/Rt T1 snRNA Human/Mouse/Rat small nuclear RNA hpHMG Highly Purified Human Menopausal Gonadotrophin ISEV Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares ICSI Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoide IGF1 Insulin-like Growth Factor 1 ILV Vesículas Intraluminais IMC Índice de Massa Corporal IOP Insuficiência Ovariana Precoce KEEG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LH Hormônio Luteinizante LMMD Laboratório de Morfofisiologia Molecular do Desenvolvimento MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MEK1 Meiotic Chromosome-axis-associated Kinase 1 MII metáfase II miRNAs microRNAs ml Mililitro MPF Fator Promotor de Maturação MS Ministério da Saúde mtDNA DNA mitocondrial MVB Multivesicular Body ng Nanograma nm Nanômetro NTA Nanoparticle Tracking Analysis OMS Organização Mundial de Saúde PI3K/Akt Fosfatidilinusitol 3-quinase/Proteína quinase B 15 RAF1 proto-oncogene serine/threonine-protein kinase 1 Rap1 Proteína-1 relacionada a Ras Ras RAt Sarcoma vírus RNA Ácido Ribonucleico RNAt Ácido Ribonucleico transportador RNAm Ácido Ribonucleico mensageiro RNAse Ribonuclease RT PCR Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real SOP Síndrome de Ovários Policísticos TAZ Transcriptional co-Activator with PDZ-binding motif TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TEAD TEA Domain Family Member TGF-ß Fator de Transformação do Crescimento Beta TRA Tratamento de Reprodução Assistida TSH Hormônio Tireoestimulante TZP Projeções Transzonais USP Universidade de São Paulo UStv Ultrassonografia Transvaginal VE Vesículas Extracelulares VLPSC Videolaparoscopia WNT Wingless-related Integration Site YAP Yes-Associated Protein ZP μl Zona pelúcida Microlitro 16 Sumário 1 Introdução..................................................................................................18 1.1 Endometriose.........................................................................................18 1.2 Endometriose e infertilidade..................................................................19 1.3 Endometriose e foliculogênese..............................................................21 1.4 Vesículas extracelulares e qualidade oocitária......................................23 1.5 MicroRNAs e qualidade oocitária.........................................................26 1.6 Vesículas extracelulares e seu conteúdo de microRNAs na infertilidade relacionada à endometriose............................................................................29 2 Objetivos.....................................................................................................31 2.1 Objetivos Primários...............................................................................31 2.2 Objetivos Secundários...........................................................................31 3 Casuística e Métodos.................................................................................32 3.1 Considerações Éticas.............................................................................32 3.2 Desenho do estudo e local realizado......................................................32 3.3 Participantes e Critérios de Elegibilidade..............................................32 3.4 Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação da Fase Lútea...33 3.5 Delineamento Experimental..................................................................35 3.5.1 Coleta e armazenamento das amostras.........................................35 3.5.2 Isolamento das Vesículas Extracelulares......................................35 3.5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares................................36 3.5.3.1 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)...........................36 3.5.4. Extração de RNA das Vesículas Extracelulares..........................37 3.5.5 Transcrição Reversa.....................................................................37 3.5.6 Análise da expressão relativa dos microRNAs por Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (RT-PCR).........................................37 3.5.7 Cálculo da expressão relativa dos microRNAs............................38 4 Análise Estatística.....................................................................................39 5 Resultados..................................................................................................40 5.1 Fluxograma do estudo...........................................................................40 5.2 Caracterização das participantes da pesquisa........................................41 5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares........................................42 17 5.3.1 Comparação entre os grupos Controle e Endometriose avançada........................................................................................................42 5.3.2 Comparação entre soro e o fluido folicular do grupo Controle.........................................................................................................44 5.3.3 Comparação entre o soro e o fluido folicular do grupo Endometriose avançada........................................................................................................45 5.4 Perfil de microRNAs em Vesículas Extracelulares obtidas do fluido folicular.........................................................................................................45 5.5 Análise de bioinformática dos microRNAs.........................................48 5.5.1 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente expressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo Controle........................................................................................................48 5.5.2 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente expressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo Endometriose................................................................................................49 5.5.3 Análise de enriquecimento dos microRNAs diferencialmente expressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis sem e com endometriose avançada (grupo Controle e Endometriose)...............................................................................................50 6 Discussão...................................................................................................52 7 Conclusões.................................................................................................64 Referências................................................................................................65 Anexo A.....................................................................................................83 Anexo B.....................................................................................................85 Anexo C.....................................................................................................95 18 1 Introdução 1.1 Endometriose A endometriose é uma doença ginecológica inflamatória estrogênio dependente caracterizada pela presença de implantes endometriais (glândula e ̸ ou estroma) fora da cavidade uterina (Gupta et al., 2006). Pode apresentar quadro clínico bastante diversificado, variando desde assintomático até a presença de dor pélvica crônica, dismenorreia, dispareunia, sangramento uterino anormal e infertilidade (Bulletti et al., 2010). A prevalência da doença fica entre 10% a 15% entre as mulheres em idade reprodutiva (OMS) (OMS, 2021). No Brasil, estima-se que uma a cada dez mulheres sofr a com a endometriose de acordo com os dados do Ministério da Saúde (MS, 2022) . Entretanto, essa prevalência tende a aumentar devido ao avanço nas tecnologias de diagnóstico. É importante ressaltar que a doença é um problema de saúde pública (OMS, 2021) devido ao seu impacto negativo na qualidade de vida dessas mulheres, tanto na saúde física quanto na mental, devido aos sintomas de dor incapacitante e ao atraso em diagnosticar a doença . Além disso, há o impacto socioeconômico causado pela eventual dificuldade de acesso aos métodos diagnósticos especializados e pelo alto custo do diagnóstico e do tratamento (Hughes et al., 2015; Zondervan et al., 2020). A etiopatogenia da endometriose perm anece controversa . A teoria da menstruação retrógrada de Sampson é a mais aceita pela comunidade científica. Segundo essa teoria, ocorreria o refluxo de células endometriais descamadas na menstruação através das t ubas uterinas, com subsequente implantação e crescimento na cavidade peritoneal (Sampson, 1927). Embora a teoria de Sampson explique o deslocamento físico dos fragmentos endometriais, observa-se que, embora 70 a 90% das mulheres apresentem menstruação retrógrada, apenas uma minoria irá desenvolver a doença (Bricou & Chapron, 2008). Sendo assim, sugere -se que a combinação de fatores genéticos, hormonais, imunológicos e ambientais poderiam contribuir para maior suscetibilidade em desenvolver endometriose (Lamceva et al., 2023; Li et al., 2024; Bedrick et al., 2024). Muitos estudos têm tentado explicar fatores de risco e proteção para o desenvolvimento da doença, além de uma melhor caracterização da população acometida. Fatores como início precoce da menarca, gestações tardias, hábitos alimentares e estilo de vida estressante das grandes cidades foram associados a um aumento no risco do surgimento da endometriose (Missmer et al., 2010; Vitonis et al., 2010; Chapron et al., 2016). Enq uanto paridade, tabagismo, prática intensa de atividade física e obesidade são considerados fatores protetores da doença devido ao aumento da taxa de anovulação crônica e a irregularidade menstrual (Cramer et al., 1986; Peterson et al., 19 2013; Chapron et al., 2016). Contudo, os mecanismos dessas associações ainda permanecem incertos e, portanto, devem ser interpretados com cautela. Até pouquíssimo tempo atrás, a videolaparoscopia (VLPSC) com biópsia das lesões para análise anatomopatológica era o padrão-ouro no diagnóstico da endometriose. Entretanto, a última diretriz da European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) recomenda a VLPSC somente para mulheres com ultrassonografia pélvica transvaginal e ressonância magnética negativas, uma vez que esses exames vêm demonstrando grande sensibilidade, especificidade e alto grau de confiabilidade, principalmente, na identificação de focos de endometriose infiltrativa profunda (Abrão et al. , 2007) e endometriomas (Moore et al. , 2002), e /ou falha nos tratamentos convencionais já utilizados (Becker et al., 2022). A endometriose pode ser classificada de acordo com sua localização anatômica (peritônio, ovário ou septo retovaginal ), pelo tipo histológico dos implantes ou pela extensão da doença sobre os órgãos pélvicos. A classificação mais utilizada atualmente é a da American Society of Reproductive Medicine (ASRM) que gradua a doença em 4 estágios: I – mínima, II – leve, III – moderada, IV – grave, de acordo com a severidade da doença (ASRM, 1997). Essa classificação é útil porém possui limitações. No sentido de melhorar a associação entre a clínica e o estadiamento/classificação da doença, recentes avanços recomendam uma nova classificação baseada nos tipos morfológicos da endometriose, dividindo -a em: endometriose superficial, endometrioma ovariano e endometriose profunda, sendo que esta última classificação relaciona a doença com a sua fisiopatolo gia e também com a sintomatologia apresentada (Nogueira Neto et al., 2022). 1.2 Endometriose e infertilidade A diminuição da fertilidade em portadoras de endometriose não é totalmente estabelecida. Contudo, essa associação está fundamentada na alta prevalência da doença, identificada em 25% a 50% das mulheres inférteis (Bulletti et al., 2010), sendo que 30% a 50% das portadoras de endometriose têm dificuldade em ter filhos ( ASRM, 2012; Hodgson et al., 2020). Sabe-se que a taxa de fecundidade mensal de casais normais em idade reprodutiva é estimada em torno de 15 % a 20%, enquanto a de mulheres com endometriose está estimada entre 2% e 10% (Hughes et al., 1993; Bulletti et al., 2010). Nos estágios avançados da doença (estágios III e IV e doença infiltrativa profunda), essa relação, com frequência, tem sido associada a aderências pélvicas severas, que causam uma diversidade de alterações anatômicas no trato reprodutivo e dessa forma pode m impedir a liberação oocitária pelo ovário ou a captação deste oócito pela tuba uterina (Bulletti et al., 2010). 20 Todavia, mulheres com endometriose avançada não necessariamente apresentam distorções evidentes da anatomia tubária, e, mesmo assim, apresentam maior risco de infertilidade do que mulheres sem a doença (Ruder et al., 2008; Daniilidis et al., 2022; Imperiale et al., 2023). Vários mecanismos têm sido propostos para esclarecer essa associação entre infertilidade e endometriose, como alterações na resposta imunológica, na função peritoneal, disfunções hormonais e na receptividade uterina e piora da qualidade oocitária (Da Broi et al., 2019; Simopoulou et al., 2021). Entretanto, a patogênese da infertilidade relacionada a endometriose, não apenas nos estágios iniciais, mas também em estágios avançados, precisa ser mais bem compreendida. A ocorrência de risco aumentado de baixa reserva ovariana em mulheres com endometriose moderada e severa (Seyhan et al., 2015) pode estar relacionada a indução , ocasionada pelos focos endometriais ectópicos , de resposta inflamatória local, com recrutamento de macrófagos, liberação de citocinas e substâncias vasoativas , geração de espécies reativas de oxigênio e aumento da atividade mitótica que levariam a um ambiente pélvico adverso (Szczepánska et al., 2003; Gupta et al., 2006; Mansour et al., 2009 ; Miller et al., 2017). Como consequência, o microambiente peritoneal seria afetado levando a alterações no fluido peritoneal (FP) que poderia prejudicar a capacidade reprodutiva dessas mulheres (Gupta et al., 2008; Mansour et al., 2009; Mansour et al., 2010; Jianini et al., 2017). Corroborando com os achados citados acima, marcadores de estresse oxidativo (EO) foram encontrados alterados no FP de portadoras de endometriose avançada (Polak et al., 2013; Santulli et al., 2015), suger indo que o microambiente peritoneal está sob efeito pró -oxidante nessas mulheres. O estabelecimento do EO no FP pode ser refletido a nível sistêmico (Andrade et al., 2010; Liu et al., 2013; Singh et al., 2013 ; Da Broi et al., 2016 a; Nasiri et al., 2017) e, assim, atingir os ovários e afetar o desenvolvimento intrafolicular oocitário, uma vez que o córtex ovariano é altamente vascularizado, especialmente no final da foliculogênese (Tamanini & De Ambrogi, 2004). Portadoras de endometriose avançada, mesmo quando submetidas a técnicas de reprodução assistida, apresentam redução da implantação, menores taxas de gestação clínica e uma tendência a diminuição de nascidos vivos (Harb et al., 2013). Uma boa forma de compreender os mecanismos inerentes à endometriose e como tais processos influenciam na diminuição do potencial reprodutivo dessas mulheres seria por meio da análise do microambiente folicular. O microambiente folicular abriga os oócitos, de modo que alterações em sua composição podem ter efeitos adversos nos processos reprodutivos (Agarwal et al., 2005). 21 1.3 Endometriose e foliculogênese O ovário possui uma reserva de folículos ovarianos que são, periodicamente, recrutados a se desenvolver. No início do desenvolvimento folicular, também chamado foliculogênese, o folículo se encontra no estágio de folículo primordial, que é composto de um oócito quiescente envolto por uma camada de células somáticas. No decorrer do processo, a proliferação e a diferenciação das células somáticas foliculares em células da teca, células da granulosa (CG) e células do cumulus (CC) ocorre em sincronia com as alterações morfológicas e endócrinas que ocorrem no folículo, possibilitando o crescimento e o amadurecimento do oócito (Adonaab et al., 2012; da Broi et al.; 2018a). Concomitantemente, o oócito passa por processos que incluem a maturação citoplasmática e, posteriormente, a nuclear, visando torná-lo competente (Sirard et al., 2006; Ferreira et al., 2009). Quando o oócito adquire competência oocitária, indica que ele está apto para finalizar a sua maturação, ser fertilizado, gerar um embrião viável e um indivíduo saudável (Dumesic et al., 2015; di Pietro, 2016). Paralelamente ao crescimento do folículo ovariano , ocorre o acúmulo de um líquido, composto por secreção das células foliculares e produtos do plasma sanguíneo que atravessam a barreira hematofolicular , chamado fluido folicular (FF) (Fortune, 1994). O FF é um microambiente metabolicamente ativo que contém uma grande variedade de moléculas como proteínas, peptídeos, aminoácidos, eletrólitos, açúcares, hormônios esteroides, fatores de crescimento, fatores anti-coagulantes, espécies reativas de oxigênio, antioxidantes, entre outros (Revelli et al., 2009). O FF mantém íntima correlação com o oócito intermediando a comunicação entre os vários tipos celulares presentes no folículo, atuando em um papel crítico no crescimento folicular, na maturação citoplasmática e nuclear oocitária (Hennet & Combelle, 2012). Deste modo, a composição do FF pode ser um importante indicativo de qualidade oocitária e embrionária pois reflete todo o metabolismo folicular. Ademais, por ser constituído, em parte, pelo exsudato plasmático pode ser modificado por doenças com manifestações sistêmicas, como a endometriose, relacionada a presença de inflamação e EO peritoneal, folicular e sistêmico (Da Broi et al., 2018b). Embriões de boa qualidade (aqueles com habilidade para implantar e se desenvolver adequadamente) originam -se de oócitos competentes, que por sua vez, são originados de folículos com um adequado microambiente, condicionado tanto pelo conteúdo do FF, como pela influência das células vizinhas. Sendo assim, qualquer alteração nesse microambiente pode resultar em dano oocitário, e consequentemente, embrionário. Estudos do nosso grupo apontaram para a baixa reserva ovariana (Coelho Neto et al., 2016) e a piora da qualidade oocitária como um fator importante relacionado à etiopatogenia 22 da infertilidade relacionada à endometriose (Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., 2009; Dib et al., 2013; Da Broi et al., 2014; Barcelos et al., 2015; Jianini et al., 2017). Interessantemente, uma revisão sistemática e metánalise demonstrou que portadoras de endometriose com presença de endometrioma submetidas ao tratamento de reprodução assistida ( TRA), apresentaram número significantemente menor de oócitos recuperados e de oócitos em metáfase II (MII) quando comparadas às inférteis por fator masculino e/ou tubário (Alshehre et al., 202 1). Ademais, as taxas de implantação de embriões resultantes de oócitos doados por mulheres sem endometriose para o útero de portadoras da doença foram semelhantes às do grupo controle (Garrido et al., 2000). Esses achados podem indicar que os oócitos liberados por essas mulheres podem apresentar pior qualidade. Uma das possíveis causas desses achados pode estar na comunicação intercelular durante a foliculogênese (da Silveira et al., 2012). A comunicação intercelular é um importante evento fisiológico do sistema reprodutivo e envolve extensiva e afinada coordenação entre CG, FF, CC e oócito (Dumesic et al., 2015) , e é essencial para o desenvolvimento do folículo, maturação e aquisição de competência oocitária (Coticchio et al., 2015; da Broi et al., 2018a). Os mecanismos estabelecidos de comunicação intercelular incluem a sinalização parácrina, a comunicação bidirecional por interação direta através das junções comunicantes, também conhecida como junções GAP (da Broi et al., 2018a), o transporte mediado por vesículas extracelulares (VEs) (Théry et al., 2002; da Silveira et al., 2012; Van Der Pol et al., 2012) e mais recentemente descrito, a comunicação por contato através das VEs e junções GAP presentes na fenda das projeções transzonais (TZP) da zona pelúcida (ZP) (Macaulay et al., 2014; Maculay et al., 2016). Nos últimos anos, o transporte de moléculas através das VEs tem tido sua importância ressaltada nas principais fases do processo reprodutivo , como na gametogênese feminina e masculina, e no estabelecimento d a gestação ( Burns et al., 201 4; Ruiz‐González et al., 2015; Saadeldin et al., 2015; Burns et al., 2016; Bridi et al., 2021). VEs já foram relacionadas ao desenvolvimento folicular e maturação oocitária (Santonocito et al., 2014), fertilização (Barraud -Lange et al., 2007; Siciliano et al., 2008), implantação embrionária (Ng et al., 2013; Burns et al., 2014), desenvolvimento embrioná rio (Varela et al., 2009; Burns et al., 2014; Burns et al., 2016), comunicação entre embrião e endométrio (Ng et al., 2013; Burns et al., 2014; Saadeldin et al., 2015; Burns et al., 2016), e, até mesmo, na comunicação entre embriões co-cultivados in vitro (Mellisho et al., 2017). 23 1.4 Vesículas extracelulares e qualidade oocitária Segundo a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), VE é o termo genérico para caracterizar partículas naturalmente liberadas da célula que são delimitadas por uma bicamada lipídica e não se replicam, ou seja, não contêm um núcleo funcion al (Théry et al., 2018). Atualmente, não há consenso sobre a classificação das VE s pois atribuir uma VE a uma via de biogênese específica só é possível através da captura da VE no momento de sua liberação. A maioria dos autores usa as características físic as ( diâmetro e densidade), composição bioquímica e descrições de condições ou célula de origem das VE para classificá- las. As VE s diferem em diâmetro e biogênese, o diâmetro varia entre 40 e 4000 nm e inclui exossomos, microvesículas e corpos apoptóticos (Théry et al., 2009). Sendo assim, o termo “vesícula extracelular (VE)” será utilizado para se referir às vesículas com diâmetro de 40 a 200nm (Théry et al., 2018). VEs são nanopartículas heterogêneas secretadas por diferentes tipos celulares (György et al., 2011; Raposo & Stoorvogel, 2013; Machtinger et al., 2021) e possuem ações importantes em processos biológicos. Uma das possíveis vias de biossíntese das VEs é a part ir de corpos multivesiculares (Multivesicular body – MVB) produzindo vesículas intraluminais (ILV) por endocitose. Mediante a fusão dos MVB com a membrana plasmática, as ILV são liberadas para o meio extracelular (van Niel et al., 2018). VEs são liberadas no ambiente extracelular de forma constitutiva em resposta a estímulos específicos, em situações fisiológicas e patológicas (Cocucci et al., 2009; El Andaloussi et al., 2013; Tannetta et al., 2014). O conteúdo transportado por VE varia com o tipo celula r que a produz, assim como o ambiente em que a célula se encontra (Machtinger et al., 2016). Essas vesículas são capazes de capturar diferentes tipos de macromoléculas das células e transferi -las para outras células, induzindo modificações funcionais nas células receptoras (Lee et al., 2012; Villarroya-Beltri et al., 2014; Nguyen et al., 2016). Os mecanismos propostos na interação entre as VEs e as células receptoras, com a finalidade de liberar o conteúdo das VEs, podem ocorrer por meio da ligação direta com receptores de superfície celular ou produtos da clivagem das proteínas da membrana das VEs com receptores de superfície da célula -alvo através da sinalização justácrina (Mathivanan & Simpson, 2010), fusão direta e completa das VEs com a membrana plasmática da célula -alvo (Mathivanan & Simpson, 2010; Mathieu et al., 2019; Bhagyashree et al., 2 020) e fusão “Kiss and run ”, mecanismo para a endocitose rápida no qual as vesículas extracelulares entram, brevemente, em contato com a membrana plasmática da célula -alvo por meio de um pequeno poro de fusão (Wen et al., 2017) (Figura 1). 24 A especificidade das células receptoras parece ser dirigida por receptores específicos entre as células-alvo e as vesículas (Simon et al., 2018). A compartimentalização de compostos é uma das características mais vantajosas da comunicação intercelular medi ada por VE pois protege o conteúdo da vesícula da degradação enzimática mediada pelas enzimas presentes no meio extracelular. Além do mais, permite o transporte de mais de um composto na mesma vesícula (Manning & Kuhen, 2013). Através das VE, diferentes moléculas como lipídios (Subra et al., 2007), proteínas (Simpson et al., 2008) e ácidos nucléicos (DNA, mRNAs, RNAs não codificantes, fragmentos de tRNA e miRNAs) (Valadi et al., 2007) podem ser transferidos de célula para célula e transportados, através do sangue, por longas distâncias (Valadi et al., 2007; da Silveira et al., 2012, Andronico et al., 2019). Figura 1: Mecanismos de comunicação intercelular entre vesículas extracelulares e célula-alvo. (A) Interação das proteínas da membrana das vesículas extracelulares com receptores de superfície da célula -alvo através da sinalização justácrina. (B) Interação dos produtos da clivagem das proteínas da membrana das vesículas extracelulares com receptores de superfície da célula -alvo através da sinalização justácrina. Esses mecanismos, por sua vez, ativa m a cascata de sinalização dentro da célula -alvo. (C) Transferência de moléculas, de maneira não seletiva, por meio da fusão direta entre vesículas extracelulares e célula -alvo. (D) Fusão “Kiss and run ”, mecanismo para a endocitose rápida no qual as vesículas extracelulares entram, brevemente, em contato com a membrana plasmática da célula-alvo por meio de um pequeno poro de fusão. Fonte: adaptado de Mathivan & Simpson, 2010; Wen et al., 2017; Bhagyashree et al., 2020. Uma importante função atribuída às VEs é seu papel crucial na comunicação intercelular dentro do folículo ovariano (Hung et al., 2015). Até o momento, vários estudos têm isolado VEs do FF de equinos (da Silveira et al., 2012), bovinos (Sohel et al., 2013; Hung et al., 2015; 25 Navakanitworakul et al., 2016; Morales et al., 2019), suínos (Matsuno et al., 2019) e humanos (Santonocito et al., 2014; Machtinger et al., 2016). Tais VEs estão envolvidas tanto na regulação de vias que controlam o crescimento folicular e a resposta hormo nal, bem como na maturação citoplasmática do oócito e na retomada da meiose (da Silveira et al., 2017). Embora, suponha-se que a maioria das VEs isoladas do FF, são secretadas pelas CG e CC (Figura 2), não se pode excluir que algumas dessas vesículas podem se originar de células da teca, dos oócitos, e até mesmo de tecido não ovariano (Machtinger et al., 2016). A atividade secretória de comunicação entre células somáticas e oócitos foi demonstrada por meio da presença de material bioativo de VEs isoladas do FF nas CG, nas CC (da Silveira et al., 2012), no complexo cumulus-oócito (COC) (Sohel at el., 2013) e n a extremidade próxima ao oócito das TZP ( Macaulay et al. , 2014) indicando a tiva comunicação intercelular entre as células somáticas e o oócito e absorção do conteúdo das VEs no decorrer da maturação oocitária e do desenvolvimento embrionário inicial in vitro.v A literatura já comprovou que a expansão do COC é um evento crítico para a adequada ovulação de um oócito competente (da Broi et al., 2018a). A presença de VEs, provenientes de pequenos folículos antrais, parece induzir a expansão do COC in vitro (Hung et al., 2015). VEs isoladas do FF de folículos com 3 ± 6 mm, usadas como suplemento durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vitro , parecem melhorar o desenvolvimento embrionário (da Silveira et al., 2017). Uma vez que os oócit os imaturos presentes em folículos em desenvolvimento precisam acumular RNA mensageiro (RNAm), sofrer maturação epigenética e adquirir competência oocitária para realizar o desenvolvimento inicial do embrião até a ativação do genoma embrionário, essa suple mentação parece regular parcialmente a expressão gênica, modificando os níveis de transcrição de genes relacionados ao metabolismo e ao desenvolvimento embrionário inicial através da modulação de miRNAs, da metilação global e da hidroximetilação (da Silveira et al., 2017). Ademais, descobriu -se que VEs isoladas de pequenos, médios e grandes folículos bovinos foram similares no diâmetro. Em contrapartida, a concentração das VEs diminuiu progressivamente com o aumento do diâmetro do folículo (Navakanitworakul et al., 2016). Esses achados confirmam o papel de mediador da comunicação celular através das VEs no FF (da Silveira et al., 2012) transportando informações do FF para as células foliculares e oócito durante o desenvolvimento oocitário, folicular e embrionário inicial (da Silveira et al., 2017). 26 Figura 2: Vesículas extracelulares no folículo ovariano. Fonte: adaptado de Machtinger et al., 2016. Atualmente, há um crescente interesse na caracterização das VEs do FF a fim de melhorar a expansão das CC e a aquisição de competência oocitária (Neyroud et al., 2022). A maioria das pesquisas direciona o foco do estudo para o FF pois, sua composição composta por hormônios, fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas é extremamente importante para o desenvolvimento oocitário, mas também, devido à sua proximidade com o oócito, o conteúdo do FF potencialmente pode refletir o estado fisiológico do oócito (di Pietro et al., 2016). Deste modo, a análise dos componentes do FF pode fornecer informações úteis sobre a qualidade oocitária e as vias envolvidas na diferenciação e no desenvolvimento folicular. De fato, qualquer alteração na composição bioquímica do F F estará, frequentemente, associada a alterações na qualidade dos oócitos. 1.5 MicroRNAs e qualidade oocitária Um dos conteúdos mais bem caracterizados como constituintes das VEs na comunicação intercelular são os microRNAs (miRNAs) (Navakanitworakul et al, 2016; Neyroud et al., 2022). A relação entre miRNAs e qualidade oocitária é amplamente estudada na literatura (Xu et al., 2011; Assou et al., 2013; Uhde et al., 2017; Matchinger et al., 2017; Tesfaye et al., 2018). Devido às restrições éticas e escassez de oócitos humanos maduros doados para a pesquisa, a maioria dos estudos relacionados à qualidade oocitária são realizados indiretamente através da avaliação das CC e/ou do conteúdo do FF em modelos animais (revisado por Llobat, 2021). O resultado é que vários processos reprodutivos e vias de sinalização são influenciados 27 pelos miRNAs, incluindo o desenvolvimento folicular (da Silveira et al., 2012). Durante o crescimento oocitário, as células foliculares são capazes de captar e transferir miRNAs, através dos componentes do microambiente folicular, regulando assim a prolife ração celular, o crescimento e a maturação oocitária, atresia folicular, luteólise, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial (da Silveira et al., 2018). Deste modo, uma crítica regulação da expressão gênica deve ocorrer em vista de suportar o desenvolvimento da próxima geração (McGinnis et al., 2015). Estima-se que os miRNAs são capazes de regular 10 -50% da expressão gênica do genoma humano (Lu & Clark, 2012). Os miRNAs são pequenas moléculas endógenas de RNA não -codificante com 17 a 25 nucleotídeos que estão envolvidos, em um nível pós-transcricional, na regulação da expressão gênica dos mais variados processos biológicos (Lee et al., 1993; Wightman et al. 1993; Saliminejad et al., 2019). A primeira observação da existência destes pequenos RNAs foi realizada em C. elegans (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993) . De acordo com o banco de dados da miRBase versão 22 (www.mirbase.org), atualmente, existem mais de 38 mil miRNAs identificados e catalogados. Acredita-se que cerca de 60% do RNAm humano seja regulado por miRNAs ( Ha & Kim, 2014 ), porém a função de muitos deles ainda não é totalmente compreendida (Kozomara et al., 2018). A localização dos miRNAs no genoma é variada, podendo estar localizados em regiões intrônicas ou exôgenicas de genes codificadores de proteínas ou em regiões intergênicas (revisto em Kim, 2005 ; Saliminejad et al., 201 9). Essa característica permite que os miRNAs sejam evolutivamente conservados. A maioria dos miRNAs apresenta efeito inibitório na expressão gênica, causado pelo impedimento da tradução proteica do RNA m-alvo. No entanto, quando o miRNA se liga à região promotora de um gene, seu efeito pode ser oposto, causando a ativação de sua expressão (Jorge et al., 2021). O pequeno tamanho dos miRNAs e a tolerância de complementariedade parcial com seu alvo permitem a interação com grande número de RNAms, ou seja, um único miRNA pode regular vários RNAm -alvos. Assim como, vários miRNAs podem coope rar no controle da expressão gênica em um único RNAm (Saliminejad et al., 2019). Tal fato reforça a importância dos miRNAs na regulação da expressão gênica em diversos processos biológicos e patológicos (Walayat et al., 2018). Em processos biológicos de modelos animais, o conteúdo de miRNAs provenientes de VE isoladas do FF de suínos difere e pode afetar o padrão de distribuição mitocondrial durante a maturação oocitária (Gad et al., 2022). Em bovinos, VE isoladas de folículos pequenos (3 a 5 mm) apresentaram conteúdo de miRNAs que foram associados a genes relevantes para vias de desenvolvimento celular, proliferação celular e apoptose indicando o estágio inicial do 28 crescimento do folículo antral (Navakanitworakul et al., 2016). Já, VE isoladas de folículos maiores (acima de 9 mm) apresentaram conteúdo de miRNAs que foram relacionados a genes envolvidos em vias de resposta inflamatória, aumento da permeabilidade vascular e angiogênese (Navakanitworakul et al., 2016). Em equinos, o perfil de express ão de miRNAs provenientes de VEs isoladas do FF também estavam presentes nas GC e CC circundantes (da Silveira et al., 2012). Além disso, detectou -se três miRNAs que estavam expressos em quantidades significantemente maiores em VE isoladas do FF de éguas idosas quando comparadas a éguas jovens (da Silveira et al., 2012). Apesar da correlação encontrada em animais domésticos, evidências mais diretas s ão necessárias para estabelecer o conteúdo e possíveis papéis funcionais d as VE ao longo d o desenvolvimento folicular humano. Além disso, resultados encontrados em modelo animal de mamíferos podem não ser, necessariamente, extrapolados para humanos e vice-versa, tornando importante o estudo das VE do fluido folicular humano. Avanços na temática em humanos demonstram ser possível avaliar a expressão de miRNAs provenientes de VE isoladas do microambiente folicular. Até o presente somente seis estudos avaliaram a expressão das VEs e seu conteúdo de miRNAs no FF humano (Sang et al., 2013; Santonocito et al., 2014; Diez-Fraile et al. 2014; Machtinger et al., 2017; Martinez et al., 2018; Zhang et al., 2021). Desses estudos, Sang e colaboradores (2013) reportaram 116 miRNAs provenientes de VEs isoladas do FF de mulheres saudáveis submetidas ao TRA por injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) , Machtinger e colaboradores (2017) detectaram 207 miRNAs e Martinez e colaboradores (2018), 22 miRNAs. Já Santonocito e colaboradores (2014) evidenciaram 22 miRNAs diferencialmente expressos (hiperexpressos) provenientes das VEs isoladas do FF comparados aos miRNAs provenientes das VE isoladas do plasma das mesm as participantes da pesquisa. Semelhantemente aos achados encontrados em modelos equino (da Silveira et al., 2012), miRNAs provenientes de VEs isoladas do FF de mulheres com menos que 31 anos de idade estavam diferencialmente expressos dos encontrados naquelas com mais que 38 anos de idade (Diez-Fraile et al. 2014). E para finalizar, Martinez e colaboradores (2018) revelaram diferença nos miRNAs proven ientes VEs do FF de mulheres submetidas a estimulação ovariana para ICSI encontrados em oócitos que fertilizaram e falharam em fertilizar, e Zhang e colaboradores (2021) identificaram que miRNAs provenientes de VEs isoladas do FF de mulheres submetidas a estimulação ovariana para ICSI estavam diferencialmente expressos entre o FF de oócitos com alta e baixa qualidade. Quando comparados aos miRNAs provenientes de VEs isoladas do FF do grupo de oócitos com alta qualidade, os miRNAs do FF de oócitos classificados como de baixa qualidade ( contagem de 29 folículos antrais [CFA] menor que 10 e níveis de hormônio anti -mulleriano [AMH] abaixo de 1.5 ng/mL), mostraram-se superexpressos (Zhang et al., 2021). Esses resultados sugerem que as VE têm um importante papel em carregar miRNAs envolvidos no desenvolvimento folicular, na retomada da meiose, na comunicação celular dentro do folículo ovariano, e também na ativação e/ou desenvolvimento embrionário inicial. Essa crítica regulação envolve vias de sinalização que incluem TGF -ß e WNT (da Silveira et al., 2018). Sabe-se que o perfil de miRNAs difere significativamente entre pessoas saudáveis e doentes (Sang et al., 2013; Schwarzenbach et al., 2014). Desde então, mudanças na expressão de miRNAs específicos foram observad as em uma variedade de doenças, incluindo cânceres ginecológicos (cervical, ovariano e endometrial) (Srivastava et al., 2017), adenocarcinomas (Zhang et al., 2008), leiomiomas uterinos (Wang et al., 2007), síndrome de ovários policísticos (SOP) (Jiang et al., 2021), insuficiência ovariana precoce (IOP) (Zhou et al., 2021) e endometriose (Cosar et al., 2017), além de distúrbios gestacionais, como pré -eclâmpsia e prematuridade (Traver et al., 2014; Santamaria et al., 2014). 1.6 Vesículas extracelulares e seu conteúdo de microRNAs na infertilidade relacionada à endometriose O interesse em conhecer o papel das VE na infertilidade relacionada à endometriose expandiu, rapidamente, nos últimos anos (Machtinger et al., 2021; Zhou et al., 2021). Visto que a presença de VE foi relatada no endométrio eutópico, nas lesões endometrióticas, no conteúdo do endometrioma, no soro, no plasma e no FP de portadoras d a doença (Scheck et al., 2022), alguns estudos indicam que a comunicação intercelular mediada por essas vesículas contribui para desenvolvimento e progressão da endometriose (Harp et al., 2016; Sun et al., 2018; Schjenken et al., 2019). Todavia, a maioria dos estudos direciona o foco para o endométrio eutópico, as lesões endometrióticas ectópicas e o endometrioma, explorando muito pouco o soro e o plasma e ainda mais raramente o FP e o microambiente folicular. Apenas um único estudo avaliou a caracterização das VE quanto ao diâmetro e à quantificação no FP de mulheres com infertilidade secundária à endometriose (Nazri et al., 2020). Essa avaliação evidenciou aumento na concentração de VE isoladas do FP de mulheres inférteis por endometriose nos estágios I e II comparadas a mulheres férteis tanto na fase proliferativa quanto na secretória do ciclo menstrual (Nazri et al., 2020). Apesar desse estudo não ter avaliado o conteúdo de miRNAs das VE, o s achados sugerem q ue o envolvimento de células inflamatórias seja mais proeminente nos estágios iniciais da doença em comparação aos 30 estágios mais tardios que, frequentemente, é caracterizado por lesões endometrióticas profundas que já foram removidas do contato direto com o FP. O resultado é que essa característica inflamatória do FP pode afetar os folículos ovarianos em desenvolviment o e, consequentemente, interferir na qualidade oocitária (Chen et al., 2019; Nazri et al., 2020). Vários estudos têm demonstrado que a qualidade oocitária tem importância significativa no comprometimento da fertilidade de mulheres com endometriose (Barcelos et al., 2009, Da Broi et al., 2014; Barcelos et al., 2015; Donabela et al., 2015; Da Broi & Navarro, 2016; da Luz et al., 2017; da Luz et al., 2021, da Silva et al., 2021 ). A avaliação direta do oócito humano maduro é eticamente complicada e é rara a sua doação para pesquisas que inviabilizam a sua utilização clínica. Deste modo, uma alternativa utilizada para avaliar a qualidade oocitária é por meio de preditores indiretos como o FF e as CC (Dumesic et al., 2015; Da Broi et al., 2018a). O FF e as CC são microambientes ativos com papel crucial na aquisição de competência oocitária, além de manterem íntima correlação com o oócito (Dumesic et al., 2015; Da Broi et al., 2018 a). Dados recentes da literatura apontam para a importância da comunicação intercelular mediada por VE na infertilidade relacionada à endometriose (Harp et al., 2016; Schjenken et al., 2019; Zhang et al., 2019; Huang et al., 2022; Wu et al., 2022). Apenas um único estudo detectou 21 miRNAs diferencialmente expressos em VE isoladas do FP e do plasma de mulheres com infertilidade relacionada a endometriose. Esses miRNAs estavam envolvidos em alterações do sistema imune e processos metabólicos (Khalaj et al., 2019). Esses achados sugerem que as VE do FP carregam um conteúdo de miRNAs diferente das VE isoladas do plasma. Apesar da existência de vários estudos sobre miRNAs e infertilidade associada a endometriose, grande parte deles estão direcionados para miRNAs circulantes, ou seja, não são miRNAs provenientes de VE, que é o foco do nosso estudo. Em consequência disso, constata- se uma ausência na literatura de estudos investigando a potencial associação entre infertilidade, endometriose e qualidade oocitária, mediada pelo conteúdo de VE. Neste contexto, a caracterização das VE em relação ao seu diâmetro em nanômetros (nm) e à quantificação de VE por mililitros (ml) no soro e no FF de mulheres com infertilidade relacionada à endometriose torna nosso estudo pioneiro nesta temática. Ademais, a análise da expressão de miRNAs provenientes de VE isoladas do FF de mulheres com infertilidade devido à endometriose ainda não foi explorada. Em consequência disso, o presente estudo será uma realização inédita capaz de esclarecer vias metabólicas e mecanismos moleculares desregulados que estão relacionados com o papel da endometriose na infertilidade e seu impacto na aquisição de competência oocitária. 31 2 Objetivos 2.1 Objetivos Primários Caracterizar e comparar o diâmetro, em nm, e a concentração de VEs por ml no soro de mulheres inférteis com endometriose avançada e com infertilidade por fator masculino submetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para realização de fertilização in vitro. Caracterizar e comparar diâmetro, em n m, e a concentração de VEs por ml no FF de mulheres inférteis com endometriose avançada e com infertilidade por fator masculino submetidas à EOC para realização de fertilização in vitro. Comparar a expressão de 82 miRNAs maduros e precursores isolados d e VEs provenientes do FF de mulheres inférteis com endometriose avançada e com infertilidade por fator masculino submetidas à EOC para realização de fertilização in vitro. 2.2 Objetivos Secundários Comparar o diâmetro, em n m, e a quantidade de VE por ml entre o soro e o FF de mulheres com infertilidade por fator masculino submetidas à EOC para realização de fertilização in vitro. Comparar o diâmetro, em n m, e a quantidade de VE por ml entre o soro e o FF de mulheres inférteis com endometriose avançada submetidas à EOC para realização de fertilização in vitro. Identificar os miRNAs em VE do FF entre os grupos controle infértil sem endometriose e infértil por endometriose avançada. Predizer as vias metabólicas nas quais esses miRNAs possam estar envolvidos. 32 3 Casuística e Métodos 3.1 Considerações éticas O projeto foi aprovado pela Comissão de Pesquisa do DGO da FMRP da USP, pela Comissão de Ética em Pesquisa (CEP) do HC/FMRP/USP sob número do parecer: 5.793.443 e CAAE: 64403022.3.0000.5440. 3.2 Desenho do estudo e local realizado Trata-se de um estudo observacional caso -controle não multicêntrico desenvolvido junto ao Setor de Reprodução Humana, do D epartamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (DGO/F MRP/USP), que incluiu pacientes no período de novembro de 2018 a dezembro de 2022 . O recrutamento das participantes da pesquisa, a coleta e o preparo do material foram realizados no Centro de Reprodução Humana (CRH) do Hospital das Clínicas da F MRP/USP (HCFMRP/USP). Os procedimentos de isolam ento, caracterização e avaliação da quantificação de VE por ml e diâmetro das VE em nm, e a análise do perfil de miRNA isolados das VEs das amostras de soro e FF foram feitos no Laboratório de Morfofisiologia Molecular do Desenvolvimento (LMMD) do Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA) , Ca mpus Fernando Costa da Uni versidade de São Paulo (USP), Pirassununga, São Paulo. 3.3 Participantes e Critérios de Elegibilidade Mulheres com infertilidade que preencher am os critérios de elegibilidade, foram convidadas a participar do estudo no dia de início do ciclo de estimulação ovariana para ICSI , após a realização do ultrassonografia transvaginal ( UStv). As pacientes que concordaram em conceder as amostras de sangue periférico e FF assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) previamente à inclusão no estudo. Como rotina do serviço de Reprodução Humana, todas as pacientes são clinicamente examinadas para determinar o fator de infertilidade e somente foram incluídas pacientes que foram submetidas aos protocolos de EOC definidos no estudo para a realização de ICSI. Para este estudo, as participantes da pesquisa foram divididas no grupo endometriose e grupo controle infértil (fator masc ulino de infertilidade). Foram consideradas elegíveis as pacientes com idade inferior a 40 anos, índice de massa corporal ( IMC) entre 18,5 kg ̸m2 e 30 kg ̸m2, sem quaisquer outras condições patológicas 33 associadas como dislipidemia, doenças autoimunes, SOP, neoplasias malignas, IOP, anovulação crônica, hidrossalpinge , doença cardiovascular, doenças reumatológicas, doenças renais, hepatopatias, doenças crônicas como diabetes melittus e outras endocrinopatias (exceto hipotireoidismo controlado com TSH menor que 2,5UI/ml ), infecção pelo vírus HIV, hipertensão, qualquer infecção ativa, tabagismo ou uso crônico de medicações antidislipidêmicas, hormonais, anti-inflamatórios hormonais e não hormonais e medicamentos como tiazídicos, betabloqueadores e corticoides nos três meses anteriores à inclusão no estudo. No grupo endometriose foram elegíveis pacientes com infertilidade associada exclusivamente à endometriose, diagnosticada por VLPSC nos estágios III e IV ou com doença infiltrativa profunda diagnosticada por VLPSC, UStv ou ressonância magnética pélvica, sem endometrioma ovariano no ciclo de participação no estudo. O grupo controle foi constituído por pacientes sem diagnóstico de endometriose (sem quadro clínico e exames de imagem sugestivos da doença) e que apresent avam infertilidade por fator masculino. Com o fator masculino foi considerado a presença de contagem total de espermatozoides mó veis (CTEP) menor que 10 milhões. A CTEP foi obtida pela multiplicação do volume da ejaculação em mililitros pela concentração de espermatozóides e a proporção de espermatozóides com motilidade progressiva dividida por 100% (Smith et al., 1977; Ayala et al., 1996; Hamilton et al., 2015). Foram excluídas as participantes da pesquisa que, após o recrutamento, for am submetidas a protocolos de EOC distintos dos propostos para o estudo, que utilizar am a medicação incorretamente ou que ti veram o ciclo cancelado e não realizar am captação oocitária. 3.4 Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea Com o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de EOC foi utilizada a programação da menstruação, por meio do uso de anticoncepcionais orais combinados diariamente, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para o início da estimulação ovariana. A EOC foi iniciada cinco dias após a interrupção dos contraceptivos orais combinados usados para a programação do ciclo. Todas as mulheres foram monitorizadas apenas por UStv (Martins et al., 2014), submetidas ao protocolo flexível com antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas ( GnRH) e a EOC foi realizada de acordo com um dos três protocolos descritos a seguir: 34 - Protocolo flexí vel com antagonista e alfacorifolitropina (Elonva®, Schering -Plough, Brasil). Cinco dias após a interrupção do contraceptivo oral combinado foi administrada a alfacorifolitropina na dose de 100 mcg para participantes da pesquisa com até 60kg e 150 mcg para participantes da pesquisa com mais de 60kg. Seis dias após a administração da alfacorifolitropina foi realizada a primeira US tv para monitorização do ciclo. O bloqueio hipofisário foi realizado com antagonista do GnRH (Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, Brasil ou Orgalutran®, Merck & Co), iniciado quando houve um folículo com tamanho médio ≥ 14 mm e mantido até o dia da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil). No oitavo dia após a administração da alfacorifolitropina, as participantes da pesquisa que não apresentar am critério para uso do hCG recombinante, iniciaram o uso diário de gonadotrofinas (150 -300 IU/dia), usadas até a véspera do dia de uso do hCG. - Protocolo flexível com antagonista e hormônio folículo estimulante (FSH) recombinante (FSHr) (Gonal-F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil). Cinco dias após a interrupção do contraceptivo oral combinado foi administrado FSHr, 150 a 300 UI por dia, durante os seis primeiros dias da EOC. A partir do sétimo dia EOC, a dose foi ajustada de acordo com o crescimento folicular, monitorado com US tv diariamente ou em dias alternados e mantida até a véspera do dia de uso do hCG. O bloqueio hipofisário foi realizado com antagonista do GnRH (Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, Brasil ou Orgalutran®, Merck & Co), iniciado quando houve um folículo com tamanho médio ≥ 14 mm e mantido até o dia da administração da hCG (Ovidrel®, Serono, Brasil). - Protocolo flexível com antagonista e hpHMG (Menopur©, Ferring, Aalst, Belgium ou Pergoveris). Cinco dias após a interrupção do contraceptivo oral combinado foi administrado hpHMG 225 a 300 UI por dia, pela via subcutânea, durante os seis primeiros dias da EOC. O monitoramento do crescimento folicular foi realizado por US tv a cada dois dias. O bloqueio hipofisário foi realizado com antagonista do GnRH (Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, Brasil ou Orgalutran®, Merck & Co), iniciado quando houve um folículo com tamanho médio ≥ 14 mm e mantido até o dia da administração da hCG, que foi realizada com a injeção subcutânea de uma ampola de hCG recombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil), no dia seguinte (em torno das 22-23h) à observação de um folículo ≥ 16 mm, ou no dia da observação de um folículo ≥ 18 mm. Quando pelo menos dois folículos atingiram 17 mm de tamanho médio, foi administrado 250 µg de hCG recombinante neste dia ou no dia seguinte às 22:00. A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. 35 A suplementação da fase lútea foi realizada com progesterona natural micronizada (Utrogestan®, Besins Healthcare, Brasil) por via vaginal na dose de 200mg, três vezes ao dia, a partir do dia da captação oocitária e mantida até a décima segunda semana da gestação, nas participantes da pesquisa que engravidaram. 3.5 Delineamento experimental 3.5.1 Coleta e armazenamento das amostras Para a aspiração folicular , as participantes da pesquisa foram submetidas a sedação endovenosa com propofol (Diprivan®, Zeneca -Astra, Brasil) e fentanil (Fentanil®, Jansen - Cilag, Brasil). O FF e os COCs foram aspirados por via endovaginal, guiada por um transdutor de ultrassom transvaginal. Uma agulha padrão de lúmen único (Wallace, Smiths Medical, Mexico) foi usada, com pressão aspirativa artificial constante de 100mmHg , obtida com uma bomba de sucção controlada eletronicamente (Craft® Bomba de sucção, Rocket Medical, Inglaterra). O FF coletado em cada tubo foi analisado em estereomicroscópio e, após a identificação e remoção dos COCs , foi separado. As amostras de FF usadas na pesquisa foram obtidas juntando-se todo o FF obtido de todos os folículos puncionados de cada pa rticipante da pesquisa, originando um pool de FF. O pool de FF foi reunido em tubos estéreis, individuais, aquecidos a 37°C, sem meio de cultura. Imediatamente após a coleta, as amostras de FF foram centrifugadas à 800xg por 10 minutos à 4°C para a separação do líquido de interesse dos debris celulares e armazenadas a -80°C para posterior isolamento e caracterização das VE. As amostras de sangue foram coletadas no momento da punção venosa para administração da sedação. As amostras de sangue foram deixadas em temperatura ambiente por 20 minutos para que se efetuasse a coagulação. Em seguida, foram centrifugadas duas vezes à 1000 x g por 10 minutos à 4°C para a separação do soro. O soro foi, imediatamente, transferido para microtubos e armazenados a -80°C para posterior isolamento e caracterização das VE. 3.5.2 Isolamento das Vesículas Extracelulares VE menores de 200nm (semelhantes a exossomos), foram obtidas do soro e FF. 1ml dessas amostras de cada participante da pesquisa de ambos os grupos, endometriose e controle, foram descongeladas à temperatura ambiente por 5 minutos e passaram por centrifugações seriadas. A primeira centrifugação foi de 300 x g por 10 minutos à 4°C para a retirada de células. O sobrenadante foi retirado e adicionado novos microtubos que foram centrifugados em 2000 x g por 10 minutos à 4°C para retirada de debris celulares. Novamente, o sobrenadante foi 36 retirado e adicionado a novos microtubos que foram centrifugados em 16.500 x g por 30 minutos à 4°C para a separação das VEs pequenas (exosossomos) e microvesículas (MV). Após a centrifugação seriada, as MV foram armazenadas a -80°C. O sobrenadante, que corresponde à VEs pequenas, foi transferido para microtubos e filtrado em filtro com poro de 0,22µm (Kasvi). Em seguida, foi ultracentrifugado a 119.700 x g por 70 minutos à 4°C (Optima XE-90 Ultracentrifuge; rotor 70 Ti; Beckman Coulter). Após a primeira ultracentrifugação , o pellet foi diluído em 2 ml de tampão fosfato -salino (1xPBS) livre de cálcio e magnésio e ultracentrifugado, novamente, a 119.700 x g por 70 minutos à 4°C. O pellet (Figura 3) obtido a partir da segunda centrifugação foi diluído em 50μl de 1xPBS livre de cálcio e magnésio, 20ul foi transferido para microtubos destinados à análise de miRNA e armazenado a -80°C, e 10ul foi destinado à análise do diâmetro e da concentração das VE. Figura 3: Figura esquemática representando o protocolo de centrifugações seriadas para preparo de fluidos para posterior isolamento de vesículas extracelulares. Fonte: própria autoria. 3.5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares A suspensão de VE isoladas do soro e FF foi analisada pela metodologia de rastreamento de nanopartículas (NTA). A NTA é uma metodologia óptica de visualização e caracterização de nanopartículas amplamente utilizada nas pesquisas tratando com VEs (V an der Pol et al., 2012). 3.5.3.1 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Para estimar o diâmetro (média das modas) e a quantificação das VE, 10µL da suspensão de VEs isoladas foi diluído em 50µL de 1xPBS livre de cálcio e magnésio. A análise das VEs foi realizada no aparelho Nanosight® (NS300; NTA 3.1 Build 3.1.45; Mal Vern) através da captura de 5 vídeos de 30 segundo s para cada amostra. Os parâmetros utilizados foram: fator de diluição utilizado para leitura foi de 7.1x10, tipo de câmera sCMOS, camera level 13, velocidade de bombeamento da seringa 60 e temperatura controlada a 37°C. As análises foram realizadas considerando um threshold 5. 37 3.5.4 Extração de RNA das Vesículas Extracelulares O conteúdo de RNA total das VE, incluindo os miRNAs, foi extraído usando o protocolo QIAzol® (QIAzol®Lysis Reagent, Qiagen, EUA), segundo instruções do fabricante, com adição do coprecipitante GlycoBlue® (15µg/mL, Thermo Fisher Scientific) para aumentar a precipitação de RNA. O protocolo QIAzol® combina a lise do Qiazol com métodos padrão de homogeneização e precipitação com isopropanol. O pellet de RNA total foi ressuspendido em 10µL de água livre de RNAse e DNAse. As concentrações (ng/µL) foram determinadas por espectrofotometria por meio do espectrofotômetro NanoDrop® 2000 (Thermo Fisher Science). Resumidamente, 1µL da suspensão de RNA total foi utilizada para a quantificação do RNA. Para evitar a contaminação com DNA, 9 µL da suspensão de RNA total de cada amostra foi tratada com DNAse I (Invitrogen. Thermo Fisher Scientific, EUA & Canadá) segundo as instruções do fabricante. 3.5.5 Transcrição Reversa Para obtenção do cDNA de miRNAs foi realizada a transcrição reversa utilizando o kit comercial microscript microRNA cDNA Synthesis Kit (Norgen, Biotec Corp., Canadá) . Resumidamente, 5µL do 2x Reaction Mix; 0,5µL da TruScript microRNA Enzyme Mix e 4,5µL da suspensão de RNA total de cada amostra foram incubadas em termociclador ProFlex™ PCR System (Life Technologies, EUA) seguindo as instruções do fabricante: 30 minutos incubação à 37°C, seguido por 30 minutos à 50°C e 15 minutos à 70°C. O resultado obtido pa ra cada amostra foi 10 µL de reação contendo concentração entre 80 e 120 ng totais de RNA total. 3.5.6 Análise da expressão relativa dos microRNAs por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT – PCR) A amplificação de 82 miRNAs em VE do FF de mulheres inférteis com e sem endometriose foi avaliada por RT-PCR. Para obter os miRNAs fo ram selecionados apenas primers de miRNAs relacionados à qualidade oocitária e que já foram identificados em outros tecidos de portadoras de endometriose, como endométrio eutópico, lesões peritoneais, endometrioma, soro, plasma e FP (Anexo A). RT-PCR foi realizado usando o kit GoTaq® qPCR Mastex Mix ( Promega, EUA), Universal PCR Reverse Primer, água livre de RNA, microRNA cDNA e microRNA específicos Foward Primer (5 µM) (todos da Norgen Biotek Cop., Canadá), totalizando reações de 6 μl. 38 As amplificações foram realizadas no equipamento QuantStudio 6 Flex (Life Technology). As temperaturas e tempos utilizados foram 95°C por 5 minutos para o início da desnaturação das fitas de cDNA seguido de 45 ciclos de 95°C por 10 segundos para desnaturação, 60°C por 30 segundos para anelamento dos primers e 70°C por 30 segundos para extensão, quando ocorre a captação da fluorescência. A amplificação foi confirmada pela análise da curva de melting. 3.5.7 Cálculo da expressão relativa dos microRNAs Para análise dos miRNAs das VEs obtidas do FF, Cycle threshold (CT) maior que 37 foram excluídos. Os valores brutos de CT foram normalizados utilizando o Hm/Ms/Rt T1 snRNA. As amostras foram avaliadas quanto à repetibilidade dentro de cada grupo. Os miRNAs foram considerados presentes apenas quando observados em pelo menos 50% amostras do mesmo grupo. Os miRNAs identificados em ambos os grupos foram comparados através das médias de expressão relativa de cada miRNA dos dois grupos. Para saber a expressão diferencial dos miRNAs, os níveis de transcritos foram calculados usando o método 2 -∆CT (Schmittgen & Livak, 2008). 3.5.8 Enriquecimento funcional Para identificação das vias relacionadas, os miRNAs encontrados foram inseridos n o software de predição miRPath v.4 da plataforma DIANA Tools (http://62.217.122.229/app/miRPathv4). O DIANA-miRPath permite identificar, com alta precisão, interações de miRNA s preditos experimentalmente baseado no DIANA-TargetScan v.8 e miRBase v.22.1 ( Tastsoglou et al., 2023). A análise de enriquecimento dos múltiplos genes-alvos comparando o conjunto de miRNAs para todas as vias conhecidas na base de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEEG) (P-value threshold 0.05). 39 4 Análise Estatística Para a comparação das características clínicas das participantes da pesquisa como idade, IMC, FSH, CFA, tempo de infertilidade , número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados, tempo da EOC, número de embriões em D2, número de embriões em D3, número de blastocistos, número total de embriões formados, número de embriões transferidos a fresco , número de embriões vitrificados , presença ou ausência de transferência a fresco e tipo de infertilidade entre os grupos endometriose avançada e controle infértil foi usado a média dos dados e o desvio padrão (DP) com p referente ao teste paramétrico para dua s amostras independentes , teste t de Student (p < 0,05). A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS® 9.3 Para a análise do diâmetro e da quantificação das VEs foi aplicado o teste t de Student. As análises foram realizadas no programa SAS® 9.3. Para análise dos miRNAs exclusivos das VEs obtidas do FF em cada grupo fo i utilizado o Diagrama de Venn. A expressão relativa de cada miRNA dos dois grupos foi comparada através das médias dos grupos utilizando teste t de Student considerando 5% de probabilidade. A expressão diferencial dos miRNAs foi calculada através do Fold Change (FC), considerando log2 FC ≥ 1.5 e p < 0.05, por meio da plataforma Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/). A análise de enriquecimento foi realizada com o software de predição miRPath v.4 da plataforma DIANA Tools ( http://62.217.122.229/app/miRPathv4) e do banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEEG) (P-value threshold 0.05). 40 5 Resultados 5.1 Fluxograma do estudo No período de novembro de 2018 a dezembro de 2022 foram analisados um total de 1303 prontuários de mulheres admitidas por infertilidade conjugal no Serviço de Reprodução Assistida do CRH -HCFMRP-USP. Dessas mulheres, 1256 não atenderam os critérios de elegibilidade. Assim, as 47 elegíveis para participação no estudo foram entrevistadas, 7 não aceitaram participar do estudo e 40 assinaram o TCLE (Anexo B), sendo 20 do grupo endometriose avançada e 20 do grupo controle. Dessas 40, 5 do grupo endometriose tiveram o ciclo cancelado por apresentarem má resposta ovariana . Desta forma, obtivemos soro e FF doados por 20 mulheres do grupo controle (infértil por fator masculino) e 15 do grupo endometriose avançada. Amostras de soro e FF de 5 mulheres do grupo endometriose avançada foram perdidas devido a um problema no freezer -80°C no período da pandemia de COVID-19 em que o CRH -HCFMRP-USP esteve fechado. Finalizando, as análises foram realizadas em 20 participantes da pesquisa com infertilidade conjugal exclusiva por fator masculino representando o grupo Controle e em 10 participantes da pesquisa com infertilidade relacionada à endometriose avançada configurando o grupo endometriose . O fluxograma do estudo está representado na figura 4. 41 Figura 4: Fluxograma do estudo. Total de participantes da pesquisa avaliadas quanto a elegibilidade, elegíveis, incluídas e excluídas no estudo. Divisão nos Grupos Controle e Endometriose avançada. 5.2 Caracterização das participantes da pesquisa A comparação entre os grupos Controle e Endometriose avançada não evidenciou diferenças estatisticamente significa tivas em relação às características clínicas das pacientes: idade, IMC, FSH, CFA, tempo de infertilidade (meses), tempo da EOC (dias), número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados, número total de embriões formados, número de embriões em D2, número de embriões em D3, número de blastocistos, número de embriões transferidos a fresco e número de embriões vit rificados conforme apresentado na Tabela 1. 42 Tabela 1: Características clínicas das pa rticipantes da pesquisa do grupo controle e do grupo endometriose Avançada. Variável Endometriose n= 10 Controle n= 20 P Idade (anos) 36.60 (3.31) 35.90 (3.01) 0.5653 IMC (kg/m2) 24.20 (3.20) 25.29 (2.75) 0.3404 FSH (mIU/mL) 6.58 (1.97) 6.15 (3.98) 0.7632 CFA 10.60 (8.44) 13.65 (6.26) 0.2723 Tempo de infertilidade (meses) 76.80 (40.99) 66.90 (42.26) 0.5463 Tempo de EOC (dias) 11.00 (2.11) 10.85 (1.79) 0.8395 N° de oócitos captados 7.20 (2.70) 6.10 (3.65) 0.4075 N° de oócitos maduros 5.70 (2.87) 5.00 (3.34) 0.5763 N° de oócitos fertilizados 3.80 (2.39) 3.20 (3.09) 0.5953 N° de total de embriões formados 3.00 (1.94) 2.35 (2.16) 0.4292 N° de embriões em D2 3.30 (1.89) 3.05 (2.93) 0.8086 N° de embriões em D3 2.90 (2.33) 2.55 (2.91) 0.7438 N° de blastocistos 0.30 (0.95) 0.35 (1.35) 0.9174 N° de embriões transferidos a fresco 0.80 (0.92) 0.75 (0.97) 0.8930 N° de embriões vitrificados 2.20 (2.35) 1.45 (2.14) 0.3880 Nota. Dados expressos como média (desvio padrão), p referente ao teste t de Student para duas amostras independentes (p < 0,05). Endometriose nos estágios avançada; IMC: índice de massa corporal; FSH: hormônio folículo estimulante; CFA: contagem de folículos antrais; OO: oócitos; EOC: estimulação ovariana controlada. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS® 9.3. A comparação entre os grupos Controle e Endometriose avançada também não evidenciou diferenças estatisticamente significativas em relação ao tipo de infertilidade, primária ou secundária, (p = 0.4475) e presença de embrião top transferido (p = 0.7703). 43 5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares As VE obtidas a partir do isolamento do soro e FF foram mensuradas e contabilizadas por NTA. O diâmetro médio, em nanômetros, das partículas no soro e no FF dos grupos Controle e Endometriose avançada estavam de acordo com o esperado para VEs. 5.3.1 Comparação entre os grupos Controle e Endometriose avançada A quantificação de VEs por ml e o diâmetro das VEs, em nm, no soro não apresentaram diferença entre os grupos (p = 0.3412 e p = 0.1954, respectivamente) (Tabela 2). Tabela 2: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no soro dos grupos Controle e Endometriose avançada. Variável Endometriose Controle P Quantificação (VE/ml) 6,67x109 (2,06 x109) 7,5x109 (2,04 x109) 0.3412 Diâmetro (nm) 153.13 (18.88) 153.55 (15.87) 0.1954 NOTA: Dados expressos como média (desvio padrão). Teste t de Student para duas amostras independentes. Nível de significância de 95%. Endometriose: mulheres inférteis por endometriose avançada. Controle: mulheres inférteis fator masculino sem endometriose . Diâmetro = média das modas. A quantificação de VEs por ml no FF não demonstrou diferença entre os grupos (p = 0.5132). Todavia, o diâmetro das VEs, em nanômetros, no FF foi significativamente maior no grupo endometriose avançada comparado ao controle (Tabela 3). Tabela 3: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no fluido folicular dos grupos Controle e Endometriose avançada. Variável Endometriose Controle P Quantificação (VE/ml) 9,71x109 (4,38x109) 8,77x109 (2,6 x109) 0.5132 Diâmetro (nm) 162.24 (12.34) 155.08 (15.30) 0.0405 NOTA: Dados expressos como média (desvio padrão). Teste t de student para duas amostras independentes. Nível de significância de 95%. Endometriose: mulheres inférteis por endometriose avançada. Controle: mulheres inférteis sem endometriose. Diâmetro = média das modas. 44 5.3.2 Comparação entre soro e o fluido folicular do grupo Controle A concentração e o diâmetro das VE no grupo Controle não apresentaram diferença significativa (p < 0.05) entre o soro e o FF (p = 0.0896 e p = 0.7579, respectivamente). 5.3.3 Comparação entre soro e fluido folicular do grupo Endometriose avançada A quantificação de VE por ml e o diâmetro das VE em nanômetros no grupo Endometriose foram estatisticamente maiores no FF quando comparadas ao soro (Tabela 4). Tabela 4: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares entre soro e fluido folicular do grupo Endometriose avançada. Variável Soro Fluido Folicular P Concentração 6,67x109 (2,06x109) 9,7x109 (4,38 x109) 0.0334 Diâmetro 153,55 (18,88) 162.24 (12,34) 0.0021 NOTA: Dados expressos como média (desvio padrão). Teste t de student para duas amostras pareadas. Nível de significância de 95%. Endometriose: mulheres inférteis por endometriose avançada. Diâmetro = média das modas. 5.4 Perfil de microRNAs em Vesículas Extracelulares obtidas do fluido folicular O perfil de miRNAs das VE obtidas do FF foi avaliado utilizando um painel customizado contendo as sequências de 82 miRNAs. Foram detectados 73 miRNAs nos dois grupos. Desses, 59 foram comuns em ambos os grupos, 1 foi exclusivo do grupo controle e 13 foram exclusivos do grupo endometriose avançada (Figura 5). 45 Figura 5: Diagrama de Venn representando a intersecção dos 73 microRNAs provenientes das comparações entre as vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose. Entre os 59 miRNAs presentes em ambos os grupos, 24 estavam diferencialmente expressos entre os grupos ( |log2 FC| ≥ 1.5 e p < 0.05), sendo todos elevados no grupo endometriose avançada (Tabela 5 e Figura 6). Tabela 5 : microRNAs diferencialmente expressos em vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose avançada comparadas aos controles inférteis sem endometriose. miRNA p value Fold Change (FC) Status miR-24-3p 0.0008 6.6464 Hiperexpressos miR-145-5p 0.0165 6.0871 Hiperexpressos miR-151-3p < 0.0001 5.7267 Hiperexpressos miR-206 0.0043 5.705 Hiperexpressos miR-141-3p 0.0424 5.4108 Hiperexpressos miR-885-5p < 0.0001 5.0663 Hiperexpressos miR-214-3p < 0.0001 4.9985 Hiperexpressos miR-21-5p 0.0327 4.9303 Hiperexpressos 46 miR-31-5p 0.0008 4.7659 Hiperexpressos miR-139-5p 0.00025 4.7206 Hiperexpressos miR-330-3p 0.0004 3.8784 Hiperexpressos miR-185-5p 0.0053 3.6476 Hiperexpressos miR-127-3p < 0.0001 3.5234 Hiperexpressos miR-425-3p 0.0019 3.3947 Hiperexpressos miR-504-3p 0.0264 3.3922 Hiperexpressos miR-378a-3p < 0.0001 2.9698 Hiperexpressos miR-490-3p 0.0009 2.9432 Hiperexpressos miR-92a-3p 0.0228 2.8707 Hiperexpressos miR-574-5p 0.00018 2.3866 Hiperexpressos miR-30c-5p 0.0012 2.3805 Hiperexpressos miR-877-5p 0.0006 2.3443 Hiperexpressos miR-187-3p 0.0002 2.1903 Hiperexpressos miR-191-5p < 0.0001 2.0446 Hiperexpressos miR-423-3p 0.002 1.936 Hiperexpressos NOTA: Status de expressão dos miRNAs no grupo infértil por endometriose avançada em relação ao grupo controle infértil sem endometriose (Fold change ≥ 1.5 e p value < 0.05). 47 48 Figura 6: microRNAs diferencialmente expressos em mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle) e inférteis por endometriose avançada (grupo Endometriose). (A–X) Os 24 miRNAs hiperexpressos em mulheres inférteis por endometriose avançada. Análise estatística realizada pelo tese t de Student. Nível de significância de 95%. 5.5 Análise de bioinformática dos microRNAs A análise de bioinformática foi utilizada para identificar as vias reguladas pelos miRNAs identificados e potencialmente envolvidas na aquisição de competência oocitária. Os miRNAs que foram exclusivos em cada grupo e os miRNAs que foram diferencialmente expressos entre os grupos foram utilizados para selecionar as vias moduladas. 5.5.1 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente expressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo Controle A análise de enriquecimento do grupo Controle considerou as 10 principais vias metabólicas que evidenciaram processos biológicos e vias de atuação correlacionadas com o miRNA encontrado, exclusivamente, em VEs do FF de mulheres inférteis sem endometriose (Figura 7 A e B). As vias foram classificadas por meio dos valores mais baixos do p-value (p≤0.05). O mir-155-5p é predito de regular 58 vias de sinalização (Anexo C – Tabela 1). Dentre as 10 principais vias, as vias de sinalização mAPK, regulatória das cé lulas-tronco de pluripotência, mTOR, TGF-β e de prolactina estão correlacionadas com o possível impacto na aquisição oocitária. 49 Figura 7: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas modulada pelo microRNA proveniente de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle). (A) Representação do número de genes alvos dos miRNAs em cada via de sinalização. (B) Representação da significância de modulação da via de acordo com o valor de p. Os valores de p foram normalizados utilizando -log10. 5.5.2 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente expressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo Endometriose As 10 principais vias metabólicas preditas moduladas pelos miRNAs identificados exclusivamente no grupo Endometriose foram classificadas por meio dos valores mais baixos do p-value (p≤0.05) com o objetivo de evidenciar os processos biológicos e as vias de atuação (Figura 8 A e B). Os 13 miRNAs exclusivos em endometriose III/IV são preditos de regularem 149 vias de sinalização (Anexo C – Tabela 2). Dentre as 10 principais vias, as vias de sinalização MAPK, Ras, regulação do citoesqueleto de actina, adesão f ocal e ErbB se 50 correlacionaram com o potencial papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto na aquisição oocitária. Figura 8: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos microRNAs provenientes de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose III/IV (grupo Endometriose). ( A) Representação do número de genes alvos dos miRNAs em cada via de sinalização. ( B) Representação da significância de modulação da via de acordo com o valor de p. Os valores de p foram normalizados utilizando - log10. 5.5.3 Análise de enriquecimento dos microRNAs diferencialmente expressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis sem e com endometriose avançada (grupos Controle e Endometriose) A análise de enriquecimento foi realizada para definir as vias biológicas preditas pelos miRNAs diferencialmente expressos entre mulheres inférteis sem endometriose e inférteis com 51 endometriose avançada. Nas VE isoladas do FF de mulheres inférteis com endometriose avançada, 24 miRNAs estavam hiperexpressos e foram preditos de regularem 152 vias de sinalização (Anexo C – Tabela 3). As 10 principais vias metabólicas envolvidas nos processos biológicos e nas vias de atuação foram classificadas por meio dos valores mais baixos do p- value (p≤0.05) (Figura 9 A e B). Das 10 principais vias, as vias de sinalização Ras, cAMP, Rap1, WNT, Hippo, regulatória das células -tronco de pluripotência e ErbB estão correlacionadas com o potencial papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto na aquisição da competência oocitária. Figura 9: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos microRNAs provenientes d e vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular diferencialmente expressos entre mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle) e com endometriose avançada (grupo Endometriose). ( A) Representação do número de genes alvos dos miRNAs em cada via de sinalização. (B) Representação da significância de modulação da via de acordo com o valor de p. Os valores de p foram normalizados utilizando -log10. 52 6 Discussão A associação entre endometriose e infertilidade encontra fundamento na alta prevalência desta doença em populações de mulheres inférteis (Missmer et al., 2004; ASRM, 2012; OMS, 2021). O efeito deletério da endometriose na qualidade oocitária foi suspeitado há cerca de três décadas, ao se observar que as taxas de gestação de mulheres com endometriose usando seus próprios oócitos foram menores do que as de mulheres sem a doença (Simón et al., 1994). Entretanto, mulheres com endometriose , usando oócitos doados por mulheres sem a doença, apresentaram taxas de implantação similares as de mulheres sem endometriose (Simón et al., 1994). A qualidade oocitária comprometida tem sido considerada um dos possíveis fatores envolvidos na infertilidade apresentada por mulheres com endometriose e uma série de estudos tem procurado entender os mecanismos pelos quais a endometriose poderia favorecer o comprometimento da qualidade gamética (Barcelos et al., 2009; da Broi et al., 2014; Barcelos et al., 2015; Donabela et al., 2015; da Broi et al., 2016; Giorgi et al., 2016; Jianini et al., 2017; da Luz et al., 2017; da Broi et al., 2018a; da Broi et al., 2019; da Luz et al., 2021; da Silva et al., 2021; Simopoulou et al., 2021). Oócitos de boa qualidade dependem da adequada aquisição de competência oocitária, que é condicionada pelo conteúdo do FF e pela influência das células da granulosa e do cumulus (da Broi et al., 2018a). Esses fatores estabelecem um microambiente ovariano propício para o desenvolvimento do folículo, maturação oocitária e, subsequente, ovulação. Dentro desse microambiente, é necessário que ocorra uma comunicação precisa e bidirecional entre as CG e o COC , influenciada pelo microambiente folicular (Hung et al., 2015). Essa comunicação celular é mediada, entre outros, pelas VE (da Silveira et al., 2012), que atuam como moléculas sinalizadoras envolvidas na ativação de vias de sinalização incluindo regulação da foliculogênese, maturação oocitária, retomada da meiose, ovulação, fertilização , desenvolvimento embrionário (Zhang et al., 2009; da Silveira et al., 2012; Santonocito et al., 2014; Hung et al., 2015) e controlando a esteredoigênese ovariana (Sohel et al., 2013; Andrade et al., 2017). Até o momento, os dados apresentados pelos estudos de VE no microambiente folicular de várias espécies, incluindo mamíferos, avaliaram apenas o conteúdo de miRNAs dessas VE sem focar em sua liberação, quantidade e diâmetro. Entretanto, análises realizadas em situações patológicas (Stavrou & Ortiz, 2022) , como por exemplo tumores malignos, demonstraram valiosas alterações na quantidade de VE liberadas (Kalluri, 2016; Djusberg et al., 2017; Patton et al., 2020) e em seu diâmetro (Patton et al., 2020). Desta forma, propusemos um estudo inédito de análise do diâmetro e concentração de VE por ml no soro e no FF de mulheres inférteis sem 53 e com endometriose avançada, seguido pela análise do perfil de miRNAs provenientes das VE isoladas do FF com o objetivo de avaliar se ocorre alguma alteração importante na regulação de processos biológicos e vias de atuação para aquisição e manutenção da qualidade oocitária, almejando obter mais informações sobre os mecanismos pelo os quais a endometriose poderia interferir no comprometimento gamético ocasionando a infertilidade nessas mulheres. Ao compararmos os grupos infértil sem endometriose e com endometriose avançada, não encontramos diferença significativa entre o diâmetro e a concentração de VE por ml obtidas do soro. Todavia, apesar da concentração de VE por ml no FF tenha sido similar entre os grupos, o diâmetro das VE isoladas do FF evidenciou VE maiores em mulheres inférteis por endometriose avançada. Variações no diâmetro dessas vesículas ainda são pouco compreendidas. Em células tumorais, foi demonstrado que as VE apresentaram aumento em seu diâmetro favorecendo a comunicação intercelular, o crescimento e a proliferação tumoral (Zhang & Yu, 2019) através da supressão da resposta imunológica, promoção de metástase e estimulação da angiogênese (Yáñez-Mó et al., 2015). Já em outras situações patológicas, como a hipóxia extrema, foi observada a diminuição do diâmetro médio das VE como um mecanismo adaptativo de sobrevivência ( Patton et al., 2020). Dados prévio s demonstraram que as VE liberadas por portadoras de endometriose são ricas em mediadores pró-inflamatórios e citocinas capazes de induzir a resposta inflamatória e desencadear o estresse oxidativo (Khalaj et al., 2019; Chen et al., 2019; Zhang et al., 2020; Nazri et al., 2020; Zhou et al., 2020; Jiang et al., 2022; Wu et al., 2022; Nazri et al., 2023). Sendo assim, sugerimos que o aumento no diâmetro das VE do FF somente no grupo inférteis por endometriose avançada possa ser devido à exacerbada quantidade de fatores inflamatórios e oxidativos presentes no microambiente folicular dessas mulheres que não é observado em mulheres inférteis sem a doença. Quando comparamos o diâmetro e a concentração de VE por ml entre o soro e o FF somente do grupo infértil sem endometriose não encontramos diferença significativa. Entretanto, ao analisarmos somente o grupo infértil por endometriose avançada, foi evidenciado que o diâmetro e a concentração de VE por ml do FF é maior que a encontrada no soro . Em relação ao aumento da concentração de VE por ml do FF , evidências recentes sugerem que células foliculares expostas à estressores metabólicos, como por exemplo, fatores inflamatórios e pró-oxidantes, que é uma característica marcante do microambiente folicular em portadoras de endometriose (da Broi & Navarro, 2016), mantém uma comunicação ativa enviando sinais moleculares para as células vizinhas com a finalidade de ajustar o metabolismo e reestabelecer o equilíbrio desse microambiente na tentativa de proteger os oócitos desses estressores (de Maio; 2011; Gebremedhn et al., 2020). Deste modo, u ma possível explicação para esses 54 achados seria que o aumento na concentração de VE por ml somente no FF, e não no soro, de mulheres inférteis por endometriose avançada seja um mecanismo de proteção ao oócito uma vez que o constante estresse metabólico presente no microambiente folicular dessas mulheres poderia comprometer a qualidade gamética. Todavia, também foi observado que o diâmetro das VE do FF estava maior do que o diâmetro das VE encontradas no soro somente no grupo infértil por endometriose avançada . Esse achado corrobora com o resultado citado acima de que os fatores estressores localizados no microambiente folicular podem provocar modificações conteúdo da s VE, como maior liberação e aumento no diâmetro. Evidências demonstraram que, em situações patológicas, as VE atuam como mediadoras do progresso da doença (Stavrou & Ortiz, 2022). Por exemplo, VE secretadas de células tumorais apresentaram em seu conteúdo fatores que são capazes de promover a sobrevivência celular e prevenir a apoptose nas células receptoras ( Fonseka et al., 2019). Ademais, o conteúdo molecular bioativo das VE liberadas de células submetidas a uma variedade de estressores ambientais e metabólicos parece ser distinto e divergente quando comparados às VE obtidas de células não estressadas (Eldh et al., 2010; Yentrapalli et al., 2017). Deste modo sugerimos que , apesar o au mento na concentração de VE liberadas no FF possa tentar reestabelecer o equilíbrio no microambiente folicular, porém o conteúdo inflamatório e pró-oxidativo dessas vesículas poderia contribuir para que as VE atuassem como mediadoras e perpetuadoras da inflamação ( Sanwlani & Gangoda, 2021 ) e do EO (Ho et al., 2022) comprometendo o desenvolvimento folicular e a qualidade gamética (da Broi et al., 2019) já relatada nessas mulheres (Polak et al., 2013; Da Broi et al., 2014; Donabela et al., 2015; Da Broi et al., 2016; Da Broi & Navarro, 2016; Giorgi et al., 2016; Nasiri et al., 2017; Jianini et al., 2017; Da Broi et al., 2018a; Da Broi et al., 2019; Ferreira et al., 2019; Da Luz et al., 2021, Da Silva et al., 2021; Giorgi et al., 2023; Casalechi et al., 2023; Wang et al., 2024). Esses achados abrem grandes perspectivas para estudos futuros que visem esclarecer por meio de quais mecanismos as VE poderiam influenciar na qualidade oocitária e contribuir para o comprometimento da fertilidade natural nessas mulheres. Na última década, plausíveis evidências indicam que o conteúdo de miRNAs das VE do FF representa um novo mecanismo de regulação de eventos relacionados com a qualidade oocitária (da Silveira et al., 2012; Sang et al., 2013; Sohel et al. 2013; Santonocito et al., 2014; Hung et al., 2015 ; Navakanitworakul et al., 2016 ; Machtinger et al., 201 7; da Silveira et al., 2017; da Silveira et al., 2018; Matsuno et al., 2019; Hu et al., 2020; Inoue et al., 2020; Zhang et al., 2021; Shen et al., 2023 ). Apesar dos recentes avanços, dispomos de raríssimos estudos que avaliaram esses miRNAs em VE do FF humano (Sang et al., 2013; Santonocito et al., 2014; 55 Diez-Fraile et al. 2014; Machtinger et al., 2017; Martinez et al., 2018; Zhang et al., 2021) e, até o presente momento, não há dados na literatura analisando a identificação e a expressão de miRNAs em VE do FF de mulheres inférteis por patologias como a endometriose. Sendo assim, o presente estudo comparou a expressão de 82 miRNAs, que j á foram correlacionados com qualidade oocitária , extraídos de VE isoladas do FF de mulheres inférteis sem e com endometriose avançada. Os resultados obtidos identificaram 73 miRNAs. Desses 59, 24 miRNAs (miR-127-3p, miR-139-5p, miR-141-3p, miR-145-5p, miR-151-3p, miR-185-5p, miR-187-3p, miR-191-5p, miR-206, miR-21-5p, miR-214-3p, miR-24-3p, miR-30c-5p, miR-31-5p, miR-330-3p, miR- 378-3p, miR-423-3p, miR-425-3p, miR-490-3p, miR-504-3p, miR-574-5p, miR-885-5p, miR- 877-5p e miR-92a-3p) apresentaram expressão elevada no grupo infértil por endometriose avançada em relação ao controle infértil sem endometriose . O genes regulados por esses miRNAs estão envolvidos em vias relacionadas, em sua maioria, a processos que controlam o desenvolvimento, o crescimento e a atresia folicular, e comprometem a parada e a retomada da meiose oocitária (Castanon et al., 2012; Wang et al., 2x013; Liu & Ge, 2013; Wang et al., 2018; Ma et al., 2019; Dey et al., 2020 ) (cAMP, Rap1, Ras, ErbB, Hippo e WNT). Uma vez que os miRNAs atuam como silenciadores da expressão gênica (Singh et al., 2008), acreditamos que há menor expressão dessas vias na doença avançada. No microambiente folicular, u m conceito muito bem estabelecido é que a parada da meiose oocitária na prófase da primeira divisão meiótica depende de altas concentrações do s mensageiros secundários adenosina mon ocíclica fosfato (cAMP) e guanosina monocíclica fosfato (cGMP) (Conti et al., 2002; Conti et al., 2012). Inicialmente, acreditava -se que esses mensageiros secundários eram fornecidos ao oócito pelas células somáticas por meio de junções GAP (Dekel, 1988), devido à dependência oocitária das células da granulosa. Entretanto, com o avanço dos estudos nesse mecanismo, descobriu-se que toda a maquinaria molecular necessária para os produzir é expressa pelos próprios oócitos e a atividade desses componentes endógenos é suficiente para manter cAMP e cGMP em níveis que impedem a maturação oocitária até que ocorra o pico do hormônio luteinizante (LH) (Wang et al., 2018). Em resposta ao pico de LH, a concentração de cGMP no folículo pré -ovulatório diminui e o cAMP é , rapidamente, hidrolisado levando à ativação do fator promotor de maturação (MPF) que inicia a retomada da meiose e a segregação cromossômica liberando o oócito da parada meiótica (Arroyo et al., 2020). Um dos mecanismos de parada da meiose oocitária é por meio da ativação da proteína de troca diretamente ativada por cAMP (Epac) (de Rooij et al., 1998; Kawasaki et al., 1998 ). A proteína Epac é responsável pela ativação direta de uma molécula efetora de 56 cAMP, chamada proteína-1 relacionada a Ras (Rap1) (de Rooij et al., 1998). Uma vez ativada a proteína Rap1 , inicia-se a via de sinalização Rap1 que está envolvid a no controle da morfologia celular , no início da atividade d as moléculas de adesão celular mediada p elas integrinas (Kitayama et al., 1989), na sinalização efetora das proteínas Ras e na ativação da via de sinalização MAPK (Vossler et al., 1997; York et al., 1998). A via de sinalização Ras é responsável pelos processos de progressão do ciclo celular, apoptose, reorganização dos filamentos de actina e dinâmica dos microtúbulos do citoesqueleto de actina (Zwartkruis et al., 1999) regulando, assim, a proliferação e sobrevivência celular (Cox et al., 2003). Já a via MAPK tem um papel crucial na reativação d o MPF após meiose I por meio das quinases reguladas por sinal extracelular 1/2 (ERK1/2) (Sun et al., 1999; Fan et al., 2004) e, posteriormente, na manutenção da parada na meiose II (Araki et al., 1996). A via ErbB , composta por 4 membros de receptores com atividade tirosina quinase (RTK) [receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)/ErbB1, ErbB2, ErbB3 e ErbB4] , regula processos relacionados ao crescimento e sobrevivência celular (Orofiamma et al., 2022) e uma complexa rede de sinalização intracelular responsável pelo controle do ciclo celular, apoptose, reorganização do citoesqueleto de actina (Yardenn & Shilo, 2007; Lemmon & Schlessinger, 2010; Wee & Wang, 2017) , regulação da expressão gênica (Holbro & Hynes, 2004) e ativação de diversas vias de sinalização (Miaczynska et al., 2004). No folículo ovariano, os receptores ErbB são mediadores do efeito induzido pelo LH na maturação oocitária, expansão das CC e luteinização das CG (Park et al., 2004 ; Reizel et al., 2010). A ativação de ErbB nas CG são essenciais para ovulação pois ativam a via ErbB-ERK1/2 nas CC (Arroyo et al., 2020). Uma vez ativada, essa via induz a fosforilação de ERK1/2, por meio de Ras quinase, e ERK1/2 fosforiladas aumentam a expressão de genes relacionados à expansão d as CC no COC (Arroyo et al., 2020). Ademais, a via ErbB está envolvida no aumento na demanda da produção de energia (Zhang et al., 2019). A via de sinalização Hippo atua na diferenciação e especialização celular em decorrência da complexa rede de sinais que controlam a atividade de dois efetores principais, Transcriptional co-activator with PDZ -binding motif (TAZ) e Yes-Associated Protein (YAP) que, por sua vez, ligam-se aos fatores de transcrição TEA domain family member (TEAD) e regulam a expressão de diversos genes (Piccolo et al., 2014). No microambiente folicular, a via Hippo, uma cascata de sinalização serina/treonina quinase evolutivamente conservada, é responsável pela transdução de sinais envolvidos na ativação e crescimento folicular, oogênese, bem como na esteredoigênese, regulando assim, o desenvolvimento do folículo ovariano ( Ma et al., 2019; Dey et al., 2020; Zhu et al., 2023). A ativação da transição dos folículos primordiais 57 para os folículos primários ocorre através da proteína YAP expressa em diferentes estágios dos folículos (Kawamura et al., 2013; De Roo et al., 2017; Gershon & Dekel, 2020). A subunidade YAP1 foi encontrada em oócitos maduros (Yan et al., 2013) e está relacionada com o processo de ovulação (Sun & Diaz, 2019). Antes da ovulação, o oócito maduro inibe a via Hippo para ativar a YAP1 e aumentar a sobrevivência e proliferação das células da granulosa e inibir a diferenciação celular (Sun & Diaz, 2019). Com a ovulação, esses efeitos são revertidos através da inibição e degradação da YAP1 concomitante com a promoção da proliferação celular (Sun & Diaz, 2019). Já, a via WNT impacta nas funções reprodutivas, incluindo a regulação de processos cruciais de desenvolvimento ovariano e do tecido do ovário, esteroidogênese, desenvolvimento folicular, maturação oocitária, indução embrionária e geração de polaridade celular (Cadigan & Nusse 1997, Miller et al. 1999, Komiya & Habas 2008; Hernandez Gifford, 2015). Através da interação com seu receptor frizzled (FZ), a via WNT inicia três cascatas de transdução de sinal separadas, sendo a canônica , fundamental para regulação da maturação folicular, governada pela interação com a ß-catenina (Hernandez Gifford, 2015). Durante o desenvolvimento folicular, níveis moderados de espécies reativas de oxigênio atuam como moléculas sinalizadoras cruciais para maturação folicular, meiose oocitária e ovulação. Níveis controlados de espécies reativas de oxigênio asseguram a atresia de folículos não dominantes, permitindo o amadurecimento apenas dos mais saudáveis. As espécies reativas de oxigênio também desempenham um papel fundamental na resposta inflamatória essencial para a ovulação, regulam genes envolvidos na proteólise e remodelação tecidual (Shkolnik et al., 2011; Kala et al., 2017), impactam na sobrevivência e função das células lúteas, afetando a produção de progesterona e angiogênese para manutenção do corpo lúteo (Jamil et al., 2020; Wang et al, 20 21; Tian et al., 2022; Liang et al., 2023 ). Deste modo, o equilíbrio entre a s espécies reativas de oxig ênio e os agentes antioxidantes é essencial para processos ovarianos normais. No entanto, sua produção em excesso pode desencadear o estresse oxidativo (Silva et al., 2011; Sies, 2015; Tsikas, 2017). O estresse oxidativo está associado a altas taxas de morte folicular, comprometendo severamente a qualidade dos folículos (Saeed-Zidane et al., 2017) através da peroxidação de membranas lipídicas, dano oxidativo aos ácidos nucléicos e carboidratos e ainda a oxidação de grupos sulfidrilas nas proteínas (Dornas, et al., 2007). Esses eventos resultam em mau funcionamento do DNA, perda da integridade da membrana e disfunção mitocondrial (Wu et al., 2011). Além disso, o estresse oxidativo pode, ainda, ativar importantes vias indutoras de apoptose, além de regular positivamente o nível de expressão de proteínas pró -apoptóticas resultando, dessa forma, no comprometimento da estrutura dos folículos ovarianos (Hori et al., 2013). Deste modo, o e stresse oxidativo já encontrado em 58 mulheres inférteis por endometriose (da Broi e Navarro, 2016), associado a menor ativação das vias cAMP, Rap1, Ras, ErbB, Hippo e WNT pode indicar que o microambiente folicular esteja sofrendo dano oxidati vo e inflamatório com comprometimento do desenvolvimento folicular que, certamente, afetarão a maturação e qualidade oocitárias. Esses achados corroboram com evidências da literatura de que a diminuição nos níveis intracelulares de cAMP não seriam suficientes para manter o oócito inativo, permitindo, assim, a retomada precoce da meiose oocitária (Dekel, 1996; Hinckley et al., 2005; Kawamura et al., 2011). A diminuição da sinalização da via Rap1 poderia afetar a via MAPK, interferindo na segunda parada meiótica, e a via Ras resultando em alterações de processos que controlam a reorganização do citoesqueleto de actina, a formação do fuso meiótico e a inibição da apoptose, comprometendo a qualidade oocitária, culminando com anormalidades meióticas, instabilidade cromossômica e aumento da apoptose (Liu et al. 2003; Navarro et al. , 2004; Navarro et al. , 2006; Da Broi et al., 2019 ). Ademais, a interferência na adesão focal permit iria a progressão descontrolada do ciclo e da proliferação celular (Cox et al., 2003). Já, a diminuição da via Hippo que é, altamente, suscetível à inibição por fatores de crescimento como por exemplo insulin - like growth factor 1 (IGF1) e EGF (Zhou et al., 2020), poderia levar a perda da homeostase folicular, secreção anormal das gonadotrofinas e outros hormônios ovarianos prejudicando, consequentemente, a fertilidade nessas mulheres (Hu et al., 2019; Siegel et al., 2020; Chang & Dunaif, 2021). Nesse sentido, Hsueh & Kawamura, (2020) evidenciaram que a perda da YAP nas CG aumenta a apoptose celular e leva a subfertilidade e Song et al., 2016 demonstrou o crítico papel da via Hippo/YAP na endometriose, o que reforça nossos achados. Deste modo, sugerimos que as a lterações no ciclo celular, na proliferação e diferenciação das células foliculares ovarianas, na retomada da meiose oocitária, na expansão das CC, na indução da apoptose, na diminuição da produção de energia, na formação do corpo lúteo e na produção de esteroides induzida pela diminuição da ativação dessas vias resultaria em danos à regulação d o desenvolvimento folicular e da maturação oocitária que poderiam afetar a qualidade gamética em portadoras de endometriose avançada com consequente alteração na fertilidade natural feminina dessas mulheres (Park et al., 2004; Holbro & Hynes , 2004; Khan et al., 2005; Hsieh et al., 2007; Hsieh et al., 2011; Conti et al., 2012; Velthut-Meikas et al., 2013; Li et al. 2014; Hernandez Gifford, 2015; Richani & Gilchrist, 2018; Zhang et al., 2019; Fan et al., 2023). Ao comparamos os grupo s infértil sem endometriose e com endometriose avançada o observamos que os miRNAs miR-1271-5p, miR-146b-5p, miR-150-5p, miR-17-5p, miR-193a- 5p, miR-196b-5p, miR-215-5p, miR-22-5p, miR-28-5p, miR-542-5p, miR-628-5p, miR-708- 59 5p e miR -9-5p foram encontrados, exclusivamente, em VE do FF no grupo endometriose avançada. Dentre eles, o miR -215-5p já foi identificado em VEs do soro de portadoras de endometriose (Wu et al., 2022). Por meio da análise de enriquecimento verificamos que, juntos, esses 13 miRNAs podem regular genes envolvidos em 149 vias, que quando alteradas , comprometem processos envolvidos na adesão focal e montagem do fuso meiótico, atenuam a extrusão do corpo polar, enfraquecem o nível de acetilação da α-tubulina, alteram o controle do ciclo e da proliferação celular, danificam a função das mitocôndrias, induzindo o declínio do conteúdo de ATP e a elevação de espécies reativas de oxigênio que resultam em apoptose precoce e danos ao DNA, causam alterações epigenéticas que modificam a metilação das histonas e desencadeiam a ativação das vias de sinalização MAPK, ErbB e Ras culminando com danos à maturação oocitária. A adesão focal é um evento crucial para o adequado desenvolvimento folicular e maturação oocitária. Através dela, as proteínas transmembranas do tipo integrinas ( Hynes, 2002) se ligam, internamente, aos microfilamentos do citoesqueleto de actina e, externamente, à matriz extracelular possibilitando a transdução de sinais para o interior da célula (Hynes, 2002). Esse mecanismo é responsável pela estreita comunicação entre o oócito e as células somáticas ao seu redor com a função de fornecer suporte metabólico e permitir a sinalização de estímulos endócrinos ou parácrinos. A fim de suportar as alterações metabólicas envolvidas no desenvolvimento folicular bem como na maturação oocitária citoplasmática e nuclear , e ssa comunicação é mediada tanto pelas junções GAP como pelas VE (McGinnis & Kinsey, 2015). Alterações na adesão focal, geralmente, interfere m na transdução de sinais que servem para modular diversos aspectos do comportamento celular incluindo crescimento, proliferação, diferenciação, sobrevivência/apop tose, polaridade, motilidade e expressão gênica (Hynes, 2002). A reorganização do citoesqueleto de actina é responsável pelas divisões celulares assimétricas e consecutivas que geram o gameta haplóide e funcional (Yi & Li, 2012). Essa divisão assimétrica permite que o oócito maduro mantenha, em seu citoplasma, não somente os cromossomos maternos, mas também, uma reserva energética e de nutrientes vitais para manter a formação e o desenvolvimento embrionário até que o código genético do embrião seja ativado (Nikalayevich & Terret, 202 3). Para assegurar a assimetria em c ada divisão e a segregação cromossômica durante a meiose, o fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II, que é uma estrutura dinâmica e temporária composta por microtúbulos, deve estar assimetricamente posicionado próximo a um lado do córtex oocitário e sua rede subcortical de filamentos de 60 actina deve estabelecer a polaridade cortical (Wang & Keefe, 2002; Navarro et al., 2005; De Santis et al., 2005; Yi & Li, 2012; Duan & Sun, 2019). Um dos mecanismos que leva a alterações no posicionamento assimétrico do fuso e/ou na polarização cortical , e influencia a perda da adesão intercelular é o estresse oxidativo (Navarro et al., 2005; Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., 2009 ; Dib et al., 2013; Da Broi et al., 2014; Donabela et al., 2015; Da Broi et al., 201 6; Jianini et al., 2017; Da Luz et al., 2017; Da Broi et al., 2018a; Da Broi et al., 2019; Giorgi et al., 2021; Da Luz et al., 2021, Da Silva et al., 2021 ). O fuso meiótico oocitário é extremamente sensível ao EO (Hu et al., 2001; Eichenlaub-Ritter et al., 2002; Mullen et al., 2004) que, por sua vez, quando alterado promove anomalias meiótica s, instabilidade c romossômica, aumento da apoptose e prejuízos ao desenvolvimento oocitário e ao embrião pré-implantacional (Liu et al., 2003; Navarro et al., 2004, Navarro et al., 2006). A correlação entre endometriose e EO é ampla na literatura (Agarwal et al., 2005; Rizzo et al., 2011; Carvalho et al., 2012; Luderer, 2014; Prasad et al., 2016; Simopoulou et al., 2021). O desequilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio e os antioxidantes permite o aumento das espécies reativas de oxigênio e seu influxo no FP (Jianini et al., 2017), folículo ovariano (Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., 2009; d a Luz et al., 2017; Giorgi et al., 2021; da Luz et al., 2021; da Silva et al., 2021 ) e FF (da Broi et al., 2014) resultando em impacto deletério na sinalização celular, na maturação oocitária, na esteredoigênese ovariana, na ovulação, na luteólise, na interação gamética, na capacidade de implantação e na formação do blastocisto (Agarwal et al. 2005; Simopoulou et al., 2021). A relação encontrada entre os miRNAs derivados de VE do FF de portadoras de endometriose avançada com adesão focal e reorganização do citoesqueleto de actina, sugere que o FF esteja sofrendo dano oxidativo com tentativa de reparo de DNA e indução da apoptose, o que poderia comprometer o desenvolvimento folicular, a maturação e a qualidade oocitárias nessas mulheres. Esses achados corroboram com evidências da literatura de comprometimento da qualidade oocitária através de anormalidades meióticas, instabilida de cromossômica e aumento da apoptose (Liu et al. 2003; Navarro et al., 2004; Navarro et al., 2006; Da Broi et al., 2019) mediadas pelo aumento da produção de espécies reativas de oxigênio no FP (Jianini et al., 2017), FF (Da Broi et al., 2014; Giorgi et al., 2016; Giorgi et al., 2021; Giorgi et al., 2023), CC (Barcelos et al., 2015; Donabela et al., 2015; Da Luz et al., 2021; Da Silva et al., 2021) e oócitos (Barcelos et al., 2009; Da Broi et al., 2018a) de portadoras de endometriose. Ademais, resultados da análise do fuso meiótico celular e da distribuição cromossômica de oócitos imaturos, maturados in vitro, obtidos de mulheres inférteis com endometriose sugerem que a 61 meiose I está potencialmente atrasada ou comprometida nessas mulheres evidenciando, ainda mais, a relação entre endometriose e anormalidades meióticas oocitária (Barcelos et al. 2009). Todavia, estudos futuros são necessários para melhor elucidar essa questão. Cada vez mais, estudos sugerem que os miRNAs de VE podem ser possíveis reguladores das vias de sinalização, como por exemplo a via MAPK, modulando negativamente a maturação de folículos e oócitos em mamíferos (da Silveira et al., 2012; Sohel et al., 2013; Santonocito et al., 2014; da Silveira et al., 2014). Oócitos incompetentes apresentaram MAPK na sua forma não fosforilada, supostamente, inativa (Goudet et al., 1998) sugerindo que a falta de aquisição de competência oocitária é provável resultado de uma deficiência de reguladores do MPF e/ou da incapacidade de fosforilar a MAPK. Sabe-se que ERK1/2 fosforiladas aumentam a expressão de genes relacionados à expansão das CC no COC e de genes relacionados à esteredoigênese em CG (Arroyo et al., 2020). Corroborando com nossos resultados, falhas na maturação oocitária em camundongos foram correlacionadas com a ruptura das ERK1/2 nas CG (Fan et al., 2009) e níveis reduzidos, porém mensuráveis, das ERK1/2 fosforiladas foram detectados em folículos de camundongos mutantes nos quais a maturação oocitária foi prejudicada (Panigone et al., 2008). A via de sinalização Ras, já descrita acima, parece ser divergente em sua atuação (Fan et al., 2008) . A ativação transitória de Ras e a fosforilação de seus alvos , as vias RAF1/MEK1/ERK1/2 e PI3K/Akt, são cruciais para intermediar respostas apropriadas das CG aos hormônios gonadotrópicos FSH e LH, levando ao adequado desenvolvimento folicular e, subsequente, ovulação (Fan et al., 2008). Em contrapartida, a ativação persistente da forma ativa de Ras resulta em progressão desregulada do ciclo celular e prolif eração celular descontrolada (Cox et al., 2003) prejudicando o desenvolvimento folicular, a ovulação e a expressão de genes relacionados à ovulação (Fan et al., 2008). Ademais, a expressão de Ras no estágio inicial do desenvolvimento folicular parece alterar, drasticamente, o destino das CG, impedindo sua diferenciação, proliferação e apoptose, e prejudicando as respostas das CG às gonadotrofinas podendo culminar com alterações no desenvolvimento folicular, na diminuição da reserva ovariana e na falência ovariana precoce (Fan et al., 2008; Fan et al., 2023). Essa divergência sugere potente silenciamento epigenético de genes promotores específicos agindo na função das CG que pode estar relacionado com a presença de miRNAs específicos atuando nesse silenciamento. Deste modo, sugerimos que a correlação da via Ras com os miRNAs em VE do FF de mulheres inférteis por endometriose avançada pode indicar que o microambiente folicular esteja sofrendo danos resultante da ativação contínua de Ras desde o início do desenvolvimento 62 folicular. Esses achados corroboram com o fato de que portadoras d a doença demonstram alterações no ciclo celular, aumento da apoptose e modificações nos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento e crescimento das CG (Nakahara et al., 1998; Toya et al., 2000; Fan et al., 2008; Almeida et al., 2018). Curiosamente, todas as vias de sinalização se interligam, a via ErbB ativa a via MAPK, por meio da proteína Ras ( Holbro & Hynes, 2004; Orofiamma et al., 2022) , que gerando um ciclo de feedback positivo da via MAPK/Ras que, por sua vez, também ativa a transcrição de genes ErbB (Yarden & Sliwkowski, 2001). Um dos mecanismos em comum entre as vias ErbB, MAPK e Ras é a modulação da expressão gênica e da função proteica, a fim de regulação a produção de energia ( Zhang et al., 2009; Conti et al., 2012; Zhang et al., 2019), seja pela metabolização de carboidratos ( Hsu et al., 2015), glicose (Heiden & Cantley, 2009; Potter et al., 2016), aminoácidos (Tsuchihashi et al., 2016) e glutamina (Gao et al., 2009), pela oxidação de ácidos graxos e biossíntese de colest erol (Huang et al., 2020; Römer et al., 2021) ou pela síntese do fator induzido por hipóxia (HIF-1a), um fator de transcrição ativado durante a hipóxia (Déry et al., 2005; Peng et al., 2006; Lee et al., 2009). O oócito em si não é capaz de gerar energia (Sanchez-Lazo et al., 2014) e o desenvolvimento folicular demanda alto consumo de energia para a diferenciação das células somáticas, proliferação celular, reorganização das organelas citoplasmática , divisão nuclear, crescimento e aquisição de competência oocitária ( Hsu et al., 2015 ), as mitocôndrias têm um papel vital neste metabolismo de produção de energia, sob forma de ATP, através das células foliculares que circundam o oócito (Fan et al., 2023). Deste modo, a modulação da expressão gênica e da função proteica mediada pelos miRNAs exclusivos em mulheres inférteis por endometriose avançada e sua correlação com as vias ErbB, MAPK e Ras pode indicar uma maior necessidade de aporte energético frente ao estresse oxidativo folicular já evidenciado na doença (Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., 2009; Da Broi et al., 2014; Donabela et al., 2015; Da Broi et al., 201 6; Jianini et al., 2017; Da Broi et al., 2018a; Da Broi et al., 2019; Giorgi et al., 2021; Da Luz et al., 2021, Da Silva et al., 2021). Em resposta aos estressores oxidativos, as vias ErbB, MAPK e Ras podem interagir nas funções metabólicas mitocondriais, a fim de garantir energia. Um dos mecanismo de aumento energético é por meio da produção de ATP é proveniente da fosforilação oxidativa dos ácidos graxos presentes nas CG e CC com consequente liberação de elétrons (Römer et al., 2021 ; Christie, 202 4). Esse mecanismo molecular ocorre por meio de complexos da cadeia de respiração mitocondrial localizada na membrana interna da mitocôndria (Pitangui-Molina et al., 2017; Da Luz et al., 2021). As mitocôndrias do COC estão em um estado metabólico de baixa 63 atividade a fim de reduzir sua produção de espécies reativas de oxigênio. No entanto, o processo de maturação oocitária , em si, já modifica esse estado de quiescência exigindo aumento no número, acentuação da mobilidade e agrupamento mitocondrial em uma área específica do oócito (Chiaratti et al., 2018a; 2018b). Dados da literatura evidenciam que alterações no ciclo celular das CG (Toya et al., 2000) e na função mitocondrial das CG e CC (Hsu et al., 2015; Sanchez et al., 2016) estão relacionadas com o aumento da apoptose no microambiente folicular (Toya et al., 2000; Demirel et al., 2001; Sanchez et al., 2016) . Portadoras de endometriose apresentam atividade mitocondrial comprometida, redução da expressão de mtDNA nas CC (Hsu et al., 2015), despolarização do potencial da membrana mitocondrial das CG (Sanchez et al., 2016), aumento na expansão da biogênese mitocondrial (Puigserver et al., 1998), senescência das CG e CC (Dai et al., 2023), aumento na ingestão de glicose e geração de lactato pelas CG (Mao et al., 2022), anormalidades na biossíntese de hormônios esteroides e metabolismo lipídico (Dai et al., 2023), danos ao DNA, destruição do citoesqueleto de actina e alterações na membrana celular (Dai et al., 2023) que podem resultar em menor qualidade oocitária nessas mulheres e as torna infértil devido a endometriose. Por fim, a endometriose parece não afeta r diretamente o oócito, porém prejudica indiretamente o desenvolvimento folicular e a qualidade oocitária . A presença dos implantes ectópicos na cavidade peritoneal promove inflamação e estresse oxidativo crônicos que podem levar a fibrose ovariana, afetando o suprimento sanguíneo do ovário. Consequentemente, os folículos em crescimento não conseguem obter suporte nutricional suficiente e entram em estado de atresia (Fan et al., 2023). A inflamação e o estresse oxidativo presentes na cavidade peritoneal pode m atingir a circulação sistêmica e alterar o microambiente folicular que é altamente vascularizado (Fan et al., 2023), levando ao recrutamento de folículos primordiais que crescerão e se desenvolverão em um ambiente desfavorável resultante de perturbações no ciclo celular, inibição da apoptose das CG, inibição da síntese de esteroides pelas CG e alterações no metabolismo energético mitocondrial das células foliculares (Fan et al., 2023). O resultado é um ciclo vicioso que influencia na diminuição da reserva ovariana e no comprometimento da qualidade oocitária, frequentemente, observada nessas mulheres. Nosso estudo trouxe avanços no entendimento do papel das vesículas extracelulares em situações patológicas como a endometriose e contribuiu com inéditas descobertas dos processos biológicos e as vias de atuação associadas ao papel da endometriose na infert ilidade e seu impacto na aquisição de competência oocitária. 64 7 Conclusões A comparação entre o diâmetro e a quantidade de VE por ml obtidas do soro entre os grupos controle infértil sem endometriose e com endometriose avançada não evidenciou diferença significativa. Por outro lado, o diâmetro das VE do FF de mulheres inférteis por endometriose avançada foi significantemente maior do que no grupo controle, apesar de não ser observada diferença na quantidade de VE por ml do FF entre os grupos. Baseado nesses achados, hipotetizamos que o microambiente folicular de mulheres com endometriose avançada é estimulado a liberar VE com diâmetro aumentado, possivelmente devido ao estresse metabólico resultante do aumento local de fatores inflamatórios e oxidativos observado nessas mulheres. Ao compararmos o diâmetro e a quantidade de VE por ml intragrupos, observamos que, no grupo controle, não foi evidenciada diferença nestas variáveis entre o soro e o FF. Todavia, no grupo infértil com endometriose avançada, o diâmetro e a quantidade de VE por ml no FF foi maior que no soro. Sugerimos que o maior diâmetro dessas vesículas possa ser decorrente do acúmulo intravesicular de fatores estressores presentes no FF de ssas mulheres , os quais também podem induzir a liberação de maior quantidade de VE, na tentativa de combater esses fatores e reestabelecer o equilíbrio. Contudo, esses achados reforçam a importância de estudos futuros investigando o papel das VE do FF na qualidade oocitária de mulheres inférteis com endometriose avançada. Ao compararmos a expressão de 82 miRNAs extraídos de VE isoladas do FF de mulheres inférteis sem e com endometriose avançada, detectamos 73 miRNAs, sendo um exclusivo no grupo controle, treze exclusivos no grupo com endometriose avançada e 25 miRNAs presentes em ambos os grupos, mas diferencialmente expressos entre eles , dos quais 24 apresentaram expressão mais elevada no grupo infértil com endometriose avançada. Os miRNAs hiperexpressos ou exclusivos em VE isoladas do FF de mulheres inférteis com endometriose avançada estão relacionados a vias de adesão e regulação da reorganização do citoesqueleto de actina, assim como em vias de sinalização , incluindo ErbB, Ras, MAPK, Hippo, Rap1, cAMP e WNT , que estão relacionad as com desenvolvimento folicular e a aquisição de competência oocitária. Deste modo, sugerimos que a desregulação desses miRNAs possa estar comprometendo vias biológicas cruciais para o adequado desenvolvimento folicular e a aquisição de competência oocitária , agregando conhecimento inédito que auxilia no entendimento dos mecanismos relacionados ao comprometimento da qualidade gamética em portadoras de endometriose avançada. 65 Referencias Bibliográficas Abrão MS, Gonçalves MO, Dias JA Jr, Podgaec S, Chamie LP, Blasbalg R. Comparison between clinical examination, transvaginal sonography and magnetic resonance imaging for the diagnosis of deep endometriosis. Hum Reprod. 2007;22(12):3092-7. Adonaab, P.R; Monzaniab, P.S.; Guemraab, S.; Mirandac, M.S.; Ohashic, O.M. Oogenesis and Folliculogenesis in Mammals. UNOPAR Cient Ciênc Biol Saúde;15(3):245-50, 2013. Agarwal, A.; Gupta, S.; Sharma, R.K. Role of oxidative stress in female reproduction. Reproductive Biology and Endocrinology, v. 3, p. 28, 2005. 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Exp Cell Res 253: 157‑165, 1999. 83 ANEXOS ANEXO A Tabela 1 – Sequência de nucleotídeos dos microRNAs utilizados na análise de RT -PCR quantitativo. Sequência de nucleotídeos miRNA humano TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT CTAGACTGAAGCTCCTTGAGG TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT TGAGATGAAGCACTGTAGCTCG AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT TACAGTATAGATGATGTACTAG TGAGGTAGTAGATTGTATAGTT GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG TAGGTTATCCGTGTAGCCTTCG TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA TGAGAACTGAATTCCATAGGCTGT TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT TCACAGTGAACCGGTCTCTTT TAGCAGCACATCATGGTTTACA ACTCCATTTGTTTTGATGATGGA TCTCCCAACCCTTGTACCAGTGT CAGTGCAATGTTAAAAGGGCAT TAGCAGCACGTAAATATTGGC TCTACAGTGCACGTGTCTCCAGT CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT TAACACTGTCTGGTAAAGATGG TAAGGTGCATCTAGTGCAGATA AACATTCATTGTTGTCGGTGGGT TAGCTTATCAGACTGATGTTGACT CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG TAATACTGCCTGGTAATGATG AACTGGCCTACAAAGTCCCAGT AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTA TGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGA ACCTTGGCTCTAGACTGCTTACT TCGTGTCTTGTGTTGCAGCCGG ACAGCAGGCACAGACAGGCAGT TAGCAGCACAGAAATATTGGCA ATGACCTATGAATTGACAGACA TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGGA TTGTGCTTGATCTAACCATGTG ACAGTAGTCTGCACATTGGTTA GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG CCCAGTGTTCAGACTACCTGTT TTCAAGTAATTCAGGATAGGTT TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG AAGGAGCTCACAGTCTATTGAG TAACACTGTCTGGTAACGATGTT CTAGCACCATCTGAAATCGGTTA TGTAAACATCCTACACTCTCAGC hsa-let-7a-3p hsa-miR-151-3p hsa-let-7b/hsa-let-7b-5p hsa-miR-143-3p hsa-let-7d hsa-miR-144-5p hsa-let-7f hsa-miR-145/hsa-miR-145-5p hsa-miR-122 hsa-miR-154-5p hsa-miR-125b-5p hsa-miR-146b-3p hsa-miR-127-3p hsa-miR-155 hsa-miR-128a/hsa-miR-128-1-5p hsa-miR-15b-5p hsa-miR-136-3p hsa-miR-150-5p hsa-miR-130a hsa-miR-16b hsa-miR-139-3p hsa-miR-17-5p hsa-miR-141 hsa-miR-18a/hsa-miR-18a-5p hsa-miR-181d hsa-miR-21 hsa-miR-191 hsa-miR-200b hsa-miR-193a-3p hsa-miR-22 hsa-miR-185-5p hsa-miR-212 hsa-miR-187 hsa-miR-214 hsa-miR-195 hsa-miR-215-5p hsa-miR-196b-5p hsa-miR-218-1 hsa-miR-199a-3p hsa-miR-3074-5p hsa-miR-206 hsa-miR-3074-5p hsa-miR-199a-5p hsa-miR-26b-5p hsa-miR-20a/hsa-miR-20a-5p hsa-miR-28-5p hsa-miR-200a hsa-miR-129a hsa-miR-30c-5p 84 ATCGGGAATGTCGTGTCCGCCC GCAAAGCACACGGCCTGCAGAGA ATGACACGATCACTCCCGTTGA AGGCAAGATGCTGGCATAGCT AAACCGTTACCATTACTGAGTTT TATTGCACATGACTAAGTTGCAT AGGTTGTCCGTGGTGAGTTCGCA AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA TAATCCTTGCTACCTGGGTGAGA GTGCATTGTAGTTGCATTGCA TTGAAAGGCTGTTTCTTGGTC TCTCACACAGAAATCGCACCCATCT GTGACATCACATATATGGCGAC AATCCTTGGAACCTAGGTGTGAGT CAACCTGGAGGACTCCATGCTG ACTGGACTTGGAGTCAGAAGGC AGACCCTGGTCTGCACTCTGTC AAGCTCGGTCTGAGGCCCCTCAGT GGAGAAATTATCCTTGGTGTGT CAAAACGTGAGGCGCTGCTAT TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG CAGCAGCAATTCATGTTTTGA CACCCGTAGAACCGACCTTGCG TCGGGGATCATCATGTCACGAG ATGCTGACATATTTACTAGAGG TGAGTGTGTGTGTGTGAGTGTGTG AAGGAGCTTACAATCTAGCTGGG GTAGAGGAGATGGCGCAGGG TCCATTACACTACCCTGCCTCT ATAAAGCTAGATAACCG TCTTTGGTTATCTAGCTGTATG TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT CTTGGCACCTAGTAAGTACTCA hsa-miR-425 hsa-miR-330-5p hsa-miR-425 hsa-miR-31 hsa-miR-451a hsa-miR-32-3p hsa-miR-323b-5p hsa-miR-320a hsa-miR-500a-3p hsa-miR-33a-5p hsa-miR-488 hsa-miR-342-3p hsa-miR-489 hsa-miR-362-5p hsa-miR-490-5p hsa-miR-378/hsa-miR-378a-3p hsa-miR-504 hsa-miR-423-3p hsa-miR-539-5p hsa-miR-424-3p hsa-miR-122 hsa-miR-424-5p hsa-miR-99b-5p hsa-miR-542-5p hsa-miR-628-3p hsa-miR-574-3p hsa-miR-708 hsa-miR-877-5p hsa-miR-885-3p hsa-miR-9-3p hsa-miR-9-5p hsa-miR-92a hsa-miR-1271-5p 85 ANEXO B 1. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE

BIOLÓGICO (Grupo Controle Infértil sem Endometriose). TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE

BIOLÓGICO (Grupo Controle Infértil sem Endometriose) 1. NOME DA PESQUISA: “Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do fluido folicular de pacientes com endometriose submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro”. 2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Profa. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro. 3. INFORMAÇÕES À PARTICIPANTE DA PESQUISA Você está sendo convidada a participar voluntariamente da pesquisa intitulada “Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do fluido folicular de pacientes com endometriose submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro ”. Antes de decidir participar deste estudo, é importante que você leia e compreenda os procedimentos envolvidos. Este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e para a Guarda de

Biológico descreve o motivo, os procedimentos e os potenciais benefícios e desconfortos/riscos desta pesquisa. Por favor, sinta -se à vontade para fazer quantas perguntas quiser. É necessário ler e assinar este termo de consentimento antes que você possa participar. Sua decisão de participar ou não participar neste estudo não terá qualquer interferência sobre o seu tratamento para engravidar. A endometriose é uma doença caracterizada pela presença do endométrio (tecido que reveste o interior do útero) fora da cavidade uterina e uma causa bastante comum de dificuldade para engravidar (denominada infertilidade, que é a não ocorrência de gravidez após 12 meses de atividade sexual regular sem uso de métodos para evitar a gestação). Nas mulheres inférteis com endometriose, questiona-se se um dos motivos responsáveis por essa maior dificuldade em engravidar seja a inadequada qualidade dos óvulos (oóc itos), que poderão produzir embriões também de má qualidade, impossibilitando a gestação. Dentro do ovário, o óvulo é rodeado por camadas de células, chamadas células do cumulus, e está mergulhado em um líquido chamado fluido folicular. Juntos, esses compo nentes formam o folículo ovariano e permitem o desenvolvimento do óvulo até que ele possa ser fertilizado pelo espermatozoide. Algumas evidências sugerem que modificações nas chamadas vesículas extracelulares, que são pequenas estruturas presentes no sangue e no fluido folicular, formadas por uma camada dupla composta de lipídeos e proteínas, e repletas de moléculas em seu interior. Essas vesículas extracelulares permitem a troca de diversos componentes entre células, ajudando na comunicação celular e agindo na regulação de eventos fisiológicos em resposta a condições ambientais específicas, e podem estar envolvidas em processos normais ou patológicos. Um dos componentes encontrados dentro destas vesículas extracelulares são os miRNAs (microRNAs), que são 86 pequenos RNAs (ácidos ribonucl éicos), conservados ao longo da evolução, que agem como potentes reguladores pós -transcricionais da expressão gênica. Alterações na expressão dos miRNAs podem causar danos aos óvulos, prejudicar a sua qualidade e levar à redução das chances de gravidez mesmo quando se realizam procedimentos de fertilização assistida (obtenção e fertilização dos óvulos no laboratório utilizando os espermatozoides do parceiro, seguido pela colocação do embrião dentro da cavidade uterina). Para saber se realmente existem danos nos óvulos, seria importante analisar os componentes do folículo ovariano e o sangue de mulheres com endometriose e comparar com os de mulheres sem endometriose. Quando é realizada a captação oocitária (procedimento do tratamento de reprodução assistida em que são coletados os óvulos), junto com os óvulos é aspirado o fluido folicular (que é o líquido no qual os óvulos estão mergulhados e não tem uso no tratamento da paciente, sendo descartado). Essa amostra que é descartada ( fluido folicular), juntamente com a amostra de sangue (coletada durante a anestesia feita para o procedimento de captação oocitária) serão utilizadas para se avaliar se existem danos nos folículos de mulheres com e sem a doença. 4. POR QUE VOCÊ ESTÁ SENDO CONVIDADA A PARTICIPAR? A senhora está sendo convidada a participar deste estudo na posição de participante da pesquisa do grupo controle infértil sem endometriose, pois para saber se o perfil de miRNAs de microvesículas do fluido folicular e do sangue de mulheres com endometriose estão alterados, precisamos compará-los com amostras de um grupo chamado de controle, ou seja, que não tem endometriose, onde você estaria incluída. Sua colaboração, portanto, no fornecimento das amostras será fundamental para um melhor conhecimento dos mecanismos envolvidos em casos de infertilidade sem endometriose. Esses dados também serão fundamentais para um melhor entendimento da qualidade do óvulo, e se, quando alterados, podem contribuir para menores chances de gestação em mulheres inférteis com endometriose, o que ajudaria na identificação de tratamentos futuros. 5. OBJETIVO DO ESTUDO Como não há na literatura nenhuma análise direta da concentração e do tamanho das vesículas extracelulares, assim como do conteúdo de miRNAs das vesículas extracelulares presentes no soro e fluido folicular humano de mulheres inférteis com endometriose, o objetivo desse estudo é isolar e caracterizar vesículas extracelulares e avaliar o perfil de 82 miRNAs maduros e precursores carregados por vesículas extracelulares no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e com infertilidade por f ator tubário e/ou masculino submetidas à estimulação ovariana controlada para realização de fertilização in vitro. 6. O QUE ENVOLVE A SUA PARTICIPAÇÃO? Para estudarmos as alterações moleculares de mulheres inférteis com endometriose e compará- los com o que ocorre em mulheres inférteis sem a doença coletaremos uma amostra de sangue no dia da captação dos óvulos, antes da anestesia geral. Durante a aspiração folicular (aspiração dos óvulos realizada através de um aparelho de ultrassom, em que se é acoplada uma agulha que será guiada até o ovário para que seja aspirado seu conteúdo), junto com os óvulos também vem o líquido aonde os óvulos se desenvolvem (flu ido folicular). Esse componente é normalmente descartado, não tendo utilidade no procedimento de reprodução assistida, de modo que solicitamos para que seja concedido para a presente pesquisa. A concessão dessa amostra para este estudo não prejudicará o se u tratamento, nem promoverá intervenções complementares às da rotina assistencial. Para este estudo não será realizado nenhum procedimento adicional além daquele que você já vai realizar para fazer o tratamento de reprodução assistida. A única diferença é que o material que seria descartado será concedido para esta pesquisa. Devemos, portanto, ressaltar que este estudo não irá interferir em seu 87 tratamento para engravidar, assim como não causará prejuízo nenhum para sua saúde, nem para a do futuro bebê. 7. POSSÍVEIS BENEFÍCIOS A sua participação neste estudo não implica em benefícios diretos para você. Caso haja benefícios oriundos da sua participação, eles serão indiretos, ou seja, poderão contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos relacionados a pior qualidade do óvu lo em mulheres inférteis com endometriose e, talvez, no futuro poderão ser usados no sentido de auxiliar na elaboração de novos tratamentos para a infertilidade associada à endometriose. 8. POSSÍVEIS DESCONFORTOS E RISCOS: Para conceder uma amostra de sangue serão coletados 20mL de sangue utilizando a punção venosa realizada pelo anestesista para a realização da sedação endovenosa para a aspiração dos folículos. Pode haver discreto dolorimento local e formação de hematoma, mas estes possíveis desconfortos podem ocorrer pela punção, que será realizada como rotina assistencial. Para conceder amostra de fluido folicular não haverá qualquer desconforto adicional ao do procedimento, realizado como parte da rotina assistencial para obtenção dos óvulos para o seu tratamento. 9. O QUE ACONTECE SE VOCÊ NÃO QUISER PARTICIPAR? Sua participação neste estudo é totalmente voluntária. Se você decidir não participar, não haverá penalidade, perda de benefícios ou redução na qualidade dos cuidados médicos. 10. E SE VOCÊ QUISER SAIR DO ESTUDO APÓS TER ACEITADO PARTICIPAR? Você tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Caso você deseje retirar o seu consentimento, favor notificar as investigadoras, através do número de telefone listado no item 14 deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para a Guarda de Material Biológico. 11. SIGILO E DIVULGAÇÃO DE INFORMAÇÕES PESSOAIS Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes das integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. 12. CUSTOS E REMUNERAÇÃO É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Você não terá que pagar para participar deste estudo e nem será paga por sua participação. Você também não terá que pagar por nenhum procedimento que será real izado neste estudo, uma vez que as amostras serão coletadas exclusivamente nos dias que você terá retorno no serviço por indicação médica. Todavia, se houver necessidade de comparecer ao serviço, exclusivamente para a pesquisa, para fins de esclarecimento ou outra demanda relacionada, você e seu acompanhante terão direito ao ressarcimento dos gastos decorrentes de sua participação, como por exemplo gastos com transporte e alimentação. 13. NO CASO DE DANO RELACIONADO À PESQUISA A Resolução CNS N° 466 de 2012 define como dano associado (ou decorrente) da pesquisa o “agravo imediato ou posterior, direto ou indireto, ao indivíduo ou à coletividade, decorrente da pesquisa” (item II.6). Caso você sofra algum dano supostamente relacion ado a esta pesquisa, você tem o direito de buscar indenização, assim como direito à assistência integral imediata, de forma gratuita, pelo tempo que for necessário providenciada pelas pesquisadoras e pelo 88 HC/FMRP-USP/SP como estabelecido dentro do padrão internacional de boas práticas clínicas e resolução vigente no Brasil. 14. CONTATO PARA MAIS INFORMAÇÕES As pesquisadoras estarão disponíveis para responder a quaisquer perguntas que você possa ter em relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante a investigação da causa da infertilidade ou do seu tratamento para engravidar. Se você tiver alguma dú vida sobre esta pesquisa, você pode entrar em contato com uma das pesquisadoras principais (Profa. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro, Dr a Michele Gomes da Broi e Mayra Beraldo Andozia) pelos telefones (16) 3602 -2816 e/ou (16) 3602 -2815 ou procurá -las diretamente no setor de Reprodução Humana do HC -FMRP-USP, sito à avenida Bandeirantes, 3900, Campus Universitário da USP, 1º andar, Ribeirão Preto, SP, de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min às 16hrs00min. Caso ocorra alguma emergência poderá entrar em co ntato pelo telefone (16) 99179-5680 disponível 24 horas. Se você tem alguma dúvida sobre seus direitos como participante da pesquisa ou em caso de julgamento relacionado com uma lesão, entre em contato com o médico do estudo ou o seu médico de confiança. Caso você queira falar com alguém não diretamente envolvido neste estudo sobre os seus direitos, preocupações, danos relacionados à pesquisa, você pode se comunicar com o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribei rão Preto da Universidade de São Paulo no Campus Universitário, S/N, Monte Alegre, Prédio Central, Subsolo - 14048-900 – Ribeirão Preto/SP, em (16) 3602-2228 com horário de funcionamento de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min às 17hrs00min. Você também poderá entrar em contato, caso se sentir coagida para aceitar ou continuar a participar da pesquisa. 15. INFORMAÇÕES ADICIONAIS Este estudo encontra-se registrado no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e na Comissão Nacional de Ética em Pesquisa. Comitê de Ética em Pesquisa (CEP ) é um colegiado que deve existir nas instituições que realizam pesquisa envolvendo seres humanos no Brasil, criado para defender os interesses dos participantes da pesquisa em sua integridade e dignidade e para contribuir no desenvolvimento da pesquisa dent ro de padrões éticos (Resolução nº 466/12 Conselho Nacional de Saúde). 16. BIORREPOSITÓRIO Biorrepositório é o armazenamento de material biológico para uso em curto prazo. Esta pesquisa está vinculada ao biorrepositório de sangue e fluido folicular para avaliação de características moleculares (tamanho, concentração e conteúdo de miRNAs das vesí culas extracelulares) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP com o objetivo de guardar amostras de sangue e fluido folicular para o melhor compreendimento da infertilidade por endometriose. Gostaríamos de convidá -la a autor izar a coleta, o depósito, o armazenamento e a utilização dos materiais biológicos humano acima discriminados para fins de pesquisa e análise científica. Será coletado 20 ml de sangue por punção venosa e amostras de fluido folicular por aspiração folicular no dia da aspiração de folículos durante o seu tratamento de Reprodução Assistida. Após coletadas, as amostras serão processadas, congeladas e armazenadas em Biorrepositório localizado no Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP até que o material esteja completo para ser analisado. As pesquisadoras responsáveis pela equipe se comprometem a identificar as amostras e os dados coletados por meio do número de prontuário, de modo que garan ta o seu sigilo e a sua confidencialidade. Após a conclusão do estudo, qualquer material remanescente será destruído de acordo com as boas práticas clínicas. Sua 89 participação é voluntária, tendo liberdade de aceitar ou não que a sua amostra seja guardada, sem risco de qualquer penalização ou prejuízo no atendimento e tratamento que está recebendo. A Sra. também tem o direito de retirar seu consentimento de guarda e utilização do sangue e fluido folicular armazenados a qualquer momento. Solicitamos também os seus dados de contato para possa ser encontrada posteriormente. 17. ASSINALE AS AMOSTRAS QUE DESEJA CONCEDER: ( ) Sangue ( ) Fluido Folicular 18. CONSENTIMENTO Ao assinalar as amostras, assinar e datar este termo, você irá confirmar que foi suficiente informada sobre a natureza e a finalidade deste estudo. Confirma também que foi capaz de discutir dúvidas em detalhes com a pesquisadora, e que estas, foram completamente e satisfatoriamente respondidas. Este termo consta em duas vias. Você receberá uma via datada e assinada e a outra via ficará com a pesquisadora. _____________________________________ __________________ ___________ Nome da participante da pesquisa Assinatura Data ____________________________________ ____________________ ___________ Nome da pesquisadora Assinatura Data _____________________________________ ____________________ ___________ Nome do(a) responsável pela coleta Assinatura Data 90 2. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE

BIOLÓGICO (Grupo Endometriose composto por mulheres inférteis com endometriose Avançada). TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE

BIOLÓGICO (Grupo Infértil com Endometriose) 1. NOME DA PESQUISA: “Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do fluido folicular de pacientes com endometriose submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro”. 2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Profa. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro. 3. INFORMAÇÕES À PARTICIPANTE DA PESQUISA Você está sendo convidada a participar voluntariamente da pesquisa intitulada “Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do fluido folicular de pacientes com endometriose submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro”. Ant es de decidir participar deste estudo, é importante que você leia e compreenda os procedimentos envolvidos. Este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e para a Guarda de

Biológico descreve o motivo, os procedimentos e os potenciais ben efícios e desconfortos/riscos desta pesquisa. Por favor, sinta -se à vontade para fazer quantas perguntas quiser. É necessário ler e assinar este termo de consentimento antes que você possa participar. Sua decisão de participar ou não participar neste estudo não terá qualquer interferência sobre o seu tratamento para engravidar. A endometriose é uma doença caracterizada pela presença do endométrio (tecido que reveste o interior do útero) fora da cavidade uterina e é uma causa bastante comum de dificuldade para engravidar (denominada infertilidade, que é a não ocorrência de gravidez após 12 meses de atividade sexual regular sem uso de métodos para evitar a gestação). Nas mulheres inférteis com endometriose, questiona -se se um dos motivos responsáveis por essa maior dificuldade em engravidar é a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade, impossibilitando a gestação. Dentro do ovário, o óvulo é rodeado por camadas de células, chamadas células do cumulus, e está mergulhado em um líquido chamado fluido folicular. Juntos, esses compon entes formam o folículo ovariano e permitem o desenvolvimento do óvulo até que ele possa ser fertilizado pelo espermatozoide. Algumas evidências sugerem que na presença da endometriose possa haver modificações nas chamadas vesículas extracelulares, que são pequenas estruturas presentes no sangue e no fluido folicular, formadas por uma camada dupla composta de lipídeos e proteínas, e repletas de moléculas em seu interior. Essas vesículas extracelulares permitem a troca de diversos componentes entre células, ajudando na comunicação celular e agindo na regulação de eventos fisiológicos em resposta a condições ambientais específicas, e podem estar envolvidas em 91 processos normais ou patológicos. Um dos componentes encontrados dentro destas vesículas extracelulares são os miRNAs (microRNAs), que são pequenos RNAs (ácidos ribonucléicos), conservados ao longo da evolução, que agem como potentes reguladores pós-transcricionais da expressão gênica. Alterações na expressão dos miRNAs podem causar danos aos óvulos, prejudicar a sua qualidade e levar à redução das chances de gravidez mesmo quando se realizam procedimentos de fertilização assistida (obtenção e fertilização dos óvulos no laboratório utilizando os espermatozoides do parceiro, seguido pela colocação do embrião dentro da cavidade uterina). Para saber se realmente existem danos nos óvulos, seria importante analisar os componentes do folículo ovariano e o sangue d e mulheres com endometriose e comparar com os de mulheres sem endometriose. Quando é realizada a captação oocitária (procedimento do tratamento de reprodução assistida em que são coletados os óvulos), junto com os óvulos é aspirado o fluido folicular (que é o líquido no qual os óvulos estão mergulhados e não tem uso no tratamento da paciente, sendo descartado). Essa amostra que é descartada (fluido folicular), juntamente com a amostra de sangue (coletada durante a anestesia feita para o procedimento de captação oocitária) serão utilizadas para se avaliar se existem danos nos folículos de mulheres com e sem a doença. 4. POR QUE VOCÊ ESTÁ SENDO CONVIDADA A PARTICIPAR? A senhora está sendo convidada a participar deste estudo na posição de participante da pesquisa do grupo endometriose, para saber se o perfil de miRNAs de microvesículas do fluido folicular e do sangue de mulheres com endometriose são alterados em relação aos de mulheres sem a doença. Sua colaboração, portanto, no fornecimento das amostras será fundamental para um melhor conhecimento dos mecanismos envolvidos em casos de infertilidade com endometriose. Esses dados também serão fundamentais para um melhor entendimento da qualidade do óvulo, e se, quando alterados, podem contribuir para menores chances de gestação em mulheres inférteis com endometriose, o que ajudaria na identificação de tratamentos futuros. 5. OBJETIVO DO ESTUDO Como não há na literatura nenhuma análise direta da concentração e do tamanho das vesículas extracelulares, assim como do conteúdo de miRNAs das vesículas extracelulares presentes no soro e fluido folicular humano de mulheres inférteis com endometriose, o objetivo desse estudo é isolar e caracterizar vesículas extracelulares e avaliar o perfil de 82 miRNAs maduros e precursores carregados por vesículas extracelulares no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e com infertilidade por f ator tubário e/ou masculino submetidas à estimulação ovariana controlada para realização de fertilização in vitro. 6. O QUE ENVOLVE A SUA PARTICIPAÇÃO? Para estudarmos as alterações moleculares de mulheres inférteis com endometriose e compará- los com o que ocorre em mulheres inférteis sem a doença coletaremos uma amostra de sangue no dia da captação dos óvulos, antes da anestesia geral. Durante a aspiração folicular (aspiração dos óvulos realizada através de um aparelho de ultrassom, em que se é acoplada uma agulha que será guiada até o ovário para que seja aspirado seu conteúdo), junto com os óvulos também vem o líquido aonde os óvulos se desenvolvem (flu ido folicular). Esse componente é normalmente descartado, não tendo utilidade no procedimento de reprodução assistida, de modo que solicitamos para que seja concedido para a presente pesquisa. A concessão dessa amostra para este estudo não prejudicará o se u tratamento, nem promoverá intervenções complementares às da rotina assistencial. Para este estudo não será realizado nenhum procedimento adicional além daquele que você já vai realizar para fazer o tratamento de reprodução assistida. A única diferença é que o material que seria descartado será concedido para esta pesquisa. Devemos, portanto, ressaltar que este estudo não irá interferir em seu 92 tratamento para engravidar, assim como não causará prejuízo nenhum para sua saúde, nem para a do futuro bebê. 7. POSSÍVEIS BENEFÍCIOS A sua participação neste estudo não implica em benefícios diretos para você. Caso haja benefícios oriundos da sua participação, eles serão indiretos, ou seja, poderão contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos relacionados a pior qualidade do óvu lo em mulheres inférteis com endometriose e, talvez, no futuro poderão ser usados no sentido de auxiliar na elaboração de novos tratamentos para a infertilidade associada à endometriose. 8. POSSÍVEIS DESCONFORTOS E RISCOS: Para conceder uma amostra de sangue serão coletados 20mL de sangue utilizando a punção venosa realizada pelo anestesista para a realização da sedação endovenosa para a aspiração dos folículos. Pode haver discreto dolorimento local e formação de hematoma, mas estes possíveis desconfortos podem ocorrer pela punção, que será realizada como rotina assistencial. Para conceder amostra de fluido folicular não haverá qualquer desconforto adicional ao do procedimento, realizado como parte da rotina assistencial para obtenção dos óvulos para o seu tratamento. 9. O QUE ACONTECE SE VOCÊ NÃO QUISER PARTICIPAR? Sua participação neste estudo é totalmente voluntária. Se você decidir não participar, não haverá penalidade, perda de benefícios ou redução na qualidade dos cuidados médicos. 10. E SE VOCÊ QUISER SAIR DO ESTUDO APÓS TER ACEITADO PARTICIPAR? Você tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Caso você deseje retirar o seu consentimento, favor notificar as investigadoras, através do número de telefone listado no item 14 deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para a Guarda de Material Biológico. 11. SIGILO E DIVULGAÇÃO DE INFORMAÇÕES PESSOAIS Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes das integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. 12. CUSTOS E REMUNERAÇÃO É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Você não terá que pagar para participar deste estudo e nem será paga por sua participação. Você também não terá que pagar por nenhum procedimento que será real izado neste estudo, uma vez que as amostras serão coletadas exclusivamente nos dias que você terá retorno no serviço por indicação médica. Todavia, se houver necessidade de comparecer ao serviço, exclusivamente para a pesquisa, para fins de esclarecimento ou outra demanda relacionada, você e seu acompanhante terão direito ao ressarcimento dos gastos decorrentes de sua participação, como por exemplo gastos com transporte e alimentação. 13. NO CASO DE DANO RELACIONADO À PESQUISA A Resolução CNS N° 466 de 2012 define como dano associado (ou decorrente) da pesquisa o “agravo imediato ou posterior, direto ou indireto, ao indivíduo ou à coletividade, decorrente da pesquisa” (item II.6). Caso você sofra algum dano supostamente relacion ado a esta pesquisa, você tem o direito de buscar indenização, assim como direito à assistência integral imediata, de 93 forma gratuita, pelo tempo que for necessário providenciada pelas pesquisadoras e pelo HC/FMRP-USP/SP como estabelecido dentro do padrão internacional de boas práticas clínicas e resolução vigente no Brasil. 14. CONTATO PARA MAIS INFORMAÇÕES As pesquisadoras estarão disponíveis para responder a quaisquer perguntas que você possa ter em relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante a investigação da causa da infertilidade ou do seu tratamento para engravidar. Se você tiver alguma dú vida sobre esta pesquisa, você pode entrar em contato com uma das pesquisadoras principais (Profa. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro, Dra Michele Gomes da Broi e Mayra Beraldo Andozia) pelos telefones (16) 3602 -2816 e/ou (16) 3602 -2815 ou procurá -las diretamente no setor de Reprodução Humana do HC -FMRP-USP, sito à avenida Bandeirantes, 3900, Campus Universitário da USP, 1º andar, Ribeirão Preto, SP, de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min às 16hrs00min. Caso ocorra alguma emergência poderá entrar em co ntato pelo telefone (16) 99179-5680 disponível 24 horas. Se você tem alguma dúvida sobre seus direitos como participante da pesquisa ou em caso de julgamento relacionado com uma lesão, entre em contato com o médico do estudo ou o seu médico de confiança. Caso você queira falar com alguém não diretamente envolvido neste estudo sobre os seus direitos, preocupações, danos relacionados à pesquisa, você pode se comunicar com o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribei rão Preto da Universidade de São Paulo no Campus Universitário, S/N, Monte Alegre, Prédio Central, Subsolo - 14048-900 – Ribeirão Preto/SP, em (16) 3602-2228 com horário de funcionamento de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min às 17hrs00min. Você também poderá entrar em contato, caso se sentir coagida para aceitar ou continuar a participar da pesquisa. 15. INFORMAÇÕES ADICIONAIS Este estudo encontra-se registrado no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e na Comissão Nacional de Ética em Pesquisa. Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) é um colegiado que deve existir nas instituições que realizam pesquisa envolvendo seres humanos no Brasil, criado para defender os interesses dos participantes da pesquisa em sua integridade e dignidade e para contribuir no desenvolvimento da pesquisa dentro de padrões éticos (Resolução nº 466/12 Conselho Nacional de Saúde). 16. BIORREPOSITÓRIO Biorrepositório é o armazenamento de material biológico para uso em curto prazo. Esta pesquisa está vinculada ao biorrepositório de sangue e fluido folicular para avaliação de características moleculares (tamanho, concentração e conteúdo de miRNAs das vesí culas extracelulares) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP com o objetivo de guardar amostras de sangue e fluido folicular para o melhor compreendimento da infertilidade por endometriose. Gostaríamos de convidá -la a autor izar a coleta, o depósito, o armazenamento e a utilização dos materiais biológicos humano acima discriminados para fins de pesquisa e análise científica. Será coletado 20 ml de sangue por punção venosa e amostras de fluido folicular por aspiração folicular no dia da aspiração de folículos durante o seu tratamento de Reprodução Assistida. Após coletadas, as amostras serão processadas, congeladas e armazenadas em Biorrepositório localizado no Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP até que o material esteja completo para ser analisado. As pesquisadoras responsáveis pela equipe se comprometem a identificar as amostras e os dados coletados por meio do número de prontuário, de modo que garan ta o seu sigilo e a sua confidencialidade. Após a conclusão do estudo, 94 qualquer material remanescente será destruído de acordo com as boas práticas clínicas. Sua participação é voluntária, tendo liberdade de aceitar ou não que a sua amostra seja guardada, sem risco de qualquer penalização ou prejuízo no atendimento e tratamento que está recebendo. A Sra. também tem o direito de retirar seu consentimento de guarda e utilização do sangue e fluido folicular armazenados a qualquer momento. Solicitamos também os seus dados de contato para possa ser encontrada posteriormente. 17. ASSINALE AS AMOSTRAS QUE DESEJA CONCEDER: ( ) Sangue ( ) Fluido Folicular 18. CONSENTIMENTO Ao assinalar as amostras, assinar e datar este termo, você irá confirmar que foi suficiente informada sobre a natureza e a finalidade deste estudo. Confirma também que foi capaz de discutir dúvidas em detalhes com a pesquisadora, e que estas, foram complet amente e satisfatoriamente respondidas. Este termo consta em duas vias. Você receberá uma via datada e assinada e a outra via ficará com a pesquisadora. _____________________________________ __________________ ___________ Nome da participante da pesquisa Assinatura Data ____________________________________ ____________________ ___________ Nome da pesquisadora Assinatura Data _____________________________________ ____________________ ___________ Nome do(a) responsável pela coleta Assinatura Data 95 ANEXO C Tabela 1 – Vias preditas de serem reguladas pelo microRNA que foi exclusivo nas Vesículas Extracelulares obtidas do fluido olicular do grupo Controle Vias preditas de serem reguladas pelo miR-155-5p exclusivo do grupo controle KEGG pathway Genes(n) miRNA(n) miRNA p-value Pathways in cancer 39 1 hsa-miR-155-5p 1.7082821001798e-08 Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells 18 1 hsa-miR-155-5p 1.46653958316825e-07 Breast cancer 17 1 hsa-miR-155-5p 1.39200098334898e-06 Gastric cancer 17 1 hsa-miR-155-5p 1.27670540244495e-06 Prolactin signaling pathway 11 1 hsa-miR-155-5p 3.04860812905044e-06 Colorectal cancer 12 1 hsa-miR-155-5p 3.19524553427849e-06 MAPK signaling pathway 24 1 hsa-miR-155-5p 6.4569646849647e-06 T cell receptor signaling pathway 13 1 hsa-miR-155-5p 1.03619549987702e-05 Acute myeloid leukemia 10 1 hsa-miR-155-5p 1.23548219893408e-05 Hepatocellular carcinoma 16 1 hsa-miR-155-5p 1.80714184538805e-05 Longevity regulating pathway 12 1 hsa-miR-155-5p 2.03740713124604e-05 Hedgehog signaling pathway 9 1 hsa-miR-155-5p 2.21892728827181e-05 Neurotrophin signaling pathway 13 1 hsa-miR-155-5p 2.35449069568732e-05 Rap1 signaling pathway 17 1 hsa-miR-155-5p 5.25965426483445e-05 PI3K-Akt signaling pathway 24 1 hsa-miR-155-5p 4.91944244993311e-05 mTOR signaling pathway 15 1 hsa-miR-155-5p 7.00785200446317e-05 TGF-beta signaling pathway 11 1 hsa-miR-155-5p 8.47733291408408e-05 Renal cell carcinoma 9 1 hsa-miR-155-5p 8.90950126723118e-05 cAMP signaling pathway 17 1 hsa-miR-155-5p 0.000103728587314935 AMPK signaling pathway 12 1 hsa-miR-155-5p 0.000167519667740704 Endometrial cancer 8 1 hsa-miR-155-5p 0.000191210468245777 Insulin signaling pathway 13 1 hsa-miR-155-5p 0.000207837942930446 Ras signaling pathway 17 1 hsa-miR-155-5p 0.000225612560296029 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance 9 1 hsa-miR-155-5p 0.000304570150211147 Prostate cancer 10 1 hsa-miR-155-5p 0.000332208817362951 B cell receptor signaling pathway 11 1 hsa-miR-155-5p 0.000356820163790912 Autophagy - animal 12 1 hsa-miR-155-5p 0.000492272523933608 Hepatitis C 13 1 hsa-miR-155-5p 0.000683547022611071 Hepatitis B 13 1 hsa-miR-155-5p 0.000846857057981338 Endocrine resistance 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00113777747916423 Osteoclast differentiation 13 1 hsa-miR-155-5p 0.00115252279949868 Relaxin signaling pathway 11 1 hsa-miR-155-5p 0.00108318361237378 Pancreatic cancer 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00103390169896483 Chronic myeloid leukemia 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00112457460316882 Ubiquitin mediated proteolysis 11 1 hsa-miR-155-5p 0.00136789954307524 96 Hippo signaling pathway 12 1 hsa-miR-155-5p 0.00137565509346418 Basal cell carcinoma 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00174297636041243 ErbB signaling pathway 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00195151282183209 Choline metabolism in cancer 9 1 hsa-miR-155-5p 0.00196868329609854 Proteoglycans in cancer 14 1 hsa-miR-155-5p 0.00215175965236356 Growth hormone synthesis, secretion and action 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00222827388098867 TNF signaling pathway 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00249593820097659 Regulation of actin cytoskeleton 14 1 hsa-miR-155-5p 0.00254107337242014 Amphetamine addiction 7 1 hsa-miR-155-5p 0.0033679300250272 Transcriptional misregulation in cancer 13 1 hsa-miR-155-5p 0.00329930995350718 FoxO signaling pathway 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00383565080517514 Mitophagy - animal 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00391290419299402 Melanoma 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00391290419299402 Parathyroid hormone synthesis, secretion and action 9 1 hsa-miR-155-5p 0.00407602898024067 Longevity regulating pathway - multiple species 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00485268105795882 Shigellosis 15 1 hsa-miR-155-5p 0.00512983324934412 PD-L1 expression and PD -1 checkpoint pathway in cancer 8 1 hsa-miR-155-5p 0.0052962132881104 Cellular senescence 13 1 hsa-miR-155-5p 0.0055281064796357 Insulin resistance 9 1 hsa-miR-155-5p 0.00564293040241742 Yersinia infection 10 1 hsa-miR-155-5p 0.0056908791289624 Fluid shear stress and atherosclerosis 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00624933730836738 IL-17 signaling pathway 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00706175852352549 Cushing syndrome 11 1 hsa-miR-155-5p 0.00715034497313553 97 Tabela 2 – Vias preditas de serem reguladas pelos microRNAs exclusivos nas Vesículas Extracelulares obtidas do fluido folicular do grupo endometriose. Vias preditas de serem reguladas pelos miRNAs exclusivos do grupo endometriose KEEG pathway Genes(n) miRNAs(n) miRNAs P-value Axon guidance 186 8 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 9.4378E-43 Pathways in cancer 555 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271- 5p 3.34994E-36 Focal adhesion 213 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271- 5p 5.88356E-33 ErbB signaling pathway 86 8 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 1.98927E-30 Proteoglycans in cancer 220 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 4.48216E-29 Ras signaling pathway 241 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-196b-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR- 1271-5p 4.024E-26 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance 82 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271- 5p 1.06088E-25 Gastric cancer 162 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p 2.45645E-24 Regulation of actin cytoskeleton 224 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 7.59839E-24 PI3K-Akt signaling pathway 372 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 1.39805E-23 Hepatocellular carcinoma 177 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p 1.61794E-23 MAPK signaling pathway 329 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 1271-5p 7.05733E-23 Neurotrophin signaling pathway 124 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 1.05882E-22 Prostate cancer 101 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 5.64496E-22 FoxO signaling pathway 139 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR- 1271-5p 6.12314E-22 98 Breast cancer 163 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p 9.26413E-22 Chronic myeloid leukemia 79 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271- 5p 1.74639E-20 Prolactin signaling pathway 73 8 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 3.80908E-20 Growth hormone synthesis, secretion and action 129 6 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 4.70448E-20 Rap1 signaling pathway 214 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 2.09964E-19 Wnt signaling pathway 173 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p 2.53497E-19 Glioma 79 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271- 5p 5.46939E-19 Autophagy - animal 146 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-628-5p,hsa-miR-1271-5p 6.5557E-19 Renal cell carcinoma 70 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 1271-5p 1.19314E-18 Hippo signaling pathway 164 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p 2.17882E-18 Pancreatic cancer 78 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p 2.4184E-17 Phospholipase D signaling pathway 158 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR- 1271-5p 1.61262E-16 Colorectal cancer 88 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 1.85421E-16 Thyroid hormone signaling pathway 137 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-1271-5p 4.64221E-16 Cholinergic synapse 122 4 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-628-5p,hsa-miR-1271-5p 6.97279E-16 Melanoma 76 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p 9.46292E-16 Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells 156 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p 5.87167E-15 Choline metabolism in cancer 106 7 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-196b-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR- 1271-5p 8.95199E-15 Non-small cell lung cancer 81 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 1.48165E-14 99 mTOR signaling pathway 177 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p 1.71812E-14 Cushing syndrome 176 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 1271-5p 2.44396E-14 Longevity regulating pathway 105 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 9.03347E-14 Endometrial cancer 61 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-628-5p 2.12097E-13 HIF-1 signaling pathway 112 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 3.20803E-13 Oxytocin signaling pathway 161 4 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-628-5p,hsa-miR-1271-5p 3.55966E-13 Insulin signaling pathway 153 5 hsa-miR-196b-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR- 1271-5p 7.17309E-13 cGMP-PKG signaling pathway 175 4 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 8.20348E-13 cAMP signaling pathway 226 4 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 2.37555E-12 Parathyroid hormone synthesis, secretion and action 118 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 7.83029E-12 Relaxin signaling pathway 138 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 1271-5p 1.33419E-11 Transcriptional misregulation in cancer 206 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 1271-5p 4.54701E-11 AMPK signaling pathway 130 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 628-5p,hsa-miR-1271-5p 5.23827E-11 Insulin resistance 124 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR- 1271-5p 9.50627E-11 GnRH secretion 74 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 1.15554E-10 Hedgehog signaling pathway 59 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-628-5p 1.21932E-10 Spinocerebellar ataxia 145 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR- 1271-5p 1.55581E-10 Shigellosis 268 3 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 1.75526E-10 Glutamatergic synapse 117 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 2.13268E-10 Small cell lung cancer 100 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-628-5p 2.52305E-10 Endocrine resistance 118 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p,hsa-miR-1271-5p 2.91047E-10 TGF-beta signaling pathway 103 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-22-5p 2.9401E-10 Circadian rhythm 31 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p 3.16582E-10 100 Hepatitis B 177 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR- 22-5p 3.54175E-10 Endocytosis 311 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-542-5p 1.22709E-09 Human papillomavirus infection 406 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-150-5p,hsa-miR-542-5p 1.54669E-09 Mitophagy - animal 76 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-28-5p,hsa- miR-708-5p 1.935E-09 Calcium signaling pathway 246 3 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa- miR-1271-5p 2.52872E-09 Basal cell carcinoma 66 3 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p 2.65591E-09 Melanogenesis 107 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 3.97953E-09 Ubiquitin mediated proteolysis 142 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-628-5p 7.17708E-09 Adherens junction 79 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 7.16138E-09 Phosphatidylinositol signaling system 101 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 1.62221E-08 Long-term potentiation 71 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 2.57699E-08 Morphine addiction 101 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 3.38036E-08 Yersinia infection 147 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 3.47633E-08 Sphingolipid signaling pathway 133 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 3.77314E-08 Circadian entrainment 100 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 5.97257E-08 Apelin signaling pathway 140 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 6.63398E-08 Gap junction 99 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 1.20594E-07 Dopaminergic synapse 143 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 1.21322E-07 p53 signaling pathway 75 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-22-5p 1.37937E-07 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 115 3 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa- miR-1271-5p 1.62998E-07 MicroRNAs in cancer 334 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa- miR-1271-5p 1.79038E-07 Aldosterone-regulated sodium reabsorption 37 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 1.81935E-07 Bacterial invasion of epithelial cells 80 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-1271-5p 2.37426E-07 Metabolic pathways 1634 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p 9.02745E-07 Insulin secretion 92 4 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa- miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 1.00185E-06 GnRH signaling pathway 97 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 1.07911E-06 Glycosaminoglycan biosynthesis - heparan sulfate / heparin 25 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p 1.19641E-06 Adrenergic signaling in cardiomyocytes 161 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 1.41694E-06 Lysine degradation 69 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-628-5p 1.47688E-06 Bladder cancer 43 1 hsa-miR-17-5p 3.62217E-06 101 Fc gamma R -mediated phagocytosis 101 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 4.16888E-06 T cell receptor signaling pathway 115 3 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 4.76595E-06 Other types of O -glycan biosynthesis 49 3 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-628-5p 5.1787E-06 Chemokine signaling pathway 215 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 5.29581E-06 Longevity regulating pathway - multiple species 79 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 5.29405E-06 Long-term depression 64 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 7.07134E-06 GABAergic synapse 100 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa- miR-1271-5p 7.27105E-06 Hepatitis C 173 2 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p 1.79956E-05 Kaposi sarcoma -associated herpesvirus infection 245 2 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p 2.83155E-05 PD-L1 expression and PD -1 checkpoint pathway in cancer 101 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 2.91058E-05 Type II diabetes mellitus 57 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 3.02081E-05 Renin secretion 72 1 hsa-miR-1271-5p 6.12652E-05 Platelet activation 136 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 9.8217E-05 Inflammatory mediator regulation of TRP channels 101 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 9.76255E-05 Estrogen signaling pathway 167 1 hsa-miR-1271-5p 0.000115798 Autophagy - other 33 1 hsa-miR-22-5p 0.000127825 Central carbon metabolism in cancer 74 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 0.000140677 Cortisol synthesis and secretion 78 1 hsa-miR-1271-5p 0.000143931 Glycosaminoglycan biosynthesis - chondroitin sulfate / dermatan sulfate 21 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p 0.000162985 Progesterone-mediated oocyte maturation 104 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-1271-5p 0.000179463 Acute myeloid leukemia 69 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p 0.000215008 Platinum drug resistance 75 1 hsa-miR-22-5p 0.000236272 Human cytomegalovirus infection 306 2 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-1271-5p 0.000267408 Alanine, aspartate and glutamate metabolism 38 1 hsa-miR-22-5p 0.000271981 Vasopressin-regulated water reabsorption 47 1 hsa-miR-9-5p 0.000308966 Synaptic vesicle cycle 89 1 hsa-miR-542-5p 0.000350263 N-Glycan biosynthesis 51 1 hsa-miR-22-5p 0.000430406 Aldosterone synthesis and secretion 110 1 hsa-miR-1271-5p 0.000451751 Fluid shear stress and atherosclerosis 149 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 0.000450863 Adipocytokine signaling pathway 88 1 hsa-miR-22-5p 0.000519492 Salmonella infection 277 1 hsa-miR-150-5p 0.000622366 Vascular smooth muscle contraction 138 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 0.000642268 Glucagon signaling pathway 114 1 hsa-miR-1271-5p 0.000663888 102 Pathogenic Escherichia coli infection 222 1 hsa-miR-22-5p 0.00082426 Nicotine addiction 42 1 hsa-miR-22-5p 0.000836426 Endocrine and other factor - regulated calcium reabsorption 57 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 0.000868276 Mucin type O -glycan biosynthesis 34 1 hsa-miR-22-5p 0.000889629 Measles 161 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 0.001015487 SNARE interactions in vesicular transport 33 1 hsa-miR-22-5p 0.001592813 Amphetamine addiction 74 1 hsa-miR-542-5p 0.003077163 Inositol phosphate metabolism 78 1 hsa-miR-22-5p 0.00325241 Oocyte meiosis 134 1 hsa-miR-1271-5p 0.003420484 Cellular senescence 219 1 hsa-miR-1271-5p 0.004027249 Human immunodeficiency virus 1 infection 277 1 hsa-miR-1271-5p 0.004012487 JAK-STAT signaling pathway 168 1 hsa-miR-22-5p 0.004152533 Regulation of lipolysis in adipocytes 61 1 hsa-miR-22-5p 0.004408795 Leukocyte transendothelial migration 120 1 hsa-miR-542-5p 0.005264539 Pantothenate and CoA biosynthesis 21 1 hsa-miR-22-5p 0.005312422 Pyrimidine metabolism 57 1 hsa-miR-628-5p 0.006614233 Fc epsilon RI signaling pathway 79 1 hsa-miR-1271-5p 0.006701088 Purine metabolism 137 1 hsa-miR-9-5p 0.006979135 Sphingolipid metabolism 59 1 hsa-miR-9-5p 0.00726121 Gastric acid secretion 80 1 hsa-miR-542-5p 0.007378341 beta-Alanine metabolism 30 1 hsa-miR-22-5p 0.008317317 Hippo signaling pathway - multiple species 30 1 hsa-miR-22-5p 0.008317317 Serotonergic synapse 126 1 hsa-miR-22-5p 0.008305937 TNF signaling pathway 131 1 hsa-miR-22-5p 0.008690432 Cell cycle 129 1 hsa-miR-22-5p 0.009406269 Cocaine addiction 53 1 hsa-miR-542-5p 0.010274138 Nicotinate and nicotinamide metabolism 37 1 hsa-miR-22-5p 0.010704334 Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy 79 1 hsa-miR-22-5p 0.015135863 Retrograde endocannabinoid signaling 166 1 hsa-miR-22-5p 0.016269375 103 Tabela 3 – Vias preditas de serem reguladas pelos microRNAs diferencialmente expressos em Vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo controle x endometriose. Vias preditas de serem reguladas pelos miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos controle e endometriose KEEG pathway Genes(n) miRNAs (n) miRNAs p-value Axon guidance 186 15 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24- 3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR- 92a-3p,hsa-miR-30c-5p,hsa- miR-139-5p,hsa-miR-214- 3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR- 145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR- 330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-885- 5p,hsa-miR-504-3p 3.1199E-61 Pathways in cancer 555 11 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24- 3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR- 139-5p,hsa-miR-214-3p,hsa- miR-141-3p,hsa-miR-206,hsa- miR-330-3p,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 3.078E-44 Proteoglycans in cancer 220 12 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 139-5p,hsa-miR-141-3p,hsa- miR-145-5p,hsa-miR-206,hsa- miR-330-3p,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 885-5p,hsa-miR-504-3p 1.7324E-42 ErbB signaling pathway 86 11 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 139-5p,hsa-miR-214-3p,hsa- miR-145-5p,hsa-miR-330- 3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-885-5p,hsa- miR-504-3p 3.0197E-33 Hippo signaling pathway 164 9 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-139- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR- 330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 4.2453E-31 Rap1 signaling pathway 214 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214- 3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR- 145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 3.5759E-29 Ras signaling pathway 241 11 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24- 3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR- 30c-5p,hsa-miR-139-5p,hsa- miR-214-3p,hsa-miR-145- 5p,hsa-miR-206,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 1.6382E-28 Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells 156 12 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 30c-5p,hsa-miR-214-3p,hsa- 4.5103E-28 104 miR-145-5p,hsa-miR-206,hsa- miR-330-3p,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 885-5p,hsa-miR-504-3p cAMP signaling pathway 226 8 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-139-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-330-3p,hsa- miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 5.0406E-27 Wnt signaling pathway 173 9 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 141-3p,hsa-miR-206,hsa-miR- 330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 2.6904E-26 FoxO signaling pathway 139 8 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 30c-5p,hsa-miR-214-3p,hsa- miR-145-5p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 2.2462E-25 Regulation of actin cytoskeleton 224 9 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-145-5p,hsa- miR-206,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 1.1657E-24 MAPK signaling pathway 329 8 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24- 3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR- 141-3p,hsa-miR-145-5p,hsa- miR-206,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 3.9899E-24 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance 82 10 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24- 3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR- 92a-3p,hsa-miR-30c-5p,hsa- miR-214-3p,hsa-miR-206,hsa- miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 1.2401E-22 Focal adhesion 213 8 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-139- 5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 1.2578E-22 Neurotrophin signaling pathway 124 9 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 30c-5p,hsa-miR-214-3p,hsa- miR-145-5p,hsa-miR-206,hsa- miR-330-3p,hsa-miR-504-3p 2.2452E-22 Oxytocin signaling pathway 161 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-145-5p,hsa- miR-206,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 9.5709E-22 TGF-beta signaling pathway 103 9 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-145-5p,hsa- miR-206,hsa-miR-330-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 2.1687E-21 cGMP-PKG signaling pathway 175 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-504-3p 5.5642E-21 105 Dopaminergic synapse 143 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-139-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 7.0896E-21 Melanogenesis 107 7 hsa-miR-24-3p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-504-3p 1.6499E-20 Renal cell carcinoma 70 9 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 139-5p,hsa-miR-206,hsa-miR- 330-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa- miR-425-3p,hsa-miR-504-3p 9.22E-20 Apelin signaling pathway 140 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-504-3p 2.1224E-19 Calcium signaling pathway 246 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 3.5336E-19 Cushing syndrome 176 7 hsa-miR-24-3p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-206,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-504-3p 3.653E-19 Ubiquitin mediated proteolysis 142 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-885-5p 1.1433E-18 Cholinergic synapse 122 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 1.5974E-18 Growth hormone synthesis, secretion and action 129 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-330-3p,hsa- miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 4.8847E-18 Adrenergic signaling in cardiomyocytes 161 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-206,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 5.3216E-18 Glutamatergic synapse 117 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 141-3p,hsa-miR-206,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 3.0679E-17 Circadian entrainment 100 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 4.339E-17 Hepatocellular carcinoma 177 7 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-504-3p 5.0834E-17 Long-term potentiation 71 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 7.3577E-17 106 Insulin signaling pathway 153 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-504-3p 1.5216E-16 Glioma 79 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 9.2763E-16 Transcriptional misregulation in cancer 206 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR- 145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR- 574-5p 1.6791E-15 PI3K-Akt signaling pathway 372 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214- 3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-504-3p 1.9349E-15 Choline metabolism in cancer 106 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 504-3p 2.5231E-15 Colorectal cancer 88 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 139-5p,hsa-miR-504-3p 3.4899E-15 AMPK signaling pathway 130 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 141-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-574-5p,hsa-miR-504-3p 5.2235E-15 Thyroid hormone signaling pathway 137 5 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-504-3p 1.6224E-14 Breast cancer 163 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-206,hsa-miR-330- 3p,hsa-miR-504-3p 8.4306E-14 Gastric cancer 162 4 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR- 504-3p 9.9904E-14 Phosphatidylinositol signaling system 101 5 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-504-3p 1.7273E-13 Sphingolipid signaling pathway 133 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 574-5p,hsa-miR-504-3p 2.7151E-13 Pancreatic cancer 78 6 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 4.2331E-13 Phospholipase D signaling pathway 158 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 7.2665E-13 Chronic myeloid leukemia 79 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-141- 3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR- 504-3p 8.8188E-13 Hedgehog signaling pathway 59 4 hsa-miR-141-3p,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 1.0921E-12 Insulin resistance 124 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 425-3p 1.1656E-12 107 Tight junction 182 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-141- 3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-425-3p 1.1979E-12 Adherens junction 79 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-145- 5p,hsa-miR-206,hsa-miR-574- 5p 1.2487E-12 Autophagy - animal 146 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa- miR-504-3p 2.489E-12 Inflammatory mediator regulation of TRP channels 101 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa- miR-504-3p 3.0953E-12 Morphine addiction 101 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-139- 5p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 3.4361E-12 Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy 79 4 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR- 504-3p 6.5999E-12 Longevity regulating pathway 105 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-425-3p 1.6252E-11 Endocytosis 311 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-574-5p 2.1961E-11 Yersinia infection 147 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 504-3p 3.1178E-11 GnRH secretion 74 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 574-5p 1.0064E-10 Hepatitis B 177 6 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 214-3p,hsa-miR-141-3p,hsa- miR-504-3p 1.074E-10 GnRH signaling pathway 97 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-206,hsa-miR-330- 3p,hsa-miR-504-3p 2.3141E-10 Bacterial invasion of epithelial cells 80 4 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-145- 5p,hsa-miR-206,hsa-miR-425- 3p 2.9417E-10 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 115 4 hsa-miR-21-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 574-5p 4.0278E-10 Aldosterone synthesis and secretion 110 4 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-145- 5p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 7.4413E-10 Shigellosis 268 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-145- 5p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR- 425-3p 1.1834E-09 Spinocerebellar ataxia 145 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR- 574-5p 1.6678E-09 Parathyroid hormone synthesis, secretion and action 118 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR- 504-3p 2.3065E-09 Endometrial cancer 61 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-504-3p 2.6649E-09 108 Fc gamma R -mediated phagocytosis 101 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-425-3p 3.3057E-09 mTOR signaling pathway 177 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-141- 3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 504-3p 4.6167E-09 Melanoma 76 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-504-3p 6.8266E-09 Insulin secretion 92 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 6.9822E-09 Other types of O -glycan biosynthesis 49 3 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 8.0493E-09 HIF-1 signaling pathway 112 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31- 5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR- 425-3p,hsa-miR-504-3p 7.8667E-09 Gastric acid secretion 80 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 8.0709E-09 Central carbon metabolism in cancer 74 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-151a-3p 1.1578E-08 Circadian rhythm 31 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504- 3p 3.5746E-08 Prostate cancer 101 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214- 3p,hsa-miR-504-3p 5.4776E-08 Synaptic vesicle cycle 89 2 hsa-miR-141-3p,hsa-miR-504- 3p 1.0662E-07 Amphetamine addiction 74 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-504-3p 1.3595E-07 Regulation of lipolysis in adipocytes 61 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-214-3p 1.8369E-07 SNARE interactions in vesicular transport 33 2 hsa-miR-24-3p,hsa-miR-504- 3p 2.2978E-07 Long-term depression 64 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 2.3538E-07 Hypertrophic cardiomyopathy 99 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c- 5p,hsa-miR-504-3p 3.3844E-07 Longevity regulating pathway - multiple species 79 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-425-3p 5.8965E-07 Endocrine and other factor - regulated calcium reabsorption 57 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 7.2168E-07 Inositol phosphate metabolism 78 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-504-3p 7.3065E-07 Metabolic pathways 1634 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504- 3p 9.1321E-07 Non-small cell lung cancer 81 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR- 206,hsa-miR-504-3p 1.0248E-06 Human papillomavirus infection 406 3 hsa-miR-206,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-504-3p 1.3952E-06 Basal cell carcinoma 66 1 hsa-miR-504-3p 1.5422E-06 Platelet activation 136 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR- 504-3p 1.9802E-06 Small cell lung cancer 100 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p,hsa-miR-504-3p 2.4182E-06 Mannose type O -glycan biosynthesis 24 1 hsa-miR-425-3p 2.9728E-06 Pentose and glucuronate interconversions 37 1 hsa-miR-141-3p 3.3235E-06 109 p53 signaling pathway 75 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-504-3p 3.3359E-06 Thyroid hormone synthesis 84 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 4.3938E-06 MicroRNAs in cancer 334 2 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-92a- 3p 5.0467E-06 Endocrine resistance 118 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR- 206,hsa-miR-504-3p 5.6319E-06 Prolactin signaling pathway 73 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504- 3p 8.4044E-06 Ascorbate and aldarate metabolism 33 1 hsa-miR-141-3p 9.5755E-06 Dilated cardiomyopathy 107 2 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-504- 3p 9.6074E-06 Mucin type O -glycan biosynthesis 34 3 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-574- 5p,hsa-miR-504-3p 1.283E-05 VEGF signaling pathway 61 3 hsa-miR-206,hsa-miR-425- 3p,hsa-miR-504-3p 1.351E-05 Nicotine addiction 42 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-574- 5p 1.4661E-05 Glycerophospholipid metabolism 116 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504- 3p 1.5606E-05 Relaxin signaling pathway 138 2 hsa-miR-574-5p,hsa-miR-504- 3p 2.1446E-05 Cocaine addiction 53 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-425- 3p 3.0169E-05 Vascular smooth muscle contraction 138 2 hsa-miR-574-5p,hsa-miR-504- 3p 3.512E-05 Hippo signaling pathway - multiple species 30 2 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-574- 5p 3.7776E-05 GABAergic synapse 100 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-574- 5p 4.6238E-05 Glycosaminoglycan biosynthesis - heparan sulfate / heparin 25 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214- 3p 4.9696E-05 Glycosaminoglycan biosynthesis - chondroitin sulfate / dermatan sulfate 21 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-206 5.0949E-05 Acute myeloid leukemia 69 2 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-504- 3p 6.0219E-05 Vibrio cholerae infection 60 2 hsa-miR-206,hsa-miR-425-3p 6.3859E-05 Leukocyte transendothelial migration 120 2 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574- 5p 9.5797E-05 Cellular senescence 219 2 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-206 9.8322E-05 Thyroid cancer 43 2 hsa-miR-206,hsa-miR-504-3p 0.00010927 Porphyrin and chlorophyll metabolism 46 1 hsa-miR-141-3p 0.00016326 Aldosterone-regulated sodium reabsorption 37 2 hsa-miR-206,hsa-miR-574-5p 0.00016287 Cytokine-cytokine receptor interaction 333 1 hsa-miR-21-5p 0.00019752 Retrograde endocannabinoid signaling 166 1 hsa-miR-574-5p 0.00026432 Vasopressin-regulated water reabsorption 47 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-425- 3p 0.00028336 Fluid shear stress and atherosclerosis 149 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a- 3p 0.00030931 110 Protein processing in endoplasmic reticulum 194 1 hsa-miR-30c-5p 0.0003146 Bile secretion 98 1 hsa-miR-141-3p 0.00039186 Gap junction 99 1 hsa-miR-31-5p 0.00042149 Hepatitis C 173 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-504- 3p 0.00044261 Glycosphingolipid biosynthesis - lacto and neolacto series 29 1 hsa-miR-214-3p 0.00051769 T cell receptor signaling pathway 115 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-504- 3p 0.00057317 Bladder cancer 43 1 hsa-miR-206 0.0006323 Glucagon signaling pathway 114 1 hsa-miR-92a-3p 0.00063952 Lysine degradation 69 1 hsa-miR-214-3p 0.00064585 Cortisol synthesis and secretion 78 1 hsa-miR-92a-3p 0.00075311 Progesterone-mediated oocyte maturation 104 1 hsa-miR-92a-3p 0.00083639 C-type lectin receptor signaling pathway 116 1 hsa-miR-21-5p 0.00086545 Purine metabolism 137 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-504- 3p 0.00088647 Drug metabolism - other enzymes 85 1 hsa-miR-141-3p 0.00133218 Phosphonate and phosphinate metabolism 6 1 hsa-miR-145-5p 0.00177112 Biosynthesis of cofactors 173 1 hsa-miR-141-3p 0.00183676 Sphingolipid metabolism 59 1 hsa-miR-504-3p 0.0019843 Mineral absorption 62 1 hsa-miR-574-5p 0.00224104 JAK-STAT signaling pathway 168 1 hsa-miR-21-5p 0.00247343 Alcoholism 195 1 hsa-miR-206 0.0035303 Estrogen signaling pathway 167 1 hsa-miR-92a-3p 0.00385297 Glycosaminoglycan biosynthesis - keratan sulfate 14 1 hsa-miR-31-5p 0.00478453 Fatty acid degradation 43 1 hsa-miR-214-3p 0.00491418 Notch signaling pathway 63 1 hsa-miR-214-3p 0.00755991 N-Glycan biosynthesis 51 1 hsa-miR-504-3p 0.00831635 Platinum drug resistance 75 1 hsa-miR-31-5p 0.00902131 Renin secretion 72 1 hsa-miR-504-3p 0.00959391