{"paper_id":"c4f3a1f5-33da-4910-9f3b-d74375b14d6f","body_text":"1 \n UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nDEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA \n \n \n \n \n \n \nMAYRA BERALDO ANDOZIA \n \n \n \n \n \n \n \n Avaliação do tamanho, quantidade e microRNAs de vesículas extracelulares do fluido \nfolicular de mulheres inférteis com e sem endometriose avançada submetidas à estimulação \novariana e fertilização in vitro \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2024 \n \n\n 2 \nMAYRA BERALDO ANDOZIA \n \n \n \n \n \n \nAvaliação do tamanho, quantidade e microRNAs de vesículas extracelulares do fluido \nfolicular de mulheres inférteis com e sem endometriose avançada submetidas à estimulação \novariana e fertilização in vitro \n \n             \n \n“Versão corrigida. A versão original encontra-se disponível tanto na Biblioteca da Unidade \nque aloja o Programa, quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP (BDTD)” \n \n \nTese apresentada ao Programa de Pós  Graduação \nem Ginecologia e Obstetrícia Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto para obtenção do \nTítulo de Doutor em Ciências Médicas. \n \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia  \n(opção: Biologia da Reprodução) \n \nOrientadora: Prof a. Dra. Paula Andrea de \nAlbuquerque Salles Navarro \nCoorientadora: Dra. Michele Gomes da Broi \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2024 \n \n\n 3 \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n       \n \n         Andozia, Mayra Beraldo \n      Avaliação do tamanho, quantidade e microRNAs de vesículas \nextracelulares do fluido folicular de mulheres inférteis com e sem \nendometriose avançada submetidas à estimulação ovariana e \nfertilização in vitro. Ribeirão Preto: FMRP, 2024. \n               \n 110 p. : il. ; 30 cm \n \n      Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto/USP. Área de concentração: Ginecologia e Obstetrícia. \n               Orientadora: Navarro, Paula Andrea de Albuquerque Salles. \n \n       1. Endometriose. 2. Infertilidade. 3. Qualidade oocitária. 4. Vesículas  \nextracelulares. 5. MicroRNA. \n \n \n \n \n\n 4 \nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \nNome: ANDOZIA, Mayra Beraldo  \n \nTítulo: Avaliação do tamanho, quantidade e microRNAs de vesículas extracelulares do fluido \nfolicular de mulheres inférteis com e sem endometriose avançada submetidas à estimulação \novariana e fertilização in vitro \n \n \nTese apresentada ao Programa de Pós Graduação em  Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade \nde Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Doutor \nem Ciências Médicas. \n \nAprovada em: 14/08/2024 \n \nBanca examinadora \n \nProfa. Dra.: Paula Andrea de Albuquerque Salles Navarro \nInstituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo  \nJulgamento: Aprovado \n \nProf. Dr.: Júlio César Rosa e Silva                                     \nInstituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo  \nJulgamento: Aprovado \n \nProf. Dr. Felipe Perecin                                                     \nInstituição: Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo  \nJulgamento: Aprovado \n \nProf. Dr. Eduardo Schor                                                      \nInstituição: Universidade Federal de São Paulo \nJulgamento: Aprovada \n \n \n \n \n\n 5 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedico este trabalho a minha família por todo amor, compreensão e \nincansável apoio ao longo do período de elaboração deste trabalho. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 6 \nAGRADECIMENTOS \n \nÀ Deus que me proporcionou uma força inesgotável, esperança e proteção. \n \nÀ minha orientadora Profa. Dra. Paula Andrea de Albuquerque Salles Navarro que a cada dia \nmais me inspira por ser uma excelente profissional e, acima de tudo, uma pessoa maravilhosa, \npaciente, dedicada e que apoiou e confiou no meu potencial e me auxiliou muito no meu \ncrescimento científico. Certamente foi uma honra poder tê-la como orientadora. \n \nÀ minha coorientadora Dra. Michele Gomes da Broi pela orientação, paciência, apoio que me \nmotivaram a seguir adiante frente aos desafios e frustações. \n \nAo Prof. Associado Dr. Juliano Coelho da Silveira  que acreditou neste estudo e gentilmente \npermitiu a realização dos experimentos no  Laboratório de Morfofisiologia Molecular e \nDesenvolvimento da FZEA/USP. Obrigada pela oportunidade e pelo compartilhamento de seu \nconhecimento científico. \n \nÀ Larissa de Oliveira Koopman que caminhou comigo compartilhando vitórias e frustações no \nperíodo de acompanhamento das pacientes e coleta das amostras. Obrigada pela sua parceria \nque foi fundamental para que essa etapa fosse concluída. \n \nÀs participantes da pesquisa doadoras do material biológico essencial para a realização deste \nestudo. \n \nA todos os amigos da pós -graduação, obrigada pelo carinho,  incentivo diário e momentos de \ndescontração. \n \nÀs embriologistas: Maria Cristina, Roberta e Tatiana que sem o apoio este trabalho seria \ninviável. Obrigada por toda paciência, disponibilidade e carinho. \n \nA tod os os funcionári os do Centro de Reprodução Humana: Adriana, Albina,  Erci, Maria \nAparecida, Marilda, Marisa, Sandra, Stael e Tatá. Agradeço pelo carinho de todos. \n \n \n\n 7 \nA todos os amigos do Laboratório de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento da \nFZEA/USP, especialmente Cibele, Paola e Gislaine, por toda disponibilidade em compartilhar \nconhecimentos e me treinar para realização dos experimentos científicos.  \nÀ Suleimy pela paciência e atenção com as análise estatísticas do estudo. \n \nÀ Suelen pela enorme paciência e disponibilidade em me ajudar em todos os processos \nadministrativos durante o período da pós-graduação. \n \nAos membros da banca de defesa Prof. Dr.: Júlio César Rosa e Silva, Prof. Dr. Felipe Perecin \ne Prof. Dr. Eduardo Schor por aceitarem o convite. \n \nÀ Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) por meio \ndo Programa de Excelência Acadêmica (PROEX) pelo apoio financeiro durante todo o \nperíodo de Doutorado (Processo n° 88887.199256/2018-00).                       \n \nÀ Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FAEPA), ao INCT – Hormônio e Saúde da \nMulher, a Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP/USP), ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia e ao Laboratório de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento \nda FZEA/USP por fornecerem todo suporte financeiro e a infraestrutura para que este trabalho \nfosse realizado. \n \nA todos meu muito obrigada! \n                                  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 8 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Crescer significa mudar e mudar envolve riscos, uma \npassagem do conhecido para o desconhecido.” \n                   \n \n      William P. Young  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 9 \nResumo \nAndozia, MB. Avaliação do tamanho, quantidade e microRNAs de vesículas extracelulares \ndo fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose avançada submetidas à \nestimulação ovariana e fertilização in vitro . Tese (Doutorado em Ciências Médicas)  – \nPrograma de Pós Graduação em Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2024. \n \nA endometriose é uma doença altamente prevalente nas mulheres em idade reprodutiva, \nfrequentemente associada à infertilidade. Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda não \nforam totalmente elucidados, sendo o comprometimento da qualidade oocitária um dos \nprincipais fatores identificados. Nos últimos anos, o papel das vesículas extracelulares (VE), \ncomo mediadoras da comunicação celular, tem sido investigado em todas as fases do \ndesenvolvimento oocitário. Todavia, nenhum estudo até o presente avaliou as VE no soro e \nfluido folicular (FF) de mulheres inférteis com endometriose. Desta forma, objetivamos isolar \ne caracterizar o diâmetro e a quantidade de VE do soro e do FF de mulheres inférteis com e sem \nendometriose avançada, assim como comparar a expressão de 82 miRNAs de VE do FF dessas \nmesmas mulheres. Para tanto, realizou-se um estudo caso-controle utilizando amostras de soro \ne FF o btidas de 30 mulheres inférteis (10 com endometriose modera da e severa sem \nendometrioma e 20 com infertilidade por fator mascul ino) submetidas à estimulação ovariana \ncontrolada para injeção intracitoplasmática de espermatozóides. Amostras de soro e FF foram \ncoletadas no momento da punção folicular e caracterizadas quanto à concentração de vesículas \nextracelulares por ml e ao diâmetro em nanômetros por Nanoparticle Tracking Analysis . A \ncomparação da expressão de 82 miRNAs na VE do FF foi realizada por Real Time – Polymerase \nChain Reaction  (RT-PCR). Ao compararmos os grupos com e sem endometriose, não \nobservamos diferença no diâmetro e na quantidade das VE do soro. Mas, observamos um \naumento no diâmetro das VE do FF de mulheres com infertilidade associada a endometriose \navançada comparadas às controles, sem diferença na quantidade. Dentro do grupo \nEndometriose, o diâmetro e a quantificação das VE do FF estavam aumentados em relação ao \nsoro, o que não foi observado no grupo controle. Esses resultados podem indicar maior \nliberação de VE com diâmetro também aumentado, como uma tentativa de combater os fatores \nestressores e reestabelecer o  equilíbrio folicular no grupo endometriose.  Ao compararmos a \nexpressão de 82 miRNAs extraídos de VE isoladas do FF de mulheres inférteis sem e com \nendometriose avançada, detectamos 73 miRNAs, sendo um exclusivo no grupo controle, treze \nexclusivos no grupo com endometriose avançada e 25 miRNAs presentes em ambos os grupos, \nmas diferencialmente expressos entre eles, dos quais 24 apresentaram expressão mais elevada \nno grupo infértil com endometriose avançada. Dentre os principais miRNAs exclusivos e hiper \nexpressos nas comparações entre os grupos com endometriose avançada e controle, foram \nevidenciadas alterações em miRNAs relacionados a vias de adesão e regulação da \nreorganização do citoesqueleto de actina, assim como em vias de sinalização, incluindo ErbB, \nRas, MAPK, Hippo, Rap1, cAMP e WNT que estão relacionados com desenvolvimento \nfolicular e a aquisição de competência oocitária, cuja desregulação poderia favorecer a piora da \nqualidade gamética. Sendo assim, nossos achados aprofundam o entendimento dos mecanismos \nenvolvidos no comprometimento da fertilidade em mulheres com endometriose avançada, \nevidenciando potenciais vias alteradas, mediadas por miRNA de VE do FF dessas mulheres. \n \nPalavras-chave: endometriose, infertilidade, qualidade oocitária, vesículas extracelulares, \nmicroRNA. \n \n \n\n 10 \nAbstract \nAndozia, MB.  Determination of s ize, quantity and microRNAs of extracellular vesicles \nfrom follicular fluid of infertile women with and without advanced endometriosis \nundergoing ovarian stimulation and in vitro  fertilization. Thesis (Doctorate Degree in \nSciences) – Graduated Program in Gynecology and Obstetrics, Ribeirão Preto Medical School, \nUniversity of São Paulo, Ribeirão Preto, 2024. \n \nEndometriosis is a highly prevalent disease  among women of reproductive age , strongly, \nassociated with infertility . However, the mechanisms involved have not yet been fully \nelucidated, although several studies propose an i mpairment effect of endometriosis on oocyte \nquality. In recent years, the role of extracellular vesicles (EV), as mediators of cellular \ncommunication, has been investigated at all stages of oocyte development. Although, no study \nto date has evaluated EV in the serum and follicular fluid (F F) of infertile women with \nendometriosis. In order to expand the understanding of the extracellular vesicles and oocyte \nquality, we aimed to isolate and characterize the size and quantity of EV from serum and FF of \ninfertile women with and without advanced endometriosis, as well as to compare the expression \nof 82 EV miRNAs from FF of these same women. Therefore, a case-control study was carried \nout using serum and follicular fluid samples obtained from 30 infertile women (10 with \nmoderate and severe endometriosis without endometrioma and 20 with male factor infertility) \nwho underwent controlled ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Serum and \nFF samples were collected at the time of oocyte capture and characterized regarding the \nquantification of extracellular vesicles per ml and size in nanometers by Nanoparticle Tracking \nAnalysis. Comparison of the expression of 82 miRNAs in FF-EV was performed by Real Time \n– Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The comparison between the groups with and without \nendometriosis, we did not observe any difference in the size or quantity of serum-EV. However, \nwe observed an increase in FF-VE size in women with infertility associated with advanced \nendometriosis compared to controls, with no difference in quantity.  By comparison between  \nfollicular fluid and serum from advanced endometriosis group, FF-EV size and quantification \nwere increased in relation to serum, which was not observed in control group. These results \nmay indicate greater release of EV with increased size, as an attempt to combat stress factors \nand reestablish follicular balance in the  advanced endometriosis group.  The expression \ncomparison of 82 miRNAs extracted from FF-EV of infertile women without and with \nadvanced endometriosis, it was detected 73 miRNAs, one being exclusive in control group, \nthirteen exclusive in advanced endometriosis  and 25 miRNAs present in both groups, but \ndifferentially expressed between them, of which 24 showed higher expression in  advanced \nendometriosis infertile women . Among the main exclusive and overexpressed miRNAs in \ncomparisons between the groups with a dvanced endometriosis and control, changes were \nevidenced in miRNAs related to focal adhesion and regulation of the reorganization of the actin \ncytoskeleton, as well as in signaling pathways, including ErbB, Ras, MAPK, Hippo, Rap1, \ncAMP and WNT which are related to follicular development and the acquisition of oocyte \ncompetence, whose deregulation could favor the worsening of gametic quality.  Therefore, our \ndata deepens the understanding of the mechanisms involved in compromising fertility in \nwomen with advanced endometriosis, highlighting potential altered pathways, mediated by EV-\nFF miRNA in these women. \n \nKeywords: endometriosis, female infertility, oocyte quality, extracellular vesicles, microRNA. \n \n \n \n \n\n 11 \nLista de figuras \n \nFigura 1:  Mecanismos de comunicação intercelular entre vesículas extracelulares e \ncélula-alvo.....................................................................................................................24 \nFigura 2: Vesículas extracelulares no folículo ovariano..............................................26 \nFigura 3: Figura esquemática representando o protocolo de centrifugações seriadas para \npreparo de fluidos para posterior isolamento de vesículas extracelulares....................36 \nFigura 4: Fluxograma do estudo..................................................................................41 \nFigura 5: Diagrama de Venn representando a intersecção dos 73 microRNAs \nprovenientes das comparações entre as vesículas extracelulares isoladas do fluido \nfolicular de mulheres inférteis com e sem endometriose..............................................45 \nFigura 6: microRNAs diferencialmente expressos em mulheres inférteis sem \nendometriose (grupo Controle) e inférteis com endometriose avançada (grupo \nEndometriose)...............................................................................................................48 \nFigura 7: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas modulada pelo \nmicroRNA proveniente de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de \nmulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle)................................................49 \nFigura 8: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos \nmicroRNAs provenientes de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de \nmulheres inférteis com endometriose avançada (grupo Endometriose).......................50 \nFigura 9: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos \nmicroRNAs provenientes de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular \ndiferencialmente expressos entre mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle) \ne com endometriose avançada (grupo Endometriose)..................................................51 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 12 \nLista de tabelas \n \nTabela 1: Características clínicas das participantes da pesquisa do grupo controle e \ndo grupo endometriose avançada................................................................................ 42 \nTabela 2: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no soro dos grupos \nControle e Endometriose avançada............................................................................. 43 \nTabela 3: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no fluido folicular dos \ngrupos Controle e Endometriose avançada.................................................................. 43 \nTabela 4: Quantificação e diâmetro das Vesículas Extracelulares entre soro e fluido \nfolicular do grupo Endometriose avançada................................................................. 44 \nTabela 5: microRNAs diferencialmente expressos em vesículas extracelulares isoladas \ndo fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose avançada comparadas aos \ncontroles inférteis sem endometriose........................................................................... 45 \n \n \n \n \n \n  \n \n \n  \n \n\n 13 \nLista de siglas \n \nAMH Hormônio Anti-mülleriano  \nASRM American Society of Reproductive Medicine  \nATP Adenosina Trifosfato \ncAMP Adenosina Monocíclica Fosfato \nCC Células do Cumulus  \nCEP Comissão de Ética em Pesquisa  \nCFA Contagem de Folículos Antrais  \nCG Células da Granulosa   \ncGMP Guanosina Monocíclica Fosfato  \nCOC Complexo Cumulus-Oócito  \nCRH Centro de Reprodução Humana  \nCT Cycle threshold  \nCTEP Contagem Total de Espermatozoides Móveis  \nDGO Departamento de Ginecologia e Obstetrícia \nDNA Ácido Desoxirribonucleico \nDNAse Desoxirribonuclease \nDP Desvio Padrão  \nEGF Fator de Crescimento Epidérmico \nEGFR Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico  \nEO Estresse Oxidativo  \nEOC Estimulação Ovariana Controlada  \nEpac Proteína de troca diretamente ativada por cAMP  \nErbB Receptores Tirosina Quinase \nERK1/2 Quinases reguladas por sinal extracelular 1/2  \nESHRE European Society of Human Reproduction and Embryology  \nFC Fold Change  \nFF Fluido Folicular  \nFMRP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nFP Fluido Peritoneal  \nFSH Hormônio Folículo Estimulante  \nFSHr  Hormônio Folículo Estimulante recombinante \n \n\n 14 \nFZ Receptor Frizzled  \nFZEA Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos  \nGnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas  \nHC Hospital das Clínicas \nhCG Gonadotrofina Coriônica Humana  \nHIF-1a Fator Induzido por Hipóxia  \nHippo Protein Kinase Hpo   \nHIV Vírus da Imunodeficiência humana \nHm/Ms/Rt T1 snRNA Human/Mouse/Rat small nuclear RNA \nhpHMG Highly Purified Human Menopausal Gonadotrophin \nISEV Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares  \nICSI Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoide  \nIGF1 Insulin-like Growth Factor 1   \nILV Vesículas Intraluminais  \nIMC Índice de Massa Corporal  \nIOP Insuficiência Ovariana Precoce  \nKEEG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes  \nLH Hormônio Luteinizante  \nLMMD Laboratório de Morfofisiologia Molecular do Desenvolvimento  \nMAPK Mitogen-Activated Protein Kinase \nMEK1 Meiotic Chromosome-axis-associated Kinase 1 \nMII metáfase II  \nmiRNAs microRNAs \nml Mililitro \nMPF Fator Promotor de Maturação  \nMS Ministério da Saúde \nmtDNA DNA mitocondrial \nMVB Multivesicular Body \nng Nanograma \nnm Nanômetro \nNTA Nanoparticle Tracking Analysis  \nOMS Organização Mundial de Saúde  \nPI3K/Akt Fosfatidilinusitol 3-quinase/Proteína quinase B \n \n\n 15 \nRAF1 proto-oncogene serine/threonine-protein kinase 1 \nRap1 Proteína-1 relacionada a Ras \nRas RAt Sarcoma vírus \nRNA Ácido Ribonucleico \nRNAt Ácido Ribonucleico transportador \nRNAm Ácido Ribonucleico mensageiro \nRNAse Ribonuclease \nRT PCR Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real \nSOP Síndrome de Ovários Policísticos  \nTAZ Transcriptional co-Activator with PDZ-binding motif   \nTCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido  \nTEAD TEA Domain Family Member  \nTGF-ß Fator de Transformação do Crescimento Beta \nTRA Tratamento de Reprodução Assistida  \nTSH Hormônio Tireoestimulante \nTZP Projeções Transzonais  \nUSP Universidade de São Paulo \nUStv Ultrassonografia Transvaginal  \nVE Vesículas Extracelulares  \nVLPSC Videolaparoscopia \nWNT Wingless-related Integration Site \nYAP Yes-Associated Protein  \nZP \nμl \nZona pelúcida \nMicrolitro \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 16 \nSumário \n1 Introdução..................................................................................................18 \n   1.1 Endometriose.........................................................................................18 \n   1.2 Endometriose e infertilidade..................................................................19 \n   1.3 Endometriose e foliculogênese..............................................................21 \n   1.4 Vesículas extracelulares e qualidade oocitária......................................23 \n   1.5 MicroRNAs e qualidade oocitária.........................................................26 \n   1.6 Vesículas extracelulares e seu conteúdo de microRNAs na infertilidade \nrelacionada à endometriose............................................................................29 \n2 Objetivos.....................................................................................................31 \n   2.1 Objetivos Primários...............................................................................31 \n   2.2 Objetivos Secundários...........................................................................31 \n3 Casuística e Métodos.................................................................................32 \n   3.1 Considerações Éticas.............................................................................32 \n   3.2 Desenho do estudo e local realizado......................................................32 \n   3.3 Participantes e Critérios de Elegibilidade..............................................32 \n   3.4 Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação da Fase Lútea...33 \n   3.5 Delineamento Experimental..................................................................35 \n         3.5.1 Coleta e armazenamento das amostras.........................................35 \n         3.5.2 Isolamento das Vesículas Extracelulares......................................35 \n         3.5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares................................36 \n                  3.5.3.1 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)...........................36 \n         3.5.4. Extração de RNA das Vesículas Extracelulares..........................37 \n         3.5.5 Transcrição Reversa.....................................................................37 \n         3.5.6 Análise da expressão relativa dos microRNAs por Reação em \nCadeia de Polimerase em Tempo Real (RT-PCR).........................................37 \n         3.5.7 Cálculo da expressão relativa dos microRNAs............................38 \n4 Análise Estatística.....................................................................................39 \n5 Resultados..................................................................................................40 \n   5.1 Fluxograma do estudo...........................................................................40 \n   5.2 Caracterização das participantes da pesquisa........................................41 \n   5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares........................................42 \n \n\n 17 \n         5.3.1 Comparação entre os grupos Controle e Endometriose  \navançada........................................................................................................42 \n         5.3.2 Comparação entre soro e o fluido folicular do grupo \nControle.........................................................................................................44 \n         5.3.3 Comparação entre o soro e o fluido folicular do grupo Endometriose \navançada........................................................................................................45 \n   5.4 Perfil de microRNAs em Vesículas Extracelulares obtidas do fluido \nfolicular.........................................................................................................45 \n   5.5 Análise de bioinformática dos microRNAs.........................................48 \n         5.5.1 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente \nexpressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo \nControle........................................................................................................48 \n         5.5.2 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente \nexpressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo \nEndometriose................................................................................................49 \n         5.5.3 Análise de enriquecimento dos microRNAs diferencialmente \nexpressos em Vesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres \ninférteis sem e com endometriose avançada (grupo Controle e \nEndometriose)...............................................................................................50 \n6 Discussão...................................................................................................52 \n7 Conclusões.................................................................................................64 \n   Referências................................................................................................65 \n   Anexo A.....................................................................................................83 \n     Anexo B.....................................................................................................85 \n     Anexo C.....................................................................................................95 \n \n \n \n\n 18 \n1 Introdução \n \n1.1 Endometriose \nA endometriose é uma doença ginecológica  inflamatória estrogênio  dependente \ncaracterizada pela presença de implantes endometriais (glândula e ̸ ou estroma) fora da cavidade \nuterina (Gupta et al., 2006).  Pode apresentar quadro clínico bastante diversificado, variando \ndesde assintomático até a presença de dor pélvica crônica, dismenorreia, dispareunia, \nsangramento uterino anormal e infertilidade (Bulletti et al., 2010). A prevalência da doença fica \nentre 10% a 15% entre as mulheres em idade reprodutiva (OMS) (OMS, 2021). No Brasil, \nestima-se que uma a cada dez mulheres sofr a com a endometriose de acordo com os dados do \nMinistério da Saúde  (MS, 2022) . Entretanto, essa prevalência tende a aumentar devido ao \navanço nas tecnologias de diagnóstico. É importante ressaltar que a doença é um problema de \nsaúde pública (OMS, 2021)  devido ao seu impacto negativo na qualidade de vida dessas \nmulheres, tanto na saúde física quanto na mental,  devido aos sintomas de dor incapacitante e \nao atraso em diagnosticar a doença . Além disso, há o impacto socioeconômico causado pela \neventual dificuldade de acesso aos métodos diagnósticos especializados  e pelo alto custo do \ndiagnóstico e do tratamento (Hughes et al., 2015; Zondervan et al., 2020).  \nA etiopatogenia da endometriose perm anece controversa . A teoria da menstruação \nretrógrada de Sampson é a mais aceita pela comunidade científica. Segundo essa teoria, \nocorreria o refluxo de células endometriais descamadas na menstruação  através das t ubas \nuterinas, com subsequente implantação e crescimento na cavidade peritoneal (Sampson, 1927). \nEmbora a teoria de Sampson explique o deslocamento físico dos fragmentos endometriais, \nobserva-se que, embora 70 a 90% das mulheres apresentem menstruação retrógrada,  apenas \numa minoria irá desenvolver a doença (Bricou & Chapron, 2008).  \nSendo assim, sugere -se que a combinação de fatores genéticos, hormonais, \nimunológicos e ambientais poderiam contribuir para maior suscetibilidade em desenvolver \nendometriose (Lamceva et al., 2023; Li et al., 2024; Bedrick et al., 2024). Muitos estudos têm \ntentado explicar fatores de risco e proteção para o desenvolvimento da doença, além de uma \nmelhor caracterização da população acometida. Fatores como  início precoce da menarca, \ngestações tardias, hábitos alimentares e estilo de vida estressante das grandes cidades foram \nassociados a um aumento no risco do surgimento da endometriose (Missmer et al., 2010; \nVitonis et al., 2010; Chapron et al., 2016). Enq uanto paridade, tabagismo, prática intensa de \natividade física e obesidade são considerados fatores protetores da doença devido ao aumento \nda taxa de anovulação crônica e a irregularidade menstrual (Cramer et al., 1986; Peterson et al., \n\n 19 \n2013; Chapron et al., 2016). Contudo, os mecanismos dessas associações ainda permanecem \nincertos e, portanto, devem ser interpretados com cautela.  Até pouquíssimo tempo atrás, a \nvideolaparoscopia (VLPSC) com biópsia das lesões para análise anatomopatológica era o \npadrão-ouro no diagnóstico da endometriose. Entretanto, a última diretriz da European Society \nof Human Reproduction and Embryology  (ESHRE) recomenda a VLPSC somente para \nmulheres com ultrassonografia pélvica transvaginal e ressonância magnética negativas, uma \nvez que esses exames vêm  demonstrando grande sensibilidade, especificidade e alto grau de \nconfiabilidade, principalmente, na identificação de focos de endometriose infiltrativa profunda \n(Abrão et al. , 2007) e endometriomas  (Moore et al. , 2002), e /ou falha nos tratamentos \nconvencionais já utilizados (Becker et al., 2022). \nA endometriose pode ser classificada de acordo com sua localização anatômica \n(peritônio, ovário ou septo retovaginal ), pelo tipo histológico dos implantes ou pela extensão \nda doença sobre os órgãos pélvicos. A classificação mais utilizada atualmente é a da American \nSociety of Reproductive Medicine (ASRM) que gradua a doença em 4 estágios: I – mínima, II \n– leve, III – moderada, IV – grave, de acordo com a severidade da doença (ASRM, 1997). Essa \nclassificação é útil porém possui limitações. No sentido de melhorar a associação entre a clínica \ne o estadiamento/classificação da doença, recentes avanços recomendam uma nova \nclassificação baseada nos tipos morfológicos da endometriose, dividindo -a em: endometriose \nsuperficial, endometrioma ovariano e endometriose profunda, sendo que esta última \nclassificação relaciona a doença com a sua fisiopatolo gia e também com a sintomatologia \napresentada (Nogueira Neto et al., 2022).  \n \n1.2 Endometriose e infertilidade \nA diminuição da fertilidade  em portadoras de endometriose não é totalmente \nestabelecida. Contudo, essa associação está fundamentada na alta prevalência da doença, \nidentificada em 25% a 50% das mulheres inférteis (Bulletti et al., 2010), sendo que 30% a 50% \ndas portadoras de endometriose têm dificuldade em ter filhos ( ASRM, 2012; Hodgson et al., \n2020). Sabe-se que a taxa de fecundidade mensal de casais normais em idade reprodutiva é \nestimada em torno de 15 % a 20%, enquanto a de mulheres com endometriose está estimada \nentre 2% e 10% (Hughes et al., 1993; Bulletti et al., 2010).  \nNos estágios avançados da doença (estágios III e IV e doença infiltrativa profunda), essa \nrelação, com frequência, tem sido associada a aderências pélvicas severas, que causam uma \ndiversidade de alterações anatômicas no trato reprodutivo e dessa forma pode m impedir a \nliberação oocitária pelo ovário ou a captação deste oócito pela tuba uterina (Bulletti et al., 2010). \n\n 20 \nTodavia, mulheres com endometriose avançada não necessariamente apresentam distorções \nevidentes da anatomia tubária, e, mesmo assim, apresentam maior risco de infertilidade do que \nmulheres sem a doença (Ruder et al., 2008; Daniilidis et al., 2022; Imperiale et al., 2023).  \nVários mecanismos têm sido propostos para esclarecer essa associação entre \ninfertilidade e endometriose, como alterações na resposta imunológica, na função peritoneal, \ndisfunções hormonais e na receptividade uterina e piora da qualidade oocitária (Da Broi et al., \n2019; Simopoulou et al., 2021). Entretanto, a patogênese da infertilidade relacionada a \nendometriose, não apenas nos estágios iniciais, mas também em estágios avançados, precisa ser \nmais bem compreendida.  \nA ocorrência de risco aumentado de baixa reserva ovariana em mulheres com \nendometriose moderada e severa (Seyhan et al., 2015) pode estar relacionada a indução , \nocasionada pelos focos endometriais ectópicos , de resposta inflamatória local, com \nrecrutamento de macrófagos, liberação de citocinas  e substâncias vasoativas , geração de \nespécies reativas de oxigênio  e aumento da atividade mitótica que levariam a um ambiente \npélvico adverso (Szczepánska et al., 2003; Gupta et al., 2006; Mansour et al., 2009 ; Miller et \nal., 2017). Como consequência, o microambiente peritoneal seria afetado levando a alterações \nno fluido peritoneal (FP) que poderia prejudicar a capacidade reprodutiva dessas mulheres \n(Gupta et al., 2008; Mansour et al., 2009; Mansour et al., 2010; Jianini et al., 2017). \nCorroborando com os achados citados acima, marcadores de estresse oxidativo (EO) foram \nencontrados alterados no FP de portadoras de endometriose avançada (Polak et al., 2013; \nSantulli et al., 2015), suger indo que o microambiente peritoneal está sob efeito pró -oxidante \nnessas mulheres. \nO estabelecimento do EO no FP pode ser refletido a nível sistêmico (Andrade et al., \n2010; Liu et al., 2013; Singh et al., 2013 ; Da Broi et al., 2016 a; Nasiri et al., 2017)  e, assim, \natingir os ovários  e afetar o desenvolvimento intrafolicular oocitário, uma vez que o córtex \novariano é altamente vascularizado, especialmente no final da foliculogênese (Tamanini & De \nAmbrogi, 2004). Portadoras de endometriose avançada, mesmo quando submetidas a técnicas \nde reprodução assistida, apresentam redução da implantação, menores taxas de gestação clínica \ne uma tendência a diminuição de nascidos vivos (Harb et al., 2013). \nUma boa forma de compreender os mecanismos inerentes à endometriose e como tais \nprocessos influenciam na diminuição do potencial reprodutivo dessas mulheres seria por meio \nda análise do microambiente folicular.  O microambiente folicular abriga os oócitos, de modo \nque alterações em sua composição podem ter efeitos adversos nos processos reprodutivos \n(Agarwal et al., 2005). \n\n 21 \n1.3 Endometriose e foliculogênese \nO ovário possui uma reserva de folículos ovarianos que são, periodicamente, recrutados \na se desenvolver. No início do desenvolvimento folicular, também chamado foliculogênese, o \nfolículo se encontra no estágio de folículo primordial, que é composto de um oócito quiescente \nenvolto por uma camada de células somáticas. No decorrer do processo, a proliferação e a \ndiferenciação das células somáticas foliculares em células da teca, células da granulosa (CG) e \ncélulas do cumulus (CC) ocorre em sincronia com as alterações morfológicas e endócrinas que \nocorrem no folículo, possibilitando o crescimento e o amadurecimento do oócito (Adonaab et \nal., 2012; da Broi et al.; 2018a). Concomitantemente, o oócito passa por processos que incluem \na maturação citoplasmática e, posteriormente, a nuclear, visando torná-lo competente (Sirard et \nal., 2006; Ferreira et al., 2009). Quando o oócito adquire competência oocitária, indica que ele \nestá apto para finalizar a sua maturação, ser fertilizado, gerar um embrião viável e um indivíduo \nsaudável (Dumesic et al., 2015; di Pietro, 2016).  \nParalelamente ao crescimento do folículo ovariano , ocorre o acúmulo de um líquido, \ncomposto por secreção das células foliculares e produtos do plasma sanguíneo que atravessam \na barreira hematofolicular , chamado fluido  folicular (FF) (Fortune, 1994). O FF é um \nmicroambiente metabolicamente ativo que contém uma grande variedade de moléculas como \nproteínas, peptídeos, aminoácidos, eletrólitos, açúcares, hormônios esteroides, fatores de \ncrescimento, fatores anti-coagulantes, espécies reativas de oxigênio, antioxidantes, entre outros \n(Revelli et al., 2009). O FF mantém íntima correlação com o oócito intermediando a \ncomunicação entre os vários tipos celulares presentes no folículo, atuando em um papel crítico \nno crescimento folicular, na maturação citoplasmática e nuclear oocitária (Hennet & Combelle, \n2012). Deste modo, a composição do FF pode ser um importante indicativo de qualidade \noocitária e embrionária pois reflete todo o metabolismo folicular. Ademais, por ser constituído, \nem parte, pelo exsudato plasmático pode ser modificado por doenças  com manifestações \nsistêmicas, como a endometriose, relacionada a presença de inflamação e EO peritoneal, \nfolicular e sistêmico (Da Broi et al., 2018b). \nEmbriões de boa qualidade (aqueles com habilidade para implantar e se desenvolver \nadequadamente) originam -se de oócitos competentes, que por sua vez, são originados de \nfolículos com um adequado microambiente, condicionado tanto pelo conteúdo do FF, como \npela influência das células vizinhas. Sendo assim, qualquer alteração nesse microambiente pode \nresultar em dano oocitário, e consequentemente, embrionário. \nEstudos do nosso grupo apontaram para a baixa reserva ovariana (Coelho Neto et al., \n2016) e a piora da qualidade oocitária como um fator importante relacionado à etiopatogenia \n\n 22 \nda infertilidade relacionada à endometriose (Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., 2009; Dib et \nal., 2013; Da Broi et al., 2014; Barcelos et al., 2015; Jianini et al., 2017). Interessantemente, \numa revisão sistemática e metánalise demonstrou que portadoras de endometriose com presença \nde endometrioma submetidas ao tratamento de reprodução assistida ( TRA), apresentaram \nnúmero significantemente menor de oócitos recuperados e de oócitos em metáfase II (MII)  \nquando comparadas às inférteis por fator masculino e/ou tubário (Alshehre et al., 202 1). \nAdemais, as taxas de implantação de embriões resultantes de oócitos doados por mulheres sem \nendometriose para o útero de portadoras da doença foram semelhantes às do grupo controle \n(Garrido et al., 2000). Esses achados podem indicar que os oócitos liberados por essas mulheres \npodem apresentar pior qualidade. \nUma das possíveis causas desses achados pode estar na comunicação intercelular \ndurante a foliculogênese (da Silveira et al., 2012). A comunicação intercelular é um importante \nevento fisiológico do sistema reprodutivo e envolve extensiva e afinada coordenação entre CG, \nFF, CC e oócito  (Dumesic et al., 2015) , e é essencial para o desenvolvimento do folículo, \nmaturação e aquisição de competência oocitária (Coticchio et al., 2015; da Broi et al., 2018a). \nOs mecanismos estabelecidos de comunicação intercelular incluem  a sinalização \nparácrina, a comunicação bidirecional por interação direta através das junções comunicantes, \ntambém conhecida como junções GAP (da Broi et al., 2018a), o transporte mediado por \nvesículas extracelulares (VEs) (Théry et al., 2002; da Silveira et al., 2012; Van Der Pol et al., \n2012) e mais recentemente descrito, a comunicação por contato através das VEs e junções GAP \npresentes na fenda das projeções transzonais (TZP) da zona pelúcida  (ZP) (Macaulay et al., \n2014; Maculay et al., 2016). Nos últimos anos, o transporte de moléculas através das VEs tem \ntido sua importância ressaltada  nas principais fases do processo reprodutivo , como na \ngametogênese feminina e masculina, e no estabelecimento d a gestação ( Burns et al., 201 4; \nRuiz‐González et al., 2015; Saadeldin et al., 2015; Burns et al., 2016; Bridi et al., 2021). \nVEs já foram relacionadas ao desenvolvimento folicular e maturação oocitária \n(Santonocito et al., 2014), fertilização (Barraud -Lange et al., 2007; Siciliano et al., 2008), \nimplantação embrionária (Ng et al., 2013; Burns et al., 2014), desenvolvimento embrioná rio \n(Varela et al., 2009; Burns et al., 2014; Burns et al., 2016), comunicação entre embrião e \nendométrio (Ng et al., 2013; Burns et al., 2014; Saadeldin et al., 2015; Burns et al., 2016), e, \naté mesmo, na comunicação entre embriões co-cultivados in vitro (Mellisho et al., 2017). \n \n \n \n\n 23 \n1.4 Vesículas extracelulares e qualidade oocitária \nSegundo a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), VE é o termo \ngenérico para caracterizar partículas naturalmente liberadas da célula que são delimitadas por \numa bicamada lipídica e não se replicam, ou seja, não contêm um núcleo funcion al (Théry et \nal., 2018). Atualmente, não há consenso sobre a classificação das VE s pois atribuir uma VE a \numa via de biogênese específica só é possível através da captura da VE no momento de sua \nliberação. A maioria dos autores usa as características físic as ( diâmetro e densidade), \ncomposição bioquímica e descrições de condições ou célula de origem das VE para classificá-\nlas. As VE s diferem em diâmetro e biogênese, o diâmetro varia entre 40 e 4000 nm e inclui \nexossomos, microvesículas e corpos apoptóticos (Théry et al., 2009). Sendo assim, o termo \n“vesícula extracelular (VE)” será utilizado para se referir às  vesículas com diâmetro de 40 a \n200nm (Théry et al., 2018). \nVEs são nanopartículas heterogêneas secretadas por diferentes tipos celulares (György \net al., 2011; Raposo & Stoorvogel, 2013; Machtinger et al., 2021) e possuem ações importantes \nem processos biológicos. Uma das possíveis vias de biossíntese das VEs é a part ir de corpos \nmultivesiculares (Multivesicular body – MVB) produzindo vesículas intraluminais (ILV) por \nendocitose. Mediante a fusão dos MVB com a membrana plasmática, as ILV são liberadas para \no meio extracelular (van Niel et al., 2018). VEs são liberadas no ambiente extracelular de forma \nconstitutiva em resposta a estímulos específicos, em situações fisiológicas e patológicas \n(Cocucci et al., 2009; El Andaloussi et al., 2013; Tannetta et al., 2014). O conteúdo transportado \npor VE varia com o tipo celula r que a produz, assim como o ambiente em que a célula se \nencontra (Machtinger et al., 2016). Essas vesículas são capazes de capturar diferentes tipos de \nmacromoléculas das células e transferi -las para outras células, induzindo modificações \nfuncionais nas células receptoras (Lee et al., 2012; Villarroya-Beltri et al., 2014; Nguyen et al., \n2016). \nOs mecanismos propostos na interação entre as VEs e as células receptoras, com a \nfinalidade de liberar o conteúdo das VEs, podem ocorrer por meio da ligação direta com \nreceptores de superfície celular ou produtos da clivagem das proteínas da membrana das VEs \ncom receptores de superfície da célula -alvo através da sinalização justácrina  (Mathivanan & \nSimpson, 2010), fusão direta e completa das VEs com a membrana plasmática da célula -alvo \n(Mathivanan & Simpson, 2010;  Mathieu et al., 2019; Bhagyashree et al., 2 020) e fusão “Kiss \nand run ”, mecanismo para a endocitose rápida no qual as vesículas extracelulares entram, \nbrevemente, em contato com a membrana plasmática da célula -alvo por meio de um pequeno \nporo de fusão (Wen et al., 2017) (Figura 1). \n\n 24 \nA especificidade das células receptoras parece ser dirigida por receptores específicos \nentre as células-alvo e as vesículas (Simon et al., 2018). A compartimentalização de compostos \né uma das características mais vantajosas da comunicação intercelular medi ada por VE pois \nprotege o conteúdo da vesícula da degradação enzimática mediada pelas enzimas presentes no \nmeio extracelular. Além do mais, permite o transporte de mais de um composto na mesma \nvesícula (Manning & Kuhen, 2013). Através das VE, diferentes moléculas como lipídios (Subra \net al., 2007), proteínas (Simpson et al., 2008) e ácidos nucléicos (DNA, mRNAs, RNAs não \ncodificantes, fragmentos de tRNA e miRNAs) (Valadi et al., 2007) podem ser transferidos de \ncélula para célula e transportados, através do sangue, por longas distâncias (Valadi et al., 2007; \nda Silveira et al., 2012, Andronico et al., 2019).  \n \nFigura 1: Mecanismos de comunicação intercelular entre vesículas extracelulares e célula-alvo. \n(A) Interação das proteínas da membrana das vesículas extracelulares com receptores de \nsuperfície da célula -alvo através da sinalização justácrina.  (B) Interação dos produtos da \nclivagem das proteínas da membrana das vesículas extracelulares com receptores de superfície \nda célula -alvo através da sinalização justácrina.  Esses mecanismos, por sua vez, ativa m a \ncascata de sinalização dentro da célula -alvo. (C) Transferência de moléculas, de maneira não \nseletiva, por meio da fusão direta entre vesículas extracelulares e célula -alvo. (D) Fusão “Kiss \nand run ”, mecanismo para a endocitose rápida no qual  as vesículas extracelulares entram, \nbrevemente, em contato com a membrana plasmática  da célula-alvo por meio de um pequeno \nporo de fusão. Fonte: adaptado de Mathivan & Simpson, 2010; Wen et al., 2017; Bhagyashree \net al., 2020. \n \nUma importante função atribuída às VEs é seu papel crucial na comunicação intercelular \ndentro do folículo ovariano (Hung et al., 2015). Até o momento, vários estudos têm isolado \nVEs do FF de equinos (da Silveira et al., 2012), bovinos (Sohel et al., 2013; Hung et al., 2015; \n\n\n 25 \nNavakanitworakul et al., 2016; Morales et al., 2019), suínos (Matsuno et al., 2019) e humanos \n(Santonocito et al., 2014; Machtinger et al., 2016). Tais VEs estão envolvidas tanto na regulação \nde vias que controlam o crescimento folicular e a resposta hormo nal, bem como na maturação \ncitoplasmática do oócito e na retomada da meiose (da Silveira et al., 2017).  \nEmbora, suponha-se que a maioria das VEs isoladas do FF, são secretadas pelas CG e \nCC (Figura 2), não se pode excluir que algumas dessas vesículas podem se originar de células \nda teca, dos oócitos, e até mesmo de tecido não ovariano (Machtinger et al., 2016). A atividade \nsecretória de comunicação entre células somáticas e oócitos  foi demonstrada por meio da \npresença de material bioativo de VEs isoladas do FF nas CG, nas CC (da Silveira et al., 2012), \nno complexo cumulus-oócito (COC) (Sohel at el., 2013) e n a extremidade próxima ao oócito \ndas TZP ( Macaulay et al. , 2014) indicando a tiva comunicação intercelular  entre as células \nsomáticas e o oócito e absorção do conteúdo das VEs no decorrer da maturação oocitária e do \ndesenvolvimento embrionário inicial in vitro.v \nA literatura já comprovou que a expansão do COC é um evento crítico para a adequada \novulação de um oócito competente (da Broi et al., 2018a). A presença de VEs, provenientes de \npequenos folículos antrais, parece induzir a expansão do COC in vitro (Hung et al., 2015). VEs \nisoladas do FF de folículos com 3 ± 6 mm, usadas como suplemento durante a maturação \noocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vitro , parecem melhorar o \ndesenvolvimento embrionário (da Silveira et al., 2017). Uma vez que os oócit os imaturos \npresentes em folículos em desenvolvimento precisam acumular RNA mensageiro (RNAm), \nsofrer maturação epigenética e adquirir competência oocitária para realizar o desenvolvimento \ninicial do embrião até a ativação do genoma embrionário, essa suple mentação parece regular \nparcialmente a expressão gênica, modificando os níveis de transcrição de genes relacionados \nao metabolismo e ao desenvolvimento embrionário inicial através da modulação de miRNAs, \nda metilação global e da hidroximetilação (da Silveira et al., 2017). \nAdemais, descobriu -se que VEs isoladas de pequenos, médios e grandes folículos \nbovinos foram similares no diâmetro. Em contrapartida, a concentração das VEs diminuiu \nprogressivamente com o aumento do diâmetro do folículo (Navakanitworakul  et al., 2016). \nEsses achados confirmam o papel de mediador da comunicação celular através das VEs no FF \n(da Silveira et al., 2012) transportando informações do FF para as células foliculares e oócito \ndurante o desenvolvimento oocitário, folicular e embrionário inicial (da Silveira et al., 2017).  \n \n\n 26 \n \nFigura 2: Vesículas extracelulares no folículo ovariano. Fonte: adaptado de Machtinger et al., \n2016. \nAtualmente, há um crescente interesse na caracterização das VEs do FF a fim de \nmelhorar a expansão das CC e a aquisição de competência oocitária (Neyroud et al., 2022). A \nmaioria das pesquisas direciona o foco do estudo para o FF pois, sua composição composta por \nhormônios, fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas é extremamente importante para o \ndesenvolvimento oocitário, mas também, devido à sua proximidade com o oócito, o conteúdo \ndo FF potencialmente pode refletir o estado fisiológico do oócito (di Pietro et al., 2016). Deste \nmodo, a análise dos componentes do FF pode fornecer informações úteis sobre a qualidade \noocitária e as vias envolvidas na diferenciação e no desenvolvimento folicular. De fato, \nqualquer alteração na composição bioquímica do F F estará, frequentemente, associada a \nalterações na qualidade dos oócitos. \n \n1.5 MicroRNAs e qualidade oocitária \nUm dos conteúdos mais bem caracterizados como constituintes das VEs na \ncomunicação intercelular são os microRNAs (miRNAs) (Navakanitworakul et al, 2016; \nNeyroud et al., 2022). A relação entre miRNAs e qualidade oocitária é amplamente estudada \nna literatura (Xu et al., 2011; Assou et al., 2013; Uhde et al., 2017; Matchinger et al., 2017; \nTesfaye et al., 2018). \nDevido às restrições éticas e escassez de oócitos humanos maduros doados para a \npesquisa, a maioria dos estudos relacionados à qualidade oocitária são realizados indiretamente \natravés da avaliação das CC e/ou do conteúdo do FF em modelos animais (revisado por Llobat, \n2021). O resultado é que vários processos reprodutivos e vias de sinalização são influenciados \n\n\n 27 \npelos miRNAs, incluindo o desenvolvimento folicular (da Silveira et al., 2012). Durante o \ncrescimento oocitário, as células foliculares são capazes de captar e transferir miRNAs, através \ndos componentes do microambiente folicular, regulando assim a prolife ração celular, o \ncrescimento e a maturação oocitária, atresia folicular, luteólise, fertilização e desenvolvimento \nembrionário inicial (da Silveira et al., 2018).  Deste modo, uma crítica regulação da expressão \ngênica deve ocorrer em vista de suportar o desenvolvimento da próxima geração (McGinnis et \nal., 2015). Estima-se que os miRNAs são capazes de regular 10 -50% da expressão gênica do \ngenoma humano (Lu & Clark, 2012). \nOs miRNAs são pequenas moléculas endógenas de RNA não -codificante com 17 a 25 \nnucleotídeos que estão envolvidos, em um nível pós-transcricional, na regulação da expressão \ngênica dos mais variados processos biológicos  (Lee et al., 1993; Wightman et al. 1993; \nSaliminejad et al., 2019). A primeira observação da existência destes pequenos RNAs foi \nrealizada em C. elegans (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993) . De acordo com o banco de \ndados da miRBase versão 22 (www.mirbase.org), atualmente, existem mais de 38 mil miRNAs \nidentificados e catalogados. Acredita-se que cerca de 60% do RNAm humano seja regulado por \nmiRNAs ( Ha & Kim, 2014 ), porém a função de muitos deles ainda não é totalmente \ncompreendida (Kozomara et al., 2018).  A localização dos miRNAs no genoma é variada, \npodendo estar localizados em regiões intrônicas ou exôgenicas de genes codificadores de \nproteínas ou em regiões intergênicas (revisto em Kim, 2005 ; Saliminejad et al., 201 9). Essa \ncaracterística permite que os miRNAs sejam evolutivamente conservados. \nA maioria dos miRNAs apresenta efeito inibitório na expressão  gênica, causado pelo \nimpedimento da tradução  proteica do RNA m-alvo. No entanto, quando o miRNA  se liga à \nregião promotora de um gene, seu efeito pode ser oposto, causando a ativação de sua expressão \n(Jorge et al., 2021).  O pequeno tamanho dos miRNAs e a tolerância de  complementariedade \nparcial com seu alvo permitem a interação com grande número de RNAms, ou seja, um único \nmiRNA pode regular vários RNAm -alvos. Assim como, vários miRNAs podem coope rar no \ncontrole da expressão gênica em um único RNAm (Saliminejad et al., 2019). Tal fato reforça a \nimportância dos miRNAs na regulação da expressão gênica em diversos processos biológicos \ne patológicos (Walayat et al., 2018). \nEm processos biológicos de modelos animais, o conteúdo de miRNAs provenientes de \nVE isoladas do FF de suínos difere e pode afetar o padrão de distribuição mitocondrial durante \na maturação oocitária (Gad et al., 2022). Em bovinos, VE isoladas de folículos pequenos (3 a 5 \nmm) apresentaram conteúdo de miRNAs que foram associados a genes relevantes para vias de \ndesenvolvimento celular, proliferação celular e apoptose indicando o estágio inicial do \n\n 28 \ncrescimento do folículo antral (Navakanitworakul et al., 2016). Já, VE isoladas de folículos \nmaiores (acima de 9 mm) apresentaram conteúdo de miRNAs que foram relacionados a genes \nenvolvidos em vias de resposta inflamatória, aumento da permeabilidade vascular e \nangiogênese (Navakanitworakul et al., 2016).  Em equinos, o perfil de express ão de miRNAs \nprovenientes de VEs isoladas do FF também estavam presentes nas GC e CC circundantes (da \nSilveira et al., 2012). Além disso, detectou -se três miRNAs que estavam expressos em \nquantidades significantemente maiores em VE isoladas do FF de éguas idosas quando \ncomparadas a éguas jovens (da Silveira et al., 2012). \nApesar da correlação encontrada em animais domésticos, evidências mais diretas s ão \nnecessárias para  estabelecer o conteúdo e possíveis papéis funcionais d as VE ao longo d o \ndesenvolvimento folicular humano. Além disso, resultados encontrados em modelo animal de \nmamíferos podem não ser, necessariamente, extrapolados para humanos e vice-versa, tornando \nimportante o estudo das VE do fluido folicular humano. \nAvanços na temática em humanos demonstram ser possível avaliar a expressão de \nmiRNAs provenientes de VE isoladas do microambiente folicular. Até o presente somente seis \nestudos avaliaram a expressão das VEs e seu conteúdo de miRNAs no FF humano (Sang et al., \n2013; Santonocito et al., 2014; Diez-Fraile et al. 2014; Machtinger et al., 2017; Martinez et al., \n2018; Zhang et al., 2021).  Desses estudos,  Sang e colaboradores (2013) reportaram 116 \nmiRNAs provenientes de VEs isoladas do FF de mulheres saudáveis submetidas ao TRA por \ninjeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) , Machtinger e colaboradores (2017) \ndetectaram 207 miRNAs e Martinez e colaboradores (2018), 22 miRNAs. Já Santonocito e \ncolaboradores (2014) evidenciaram 22 miRNAs diferencialmente expressos (hiperexpressos) \nprovenientes das VEs isoladas do FF comparados aos miRNAs provenientes das VE isoladas \ndo plasma das mesm as participantes da pesquisa. Semelhantemente aos achados encontrados \nem modelos equino (da Silveira et al., 2012), miRNAs provenientes de VEs isoladas do FF de \nmulheres com menos que 31 anos de idade estavam diferencialmente expressos dos encontrados \nnaquelas com mais que 38 anos de idade (Diez-Fraile et al. 2014). E para finalizar, Martinez e \ncolaboradores (2018) revelaram diferença nos miRNAs proven ientes VEs do FF de mulheres \nsubmetidas a estimulação ovariana para ICSI encontrados em oócitos que fertilizaram e \nfalharam em fertilizar, e Zhang e colaboradores (2021) identificaram que miRNAs provenientes \nde VEs isoladas do FF de mulheres submetidas a estimulação ovariana para ICSI estavam \ndiferencialmente expressos entre o FF de oócitos com alta e baixa qualidade. Quando \ncomparados aos miRNAs provenientes de VEs isoladas do FF do grupo de oócitos com alta \nqualidade, os miRNAs do FF de oócitos classificados como de baixa qualidade ( contagem de \n\n 29 \nfolículos antrais [CFA] menor que 10 e níveis de hormônio anti -mulleriano [AMH] abaixo de \n1.5 ng/mL), mostraram-se superexpressos (Zhang et al., 2021).  \nEsses resultados sugerem que as VE têm um importante papel em carregar miRNAs \nenvolvidos no desenvolvimento folicular, na retomada da meiose, na comunicação celular \ndentro do folículo ovariano, e também na ativação e/ou desenvolvimento embrionário inicial.   \nEssa crítica regulação envolve vias de sinalização que incluem TGF -ß e WNT (da Silveira et \nal., 2018). \nSabe-se que o  perfil de miRNAs difere significativamente entre pessoas saudáveis e \ndoentes (Sang et al., 2013; Schwarzenbach et al., 2014). Desde então, mudanças na expressão \nde miRNAs específicos foram observad as em uma variedade  de doenças, incluindo cânceres \nginecológicos (cervical, ovariano e endometrial)  (Srivastava et al., 2017), adenocarcinomas \n(Zhang et al., 2008), leiomiomas uterinos (Wang et al., 2007), síndrome de ovários policísticos \n(SOP) (Jiang et al., 2021), insuficiência ovariana precoce (IOP) (Zhou et al., 2021) e \nendometriose (Cosar et al., 2017), além de  distúrbios gestacionais, como pré -eclâmpsia e \nprematuridade (Traver et al., 2014; Santamaria et al., 2014).  \n \n1.6 Vesículas extracelulares e seu conteúdo de microRNAs na infertilidade relacionada à \nendometriose \nO interesse em conhecer o papel das VE na infertilidade relacionada à endometriose \nexpandiu, rapidamente, nos últimos anos (Machtinger et al., 2021; Zhou et al., 2021). Visto que \na presença de VE foi relatada no endométrio eutópico, nas lesões endometrióticas, no conteúdo \ndo endometrioma, no soro, no plasma e no FP de portadoras d a doença (Scheck et al., 2022), \nalguns estudos indicam que a comunicação intercelular mediada por essas vesículas contribui \npara desenvolvimento e progressão da endometriose (Harp et al., 2016; Sun et al., 2018; \nSchjenken et al., 2019).  Todavia, a maioria dos estudos direciona o foco para o endométrio \neutópico, as lesões endometrióticas  ectópicas e o endometrioma, explorando muito pouco o \nsoro e o plasma e ainda mais raramente o FP e o microambiente folicular.  \nApenas um único estudo avaliou a caracterização das VE quanto ao diâmetro e à \nquantificação no FP de mulheres com infertilidade secundária à endometriose (Nazri et al., \n2020). Essa avaliação evidenciou aumento na concentração de VE isoladas do FP de mulheres \ninférteis por endometriose nos estágios I e II comparadas a mulheres férteis tanto na fase \nproliferativa quanto na secretória do ciclo menstrual (Nazri et al., 2020). Apesar desse estudo \nnão ter avaliado o conteúdo de miRNAs das VE, o s achados sugerem q ue o envolvimento de \ncélulas inflamatórias seja mais proeminente nos estágios iniciais da doença em comparação aos \n\n 30 \nestágios mais tardios que, frequentemente, é caracterizado por lesões endometrióticas \nprofundas que já foram removidas do contato direto com o FP. O resultado é que essa \ncaracterística inflamatória do FP pode afetar os folículos ovarianos em desenvolviment o e, \nconsequentemente, interferir na qualidade oocitária (Chen et al., 2019; Nazri et al., 2020). \nVários estudos têm demonstrado que a qualidade oocitária tem importância significativa \nno comprometimento da fertilidade de mulheres com endometriose (Barcelos et al., 2009, Da \nBroi et al., 2014; Barcelos et al., 2015; Donabela et al., 2015; Da Broi & Navarro, 2016; da Luz \net al., 2017; da Luz et al., 2021, da Silva et al., 2021 ). A avaliação direta do oócito humano \nmaduro é eticamente complicada e é rara a sua doação para pesquisas que inviabilizam a sua \nutilização clínica. Deste modo, uma alternativa utilizada para avaliar a qualidade oocitária é por \nmeio de preditores indiretos como o FF e as CC (Dumesic et al., 2015;  Da Broi et al., 2018a). \nO FF e as CC são microambientes ativos com papel crucial na aquisição de competência \noocitária, além de manterem íntima correlação com o oócito (Dumesic et al., 2015;  Da Broi et \nal., 2018 a). Dados recentes da literatura apontam para a importância da comunicação \nintercelular mediada por VE na infertilidade relacionada à endometriose (Harp et al., 2016; \nSchjenken et al., 2019; Zhang et al., 2019; Huang et al., 2022; Wu et al., 2022).  Apenas um \núnico estudo detectou 21 miRNAs diferencialmente expressos em VE isoladas  do FP e do \nplasma de mulheres com infertilidade relacionada a endometriose. Esses miRNAs estavam \nenvolvidos em alterações do sistema imune e processos metabólicos (Khalaj et al., 2019). Esses \nachados sugerem que as VE do FP carregam um conteúdo de miRNAs diferente das VE isoladas \ndo plasma. \nApesar da existência de vários estudos sobre miRNAs e infertilidade associada a \nendometriose, grande parte deles estão direcionados para miRNAs circulantes, ou seja, não são \nmiRNAs provenientes de VE, que é o foco do nosso estudo. Em consequência disso, constata-\nse uma ausência na literatura de estudos investigando a potencial associação entre infertilidade, \nendometriose e qualidade oocitária, mediada pelo conteúdo de VE.  \nNeste contexto, a caracterização das VE em relação ao seu diâmetro em nanômetros \n(nm) e à quantificação de VE por mililitros (ml) no soro e no FF de mulheres com infertilidade \nrelacionada à endometriose torna nosso estudo pioneiro nesta temática. Ademais, a análise da \nexpressão de miRNAs provenientes de VE isoladas do FF de mulheres com infertilidade devido \nà endometriose ainda não foi explorada. Em consequência disso, o presente estudo será uma \nrealização inédita capaz de esclarecer vias metabólicas e mecanismos moleculares desregulados \nque estão relacionados com o papel da endometriose na infertilidade e seu impacto na aquisição \nde competência oocitária. \n\n 31 \n2 Objetivos \n \n2.1 Objetivos Primários \nCaracterizar e comparar o diâmetro, em nm, e a concentração de VEs por ml no soro de \nmulheres inférteis com endometriose avançada e com infertilidade por fator masculino \nsubmetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para realização de fertilização in vitro. \nCaracterizar e comparar diâmetro, em n m, e a concentração de VEs por ml no FF de \nmulheres inférteis com endometriose avançada e com infertilidade por fator masculino \nsubmetidas à EOC para realização de fertilização in vitro. \nComparar a expressão de 82 miRNAs maduros e precursores isolados d e VEs \nprovenientes do FF de mulheres inférteis com endometriose avançada e com infertilidade por \nfator masculino submetidas à EOC para realização de fertilização in vitro. \n \n2.2 Objetivos Secundários \nComparar o diâmetro, em n m, e a quantidade de VE por ml  entre o soro e o FF de \nmulheres com infertilidade por fator masculino submetidas à EOC para realização de \nfertilização in vitro.  \nComparar o diâmetro, em n m, e a quantidade de VE por ml entre o soro e o FF de \nmulheres inférteis com endometriose avançada submetidas à EOC para realização de \nfertilização in vitro. \nIdentificar os miRNAs em VE do FF entre os grupos controle infértil sem endometriose \ne infértil por endometriose avançada. Predizer as vias metabólicas nas quais esses miRNAs \npossam estar envolvidos.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 32 \n3 Casuística e Métodos  \n \n3.1 Considerações éticas \nO projeto foi aprovado pela Comissão de Pesquisa do DGO da FMRP da USP, pela \nComissão de Ética em Pesquisa (CEP) do HC/FMRP/USP sob número do parecer: 5.793.443 e \nCAAE: 64403022.3.0000.5440. \n \n3.2 Desenho do estudo e local realizado \nTrata-se de um estudo  observacional caso -controle não multicêntrico desenvolvido \njunto ao Setor de Reprodução Humana, do D epartamento de Ginecologia e Obstetrícia da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (DGO/F MRP/USP), \nque incluiu pacientes no período de novembro de 2018 a dezembro de 2022 . O recrutamento \ndas participantes da pesquisa, a  coleta e o preparo do material foram realizados no Centro de \nReprodução Humana (CRH) do Hospital das Clínicas da F MRP/USP (HCFMRP/USP). Os \nprocedimentos de isolam ento, caracterização e avaliação da quantificação de VE por ml e \ndiâmetro das VE em nm, e a análise do perfil de miRNA isolados das VEs das amostras de soro \ne FF foram feitos no Laboratório de Morfofisiologia Molecular do Desenvolvimento (LMMD) \ndo Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de \nAlimentos (FZEA) , Ca mpus Fernando Costa da Uni versidade de São Paulo (USP), \nPirassununga, São Paulo. \n \n3.3 Participantes e Critérios de Elegibilidade \nMulheres com infertilidade  que preencher am os critérios de elegibilidade, foram \nconvidadas a participar do estudo no dia de início do ciclo de estimulação ovariana para ICSI , \napós a realização do ultrassonografia transvaginal ( UStv). As pacientes que concordaram em \nconceder as amostras de sangue periférico  e FF assinaram o termo de consentimento livre e \nesclarecido (TCLE) previamente à inclusão no estudo. Como rotina do serviço de Reprodução \nHumana, todas as pacientes são clinicamente examinadas para determinar o fator de \ninfertilidade e somente foram incluídas pacientes que foram submetidas aos protocolos de EOC \ndefinidos no estudo  para a realização de ICSI. Para este estudo, as participantes da pesquisa  \nforam divididas no grupo endometriose  e grupo controle infértil (fator masc ulino de \ninfertilidade). \n Foram consideradas elegíveis as pacientes com idade inferior a 40 anos, índice de massa \ncorporal ( IMC) entre 18,5 kg  ̸m2 e 30 kg  ̸m2, sem quaisquer outras condições patológicas \n\n 33 \nassociadas como dislipidemia, doenças autoimunes, SOP, neoplasias malignas, IOP, \nanovulação crônica, hidrossalpinge , doença cardiovascular, doenças reumatológicas, doenças \nrenais, hepatopatias, doenças crônicas como diabetes melittus e outras endocrinopatias (exceto \nhipotireoidismo controlado com TSH menor que 2,5UI/ml ), infecção pelo vírus HIV, \nhipertensão, qualquer infecção ativa, tabagismo ou uso crônico de medicações \nantidislipidêmicas, hormonais, anti-inflamatórios hormonais e não hormonais e medicamentos \ncomo tiazídicos, betabloqueadores e corticoides nos três meses anteriores à inclusão no estudo. \nNo grupo endometriose foram elegíveis pacientes com infertilidade associada \nexclusivamente à endometriose, diagnosticada por VLPSC nos estágios III e IV ou com doença \ninfiltrativa profunda diagnosticada por VLPSC, UStv ou ressonância magnética pélvica, sem \nendometrioma ovariano no ciclo de participação no estudo. O  grupo controle foi constituído \npor pacientes sem  diagnóstico de endometriose (sem quadro clínico e exames de imagem \nsugestivos da doença) e que apresent avam infertilidade por fator masculino. Com o fator \nmasculino foi considerado a presença de contagem total de espermatozoides mó veis (CTEP) \nmenor que 10 milhões. A CTEP foi obtida pela multiplicação do volume da ejaculação em \nmililitros pela concentração de espermatozóides e a proporção de espermatozóides com \nmotilidade progressiva dividida por 100% (Smith et al., 1977; Ayala et al., 1996; Hamilton et \nal., 2015).  \nForam excluídas as participantes da pesquisa  que, após o recrutamento, for am \nsubmetidas a protocolos de EOC distintos dos propostos para o estudo, que utilizar am a \nmedicação incorretamente ou que ti veram o ciclo cancelado e não realizar am captação \noocitária. \n \n3.4 Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea \nCom o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de EOC foi utilizada a \nprogramação da menstruação, por meio do uso de  anticoncepcionais orais combinados \ndiariamente, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto \npara o início da estimulação ovariana. \nA EOC foi iniciada cinco dias após a interrupção dos contraceptivos orais combinados \nusados para a programação do ciclo. Todas as mulheres foram monitorizadas apenas por UStv \n(Martins et al., 2014), submetidas ao protocolo flexível com antagonista do hormônio liberador \nde gonadotrofinas ( GnRH) e a EOC foi realizada de acordo com um dos três protocolos \ndescritos a seguir: \n\n 34 \n- Protocolo flexí vel com antagonista e alfacorifolitropina (Elonva®, Schering -Plough, \nBrasil). Cinco dias após a interrupção do contraceptivo oral combinado foi administrada a \nalfacorifolitropina na dose de 100 mcg para participantes da pesquisa com até 60kg e 150 mcg \npara participantes da pesquisa  com mais de 60kg. Seis dias após a administração da \nalfacorifolitropina foi realizada a primeira US tv para monitorização do ciclo. O bloqueio \nhipofisário foi realizado com antagonista do GnRH (Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, \nBrasil ou Orgalutran®, Merck & Co), iniciado quando houve um folículo com tamanho médio \n≥ 14 mm e mantido até o dia da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) \n(Ovidrel®, Serono, Brasil). No oitavo dia após a administração da alfacorifolitropina, as \nparticipantes da pesquisa  que não apresentar am critério para uso do hCG recombinante, \niniciaram o uso diário de gonadotrofinas (150 -300 IU/dia), usadas até a véspera do dia de uso \ndo hCG.   \n- Protocolo flexível com antagonista e hormônio folículo estimulante (FSH) recombinante \n(FSHr) (Gonal-F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil). Cinco dias após a interrupção \ndo contraceptivo oral combinado foi administrado FSHr, 150 a 300 UI por dia, durante os seis \nprimeiros dias da EOC. A partir do sétimo dia EOC, a dose foi ajustada de acordo com o \ncrescimento folicular, monitorado com US tv diariamente ou em dias alternados e mantida até \na véspera do dia de uso do hCG. O bloqueio hipofisário foi realizado com antagonista do GnRH \n(Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, Brasil ou Orgalutran®, Merck & Co), iniciado \nquando houve um folículo com tamanho médio ≥ 14 mm e mantido até o dia da administração \nda hCG (Ovidrel®, Serono, Brasil). \n- Protocolo flexível com antagonista e hpHMG (Menopur©, Ferring, Aalst, Belgium ou \nPergoveris). Cinco dias após a interrupção do contraceptivo oral combinado foi administrado \nhpHMG 225 a 300 UI por dia, pela via subcutânea, durante os seis primeiros dias da EOC. O \nmonitoramento do crescimento folicular  foi realizado por US tv a cada dois dias. O bloqueio \nhipofisário foi realizado com antagonista do GnRH (Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, \nBrasil ou Orgalutran®, Merck & Co), iniciado quando houve um folículo com tamanho médio \n≥ 14 mm e mantido até o dia da administração da  hCG, que foi realizada com a injeção \nsubcutânea de uma ampola de hCG recombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil), no dia seguinte \n(em torno das 22-23h) à observação de um folículo ≥ 16 mm, ou no dia da observação de um \nfolículo ≥ 18 mm.  \nQuando pelo menos dois folículos atingiram 17 mm de tamanho médio, foi administrado \n250 µg de hCG recombinante neste dia ou no dia seguinte às 22:00. A captação dos oócitos foi \nrealizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante.  \n\n 35 \nA suplementação da fase lútea foi realizada com progesterona natural micronizada \n(Utrogestan®, Besins Healthcare, Brasil) por via vaginal na dose de 200mg, três vezes ao dia, \na partir do dia da captação oocitária e mantida até a décima segunda semana da gestação, nas \nparticipantes da pesquisa que engravidaram. \n \n3.5 Delineamento experimental \n3.5.1 Coleta e armazenamento das amostras \nPara a aspiração folicular , as participantes da pesquisa foram submetidas a sedação \nendovenosa com propofol (Diprivan®, Zeneca -Astra, Brasil)  e fentanil (Fentanil®, Jansen -\nCilag, Brasil). O FF e os COCs foram aspirados por via endovaginal, guiada por um transdutor \nde ultrassom transvaginal. Uma agulha padrão de lúmen único (Wallace, Smiths Medical, \nMexico) foi usada, com pressão aspirativa artificial constante de 100mmHg , obtida com uma \nbomba de sucção controlada eletronicamente (Craft® Bomba de sucção, Rocket Medical, \nInglaterra).  \nO FF coletado em cada tubo foi analisado em estereomicroscópio e, após a identificação \ne remoção dos COCs , foi separado. As amostras de FF usadas na pesquisa foram  obtidas \njuntando-se todo o FF obtido  de todos os folículos  puncionados de cada pa rticipante da \npesquisa, originando um pool de FF. O pool de FF foi reunido em tubos estéreis, individuais, \naquecidos a 37°C, sem meio de cultura. Imediatamente após a coleta, as amostras de FF foram \ncentrifugadas à 800xg por 10 minutos à 4°C para a separação do líquido de interesse dos debris \ncelulares e armazenadas a -80°C para posterior isolamento e caracterização das VE. \nAs amostras de sangue foram coletadas no momento da punção venosa para \nadministração da sedação. As amostras de sangue foram deixadas em temperatura ambiente por \n20 minutos para que se efetuasse a coagulação. Em seguida, foram centrifugadas duas vezes à \n1000 x g por 10 minutos à 4°C para a separação do soro. O soro foi, imediatamente, transferido \npara microtubos e armazenados a -80°C para posterior isolamento e caracterização das VE. \n \n3.5.2 Isolamento das Vesículas Extracelulares \nVE menores de 200nm (semelhantes a exossomos), foram obtidas do soro e FF. 1ml \ndessas amostras de cada participante da pesquisa de ambos os grupos, endometriose e controle, \nforam descongeladas à temperatura ambiente por 5 minutos  e passaram por centrifugações \nseriadas. A primeira centrifugação foi de 300 x g por 10 minutos à 4°C para a retirada de células. \nO sobrenadante foi retirado e adicionado novos microtubos que foram centrifugados em 2000 \nx g por 10 minutos à 4°C para retirada de debris celulares. Novamente, o sobrenadante foi \n\n 36 \nretirado e adicionado a novos microtubos que foram centrifugados em 16.500 x g por 30 \nminutos à 4°C para a separação das VEs pequenas (exosossomos) e microvesículas (MV). \nApós a centrifugação seriada, as MV foram armazenadas a -80°C. O sobrenadante, que \ncorresponde à VEs pequenas, foi transferido para microtubos e filtrado em filtro com poro de \n0,22µm (Kasvi). Em seguida, foi ultracentrifugado a 119.700 x g por 70 minutos à 4°C (Optima \nXE-90 Ultracentrifuge; rotor 70 Ti; Beckman Coulter). Após a primeira ultracentrifugação , o \npellet foi diluído em 2 ml  de tampão fosfato -salino (1xPBS) livre de cálcio e magnésio e \nultracentrifugado, novamente, a 119.700 x g por 70 minutos à 4°C. O pellet (Figura 3) obtido a \npartir da segunda centrifugação foi diluído em 50μl de 1xPBS livre de cálcio e magnésio, 20ul \nfoi transferido para microtubos destinados à análise de miRNA e armazenado a -80°C, e 10ul \nfoi destinado à análise do diâmetro e da concentração das VE. \n \nFigura 3: Figura esquemática representando o protocolo de centrifugações seriadas para \npreparo de fluidos para posterior isolamento de vesículas extracelulares. Fonte: própria autoria. \n \n3.5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares  \nA suspensão de VE isoladas do soro e FF foi analisada pela metodologia de rastreamento \nde nanopartículas (NTA). A NTA é uma metodologia óptica de visualização e caracterização \nde nanopartículas amplamente utilizada nas pesquisas tratando com VEs (V an der Pol et al., \n2012). \n3.5.3.1 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) \n Para estimar o diâmetro (média das modas)  e a quantificação das VE, 10µL da \nsuspensão de VEs isoladas foi diluído em 50µL de 1xPBS livre de cálcio e magnésio. A análise \ndas VEs  foi realizada no  aparelho Nanosight® (NS300; NTA 3.1 Build 3.1.45; Mal Vern) \natravés da captura de 5 vídeos de 30 segundo s para cada amostra. Os parâmetros utilizados \nforam:  fator de diluição utilizado para leitura foi de 7.1x10, tipo de câmera sCMOS, camera \nlevel 13, velocidade de bombeamento da seringa 60  e temperatura controlada a 37°C. As \nanálises foram realizadas considerando um threshold 5. \n \n \n\n\n 37 \n \n3.5.4 Extração de RNA das Vesículas Extracelulares  \n O conteúdo de RNA total das VE, incluindo os miRNAs, foi extraído usando o protocolo \nQIAzol® (QIAzol®Lysis Reagent, Qiagen, EUA), segundo instruções do fabricante, com \nadição do coprecipitante GlycoBlue® (15µg/mL, Thermo Fisher Scientific) para aumentar a \nprecipitação de RNA. O protocolo QIAzol® combina a lise do Qiazol com métodos padrão de \nhomogeneização e precipitação com isopropanol. O pellet de RNA total foi ressuspendido em \n10µL de água livre de RNAse e DNAse.  \n As concentrações (ng/µL) foram determinadas por espectrofotometria por meio do \nespectrofotômetro NanoDrop® 2000 (Thermo Fisher Science). Resumidamente, 1µL da \nsuspensão de RNA total foi utilizada para a quantificação do RNA. Para evitar a contaminação \ncom DNA, 9 µL da suspensão de RNA total de cada amostra foi tratada com DNAse I \n(Invitrogen. Thermo Fisher Scientific, EUA & Canadá) segundo as instruções do fabricante.  \n \n3.5.5 Transcrição Reversa \nPara obtenção do cDNA de miRNAs foi realizada a transcrição reversa utilizando o kit \ncomercial microscript microRNA cDNA Synthesis Kit (Norgen, Biotec Corp., Canadá) . \nResumidamente, 5µL do 2x Reaction Mix; 0,5µL da TruScript microRNA Enzyme Mix e 4,5µL \nda suspensão de RNA total de cada amostra foram incubadas em termociclador ProFlex™ PCR \nSystem (Life Technologies, EUA) seguindo as instruções do fabricante: 30 minutos incubação \nà 37°C, seguido por 30 minutos à 50°C e 15 minutos  à 70°C. O resultado obtido pa ra cada \namostra foi 10 µL de reação contendo concentração entre 80 e 120 ng totais de RNA total. \n \n3.5.6 Análise da expressão relativa dos microRNAs por Reação em Cadeia da \nPolimerase em Tempo Real (RT – PCR) \nA amplificação de 82 miRNAs em VE do FF de mulheres inférteis com e sem \nendometriose foi avaliada por  RT-PCR. Para obter os miRNAs fo ram selecionados  apenas \nprimers de miRNAs relacionados à qualidade oocitária e que já foram identificados em outros \ntecidos de portadoras de endometriose, como endométrio eutópico, lesões peritoneais, \nendometrioma, soro, plasma e FP (Anexo A). \nRT-PCR foi realizado usando o kit GoTaq® qPCR Mastex Mix ( Promega, EUA), \nUniversal PCR Reverse Primer, água livre de RNA, microRNA cDNA e microRNA específicos \nFoward Primer (5 µM) (todos da Norgen Biotek Cop., Canadá), totalizando reações de 6 μl. \n\n 38 \nAs amplificações foram realizadas no equipamento QuantStudio 6 Flex (Life \nTechnology). As temperaturas e tempos utilizados foram 95°C por 5 minutos para o início da \ndesnaturação das fitas de cDNA seguido de 45 ciclos de 95°C por 10 segundos para \ndesnaturação, 60°C por 30 segundos para anelamento dos primers e 70°C por 30 segundos para \nextensão, quando ocorre a captação da fluorescência. A amplificação foi confirmada pela \nanálise da curva de melting.  \n \n3.5.7 Cálculo da expressão relativa dos microRNAs  \nPara análise dos miRNAs das VEs obtidas do FF, Cycle threshold (CT) maior que 37 \nforam excluídos. Os valores brutos de CT foram normalizados utilizando o Hm/Ms/Rt T1 \nsnRNA. As amostras foram avaliadas quanto à repetibilidade dentro de cada grupo. Os miRNAs \nforam considerados presentes apenas quando observados em pelo menos 50% amostras do \nmesmo grupo. Os miRNAs identificados em ambos os grupos foram comparados através das  \nmédias de expressão relativa de cada miRNA dos dois grupos. Para saber a expressão \ndiferencial dos miRNAs, os níveis de transcritos foram calculados usando o método 2 -∆CT \n(Schmittgen & Livak, 2008). \n \n3.5.8 Enriquecimento funcional  \nPara identificação das vias relacionadas, os miRNAs encontrados foram inseridos n o \nsoftware de predição miRPath v.4 da plataforma DIANA Tools \n(http://62.217.122.229/app/miRPathv4). O DIANA-miRPath permite identificar,  com alta \nprecisão, interações de miRNA s preditos experimentalmente baseado no DIANA-TargetScan \nv.8 e miRBase v.22.1 ( Tastsoglou et al., 2023). A  análise de enriquecimento dos múltiplos \ngenes-alvos comparando o conjunto de miRNAs para todas as vias conhecidas na base de dados \nKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEEG) (P-value threshold 0.05). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 39 \n4 Análise Estatística \nPara a comparação das características clínicas das participantes da pesquisa como idade, \nIMC, FSH, CFA, tempo de infertilidade , número de oócitos captados, número de oócitos \nmaduros, número de oócitos fertilizados, tempo da EOC, número de embriões em D2, número \nde embriões em D3, número de blastocistos, número total de embriões formados, número de \nembriões transferidos a fresco , número de embriões vitrificados , presença ou ausência de \ntransferência a fresco e tipo de infertilidade entre os grupos endometriose avançada e controle \ninfértil foi usado a média dos dados e o desvio padrão (DP) com p referente ao teste paramétrico \npara dua s amostras independentes , teste t  de Student (p < 0,05). A análise estatística foi \nrealizada utilizando-se o programa SAS® 9.3 \nPara a análise do diâmetro e da quantificação das VEs foi aplicado o teste t de Student. \nAs análises foram realizadas no programa SAS® 9.3. Para análise dos miRNAs exclusivos das \nVEs obtidas do FF em cada grupo fo i utilizado o Diagrama de Venn.  A expressão relativa de \ncada miRNA dos dois grupos foi comparada através das médias dos grupos utilizando teste t de \nStudent considerando 5% de probabilidade. A expressão diferencial dos miRNAs foi calculada \natravés do Fold Change (FC), considerando log2 FC ≥ 1.5 e p < 0.05, por meio da plataforma \nMetaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).  \nA análise de enriquecimento foi realizada com o software de predição miRPath v.4 da \nplataforma DIANA Tools ( http://62.217.122.229/app/miRPathv4) e do banco de dados Kyoto \nEncyclopedia of Genes and Genomes (KEEG) (P-value threshold 0.05). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 40 \n5 Resultados \n \n5.1 Fluxograma do estudo \n No período de novembro de 2018 a dezembro de 2022 foram analisados um total de \n1303 prontuários de mulheres admitidas por infertilidade conjugal no Serviço de Reprodução \nAssistida do CRH -HCFMRP-USP. Dessas mulheres, 1256 não atenderam os critérios de \nelegibilidade. Assim, as 47 elegíveis para participação no estudo foram entrevistadas, 7 não \naceitaram participar do estudo e 40 assinaram o TCLE (Anexo B), sendo  20 do grupo \nendometriose avançada e 20 do grupo controle. Dessas 40, 5 do grupo endometriose tiveram o \nciclo cancelado  por apresentarem má resposta ovariana . Desta forma, obtivemos soro e FF \ndoados por 20 mulheres do grupo controle (infértil por fator masculino) e 15 do grupo \nendometriose avançada. Amostras de soro e FF de 5 mulheres do grupo endometriose  avançada \nforam perdidas devido a um problema no freezer -80°C no período da pandemia de COVID-19 \nem que o CRH -HCFMRP-USP esteve fechado. Finalizando, as análises foram realizadas em  \n20 participantes da pesquisa com infertilidade conjugal exclusiva por  fator masculino  \nrepresentando o grupo Controle e em 10 participantes da pesquisa com infertilidade relacionada \nà endometriose avançada configurando o grupo endometriose . O fluxograma do estudo está \nrepresentado na figura 4. \n \n \n \n \n\n 41 \n \nFigura 4: Fluxograma do estudo. Total de participantes da pesquisa avaliadas quanto a \nelegibilidade, elegíveis, incluídas e excluídas no estudo. Divisão nos Grupos Controle e \nEndometriose avançada. \n \n5.2 Caracterização das participantes da pesquisa \nA comparação entre os grupos Controle e Endometriose  avançada não evidenciou \ndiferenças estatisticamente significa tivas em relação às características clínicas das pacientes: \nidade, IMC, FSH, CFA, tempo de infertilidade (meses), tempo da EOC (dias), número de \noócitos captados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados, número total de \nembriões formados,  número de embriões em D2, número de embriões em D3, número de \nblastocistos, número de embriões transferidos a fresco  e número de embriões vit rificados \nconforme apresentado na Tabela 1.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n 42 \nTabela 1: Características clínicas das pa rticipantes da pesquisa do grupo controle e do grupo \nendometriose Avançada. \nVariável Endometriose \nn= 10 \nControle \nn= 20 \nP \nIdade (anos) 36.60 (3.31) 35.90 (3.01) 0.5653 \nIMC (kg/m2) 24.20 (3.20) 25.29 (2.75) 0.3404 \nFSH (mIU/mL) 6.58 (1.97) 6.15 (3.98) 0.7632 \nCFA 10.60 (8.44) 13.65 (6.26) 0.2723 \nTempo de infertilidade (meses) 76.80 (40.99) 66.90 (42.26) 0.5463 \nTempo de EOC (dias) 11.00 (2.11) 10.85 (1.79) 0.8395 \nN° de oócitos captados 7.20 (2.70) 6.10 (3.65) 0.4075 \nN° de oócitos maduros 5.70 (2.87) 5.00 (3.34) 0.5763 \nN° de oócitos fertilizados 3.80 (2.39) 3.20 (3.09) 0.5953 \nN° de total de embriões formados 3.00 (1.94) 2.35 (2.16) 0.4292 \nN° de embriões em D2 3.30 (1.89) 3.05 (2.93) 0.8086 \nN° de embriões em D3 2.90 (2.33) 2.55 (2.91) 0.7438 \nN° de blastocistos 0.30 (0.95) 0.35 (1.35) 0.9174 \nN° de embriões transferidos a fresco 0.80 (0.92) 0.75 (0.97) 0.8930 \nN° de embriões vitrificados 2.20 (2.35) 1.45 (2.14) 0.3880 \nNota. Dados expressos como média (desvio padrão), p referente ao teste t de Student para duas \namostras independentes (p < 0,05). Endometriose nos estágios avançada; IMC: índice de massa \ncorporal; FSH: hormônio folículo estimulante; CFA: contagem de folículos antrais; OO: \noócitos; EOC: estimulação ovariana controlada. A análise estatística foi realizada utilizando-se \no programa SAS® 9.3. \n \nA comparação entre os grupos Controle e Endometriose avançada também não \nevidenciou diferenças estatisticamente significativas em relação ao tipo de infertilidade, \nprimária ou secundária, (p = 0.4475) e presença de embrião top transferido (p = 0.7703).  \n \n \n\n 43 \n5.3 Caracterização das Vesículas Extracelulares  \n As VE obtidas a partir do isolamento do soro e FF foram mensuradas e contabilizadas \npor NTA. O diâmetro médio, em nanômetros, das partículas no soro e no FF dos grupos \nControle e Endometriose avançada estavam de acordo com o esperado para VEs.  \n \n5.3.1 Comparação entre os grupos Controle e Endometriose avançada \nA quantificação de VEs por ml e o diâmetro das VEs, em nm, no soro não apresentaram \ndiferença entre os grupos (p = 0.3412 e p = 0.1954, respectivamente) (Tabela 2). \n \nTabela 2: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no soro dos grupos Controle e \nEndometriose avançada. \n \nVariável Endometriose Controle P \nQuantificação (VE/ml) 6,67x109 (2,06 x109) 7,5x109 (2,04 x109) 0.3412 \nDiâmetro (nm) 153.13 (18.88) 153.55 (15.87) 0.1954 \nNOTA: Dados expressos como média (desvio padrão). Teste t de Student para duas amostras \nindependentes. Nível de significância  de 95%. Endometriose: mulheres inférteis por \nendometriose avançada. Controle: mulheres inférteis fator masculino sem endometriose . \nDiâmetro = média das modas.  \n \nA quantificação de VEs por ml no FF não demonstrou diferença entre os grupos (p = \n0.5132). Todavia, o diâmetro das VEs, em nanômetros, no FF foi significativamente maior no \ngrupo endometriose avançada comparado ao controle (Tabela 3).  \n \nTabela 3: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares no fluido folicular dos grupos \nControle e Endometriose avançada. \n \nVariável Endometriose Controle P \nQuantificação (VE/ml) 9,71x109 (4,38x109) 8,77x109 (2,6 x109) 0.5132 \nDiâmetro (nm) 162.24 (12.34) 155.08 (15.30) 0.0405 \nNOTA: Dados expressos como média (desvio padrão). Teste t de student para duas amostras \nindependentes. Nível de significância  de 95%. Endometriose: mulheres inférteis por \nendometriose avançada. Controle: mulheres inférteis sem endometriose. Diâmetro = média das \nmodas. \n \n \n \n\n 44 \n5.3.2 Comparação entre soro e o fluido folicular do grupo Controle \nA concentração e o diâmetro das VE no grupo Controle não apresentaram diferença  \nsignificativa (p < 0.05) entre o soro e o FF (p = 0.0896 e p = 0.7579, respectivamente). \n \n5.3.3 Comparação entre soro e fluido folicular do grupo Endometriose avançada \n A quantificação de VE por ml e o diâmetro das VE em nanômetros no grupo \nEndometriose foram estatisticamente maiores no FF quando comparadas ao soro (Tabela 4).   \n \nTabela 4: Quantificação e diâmetro das vesículas extracelulares entre soro e fluido folicular do \ngrupo Endometriose avançada. \n \nVariável Soro Fluido Folicular P \nConcentração 6,67x109 (2,06x109) 9,7x109 (4,38 x109) 0.0334 \nDiâmetro 153,55 (18,88) 162.24 (12,34) 0.0021 \nNOTA: Dados expressos como média (desvio padrão). Teste t de student para duas amostras \npareadas. Nível de significância  de 95%. Endometriose: mulheres inférteis por endometriose \navançada. Diâmetro = média das modas. \n \n5.4 Perfil de microRNAs em Vesículas Extracelulares obtidas do fluido folicular \n O perfil de miRNAs das VE obtidas do FF foi avaliado utilizando um painel \ncustomizado contendo as sequências de 82 miRNAs. Foram detectados 73 miRNAs nos dois \ngrupos. Desses, 59 foram comuns em ambos os grupos, 1 foi exclusivo do grupo controle e 13 \nforam exclusivos do grupo endometriose avançada (Figura 5). \n \n \n \n \n\n 45 \n \nFigura 5: Diagrama de Venn representando a intersecção dos 73 microRNAs provenientes das \ncomparações entre as vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis \ncom e sem endometriose. \n \n Entre os 59 miRNAs presentes em ambos os grupos, 24 estavam diferencialmente \nexpressos entre os grupos ( |log2 FC|  ≥ 1.5 e p < 0.05), sendo todos elevados no grupo \nendometriose avançada (Tabela 5 e Figura 6). \n \nTabela 5 : microRNAs diferencialmente expressos em vesículas extracelulares  isoladas do \nfluido folicular de mulheres inférteis com endometriose avançada comparadas aos controles  \ninférteis sem endometriose. \nmiRNA p value Fold Change (FC) Status \nmiR-24-3p 0.0008 6.6464 Hiperexpressos \nmiR-145-5p 0.0165 6.0871 Hiperexpressos \nmiR-151-3p < 0.0001 5.7267 Hiperexpressos \nmiR-206 0.0043 5.705 Hiperexpressos \nmiR-141-3p 0.0424 5.4108 Hiperexpressos \nmiR-885-5p < 0.0001 5.0663 Hiperexpressos \nmiR-214-3p < 0.0001 4.9985 Hiperexpressos \nmiR-21-5p 0.0327 4.9303 Hiperexpressos \n\n\n 46 \nmiR-31-5p 0.0008 4.7659 Hiperexpressos \nmiR-139-5p 0.00025 4.7206 Hiperexpressos \nmiR-330-3p 0.0004 3.8784 Hiperexpressos \nmiR-185-5p 0.0053 3.6476 Hiperexpressos \nmiR-127-3p < 0.0001 3.5234 Hiperexpressos \nmiR-425-3p 0.0019 3.3947 Hiperexpressos \nmiR-504-3p 0.0264 3.3922 Hiperexpressos \nmiR-378a-3p < 0.0001 2.9698 Hiperexpressos \nmiR-490-3p 0.0009 2.9432 Hiperexpressos \nmiR-92a-3p 0.0228 2.8707 Hiperexpressos \nmiR-574-5p 0.00018 2.3866 Hiperexpressos \nmiR-30c-5p 0.0012 2.3805 Hiperexpressos \nmiR-877-5p 0.0006 2.3443 Hiperexpressos \nmiR-187-3p 0.0002 2.1903 Hiperexpressos \nmiR-191-5p < 0.0001 2.0446 Hiperexpressos \nmiR-423-3p 0.002 1.936 Hiperexpressos \nNOTA: Status de expressão dos miRNAs no grupo infértil por endometriose avançada em \nrelação ao grupo controle infértil sem endometriose (Fold change ≥ 1.5 e p value < 0.05). \n \n \n \n \n \n\n 47 \n \n \n \n\n\n 48 \n \nFigura 6: microRNAs diferencialmente expressos em mulheres inférteis sem endometriose \n(grupo Controle) e inférteis por endometriose avançada (grupo Endometriose). (A–X) Os 24 \nmiRNAs hiperexpressos em mulheres inférteis por endometriose avançada. Análise estatística \nrealizada pelo tese t de Student. Nível de significância de 95%. \n \n5.5 Análise de bioinformática dos microRNAs \n A análise de bioinformática foi utilizada para identificar as vias reguladas pelos \nmiRNAs identificados e potencialmente envolvidas na aquisição de competência oocitária. Os \nmiRNAs que foram exclusivos em cada grupo e os miRNAs que foram diferencialmente \nexpressos entre os grupos foram utilizados para selecionar as vias moduladas. \n \n \n5.5.1 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente expressos em Vesículas \nExtracelulares isoladas do fluido folicular do grupo Controle \n A análise de enriquecimento do grupo Controle considerou as 10 principais vias \nmetabólicas que evidenciaram processos biológicos e vias de atuação correlacionadas com o \nmiRNA encontrado, exclusivamente, em VEs do FF de mulheres inférteis sem endometriose \n(Figura 7 A e B). As vias foram classificadas por meio dos valores mais baixos do p-value \n(p≤0.05). O mir-155-5p é predito de regular 58 vias de sinalização (Anexo C – Tabela 1). Dentre \nas 10 principais vias, as vias  de sinalização  mAPK, regulatória das cé lulas-tronco de \npluripotência, mTOR, TGF-β e de prolactina estão correlacionadas com o possível impacto na \naquisição oocitária. \n\n\n 49 \n \n \nFigura 7: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas modulada pelo microRNA \nproveniente de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis sem \nendometriose (grupo Controle). (A) Representação do número de genes alvos dos miRNAs em \ncada via de sinalização. (B) Representação da significância de modulação da via de acordo com \no valor de p. Os valores de p foram normalizados utilizando -log10.  \n \n5.5.2 Análise de enriquecimento dos microRNAs exclusivamente expressos em \nVesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo Endometriose \n As 10 principais vias metabólicas preditas moduladas pelos miRNAs identificados \nexclusivamente no grupo Endometriose foram classificadas por meio dos valores mais baixos \ndo p-value (p≤0.05) com o objetivo de evidenciar os processos biológicos e as vias de atuação \n(Figura 8 A e B). Os 13 miRNAs exclusivos em endometriose III/IV são preditos de regularem \n149 vias de sinalização (Anexo C – Tabela 2). Dentre as 10 principais vias, as vias de \nsinalização MAPK, Ras, regulação do citoesqueleto de actina, adesão f ocal e ErbB se \n\n\n 50 \ncorrelacionaram com o potencial papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto \nna aquisição oocitária. \n \n \n \nFigura 8: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos \nmicroRNAs provenientes de vesículas extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres \ninférteis com endometriose III/IV (grupo Endometriose). ( A) Representação do número de \ngenes alvos dos miRNAs em cada via de sinalização. ( B) Representação da significância de \nmodulação da via de acordo com o valor de p. Os valores de p foram normalizados utilizando -\nlog10.  \n \n5.5.3 Análise de enriquecimento dos microRNAs diferencialmente expressos em \nVesículas Extracelulares isoladas do fluido folicular de mulheres inférteis sem e com \nendometriose avançada (grupos Controle e Endometriose) \nA análise de enriquecimento foi realizada para definir as vias biológicas preditas pelos \nmiRNAs diferencialmente expressos entre mulheres inférteis sem endometriose e inférteis com \n\n\n 51 \nendometriose avançada. Nas VE isoladas do FF de mulheres inférteis com endometriose  \navançada, 24 miRNAs estavam hiperexpressos e foram preditos de regularem 152 vias de \nsinalização (Anexo C – Tabela 3). As 10 principais vias metabólicas envolvidas nos processos \nbiológicos e nas vias de atuação foram classificadas por meio dos valores mais baixos do p-\nvalue (p≤0.05) (Figura 9 A e B). Das 10 principais vias, as vias de sinalização Ras, cAMP, \nRap1, WNT, Hippo, regulatória das células -tronco de pluripotência e ErbB  estão \ncorrelacionadas com o potencial papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto \nna aquisição da competência oocitária. \n \n \nFigura 9: Análise de enriquecimento das 10 principais vias preditas moduladas pelos \nmicroRNAs provenientes d e vesículas extracelulares  isoladas do fluido folicular \ndiferencialmente expressos entre mulheres inférteis sem endometriose (grupo Controle) e com \nendometriose avançada (grupo Endometriose). ( A) Representação do número de genes alvos \ndos miRNAs em cada via de sinalização. (B) Representação da significância de modulação da \nvia de acordo com o valor de p. Os valores de p foram normalizados utilizando -log10.  \n \n \n \n\n\n 52 \n6 Discussão \nA associação entre endometriose e infertilidade encontra fundamento na alta prevalência \ndesta doença em populações de mulheres inférteis (Missmer et al., 2004; ASRM, 2012; OMS, \n2021). O efeito deletério da endometriose na qualidade oocitária foi suspeitado há cerca de três \ndécadas, ao se observar que as taxas de gestação de mulheres com endometriose  usando seus \npróprios oócitos foram menores do que as de mulheres sem a doença  (Simón et al., 1994).  \nEntretanto, mulheres com endometriose , usando oócitos doados  por mulheres sem a doença, \napresentaram taxas de implantação similares as de mulheres sem endometriose (Simón et al., \n1994). A qualidade oocitária comprometida tem sido considerada um dos possíveis fatores \nenvolvidos na infertilidade apresentada por mulheres com endometriose e uma série de estudos \ntem procurado entender os mecanismos pelos quais a endometriose poderia favorecer o \ncomprometimento da qualidade gamética (Barcelos et al., 2009; da Broi et al., 2014; Barcelos \net al., 2015; Donabela et al., 2015; da Broi et al., 2016; Giorgi et al., 2016; Jianini et al., 2017; \nda Luz et al., 2017; da Broi et al., 2018a; da Broi et al., 2019; da Luz et al., 2021; da Silva et \nal., 2021; Simopoulou et al., 2021). \nOócitos de boa qualidade dependem da adequada aquisição de competência oocitária, \nque é condicionada pelo conteúdo do FF e pela influência das células da granulosa e do cumulus \n(da Broi et al., 2018a). Esses fatores estabelecem um microambiente ovariano propício para o \ndesenvolvimento do folículo, maturação oocitária e, subsequente, ovulação. Dentro desse \nmicroambiente, é necessário que ocorra uma comunicação precisa e bidirecional entre as CG e \no COC , influenciada pelo microambiente folicular  (Hung et al.,  2015). Essa comunicação \ncelular é mediada, entre outros, pelas VE (da Silveira et al., 2012), que atuam como moléculas \nsinalizadoras envolvidas na ativação de vias de sinalização incluindo regulação da \nfoliculogênese, maturação oocitária, retomada da meiose, ovulação, fertilização , \ndesenvolvimento embrionário (Zhang et al., 2009; da Silveira et al., 2012; Santonocito et al., \n2014; Hung et al., 2015) e controlando a esteredoigênese ovariana (Sohel et al., 2013; Andrade \net al., 2017).  \nAté o momento, os dados apresentados pelos estudos de VE no microambiente folicular \nde várias espécies, incluindo mamíferos, avaliaram apenas o conteúdo de miRNAs dessas VE \nsem focar em sua liberação, quantidade e diâmetro. Entretanto, análises realizadas em situações \npatológicas (Stavrou & Ortiz, 2022) , como por exemplo tumores malignos, demonstraram  \nvaliosas alterações na quantidade de VE liberadas (Kalluri, 2016; Djusberg et al., 2017; Patton \net al., 2020) e em seu diâmetro (Patton et al., 2020). Desta forma, propusemos um estudo inédito \nde análise do diâmetro e concentração de VE por ml no soro e no FF de mulheres inférteis sem \n\n 53 \ne com endometriose avançada, seguido pela análise do perfil de miRNAs provenientes das VE \nisoladas do FF com o objetivo de avaliar se ocorre alguma alteração importante na regulação \nde processos biológicos e vias de atuação para aquisição e manutenção da qualidade oocitária, \nalmejando obter mais informações sobre os mecanismos pelo os quais a endometriose poderia \ninterferir no comprometimento gamético ocasionando a infertilidade nessas mulheres. \nAo compararmos os grupos infértil sem endometriose e com endometriose avançada, \nnão encontramos diferença significativa entre o diâmetro e a concentração de VE por ml obtidas \ndo soro. Todavia, apesar da concentração de VE por ml no FF tenha sido similar entre os grupos, \no diâmetro das VE isoladas do FF evidenciou VE maiores em  mulheres inférteis por \nendometriose avançada. Variações no diâmetro dessas vesículas  ainda são pouco \ncompreendidas. Em células tumorais, foi demonstrado que as VE apresentaram aumento em \nseu diâmetro favorecendo a comunicação intercelular, o crescimento e a proliferação tumoral \n(Zhang & Yu, 2019)  através da supressão da resposta imunológica, promoção de metástase e \nestimulação da angiogênese (Yáñez-Mó et al., 2015). Já em outras situações patológicas, como \na hipóxia extrema, foi observada a diminuição do diâmetro médio das VE como um mecanismo \nadaptativo de sobrevivência ( Patton et al., 2020). Dados prévio s demonstraram que as VE \nliberadas por portadoras de endometriose são ricas em mediadores pró-inflamatórios e citocinas \ncapazes de induzir a resposta inflamatória e desencadear o estresse oxidativo  (Khalaj et al., \n2019; Chen et al., 2019; Zhang et al., 2020; Nazri et al., 2020; Zhou et al., 2020; Jiang et al., \n2022; Wu et al., 2022; Nazri et al., 2023). Sendo assim, sugerimos que o aumento no diâmetro \ndas VE do FF  somente no grupo inférteis por endometriose  avançada possa ser  devido à \nexacerbada quantidade de fatores inflamatórios e oxidativos presentes no microambiente \nfolicular dessas mulheres que não é observado em mulheres inférteis sem a doença. \nQuando comparamos o diâmetro e a concentração de VE por ml entre  o soro e o FF  \nsomente do grupo  infértil sem endometriose não encontramos diferença significativa. \nEntretanto, ao analisarmos somente o grupo infértil por endometriose avançada, foi evidenciado \nque o diâmetro e a concentração de VE por ml do FF é maior que a encontrada no soro . Em \nrelação ao aumento da concentração de VE por ml do FF , evidências recentes sugerem que \ncélulas foliculares expostas à estressores metabólicos, como por exemplo, fatores inflamatórios \ne pró-oxidantes, que é uma característica marcante do microambiente folicular em portadoras \nde endometriose (da Broi & Navarro, 2016), mantém uma comunicação ativa enviando sinais \nmoleculares para as células vizinhas com a finalidade de ajustar o metabolismo e reestabelecer \no equilíbrio desse microambiente na tentativa de proteger os oócitos desses estressores (de \nMaio; 2011; Gebremedhn et al., 2020). Deste modo, u ma possível explicação  para esses \n\n 54 \nachados seria que o aumento na concentração de VE por ml somente no FF, e não no soro, de \nmulheres inférteis por endometriose avançada seja  um mecanismo de proteção ao oócito uma \nvez que o constante estresse metabólico presente no microambiente folicular dessas mulheres \npoderia comprometer a qualidade gamética.  \nTodavia, também foi observado que o diâmetro das VE do FF estava maior do que o \ndiâmetro das VE encontradas no soro  somente no grupo infértil por endometriose avançada . \nEsse achado corrobora com o resultado citado acima de que os fatores estressores localizados \nno microambiente folicular podem provocar modificações conteúdo da s VE, como maior \nliberação e aumento no diâmetro. Evidências demonstraram que, em situações patológicas, as \nVE atuam como mediadoras do progresso da doença (Stavrou & Ortiz, 2022). Por exemplo, VE \nsecretadas de células tumorais apresentaram em seu conteúdo fatores que são capazes de \npromover a sobrevivência celular e prevenir a apoptose nas células receptoras ( Fonseka et al., \n2019). Ademais, o conteúdo molecular bioativo das VE liberadas de células submetidas a uma \nvariedade de estressores ambientais e metabólicos parece ser distinto e divergente quando \ncomparados às VE obtidas de células não estressadas (Eldh et al., 2010; Yentrapalli et al., 2017). \nDeste modo sugerimos que , apesar o au mento na concentração de VE liberadas no FF possa \ntentar reestabelecer o equilíbrio no  microambiente folicular, porém o conteúdo inflamatório e \npró-oxidativo dessas vesículas poderia contribuir para que as VE atuassem como mediadoras e \nperpetuadoras da inflamação ( Sanwlani & Gangoda, 2021 ) e do EO (Ho et al., 2022)  \ncomprometendo o desenvolvimento folicular e a qualidade gamética (da Broi et al., 2019)  já \nrelatada nessas mulheres (Polak et al., 2013; Da Broi et al., 2014; Donabela et al., 2015; Da \nBroi et al., 2016; Da Broi & Navarro, 2016; Giorgi et al., 2016; Nasiri et al., 2017; Jianini et \nal., 2017; Da Broi et al., 2018a; Da Broi et al., 2019; Ferreira et al., 2019; Da Luz et al., 2021, \nDa Silva et al., 2021; Giorgi et al., 2023; Casalechi et al., 2023; Wang et al., 2024). \nEsses achados abrem grandes perspectivas para estudos futuros que visem esclarecer \npor meio de quais mecanismos as VE poderiam influenciar na qualidade oocitária e contribuir \npara o comprometimento da fertilidade natural nessas mulheres. \nNa última década, plausíveis evidências indicam que o conteúdo de miRNAs das VE do \nFF representa um novo mecanismo  de regulação de eventos relacionados com a qualidade \noocitária (da Silveira et al., 2012; Sang et al., 2013; Sohel et al. 2013; Santonocito et al., 2014; \nHung et al., 2015 ; Navakanitworakul et al., 2016 ; Machtinger et al., 201 7; da Silveira et al., \n2017; da Silveira et al., 2018; Matsuno et al., 2019; Hu et al., 2020; Inoue et al., 2020; Zhang \net al., 2021; Shen et al., 2023 ). Apesar dos recentes avanços, dispomos de raríssimos estudos \nque avaliaram esses miRNAs em VE do FF humano (Sang et al., 2013; Santonocito et al., 2014; \n\n 55 \nDiez-Fraile et al. 2014; Machtinger et al., 2017; Martinez et al., 2018; Zhang et al., 2021) e, até \no presente momento, não há dados na literatura analisando a identificação e a expressão de \nmiRNAs em VE do FF de mulheres inférteis por patologias como a endometriose. Sendo assim, \no presente estudo comparou a expressão de 82 miRNAs, que j á foram correlacionados com \nqualidade oocitária , extraídos de VE isoladas do FF de mulheres inférteis sem e com \nendometriose avançada. \nOs resultados obtidos identificaram 73 miRNAs. Desses 59, 24 miRNAs (miR-127-3p, \nmiR-139-5p, miR-141-3p, miR-145-5p, miR-151-3p, miR-185-5p, miR-187-3p, miR-191-5p, \nmiR-206, miR-21-5p, miR-214-3p, miR-24-3p, miR-30c-5p, miR-31-5p, miR-330-3p, miR-\n378-3p, miR-423-3p, miR-425-3p, miR-490-3p, miR-504-3p, miR-574-5p, miR-885-5p, miR-\n877-5p e  miR-92a-3p) apresentaram expressão elevada no grupo infértil por endometriose \navançada em relação  ao controle infértil sem endometriose . O genes regulados por esses \nmiRNAs estão envolvidos em vias relacionadas, em sua maioria, a processos que controlam o \ndesenvolvimento, o crescimento e a atresia folicular, e comprometem a parada e a retomada da \nmeiose oocitária (Castanon et al., 2012; Wang et al., 2x013; Liu & Ge, 2013; Wang et al., 2018; \nMa et al., 2019; Dey et al., 2020 ) (cAMP, Rap1, Ras, ErbB, Hippo e WNT). Uma vez que os \nmiRNAs atuam como silenciadores da expressão gênica (Singh et al., 2008), acreditamos que \nhá menor expressão dessas vias na doença avançada.  \nNo microambiente folicular, u m conceito muito bem estabelecido é que a parada da \nmeiose oocitária na prófase da primeira divisão meiótica  depende de altas concentrações do s \nmensageiros secundários adenosina mon ocíclica fosfato (cAMP)  e guanosina monocíclica \nfosfato (cGMP) (Conti et al., 2002; Conti et al., 2012). Inicialmente, acreditava -se que esses \nmensageiros secundários eram fornecidos ao oócito pelas células somáticas por meio de junções \nGAP (Dekel, 1988), devido à dependência oocitária das células da granulosa. Entretanto, com \no avanço dos estudos nesse mecanismo, descobriu-se que toda a maquinaria molecular \nnecessária para os produzir é expressa pelos próprios oócitos e a atividade desses componentes \nendógenos é suficiente para manter cAMP e cGMP em níveis que impedem a maturação  \noocitária até que ocorra o pico do hormônio luteinizante (LH) (Wang et al., 2018). Em resposta \nao pico de LH, a concentração de cGMP no folículo pré -ovulatório diminui e o cAMP é , \nrapidamente, hidrolisado levando à ativação do fator promotor de maturação (MPF) que inicia \na retomada da meiose e  a segregação cromossômica liberando o oócito da parada meiótica  \n(Arroyo et al., 2020). Um dos mecanismos de parada da meiose oocitária é por meio da ativação \nda proteína de troca diretamente ativada por cAMP (Epac)  (de Rooij et al., 1998; Kawasaki et \nal., 1998 ). A proteína Epac é responsável pela ativação direta de uma molécula efetora de \n\n 56 \ncAMP, chamada proteína-1 relacionada a Ras (Rap1) (de Rooij et al., 1998). Uma vez ativada \na proteína Rap1 , inicia-se a via de sinalização Rap1 que está envolvid a no controle da \nmorfologia celular , no início da atividade d as moléculas de adesão celular mediada p elas \nintegrinas (Kitayama et al., 1989), na sinalização efetora das proteínas Ras e na ativação da via \nde sinalização MAPK (Vossler et al., 1997; York et al., 1998). \nA via de sinalização Ras é responsável pelos processos de progressão do ciclo celular, \napoptose, reorganização dos filamentos de actina e dinâmica dos microtúbulos do citoesqueleto \nde actina (Zwartkruis et al., 1999) regulando, assim, a proliferação e sobrevivência celular (Cox \net al., 2003). Já a via MAPK tem um papel crucial na reativação d o MPF após meiose I por \nmeio das quinases reguladas por sinal extracelular 1/2 (ERK1/2) (Sun et al., 1999; Fan et al., \n2004) e, posteriormente, na manutenção da parada na meiose II (Araki et al., 1996). \nA via ErbB , composta por 4 membros de receptores com atividade tirosina quinase \n(RTK) [receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)/ErbB1, ErbB2, ErbB3 e ErbB4] , \nregula processos relacionados ao crescimento e sobrevivência celular (Orofiamma et al., 2022) \ne uma complexa rede de sinalização intracelular  responsável pelo controle do ciclo celular, \napoptose, reorganização do citoesqueleto de actina  (Yardenn & Shilo, 2007;  Lemmon & \nSchlessinger, 2010; Wee & Wang, 2017) , regulação da expressão gênica (Holbro & Hynes, \n2004) e ativação de diversas vias de sinalização (Miaczynska et al., 2004). No folículo ovariano, \nos receptores ErbB  são mediadores do efeito induzido pelo  LH na maturação oocitária, \nexpansão das CC e luteinização das CG (Park et al., 2004 ; Reizel et al., 2010). A ativação de \nErbB nas CG são essenciais para ovulação pois ativam a via ErbB-ERK1/2 nas CC (Arroyo et \nal., 2020). Uma vez ativada, essa via induz a fosforilação de ERK1/2, por meio de Ras quinase, \ne ERK1/2 fosforiladas aumentam a expressão de genes relacionados à expansão d as CC no  \nCOC (Arroyo et al., 2020).  Ademais, a via ErbB está envolvida no aumento na demanda da \nprodução de energia (Zhang et al., 2019). \nA via de sinalização Hippo  atua na diferenciação e especialização celular em \ndecorrência da complexa rede de sinais que controlam a atividade de dois efetores principais,  \nTranscriptional co-activator with PDZ -binding motif (TAZ) e Yes-Associated Protein (YAP) \nque, por sua vez,  ligam-se aos fatores de transcrição TEA domain family member (TEAD) e \nregulam a expressão de diversos genes (Piccolo et al., 2014). No microambiente folicular, a via \nHippo, uma cascata de sinalização serina/treonina quinase evolutivamente conservada, é \nresponsável pela transdução de sinais envolvidos na ativação e crescimento folicular, oogênese, \nbem como na esteredoigênese, regulando assim, o desenvolvimento do folículo ovariano ( Ma \net al., 2019; Dey et al., 2020; Zhu et al., 2023). A ativação da transição dos folículos primordiais \n\n 57 \npara os folículos primários ocorre através da proteína YAP expressa em diferentes estágios dos \nfolículos (Kawamura et al., 2013; De Roo et al., 2017; Gershon & Dekel, 2020). A subunidade \nYAP1 foi encontrada em oócitos maduros (Yan et al., 2013) e está relacionada com o processo \nde ovulação (Sun & Diaz, 2019). Antes da ovulação, o oócito maduro inibe a via Hippo para \nativar a YAP1 e aumentar a sobrevivência e proliferação das células da granulosa e inibir a \ndiferenciação celular (Sun & Diaz, 2019). Com a ovulação, esses efeitos são revertidos através \nda inibição e degradação da YAP1 concomitante com a promoção da proliferação celular (Sun \n& Diaz, 2019). Já, a  via WNT impacta  nas funções reprodutivas, incluindo a regulação de \nprocessos cruciais de desenvolvimento ovariano e do tecido do ovário, esteroidogênese, \ndesenvolvimento folicular, maturação oocitária, indução embrionária e geração de polaridade \ncelular (Cadigan & Nusse 1997, Miller et al. 1999, Komiya & Habas 2008; Hernandez Gifford, \n2015). Através da interação com seu receptor frizzled (FZ), a via WNT inicia três cascatas de \ntransdução de sinal separadas, sendo a canônica , fundamental para regulação da maturação \nfolicular, governada pela interação com a ß-catenina (Hernandez Gifford, 2015).  \nDurante o desenvolvimento folicular, níveis moderados de espécies reativas de oxigênio \natuam como moléculas sinalizadoras cruciais  para maturação folicular, meiose oocitária e \novulação. Níveis controlados de espécies reativas de oxigênio asseguram a atresia de folículos \nnão dominantes, permitindo o amadurecimento apenas dos mais saudáveis. As espécies reativas \nde oxigênio também desempenham um papel fundamental na resposta inflamatória essencial \npara a ovulação, regulam genes envolvidos na proteólise e remodelação tecidual  (Shkolnik et \nal., 2011; Kala et al., 2017), impactam na sobrevivência e função das células lúteas, afetando a \nprodução de progesterona e angiogênese para manutenção do corpo lúteo (Jamil et al., 2020; \nWang et al, 20 21; Tian et al., 2022; Liang et al., 2023 ). Deste modo, o  equilíbrio entre a s \nespécies reativas de oxig ênio e os agentes antioxidantes é essencial para processos ovarianos \nnormais. No entanto, sua produção em excesso pode desencadear o estresse oxidativo (Silva et \nal., 2011; Sies, 2015; Tsikas, 2017). O estresse oxidativo está associado a altas taxas de morte \nfolicular, comprometendo severamente a qualidade dos folículos (Saeed-Zidane et al., 2017)  \natravés da peroxidação de membranas lipídicas, dano oxidativo aos ácidos nucléicos e \ncarboidratos e ainda a oxidação de grupos sulfidrilas nas proteínas (Dornas, et al., 2007). Esses \neventos resultam em mau funcionamento do DNA, perda da integridade da membrana e \ndisfunção mitocondrial (Wu et al., 2011). Além disso, o estresse oxidativo pode, ainda, ativar \nimportantes vias indutoras de apoptose, além de regular positivamente o nível de expressão de \nproteínas pró -apoptóticas resultando, dessa forma, no comprometimento da estrutura dos \nfolículos ovarianos (Hori et al., 2013).  Deste modo, o e stresse oxidativo já encontrado em \n\n 58 \nmulheres inférteis por endometriose (da Broi e Navarro, 2016), associado a menor ativação das \nvias cAMP, Rap1, Ras, ErbB, Hippo e WNT pode indicar que o microambiente folicular esteja \nsofrendo dano oxidati vo e inflamatório com comprometimento do desenvolvimento folicular \nque, certamente, afetarão a maturação e qualidade oocitárias.  \nEsses achados corroboram com evidências da literatura de que a diminuição nos níveis \nintracelulares de cAMP não seriam suficientes para manter o oócito inativo, permitindo, assim, \na retomada precoce da meiose oocitária (Dekel, 1996; Hinckley et al., 2005; Kawamura et al., \n2011). A diminuição da sinalização da via Rap1  poderia afetar a via MAPK, interferindo na \nsegunda parada meiótica, e a via Ras resultando em alterações de processos que controlam a \nreorganização do citoesqueleto de actina, a formação do fuso meiótico e a inibição da apoptose, \ncomprometendo a qualidade oocitária, culminando com anormalidades meióticas, instabilidade \ncromossômica e aumento da apoptose (Liu et al. 2003; Navarro et al. , 2004; Navarro et al. , \n2006; Da Broi et al., 2019 ). Ademais, a interferência na adesão focal permit iria a progressão \ndescontrolada do ciclo e da proliferação celular (Cox et al., 2003). Já, a diminuição da via Hippo \nque é, altamente, suscetível à inibição por fatores de crescimento como por exemplo insulin -\nlike growth factor 1 (IGF1) e EGF (Zhou et al., 2020),  poderia levar a perda da homeostase \nfolicular, secreção anormal das gonadotrofinas e outros hormônios ovarianos prejudicando, \nconsequentemente, a fertilidade nessas mulheres (Hu et al., 2019; Siegel et al., 2020; Chang & \nDunaif, 2021). Nesse sentido, Hsueh & Kawamura, (2020) evidenciaram que a perda da YAP \nnas CG aumenta a apoptose celular e leva a subfertilidade e Song et al., 2016 demonstrou o \ncrítico papel da via Hippo/YAP na endometriose, o que reforça nossos achados. \nDeste modo, sugerimos que as a lterações no ciclo celular, na  proliferação e \ndiferenciação das células foliculares ovarianas, na retomada da meiose oocitária, na expansão \ndas CC, na indução da apoptose, na diminuição da produção de energia, na formação do corpo \nlúteo e na produção de esteroides induzida pela diminuição da ativação dessas vias resultaria \nem danos à regulação d o desenvolvimento folicular e da maturação oocitária  que poderiam \nafetar a qualidade gamética em portadoras de endometriose avançada com consequente \nalteração na fertilidade natural feminina dessas mulheres (Park et al., 2004; Holbro & Hynes , \n2004; Khan et al., 2005; Hsieh et al., 2007; Hsieh et al., 2011; Conti et al., 2012; Velthut-Meikas \net al., 2013; Li et al. 2014; Hernandez Gifford, 2015; Richani & Gilchrist, 2018; Zhang et al., \n2019; Fan et al., 2023). \nAo comparamos os grupo s infértil sem endometriose e com endometriose avançada  o \nobservamos que os miRNAs miR-1271-5p, miR-146b-5p, miR-150-5p, miR-17-5p, miR-193a-\n5p, miR-196b-5p, miR-215-5p, miR-22-5p, miR-28-5p, miR-542-5p, miR-628-5p, miR-708-\n\n 59 \n5p e miR -9-5p foram encontrados, exclusivamente, em VE do FF no grupo endometriose  \navançada. Dentre eles, o miR -215-5p já foi identificado em VEs do soro de portadoras de \nendometriose (Wu et al., 2022). Por meio da análise de enriquecimento verificamos que, juntos, \nesses 13 miRNAs podem regular  genes envolvidos em 149 vias, que quando alteradas , \ncomprometem processos envolvidos  na adesão focal e montagem do fuso meiótico, atenuam a \nextrusão do corpo polar, enfraquecem o nível de acetilação da α-tubulina, alteram o controle do \nciclo e da proliferação celular, danificam a função das mitocôndrias,  induzindo o declínio do \nconteúdo de ATP e a elevação de espécies reativas de oxigênio que resultam em apoptose \nprecoce e danos ao DNA, causam alterações epigenéticas que modificam a metilação das \nhistonas e desencadeiam a ativação das vias de sinalização MAPK, ErbB e Ras culminando \ncom danos à maturação oocitária. \nA adesão focal é um evento crucial para o adequado desenvolvimento folicular e \nmaturação oocitária. Através dela, as proteínas transmembranas do tipo integrinas ( Hynes, \n2002) se ligam, internamente, aos microfilamentos do citoesqueleto de actina e, externamente, \nà matriz extracelular possibilitando  a transdução de sinais para o interior da célula  (Hynes, \n2002). Esse mecanismo é responsável pela estreita comunicação entre o oócito e as células \nsomáticas ao seu redor com a função de fornecer suporte metabólico e permitir a sinalização de \nestímulos endócrinos ou parácrinos. A fim de suportar as alterações metabólicas envolvidas no \ndesenvolvimento folicular bem como na maturação oocitária citoplasmática e nuclear , e ssa \ncomunicação é mediada tanto pelas junções GAP como pelas VE (McGinnis & Kinsey, 2015). \nAlterações na adesão focal, geralmente, interfere m na transdução de sinais que servem para \nmodular diversos aspectos do comportamento celular incluindo crescimento, proliferação, \ndiferenciação, sobrevivência/apop tose, polaridade, motilidade e expressão gênica (Hynes, \n2002).  \nA reorganização do citoesqueleto de actina é responsável pelas divisões celulares \nassimétricas e consecutivas que geram o gameta haplóide e funcional (Yi & Li, 2012). Essa \ndivisão assimétrica permite que o oócito maduro mantenha, em seu citoplasma, não somente os \ncromossomos maternos, mas também, uma reserva energética e de nutrientes vitais para manter \na formação e o desenvolvimento embrionário até que o código genético do embrião seja ativado \n(Nikalayevich & Terret, 202 3). Para assegurar a assimetria em c ada divisão e a segregação \ncromossômica durante a meiose, o fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II, que é \numa estrutura dinâmica e temporária composta por microtúbulos, deve estar assimetricamente \nposicionado próximo a um lado do córtex oocitário e sua rede subcortical de filamentos de \n\n 60 \nactina deve estabelecer a polaridade cortical (Wang & Keefe, 2002; Navarro et al., 2005; De \nSantis et al., 2005; Yi & Li, 2012; Duan & Sun, 2019). \nUm dos mecanismos que leva a alterações no posicionamento assimétrico do fuso e/ou \nna polarização cortical , e influencia a perda da adesão intercelular é o estresse oxidativo \n(Navarro et al., 2005; Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., 2009 ; Dib et al., 2013; Da Broi et \nal., 2014; Donabela et al., 2015; Da Broi et al., 201 6; Jianini et al., 2017; Da Luz et al., 2017; \nDa Broi et al., 2018a; Da Broi et al., 2019; Giorgi et al., 2021; Da Luz et al., 2021, Da Silva et \nal., 2021 ). O fuso meiótico oocitário é  extremamente sensível ao EO (Hu et al., 2001; \nEichenlaub-Ritter et al., 2002; Mullen et al., 2004) que, por sua vez, quando alterado promove \nanomalias meiótica s, instabilidade c romossômica, aumento da apoptose e prejuízos ao \ndesenvolvimento oocitário e ao embrião  pré-implantacional (Liu et al., 2003; Navarro et al.,  \n2004, Navarro et al., 2006).  \nA correlação entre endometriose e EO é ampla na literatura (Agarwal et al., 2005; Rizzo \net al., 2011; Carvalho et al., 2012; Luderer, 2014; Prasad et al., 2016; Simopoulou et al., 2021). \nO desequilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio e os antioxidantes permite o aumento das \nespécies reativas de oxigênio e seu influxo no FP (Jianini et al., 2017), folículo ovariano \n(Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., 2009; d a Luz et al., 2017; Giorgi et al., 2021; da Luz et \nal., 2021; da Silva et al., 2021 ) e FF (da Broi et al., 2014) resultando em impacto deletério na \nsinalização celular, na  maturação oocitária, na esteredoigênese ovariana, na ovulação, na \nluteólise, na interação gamética, na capacidade de implantação e na formação do blastocisto \n(Agarwal et al. 2005; Simopoulou et al., 2021). \nA relação encontrada entre os miRNAs derivados de VE do FF  de portadoras de \nendometriose avançada com adesão focal e reorganização do citoesqueleto de actina, sugere \nque o FF esteja sofrendo dano oxidativo com tentativa de reparo de DNA e indução da apoptose, \no que poderia comprometer o desenvolvimento folicular, a maturação e a qualidade oocitárias \nnessas mulheres. Esses achados corroboram com evidências da literatura de comprometimento \nda qualidade oocitária através de anormalidades meióticas, instabilida de cromossômica e \naumento da apoptose (Liu et al. 2003; Navarro et al., 2004; Navarro et al., 2006; Da Broi et al., \n2019) mediadas pelo aumento da produção de espécies reativas de oxigênio  no FP (Jianini et \nal., 2017), FF (Da Broi et al., 2014; Giorgi et al., 2016; Giorgi et al., 2021; Giorgi et al., 2023), \nCC (Barcelos et al., 2015; Donabela et al., 2015; Da Luz et al., 2021; Da Silva et al., 2021) e \noócitos (Barcelos et al., 2009; Da Broi et al., 2018a) de portadoras de endometriose. Ademais, \nresultados da análise do fuso meiótico celular e da distribuição cromossômica de oócitos \nimaturos, maturados in vitro, obtidos de mulheres inférteis com endometriose sugerem que a \n\n 61 \nmeiose I está potencialmente atrasada ou comprometida nessas mulheres  evidenciando, ainda \nmais, a relação entre endometriose e anormalidades meióticas oocitária (Barcelos et al. 2009).  \nTodavia, estudos futuros são necessários para melhor elucidar essa questão. \nCada vez mais, estudos sugerem que os miRNAs de VE podem ser possíveis reguladores \ndas vias de sinalização, como por exemplo a via MAPK, modulando negativamente a maturação \nde folículos e oócitos em mamíferos (da Silveira et al., 2012; Sohel et al., 2013; Santonocito et \nal., 2014; da Silveira et al., 2014).  Oócitos incompetentes apresentaram MAPK na sua forma \nnão fosforilada, supostamente, inativa (Goudet et al., 1998) sugerindo que a falta de aquisição \nde competência oocitária é provável resultado de uma deficiência de reguladores do MPF e/ou \nda incapacidade de fosforilar a MAPK. Sabe-se que ERK1/2 fosforiladas aumentam a expressão \nde genes relacionados à expansão das CC no COC e de genes relacionados à esteredoigênese \nem CG (Arroyo et al., 2020).  Corroborando com nossos resultados, falhas na maturação \noocitária em camundongos foram correlacionadas com a ruptura das ERK1/2 nas CG (Fan et \nal., 2009) e níveis reduzidos, porém mensuráveis, das ERK1/2  fosforiladas foram detectados \nem folículos de camundongos mutantes nos quais a maturação oocitária foi prejudicada \n(Panigone et al., 2008).  \nA via de sinalização Ras, já descrita acima, parece ser divergente em sua atuação (Fan \net al., 2008) . A ativação transitória de Ras e a fosforilação de seus alvos , as vias \nRAF1/MEK1/ERK1/2 e PI3K/Akt, são cruciais para intermediar respostas apropriadas das CG \naos hormônios gonadotrópicos FSH e LH, levando ao adequado desenvolvimento folicular e, \nsubsequente, ovulação (Fan et al., 2008).  Em contrapartida, a ativação persistente da forma \nativa de Ras resulta em progressão desregulada do ciclo celular e prolif eração celular \ndescontrolada (Cox et al., 2003) prejudicando o desenvolvimento folicular, a ovulação e a \nexpressão de genes relacionados à ovulação (Fan et al., 2008). Ademais, a expressão de Ras no \nestágio inicial do desenvolvimento folicular parece alterar, drasticamente, o destino das CG, \nimpedindo sua diferenciação, proliferação e apoptose, e prejudicando as respostas das CG às \ngonadotrofinas podendo culminar com alterações no desenvolvimento folicular, na diminuição \nda reserva ovariana e na falência ovariana precoce (Fan et al., 2008; Fan et al., 2023).  Essa \ndivergência sugere potente silenciamento epigenético de genes promotores específicos agindo \nna função das CG que pode estar relacionado com a presença de miRNAs específicos atuando \nnesse silenciamento.  \nDeste modo, sugerimos que a correlação da via Ras com os miRNAs em VE do FF de \nmulheres inférteis por endometriose avançada pode indicar que o microambiente folicular esteja \nsofrendo danos resultante da ativação contínua de Ras desde o início do desenvolvimento \n\n 62 \nfolicular. Esses achados corroboram com o fato de que portadoras d a doença  demonstram \nalterações no ciclo celular, aumento da apoptose e modificações nos mecanismos moleculares \nenvolvidos no desenvolvimento e crescimento das CG (Nakahara et al., 1998; Toya et al., 2000; \nFan et al., 2008; Almeida et al., 2018). \nCuriosamente, todas as vias de sinalização se interligam, a via ErbB ativa a via MAPK, \npor meio da proteína Ras ( Holbro & Hynes, 2004; Orofiamma et al., 2022) , que gerando um \nciclo de feedback positivo da via MAPK/Ras  que, por sua vez, também ativa a transcrição de \ngenes ErbB (Yarden & Sliwkowski, 2001). Um dos mecanismos em comum entre as vias ErbB, \nMAPK e Ras é a modulação da expressão gênica e da função proteica, a fim de regulação a \nprodução de energia ( Zhang et al., 2009; Conti et al., 2012; Zhang et al., 2019), seja pela \nmetabolização de carboidratos ( Hsu et al., 2015), glicose (Heiden & Cantley, 2009; Potter et \nal., 2016), aminoácidos (Tsuchihashi et al., 2016) e glutamina (Gao et al., 2009), pela oxidação \nde ácidos graxos e biossíntese de colest erol (Huang et al., 2020; Römer et al., 2021) ou pela \nsíntese do fator induzido por hipóxia (HIF-1a), um fator de transcrição ativado durante a hipóxia \n(Déry et al., 2005; Peng et al., 2006; Lee et al., 2009). \nO oócito em si não é capaz de gerar energia  (Sanchez-Lazo et al., 2014)  e o \ndesenvolvimento folicular demanda alto consumo de energia para a diferenciação das células \nsomáticas, proliferação celular, reorganização das organelas citoplasmática , divisão nuclear, \ncrescimento e aquisição de competência oocitária ( Hsu et al., 2015 ), as mitocôndrias têm um \npapel vital neste metabolismo de produção de energia, sob forma de ATP, através das células \nfoliculares que circundam o oócito (Fan et al., 2023).  \nDeste modo, a modulação da expressão gênica e da função proteica  mediada pelos \nmiRNAs exclusivos em mulheres inférteis por endometriose avançada e sua correlação com as \nvias ErbB, MAPK  e Ras pode indicar uma maior necessidade de aporte energético frente ao \nestresse oxidativo folicular já evidenciado na doença  (Barcelos et al., 2008; Barcelos et al., \n2009; Da Broi et al., 2014; Donabela et al., 2015; Da Broi et al., 201 6; Jianini et al., 2017; Da \nBroi et al., 2018a; Da Broi et al., 2019; Giorgi et al., 2021; Da Luz et al., 2021, Da Silva et al., \n2021). Em resposta aos estressores oxidativos, as vias ErbB, MAPK e Ras podem interagir nas \nfunções metabólicas mitocondriais, a fim de garantir energia. Um dos mecanismo de aumento \nenergético é por meio da produção de ATP é proveniente da fosforilação oxidativa dos ácidos \ngraxos presentes nas CG e CC com consequente liberação de elétrons  (Römer et al., 2021 ; \nChristie, 202 4). Esse mecanismo molecular ocorre por meio de complexos da cadeia de \nrespiração mitocondrial localizada na membrana interna da mitocôndria (Pitangui-Molina et al., \n2017; Da Luz et al., 2021). As mitocôndrias do COC estão em um estado metabólico de baixa \n\n 63 \natividade a fim de reduzir sua produção de espécies reativas de oxigênio. No entanto, o processo \nde maturação oocitária , em si, já  modifica esse estado de quiescência exigindo  aumento no \nnúmero, acentuação da mobilidade e agrupamento mitocondrial em uma área específica do \noócito (Chiaratti et al., 2018a; 2018b). \nDados da literatura evidenciam que alterações no ciclo celular das CG (Toya et al., 2000) \ne na função mitocondrial das CG e CC (Hsu et al., 2015; Sanchez et al., 2016) estão relacionadas \ncom o aumento da apoptose no microambiente folicular (Toya et al., 2000; Demirel et al., 2001; \nSanchez et al., 2016) . Portadoras de endometriose apresentam atividade mitocondrial \ncomprometida, redução da expressão de mtDNA nas CC (Hsu et al., 2015), despolarização do \npotencial da membrana mitocondrial das CG (Sanchez et al., 2016),  aumento na expansão da \nbiogênese mitocondrial (Puigserver et al., 1998), senescência das CG e CC (Dai et al., 2023),  \naumento na ingestão de glicose e geração de lactato pelas CG (Mao et al., 2022), anormalidades \nna biossíntese de hormônios esteroides e metabolismo lipídico  (Dai et al., 2023), danos ao \nDNA, destruição do citoesqueleto de actina e alterações na membrana celular (Dai et al., 2023) \nque podem resultar em menor qualidade oocitária nessas mulheres e as torna infértil devido a \nendometriose. \nPor fim, a  endometriose parece não afeta r diretamente o oócito, porém prejudica \nindiretamente o desenvolvimento folicular e a qualidade oocitária . A presença dos implantes \nectópicos na cavidade peritoneal promove inflamação e estresse oxidativo crônicos que podem \nlevar a fibrose ovariana, afetando o suprimento sanguíneo  do ovário. Consequentemente, os \nfolículos em crescimento não conseguem obter suporte nutricional suficiente e entram em \nestado de atresia (Fan et al., 2023). A inflamação e o estresse oxidativo presentes na cavidade \nperitoneal pode m atingir a circulação sistêmica e alterar o microambiente folicular que é \naltamente vascularizado (Fan et al., 2023), levando  ao recrutamento de folículos primordiais  \nque crescerão e se desenvolverão em um ambiente desfavorável resultante de perturbações no \nciclo celular, inibição da  apoptose das CG, inibição da síntese de esteroides pelas CG e \nalterações no metabolismo energético mitocondrial das células foliculares (Fan et al., 2023). O \nresultado é  um ciclo vicioso  que influencia na diminuição da reserva  ovariana e no \ncomprometimento da qualidade oocitária, frequentemente, observada nessas mulheres.  \nNosso estudo trouxe avanços no entendimento do papel das vesículas extracelulares em \nsituações patológicas como a endometriose e contribuiu com inéditas descobertas dos processos \nbiológicos e as vias de atuação associadas ao papel da endometriose na infert ilidade e seu \nimpacto na aquisição de competência oocitária.  \n \n\n 64 \n7 Conclusões \n \nA comparação entre o diâmetro e a quantidade de VE por ml obtidas do soro entre os \ngrupos controle infértil sem endometriose e  com endometriose  avançada não evidenciou \ndiferença significativa. Por outro lado, o diâmetro das VE do FF de mulheres inférteis por \nendometriose avançada foi significantemente maior do que no grupo controle, apesar de não \nser observada diferença na quantidade  de VE por ml do FF entre os grupos. Baseado nesses \nachados, hipotetizamos que o microambiente folicular de mulheres com endometriose avançada \né estimulado a liberar VE  com diâmetro aumentado, possivelmente  devido ao estresse \nmetabólico resultante do aumento local de fatores inflamatórios e oxidativos observado nessas \nmulheres. \nAo compararmos o diâmetro e a quantidade de VE por ml intragrupos, observamos que, \nno grupo controle, não foi evidenciada diferença nestas variáveis entre o soro e o FF. Todavia, \nno grupo infértil com endometriose avançada, o diâmetro e a quantidade de VE por ml no FF \nfoi maior que no soro. Sugerimos que o maior diâmetro dessas vesículas possa ser decorrente \ndo acúmulo intravesicular de fatores estressores presentes no FF de ssas mulheres , os quais \ntambém podem induzir a liberação de maior quantidade de VE, na tentativa de combater esses \nfatores e reestabelecer o equilíbrio. Contudo, esses achados reforçam a importância de estudos \nfuturos investigando o papel das VE do FF na qualidade oocitária de mulheres inférteis com  \nendometriose avançada.  \nAo compararmos a expressão de 82 miRNAs extraídos de VE isoladas do FF de \nmulheres inférteis sem e com endometriose avançada, detectamos 73 miRNAs, sendo um  \nexclusivo no grupo controle, treze exclusivos no grupo com endometriose avançada e 25 \nmiRNAs presentes em ambos os grupos, mas diferencialmente expressos entre eles , dos quais \n24 apresentaram expressão mais elevada no grupo infértil com endometriose avançada. Os \nmiRNAs hiperexpressos ou exclusivos em VE isoladas  do FF  de mulheres  inférteis com \nendometriose avançada estão relacionados a vias de  adesão e regulação da reorganização do \ncitoesqueleto de actina, assim como em  vias de sinalização , incluindo ErbB,  Ras, MAPK, \nHippo, Rap1, cAMP e WNT , que estão relacionad as com desenvolvimento folicular e a \naquisição de competência oocitária. Deste modo, sugerimos que a desregulação desses miRNAs \npossa estar comprometendo vias biológicas cruciais para o adequado desenvolvimento folicular \ne a aquisição de competência oocitária , agregando conhecimento inédito que auxilia no \nentendimento dos mecanismos relacionados ao comprometimento da qualidade gamética em \nportadoras de endometriose avançada.  \n \n \n\n 65 \nReferencias Bibliográficas \nAbrão MS, Gonçalves MO, Dias JA Jr, Podgaec S, Chamie LP, Blasbalg R. 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Exp Cell Res 253: 157‑165, 1999. \n \n  \n\n 83 \nANEXOS \nANEXO A \nTabela 1  – Sequência de nucleotídeos dos microRNAs utilizados na análise de RT -PCR \nquantitativo. \n \nSequência de nucleotídeos \n \nmiRNA humano \n \nTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT \nCTAGACTGAAGCTCCTTGAGG \nTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT \nTGAGATGAAGCACTGTAGCTCG \nAGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT \nTACAGTATAGATGATGTACTAG \nTGAGGTAGTAGATTGTATAGTT \nGTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT \nTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG \nTAGGTTATCCGTGTAGCCTTCG \nTCCCTGAGACCCTAACTTGTGA \nTGAGAACTGAATTCCATAGGCTGT \nTCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT \nTTAATGCTAATCGTGATAGGGGT \nTCACAGTGAACCGGTCTCTTT \nTAGCAGCACATCATGGTTTACA \nACTCCATTTGTTTTGATGATGGA \nTCTCCCAACCCTTGTACCAGTGT \nCAGTGCAATGTTAAAAGGGCAT \nTAGCAGCACGTAAATATTGGC \nTCTACAGTGCACGTGTCTCCAGT \nCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT \nTAACACTGTCTGGTAAAGATGG \nTAAGGTGCATCTAGTGCAGATA \nAACATTCATTGTTGTCGGTGGGT \nTAGCTTATCAGACTGATGTTGACT \nCAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG \nTAATACTGCCTGGTAATGATG \nAACTGGCCTACAAAGTCCCAGT \nAGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTA \nTGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGA \nACCTTGGCTCTAGACTGCTTACT \nTCGTGTCTTGTGTTGCAGCCGG \nACAGCAGGCACAGACAGGCAGT \nTAGCAGCACAGAAATATTGGCA \nATGACCTATGAATTGACAGACA \nTAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGGA \nTTGTGCTTGATCTAACCATGTG \nACAGTAGTCTGCACATTGGTTA \nGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT \nTGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG \nTGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG \nCCCAGTGTTCAGACTACCTGTT \nTTCAAGTAATTCAGGATAGGTT \nTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG \nAAGGAGCTCACAGTCTATTGAG \nTAACACTGTCTGGTAACGATGTT \nCTAGCACCATCTGAAATCGGTTA \nTGTAAACATCCTACACTCTCAGC \nhsa-let-7a-3p \nhsa-miR-151-3p \nhsa-let-7b/hsa-let-7b-5p \nhsa-miR-143-3p \nhsa-let-7d \nhsa-miR-144-5p \nhsa-let-7f \nhsa-miR-145/hsa-miR-145-5p \nhsa-miR-122 \nhsa-miR-154-5p \nhsa-miR-125b-5p \nhsa-miR-146b-3p \nhsa-miR-127-3p \nhsa-miR-155 \nhsa-miR-128a/hsa-miR-128-1-5p \nhsa-miR-15b-5p \nhsa-miR-136-3p \nhsa-miR-150-5p \nhsa-miR-130a \nhsa-miR-16b \nhsa-miR-139-3p \nhsa-miR-17-5p \nhsa-miR-141 \nhsa-miR-18a/hsa-miR-18a-5p \nhsa-miR-181d \nhsa-miR-21 \nhsa-miR-191 \nhsa-miR-200b \nhsa-miR-193a-3p \nhsa-miR-22 \nhsa-miR-185-5p \nhsa-miR-212 \nhsa-miR-187 \nhsa-miR-214 \nhsa-miR-195 \nhsa-miR-215-5p \nhsa-miR-196b-5p \nhsa-miR-218-1 \nhsa-miR-199a-3p \nhsa-miR-3074-5p \nhsa-miR-206 \nhsa-miR-3074-5p \nhsa-miR-199a-5p \nhsa-miR-26b-5p \nhsa-miR-20a/hsa-miR-20a-5p \nhsa-miR-28-5p \nhsa-miR-200a \nhsa-miR-129a \nhsa-miR-30c-5p \n\n 84 \nATCGGGAATGTCGTGTCCGCCC \nGCAAAGCACACGGCCTGCAGAGA \nATGACACGATCACTCCCGTTGA \nAGGCAAGATGCTGGCATAGCT \nAAACCGTTACCATTACTGAGTTT \nTATTGCACATGACTAAGTTGCAT \nAGGTTGTCCGTGGTGAGTTCGCA \nAAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA \nTAATCCTTGCTACCTGGGTGAGA \nGTGCATTGTAGTTGCATTGCA \nTTGAAAGGCTGTTTCTTGGTC \nTCTCACACAGAAATCGCACCCATCT \nGTGACATCACATATATGGCGAC \nAATCCTTGGAACCTAGGTGTGAGT \nCAACCTGGAGGACTCCATGCTG \nACTGGACTTGGAGTCAGAAGGC \nAGACCCTGGTCTGCACTCTGTC \nAAGCTCGGTCTGAGGCCCCTCAGT \nGGAGAAATTATCCTTGGTGTGT \nCAAAACGTGAGGCGCTGCTAT \nTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG \nCAGCAGCAATTCATGTTTTGA \nCACCCGTAGAACCGACCTTGCG \nTCGGGGATCATCATGTCACGAG \nATGCTGACATATTTACTAGAGG \nTGAGTGTGTGTGTGTGAGTGTGTG \nAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGG \nGTAGAGGAGATGGCGCAGGG \nTCCATTACACTACCCTGCCTCT \nATAAAGCTAGATAACCG \nTCTTTGGTTATCTAGCTGTATG \nTATTGCACTTGTCCCGGCCTGT \nCTTGGCACCTAGTAAGTACTCA \nhsa-miR-425 \nhsa-miR-330-5p \nhsa-miR-425 \nhsa-miR-31 \nhsa-miR-451a \nhsa-miR-32-3p \nhsa-miR-323b-5p \nhsa-miR-320a \nhsa-miR-500a-3p \nhsa-miR-33a-5p \nhsa-miR-488 \nhsa-miR-342-3p \nhsa-miR-489 \nhsa-miR-362-5p \nhsa-miR-490-5p \nhsa-miR-378/hsa-miR-378a-3p \nhsa-miR-504 \nhsa-miR-423-3p \nhsa-miR-539-5p \nhsa-miR-424-3p \nhsa-miR-122 \nhsa-miR-424-5p \nhsa-miR-99b-5p \nhsa-miR-542-5p \nhsa-miR-628-3p \nhsa-miR-574-3p \nhsa-miR-708 \nhsa-miR-877-5p \nhsa-miR-885-3p \nhsa-miR-9-3p \nhsa-miR-9-5p \nhsa-miR-92a \nhsa-miR-1271-5p \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 85 \nANEXO B \n1. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE \nMATERIAL BIOLÓGICO (Grupo Controle Infértil sem Endometriose). \n \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE \nMATERIAL BIOLÓGICO \n(Grupo Controle Infértil sem Endometriose)  \n1. NOME DA PESQUISA: “Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do \nfluido folicular de pacientes com endometriose submetidas à estimulação ovariana para \nfertilização in vitro”.  \n \n2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Profa. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro. \n \n3. INFORMAÇÕES À PARTICIPANTE DA PESQUISA \n Você está sendo convidada a participar voluntariamente da pesquisa intitulada \n“Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do fluido folicular de pacientes \ncom endometriose submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro ”. Antes de \ndecidir participar deste estudo, é importante que você leia e compreenda os procedimentos \nenvolvidos. Este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e para a Guarda de \nMaterial Biológico descreve o motivo, os procedimentos e os potenciais benefícios e \ndesconfortos/riscos desta pesquisa. Por favor, sinta -se à vontade para fazer quantas perguntas \nquiser. É necessário ler e assinar este termo de consentimento antes que você possa participar. \nSua decisão de participar ou não participar neste estudo não terá qualquer interferência sobre o \nseu tratamento para engravidar. \n A endometriose é uma doença caracterizada pela presença do endométrio (tecido que \nreveste o interior do útero) fora da cavidade uterina e uma causa bastante comum de dificuldade \npara engravidar (denominada infertilidade, que é a não ocorrência de gravidez  após 12 meses \nde atividade sexual regular sem uso de métodos para evitar a gestação). Nas mulheres inférteis \ncom endometriose, questiona-se se um dos motivos responsáveis por essa maior dificuldade em \nengravidar seja a inadequada qualidade dos óvulos (oóc itos), que poderão produzir embriões \ntambém de má qualidade, impossibilitando a gestação. Dentro do ovário, o óvulo é rodeado por \ncamadas de células, chamadas células do cumulus, e está mergulhado em um líquido chamado \nfluido folicular. Juntos, esses compo nentes formam o folículo ovariano e permitem o \ndesenvolvimento do óvulo até que ele possa ser fertilizado pelo espermatozoide. Algumas \nevidências sugerem que modificações nas chamadas vesículas extracelulares, que são pequenas \nestruturas presentes no sangue e no fluido folicular, formadas por uma camada dupla composta \nde lipídeos e proteínas, e repletas de moléculas em seu interior. Essas vesículas extracelulares \npermitem a troca de diversos componentes entre células, ajudando na comunicação celular e \nagindo na regulação de eventos fisiológicos em resposta a condições ambientais específicas, e \npodem estar envolvidas em processos normais ou patológicos. Um dos componentes \nencontrados dentro destas vesículas extracelulares são os miRNAs (microRNAs), que são \n\n\n 86 \npequenos RNAs (ácidos ribonucl éicos), conservados ao longo da evolução, que agem como \npotentes reguladores pós -transcricionais da expressão gênica. Alterações na expressão dos \nmiRNAs podem causar danos aos óvulos, prejudicar a sua qualidade e levar à redução das \nchances de gravidez mesmo  quando se realizam procedimentos de fertilização assistida \n(obtenção e fertilização dos óvulos no laboratório utilizando os espermatozoides do parceiro, \nseguido pela colocação do embrião dentro da cavidade uterina). Para saber se realmente existem \ndanos nos óvulos, seria importante analisar os componentes do folículo ovariano e o sangue de \nmulheres com endometriose e comparar com os de mulheres sem endometriose. Quando é \nrealizada a captação oocitária (procedimento do tratamento de reprodução assistida em que são \ncoletados os óvulos), junto com os óvulos é aspirado o fluido folicular (que é o líquido no qual \nos óvulos estão mergulhados e não tem uso no tratamento da paciente, sendo descartado). Essa \namostra que é descartada ( fluido folicular), juntamente com a amostra de sangue (coletada \ndurante a anestesia feita para o procedimento de captação oocitária) serão utilizadas para se \navaliar se existem danos nos folículos de mulheres com e sem a doença. \n   \n4. POR QUE VOCÊ ESTÁ SENDO CONVIDADA A PARTICIPAR?  \nA senhora está sendo convidada a participar deste estudo na posição de participante da pesquisa \ndo grupo controle infértil sem endometriose, pois para saber se o perfil de miRNAs de \nmicrovesículas do fluido folicular e do sangue de mulheres com endometriose estão alterados, \nprecisamos compará-los com amostras de um grupo chamado de controle, ou seja, que não tem \nendometriose, onde você estaria incluída. Sua colaboração, portanto, no fornecimento das \namostras será fundamental para um melhor conhecimento dos mecanismos envolvidos em casos \nde infertilidade sem endometriose. Esses dados também serão fundamentais para um melhor \nentendimento da qualidade do óvulo, e se, quando alterados, podem contribuir para menores \nchances de gestação em mulheres inférteis com endometriose, o que ajudaria na identificação \nde tratamentos futuros. \n \n5. OBJETIVO DO ESTUDO \nComo não há na literatura nenhuma análise direta da concentração e do tamanho das vesículas \nextracelulares, assim como do conteúdo de miRNAs das vesículas extracelulares presentes no \nsoro e fluido folicular humano de mulheres inférteis com endometriose, o objetivo desse estudo \né isolar e caracterizar vesículas extracelulares e avaliar o perfil de 82 miRNAs maduros e \nprecursores carregados por vesículas extracelulares no soro e fluido folicular de mulheres \ninférteis com endometriose e com infertilidade por f ator tubário e/ou masculino submetidas à \nestimulação ovariana controlada para realização de fertilização in vitro. \n \n6. O QUE ENVOLVE A SUA PARTICIPAÇÃO? \nPara estudarmos as alterações moleculares de mulheres inférteis com endometriose e compará-\nlos com o que ocorre em mulheres inférteis sem a doença coletaremos uma amostra de sangue \nno dia da captação dos óvulos, antes da anestesia geral. Durante a aspiração folicular (aspiração \ndos óvulos realizada através de um aparelho de ultrassom, em que se é acoplada uma agulha \nque será guiada até o ovário para que seja aspirado seu conteúdo), junto com os óvulos também \nvem o líquido aonde os óvulos se desenvolvem (flu ido folicular). Esse componente é \nnormalmente descartado, não tendo utilidade no procedimento de reprodução assistida, de \nmodo que solicitamos para que seja concedido para a presente pesquisa. A concessão dessa \namostra para este estudo não prejudicará o se u tratamento, nem promoverá intervenções \ncomplementares às da rotina assistencial. Para este estudo não será realizado nenhum \nprocedimento adicional além daquele que você já vai realizar para fazer o tratamento de \nreprodução assistida. A única diferença é que o material que seria descartado será concedido \npara esta pesquisa. Devemos, portanto, ressaltar que este estudo não irá interferir em seu \n\n 87 \ntratamento para engravidar, assim como não causará prejuízo nenhum para sua saúde, nem para \na do futuro bebê.  \n \n7. POSSÍVEIS BENEFÍCIOS \nA sua participação neste estudo não implica em benefícios diretos para você. Caso haja \nbenefícios oriundos da sua participação, eles serão indiretos, ou seja, poderão contribuir para o \nmelhor entendimento dos mecanismos relacionados a pior qualidade do óvu lo em mulheres \ninférteis com endometriose e, talvez, no futuro poderão ser usados no sentido de auxiliar na \nelaboração de novos tratamentos para a infertilidade associada à endometriose.  \n \n8. POSSÍVEIS DESCONFORTOS E RISCOS: \nPara conceder uma amostra de sangue serão coletados 20mL de sangue utilizando a punção \nvenosa realizada pelo anestesista para a realização da sedação endovenosa para a aspiração dos \nfolículos. Pode haver discreto dolorimento local e formação de hematoma, mas estes possíveis \ndesconfortos podem ocorrer pela punção, que será realizada como rotina assistencial. Para \nconceder amostra de fluido folicular não haverá qualquer desconforto adicional ao do \nprocedimento, realizado como parte da rotina assistencial para obtenção dos óvulos para o seu \ntratamento. \n \n9. O QUE ACONTECE SE VOCÊ NÃO QUISER PARTICIPAR? \nSua participação neste estudo é totalmente voluntária. Se você decidir não participar, não haverá \npenalidade, perda de benefícios ou redução na qualidade dos cuidados médicos.  \n \n10. E SE VOCÊ QUISER SAIR DO ESTUDO APÓS TER ACEITADO PARTICIPAR? \nVocê tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a \nqualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Caso \nvocê deseje retirar o seu consentimento, favor notificar as investigadoras, através do número de \ntelefone listado no item 14 deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para a \nGuarda de Material Biológico. \n \n11. SIGILO E DIVULGAÇÃO DE INFORMAÇÕES PESSOAIS \nAsseguramos o total sigilo em relação aos nomes das integrantes deste estudo, bem como \ngarantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua \nprivacidade.  \n \n12. CUSTOS E REMUNERAÇÃO \nÉ importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu \ncompanheiro. Você não terá que pagar para participar deste estudo e nem será paga por sua \nparticipação. Você também não terá que pagar por nenhum procedimento que será real izado \nneste estudo, uma vez que as amostras serão coletadas exclusivamente nos dias que você terá \nretorno no serviço por indicação médica. Todavia, se houver necessidade de comparecer ao \nserviço, exclusivamente para a pesquisa, para fins de esclarecimento ou outra demanda \nrelacionada, você e seu acompanhante terão direito ao ressarcimento dos gastos decorrentes de \nsua participação, como por exemplo gastos com transporte e alimentação.  \n13. NO CASO DE DANO RELACIONADO À PESQUISA \nA Resolução CNS N° 466 de 2012 define como dano associado (ou decorrente) da pesquisa o \n“agravo imediato ou posterior, direto ou indireto, ao indivíduo ou à coletividade, decorrente da \npesquisa” (item II.6). Caso você sofra algum dano supostamente relacion ado a esta pesquisa, \nvocê tem o direito de buscar indenização, assim como direito à assistência integral imediata, de \nforma gratuita, pelo tempo que for necessário providenciada pelas pesquisadoras e pelo \n\n 88 \nHC/FMRP-USP/SP como estabelecido dentro do padrão internacional de boas práticas clínicas \ne resolução vigente no Brasil. \n \n14. CONTATO PARA MAIS INFORMAÇÕES  \nAs pesquisadoras estarão disponíveis para responder a quaisquer perguntas que você possa ter \nem relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante a investigação da causa da \ninfertilidade ou do seu tratamento para engravidar. Se você tiver alguma dú vida sobre esta \npesquisa, você pode entrar em contato com uma das pesquisadoras principais (Profa. Dra. Paula \nAndrea de A. Salles Navarro, Dr a Michele Gomes da Broi e Mayra Beraldo Andozia) pelos \ntelefones (16) 3602 -2816 e/ou (16) 3602 -2815 ou procurá -las diretamente no setor de \nReprodução Humana do HC -FMRP-USP, sito à avenida Bandeirantes, 3900, Campus \nUniversitário da USP, 1º andar, Ribeirão Preto, SP, de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min \nàs 16hrs00min. Caso ocorra alguma emergência poderá entrar em co ntato pelo telefone (16) \n99179-5680 disponível 24 horas. Se você tem alguma dúvida sobre seus direitos como \nparticipante da pesquisa ou em caso de julgamento relacionado com uma lesão, entre em contato \ncom o médico do estudo ou o seu médico de confiança. Caso você queira falar com alguém não \ndiretamente envolvido neste estudo sobre os seus direitos, preocupações, danos relacionados à \npesquisa, você pode se comunicar com o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas \nda Faculdade de Medicina de Ribei rão Preto da Universidade de São Paulo no Campus \nUniversitário, S/N, Monte Alegre, Prédio Central, Subsolo - 14048-900 – Ribeirão Preto/SP, \nem (16) 3602-2228 com horário de funcionamento de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min \nàs 17hrs00min. Você também poderá entrar em contato, caso se sentir coagida para aceitar ou \ncontinuar a participar da pesquisa. \n \n15. INFORMAÇÕES ADICIONAIS \nEste estudo encontra-se registrado no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e na Comissão \nNacional de Ética em Pesquisa. Comitê de Ética em Pesquisa (CEP ) é um colegiado que deve \nexistir nas instituições que realizam pesquisa envolvendo seres humanos no Brasil, criado para \ndefender os interesses dos participantes da pesquisa em sua integridade e dignidade e para \ncontribuir no desenvolvimento da pesquisa dent ro de padrões éticos (Resolução nº 466/12 \nConselho Nacional de Saúde).  \n \n16. BIORREPOSITÓRIO  \nBiorrepositório é o armazenamento de material biológico para uso em curto prazo. Esta \npesquisa está vinculada ao biorrepositório de sangue e fluido folicular para avaliação de \ncaracterísticas moleculares (tamanho, concentração e conteúdo de miRNAs das vesí culas \nextracelulares) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP com \no objetivo de guardar amostras de sangue e fluido folicular para o melhor compreendimento da \ninfertilidade por endometriose. Gostaríamos de convidá -la a autor izar a coleta, o depósito, o \narmazenamento e a utilização dos materiais biológicos humano acima discriminados para fins \nde pesquisa e análise científica. Será coletado 20 ml de sangue por punção venosa e amostras \nde fluido folicular por aspiração folicular  no dia da aspiração de folículos durante o seu \ntratamento de Reprodução Assistida. Após coletadas, as amostras serão processadas, \ncongeladas e armazenadas em Biorrepositório localizado no Laboratório de Ginecologia e \nObstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP até que \no material esteja completo para ser analisado. As pesquisadoras responsáveis pela equipe se \ncomprometem a identificar as amostras e os dados coletados por meio do número de prontuário, \nde modo que garan ta o seu sigilo e a sua confidencialidade. Após a conclusão do estudo, \nqualquer material remanescente será destruído de acordo com as boas práticas clínicas. Sua \n\n 89 \nparticipação é voluntária, tendo liberdade de aceitar ou não que a sua amostra seja guardada, \nsem risco de qualquer penalização ou prejuízo no atendimento e tratamento que está recebendo. \nA Sra. também tem o direito de retirar seu consentimento de guarda e  utilização do sangue e \nfluido folicular armazenados a qualquer momento. Solicitamos também os seus dados de \ncontato para possa ser encontrada posteriormente. \n \n17. ASSINALE AS AMOSTRAS QUE DESEJA CONCEDER: \n(   ) Sangue                                     (   ) Fluido Folicular                        \n \n18. CONSENTIMENTO \nAo assinalar as amostras, assinar e datar este termo, você irá confirmar que foi suficiente \ninformada sobre a natureza e a finalidade deste estudo. Confirma também que foi capaz de \ndiscutir dúvidas em detalhes com a pesquisadora, e que estas, foram completamente e \nsatisfatoriamente respondidas. Este termo consta em duas vias. Você receberá uma via datada \ne assinada e a outra via ficará com a pesquisadora. \n \n \n_____________________________________    __________________   ___________ \n  Nome da participante da pesquisa                                Assinatura                     Data \n \n____________________________________    ____________________   ___________ \n  Nome da pesquisadora                                                  Assinatura                     Data \n \n_____________________________________    ____________________   ___________ \nNome do(a) responsável pela coleta                              Assinatura                     Data \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 90 \n2. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE \nMATERIAL BIOLÓGICO  (Grupo Endometriose composto por mulheres inférteis  com \nendometriose Avançada). \n \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO E PARA A GUARDA DE \nMATERIAL BIOLÓGICO \n(Grupo Infértil com Endometriose) \n \n1. NOME DA PESQUISA: “Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do \nfluido folicular de pacientes com endometriose submetidas à estimulação ovariana para \nfertilização in vitro”.  \n \n2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Profa. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro. \n \n3. INFORMAÇÕES À PARTICIPANTE DA PESQUISA \n Você está sendo convidada a participar voluntariamente da pesquisa intitulada \n“Determinação do perfil de miRNA de vesículas extracelulares do fluido folicular de pacientes \ncom endometriose submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro”. Ant es de \ndecidir participar deste estudo, é importante que você leia e compreenda os procedimentos \nenvolvidos. Este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e para a Guarda de \nMaterial Biológico descreve o motivo, os procedimentos e os potenciais ben efícios e \ndesconfortos/riscos desta pesquisa. Por favor, sinta -se à vontade para fazer quantas perguntas \nquiser. É necessário ler e assinar este termo de consentimento antes que você possa participar. \nSua decisão de participar ou não participar neste estudo não terá qualquer interferência sobre o \nseu tratamento para engravidar. \n A endometriose é uma doença caracterizada pela presença do endométrio (tecido que \nreveste o interior do útero) fora da cavidade uterina e é uma causa bastante comum de \ndificuldade para engravidar (denominada infertilidade, que é a não ocorrência de gravidez após \n12 meses de atividade sexual regular sem uso de métodos para evitar a gestação). Nas mulheres \ninférteis com endometriose, questiona -se se um dos motivos responsáveis por essa maior \ndificuldade em engravidar é a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir \nembriões também de má qualidade, impossibilitando a gestação. Dentro do ovário, o óvulo é \nrodeado por camadas de células, chamadas células do cumulus, e está mergulhado em um \nlíquido chamado fluido folicular. Juntos, esses compon entes formam o folículo ovariano e \npermitem o desenvolvimento do óvulo até que ele possa ser fertilizado pelo espermatozoide. \nAlgumas evidências sugerem que na presença da endometriose possa haver modificações nas \nchamadas vesículas extracelulares, que são pequenas estruturas presentes no sangue e no fluido \nfolicular, formadas por uma camada dupla composta de lipídeos e proteínas, e repletas de \nmoléculas em seu interior. Essas vesículas extracelulares permitem a troca de diversos \ncomponentes entre células, ajudando na comunicação celular e agindo na regulação de eventos \nfisiológicos em resposta a condições ambientais específicas, e podem estar envolvidas em \n\n\n 91 \nprocessos normais ou patológicos. Um dos componentes encontrados dentro destas vesículas \nextracelulares são os miRNAs (microRNAs), que são pequenos RNAs (ácidos ribonucléicos), \nconservados ao longo da evolução, que agem como potentes reguladores pós-transcricionais da \nexpressão gênica. Alterações na expressão dos miRNAs podem causar danos aos óvulos, \nprejudicar a sua qualidade e levar à redução das chances de gravidez mesmo quando se realizam \nprocedimentos de fertilização assistida (obtenção e fertilização dos óvulos no laboratório \nutilizando os espermatozoides do parceiro, seguido pela colocação do embrião dentro da \ncavidade uterina). Para saber se realmente existem danos nos óvulos, seria importante analisar \nos componentes do folículo ovariano e o sangue d e mulheres com endometriose e comparar \ncom os de mulheres sem endometriose. Quando é realizada a captação oocitária (procedimento \ndo tratamento de reprodução assistida em que são coletados os óvulos), junto com os óvulos é \naspirado o fluido folicular (que é o líquido no qual os óvulos estão mergulhados e não tem uso \nno tratamento da paciente, sendo descartado). Essa amostra que é descartada (fluido folicular), \njuntamente com a amostra de sangue (coletada durante a anestesia feita para o procedimento de \ncaptação oocitária) serão utilizadas para se avaliar se existem danos nos folículos de mulheres \ncom e sem a doença. \n \n4. POR QUE VOCÊ ESTÁ SENDO CONVIDADA A PARTICIPAR?  \nA senhora está sendo convidada a participar deste estudo na posição de participante da pesquisa \ndo grupo endometriose, para saber se o perfil de miRNAs de microvesículas do fluido folicular \ne do sangue de mulheres com endometriose são alterados em relação aos de mulheres sem a \ndoença. Sua colaboração, portanto, no fornecimento das amostras será fundamental para um \nmelhor conhecimento dos mecanismos envolvidos em casos de infertilidade com endometriose. \nEsses dados também serão fundamentais para um melhor entendimento da qualidade do óvulo, \ne se, quando alterados, podem contribuir para menores chances de gestação em mulheres \ninférteis com endometriose, o que ajudaria na identificação de tratamentos futuros. \n \n5. OBJETIVO DO ESTUDO \nComo não há na literatura nenhuma análise direta da concentração e do tamanho das vesículas \nextracelulares, assim como do conteúdo de miRNAs das vesículas extracelulares presentes no \nsoro e fluido folicular humano de mulheres inférteis com endometriose, o objetivo desse estudo \né isolar e caracterizar vesículas extracelulares e avaliar o perfil de 82 miRNAs maduros e \nprecursores carregados por vesículas extracelulares no soro e fluido folicular de mulheres \ninférteis com endometriose e com infertilidade por f ator tubário e/ou masculino submetidas à \nestimulação ovariana controlada para realização de fertilização in vitro.  \n \n6. O QUE ENVOLVE A SUA PARTICIPAÇÃO? \nPara estudarmos as alterações moleculares de mulheres inférteis com endometriose e compará-\nlos com o que ocorre em mulheres inférteis sem a doença coletaremos uma amostra de sangue \nno dia da captação dos óvulos, antes da anestesia geral. Durante a aspiração folicular (aspiração \ndos óvulos realizada através de um aparelho de ultrassom, em que se é acoplada uma agulha \nque será guiada até o ovário para que seja aspirado seu conteúdo), junto com os óvulos também \nvem o líquido aonde os óvulos se desenvolvem (flu ido folicular). Esse componente é \nnormalmente descartado, não tendo utilidade no procedimento de reprodução assistida, de \nmodo que solicitamos para que seja concedido para a presente pesquisa. A concessão dessa \namostra para este estudo não prejudicará o se u tratamento, nem promoverá intervenções \ncomplementares às da rotina assistencial. Para este estudo não será realizado nenhum \nprocedimento adicional além daquele que você já vai realizar para fazer o tratamento de \nreprodução assistida. A única diferença é que o material que seria descartado será concedido \npara esta pesquisa. Devemos, portanto, ressaltar que este estudo não irá interferir em seu \n\n 92 \ntratamento para engravidar, assim como não causará prejuízo nenhum para sua saúde, nem para \na do futuro bebê.  \n \n7. POSSÍVEIS BENEFÍCIOS \nA sua participação neste estudo não implica em benefícios diretos para você. Caso haja \nbenefícios oriundos da sua participação, eles serão indiretos, ou seja, poderão contribuir para o \nmelhor entendimento dos mecanismos relacionados a pior qualidade do óvu lo em mulheres \ninférteis com endometriose e, talvez, no futuro poderão ser usados no sentido de auxiliar na \nelaboração de novos tratamentos para a infertilidade associada à endometriose.  \n \n8. POSSÍVEIS DESCONFORTOS E RISCOS: \nPara conceder uma amostra de sangue serão coletados 20mL de sangue utilizando a punção \nvenosa realizada pelo anestesista para a realização da sedação endovenosa para a aspiração dos \nfolículos. Pode haver discreto dolorimento local e formação de hematoma, mas estes possíveis \ndesconfortos podem ocorrer pela punção, que será realizada como rotina assistencial. Para \nconceder amostra de fluido folicular não haverá qualquer desconforto adicional ao do \nprocedimento, realizado como parte da rotina assistencial para obtenção dos óvulos para o seu \ntratamento. \n \n9. O QUE ACONTECE SE VOCÊ NÃO QUISER PARTICIPAR? \nSua participação neste estudo é totalmente voluntária. Se você decidir não participar, não haverá \npenalidade, perda de benefícios ou redução na qualidade dos cuidados médicos.  \n \n10. E SE VOCÊ QUISER SAIR DO ESTUDO APÓS TER ACEITADO PARTICIPAR? \nVocê tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a \nqualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Caso \nvocê deseje retirar o seu consentimento, favor notificar as investigadoras, através do número de \ntelefone listado no item 14 deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para a \nGuarda de Material Biológico. \n \n11. SIGILO E DIVULGAÇÃO DE INFORMAÇÕES PESSOAIS \nAsseguramos o total sigilo em relação aos nomes das integrantes deste estudo, bem como \ngarantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua \nprivacidade.  \n \n12. CUSTOS E REMUNERAÇÃO \nÉ importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu \ncompanheiro. Você não terá que pagar para participar deste estudo e nem será paga por sua \nparticipação. Você também não terá que pagar por nenhum procedimento que será real izado \nneste estudo, uma vez que as amostras serão coletadas exclusivamente nos dias que você terá \nretorno no serviço por indicação médica. Todavia, se houver necessidade de comparecer ao \nserviço, exclusivamente para a pesquisa, para fins de esclarecimento ou outra demanda \nrelacionada, você e seu acompanhante terão direito ao ressarcimento dos gastos decorrentes de \nsua participação, como por exemplo gastos com transporte e alimentação.  \n \n13. NO CASO DE DANO RELACIONADO À PESQUISA \nA Resolução CNS N° 466 de 2012 define como dano associado (ou decorrente) da pesquisa o \n“agravo imediato ou posterior, direto ou indireto, ao indivíduo ou à coletividade, decorrente da \npesquisa” (item II.6). Caso você sofra algum dano supostamente relacion ado a esta pesquisa, \nvocê tem o direito de buscar indenização, assim como direito à assistência integral imediata, de \n\n 93 \nforma gratuita, pelo tempo que for necessário providenciada pelas pesquisadoras e pelo \nHC/FMRP-USP/SP como estabelecido dentro do padrão internacional de boas práticas clínicas \ne resolução vigente no Brasil. \n \n14. CONTATO PARA MAIS INFORMAÇÕES  \nAs pesquisadoras estarão disponíveis para responder a quaisquer perguntas que você possa ter \nem relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante a investigação da causa da \ninfertilidade ou do seu tratamento para engravidar. Se você tiver alguma dú vida sobre esta \npesquisa, você pode entrar em contato com uma das pesquisadoras principais (Profa. Dra. Paula \nAndrea de A. Salles Navarro, Dra Michele Gomes da Broi e Mayra Beraldo Andozia) pelos \ntelefones (16) 3602 -2816 e/ou (16) 3602 -2815 ou procurá -las diretamente no setor de \nReprodução Humana do HC -FMRP-USP, sito à avenida Bandeirantes, 3900, Campus \nUniversitário da USP, 1º andar, Ribeirão Preto, SP, de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min \nàs 16hrs00min. Caso ocorra alguma emergência poderá entrar em co ntato pelo telefone (16) \n99179-5680 disponível 24 horas. Se você tem alguma dúvida sobre seus direitos como \nparticipante da pesquisa ou em caso de julgamento relacionado com uma lesão, entre em contato \ncom o médico do estudo ou o seu médico de confiança. Caso você queira falar com alguém não \ndiretamente envolvido neste estudo sobre os seus direitos, preocupações, danos relacionados à \npesquisa, você pode se comunicar com o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas \nda Faculdade de Medicina de Ribei rão Preto da Universidade de São Paulo no Campus \nUniversitário, S/N, Monte Alegre, Prédio Central, Subsolo - 14048-900 – Ribeirão Preto/SP, \nem (16) 3602-2228 com horário de funcionamento de Segunda à Sexta -feira das 08hrs00min \nàs 17hrs00min. Você também poderá entrar em contato, caso se sentir coagida para aceitar ou \ncontinuar a participar da pesquisa. \n \n15. INFORMAÇÕES ADICIONAIS \nEste estudo encontra-se registrado no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e na Comissão \nNacional de Ética em Pesquisa. Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) é um colegiado  que deve \nexistir nas instituições que realizam pesquisa envolvendo seres humanos no Brasil, criado para \ndefender os interesses dos participantes da pesquisa em sua integridade e dignidade e para \ncontribuir no desenvolvimento da pesquisa dentro de padrões éticos (Resolução nº 466/12 \nConselho Nacional de Saúde).  \n \n16. BIORREPOSITÓRIO  \nBiorrepositório é o armazenamento de material biológico para uso em curto prazo. Esta \npesquisa está vinculada ao biorrepositório de sangue e fluido folicular para avaliação de \ncaracterísticas moleculares (tamanho, concentração e conteúdo de miRNAs das vesí culas \nextracelulares) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP com \no objetivo de guardar amostras de sangue e fluido folicular para o melhor compreendimento da \ninfertilidade por endometriose. Gostaríamos de convidá -la a autor izar a coleta, o depósito, o \narmazenamento e a utilização dos materiais biológicos humano acima discriminados para fins \nde pesquisa e análise científica. Será coletado 20 ml de sangue por punção venosa e amostras \nde fluido folicular por aspiração folicular  no dia da aspiração de folículos durante o seu \ntratamento de Reprodução Assistida. Após coletadas, as amostras serão processadas, \ncongeladas e armazenadas em Biorrepositório localizado no Laboratório de Ginecologia e \nObstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP até que \no material esteja completo para ser analisado. As pesquisadoras responsáveis pela equipe se \ncomprometem a identificar as amostras e os dados coletados por meio do número de prontuário, \nde modo que garan ta o seu sigilo e a sua confidencialidade. Após a conclusão do estudo, \n\n 94 \nqualquer material remanescente será destruído de acordo com as boas práticas clínicas. Sua \nparticipação é voluntária, tendo liberdade de aceitar ou não que a sua amostra seja guardada, \nsem risco de qualquer penalização ou prejuízo no atendimento e tratamento que está recebendo. \nA Sra. também tem o direito de retirar seu consentimento de guarda e utilização do sangue e \nfluido folicular armazenados a qualquer momento. Solicitamos também os seus dados de \ncontato para possa ser encontrada posteriormente. \n \n17. ASSINALE AS AMOSTRAS QUE DESEJA CONCEDER: \n(   ) Sangue                                     (   ) Fluido Folicular                        \n \n18. CONSENTIMENTO \nAo assinalar as amostras, assinar e datar este termo, você irá confirmar que foi suficiente \ninformada sobre a natureza e a finalidade deste estudo. Confirma também que foi capaz de \ndiscutir dúvidas em detalhes com a pesquisadora, e que estas, foram complet amente e \nsatisfatoriamente respondidas. Este termo consta em duas vias. Você receberá uma via datada \ne assinada e a outra via ficará com a pesquisadora. \n \n \n_____________________________________    __________________   ___________ \n  Nome da participante da pesquisa                                Assinatura                     Data \n \n____________________________________    ____________________   ___________ \n  Nome da pesquisadora                                                  Assinatura                     Data \n \n_____________________________________    ____________________   ___________ \nNome do(a) responsável pela coleta                              Assinatura                      Data \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 95 \nANEXO C \nTabela 1 – Vias preditas de serem reguladas pelo microRNA que foi exclusivo nas Vesículas \nExtracelulares obtidas do fluido olicular do grupo Controle \n \nVias preditas de serem reguladas pelo miR-155-5p exclusivo do grupo controle \nKEGG pathway Genes(n) miRNA(n) miRNA p-value \nPathways in cancer 39 1 hsa-miR-155-5p 1.7082821001798e-08 \nSignaling pathways regulating \npluripotency of stem cells 18 1 hsa-miR-155-5p 1.46653958316825e-07 \nBreast cancer 17 1 hsa-miR-155-5p 1.39200098334898e-06 \nGastric cancer 17 1 hsa-miR-155-5p 1.27670540244495e-06 \nProlactin signaling pathway 11 1 hsa-miR-155-5p 3.04860812905044e-06 \nColorectal cancer 12 1 hsa-miR-155-5p 3.19524553427849e-06 \nMAPK signaling pathway 24 1 hsa-miR-155-5p 6.4569646849647e-06 \nT cell receptor signaling \npathway 13 1 hsa-miR-155-5p 1.03619549987702e-05 \nAcute myeloid leukemia 10 1 hsa-miR-155-5p 1.23548219893408e-05 \nHepatocellular carcinoma 16 1 hsa-miR-155-5p 1.80714184538805e-05 \nLongevity regulating pathway 12 1 hsa-miR-155-5p 2.03740713124604e-05 \nHedgehog signaling pathway 9 1 hsa-miR-155-5p 2.21892728827181e-05 \nNeurotrophin signaling \npathway 13 1 hsa-miR-155-5p 2.35449069568732e-05 \nRap1 signaling pathway 17 1 hsa-miR-155-5p 5.25965426483445e-05 \nPI3K-Akt signaling pathway 24 1 hsa-miR-155-5p 4.91944244993311e-05 \nmTOR signaling pathway 15 1 hsa-miR-155-5p 7.00785200446317e-05 \nTGF-beta signaling pathway 11 1 hsa-miR-155-5p 8.47733291408408e-05 \nRenal cell carcinoma 9 1 hsa-miR-155-5p 8.90950126723118e-05 \ncAMP signaling pathway 17 1 hsa-miR-155-5p 0.000103728587314935 \nAMPK signaling pathway 12 1 hsa-miR-155-5p 0.000167519667740704 \nEndometrial cancer 8 1 hsa-miR-155-5p 0.000191210468245777 \nInsulin signaling pathway 13 1 hsa-miR-155-5p 0.000207837942930446 \nRas signaling pathway 17 1 hsa-miR-155-5p 0.000225612560296029 \nEGFR tyrosine kinase \ninhibitor resistance 9 1 hsa-miR-155-5p 0.000304570150211147 \nProstate cancer 10 1 hsa-miR-155-5p 0.000332208817362951 \nB cell receptor signaling \npathway 11 1 hsa-miR-155-5p 0.000356820163790912 \nAutophagy - animal 12 1 hsa-miR-155-5p 0.000492272523933608 \nHepatitis C 13 1 hsa-miR-155-5p 0.000683547022611071 \nHepatitis B 13 1 hsa-miR-155-5p 0.000846857057981338 \nEndocrine resistance 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00113777747916423 \nOsteoclast differentiation 13 1 hsa-miR-155-5p 0.00115252279949868 \nRelaxin signaling pathway 11 1 hsa-miR-155-5p 0.00108318361237378 \nPancreatic cancer 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00103390169896483 \nChronic myeloid leukemia 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00112457460316882 \nUbiquitin mediated proteolysis 11 1 hsa-miR-155-5p 0.00136789954307524 \n\n 96 \nHippo signaling pathway 12 1 hsa-miR-155-5p 0.00137565509346418 \nBasal cell carcinoma 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00174297636041243 \nErbB signaling pathway 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00195151282183209 \nCholine metabolism in cancer 9 1 hsa-miR-155-5p 0.00196868329609854 \nProteoglycans in cancer 14 1 hsa-miR-155-5p 0.00215175965236356 \nGrowth hormone synthesis, \nsecretion and action 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00222827388098867 \nTNF signaling pathway 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00249593820097659 \nRegulation of actin \ncytoskeleton 14 1 hsa-miR-155-5p 0.00254107337242014 \nAmphetamine addiction 7 1 hsa-miR-155-5p 0.0033679300250272 \nTranscriptional misregulation \nin cancer 13 1 hsa-miR-155-5p 0.00329930995350718 \nFoxO signaling pathway 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00383565080517514 \nMitophagy - animal 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00391290419299402 \nMelanoma 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00391290419299402 \nParathyroid hormone \nsynthesis, secretion and action 9 1 hsa-miR-155-5p 0.00407602898024067 \nLongevity regulating pathway \n- multiple species 7 1 hsa-miR-155-5p 0.00485268105795882 \nShigellosis 15 1 hsa-miR-155-5p 0.00512983324934412 \nPD-L1 expression and PD -1 \ncheckpoint pathway in cancer 8 1 hsa-miR-155-5p 0.0052962132881104 \nCellular senescence 13 1 hsa-miR-155-5p 0.0055281064796357 \nInsulin resistance 9 1 hsa-miR-155-5p 0.00564293040241742 \nYersinia infection 10 1 hsa-miR-155-5p 0.0056908791289624 \nFluid shear stress and \natherosclerosis 10 1 hsa-miR-155-5p 0.00624933730836738 \nIL-17 signaling pathway 8 1 hsa-miR-155-5p 0.00706175852352549 \nCushing syndrome 11 1 hsa-miR-155-5p 0.00715034497313553 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n 97 \nTabela 2  – Vias preditas de serem reguladas pelos microRNAs exclusivos nas Vesículas \nExtracelulares obtidas do fluido folicular do grupo endometriose. \n \nVias preditas de serem reguladas pelos miRNAs exclusivos do grupo endometriose \nKEEG pathway Genes(n) miRNAs(n) miRNAs P-value \nAxon guidance 186 8 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n9.4378E-43 \nPathways in cancer 555 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271-\n5p \n3.34994E-36 \nFocal adhesion 213 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271-\n5p \n5.88356E-33 \nErbB signaling pathway 86 8 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n1.98927E-30 \nProteoglycans in cancer 220 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n4.48216E-29 \nRas signaling pathway 241 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-196b-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n4.024E-26 \nEGFR tyrosine kinase \ninhibitor resistance \n82 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271-\n5p \n1.06088E-25 \nGastric cancer 162 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p \n2.45645E-24 \nRegulation of actin \ncytoskeleton \n224 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n7.59839E-24 \nPI3K-Akt signaling pathway 372 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n1.39805E-23 \nHepatocellular carcinoma 177 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p \n1.61794E-23 \nMAPK signaling pathway 329 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n7.05733E-23 \nNeurotrophin signaling \npathway \n124 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n1.05882E-22 \nProstate cancer 101 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n5.64496E-22 \nFoxO signaling pathway 139 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n6.12314E-22 \n\n 98 \nBreast cancer 163 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p \n9.26413E-22 \nChronic myeloid leukemia 79 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271-\n5p \n1.74639E-20 \nProlactin signaling pathway 73 8 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n3.80908E-20 \nGrowth hormone synthesis, \nsecretion and action \n129 6 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n4.70448E-20 \nRap1 signaling pathway 214 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n2.09964E-19 \nWnt signaling pathway 173 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p \n2.53497E-19 \nGlioma 79 7 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-1271-\n5p \n5.46939E-19 \nAutophagy - animal 146 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-628-5p,hsa-miR-1271-5p \n6.5557E-19 \nRenal cell carcinoma 70 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n1.19314E-18 \nHippo signaling pathway 164 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p \n2.17882E-18 \nPancreatic cancer 78 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p \n2.4184E-17 \nPhospholipase D signaling \npathway \n158 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n1.61262E-16 \nColorectal cancer 88 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n1.85421E-16 \nThyroid hormone signaling \npathway \n137 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-1271-5p \n4.64221E-16 \nCholinergic synapse 122 4 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-628-5p,hsa-miR-1271-5p \n6.97279E-16 \nMelanoma 76 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p \n9.46292E-16 \nSignaling pathways \nregulating pluripotency of \nstem cells \n156 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p \n5.87167E-15 \nCholine metabolism in \ncancer \n106 7 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-196b-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n8.95199E-15 \nNon-small cell lung cancer 81 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n1.48165E-14 \n\n 99 \nmTOR signaling pathway 177 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p \n1.71812E-14 \nCushing syndrome 176 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n2.44396E-14 \nLongevity regulating \npathway \n105 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n9.03347E-14 \nEndometrial cancer 61 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-628-5p \n2.12097E-13 \nHIF-1 signaling pathway 112 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p \n3.20803E-13 \nOxytocin signaling pathway 161 4 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-628-5p,hsa-miR-1271-5p \n3.55966E-13 \nInsulin signaling pathway 153 5 hsa-miR-196b-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n7.17309E-13 \ncGMP-PKG signaling \npathway \n175 4 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n8.20348E-13 \ncAMP signaling pathway 226 4 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n2.37555E-12 \nParathyroid hormone \nsynthesis, secretion and \naction \n118 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n7.83029E-12 \nRelaxin signaling pathway 138 5 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n1.33419E-11 \nTranscriptional \nmisregulation in cancer \n206 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n4.54701E-11 \nAMPK signaling pathway 130 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n628-5p,hsa-miR-1271-5p \n5.23827E-11 \nInsulin resistance 124 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n9.50627E-11 \nGnRH secretion 74 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n1.15554E-10 \nHedgehog signaling pathway 59 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-628-5p \n1.21932E-10 \nSpinocerebellar ataxia 145 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-\n1271-5p \n1.55581E-10 \nShigellosis 268 3 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n1.75526E-10 \nGlutamatergic synapse 117 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n2.13268E-10 \nSmall cell lung cancer 100 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-628-5p \n2.52305E-10 \nEndocrine resistance 118 6 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p,hsa-miR-1271-5p \n2.91047E-10 \nTGF-beta signaling pathway 103 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-22-5p \n2.9401E-10 \nCircadian rhythm 31 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p \n3.16582E-10 \n\n 100 \nHepatitis B 177 5 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-miR-\n22-5p \n3.54175E-10 \nEndocytosis 311 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-542-5p \n1.22709E-09 \nHuman papillomavirus \ninfection \n406 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-150-5p,hsa-miR-542-5p \n1.54669E-09 \nMitophagy - animal 76 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-28-5p,hsa-\nmiR-708-5p \n1.935E-09 \nCalcium signaling pathway 246 3 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n2.52872E-09 \nBasal cell carcinoma 66 3 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p \n2.65591E-09 \nMelanogenesis 107 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n3.97953E-09 \nUbiquitin mediated \nproteolysis \n142 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-628-5p \n7.17708E-09 \nAdherens junction 79 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n7.16138E-09 \nPhosphatidylinositol \nsignaling system \n101 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-542-5p,hsa-miR-22-5p \n1.62221E-08 \nLong-term potentiation 71 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 2.57699E-08 \nMorphine addiction 101 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 3.38036E-08 \nYersinia infection 147 4 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n3.47633E-08 \nSphingolipid signaling \npathway \n133 4 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n3.77314E-08 \nCircadian entrainment 100 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n5.97257E-08 \nApelin signaling pathway 140 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 6.63398E-08 \nGap junction 99 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n1.20594E-07 \nDopaminergic synapse 143 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n1.21322E-07 \np53 signaling pathway 75 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-22-5p \n1.37937E-07 \nAGE-RAGE signaling \npathway in diabetic \ncomplications \n115 3 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n1.62998E-07 \nMicroRNAs in cancer 334 3 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n1.79038E-07 \nAldosterone-regulated \nsodium reabsorption \n37 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 1.81935E-07 \nBacterial invasion of \nepithelial cells \n80 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-1271-5p 2.37426E-07 \nMetabolic pathways 1634 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p 9.02745E-07 \nInsulin secretion 92 4 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-542-5p,hsa-\nmiR-22-5p,hsa-miR-1271-5p \n1.00185E-06 \nGnRH signaling pathway 97 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 1.07911E-06 \nGlycosaminoglycan \nbiosynthesis - heparan \nsulfate / heparin \n25 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-628-5p 1.19641E-06 \nAdrenergic signaling in \ncardiomyocytes \n161 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n1.41694E-06 \nLysine degradation 69 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-628-5p \n1.47688E-06 \nBladder cancer 43 1 hsa-miR-17-5p 3.62217E-06 \n\n 101 \nFc gamma R -mediated \nphagocytosis \n101 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n4.16888E-06 \nT cell receptor signaling \npathway \n115 3 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n4.76595E-06 \nOther types of O -glycan \nbiosynthesis \n49 3 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-628-5p \n5.1787E-06 \nChemokine signaling \npathway \n215 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n5.29581E-06 \nLongevity regulating \npathway - multiple species \n79 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 5.29405E-06 \nLong-term depression 64 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 7.07134E-06 \nGABAergic synapse 100 3 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p,hsa-\nmiR-1271-5p \n7.27105E-06 \nHepatitis C 173 2 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p 1.79956E-05 \nKaposi sarcoma -associated \nherpesvirus infection \n245 2 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-150-5p 2.83155E-05 \nPD-L1 expression and PD -1 \ncheckpoint pathway in \ncancer \n101 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 2.91058E-05 \nType II diabetes mellitus 57 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 3.02081E-05 \nRenin secretion 72 1 hsa-miR-1271-5p 6.12652E-05 \nPlatelet activation 136 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 9.8217E-05 \nInflammatory mediator \nregulation of TRP channels \n101 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 9.76255E-05 \nEstrogen signaling pathway 167 1 hsa-miR-1271-5p 0.000115798 \nAutophagy - other 33 1 hsa-miR-22-5p 0.000127825 \nCentral carbon metabolism \nin cancer \n74 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 0.000140677 \nCortisol synthesis and \nsecretion \n78 1 hsa-miR-1271-5p 0.000143931 \nGlycosaminoglycan \nbiosynthesis - chondroitin \nsulfate / dermatan sulfate \n21 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p 0.000162985 \nProgesterone-mediated \noocyte maturation \n104 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-1271-5p 0.000179463 \nAcute myeloid leukemia 69 2 hsa-miR-9-5p,hsa-miR-22-5p 0.000215008 \nPlatinum drug resistance 75 1 hsa-miR-22-5p 0.000236272 \nHuman cytomegalovirus \ninfection \n306 2 hsa-miR-17-5p,hsa-miR-1271-5p 0.000267408 \nAlanine, aspartate and \nglutamate metabolism \n38 1 hsa-miR-22-5p 0.000271981 \nVasopressin-regulated water \nreabsorption \n47 1 hsa-miR-9-5p 0.000308966 \nSynaptic vesicle cycle 89 1 hsa-miR-542-5p 0.000350263 \nN-Glycan biosynthesis 51 1 hsa-miR-22-5p 0.000430406 \nAldosterone synthesis and \nsecretion \n110 1 hsa-miR-1271-5p 0.000451751 \nFluid shear stress and \natherosclerosis \n149 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 0.000450863 \nAdipocytokine signaling \npathway \n88 1 hsa-miR-22-5p 0.000519492 \nSalmonella infection 277 1 hsa-miR-150-5p 0.000622366 \nVascular smooth muscle \ncontraction \n138 2 hsa-miR-22-5p,hsa-miR-1271-5p 0.000642268 \nGlucagon signaling pathway 114 1 hsa-miR-1271-5p 0.000663888 \n\n 102 \nPathogenic Escherichia coli \ninfection \n222 1 hsa-miR-22-5p 0.00082426 \nNicotine addiction 42 1 hsa-miR-22-5p 0.000836426 \nEndocrine and other factor -\nregulated calcium \nreabsorption \n57 2 hsa-miR-542-5p,hsa-miR-22-5p 0.000868276 \nMucin type O -glycan \nbiosynthesis \n34 1 hsa-miR-22-5p 0.000889629 \nMeasles 161 2 hsa-miR-150-5p,hsa-miR-22-5p 0.001015487 \nSNARE interactions in \nvesicular transport \n33 1 hsa-miR-22-5p 0.001592813 \nAmphetamine addiction 74 1 hsa-miR-542-5p 0.003077163 \nInositol phosphate \nmetabolism \n78 1 hsa-miR-22-5p 0.00325241 \nOocyte meiosis 134 1 hsa-miR-1271-5p 0.003420484 \nCellular senescence 219 1 hsa-miR-1271-5p 0.004027249 \nHuman immunodeficiency \nvirus 1 infection \n277 1 hsa-miR-1271-5p 0.004012487 \nJAK-STAT signaling \npathway \n168 1 hsa-miR-22-5p 0.004152533 \nRegulation of lipolysis in \nadipocytes \n61 1 hsa-miR-22-5p 0.004408795 \nLeukocyte transendothelial \nmigration \n120 1 hsa-miR-542-5p 0.005264539 \nPantothenate and CoA \nbiosynthesis \n21 1 hsa-miR-22-5p 0.005312422 \nPyrimidine metabolism 57 1 hsa-miR-628-5p 0.006614233 \nFc epsilon RI signaling \npathway \n79 1 hsa-miR-1271-5p 0.006701088 \nPurine metabolism 137 1 hsa-miR-9-5p 0.006979135 \nSphingolipid metabolism 59 1 hsa-miR-9-5p 0.00726121 \nGastric acid secretion 80 1 hsa-miR-542-5p 0.007378341 \nbeta-Alanine metabolism 30 1 hsa-miR-22-5p 0.008317317 \nHippo signaling pathway - \nmultiple species \n30 1 hsa-miR-22-5p 0.008317317 \nSerotonergic synapse 126 1 hsa-miR-22-5p 0.008305937 \nTNF signaling pathway 131 1 hsa-miR-22-5p 0.008690432 \nCell cycle 129 1 hsa-miR-22-5p 0.009406269 \nCocaine addiction 53 1 hsa-miR-542-5p 0.010274138 \nNicotinate and nicotinamide \nmetabolism \n37 1 hsa-miR-22-5p 0.010704334 \nArrhythmogenic right \nventricular cardiomyopathy \n79 1 hsa-miR-22-5p 0.015135863 \nRetrograde \nendocannabinoid signaling \n166 1 hsa-miR-22-5p 0.016269375 \n \n \n \n \n \n\n 103 \nTabela 3 – Vias preditas de serem reguladas pelos microRNAs diferencialmente expressos em \nVesículas extracelulares isoladas do fluido folicular do grupo controle x endometriose. \n \nVias preditas de serem reguladas pelos miRNAs diferencialmente expressos entre \nos grupos controle e endometriose \nKEEG pathway Genes(n) miRNAs (n) miRNAs p-value \nAxon guidance 186 15 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24-\n3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-\n92a-3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-\nmiR-139-5p,hsa-miR-214-\n3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-\n145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-885-\n5p,hsa-miR-504-3p \n3.1199E-61 \nPathways in cancer 555 11 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24-\n3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-\n139-5p,hsa-miR-214-3p,hsa-\nmiR-141-3p,hsa-miR-206,hsa-\nmiR-330-3p,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n3.078E-44 \nProteoglycans in cancer 220 12 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n139-5p,hsa-miR-141-3p,hsa-\nmiR-145-5p,hsa-miR-206,hsa-\nmiR-330-3p,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n885-5p,hsa-miR-504-3p \n1.7324E-42 \nErbB signaling pathway 86 11 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n139-5p,hsa-miR-214-3p,hsa-\nmiR-145-5p,hsa-miR-330-\n3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-885-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n3.0197E-33 \nHippo signaling pathway 164 9 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-139-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n4.2453E-31 \nRap1 signaling pathway 214 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214-\n3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-\n145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n3.5759E-29 \nRas signaling pathway 241 11 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24-\n3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-\n30c-5p,hsa-miR-139-5p,hsa-\nmiR-214-3p,hsa-miR-145-\n5p,hsa-miR-206,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n1.6382E-28 \nSignaling pathways \nregulating pluripotency of \nstem cells \n156 12 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n30c-5p,hsa-miR-214-3p,hsa-\n4.5103E-28 \n\n 104 \nmiR-145-5p,hsa-miR-206,hsa-\nmiR-330-3p,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n885-5p,hsa-miR-504-3p \ncAMP signaling pathway 226 8 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-139-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-330-3p,hsa-\nmiR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n5.0406E-27 \nWnt signaling pathway 173 9 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n141-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n2.6904E-26 \nFoxO signaling pathway 139 8 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n30c-5p,hsa-miR-214-3p,hsa-\nmiR-145-5p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n2.2462E-25 \nRegulation of actin \ncytoskeleton \n224 9 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-\nmiR-206,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n1.1657E-24 \nMAPK signaling pathway 329 8 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24-\n3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-\n141-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-\nmiR-206,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n3.9899E-24 \nEGFR tyrosine kinase \ninhibitor resistance \n82 10 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-24-\n3p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-\n92a-3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-\nmiR-214-3p,hsa-miR-206,hsa-\nmiR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n1.2401E-22 \nFocal adhesion 213 8 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-139-\n5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n1.2578E-22 \nNeurotrophin signaling \npathway \n124 9 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n30c-5p,hsa-miR-214-3p,hsa-\nmiR-145-5p,hsa-miR-206,hsa-\nmiR-330-3p,hsa-miR-504-3p \n2.2452E-22 \nOxytocin signaling pathway 161 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-\nmiR-206,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n9.5709E-22 \nTGF-beta signaling pathway 103 9 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-\nmiR-206,hsa-miR-330-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n2.1687E-21 \ncGMP-PKG signaling \npathway \n175 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-504-3p \n5.5642E-21 \n\n 105 \nDopaminergic synapse 143 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-139-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n7.0896E-21 \nMelanogenesis 107 7 hsa-miR-24-3p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-504-3p \n1.6499E-20 \nRenal cell carcinoma 70 9 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n139-5p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n330-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-\nmiR-425-3p,hsa-miR-504-3p \n9.22E-20 \nApelin signaling pathway 140 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-504-3p \n2.1224E-19 \nCalcium signaling pathway 246 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n3.5336E-19 \nCushing syndrome 176 7 hsa-miR-24-3p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-504-3p \n3.653E-19 \nUbiquitin mediated \nproteolysis \n142 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-885-5p \n1.1433E-18 \nCholinergic synapse 122 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n1.5974E-18 \nGrowth hormone synthesis, \nsecretion and action \n129 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-330-3p,hsa-\nmiR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n4.8847E-18 \nAdrenergic signaling in \ncardiomyocytes \n161 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-206,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n5.3216E-18 \nGlutamatergic synapse 117 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n141-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n3.0679E-17 \nCircadian entrainment 100 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n4.339E-17 \nHepatocellular carcinoma 177 7 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-504-3p \n5.0834E-17 \nLong-term potentiation 71 8 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n7.3577E-17 \n\n 106 \nInsulin signaling pathway 153 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n330-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-504-3p \n1.5216E-16 \nGlioma 79 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n9.2763E-16 \nTranscriptional \nmisregulation in cancer \n206 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-\n145-5p,hsa-miR-206,hsa-miR-\n574-5p \n1.6791E-15 \nPI3K-Akt signaling pathway 372 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214-\n3p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-504-3p \n1.9349E-15 \nCholine metabolism in \ncancer \n106 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n504-3p \n2.5231E-15 \nColorectal cancer 88 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n139-5p,hsa-miR-504-3p \n3.4899E-15 \nAMPK signaling pathway 130 7 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n141-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-574-5p,hsa-miR-504-3p \n5.2235E-15 \nThyroid hormone signaling \npathway \n137 5 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-504-3p \n1.6224E-14 \nBreast cancer 163 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-206,hsa-miR-330-\n3p,hsa-miR-504-3p \n8.4306E-14 \nGastric cancer 162 4 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-\n504-3p \n9.9904E-14 \nPhosphatidylinositol \nsignaling system \n101 5 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-504-3p \n1.7273E-13 \nSphingolipid signaling \npathway \n133 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n574-5p,hsa-miR-504-3p \n2.7151E-13 \nPancreatic cancer 78 6 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n4.2331E-13 \nPhospholipase D signaling \npathway \n158 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n7.2665E-13 \nChronic myeloid leukemia 79 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-141-\n3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-330-3p,hsa-miR-\n504-3p \n8.8188E-13 \nHedgehog signaling pathway 59 4 hsa-miR-141-3p,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n1.0921E-12 \nInsulin resistance 124 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n425-3p \n1.1656E-12 \n\n 107 \nTight junction 182 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-141-\n3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-425-3p \n1.1979E-12 \nAdherens junction 79 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-145-\n5p,hsa-miR-206,hsa-miR-574-\n5p \n1.2487E-12 \nAutophagy - animal 146 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-425-3p,hsa-\nmiR-504-3p \n2.489E-12 \nInflammatory mediator \nregulation of TRP channels \n101 6 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-\nmiR-504-3p \n3.0953E-12 \nMorphine addiction 101 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-139-\n5p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n3.4361E-12 \nArrhythmogenic right \nventricular cardiomyopathy \n79 4 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-\n504-3p \n6.5999E-12 \nLongevity regulating \npathway \n105 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-425-3p \n1.6252E-11 \nEndocytosis 311 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-574-5p \n2.1961E-11 \nYersinia infection 147 6 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n504-3p \n3.1178E-11 \nGnRH secretion 74 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n574-5p \n1.0064E-10 \nHepatitis B 177 6 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n214-3p,hsa-miR-141-3p,hsa-\nmiR-504-3p \n1.074E-10 \nGnRH signaling pathway 97 5 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-206,hsa-miR-330-\n3p,hsa-miR-504-3p \n2.3141E-10 \nBacterial invasion of \nepithelial cells \n80 4 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-145-\n5p,hsa-miR-206,hsa-miR-425-\n3p \n2.9417E-10 \nAGE-RAGE signaling \npathway in diabetic \ncomplications \n115 4 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n574-5p \n4.0278E-10 \nAldosterone synthesis and \nsecretion \n110 4 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-145-\n5p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n7.4413E-10 \nShigellosis 268 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-145-\n5p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-\n425-3p \n1.1834E-09 \nSpinocerebellar ataxia 145 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-30c-5p,hsa-miR-\n574-5p \n1.6678E-09 \nParathyroid hormone \nsynthesis, secretion and \naction \n118 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-\n504-3p \n2.3065E-09 \nEndometrial cancer 61 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-504-3p \n2.6649E-09 \n\n 108 \nFc gamma R -mediated \nphagocytosis \n101 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-425-3p \n3.3057E-09 \nmTOR signaling pathway 177 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-141-\n3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n504-3p \n4.6167E-09 \nMelanoma 76 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-504-3p \n6.8266E-09 \nInsulin secretion 92 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n6.9822E-09 \nOther types of O -glycan \nbiosynthesis \n49 3 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n8.0493E-09 \nHIF-1 signaling pathway 112 5 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-31-\n5p,hsa-miR-214-3p,hsa-miR-\n425-3p,hsa-miR-504-3p \n7.8667E-09 \nGastric acid secretion 80 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n8.0709E-09 \nCentral carbon metabolism \nin cancer \n74 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-151a-3p \n1.1578E-08 \nCircadian rhythm 31 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504-\n3p \n3.5746E-08 \nProstate cancer 101 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214-\n3p,hsa-miR-504-3p \n5.4776E-08 \nSynaptic vesicle cycle 89 2 hsa-miR-141-3p,hsa-miR-504-\n3p \n1.0662E-07 \nAmphetamine addiction 74 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-504-3p \n1.3595E-07 \nRegulation of lipolysis in \nadipocytes \n61 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-214-3p \n1.8369E-07 \nSNARE interactions in \nvesicular transport \n33 2 hsa-miR-24-3p,hsa-miR-504-\n3p \n2.2978E-07 \nLong-term depression 64 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n2.3538E-07 \nHypertrophic \ncardiomyopathy \n99 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-30c-\n5p,hsa-miR-504-3p \n3.3844E-07 \nLongevity regulating \npathway - multiple species \n79 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-425-3p \n5.8965E-07 \nEndocrine and other factor -\nregulated calcium \nreabsorption \n57 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n7.2168E-07 \nInositol phosphate \nmetabolism \n78 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-504-3p \n7.3065E-07 \nMetabolic pathways 1634 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504-\n3p \n9.1321E-07 \nNon-small cell lung cancer 81 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-504-3p \n1.0248E-06 \nHuman papillomavirus \ninfection \n406 3 hsa-miR-206,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-504-3p \n1.3952E-06 \nBasal cell carcinoma 66 1 hsa-miR-504-3p 1.5422E-06 \nPlatelet activation 136 4 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-425-3p,hsa-miR-\n504-3p \n1.9802E-06 \nSmall cell lung cancer 100 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p,hsa-miR-504-3p \n2.4182E-06 \nMannose type O -glycan \nbiosynthesis \n24 1 hsa-miR-425-3p 2.9728E-06 \nPentose and glucuronate \ninterconversions \n37 1 hsa-miR-141-3p 3.3235E-06 \n\n 109 \np53 signaling pathway 75 3 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-504-3p \n3.3359E-06 \nThyroid hormone synthesis 84 3 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n4.3938E-06 \nMicroRNAs in cancer 334 2 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-92a-\n3p \n5.0467E-06 \nEndocrine resistance 118 3 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-\n206,hsa-miR-504-3p \n5.6319E-06 \nProlactin signaling pathway 73 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504-\n3p \n8.4044E-06 \nAscorbate and aldarate \nmetabolism \n33 1 hsa-miR-141-3p 9.5755E-06 \nDilated cardiomyopathy 107 2 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-504-\n3p \n9.6074E-06 \nMucin type O -glycan \nbiosynthesis \n34 3 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-574-\n5p,hsa-miR-504-3p \n1.283E-05 \nVEGF signaling pathway 61 3 hsa-miR-206,hsa-miR-425-\n3p,hsa-miR-504-3p \n1.351E-05 \nNicotine addiction 42 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-574-\n5p \n1.4661E-05 \nGlycerophospholipid \nmetabolism \n116 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-504-\n3p \n1.5606E-05 \nRelaxin signaling pathway 138 2 hsa-miR-574-5p,hsa-miR-504-\n3p \n2.1446E-05 \nCocaine addiction 53 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-425-\n3p \n3.0169E-05 \nVascular smooth muscle \ncontraction \n138 2 hsa-miR-574-5p,hsa-miR-504-\n3p \n3.512E-05 \nHippo signaling pathway - \nmultiple species \n30 2 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-574-\n5p \n3.7776E-05 \nGABAergic synapse 100 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-574-\n5p \n4.6238E-05 \nGlycosaminoglycan \nbiosynthesis - heparan \nsulfate / heparin \n25 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-214-\n3p \n4.9696E-05 \nGlycosaminoglycan \nbiosynthesis - chondroitin \nsulfate / dermatan sulfate \n21 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-206 5.0949E-05 \nAcute myeloid leukemia 69 2 hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-504-\n3p \n6.0219E-05 \nVibrio cholerae infection 60 2 hsa-miR-206,hsa-miR-425-3p 6.3859E-05 \nLeukocyte transendothelial \nmigration \n120 2 hsa-miR-425-3p,hsa-miR-574-\n5p \n9.5797E-05 \nCellular senescence 219 2 hsa-miR-21-5p,hsa-miR-206 9.8322E-05 \nThyroid cancer 43 2 hsa-miR-206,hsa-miR-504-3p 0.00010927 \nPorphyrin and chlorophyll \nmetabolism \n46 1 hsa-miR-141-3p 0.00016326 \nAldosterone-regulated \nsodium reabsorption \n37 2 hsa-miR-206,hsa-miR-574-5p 0.00016287 \nCytokine-cytokine receptor \ninteraction \n333 1 hsa-miR-21-5p 0.00019752 \nRetrograde \nendocannabinoid signaling \n166 1 hsa-miR-574-5p 0.00026432 \nVasopressin-regulated water \nreabsorption \n47 2 hsa-miR-214-3p,hsa-miR-425-\n3p \n0.00028336 \nFluid shear stress and \natherosclerosis \n149 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-92a-\n3p \n0.00030931 \n\n 110 \nProtein processing in \nendoplasmic reticulum \n194 1 hsa-miR-30c-5p 0.0003146 \nBile secretion 98 1 hsa-miR-141-3p 0.00039186 \nGap junction 99 1 hsa-miR-31-5p 0.00042149 \nHepatitis C 173 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-504-\n3p \n0.00044261 \nGlycosphingolipid \nbiosynthesis - lacto and \nneolacto series \n29 1 hsa-miR-214-3p 0.00051769 \nT cell receptor signaling \npathway \n115 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-504-\n3p \n0.00057317 \nBladder cancer 43 1 hsa-miR-206 0.0006323 \nGlucagon signaling pathway 114 1 hsa-miR-92a-3p 0.00063952 \nLysine degradation 69 1 hsa-miR-214-3p 0.00064585 \nCortisol synthesis and \nsecretion \n78 1 hsa-miR-92a-3p 0.00075311 \nProgesterone-mediated \noocyte maturation \n104 1 hsa-miR-92a-3p 0.00083639 \nC-type lectin receptor \nsignaling pathway \n116 1 hsa-miR-21-5p 0.00086545 \nPurine metabolism 137 2 hsa-miR-31-5p,hsa-miR-504-\n3p \n0.00088647 \nDrug metabolism - other \nenzymes \n85 1 hsa-miR-141-3p 0.00133218 \nPhosphonate and \nphosphinate metabolism \n6 1 hsa-miR-145-5p 0.00177112 \nBiosynthesis of cofactors 173 1 hsa-miR-141-3p 0.00183676 \nSphingolipid metabolism 59 1 hsa-miR-504-3p 0.0019843 \nMineral absorption 62 1 hsa-miR-574-5p 0.00224104 \nJAK-STAT signaling \npathway \n168 1 hsa-miR-21-5p 0.00247343 \nAlcoholism 195 1 hsa-miR-206 0.0035303 \nEstrogen signaling pathway 167 1 hsa-miR-92a-3p 0.00385297 \nGlycosaminoglycan \nbiosynthesis - keratan sulfate \n14 1 hsa-miR-31-5p 0.00478453 \nFatty acid degradation 43 1 hsa-miR-214-3p 0.00491418 \nNotch signaling pathway 63 1 hsa-miR-214-3p 0.00755991 \nN-Glycan biosynthesis 51 1 hsa-miR-504-3p 0.00831635 \nPlatinum drug resistance 75 1 hsa-miR-31-5p 0.00902131 \nRenin secretion 72 1 hsa-miR-504-3p 0.00959391","source_license":"CC0","license_restricted":false}