Prognostic significance of mmp-1, mmp-3, and mthfr genetic polymorphism for evaluation of uterine leiomyoma and adenomyosis progression

Prognostic significance of mmp-1, mmp-3, and mthfr genetic polymorphism for evaluation of uterine leiomyoma and adenomyosis progression - Authors: Morozova Е.В.1,2, Chukhlovin А.B.1,2, Kulagina N.V.1,2, Totolian А.А.1,2 - Affiliations: - State Medical University named after acad. I.P. Pavlova - Medical Academy of Postgraduate Education - Issue: Vol 54, No 3 (2005) - Pages: 55-59 - Section: Original study articles - Submitted: 01.11.2005 - Accepted: 20.10.2021 - Published: 01.11.2005 - URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/83482 - DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD83482 - ID: 83482 Cite item Full Text Abstract Carriage of hyperactive alleles of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) gene is associated with enhanced growth of various neoplasias in humans. When studying the frequency of promoter variants of MMP -1 and -3 genes in 170 patients with uterine leiomyoma, significant associations were revealed between low incidence of MMP-1 1G/1G genotype, high growth rates of leiomyoma, multifocal growth and more common adenomyosis development, thus presuming a protective role of MMP-1/1G homozygosity in the development of symptomatic myoma and adenomyosis and growth-promoting effect of the 2G allele. Hence, the promoter genotype of MMP-1 may be considered as possible genetic marker to predict clinical course of the uterine leiomyoma. Full Text Актуальность проблемы Лейомиома матки (ЛМ), являясь доброкачественной опухолью миометрия, развивается в результате пролиферации мышечных клеток и соединительнотканных элементов [3]. При сравнении ультраструктуры коллагеновых фибрилл в ткани лейомиомы и нормальном миометрии установлено, что лейомиома содержит коллагеновые фибриллы нетипичной структуры и ориентации по сравнению с нормальным миометрием [14]. Это обстоятельство может свидетельствовать о ведущей роли матриксных металлопротеиназ (коллагеназ и желатиназ) в патогенезе лейомиомы. Причины нарушений соединительнотканного компонента могут быть обусловлены, в частности, гормональным дисбалансом у женщин [3]. Молекулярно-генетические механизмы влияния измененного гормонального фона на активность соответствующих энзимных систем в ткани матки пока мало изучены. Так, несомненно участие матриксных металлопротеиназ (ММР) в процессах ремоделинга коллагена в опухолевых тканях [12]. Известно более 20 видов ММР, которые осуществляют различные этапы деградации коллагена, эластина и других белков экстрацеллюлярного матрикса. Среди них особую роль играет матриксная металлопротеиназа-1 (ММР-1), которая осуществляет первичную деградацию молекул коллагена, после чего происходит их дальнейший распад под действием остальных ММР [12]. В последующей деградации продуктов коллагенолиза участвуют другие ММР, в частности стромелизин-1 (ММР-3). Имеется небольшое число молекулярно-биологических исследований, которые показывают, что в миоматозных тканях происходит усиление экспрессии специфических генов цитокинов и ростовых факторов [7]. Выявлено достоверное повышение экспрессии ММР-1 (специфические мРНК и белки) при лейомиоме [6]. Возникает вопрос о причинах усиления транскрипции генов ММР у отдельных пациентов. Одним из этих факторов может быть полиморфизм регуляторных сегментов, в частности - промоторных участков генов. При этом не изменяется первичная структура и активность белкового продукта, однако существенно изменяется продукция мРНК и специфического белка. В связи с этим у носителей «гиперактивных» промоторных вариантов может усиливаться склонность к различным заболеваниям [13]. Диагностика и профилактика соответствующих состояний представляет собой одно из важных направлений новой отрасли науки — предиктивной медицины, изучающей генные механизмы предрасположенности к тем или иным клиническим состояниям [1]. Для промоторного участка ММР-1 известно 2 генных варианта - наличие 1G или 2G в позиции - 1607. При наличии варианта 2G в промоторе гена ММР-1 появляется дополнительный сайт связывания фактора транскрипции Ets, тем самым определяя высокие уровни синтеза специфической мРНК и продукции молекул проэнзима ММР-1. Показано, что гомозиготное состояние гена ММР- 1 2G/2G связано с повышенным риском развития и диссеминацией злокачественных новообразований (например, меланомы и рака яичника) [21]. Наши исследования при трансплантации костного мозга показали взаимосвязь между наличием аллеля 2G у больных и повышенным риском развития реакции «трансплантат против хозяина» [4]. ММР-3 (стромелизин-1) осуществляет последующее разрушение коллагена. Для этого гена показан генный полиморфизм в позиции промотора-600 (5А/6А). Аллель 5А характеризуется более высоким уровнем транскрипции, нежели аллель 6А. Преобладание аллеля 5А гена ММР-3 обнаружено для женщин с метастазирующим раком молочной железы [8]. Кроме того, в ряде работ показана важность полиморфизма MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктазы), катализирующего синтез 5-метил- тетрагидрофолата, который используется в процессах метилирования. Вариант MTHFR С677Т сопровождается существенно сниженной активностью, что повышает гемокоагуляцию и онкологические риски у женщин - носительниц этого гена [11]. Целью настоящей работы явилась оценка возможной роли упомянутых клинически актуальных генных вариантов как факторов риска в развитии миомы матки и аденомиоза. Материалы и методы При выполнении настоящей работы проведено клиническое обследование 170 пациенток, имевших миому матки, в возрасте от 26 до 71 года (средний возраст 46,6 года), с морфологической верификацией диагноза у оперированных больных. У 122 (71,7 %) женщин имелась симптомная миома, проявлявшаяся гиперполименоррей, быстрым темпом роста опухоли, нарушением функции смежных органов, что потребовало хирургического лечения. У 48 (28,3 %) - миома матки была без клинических проявлений. Комплекс обследования, помимо анамнестического и общеклинического, включал эхографическое исследование органов малого таза, морфологическое исследование эндометрия. Ультразвуковое исследование проводили в первую фазу при сохраненном менструальном цикле трансабдоминальным доступом конвексным датчиком с частотой 3,5 МГц и трансвагинальным доступом с частотой 8 МГц. При исследовании с использованием серой шкалы оценивали размеры матки, величину, число и локализацию узлов, а также состояние яичников. Вычисление объема матки и миоматозных узлов осуществляли по предложенной Healey (1989) формуле [20], основанной на данных ультразвукового сканирования с определением продольного (А), поперечного (В) и переднезаднего (С) размеров. Темп роста узлов миомы или ее регресс оценивали в динамике по данным эхографии, проводившейся каждые шесть месяцев. С целью изучения молекулярно-биологических аспектов патогенеза миомы матки проводилось генотипирование промоторных аллелей генов ММР-1 и ММР-3, а также гена MTHFR (С677Т). Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови больных и доноров после лизиса, иммобилизации и очистки ДНК на сорбенте, с применением набора «ДНК-Сорб» (Литех, Москва). Генотипы ММР- 1 (1G/2G), ММР-3 (5А/6А) и MTHFR (С677Т) определяли с помощью аллель-специфической ПЦР. Подбор соответствующих праймеров осуществляли с помощью программы Primer Express (Applied Biosystems, Германия), причем искомый точечный полиморфизм располагали на 3’-конце передних праймеров. Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 5х ПЦР-буфер (Амплисенс, Москва); смесь дезоксинуклеотидов (MBI Fermentas, Каунас, Литва), праймеры (от 0.05 до 0.3 μМ) производства «Синтол» (Москва), ДНК- Taq полимеразу («ДНК-Технология, Москва», 1,0 ME в пробе) и геномную ДНК (2,5 мкл на реакцию), в общем объеме 20 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе I. Cycler (Bio-Rad, США). Режимы ПЦР были следующими: 94°С, 5 мин; 40 циклов ПЦР: денатурация: 94°С, 30 с; отжиг в течение 30 с: 67°С (MTHFR), 55°С (ММР-1), 54°С (ММР- 3/5А), 49°С, (ММР-3/6А); элонгация: 72°С, 30 с (40 циклов); 72°С, 7 мин. Продукты ПЦР оценивали после электрофореза в 1,5 %-ном агарозном геле при окраске этидий-бромидом. Визуализацию специфических продуктов осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора. Изображения фиксировали с помощью цифровой фотокамеры Canon PowerShot А70. Статистический анализ проводился путем непараметрического анализа (тест хи-квадрат), с помощью пакета программ Winstat. Результаты исследования По данным анамнеза, длительность существования миомы до 5 лет отмечена у 100 женщин (58,9 %); от 6 до 10 лет - у 43 (25,2 %), более 10 лет - у 27 (15,9 %) пациенток. Подбрюшинная локализация миоматозных узлов обнаружена у 12 (7,9 %) больных, межмышечная – у 43 (28,3 %) и подслизистая - у 9 (5,9 %) женщин. Сочетание подбрюшинной и межмышечной локализации миоматозных узлов выявлено у 88 (57,9 %) пациенток. Единичные миоматозные узлы отмечены у 42 (24,7 %) больных; по 2 миоматозных узла выявлено у 44 (25,9 %), от 3 до 5 узлов - также у 44 пациенток (25,9 %) и более 5 узлов - у 40 (23,5 %). Быстрый рост опухоли отмечен у 41 (29,3 %) пациентки, медленный - у 69 (49,3 %) и регресс миоматозных узлов - у 30 (21,4 %). При морфологическом исследовании эндометрия у 72 (42,3 %) женщин выявлено его соответствие фазе менструального цикла, у 33 (19,5 %) - обнаружена железистая или железисто-кистозная гиперплазия, у 46 (27,2 %) - полип эндометрия и у 18 (10,6 %) - гипопластический или атрофичный эндометрий. Репродуктивная функция обследованных женщин характеризовалась большим количеством беременностей, значительная часть которых закончилась искусственным и/или самопроизвольным прерыванием. Из гинекологических заболеваний наиболее часто миоме матки сопутствовал аденомиоз, выявленный у 93 больных (54,7 %). Доброкачественные опухоли яичников (кисты) обнаружены у 23 (13,8%) обследованных больных. При изучении состояния молочных желез патологические изменения выявлены у 144 (84,7 %) больных миомой матки. В 66,1 % наблюдений обнаружена диффузная кистозно-фиброзная мастопатия, узловая форма фиброзно-кистозной мастопатии отмечена у 2,4 % больных, аденоз - в 12 % случаев, фиброаденома - у 3,2 % пациенток. Преморбидным фоном лейомиомы матки являлись заболевания сердечно-сосудистой системы (артериальная гипертензия, миокардиодистрофия, приобретенные и врожденные пороки сердца), отмеченные у 107 пациенток (62,9 %). Ожирение и сахарный диабет выявлены у 60 женщин (35,2 %), заболевания желудочно-кишечного тракта и гепато-билиарной системы (хронический холецистит, дискинезии желчевыводящих путей, желчекаменная болезнь, звенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, хронический гастрит и гастродуоденит) - у 67 (39,4 %), варикозное расширение вен нижних конечностей у 38 (22,3 %) пациенток. Таблица 1. Распределение генных вариантов ММР-1, ММР-З и MTHFR среди больных лейомиомой в Санкт-Петербурге Исследованные гены | Доля генотипов в выборке | || ММР-1-1607 1G/2G | 1G/1G | 1G/2G | 2G/2G | 26,5 % (45/170) | 51,2 % (87/170) | 22,4 % (38/170) | | ММР-З-500 5А/6А | 5А/5А | 5А/6А | 6А/6А | 20,5 % (35/170) | 54,1 % (92/170) | 25,2 % (43/170) | | MTHFR С677Т | СС | СТ | ТТ | 37,1 % (63/168) | 41,7 % (71/168) | 20,2 % (34/168) | Анализ распределения изученных генных вариантов показал высокую частоту встречаемости альтернативных аллелей генов ММР-1, ММР-З, и MTHFR в обследованной группе больных (табл. 1). Частоты аллелей этих генов в данной группе достоверно не отличались от ранее опубликованных выборок для населения Европы. При этом распределение промоторных аллелей генов ММР-1 и ММР-З практически соответствовало классическому «менделевскому» варианту (50 % гетерозигот и по 25 % гомозигот обоих видов). При анализе промоторного полиморфизма гена MTHFR в выборке отмечена тенденция к преобладанию носителей аллеля 677С. При анализе результатов по клиническим подгруппам выявлено, в частности, что у больных с отсутствием роста или регрессом опухоли отмечается повышенная встречаемость генотипа 1G/1G гена ММР-1, тогда как быстрый рост миомы ассоциировался с пониженной частотой данного аллеля (табл. 2, рисунок). График Корреляция темпов роста лейомиомы с наличием генотипа 1G/1G (р = 0,02). По оси абсцисс - темпы роста лейомиомы (1 - регресс или отсутствие роста, 2 - медленный рост, 3 - быстрый рост). По оси ординат - частота встречаемости генотипа 1G/1G гена ММП-1. Таблица 2. Взаимосвязи между частотами промоториых аллелей гена ММР-1 и темпами роста лейомиомы Группы больных/генотипы ММП-1 | 1G/1G | 1G/2G | 2G/2G | Суммарная выборка | 28,6 % (40/140) | 48,6 % (68/140) | 22,9 % (32/140) | Отсутствие роста миомы или регресс | 46,7 % (14/30) | 36,7 % (11/30) | 16,7% (5/30) | Медленный рост | 27,5 % (19/69) | 46,4 % (32/69) | 26,1 % (18/69) | Быстрый рост миомы | 17,1 % (7/41) | 61,0% (25/41) | 22,0 % (9/41) | Уровни достоверности различий | р = 0,023 | р = 0,11 | р = 0,58 | Примечание. Приведены данные по группе из 140 больных, для которых имелась информация о динамике роста миомы. Приводятся различия между клиническими подгруппами. Среди больных с медленным ростом опухоли этот показатель имел промежуточное значение. Указанные различия были достоверными при р = 0,02, что говорит о существенной связи между наличием низкоактивного аллеля ММР-1 и темпами роста новообразования. Кроме того, обнаружена достоверная ассоциация между наличием аллеля 1G ММР-1 (генотипы 1G/1G и 1G/2G), и частотой встречаемости аденомиоза (р = 0,008). Как показано в табл. 3, частота генотипа 1G/1G существенно ниже у больных с аденомиозом, что, возможно, связано с его протективной ролью в отношении эктопической пролиферации клеток эндометрия. Частота 1 G/lG гена матриксной металлопротеиназы-1 (ММР-1) оказалась в среднем менее высокой у больных с многоузловой формой миомы матки (р = 0,01, табл. 4). Можно предположить, что наличие гиперактивного аллеля 2G, напротив, предполагает усиленную склонность к диссеминации данного новообразования у больных с лейомиомой и, соответственно, к возникновению многоузловой формы лейомиомы. В описанном контингенте больных нами также изучались частоты аллелей 5А и 6А гена ММР-3, тесно сцепленного с геном ММР-1 на хромосоме 11, а также гена MTHFR (С677Т). По данным аллелям не было выявлено статистически достоверных различий между подгруппами с различной клиникой. Этот результат подчеркивает особую значимость взаимосвязей между гомозиготным состоянием 1G/1G гена ММР-1 и клиническими характеристиками лейомиомы матки. Обсуждение В нашем исследовании участвовала репрезентативная группа женщин с лейомиомой матки. Их распределение по возрасту (в среднем 47 лет) соответствовало встречаемости симптомного заболевания у населения. На основании данных анамнеза и клинического обследования больные были классифицированы по темпам роста, количеству, локализации и размерам новообразований матки, а также сопутствующей патологии. При анализе результатов выявлено, что быстрый темп роста миомы коррелирует с низкой частотой встречаемости у больных генотипа 1G/1G гена ММР-1. Количество миоматозных узлов также было существенно меньше у носителей генотипа 1G/1G. Таблица 3. Частоты аллелей ММР-1 у больных с аденомиозом Группы больных/генотипы ММП-1 | 1G/1G | 1G/2G | 2G/2G | Больные с аденомиозом | 18,3% (17/93) | 58,1 % (54/93) | 23,7 % (22/93) | Больные без выявленного аденомиоза | 36,4 % (28/77) | 42,9 % (33/77) | 20,8 % (16/77) | Уровни достоверности различий | р = 0,008 | р = 0,048 | р = 0,65 | Примечание. Приведены данные обработки выборки из 170 больных лейомиомой матки. Эта зависимость указывает на протективную роль менее активного аллеля 1G гена ММП-1, что подтверждает специфическую функцию ММП-1 в модификации межклеточного матрикса в зонах опухолевого роста. Можно предположить, что гиперактивный аллель 2G, напротив, способствует росту лейомиомы и увеличению количества узлов. Исследования [6] показали, что локальная экспрессия антигена ММР1 отмечается при лейомиоме в 90 % случаев. Inagaki N et al. (2003) выявили повышенный уровень активности ММР-1 и некоторых ростовых и провоспалительных цитокинов при лейомиоме и аденомиозе [10]. Эти данные предполагают сочетанное действие различных ростовых факторов в усилении коллагенолиза и ремоделинге ткани миомы, что должно вести к интенсивной пролиферации клеток опухоли, соединительнотканных клеточных элементов и, соответственно, усилению темпов роста лейомиомы. В ряде работ показан повышенный уровень транскрипции ММР-1 при 2G-варианте промотора [21]. Следовательно, полученные нами результаты согласуются с общепринятыми воззрениями на биологию опухолевого роста in vivo. Таблица 4. Частоты аллелей гена ММП-1 у больных с различным количеством узлов лейомиомы Количество узлов миомы | 1G/1G | 1G/2G | 2G/2G | 1 -2 узла | 33,7 % (29/86) | 47,7% (41/86) | 18,6% (16/86) | 3-4 узла | 25,0% (11/44) | 52,3 % (23/44) | 22,7% (10/44) | 5 и больше узлов | 12,5 % (5/40) | 57,5 % (23/40) | 30,0% (12/40) | Достоверность различий | р-0,01 | р = 0,86 | р-0,14 | Роль отдельных генных вариантов в патогенезе эндометриоза была впервые установлена отечественными исследователями несколько лет назад [2]. В частности, авторами показана ассоциация между генетически обусловленным дефицитом продукции энзимов детоксикации («нуль-аллель» GSTM и др.) и повышенным риском развития аденомиоза. Дальнейшее совершенствование генетического прогноза подобных мультигенных заболеваний возможно на путях поиска их ассоциаций с другими генными вариантами. В настоящей работе нами показано, что у больных с аденомиозом снижена частота встречаемости генотипа 1G/1G гена ММР-1. Можно предположить, что больные гомозиготные по данному генотипу составляют группу сниженного риска по развитию этого осложнения. Напротив, больные-носители гиперактивного аллеля 2G (гомо- и гетерозиготы) попадают в группу повышенного риска и нуждаются в более тщательном мониторинге. Действительно, в недавнем исследовании, проведенном в Китае [19], было установлено, что у женщин, гомозиготных по аллелю 2G гена ММР-1, чаще встречается аденомиоз, чем у остальных пациенток, что подтверждает существенную роль аллеля 2G гена ММР-1 при данной патологии. Можно допустить, что при наличии у больных аллеля 2G наблюдается более активная продукция проэнзима матриксной металлопротеиназы-1, что приводит к активации коллагенолиза и облегченной миграции клеток эндометрия в зоны эктопического роста. Ramon et al. показали, что для женщин с эндометриозом характерен высокий уровень экспрессии мРНК ММР в ткани эндометрия [18]. Кроме того, важна роль неоангиогенеза в патогенезе как миомы, так и эндометриоза [5]. Матриксные металлопротеиназы участвуют в процессах деградации матрикса при росте тканей, тем самым формируя пространство для прорастания в межклеточном матриксе новых капилляров, которые обеспечивают питание новообразований. Исходя из этого, одним из методов лечения аденомиоза является использование ингибиторов ангиогенеза и матриксных металлопротеиназ [15]. Заключение Динамика роста лейомиомы матки и развитие аденомиоза могут быть ассоциированы с гиперактивностью гена ММР-1 и перестройками межклеточного матрикса. Судя по известной нам литературе, этот факт обнаружен впервые и, тем самым, обнаружена связь между генным полиморфизмом в системе матриксных металлопротеиназ и развитием доброкачественных новообразований. Этот физиологический механизм следует учитывать в изучении патогенеза и выбора лечения этих состояний. Следовательно, больные, у которых выявлен генотип 1G/1G гена ММР-1, составляют группу пониженного риска по развитию симптом- ной миомы матки (быстрый темп роста опухоли, множественное узлообразование, большие размеры опухоли), а также сочетанию миомы с аденомиозом. Полученные результаты способствуют индивидуальному прогнозированию развития миомы с целью использования консервативных и малоинвазивных методов терапии (эмболизация или лапароскопическая перевязка маточных артерий) до клинического проявления заболевания. About the authors Е. В. Morozova State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education Author for correspondence. Email: [email protected] Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation Russian Federation, Saint Petersburg; Saint PetersburgА. B. Chukhlovin State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education Email: [email protected] Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation Russian Federation, Saint Petersburg; Saint PetersburgN. V. Kulagina State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education Email: [email protected] Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation Russian Federation, Saint Petersburg; Saint PetersburgА. А. Totolian State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education Email: [email protected] Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg