Suplementasi Kurkumin untuk Perbaikan Maturis Oosit dan Hasil in vitro Fertilisasi pada Mencit Model Endometriosis

Endometriosis is defined as the presence of endometrial -like tissue outside the uterus, which induces a chronic inflammatory reaction. The outcome of endometriosis treatment espe cially in infertility remain unsatisfied with low pregnancy rate. Curcumin, a potent anti-oxidant and anti-inflammation turmeric, had role on improvement of folliculogenesis disturbace but the role of curcumin on oocyte and embryo still unclear. The purpos e of this study was to evaluate whether curcumin had role on oocyte maturation and fertilization result in invitro fertilization. This was an animal laboratory experimental study. Endometriosis was induced by administration of cyclosporine A, human endomet rium tissue and ethynil estradiol in 76 mice. Study subject was divided into 2 groups : curcumin and placebo supplementation. Ovarian stimulation was conducted using PMSG and hCG to evaluate oocyte maturation by analyzing GV, GVBD, metaphase 1 and metaphas e 2. In vitro fertilization was performed to clarify II polar body as fertilization result evaluation. Data were compared by student t -test. The mean ovum number of curcumin group (15 .42 ± 3.17) was significantly higher than those of placebo group (8 .21 ± 2.82) (p < 0 .0001). Oocyte maturation including GV, GVBD, metaphase I dan metaphase II was better, especially the high number of metaphase II maturation (37.2 %) on curcumin group. Fertilization result of invitro fertilization on curcumin group (15 .26 ± 3.21) was significantly higher than those of placebo group (5 .57 ± 3.18) (p=0.000). In conclusion, on experimental endometriosis in mice, curcumin supplementation may improve oocyte maturation and fertilization result. (MOG 2014;22:53-57)

curcumin, endometriosis, oocyte maturation, fertilization result Correspondence: Hendy Hendarto, Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, RSUD Dr. Soetomo, Jl Mayjen Prof Moestopo 6-8, Surabaya 60268, email : [email protected]. PENDAHULUAN Endometriosis merupakan penyakit ginekologi yang sering dijumpai pada perempuan usia reproduksi dengan memberikan keluhan nyeri dan infertilitas sehingga menyebabkan penurunan kualitas hidup. Endometriosis ditandai dengan adanya jaring an seperti endometrium berada diluar kavum uteri yang akan menginduksi reaksi inflamasi kronis .1 Walaupun patogenesis masih diperdebatkan terutama pada stadium minimal dan ringan, endometriosis akan menyebabkan infertilitas yang sulit diatasi. Hal ini terb ukti pada penelitian Barnhart yang mendapatkan bahwa angka kehamilan dengan fertilisasi in vitro pada pasien endometriosi Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 53-57 54 lebih rendah dibandingkan dengan pasien infertilitas karena faktor tuba. Pada penelitian tersebut didapatkan juga bahwa angka fertilis asi, angka implantasi dan jumlah oosit yang didapat pada pasien endometriosis saat fertilsasi in vit ro lebih rendah secara bermakn a.2,3 Penatalaksanaan endometriosis dapat dilakukan melalui beberapa cara, yatu terapi medisinalis, bedah, dan Medically Assis ted Reproduction, yang dapat berupa inseminasi intra uteri atau fertilisasi in vitro .4,5 Hughes dkk menyimpulkan bahwa terapi medisinalis dengan menggunakan obat hormon misal pil kontrasepsi, Danzol dan GnRH agonist untuk supresi ovarium pada pasien endome triosis dengan infertilitas ternyata tidak efektif.6 Disamping tidak efektif, terapi medisinalis dengan obat hormon membuat suasana hipoestrogen dan tidak terjadi ovulasi. Suasana hipoestrogen menyebabkan pemberian terapi medisinalis menjadi sangat terbata s karena supresi ovarium jangka panjang akan mengurangi masa tulang hingga berisiko terjadi osteoporosis.7 Karena itu mendapatkan strategi alternatif terapi medisinalis yang ideal untuk endometriosis perlu dipikirkan. Curcumin, kandungan penting dari curc uminoid suatu herbal turmeric, mempunyai sejarah panjang sebagai obat tradional yang mempunyai potensi anti proliferasi, anti inflamasi dan anti oksidan .8 Terdapat sedikit data tentang penggunaan Curcumin untuk menekan perkembangan penyakit endometriosis, salah satu adalah Swarnakar dan Paul melaporkan khasiat anti endometriosis pada Curcumin melalui jalur MMP -9, sedangkan Jana mendapatkan Curcumin dosis 48 mg/kg bb akan menekan aktivitas MMP -2 melalui peningkatan ekspresi TIMP-2.9,10 Pada penelitian kami sebelumnya telah dibuktikan bahwa curcumin mampu memeperbaiki folikulogenesis abnormal pada mencit model endometriosis melalui perubahan ekspresi Growth Differentiation Factor -9 (GDF-9) dan KitLigand ,11 namun sampai saat ini khasiat Curcumin pada oosit dan hasil fertilisasi masih belum ada. Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari pengaruh suplementasi kurkumin terhadap maturasi oosit yang meliputi bentuk Germinal Vesicle (GV), Germinal Vesicle Break Down (GVBD), Metaphase-1 dan Metaphse -2 serta hasil fertilsasi berupa gambaran Polar bodi 2 pada ovarium hewan coba model endometriosis yang dilakukan fertilisasi in vitro. BAHAN DAN METODE Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan desain random secara buta ganda. Populasi pad a penelitian ini adalah mencit coba (mus musculus) unit hewan coba laboratorium. Untuk membuat model endometriosis, mencit disuntik siklosporin A 10 mg/kg/hari IM pada paha mencit. Selanjutnya dilakukan penyuntikan jaringan endo - metrium wanita pada mencit secara membuta pada rongga peritoneum dengan perlahan selama 60 detik. Jaringan endometrium diambil dari bahan uterus tumor jinak, yang disimpan di PBS (phosphate buffered saline). Dilakukan washing 2 x dengan alat sentrifugal dengan putaran 2500 rpm. Supe rnatan dibuang kemudian ditambahkan PBS, penicillin 200 IU/ml dan streptomisin 200 μgr/ml. diambil dengan syringe 3 ml jaringan basah endometrium. Dosis yang diberikan pada mencit adalah 0,1 ml. Berikutnya dilakukan pemberian estrogen 5,4 μgr IM pada femur pada hari 1 dan 5 setelah perlakuan penyuntikan endometrium wanita. Pada hari ke 14 diharapkan telah menjadi mencit model endometriosis. Pada stimulasi ovarium dengan PMSG dan hCG mencit model endometriosis disuntik PMSG 5 IU, 48 jam kemudian disuntik hC G 5 IU dan mencit langsung di kumpulkan dengan mencit pejantan vasektomi. Setelah 17 jam dilakukan pemeriksaan vaginal plug, jika positif dilakukan pembilasan. Uterus dipreparir dan tuba falopii diangkat dilakukan pembilasan dengan PBS. Tuba falopii dileta kkan di cawan petri untu8k dilakukan panen (flushing) sel telur dibawah mikroskop inverted dengan merobek kantong fertilisasi. Dengan metode pewarnaan Aceto Orcein 1% dilakukan penilaian maturasi oosit stadium: Germinal Vesicle (GV), Germinal Vesicle Break Down (GVBD), Metafase I dan Metafase II. Pada fertilisasi in vitro, sel telur yang sudah dikoleksi dicuci dengan medium PBS 3 kali, kemudian dicuci dengan medium M16 sebanyak 3 kali. Selanjutnya sel telur dipindahkan didalam medium M16 drop. Spermatozoa yang sudah dipreparasi dimasukan ke dalam medium drop yang ber isi sel telur dengan dosis 200.000. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam. Kemudian diamati jumlah zigot yang terbentuk. Pemeriksaan viabilitas embrio dilakukan dengan pengamatan dibawah mikroskop untuk melihat adanya Polar Bodi 2 atau tidak. Adanya Polar Bodi 2 menunjukkan telah terjadi proses fertilisasi pada oosit oleh sperma, yang sekaligus untuk penelitian ini menunjukkan viabilitas embrio yang baik. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai Oktober 2010 di Laboratorium Fertilisasi In Vitro Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya. Kelaikan etik penelitian ini didapatkan pada Komisi Etik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya Hendarto et al. : Suplementasi Kurkumin untuk Perbaikan Maturasi Oosit dan Hasil Fertilisasi in vitro 55 HASIL DAN PEMBAHASAN Sampel yang digunakan adalah 76 ekor mencit yang telah memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Penelitian ini melihat hasil perbaikan folikulogenesis karena suplementasi kurkumin terhadap jumlah dan maturasi ovum serta viabilitas em brio hasil fertilisasi in vitro. Pada tabel 1 tampak jumlah kumulatif ovum pada tiap lapang pandang mikroskop pembesaran 40x, hasilnya ada perbedaan yang bermakna rerata jumlah ovum antara kelompok kurkumin dan kelompok plasebo. Tabel 1. Perbedaan jumlah ovum antara kelompok kurkumin dan kelompok plasebo Rerata jumlah ovum Perlakuan (Kurkumin) 15,42 ± 3,17 p < 0,0001 Kontrol (Plasebo) 8,21 ± 2,82 Pada penelitian ini dievaluasi juga gambaran maturasi ovum yang terdiri dari GV, GVBD, Metafase I dan Metafase II pada kelompok perlakukan kurkumin dibandingkan dengan kelompok plasebo. Jumlah gambaran maturasi GV didapat dari kumulatif ovum yang telah melalui proses pengecatan aceto -orsein 1% pada tiap lapang pandang mikroskop pembesaran 400x, didapatkan rata-rata jumlah ovum GV pada kelompok kurkumin 3,37 ± 1,34 lebih rendah dibanding kelompok plasebo 8,21 ± 2,82. Dengan p < 0,001 yang berarti ada perbedaan yang bermakna rerata jumlah gambaran maturasi GV antara kelompok kurkumin dan kelompok plasebo Tabel 2. Perbedaan maturasi ovum berupa GV antara kelompok kurkumin dan kelompok plasebo Rerata maturasi ovum berupa GV Perlakuan (kurkumin) 3,37 ± 1,34 p < 0,0001 Kontrol (plasebo) 8,21 ± 2,82 Jumlah gambaran maturasi GVBD pada kelompok kurkumin didapatkan median jumlah ovum 1 (0 -6) lebih tinggi dibanding kelompok plasebo yang tidak ditemukan ovum GVBD. Dengan harga p < 0,0001 berarti ada perbedaan bermakna gambaran maturasi ovum GVBD antara kelompok kurkumin dibanding kelompok plasebo. Jumlah gam baran maturasi Metafase I didapatkan median jumlah ovum pada kelompok kurkumin 5 (2 -7) lebih tinggi dibanding kelompok plasebo yang tidak ditemukan ovum Metafase I . Dengan harga p < 0,05 berarti ada perbedaan bermakna gambaran maturasi ovum MI antara kelom pok kurkumin dibanding kelompok plasebo. Tabel 3. Perbedaan maturasi ovum berupa GVBD antara kelompok kurkumin dan kelompok placebo Median maturasi ovum berupa GVBD Perlakuan (kurkumin) 1 (0 – 6) p < 0,0001 Kontrol (plasebo) 0 (0) Tabel 4. Perbedaan maturasi ovum berupa Metafase I antara kelompok kurkumin dan kelompok placebo Median maturasi ovum berupa M I Perlakuan (kurkumin) 5 (2 – 7) p = 0,001 Kontrol (plasebo) 0 (0) Gambaran maturasi ovum Metafase II didapatkan median jumlah pada ke lompok kurkumin 6 (2 -8) lebih tinggi dibanding kelompok plasebo yang tidak ditemukan ovum Metafase II. Tabel 5. Perbedaan maturasi ovum berupa Metafase II antara kelompok kurkumin dan kelompok placebo. Median maturasi ovum berupa M II Perlakuan (kurkumin) 6 (2 – 8) p = 0,001 Kontrol (plasebo) 0 (0) Dengan harga p < 0,05 berarti ada perbedaan bermakna gambaran maturasi ovum M II antara kelompok kurkumin dibanding kelompok plasebo. Rerata jumlah Polar Bodi 2 pada kelompok kurkumin adalah 15,26±3,2 1 sedangkan pada kelompok plasebo 5,57±3,18 dengan p = 0,000 berati terdapat perbedaan bermakna rerata jumlah Polar Bodi antara kelompok perlakukan kurkumin dan plasebo. Suplementasi kurkumin yang mempunyai potensi anti -inflamasi dan anti-oksidan pada pene litian ini akan memperbaiki folikulogenesis melalui penghambatan proses apoptosis sel granulosa. Hal ini dapat dibuktikan bahwa suplementasi kurkumin selama 14 hari ternyata Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 53-57 56 menghasilkan jumlah ovum yang lebih banyak saat dilakukan stimulasi ovarium diband ingkan dengan pemberian plasebo. Makin banyak banyak jumlah ovum pada program FIV diharapkan akan meningkatkan kemungkinan terjadinya kehamilan. Pada kelompok kurkumin didapatkan ovum dengan tingkat maturasi GVBD (11,3%) dan metafase I (29,7%) menandakan bahwa siklus sel meiosis telah dimulai kembali. Tabel 6. Perbedaan rerata hasil ferilisasi dengan gambaran Polar Bodi 2 antara kelompok perlakuan kurkumin dan kelompok plasebo Rerata Hasil Fertilsasi (Polar Bodi 2) Perlakuan (Kurkumin) 15,26 ± 3,21 Kontrol (Plasebo) 5,57 ± 3,18 Didapatkannya ovum dengan tingkat maturasi Metafase II tidak 100% pada kelompok kurkumin menandakan bahwa meiosis telah berjalan kembali tetapi masih tertahan kembali oleh karena suatu sebab. Kami menduga TNF -α turut berperan atas terjadinya penurunan cadangan cyclin B dalam oosit, sehingga siklus sel terganggu dan pada oosit siklus sel terhenti sebelum metafase II. Kami duga, kumulus sel granulosa penderita endometriosis tidak mampu menyalurkan signal Ca2+ ke dalam oosit sehingga tidak terjadi regresi gap junction, hal ini mungkin peran dari banyaknya apoptosis yang terjadi pada sel granulosa. Akibat tidak optimalnya signal Ca 2+ yang berasal dari sel granulosa penderita endometriosis menyebabkan meiosis tertah an sehingga tampak dari hasil penelitian ini tingkat maturasi ovum pada mencit model endometriosis di kelompok plasebo semuanya berhenti pada maturasi tingkat GV. Pada kelompok yang mendapat suplementasi kurkumin terdapat perbaikan pada apoptosis sel granu losa sehingga meiosis bisa berjalan kembali walaupun masih belum sepenuhnya normal. Diduga kuat bahwa kurkumin dapat mencegah apoptosis sel granulosa dan menurunkan pr otein kinase A, sehingga MPF dapat teraktivasi dan proses pembelahan meiosis dimulai kembali. Pengamatan hasil fertilisasi in vitro dilakukan dengan cara melihat gambaran Polar Body 2. Bila terlihat gambaran Polar Body 2 berarti telah terjadi fertilisasi ovum oleh sperma, yang pada penelitian ini dianggap telah terjadi embrio dengan viabilita s yang baik. Polar Body adalah sel yang terdapat didalam ovum, yang merupakan hasil dari proses oogenesis dan meiosis. Pada penelitian ini telah dibuktikan bahwa rerata jumlah gambaran Polar Body 2 pada mencit model endometriosis yang diberi suplementasi k urkumin lebih banyak, yang berarti menghasilkan lebih banyak embrio dengan viabilitas yang lebih baik dibandingkan diberi plasebo pada fertilisasi in vitro. SIMPULAN Pada akhirnya dengan berakhirnya penelitian ini dapat disimpulkan bahwa suplementasi k urkumin pada endometriosis akan memperbaiki maturasi oosit pada stimulasi ovarium dan pada fertilisasi in vitro akan menghasilkan embrio dengan viabilitas yang lebih baik. UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini dibiayai oleh DIPA Universitas Airlangga Tahun Anggaran 2010, DAFTAR PUSTAKA 1. Kennedy S, Bergqvist A, Chapron C, D'Hooghe T, Dunselman G, Greb R, Hummelshoj L, Prentice A, Saridogan et al. ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis. Hum Reprod 2005; 20:2698–2704. 2. Barnhart K, D unsmoor-Su R, Coutifaris C. Effect of endometriosis on in vitro fertilization. Fertil Steril 2002;77:1148–55. 3. ASRM. Endometriosis and infertility: a committee opinion, The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertil Steril 2012;98:591–8 4. ESHRE Endometriosis Guideline Development Group. Management of women with endometriosis, Guideline of the European Society of Human Reproduction and Embryology. September 2013 5. Zegers-Hochschild F, Adamson GD, de Mouzon J, Ishihara O, Mansour R, Nygren K, Sullivan E, van der Poel S, The International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and World Health Organization (WHO) Revised Glossary on ART Terminology, 2009. Hum Reprod 2009; 24:2683–2687 6. Hughes E, Brown J, Co llins JJ, Farquhar C, Fedorkow DM and Vandekerckhove P. Ovulation suppression for endometriosis for women with subfertility. Cochrane Database Syst Rev 2007 7. Nasu K, Nishida M, Ueda T, Yuge A, TakaiN, NaraharaN. Application of Nuclear -kB inhibitor BAY11-7085 for the treatment of endometriosis: an in vitro study.American Journal Physiologyof Endocrinology and Metabolism 2007, 293: 16-23. 8. Akram M, Shahab -Uddin, Ahmed A, Usmanghani K, Hannan A, Mohiuddin E M. Asif S. Curcuma Hendarto et al. : Suplementasi Kurkumin untuk Perbaikan Maturasi Oosit dan Hasil Fertilisasi in vitro 57 longa and curcumin: a review article . Rom. J. Biol. – Plant Biol., 2010, 55, 2: 65–70 9. Swarnakar S, Paul S. Curcumin arrests endometriosis by downregulation of matrix metalloproteinase-9 activity. Indian J Biochem Biophys. 2009, 46(1):59-65. 10. Jana S, Rudra DS, Paul S, Snehasikta S. Curcumin delays endometriosis development by inhibiting MMP-2 activity. Indian J Biochem Biophys 2012, 49(5):342-8 11. Kuswojo H, Sa’adi A, Hendarto H, Samsulhadi, Widjiati. Pengaruh curcumin terhadap ekspresi VEGF dan luas implant endometriosis. Penelitian departemen/SMF Kebidanan dan Penyakit Kandungan FK Unair /RSUD dr Soetomo Surabaya, 2009.