Fertility, pregnancy outcomes and perinatal results related to experimental endometriosis in a murine model

SMARGIASSI, N. F. Fertility, pregnancy outcomes and perinatal results related to experimental endometriosis in a murine model. 2023. Dissertation (Master’s Degree in Sciences) – Graduated Program in Gynecology and Obstetrics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2023. Endometriosis is related to infertility and an increased risk of advers e pregnancy and neonatal outcomes, the mechanisms of this disease need to be better understood to support new therapeutic approaches. Recently, a murine model of endometriosis related to infertility was developed, and its infertility was assessed for one m onth following the surgical induction of experimental endometriosis. To determine if this model can be used in therapeutic intervention studies, it is important to test and understand it. Our objective was to investigate whether the transplantation of 1 an d 2 fragments of endometrial tissue on each side of the peritoneal wall of female mice promotes experimental endometriosis and reduces natural fertility (pregnancy rate) 4 weeks after the surgical procedure. Additionally, we compared pregnancy duration, li tter size, pup weights, mating return rates, pregnancy losses, stillbirths, and cannibalism rates among animals in the experimental groups. For this purpose, an experimental study was conducted in which females were divided into 4 groups: control group 1 ( sham surgery), endometriosis group 1 (peritoneal transplantation of 2 fragments of endometrial tissue, each 5 mm in size), control group 2 (sham surgery), and endometriosis group 2 (peritoneal transplantation of 4 fragments of endometrial tissue, each 5 mm in size). These females were then paired with fertile males 4 weeks after the surgical procedure. Pregnant females were euthanized after weaning the offspring. After euthanasia, implant tissue of the experimental groups was collected for histological anal ysis. We did not observe a statistically significant difference in pregnancy rates, pregnancy duration, total number of pups at birth, number of live pups at birth, return to mating, gestational loss, stillbirths, and cannibalism when comparing groups C, E 1, and E2. We observed that the litter weight at birth was lower in E2 when compared to groups C (p=0.0467) and E1 (p=0.0004), and higher in E1 compared to C (p=0.0183). The number of live pups at weaning was lower in E2 compared to groups C (p=0.0398) and E1 (p=0.0004), and higher in E1 compared to C (p=0.0197). The litter weight at weaning was lower in E2 compared to E1 (p=0.0009), but there was no difference in this variable between E2 and C. The litter weight at weaning was higher in E1 compared to the C group (p=0.0076). Experimental endometriosis with the suture of fragments of endometrial tissue in the peritoneum of mice did not compromise the fertility of females after 4 weeks of the endometriosis induction procedure when comparing the groups, sugges ting that this is not an appropriate translational model to study endometriosis related to infertility. Females transplanted with 2 fragments of ectopic endometrium had litters with higher birth and weaning weights and a higher number of live pups at weaning. Females transplanted with 4 fragments of ectopic endometrium had litters with lower birth weights and a lower number of live pups at weaning. These findings indicate that litters from females with a higher number of transplanted uterine fragments may have impaired development during pregnancy, with lower birth weights and higher perinatal mortality. However, studies with adequate sample sizes for these outcomes should be conducted for a better evaluation of whether this is an appropriate model to invest igate the impact of experimental endometriosis on gestational and perinatal outcomes.

Endometriosis, infertility, murine model, gestational morbidity, offspring. Lista de Figuras Figura 1. ..................................................................................................................... 25 Figura 2. ..................................................................................................................... 26 Figura 3. ..................................................................................................................... 26 Figura 4. ..................................................................................................................... 27 Figura 5. ..................................................................................................................... 29 Figura 6. ..................................................................................................................... 33 Figura 7. ..................................................................................................................... 33 Figura 8. ..................................................................................................................... 34 Figura 9. ..................................................................................................................... 34 Lista de Tabelas Tabela 1. ..................................................................................................................... 21 Tabela 2. ..................................................................................................................... 35 Tabela 3. ..................................................................................................................... 36 Tabela 4. ..................................................................................................................... 36 Tabela 5. ..................................................................................................................... 36 Lista de siglas C Controle C1 Controle 1 C2 Controle 2 E1 Endometriose 1 E2 Endometriose 2 FMRP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto H.E. Hematoxilina e eosina kg quilograma mg miligrama PIG pequenos para idade gestacional USP Universidade de São Paulo Sumário 1. INTRODUÇÃO................................ ................................ ................................ ..... 15 1.1 Endometriose e infertilidade .......................................................................................... 15 1.2 Endometriose e resultados gestacionais ..................................................................... 16 1.3 Modelo experimental murino ......................................................................................... 19 1.3.1 Acasalamento .......................................................................................................................... 21 1.3.2 Ninhadas .................................................................................................................................. 21 1.4 Endometriose e modelo experimental murino ............................................................. 22 2. OBJETIVOS ................................ ................................ ................................ ........ 23 2.1 Objetivo primário ............................................................................................................. 23 2.2 Objetivo secundário ........................................................................................................ 23 3. MATERIAL E MÉTODOS ................................ ................................ .................... 24 3.1 Considerações éticas ..................................................................................................... 24 3.2 Animais ............................................................................................................................. 24 3.3 Delineamento experimental............................................................................................ 24 3.4 Procedimento cirúrgico .................................................................................................. 25 3.5 Acasalamento dos animais ............................................................................................ 27 3.6 Variáveis analisadas ....................................................................................................... 28 3.7 Eutanásias........................................................................................................................ 28 3.8 Análise histológica do endométrio ectópico ................................................................ 29 3.9 Cálculo amostral ............................................................................................................. 30 3.10 Análises estatísticas ..................................................................................................... 30 4. RESULTADOS ................................ ................................ ................................ .... 31 4.1 Fluxograma do grupo Controle 1 .................................................................................. 31 4.2 Fluxograma do grupo Controle 2 .................................................................................. 31 4.3 Fluxograma do grupo Endometriose 1 ......................................................................... 32 4.4 Fluxograma do grupo Endometriose 2 ......................................................................... 32 4.5 Histologia ......................................................................................................................... 33 4.6 Variáveis analisadas ....................................................................................................... 34 5. DISCUSSÃO ................................ ................................ ................................ ....... 37 6. CONCLUSÃO ................................ ................................ ................................ ...... 41 REFERÊNCIAS ................................ ................................ ................................ .......... 43 ANEXO A ................................ ................................ ................................ .................... 51 15 1. INTRODUÇÃO 1.1 Endometriose e infertilidade A endometriose é uma doença ginecológica estrogênio -dependente comum, debilitante e complexa. É caracterizada pelo implante e crescimento de tecido endometrial, glândulas e/ou estroma, fora da cavidade uterina (Giudice e Kao, 2004; Sonavane et al., 2011). Implantes ectópicos podem ser encontrados em ovários, tubas uterinas, ligamentos útero-sacros, parede abdominal, períneo, tratos urinário e gastrointestinal, tórax e mucosa nasal (Simoglou et al., 2012). Considerada um problema de saúde pública, e stima-se que entre 2% e 10% das mulheres na população tenham endometriose e que 30% a 50% das mulheres com problemas de fertilidade tenham endometriose (ESHRE, 2022). Os sintomas da endometriose são comuns a outras desordens ginecológicas e não ginecológicas, não apresentando sintomas patognomônicos, o que pode dificultar o diagnóstico e impactar negativamente na qualidade de vida das pacientes (Taylor et al., 2021). Sintomas de desordens ginecológicas, incluindo dismenorreia primária, cistos ovarianos, doença inflamatória pélvica e aderências pélvicas, se sobrepõem à endometriose e distúrbios funcionais do intestino e da bexiga, fibromialgia e distúrbios musculoesqueléticos também podem apresentar sintomas semelhantes aos da endometriose (Brawn et al., 2014; Nezhat et al., 2016). Embora a etiopatogenia da infertilidade relacionada a endometriose ainda não esteja completamente esclarecida, existem diversas teorias sobre as causas da doença. Alguns estudos evidenciam que a endometriose, mesmo nos estágios iniciais (estágios I e II), em que não existem alterações anatômicas significativas na cavidade pélvica, pode favorecer a subfertilidade. Acredita -se que os microambientes peritoneal, folicular e endometrial apresentem alterações pró inflamatórias e estresse oxidativo, impactando negativamente na foliculogênese, ovulação, qualidade do oócito, receptividade endometrial e na função espermática (Andrade et al., 2010 ; Agarwal et al., 2012; Da Broi et al., 2014; Da Broi et al., 2016; Da Broi e Navarro, 2016; Gupta et al., 2008; Jianini et al., 2017; Sanchez et al., 2017; Malvezzi et al., 2018; Da Broi et al., 2018; Da Broi et al., 2019; Ferreira et al., 2019). 16 Alterações peritoneais parecem promover um microambiente prejudicial e pró-oxidativo, podendo haver comprometimento do complexo cumulus -oócito e do microambiente folicular, impactando negativamente na foliculogênese e, possivelmente, afetando também a competência oocitária de mulheres com endometriose. As mudanças peritoneais também podem danificar os espermatozoides e dificultar a interação dos gametas. Evidências sugerem que a piora da qualidade gamética está associada ao estresse oxidativo sistêmico e folicular (Da Broi et al., 2019), uma vez que o uso de antioxidantes foi passível de reverter os efeitos deletérios da doença sobre marcadores de qualidade oocitária (Giorgi et al., 2016). Diversas teorias abordam a etiopatogênese da endometriose. Atualmente, a teoria que parece melhor aceita é a proposta por Sampson (1927), conhecida como teoria da menstruação retrógrada, que propõe que parte do tecido endometrial flua para trás durante a menstruação, chegando até as tubas uterinas. Dessa maneira, o tecido pode impl antar e crescer fora do útero, possivelmente sendo também disseminado através do sistema linfático ou sanguíneo através de diferentes órgãos e formando, assim, lesões de endometriose. Miller et al. (2017) sugere que o sistema imunológico de mulheres com infertilidade relacionada a endometriose pode estar potencialmente disfuncional, podendo implicar em danos a foliculogênese, qualidade de oócitos e embriões e receptividade endometrial. É possível notar através de estudos que existe uma severa complexidade na etiopatogenia da doença, que provavelmente envolve interações entre diversos fatores e, portanto, pesquisas relacionadas a infertilidade de mulheres com endometriose se fazem necessárias para aprofundar o conhecimento acerca da relação entre essas condições. 1.2 Endometriose e resultados gestacionais Além de sua forte relação com a infertilidade, diferentes mecanismos vêm sendo associados aos impactos negativos da endometriose na gravidez. Eventos hormonais agudos ou crônicos em resposta ao estresse, ev entos infecciosos ou fatores como estresse oxidativo podem causar um desequilíbrio 17 de citocinas, que ocasiona produção de citocinas inflamatórias relacionadas ao aumento da contratilidade uterina, amadurecimento do colo do útero e ruptura de membranas devi do ao enfraquecimento das mesmas, sinais fortemente relacionados ao parto, mas também relacionados ao aborto espontâneo e ao parto prematuro (Challis et al., 2009). A inflamação está envolvida tanto nos principais processos fisiológicos (menstruação, ovula ção, implantação do embrião e gravidez) quanto em condições patogênicas no sistema reprodutivo feminino. É um processo usado como resposta à infecção, irritação ou lesão e é reconhecida como um tipo de resposta imune não específica (aguda ou crônica). A co ndição de inflamação exacerbada pode resultar em distúrbios entre o sistema imunológico e endócrino, predispondo a alterações na gestação (Weiss et al., 2009; Vannuccini et al., 2016; Vaisi-Raygani e Asgari, 2021). Diabetes mellitus gestacional, hipertensão gestacional, pré -eclâmpsia e parto prematuro são exemplos de resultados adversos gestacionais relacionados à inflamação bem estabelecidos (Wolf et al., 2004; Bodnar et al., 2005; Goldenberg et al., 2008). Distúrbios reprodutivos como a endometriose e a infertilidade inexplicada compartilham vias inflamatórias, alterações hormonais, senescência decidual e anormalidades vasculares que podem comprometer o sucesso da gravidez (Vannuccini et al., 2016). Além da inflamação local, peritoneal e sistêmica, mecanis mos como má qualidade do oócito (prejudicando a implantação do embrião), contratilidade uterina inadequada e placentação deficiente parecem estar associados à resultados adversos na implantação, crescimento fetal e duração da gestação de mulheres com endometriose (Aguilar e Mitchell, 2010; Maggiori et al., 2016). Maggiori et al. (2016) realizaram uma revisão sistemática de artigos que examinaram as relações entre endometriose e gravidez, trazendo evidências de uma associação da endometriose com aborto espon tâneo, parto prematuro, placenta prévia e recém -nascidos pequenos para a idade gestacional. Além disso, parece não haver evidências de que a cirurgia profilática evitaria o potencial impacto negativo da endometriose no resultado da gravidez. Glavind et al. (2017) indicaram haver um maior risco de pré -eclâmpsia, parto prematuro (com risco mais elevado para partos muito prematuros) e necessidade de 18 cesariana em mulheres com endometriose quando comparadas com mulheres sem a doença. Breintoft et al. (2021) realizaram uma revisão sistemática com metanálise que apoia a ideia de que a endometriose está associada a aumento no risco de resultados gestacionais adversos como hipertensão gestacional, pré-eclâmpsia, parto prematuro, placenta prévia, descolamento de place nta, necessidade de cesariana e natimortos. Além disso, também apresenta indícios de associação da doença com hemoperitônio espontâneo e perfuração intestinal espontânea na gravidez. Resultados de estudos mais recentes como o de Gebremedhin et al. (2023) são semelhantes aos relatados previamente, apoiando a hipótese de que a endometriose está associada a resultados adversos na gravidez, como maior risco de pré -eclâmpsia, placenta prévia e parto prematuro. Velez et al. (2022) também constatou associação da d oença com aumento no risco de distúrbios hipertensivos da gravidez, parto prematuro, cesariana, indução do trabalho de parto, placenta prévia, descolamento de placenta, hemorragia pós -parto e natimortos. Assim como descrito por Maggiori et al. (2016), é importante destacar que, aparentemente, não há evidências que comprovem que o procedimento cirúrgico de retirada das lesões de endometriose traria bons resultados gestacionais. A eliminação dessas lesões e restauração anatômica local não necessariamente irá reverter possíveis alterações inflamatórias e biomoleculares relacionadas a infertilidade (Bafort el al., 2020). Todavia, estudos observacionais não permitem estabelecermos relações causais, de modo que a utilização de modelos animais seria de grande valia para esclarecermos os mecanismos etiopatogênicos envolvidos no potencial impacto deletério da endometriose na gestação e prole, cujo conhecimento poderá fundamentar novas abordagens diagnósticas e terapêuticas. Escassos estudos experimentais investigaram o potencial impacto da endometriose em resultados gestacionais e perinatais. Bilotas et al. (2015) estudaram um modelo experimental de endometriose e notaram uma queda na fertilidade das fêmeas de camundongos com lesões de endometriose, porém não encontrar am diferenças significativas na taxa de reabsorção fetal, no 19 tamanho da ninhada e no peso dos filhotes ao compararem animais com e sem endometriose, após realizarem a eutanásia das fêmeas com 18 dias de prenhez. Elsherbini et al. (2022) avaliaram o impact o da exposição crônica à endometriose em resultados perinatais através de investigações em fêmeas de camundongos jovens e idosas. As fêmeas foram submetidas a injeções intraperitoneais de úteros de doadoras, acasaladas em 1 (jovens) ou 43 dias (idosas) após o procedimento e eutanasiadas no 18° dia de gestação. O número de filhotes e reabsorções foi contado, o peso corporal dos filhotes foi medido, e a lesão de endometriose foi identificada e pesada . Fêmeas jovens não tiveram alterações significativas entre os grupos, mas as fêmeas acasaladas após maior tempo de exposição à endometriose experimental apresentaram número de reabsorções significativamente maior e o peso corporal dos filhotes foi significativamente menor na endometriose em comparação com o grupo de controle. O peso total da lesão de endometriose por mãe foi significativamente menor no grupo de Endometriose Idoso em comparação com o grupo de Endometriose Jovem , o que pode sugerir que a exposição crônica à endometriose antes da gestação pode ter impactos negativos nos resultados perinatais. Já Hayashi et al. (2020) estabeleceram um modelo de endometriose ovariana em camundongos que revelou um número significativamente reduzido de filhotes implantados no grupo experimental. Tan et al. (2023) também desenvolveram um estudo de endometrioma em camundongos e notaram, além de uma redução da fertilidade, menores tamanho dos filhotes e peso das ninhadas de fêmeas com endometrioma experimental, além de maior taxa de aborto e natimortos nesse grupo quando comparado ao grupo controle (sham). 1.3 Modelo experimental murino Grande parte dos estudos no campo de ciências da vida utiliza modelo murino experimental (Mus musculus) para investigar as implicações na saúde e no corpo humano. Seres humanos e esse modelo compartilham grande parte de suas características fisiológicas e patológicas. Existem semelhanças na diferenciação e morte celular e nos mecanismos moleculares pelos quais ambas as espécies executam processos celulares básicos. Além disso, roedores como 20 ratos e camundongos e humanos também compartilham órgãos e fisiologia sistêmica e apresentam consistência na patogênese de doenças (Demetrius, 2006; Rosenthal e Brown, 2007). Por meio de análises comparativas dos genomas de ambas as espécies é possível relacionar características comuns e realizar manipulações genômicas no animal para gerar modelos de patologias humanas. Assim, esses animais podem ser submetidos a experimentos biomédicos que não são possíveis em pacientes humanos. Conforme ocorre a evolução nos estudos sobre doenças humanas que roedores normalmente não contraem, existe uma crescente de abordagens experimentais sendo aplicadas para “humanizar” a fisiologia do roedor e mimetizar as manifestações clínicas que ocorrem em humanos (Rosenthal e Brown, 2007). Camundongos fornecem condições experimentais análogas e resultados comparáveis aos humanos. Quase 80% dos animais experimentais são roedores, incluindo ratos, camundongos, cobaias e outros e, comparado a outros mamíferos, esses animais são baratos, fáceis de manter e simples de criar em cativeiro. São pequenos, dóceis, rápidos e prolíficos reprodutores ( Rosenthal e Brown, 2007; Sengupta, 2013). Considerando a reprodução desses animais, algumas similaridades entre a placenta de camundongos e humanos s ão relatadas. Em ambas as espécies é do tipo discoidal, além disso há íntimo contato na barreira materno -fetal, caracterizando a placentação de humanos e roedores como hemocorial (Burton et al, 2006). Existem diversos modelos experimentais murinos para es tudar mecanismos patogênicos de doenças humanas que cursam com problemas de placentação, como a diabetes gestacional e a pré-eclâmpsia (Plows et al., 2017; Chau et al., 2020; Bakrania et al., 2022; Liu et al., 2022; Grupe e Scherneck, 2023). Modelos experi mentais contribuem significativamente para a compreensão das bases moleculares, patogênese e eficácia terapêutica de medicamentos em doenças multifatoriais (Chatzigeorgiou et al., 2009). 21 1.3.1 Acasalamento A evidência de acasalamento nos camundongos pode ser detectada pela presença de placa vaginal, que pode persistir por 16 a 24 horas após a cópula. A placa preenche a vagina desde a cérvix até a vulva. A hipófise anterior libera prolactina para capacitar o corpo lúteo a secretar progesterona por aproximadamente 13 dias. Se ocorrer fertilização, a placenta assume a produção de progesterona. Caso a fertilização não ocorra, há um período de pseudoprenhez, não ocorrendo estro e ovulação durante os 12 dias dessa fase. A fertilização geralmente ocorre na ampo la do oviduto, 10 a 12 horas após a ovulação (Ko et al., 2017). Alguns parâmetros importantes sobre fisiologia e reprodução de camundongos usados em pesquisa são listados na Tabela 1. Tabela 1. Fisiologia geral e dados reprodutivos de camundongos Mus musculus (adaptada de Dutta e Sengupta, (2016) e Ko et al., (2017)) Dados fisiológicos comuns Dados reprodutivos Tamanho da ninhada 2-10 animais Maturidade sexual macho 6-8 semanas Peso ao nascer 1-2 gramas Maturidade sexual fêmea 6-8 semanas Duração do período reprodutivo 10-15 meses Duração do ciclo estral 4-5 dias Peso macho adulto 20-30 gramas Duração do estro 10-20 horas Peso fêmea adulta 18-35 gramas Tempo de ovulação 8,5 horas após início do estro Longevidade 1-3 anos Duração média gestação 20 dias Volume sanguíneo total 1,5-2,5 mL 1.3.2 Ninhadas O camundongo nasce sem pelos, com o corpo avermelhado, de olhos fechados e pavilhões auriculares fechados, aderidos à cabeça. Por volta do terceiro dia de vida, a pele desses animais começa a clarear ou escurecer (dependendo da coloração da linhagem), os pelos começam a aparecer e as orelhas começam a se afastar da cabeça e se abrir. Aos dez dias de vida, abrem os olhos e, a partir dos quinze dias, já começam a se alimentar de ração que a mãe fornece. Após o parto, a fêmea amamenta a ninhada e apesar de, aos 18 dias de idade, já estarem aptos ao desmame, linhagens consanguíneas 22 geralmente realizam o desmame por volta de 4 semanas de idade (Andrade e Oliveira, 2002). A perda de filhotes e ninhadas parece ser comum na espécie. Fatores estressantes relacionados a manejo, ambiente, socialização e fatores genéticos parecem afetar a sobrevivência desses animais (Reeb -Whitaker et al., 2001; Bond et al., 2002; Gaskill et al., 2009; Gaskill et al., 2013; Weber et al., 2013; Gaskill et al., 2015; Wasson, 2017; Leidinger et al., 2019). Alguns protocolos evitam inspecionar as gaiolas de reprodução nos primeiros dias de vida dos animais, na tentativa de evitar a mortalidade perinatal, mas inspecionar de 12 a 24 horas após o parto pode resultar em subestimação da mortalidade, visto que adultos canibalizam filhotes mortos, tornando -os incontáveis. Sendo assim, o adiamento na inspeção pode ser inadequado. Apesar de o infanticídio de filhotes ser raro em condições normais na criação de camundongos de laboratório, pode ocorrer (Brajon et al., 2021). 1.4 Endometriose e modelo experimental murino A endometriose ocorre espontaneamente apenas em humanos e primatas que eliminam endométrio durante o ciclo menstrual (Jabbour et a l., 2006; Emera et al., 2012), sendo possível realizar a indução da patologia cirurgicamente em alguns modelos animais. Neste contexto, um estudo recentemente publicado estudou um modelo murino de infertilidade relacionada à endometriose (Rosa e Silva et al., 2019). Neste estudo, foram avaliados quatro grupos experimentais, sendo um controle (cirurgia simulada) e três grupos de endometriose induzida pelo transplante peritoneal de 1, 2 ou 4 fragmentos endometriais de 5 mm de cada lado da parece peritoneal, p rovenientes de fêmeas doadoras. Um mês após o procedimento cirúrgico, as fêmeas foram inseridas no mesmo ambiente que machos de fertilidade comprovada, durante quatro semanas ou até apresentarem sinais de prenhez e as taxas de gestação, tempo até o parto e tamanho da ninhada foram comparados entre os 4 grupos. Os autores evidenciaram que as taxas de prenhez foram significativamente menores nas fêmeas transplantadas com 2 (67%) ou 4 segmentos (57%) de tecido endometrial (de cada lado da parede peritoneal da fêmea) em comparação com os grupos controle (100%) ou 1 segmento (100%). Todavia, os animais não 23 evidenciaram aderências peritoneais quando da eutanásia, sugerindo que a redução da fertilidade observada nestes animais não foi decorrente de fator anatômico, o que, talvez, permita extrapolar os achados para mulheres com infertilidade relacionada a endometriose, em que não se observam alterações significativas da morfologia pélvica. Os achados de Rosa e Silva et al., (2019) são bastante interessantes, e, verificar se são reprodutíveis é importante para justificar o seu uso para avaliar os mecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada a endometriose, assim como testar novas intervenções terapêuticas. Aliado a isto, considerando o potencial impacto negativo da endometriose na gestação e na prole, ainda não confirmado em estudos experimentais, investigar estes desfechos também é de grande relevância, justificando a realização do presente estudo. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo primário Este trabalho teve como objetivo primário investigar se o transplante de 1 e 2 fragmentos de tecido endometrial em cada lado da parede peritoneal de camundongos fêmeas promoveria endometriose experimental e redução da fertilidade natural, avaliada 4 semanas após a realização do pr ocedimento cirúrgico, comparando animais controle (cirurgia simulada) e animais transplantados com 1 e 2 fragmentos de tecido endometrial em cada lado da parede peritoneal. 2.2 Objetivo secundário O objetivo secundário foi investigar se o transplante de 1 e 2 fragmentos de tecido endometrial em cada lado da parede peritoneal de camundongos fêmeas promoveria comprometimento dos resultados gestacionais e perinatais da prole até o desmame , comparando a duração da prenhez, o tamanho da ninhada, o peso dos filhotes ao nascer e ao desmame , natimortos, canibalismo por parte da mãe, perdas gestacionais e retorno ao acasalamento entre animais com e sem endometriose experimental. 24 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Considerações éticas O presente projeto foi aprovado pela Com issão de Pesquisa do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, FMRP/USP e pela Comissão de Ética no Uso de Animais, FMRP/USP, sob o protocolo 163/2020. 3.2 Animais Foi realizado um estudo experimental, usando o camundongo C57BL/6J (linhagem Black) como modelo experimental. Foram utilizadas fêmeas com 8 a 12 semanas de vida e machos reprodutores com fertilidade comprovada por acasalamento e proles anteriores, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo. As fêmeas foram recebidas do Biotério Central após 6 semanas de vida e mantidas no Biotério de Cirurgia Experimental até completarem 8-12 semanas de vida. Neste período os animais foram mantidos em ciclo de claro -escuro de 12 horas com temperatura controlada e com água e ração Nuvilab ad libitum. 3.3 Delineamento experimental O estudo conta com quatro grupos experimentais (Figura 1):  Controle 1 (C1): cirurgia simulada com um ponto cirúrgico de cada lado da parede abdominal da fêmea (total de 19 animais);  Endometriose 1 (E1): cirurgia com sutura de 1 fragmento de 5 mm de tecido uterino de doadora em cada lado da parede pélvica da receptora, totalizando 2 fragmentos (total de 20 animais);  Controle 2 (C2): cirurgia simulada com dois pontos cirúrgicos de cada lado da parede abdominal da fêmea (total de 23 animais);  Endometriose 2 (E2): cirurgia com sutura de 2 fragmentos de 5 mm de tecido uterino de doadora em cada lado da parede pélvica da receptora, totalizando 4 fragmentos (total de 22 animais). 25 Pelo fato de o procedimento cirúrgico em si causar uma resposta inflamatória, optamos por desenvolver grupos sham como controle. Os animais passaram pelo mesmo procedimento que as fêmeas dos grupos experimentais, assim eliminamos possíveis efeitos que sejam consequência da cirurgia. Figura 1. Resumo do delineamento experimental. Fonte: acervo pessoal. 3.4 Procedimento cirúrgico Os úteros de 32 doadoras foram removidos por histerectomia sob anestesia e imersos em tampão de solução salina fisiológica para im plantação imediata na parede peritoneal de 42 receptoras. Antes da implantação, os cornos foram separados e o lúmen de cada um foi aberto longitudinalmente. As fêmeas foram submetidas a laparotomia sob anestesia, com aplicação de xilazina 2% (5 mg/kg) e cetamina 10% (25 mg/kg) intramuscular, para indução de endometriose ou cirurgia simulada como controle. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados por cirurgião experiente. A cavidade pélvica foi aberta por incisão longitudinal mediana de aproximadamente 2 cm, a face peritoneal interna foi exposta e os fragmentos do útero suturados no local com Vicryl 5.0. A quantidade total de tecido uterino suturado foi dois fragmentos de tecido de 5 mm por animal no grupo Endometriose 1 (N=21) e quatro fragmentos de teci do de 5 mm no grupo Endometriose 2 (N=22). Os animais pertencentes ao grupo controle foram submetidos ao mesmo procedimento, recebendo duas e quatro suturas de Vicryl 5.0, sem o tecido endometrial (Grupos C1 e C2, 26 respectivamente). A incisão abdominal foi então fechada com Sutura Vicryl 4.0. Não houve suplementação hormonal ou administração de antibióticos antes ou após a cirurgia. Para minimizar a dor pós-operatória, todos os animais receberam analgesia com meloxicam 1,0 mg/kg de peso corporal por meio de injeções intraperitoneais, a cada 24 horas por 72 horas. Os procedimentos cirúrgicos estão demonstrados nas Figuras 2, 3 e 4. Figura 2. Parede abdominal de fêmea de camundongo pertencente ao grupo Controle. Nota: A: realização do ponto cirúrgico sem a presença de fragmento endometrial. B: Ponto cirúrgico finalizado. Fonte: acervo pessoal. Figura 3. Útero e p arede abdominal de fêmea de camundongo pertencente ao grupo Endometriose 1. Nota: C: cornos uterinos expostos. D: sutura de um fragmento de tecido uterino suturado na parede peritoneal da fêmea. Fonte: acervo pessoal. A B C D 27 Figura 4. Parede abdominal de fêmea de camundongo pertencente ao grupo Endometriose 2. Nota: Dois fragmentos de tecido uterino suturados na parede peritoneal da fêmea. Fonte: acervo pessoal. 3.5 Acasalamento dos animais Quatro semanas após a cirurgia, as fêmeas de cada um dos 4 grupos foram colocadas em caixas com camundongos machos com fertilidade comprovada por um período de até 4 semanas. Foram colocadas, no máximo, 2 fêmeas para 1 macho em cada caixa. As fêmeas foram avaliadas diariamente quanto a sinais de acasalamento e prenhez. A confirmação de acasalamento foi realizada através de visualização de placa vaginal, quando a fêmea foi separada do macho e mantida com outras fêmeas até três dias antes da data prevista para o parto (20 dias após visualização da placa vaginal). Ao atingir esse período de prenhez, cada fêmea foi isolada em uma gaiola e ali mantida com sua ninhada. O desenvolvimento da prenhez foi moni torado por meio de pesagens a cada 2 dias. Não havendo aumento de peso até próximo do sétimo dia após visualização da placa vaginal, a fêmea era novamente colocada na presença do macho para acasalar até apresentar plugue ou completar 4 semanas de criada com macho. Esse ato diminui a possibilidade de a fêmea não ter desenvolvido a gestação por motivos que não possuam relação com a indução da endometriose por procedimento cirúrgico, visto que o plugue vaginal indica presença de cópula, mas a fertilização pode não ter ocorrido. 28 Sabe-se que , na medicina humana, a infertilidade é definida pela dificuldade de um casal engravidar tendo relações sexuais sem uso de nenhuma forma de anticoncepção no período de um ano. Apesar de não haver um conceito definido sobre qua ndo um camundongo é considerado infértil, levamos em consideração a definição para humanos e permitimos que a fêmea tivesse mais de uma cópula para evitar possíveis considerações errôneas a respeito da taxa de gestação. 3.6 Variáveis analisadas A taxa de prenhez (definida como a porcentagem de animais que gestaram em relação ao número total de animais do grupo), a duração da prenhez (número de dias a partir da visualização da placa vaginal até a data do parto), o número de filhotes por ninhada ao nascer e ao desmame (quatro semanas após o nascimento), o peso dos filhotes ao nascimento e ao desmame, natimortos (feto que nasceu morto), presença de canibalismo (prática de um indivíduo se alimentar de outro da mesma espécie) por parte da mãe, as perdas gestacionais e necessidade de retorno ao acasalamento foram comparados entre os grupos. A fêmea foi considerada gestante a partir do momento em que ganhou peso após apresentar placa vaginal. Duas situações foram consideradas perda gestacional: a prenhez que passou da data prevista para o parto e a fêmea perdeu peso gradualmente e a fêmea prenhe que, pouco tempo antes da data prevista para o parto começou, lentamente, a perder peso. Já a variável retorno ao acasalamento remete às fêmeas que, após visualização da placa vaginal, não ganharam peso na primeira semana de acompanhamento e, portanto, foram novamente colocadas para criar com machos até presença de nova placa vaginal (ou até completar 30 dias de exposição ao macho). 3.7 Eutanásias As fêmeas foram submetidas a eutanásia após o desmame dos filhotes e tecido das lesões de endometriose foi coletado para análise histológica. Machos após criados com fêmeas e filhotes (após devidas avaliações) também foram submetidos a eutanásia. 29 As eutanásias dos animais foram re alizadas por meio de deslocamento cervical para evitar possíveis alterações em parâmetros plasmáticos associadas ao uso de anestésicos. 3.8 Análise histológica do endométrio ectópico As lesões de endometriose foram coletadas após eutanásia dos animais e posicionadas em cassetes histológicos. Macroscopicamente, algumas lesões eram estruturas ovais translúcidas preenchidas com fluido. Outras lesões possuíam aspecto amarronzado, com conteúdo espesso e escuro. Além disso, em algumas fêmeas foram encontradas a derências à intestino, corno uterino e ovário. Na Figura 5 é possível perceber essas características citadas em apenas um animal. Figura 5. Animal eutanasiado apresentando lesões ectópicas de endometriose. Nota: Em vermelho: lesão oval e preenchida por fluido translúcido. Em azul: lesão de aspecto castanho, com conteúdo espesso e escuro. Em verde: aderência da lesão em corno uterino e ovário direito. Fonte: acervo pessoal. A fixação do material foi realizada com solução formalina neutra tamponada a 10% pelo período de 24 horas. Após esse período, as lesões foram 30 transferidas para o álcool 70% e mantidas até as próximas etapas de preparação da lâmina. A etapa de fixação tem por finalidade a interrupção do metabolismo celular, preservando e conservando elementos teciduais (Santos et al., 2021). As lesões então passaram pelos processos de clivagem, desidratação, diafanização, impregnação e inclusão. A microtomia fez cortes com espessura de 3 micrômetros para passagem de luz e observação do tecido ao microscópio. A coloração utilizada para a técnica foi hematoxilina e eosina (H.E.), indicada para observação geral de tecidos (Santos et al., 2021). Para a leitura da lâmina foi utilizado um microscópio binocular Zeiss Axio Scope.A1 de luz convencio nal com aumento de 20 vezes e as lâminas foram visualizadas e analisadas em busca de células endometriais. 3.9 Cálculo amostral Considerando a gestação como desfecho (variável binária) e assumindo uma diferença clinicamente relevante de 43% na taxa de g estação entre os grupos (100% no grupo controle versus 57% no grupo 1; Rosa e Silva et al., 2019) e assumindo um nível de significância de 5% com um poder de teste de 80%, necessitamos de 16 animais por grupo. O cálculo do tamanho da amostra foi realizado usando a calculadora implementada no site https://www.sealedenvelope.com/. 3.10 Análises estatísticas Foi realizada uma análise exploratória dos dados por meio de medidas de posição central e dispersão. O g ráfico box plot foi utilizado para verificar a distribuição dos dados. Após verificar os resultados da análise exploratória de dados, optamos pela mediana e o intervalo interquartil para sumarizar os resultados obtidos na amostra. As variáveis qualitativas (taxas de prenhez, natimortos, perda gestacional, retorno ao acasalamento e canibalismo ) foram resumidas considerando as frequências absolutas e relativas. Para verificar se os grupos diferiam em relação a estas variáveis foi aplicado o teste Qui-Quadrado. 31 À princípio foi utilizado o teste estatístico de Wilcoxon para amostras independentes para comparar as variáveis quantitativas (duração da prenhez, número de filhotes por ninhada e pesos dos filhotes ao nascimento e ao desmame) entre os dois grupos contr ole (C1 e C2) e garantir que não há diferença estatística entre eles. Após isto, os grupos Controle 1 e Controle 2 foram unificados em grupo Controle, visto que apenas diferem no período em que foram realizados e o teste não paramétrico de Kruskal Wallis f oi aplicado para verificar se existe diferença estat isticamente significativa entre os grupos de estudo (Controle, Endometriose 1 e Endometriose 2) em cada variável analisada. Quando o teste demonstrou a existência de uma diferença entre os grupos, realizamos o pós-teste de Dunn para encontrar tal fator. As análises foram realizadas no programa SAS versão 9.4 e no programa R versão 4.2.2. 4. RESULTADOS 4.1 Fluxograma do grupo Controle 1 Dezenove fêmeas foram submetidas ao procedimento cirúrgico simulado. Duas fêmeas morreram: uma fêmea por distocia fetal e outra por aborto seguido de morte da gestante com 18 dias de prenhez, sem causa aparente , restando um total de dezessete fêmeas analisadas . Dessas, três fêmeas cometeram canibalismo de seus filhotes e não foi possível checar as variáveis ao desmame. Além disso, uma fêmea perdeu a gestação aos 18 dias de prenhez. 4.2 Fluxograma do grupo Controle 2 Vinte e três fêmeas foram submetidas ao procedimento cirúrgico simulado. Duas fêmeas morreram no decorrer do es tudo: uma fêmea com ninhada de 14 dias e outra com ninhada de 5 dias, ambas sem causas aparentes, restando um total de vinte e uma fêmeas analisadas. Dessas, nenhuma fêmea cometeu canibalismo dos filhotes, mas três fêmeas perderam gestações: a primeira fêmea perdeu a gestação com 14 dias de prenhez, após retornar ao acasalamento duas vezes. A segunda fêmea perdeu a gestação aos 21 dias de 32 prenhez (houve perda de peso sem sinais de parto na gaiola) e a terceira fêmea perdeu a gestação com 13 dias de prenhez, após retornar ao acasalamento duas vezes. 4.3 Fluxograma do grupo Endometriose 1 Vinte fêmeas foram submetidas ao procedimento cirúrgico para indução de endometriose. Uma fêmea morreu no decorrer do estudo por distocia fetal, restando dezenove fêmeas. Dessas, uma fêmea cometeu canibalismo dos filhotes, e não houve perda gestacional. 4.4 Fluxograma do grupo Endometriose 2 Vinte e duas fêmeas foram submetidas ao procedimento cirúrgico para indução de endometriose. Nenhuma fêmea desse grupo morreu duran te o decorrer do estudo. Quatro fêmeas cometeram canibalismo dos filhotes. Houve uma perda gestacional de fêmea com 15 dias de prenhez, após retornar ao acasalamento uma vez. Uma fêmea desse grupo foi encontrada sem ninhada imediatamente após o parto, portanto não foi possível monitorar esses filhotes. A Figura 6 resume as perdas de animais durante o experimento. As ninhadas foram eutanasiadas por meio de dose excessiva de isoflurano após detecção da morte das mães. Nenhum animal teve complicação pós-cirúrgica. 33 Figura 6. Perdas de animais por morte durante o experimento. Fonte: acervo pessoal. 4.5 Histologia Foi realizada a confirmação histológica das lesões ectópicas de endometriose em todos os animais submetidos ao procedimento cirúrgico (como exemplificado nas Figuras 7, 8 e 9). Figura 7. Fragmentos uterinos de diferentes animais vistos no aumento de 5x em microscopia ótica. Fonte: acervo pessoal. 34 Figura 8. Fragmentos uterinos de diferentes animais visto no aumento de 10x em microscopia eletrônica. Fonte: acervo pessoal. Figura 9. Células endometriais vistas no aumento de 40x em microscopia eletrônica. Nota: células endometriais destacadas por círculo vermelho. Fonte: acervo pessoal. 4.6 Variáveis analisadas À princípio, as taxas d e prenhez, tempo de gestação, número total de filhotes ao nascer, número de filhotes vivos ao nascer, peso da ninhada ao nascer, número de filhotes vivos no desmame e peso da ninhada ao desmame foram comparados entre os grupos Controle 1 e Controle 2. Não houve diferença estatisticamente significativa nestas variáveis entre os grupos controle 1 e controle 2 (Tabela 2), de modo que foram agrupados como grupo Controle (C) e, a seguir, comparado com os grupos experimentais Endometriose 1 e Endometriose 2. 35 Tabela 2. Comparação dos resultados gestacionais nos grupos Controle 1 e Controle 2 Variável Controle 1 N = 17 Controle 2 N = 21 p Taxa de prenhez (%) 100% 100% Tempo gestação 20 (20; 21) 20 (20; 20) 0,2754 Total filhotes nascimento 8 (7,5; 9) 8 (7; 9) 1,000 Filhotes vivos nascimento 8 (7; 8) 8 (7; 9) 0,7717 Peso ninhada nascimento 10 (8; 10) 10 (8; 10) 0,7963 Filhotes desmame 6 (4,5; 7) 7 (6; 7) 0,2792 Peso ninhada desmame 108 (102; 118) 102 (96; 106) 0,0842 Nota: dado apresentado como mediana (quart il inferior; quartil superior). N= número. p<0,05 considerado estatisticamente significante. Teste estatístico da soma dos postos de Wilcoxon. Tempo de gestação: dias. Pesos ninhadas nascimento e desmame: gramas. Não observamos diferença estatisticamente significativa nas taxas de gestação, tempo de gestação, número total de filhotes ao nascimento e número de filhotes vivos ao nascimento ao compararmos os grupos C, E1 e E2 ( Tabela 3). O peso da ninhada ao nascer foi significativamente menor em E2 quando comparado aos grupos C (p= 0,0467) e E1 (0,0004) e significativamente maior em E1 quando comparado ao C (p=0,0183) (Tabela 3). O número de filhotes vivos ao desmame foi significativamente menor em E2 quando comparado aos grupos C (p= 0,0398) e E1 (0,0004) e significativamente maior em E1 do que no C (p=0,0197) (Tabela 3). O peso da ninhada ao desmame foi significativamente menor em E2 quando comparado ao e E1 (0,0009 ), mas não houve diferença dessa variável entre E2 e C. O peso da ninhada ao desmame foi maior em E1 quando comparado ao grupo C (p=0,0076) (Tabela 3). Não houve diferença estatisticamente significativa nas taxas de retorno ao acasalamento, perda gestacional, natimortos e canibalismo ao compararmos os grupos C, E1 e E2 (Tabelas 4 e 5 ). Enquanto 23,6% das fêmeas do grupo Controle não emprenharam na primeira vez que apresentaram placa vaginal, o mesmo ocorreu em 10,5% (1/10) das fêmeas do grupo E1 e em 4,5% (1/25) das fêmeas do grupo E2 (Tabela 4). Apesar de não haver diferença estatisticamente significativa no número de natimortos entre os três grupos, em pouco mais que 1/5 (23,5%) das fêmeas pertencentes ao grupo C foi possível notar a presença de filhotes mortos ao nascimento. Já nos grupos E1 e E2 a porcentagem de 36 fêmeas com filhotes natimortos foi de 42,1% (poucos mais que 2/5) e 40% (2/5), respectivamente (Tabela 5 ). Apesar de não haver diferença estatisticamente significativa também na taxa de canibalismo entre os 3 grupos, no grupo C, 1/10 (8,8%) das fêmeas cometeram ato de canibalismo, no grupo E1, 1/20 (5,2%) das fêmeas e no grupo E2, 1/5 (20%) das fêmeas (Tabela 5). Tabela 3. Comparação dos resultados gestacionais observados nos grupos Controle, Endometriose 1 e Endometriose 2 Nota: N= número. Tempo de gestação: dias. Pesos ninhadas nascimento e desm ame: gramas. Dados apresentados como mediana (quartil inferior; quartil superior). A mesma letra na mesma linha significa presença de diferença significativa (p<0,05). Teste estatístico Kruskal-Wallis e pós-teste Dunn. Tabela 4. Comparação de e retorno a o acasalamento e perda gestacional observados nos grupos Controle, Endometriose 1 e Endometriose 2 Variável Controle N = 38 Endometriose 1 N = 19 Endometriose 2 N = 22 p Retorno acasalamento 9 (23,68%) 2 (10,53%) 1 (4,55%) 0,1117 Perda gestacional 4 (10,53%) 0 (0%) 1 (4,55%) 0,2821 Nota: dado apresentado como frequência e porcentagem. N= número. p<0,05 considerado estatisticamente significante. Teste estatístico Qui-quadrado. Tabela 5. Comparação de natimortos e presença de canibalismo observados nos g rupos Controle, Endometriose 1 e Endometriose 2 Variável Controle N = 34 Endometriose 1 N = 19 Endometriose 2 N = 20 p Natimortos 8 (23,53%) 8 (42,11%) 8 (40%) 0,2809 Canibalismo 3 (8,82%) 1 (5,26%) 4 (20%) 0,2914 Nota: dado apresentado como frequência e porcentagem. N= número. p<0,05 considerado estatisticamente significante. Teste estatístico Qui-quadrado. Variável Controle N = 38 Endometriose 1 N = 19 Endometriose 2 N= 22 p Taxa de gestação 100% 100% 100% Tempo gestação 20 (20; 20) 20 (20; 20) 20 (20; 20) 0,17 Total filhotes nascimento 8 (7; 9) 9 (8; 10) 8 (7; 8,5) 0,13 Filhotes vivos nascimento 8 (7; 8) 8 (7; 9) 8 (6,5; 8) 0,23 Peso ninhada nascimento 10 (8; 10) ac 10 (10; 12) ab 8 (6; 10) bc 0,00001 Filhotes desmame 7 (5; 7) ac 8 (7; 8) ab 5 (3,5; 7) bc 0,00001 Peso ninhada desmame 104 (96; 112) a 116 (110; 128) ab 96 (67; 109) b 0,01 37 5. DISCUSSÃO Inicialmente observamos que o transplante de um ou dois fragmentos de tecido uterino em cada lado da parede peritoneal de fêmeas de camundongo não comprometeu a taxa de prenhez dos animais, evidenciando que o modelo não é adequado para o estudo da infertilidade relacionada a endometriose. Esse fato não corrobora com o estudo de Rosa e Silva et al. (2019) que, ao compararem quatro grupos: Sham (cirurgia simulada), Endometriose 1 (sutura de 1 fragmento de tecido uterino na parede pélvica), Endometriose 2 (sutura de 2 fragmentos de tecido uterino) e Endometriose 4 (sutura de 4 fragmentos), não encontraram diferença significativa entre as taxa s de gestação dos grupos Sham e Endometriose 1, porém encontraram uma redução significativa da fertilidade nos grupos Endometriose 2 e 4. Neste contexto, é importante salientarmos que o procedimento cirúrgico experimental no nosso trabalho foi realizado por cirurgião experiente e, além disso, na eutanásia foram visualizadas lesões macroscópicas compatíveis com as de endometriose em todas as fêmeas operadas. Também confirmamos histologicamente a presença de tecido endometrial em todos os animais dos grupos experimentais, de modo que nossos dados são confiáveis. A técnica de transplante de fragmentos uterinos murinos para testar o modelo de infertilidade relacionada a endometriose foi selecionada de acordo com o que havia disponível quando o nosso projeto com eçou a ser realizado, mas atualmente já existem outros estudos, como de Hayashi et al. (2020) e Tan et al. (2023) , que desenvolveram endometriose em modelos translacionais por meio de procedimentos diferentes. Questionamos se o transplante de maior quantidade de tecido uterino poderia comprometer a fertilidade de uma parcela das fêmeas. Também questionamos se outros modelos de endometriose experimental murino poderão ser adequados para o estudo da infertilidade , o que precisará ser avaliado em estudos futuros. Investigamos também se o transplante de 1 e 2 fragmentos de tecido endometrial em cada lado da parede peritoneal de camundongos fêmeas promoveria comprometimento dos resultados gestacionais e perinatais da prole até o desmame . Evidenciamos que os implantes endometriais não interferiram no tempo de gestação e no tamanho da ninhada ao nascer de acordo com nossos resultados e, o estudo de Rosa e Silva et al. (2019), corrobora com esses 38 achados. P orém, nesse trabalho , não foi realizado o acompanhamento das ninhadas até o desmame e, até o momento, não foram encontrados, na literatura, trabalhos que acompanharam as ninhadas pelo período de 30 dias após o parto. Se por um la do o implante de endométrio ectópico não comprometeu a fertilidade, o tempo de gestação, o total de filhotes e o número de filhotes vivos ao nascimento , por outro, tanto dois quanto quatro fragmentos de tecido endometrial implantados promoveram algumas alterações nos desfechos gestacionais e/ou perinatais avaliados. O grupo E1 teve o peso da ninhada ao nascer e ao desmame significativamente maior quando comparado aos grupos C e E2. Na tentativa de procurar explicações para estes achados, supomos que o desenvolvimento desses filhotes poderia ser comparado ao desenvolvimento de bebês humanos recém-nascidos grandes para a idade gestacional. A exposição a um ambiente intrauterino adverso pode resultar em alterações epigenéticas durante o desenvolvimento, resultando em alterações na estrutura e função de órgãos e sistemas de controle na prole (Bark er, 1995). Um exemplo disso é a exposição à hiperglicemia materna, que pode contribuir para o aumento da obesidade, intolerância à glicose, hipertensão, dislipidemia e risco cardiovascular alterado nos descendentes, sabe -se que existe uma forte associação entre a diabetes gestacional e a hiperglicemia materna (Ma et al., 2015). Há tempos estudos levam a crer que existe uma relação direta entre o diabetes gestacional e recém- nascidos grandes para a idade gestacional (Formby et al., 1987; Vohr et al., 1999). O diabetes, assim como a endometriose, é uma doença inflamatória também relacionada ao estresse oxidativo e distúrbios imunológicos, sendo o diabetes gestacional relacionado a inflamação sistêmica e a endometriose relacionada a inflamação crônica (Richards on e Carpenter, 2007; King et al., 2008; López -Tinoco et al., 2013; Shang et al., 2015). O estado inflamatório poderia levar a complicações na gestação que impactem no desenvolvimento fetal, podendo afetar o aporte de nutrientes ao feto. Acreditamos que as semelhanças em ambas as doenças podem ser uma hipótese para justificar o maior peso dos filhotes pertencentes ao grupo E1, fato que permaneceu desde o nascimento até o período de desmame, porém a conexão entre a endometriose e esses resultados não está estabelecida na literatura. 39 Por outro lado, evidenciamos que o peso da ninhada ao nascer e o número de filhotes vivos ao desmame foi significativamente menor em E2 quando comparado aos grupos C e E1. Além disso, o peso da ninhada ao desmame foi significativamente menor em E2 quando comparado ao E1, porém sem diferença quando comparado ao C. Esses dados demonstram que as ninhadas provenientes de fêmeas com maior número de fragmentos uterinos transplantados podem ter desenvolvimento prejudicado durante a gestação, nascendo com menor peso e apresentando maior mortalidade perinatal. Porém, os filhotes que sobrevivem, parecem conseguir recuperar o peso ao desmame , visto que não há diferença significativa entre os grupos E2 e C na variável peso dos filhotes ao desmame. Tan et al. (2023) desenvolveram um modelo de endometriose ovariana , aplicando fragmentos de tecido uterino na bolsa ovariana de camundongos receptoras. D emonstraram, além de redução da fertilidade de fêmeas pertencentes ao grupo experimental, redução do número e tamanho dos filhotes ao nascer , similarmente ao que observamos no grupo E2 do nosso estudo . Apesar de não podermos relacionar diretamente esses achados com os nossos resultados, uma vez que o modelo experimental é distinto, não há mais detalhes sobre o desenvolvimento dos filhotes, o que dificulta nossa comparação no que diz respeito à recuperação do peso dos filhotes ao desmame. As revisões de literatura e meta-análises de Bruun et al. (2018) e de Zullo et al. (2017) demonstram que mulheres co m endometriose e adenomiose possuem maior probabilidade de parto prematuro e restrição de crescimento intrauterino, culminando em recém -nascidos pequenos para idade gestacional. Horton et al. (2019) publicaram uma revisão sistemática e meta -análise a respeito de resultados neonatais de mulheres com endometriose, concluindo que a doença pode impactar de forma negativa parâmetros como peso ao nascer adequado para o período gestacional e necessidade de internação neonatal por complicações variadas. Uma metanálise recentemente publicada (Breintoft et al., 2021) evidenciou que a endometriose está associada a aumento no risco de resultados gestacionais adversos em mulheres, como hipertensão gestacional, pré-eclâmpsia, parto prematuro, placenta prévia, descolamento de placenta, necessidade de cesariana e natimortos. Gebremedhin et al. (2023) e Velez et al. (2022) também destacam a associação de aumento no risco de distúrbios 40 hipertensivos da gravidez, parto prematuro, necessidade de cesariana, indução do trabalho de parto e natimortos em mulheres com endometriose. Alguns destes desfechos gestacionais adversos podem favorecer a restrição de crescimento intrauterino, cursando com o nascimento de recém -nascidos pequenos para a idade gestacional. Crianças nascidas pequen as para idade gestacional (PIG) (Hokken-Koelega et al., 2023) possuem maior risco de morbidade perinatal, estatura baixa persistente e alterações metabólicas (Clayton et al, 2007). Além disto, o baixo peso ao nascer é considerado uma causa importante de morbidade e mortalidade na primeira infância e na infância. (Clayton et al, 2007). Grande parte dos recém-nascidos PIG a termo alcança crescimento compensatório até 2 anos de vida, principalmente no que diz respeito ao peso, que supera o aumento de comprimento (Huang et al., 2018). Questionamos, assim, se o grupo E2 poderia ser utilizado como modelo translacional para investigar o papel da endometriose em alguns dos desfechos gestacionais adversos observados em humanos, assim como nos mecanismos associados, o que precisa ser mais bem estudado em estudos futuros. As taxas de retorno ao acasalamento, perda gestacional, natimortos e canibalismo não foram estatisticamente diferentes entre os grupos C, E1 e E2 . Todavia, é interessante notar que os grupos E1 e E2 apresentaram uma taxa de natimortos clinicamente mais elevada (42,1 e 40%, respectivamente) do que o grupo C (23,5%) e o grupo E2 apresentou taxa de canibalismo (20%) maior quando comparado aos outros grupos (8,8 e 5,3%, respectivamente nos grupos C e E1). É possível que, se esses parâmetros forem mantidos, em estudos com maiores casuísticas, evidenciarão impacto adverso em ambas as variáveis, sendo mais um desfecho gestacional negativo relacionado ao modelo murino de endometriose. Enquanto tais estudos não são desenvolvidos, nossa hipótese para explicar a aparente maior fragilidade dos fetos pertencentes aos grupos experimentais é um possível estresse sistêmico que os implantes endometriais trariam à fêmea. O estresse de variadas origens vem sendo, há muito tempo, apontado como causa de fêmeas de camundongos negligenciarem, matarem e/ou comerem suas ninhadas (Poley, 1974; Elwood, 1991). O canibalismo parece ser incomum e, quando ocorre, geralmente é observado nos dois primeiros dias de vida dos filhotes, acon tecendo principalmente com filhotes já mortos, para manutenção do ninho limpo. O infanticídio parece ser raro e est á 41 associado a fatores estressantes para a mãe (Neto et al., 2015; Ko et al., 2017; Brajon et al., 2021). Neste contexto, Li et al., 2018 desenvolveram endometriose experimental em modelo murino, por meio de procedimento cirúrgico semelhante ao realizado em nosso trabalho, e evidenciaram que as fêmeas pertencentes ao grupo endometriose parecem possuir maior ansiedade, menor atividade locomotora e maior sensibilidade a dor quando comparadas às fêmeas do grupo sham. Todos esses sinais podem ser relacionados a fatores estressantes para a mãe, o que nos faz refletir sobre a possiblidade do estresse relacionado à dor no local dos implantes ectópicos ter impactado diretamente nos possíveis achados de negligência e canibalismo por parte das fêmeas pertencentes ao grupo E2. Larauche et al., 2012 sugerem que a dor crônica, o estresse e funções executivas compartilham circuitos neurais centrais comuns em roedores, sendo que alterações estruturais e funcionais que ocorrem no cérebro induzidas pela dor e pelo estresse crônicos podem resultar até mesmo em prejuízo no desempenho cognitivo. Sugerimos que esses fatores podem estar relacionados a negligência das ninhadas por parte das mães, mas destacamos a importância de estudos com maior casuística para comprovação. 6. CONCLUSÃO Este trabalho teve como objetivos investigar se o transplante de 1 e 2 fragmentos de tecido endometrial em cada lado da parede peritoneal de camundongos fêmeas promoveria endometriose experimental e redução da fertilidade natural e se o transplante também promoveria comprometimento dos resultados gestacionais e perinatais da prole até o desmame, comparando a duração da prenhez, o tamanho da ninhada, o peso dos filhotes ao nascer e ao desmame, natimortos, canibalismo por parte da mãe, perdas gestacionais e retorno ao acasalamento entre animais com e sem endometriose experimental. A endometriose experimental com sutura de fragmentos de tecido endometrial no peritônio de animais não comprometeu a fertilidade das fêmeas após 4 semanas do procedimento de indução de endometriose ao compararmos os grupos experimentais ao grupo controle, sugerindo que esse não é um modelo translacional adequado para o estudo da infertilidade relacionada a endometriose. 42 Até o momento, nosso estudo parece ser o primeiro que avalia desfechos gestacionais e perinatais até 30 dias de vida das ninhadas provenientes de modelo animal de endometriose. Evidenciamos que fêmeas transplantadas com 2 fragmentos de endométrio ectópico tiveram ninhadas com maior peso ao nascer e ao desmame e maior número de filhotes vivos ao desmame. Por outro lado, fêmeas transplantadas com 4 fragmentos de endométrio ectópico tiveram ninhadas com meno r peso ao nascer e menor número de filhotes vivos ao desmame. Esses dados demonstram que as ninhadas provenientes de fêmeas com maior número de fragmentos uterinos transplantados podem ter desenvolvimento prejudicado durante a gestação, nascendo com menor peso e apresentando maior mortalidade perinatal. Todavia, estudos subsequentes, com casuísticas adequadas para analisar os desfechos citados , devem ser desenvolvidos para melhor avaliação se esse pode ser um modelo adequado para investigar o impacto da end ometriose experimental em resultados gestacionais e perinatais. Também consideramos importante refletir sobre os desafios de encontrar um modelo translacional adequado para estudar o potencial impacto da endometriose na fertilidade e desfechos gestacionais e perinatais. O fato de a endometriose espontânea não ocorrer em camundongos e as diferenças entre a fisiologia de humanos e camundongos nos levam a reconhecer que precisamos aprofundar os estudos acerca de como a doença se comporta no modelo murino antes de afirmarmos que esse possa ser um modelo adequado para estudarmos estes desfechos relacionados a endometriose. 43 REFERÊNCIAS AGARWAL, Ashok et al. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review. Reproductive biology and endocrinology, v. 10, p. 1-31, 2012. AGUILAR, Hector N.; MITCHELL, B. F. Physiological pathways and molecular mechanisms regulating uterine contractility. Human reproduction update, v. 16, n. 6, p. 725-744, 2010. ANDRADE, Aline Zyman de et al. Se rum markers of oxidative stress in infertile women with endometriosis. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia , v. 32, p. 279-285, 2010. ANDRADE, Antenor; PINTO, Sergio Correia; OLIVEIRA, Rosilene Santos de. Animais de laboratório: criação e experimentação. 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