The features of the expression of sex steroids hormone receptors, pro-inflammatory markers and cyclin-dependent kinase inhibitor protein p16ink4a in endometrium at external genital endometriosis

Full Text Введение Генитальный эндометриоз представляет в настоящее время значимую медико-социальную проблему, это в большой степени определяется высокой частотой нарушения репродуктивной функции при данном заболевании [1-5]. Считается, что одной из причин бесплодия у пациенток с генитальным эндометриозом являются морфофункциональные изменения эндометрия, в том числе нарушение экспрессии рецепторов к половым стероидным гормонам (прогестерону и эстрогенам) [6, 7]. Нарушение репродуктивной функции у пациенток с генитальным эндометриозом III, IV степени обосновано сложными патогенетическими механизмами и структурно-функциональными повреждениями органов малого таза, тогда как до сих пор неясным остается вопрос нарушения репродуктивной функции у пациенток с незначительными (I, II ст.) проявлениями генитального эндометриоза [8]. Можно полагать, что одной из причин дисфункции эндометрия при эндометриозе является воспалительный процесс в эндометрии, в том числе ассоциированный с вирусным поражением. Результаты проведенных нами исследований показали, что у пациенток с бесплодием, ассоциированным с воспалительными заболеваниями органов малого таза, отмечалась высокая частота хронического эндометрита вирусной этиологии, который приводил к нарушению соотношения экспрессии рецепторов стероидных гормонов [9]. Исследование Е.Ф. Гавриловой (2009) показало значение персистирующих вирусов группы герпеса (ЦМВ, ВПГ 1 и 2-го типов, ВЭБ) в патогенезе аденомиоза и эффективность применения противовирусной терапии в увеличении безрецидивного периода [10]. В такой ситуации можно предположить роль вируса папилломы человека и вирусов простого герпеса в этиологии и патогенезе эндометриоза: блокировка генома и дезорганизация нормального клеточного цикла эпителиальной клетки. Одним из белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, является белок p16ink4a, представляющий собой ингибитор циклинзависимых киназ. Белок участвует в опосредованном, через белок ретинобластомы (pRB), контроле клеточного цикла и переходе клетки из фазы G1 в фазу S. Наличие экспрессии данного белка в эндометрии у пациенток с нарушением репродуктивной функции и хроническим эндометритом, возможно, является не только следствием вирусного инфицирования (вирусом папилломы человека), но и инактивации рецепторов прогестерона в клетках эндометрия при хроническом эндометрите. Это обусловлено тем, что «потеря» или снижение активности рецепторов к прогестерону может привести к гиперэкспрессии циклина D1, который, в свою очередь, стимулирует продукцию р16ink4a . Следует отметить, что в клинической практике оценка экспрессии ингибитора циклинзависимой киназы p16ink4a является диагностическим критерием верификации цервикальных интраэпителиальных неоплазий шейки матки и дифференциально-диагностическим критерием между эпителиальными и серозными карциномами органов и систем. Существенное значение в особенности экспрессии р16ink4a имеет наличие или отсутствие зависимости опухолевых клеток от стероидных гормонов [11]. В связи с этим представляется перспективным оценка экспрессии рецепторов ER, PgR, провоспалительных маркеров и экспрессии ингибитора циклинзависимой киназы p16ink4a у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ. Материалы и методы Критериями включения в основную группу являлись: возраст 19-35 лет включительно; бесплодие; наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) I-II степени тяжести (согласно классификации Американского общества фертильности (R-AFS), 1996), подтвержденный при лапароскопии, отсутствие гормонального лечения в течение 6 месяцев, предшествующих настоящему исследованию. Критериями включения в контрольную группу являлись: возраст 19-35 лет; отсутствие признаков генитального эндометриоза и воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ) при эндоскопическом обследовании; отсутствие гормонального лечения в течение 6 месяцев, предшествующих настоящему исследованию; наличие ранней и средней фазы секреции при гистологическом исследовании биоптата эндометрия на 19-24 д. м. ц.; отсутствие гистологических признаков хронического эндометрита; наступление беременности, закончившейся срочными родами в течение одного года после включения в исследование. Критериями исключения из исследования для пациенток обеих групп явились: аденомиоз, миома матки, гипергонадотропные варианты недостаточности яичников, синдром поликистозных яичников, ожирение 2-3-й степени тяжести, гиперпролактинемическая недостаточность яичников, сахарный диабет. В соответствии с критериями включения и исключения из исследования в основную группу были включены 73 пациентки, в группу сравнения - 60. Биопсия эндометрия осуществлялась всем пациенткам на 19-24-й день менструального цикла. Гистологическое исследование эндометрия проводили по стандартной методике. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. При световой микроскопии оценивалось соответствие строения эндометрия дню менструального цикла, состояние желез, стромы и сосудистого компонента эндометрия с наличием или отсутствием гистологических признаков воспалительных и патологических изменений. Иммуногистохимический метод исследования включал: количественную и качественную оценку экспрессии рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PgR) в биоптатах эндометрия с использованием антител к рецепторам ER ά (альфа) (клон 1D5) и рецепторам PgR (клон PgR 636) в стандартном разведении 1 : 50 производства (Dako) Cytomation. Оценку проводили полуколичественным методом Histochemical Score = ∑ P (i) х I, где i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3; P (i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Максимальное значение гистосчета должно соответствовать 300. Для верификации хронического эндометрита использовали антитела СD8+ (клон СD 8/144B); СD20+ (клон L26); СD4+ (клон 4В12) и СD138+ (клон М115) в стандартном разведении 1 : 50 (Dako) Cytomation. Критериями постановки диагноза хронического эндометрита являлись: увеличение количества цитотоксических T-лимфоцитов, В-лимфоцитов и плазмоцитов в 2 и более раза, наличие плазмоцитов. Для количественной и качественной оценки экспрессии ингибитора циклинзависимой киназы p16ink4a использовали набор CINtec p16ink4a Histology Kit (Roche, Germany). Качественную оценку экспрессии данного маркера подтвердили с помощью системы компьютерного анализа изображений «Морфология 5.0» (ВидеоТест, Россия). Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол. Методика для визуализации иммуногистохимической реакции выполнялась по схеме, предложенной С.В. Петровым и Н.Т. Райхлиным (2004). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартных пакетов статистического анализа (STATGRAPHICS v.6.0). Методы дескpиптивной статистики включали в себя оценку сpеднего аpифметического (M), сpедней ошибки сpеднего значения (m). Для оценки межгрупповых различий применяли t-критерий Стьюдента и метод альтернативного варьирования Ойвина с соблюдением рекомендаций для медицинских и биологических исследований. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали pавным 0,05. Случаи, когда значения вероятности р находились в диапазоне от 0,05 до 0,10, расценивали как «наличие тенденции». Результаты исследования Средний возраст пациенток обеих групп был сопоставим и составил 30,5 ± 0,36 и 30,7 ± 0,5 года соответственно. Возраст наступления менархе был 13,6 ± 0,18 года в основной группе и 12,8 ± 0,58 года в группе сравнения. Длительность менструального цикла в обеих группах составила от 28 до 35 дней. Результаты анамнестического исследования показали, что наличие вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов отмечалось у 23 пациенток (31,5 %) основной группы и у 8 (13,3 %) пациенток в группе сравнения. При микробиологическом исследовании в соскобе из цервикального канала вирус папилломы человека высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33-й типы) был выявлен в основной группе в 31 случае (42,5 %) и в 3 случаях в группе сравнения. У пациенток основной группы сочетание вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов и вируса папилломы человека отмечалось у 12 пациенток, что составило 16,4 %. Гистологическое исследование биоптатов эндометрия у пациенток с НГЭ выявило соответствие эндометрия ранней стадии фазы секреции в 15 случаях (20,5 %) и средней стадии фазы секреции в 31 случае (42,5 %) (рис. 1). Следует отметить, что в 8 случаях (10,9 %) эндометрий соответствовал поздней стадии фазы пролиферации. В 14 случаях (19,2 %) отмечалось отставание в развитии структур эндометрия. Гиперплазия эндометрия встречалась в 17 (23,3 %) биоптатах. В группе сравнения в 15 случаях (25,0 %) эндометрий соответствовал ранней стадии фазы секреции и в 45 случаях (75,0 %) - средней стадии фазы секреции. Гистологические маркеры хронического эндометрита (диффузная и очаговая мононуклеарная инфильтрация, фиброз стромы и нарушение формирования клубков спиральных артерий) были выявлены в 32 случаях (43,8 %) биоптатов эндометрия от пациенток с НГЭ и лишь в 2 случаях (3,3 %) в группе сравнения. Гистологическое исследование биоптатов эндометрия от пациенток с НГЭ в 25 случаях (53,4 %) выявило нарушение структуры эндометрия, характеризующееся гиперплазией эндометрия, отставанием в развитии стромального компонента и несоответствием дню менструального цикла. Иммуногистохимическое исследование с оценкой экспрессии рецепторов ER и PgR в поздней стадии фазы пролиферации и при гиперплазии эндометрии имеет свои особенности. В связи с этим данные гистологического исследования биоптатов эндометрия с диагностированной поздней стадией фазы пролиферации и гиперплазией эндометрия были исключены из последующего анализа результатов иммуногистохимического исследования. Оценку экспрессии рецепторов ER и PgR согласно установленным критериям проводили в раннюю и среднюю стадии фазы секреции (табл. 1). Полученные данные демонстрируют достоверное снижение экспрессии рецепторов PgR в строме эндометрия у пациенток с наружным генитальным эндометриозом в раннюю и среднюю стадию фазы секреции (**p < 0,01; ***p < 0,001). Экспрессия рецепторов ER в эндометрии от пациенток основной группы в раннюю стадию фазы секреции характеризуется достоверным повышением в железах эндометрия и достоверным снижением экспрессии данного маркера в железах и строме эндометрия в среднюю стадию фазы секреции (*p < 0,05). В группе сравнения экспрессия рецепторов ER и PgR в структурах эндометрия соответствовала морфологической картине. Результаты комплексного гистологического и иммуногистохимического исследования биоптатов эндометрия выявили хронический эндометрит у 80,0 % (60) пациенток основной группы, при этом у 20,0 % (15 пациенток) признаки хронического эндометрита отсутствовали. В структуре хронического эндометрита преобладала умеренная степень выраженности воспалительного процесса у 42,7 % (32 пациентки) с 3-4-кратным повышением цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), В-лимфоцитов (CD20+) и наличием плазмоцитов (CD138+). Слабовыраженный хронический эндометрит был диагностирован у 21,3 % (16 пациенток) и характеризовался двукратным повышением числа воспалительных клеток. Выраженный хронический воспалительный процесс характеризовался пятикратными и более повышением количества иммунопозитивных клеток и был выявлен у 16,0 % (12 пациенток). В группе сравнения только у 5 % (3 пациентки) отмечались признаки слабовыраженного хронического эндометрита. Результаты оценки экспрессии ингибитора циклинзависимых киназ p16ink4a показали, что у пациенток с наружным генитальным эндометриозом экспрессия белка p16ink4a была определена во всех случаях. При этом у 73,3 % пациенток положительная экспрессия отмечалась в железах и поверхностном эпителии, у 26,7 % - как в железах, так и в стромальном компоненте. В группе сравнения только у 3 пациенток (5,0 %) отмечалась слабоположительная экспрессия белка p16ink4a в поверхностном эпителии эндометрия. Обсуждение На сегодняшний день не вызывает сомнений роль гиперэстрогенемии в развитии эндометриоза, которая в свою очередь стимулирует пролиферативный процесс в эндометриоидных гетеротопиях на фоне измененного рецепторного статуса эндометрия [12-15]. По мнению M. Karita и др. (2011), в патогенезе бесплодия, ассоциированного с генитальным эндометриозом, основная роль принадлежит повышению экспрессии рецепторов ER и PgR в клетках гранулезы созревающих фолликулов в яичниках и формированию тем самым недостаточности их функции [16]. Эти данные подтверждаются достоверным снижением экспрессии рецепторов PgR в строме эндометрия у пациенток с наружным генитальным эндометриозом в раннюю и среднюю стадию фазы секреции, а также нарушением соотношения экспрессии рецепторов эстрогена в секреторной фазе цикла. Во вторую фазу цикла одной из основных функций прогестерона является стимуляция выработки Т-лимфоцитами прогестерон-индуцирующего блокирующего фактора (PIBF), участвующего в регуляции клеточного и гуморального иммунитета в эндометрии [17]. Иммунологические факторы и хронические эстрогензависимые воспалительные реакции при эндометриозе констатируются рядом авторов. В то же время иммунный статус эндометрия регулируется стероидными гормонами и клеточным иммунитетом. В очагах эндометриоидных гетеротопий и в эндометрии под влиянием пусковых механизмов возникает каскад иммунных реакций с высвобождением значительного числа медиаторов воспаления, формируя сначала первичный, а затем и вторичный воспалительный ответ, который поддерживает персистенцию патологического процесса в присутствии постоянной эстроген-зависимой воспалительной реакции [18, 19]. В нашем исследовании установлено, что у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, в 80,0 % случаев диагностирован хронический эндометрит разной степени выраженности. Следует отметить, что при хроническом эндометрите во всех исследуемых биоптатах эндометрия преобладало повышение числа цитотоксических Т-лимфоцитов над клетками других популяций. По мнению ряда авторов, клетки эктопированного эндометрия выделяют биологические факторы, подавляющие клеточный иммунитет, дезактивация которого приводит к нарушению соотношения специфических клеток, в частности NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов. Повышение активности этих клеток стимулирует выработку простагландинов и интерлейкинов макрофагами с последующим повышением пролиферативной активности эндометрия в очагах гетеротопий и увеличением синтеза эстрогенов, замыкая порочный круг [20-22]. Цитотоксические Т-лимфоциты уничтожают клетки, зараженные внутриклеточными инфекциями, к которым относятся и вирусы, поэтому теория о значении вирусных агентов в этиопатогенезе НГЭ все более приобретает четкие очертания. Положительная экспрессия p16ink4a у пациенток с наружным генитальным эндометриозом, возможно, является следствием вирусного инфицирования (вирусом папилломы человека и вирусами простого герпеса) с последующим развитием хронического эндометрита и инактивацией рецепторов прогестерона в клетках эндометрия. Это обусловлено тем, что «потеря» или снижение активности рецепторов к прогестерону может привести к гиперэкспрессии циклина D1, который, в свою очередь, стимулирует продукцию р16ink4a. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой частоте нарушения процесса секреторной трансформации эутопического эндометрия у больных с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом. Высокая частота встречаемости хронического эндометрита с нарушением чувствительности тканей эндометрия к половым стероидным гормонам, в частности к прогестерону, может явиться главной детерминантой бесплодия у пациенток данной группы. Учитывая высокую встречаемость вирусов простого герпеса и вируса папилломы человека (высокого онкогенного риска) в соскобе цервикального канала, а также положительную экспрессию p16ink4a в биоптатах эндометрия у пациенток с наружным генитальным эндометриозом, можно полагать высокую значимость роли данных вирусов в этиопатогенетических механизмах развития эндометриоидной болезни.About the authors Edvard K Aylamazyan Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott Email: [email protected] the chief, academician, professor Gulrukhsor Kh Tolibova Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott Email: [email protected] PhD, MD, Senior Scientist. Laboratory of Cell Biology, Department of Pathomorphology Tatyana G Tral Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott Email: [email protected] PhD, MD, Pathologist. Head of Pathologist Laboratory, Department of Pathomorphology Igor U Kogan Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott Email: [email protected] PhD, Scientific secretary Igor M Kvetnoy Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott Email: [email protected] MD, professor. The head of a Department patomorphology

- Адамян Л.В., Кулаков В.И. Эндометриозы: руководство для врачей. - М.: Медицина, 2006. [Adamyan LV, Kulakov VI. Endometriozy: Rukovodstvo dlya vrachey. Moscow: Meditsina; 2006. (In Russ.)] - Айламазян Э.К., ред. Гинекология от пубертата до постменопаузы: практическое руководство для врачей. - М.: МЕДпресс-информ, 2007. [Aylamazyan EK, red. Ginekologiya ot pubertata do postmenopauzy. Prakticheskoe rukovodstvo dlya vrachey. Moscow: MEDpress-inform; 2007. (In Russ.)] - Ярмолинская М.И., Тарасова М.А., Сельков С.А., и др. Наружный генитальный эндометриоз: пособие для врачей. - СПб., 2010. [Yarmolinskaya MI, Tarasova MA, Sel’kov SA, et al. Naruzhnyy genital’nyy endometrioz. Posobie dlya vrachey. Saint Petersburg; 2010. (In Russ.)] - Ярмолинская М.И., Цицкарава Д.З., Сельков С.А. Цитокины как маркеры для неинвазивной диагностики генитального эндометриоза // Журнал акушерства и женских болезней. - 2015. - Т. 64. - № 6. - С. 6-16. [Yarmolinskaya MI, Tsitskarava DZ, Sel’kov SA. Cytokins as the markers for non-invasive diagnosis of pelvic endometriosis. Journal of Obstetrics and Women’s Diseases. 2015;64(6):6-16. (In Russ.)] - McLaren JF. Infertility and management of unexplained infertility. Obstet Gynecol Clin North Am. 2012;39:4453-463. - Bulun SE. Endometriosis. N Engl J Med. 2009;360: 268-79. - Giudice LC, Evers JLH, Healy DL. Endometriosis: Science and Practice. N.Y.: Wiley-Blackwell; 2012. - Марченко Л.A. Преимущества лечения эндометриоза с использованием непрерывного режима оральных контрацептивов // Консилиум Медикум. - 2007. - Т. 9. - № 6. - С. 17-21. [Marchenko LA. Preimushchestva lecheniya endometrioza s ispol’zovaniem nepreryvnogo rezhima oral’nykh kontratseptivov. Konsilium Medikum. 2007;9(6):17-21. (In Russ.)] - Айламазян Э.К., Толибова Г.Х., Траль Т.Г., и др. Клинико-морфологические детерминанты бесплодия, ассоциированного с воспалительными заболеваниями органов малого таза // Журнал акушерства и женских болезней. - 2015. - Т. 67. - № 6. - С. 17-25 [Aylamazyan EK, Tolibova GKh, Tral’ TG, et al. Clinical and morphological determinants of infertility associated with inflammatory diseases of the pelvic organs. Journal of Obstetrics and Women’s Diseases. 2015;67(6):17-25. (In Russ.)] - Гаврилова Е.Ф. Лечение и мониторинг больных генитальным эндометриозом с учетом клинико-иммунологических аспектов // Гинекология. - 2009. - № 2. - С. 29-7. [Gavrilova EF. Lechenie i monitoring bol’nykh genital’nym endometriozom s uchetom kliniko-immunologicheskikh aspektov. Ginekologiya. 2009;2:29-7. (In Russ.)] - Должиков А.А., Быков П.М., Нагорный А.В., и др. Ингибитор циклинзависимых киназ белок p16ink4a в гладкомышечных опухолях матки: диагностическое значение и молекулярно-генетические основы изменений экспрессии // Вестник новых медицинских технологий. - 2012. - Т. 19. - № 2. - С. 125-27. [Dolzhikov AA, Bykov PM, Nagornyy AV, et al. Ingibitor tsiklinzavisimykh kinaz belok p16ink4a v gladkomyshechnykh opukholyakh matki: diagnosticheskoe znachenie i molekulyarno-geneticheskie osnovy izmeneniy ekspressii. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2012;19(2):125-27. (In Russ.)] - Денисова В.М., Потин В.В., Ярмолинская М.И., Тимофеева Е.М. Активность овариальной ароматазы при эндометриозе // Журнал акушерства и женских болезней. - 2013. - Т. 62. - № 2. - С. 17-22. [Denisova VM, Potin VV, Yarmolinskaya MI, Timofeeva EM. Ovarian aromatase activity in endometriosis. Journal of Obstetrics and Women’s Diseases. 2013;62(2):17-22. (In Russ.)] - Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: современные аспекты. - М.: Медицина, 2008. [Ishchenko AI, Kudrina EA. Endometrioz: sovremennye aspekty. Moscow: Meditsina; 2008. (In Russ.)] - Christofolini DM, Vilarino FL, Mafra FA, et al. Combination of polymorphisms in luteinizing hormone β, estrogen receptor β and progesterone receptor and susceptibility to infertility and endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2011;158(2):260-64. - Mehasseb MK, Panchal R, Taylor AH, et al. Estrogen and progesterone receptor isoform distribution through the menstrual cycle in uteri with and without adenomyosis. Fertil Steril. 2011;95(7):2228-35. - Karita M, Yamashita Y, Hayashi A, et al. Does advanced-stage endometriosis affect the gene expression of estrogen andprogesterone receptors in granulosa cells? Fertil Steril. 2011;95(3):889-94. - Cohen RA, Check JH, Dougherty MP. Evidence that exposure to progesterone alone is a sufficient stimulus to cause a precipitous rise in the immunomodulatory protein the progesterone induced blocking factor (PIBF). J Assist Reprod Genet. 2016 Feb;33(2):221-9. doi: 10.1007/s10815-015-0619-7. Epub 2015. - Сельков С.А., Солодовникова Н.Г., Павлов О.В., Ниаури Д.А. Особенности локальной продукции интерлейкинов и ростовых факторов при наружном генитальном эндометриозе // Бюл. экспер. биол. - 2005. - Т. 139. - № 4. - С. 439-42. [Sel’kov SA, Solodovnikova NG, Pavlov OV, Niauri DA. Osobennosti lokal’noy produktsii interleykinov i rostovykh faktorov pri naruzhnom genital’nom endometrioze. Byul. eksper. biol. 2005;139(4):439-42. (In Russ.)] - Ярмолинская М.И., Денисова В.М. Иммуномодулирующая терапия генитального эндометриоза: реалии и перспективы применения // Фарматека. - 2015. - № 2. - С. 6-15. [Yarmolinskaya MI, Denisova VM. Immunomoduliruyushchaya terapiya genital’nogo endometrioza: realii i perspektivy primeneniya. Farmateka. 2015;2:6-15. (In Russ.)] - Рабсон А., Ройт А., Делвз П. Основы медицинской иммунологии. - М.: Изд-во «Мир», 2006. [Rabson A, Royt A, Delvz P. Osnovy meditsinskoy immunologii. Moscow: Izd-vo “Mir”; 2006. (In Russ.)] - Хаитов Р.М. Иммунология. Структура и функции иммунной системы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. [Khaitov RM. Immunologiya. Struktura i funktsii immunnoy sistemy. Moscow: GEOTAR-Media; 2013. (In Russ.)] - Kitawaki J. Adenomyosis: the pathophusiologu of an oestrogen-depent disease. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2006;20(4):493-02.