The Pathogenic Role of Vitamin D in Pelvic Pain Associated with External Genital Endometriosis

One hundred and fifty women participated in this study. Patients with EGE (n = 120) were divided into two groups, each of which had two subgroups (A and B). Groups I and II consisted of women aged 20 to 41 (mean age 29.1 ± 3.3). Group I (n = 60) was The Pathogenic Role of Vitamin D in Pelvic Pain Associated with External Genital Endometriosis M.R. Orazov 1 , M.B. Khamoshina 1 , E.N. Nosenko 2 , A.O. Dukhin 1 , G.A. Demyashkin 3 , L.K. Barsegyan 1 , Yu.S. Chitanava 1 , L.R. Toktar 1 1 Peoples’ Friendship University of Russia; 6 Miklouho-Maclay St., Moscow, Russian Federation 117198 2 I.I. Mechnikov Odessa National Medical University, Ministry of Health of Ukraine; 2 Valikhovsky Pereulok, Odessa, Ukraine 65082 3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Russian Ministry of Health; 8/2 Trubetskaya St., Moscow, Russian Federation 119992 ГИНЕКОЛОГИЯ Гинекология № 7 (162), 2019 | | 37 Духин Армен Олегович — д. м. н., профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института ФГ АОУ ВО РУДН. 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. eLIBRARY.RU SPIN: 8852-3114. E-mail: [email protected] Носенко Елена Николаевна — профессор кафедры акушерства и гинекологии № 1 ОНМедУ Минздрава Украины, д. м. н., профессор. 65082, г. Одесса, Валиховский пер., д. 2. eLIBRARY.RU SPIN: 7601-2436. E-mail: [email protected] Оразов Мекан Рахимбердыевич — д. м. н., профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института ФГ АОУ ВО РУДН. 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. eLIBRARY.RU SPIN: 1006-8202. E-mail: [email protected] Токтар Лилия Равильевна — к. м. н., доцент кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института ФГ АОУ ВО РУДН. 117193, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. E-mail: [email protected] Хамошина Марина Борисовна — профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института ФГ АОУ ВО РУДН, д. м. н., профессор. 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. eLIBRARY.RU SPIN: 6790-4499. ORCID: http://orcid.org/0000- 0003-1940-4534. E-mail: [email protected] Читанава Юрий Сергеевич — аспирант кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Медицинского института ФГ АОУ ВО РУДН. 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. E-mail: [email protected] (Окончание. начало см. на с. 36.) П ричины генитального эндометриоза до сих пор оста- ются загадкой, разгадать которую пытаются ведущие ученые всего мира. Одной из наиболее часто встречаю- щихся форм генитального эндометриоза является наружный генитальный эндометриоз (НГЭ), разнообразные варианты которого чаще всего проявляются тазовой болью (ТБ). Несмотря на многочисленные исследования и полутора- вековое изучение эндометриоза, причины развития заболе- вания и связанной с ним патологической болевой импуль- сации до сих пор непонятны, и ни одна из предложенных теорий не объясняет происхождение эндометриоза [1, 2]. Вместе с тем в зарубежной и отечественной литературе появляется все больше данных о влиянии концентрации витамина D на тяжесть ТБ, ассоциированной с НГЭ [3, 4]. Выявлено, что экспрессия VDR в клетках эндометрия подвержена циклическим изменениям как в норме, так и при эндометриозе. В клеточном метаболизме 25(ОН)D также про - исходят пролиферативно-зависимые сдвиги — изменение экспрессии ключевых ферментов метаболического пути вита- мина D: 1- α-гидроксилазы ( 1 α-OH ), обеспечивающей синтез активной формы витамина D (1,25(OH) 2 D 3 ), и 24-гидроксила - зы ( 24-ОН ), обусловливающей ее инактивацию [5]. Изучение роли концентрации витамина D в патогенезе НГЭ и ассоциированной с ним ТБ представляет несомненный практический интерес, что и определило выбор цели насто- ящего исследования. Цель исследования: расширить представления о патоге- незе ТБ при НГЭ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Данное когортное проспективное сравнительное исследо- вание проведено в период с 01.09.2016 г. по 01.07.2017 г. на базе кафедры акушерства и гинекологии с курсом пери- натологии (НУЗ «Центральная клиническая больница № 6» ОАО «РЖД») медицинского факультета Медицинского инсти- тута РУДН в рамках основной научно-исследовательской деятельности — «Репродуктивное здоровье населения Московского мегаполиса и пути его улучшения в современ- ных экологических и социально-экономических условиях» (номер государственной регистрации — 01.9.70 007346, шифр темы — 317712). В исследовании приняли участие 150 женщин, давших добровольное информированное согласие на включение их в изучаемую группу, забор биологического материала, изу- чение клинических и лабораторных показателей, статисти- ческую обработку и публикацию полученных результатов. Пациенток с НГЭ (n = 120) разделили на 2 группы с 2 под- группами (А и B) в каждой. Участницы групп I и II были в воз- расте от 20 лет до 41 года. I группу (n = 60) составили паци - ентки с НГЭ, осложненным ТБ: IA (n = 30) — c дефицитом 25(ОН)D, IB (n = 30) — без него; II группа (n = 60) — паци- ентки с НГЭ без ТБ: IIA (n = 30) — c дефицитом 25(ОН)D, comprised of patients with EGE complicated by PP: 30 women with 25(ОН)D deficiency in subgroup IA and 30 women without this deficiency in subgroup IB. Group II (n = 60) was made up of patients with EGE but without PP: 30 women with 25(ОН)D deficiency in subgroup IIA and 30 women without this deficiency in subgroup IIB. The control group consisted of 30 relatively healthy women without either 25(ОН)D deficiency, verified EGE, or PP, who had been referred for diagnostic laparoscopy to evaluate unexplained infertility. Baseline total serum 25(ОН)D levels were measured by mass spectrometry in all participants. Other study examinations included morphology and immunohistochemistry with digital morphometry. Study Results: The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was significantly higher in biopsy samples from patients with PP and 25(ОН)D deficiency than in those from women with normal 25(ОН)D levels (77.4 ± 3.5% vs. 56.3 ± 2.8%; р < 0.05), which is a sign of increased angiogenesis. The expression of nerve growth factor (NGF) in both eutopic and ectopic endometrium was also significantly higher in subgroup IA than in subgroup IB (63.7 ± 2.1% and 47.3 ± 3.2% vs. 45.8 ± 1.9% and 36.1 ± 2.8%, respectively), which is a sign of enhanced neurogenesis. In women with PP and low 25(ОН)D levels, the rate of apoptosis (accompanied by abnormal expression of the vitamin D receptor [VDR]) was significantly lower (71.1 ± 3.7% vs. 31.5 ± 2.1%, p < 0.05). This conclusion was based on a lower expression of CASP3 in women with PP associated with 25(ОН)D deficiency, compared with those whose 25(ОН)D levels were normal (26.1 ± 1.5% vs. 28.4 ± 1.2%, respectively).

These findings suggest that in women with 25(ОН)D deficiency the proliferation/apoptosis balance in eutopic and ectopic endometrial cells shifts toward reduced apoptotic activity. The study also revealed impairment of 25(ОН)D metabolism in women with low levels of this vitamin. The same was true for the expression of VDR, a finding that supports the results of staining for VDR in the endometrium and endometrioma capsules of patients with EGE. This relationship underlies the key pathogenic mechanism involved in the development of PP in women with EGE, in whom the antiproliferative effects of vitamin D are reduced. These changes are accompanied by increased local neoangiogenesis and nerve fiber growth and a shift in the proliferation/apoptosis pattern toward inhibited apoptosis and increased proliferation. K eywords: vitamin D, pathogenesis of pelvic pain, external genital endometriosis. The authors declare that they do not have any conflict of interests. For reference: Orazov M.R., Khamoshina M.B., Nosenko E.N., Dukhin A.O., Demyashkin G.A., Barsegyan L.K., Chitanava Yu.S., T oktar L.R. The Pathogenic Role of Vitamin D in Pelvic Pain Associated with External Genital Endometriosis. Doctor.Ru. 2019; 7(162): 36–39. DOI: 10.31550/1727-2378-2019- 162-7-36-39 GYNECOLOGY | | Gynecology No. 7 (162), 2019 38 IIB (n = 30) — без него. В группу контроля вошли 30 относи - тельно здоровых женщин в возрасте от 22 до 39 лет, направ - ленных на диагностическую лапароскопию по поводу бес - плодия неясного генеза (МКБ-10: N97.9. Женское бесплодие неуточненное), без дефицита 25(ОН)D и диагностированного НГЭ, без ТБ. Средний возраст женщин в основной группе составил 29,3 ± 3,5 года, в группе контроля — 28,8 ± 4,9 года (p = 0,241). Критерии включения в I и II группы: лапароскопически и морфологически подтвержденный наружный генитальный эндометриоз (N80.1. Эндометриоз яичников), синдром ТБ (N94.8. Другие уточненные состояния, связанные с женски - ми половыми органами и менструальным циклом), репродук - тивный возраст. Критерии исключения: наличие сопутствующих гинеколо- гических заболеваний воспалительной и невоспалительной этиологии, сопровождающихся синдромом ТБ: варикозной болезни, системных заболеваний, спаечной болезни, интер- стициального цистита, миофасциального болевого синдро- ма, синдрома раздраженного кишечника, ТБ, обусловленной неврологическими расстройствами, психогенной боли. У всех участниц исходно определяли уровень общего 25(ОН)D в сыворотке крови методом масс-cпектрометрии, адаптированным к клинической практике согласно между- народным стандартам (Vitamin D External Quality Assessment Scheme, National Institute of Standards and T echnology), по аттестованной в соответствии с ГОСТ Р 8.563-2009 методике [6]. Исследование выполняли в лаборатории ООО «Клиника новых медицинский технологий «АрхиМед» (заведующий лабораторией — к. б. н. Нижник А.Н.). Дефицит витамина D диагностировали при концентрации 25-гидроксивитамина-D3 < 20 нг/мл (< 50 нмоль/л), недоста - точность — от 20 до 30 нг/мл (от 50 до 75 нмоль/л), а нор- мальный уровень — 31–100 нг/мл (76–250 нмоль/л). Биоптаты эндометрия, полученные в ходе пайпель-биоп- сии, а также стенки капсул эндометриоидных кист яични - ка фиксировали в забуференном HCl 10%-м формалине (рН = 7,2; от 5 до 24 часов); дегидратировали в батарее спиртов восходящей концентрации (аппарат гистологичес- кой проводки тканей фирмы Leica Biosystems, Г ермания) и заливали в парафин. Срезы тканей толщиной ≈4 мкм поме - щали на обычные, а для иммуногистохимического (ИГХ) исследования — на специальные адгезивные предметные стекла SuperFrost Plus (Menzel-Glаser, Polylisine, Г ермания), депарафинизировали, согласно принятой стандартной мето- дике. Впоследствии срезы либо окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования, либо исполь- зовали для ИГХ. ИГХ-исследование проводили после депарафинизации и регидратации парафиновых срезов по стандартному прото- колу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond- maX (Leica Biosystems). В качестве первичных антител исполь - зовали моноклональные антитела (Abcam, Великобритания) к VEGF-A (Anti-VEGFA antibody, Clone ab46154, 1:400) и кро- личьи к VDR (Anti-Vitamin D Receptor, Clone ab3508, 1:300) и CASP3 (Anti-Caspase3 antibody, Clone E87, 1:50), NGF (Anti-NGF antibody, Clone ab52918, 1:300). Исследования выполняли в гистохимической лаборатории 9-го Лечебно- диагностического центра Министерства обороны РФ. Полученные в результате подсчета данные статистичес- ки обрабатывали с использованием компьютерной про - граммы SPSS 7.5 for Windows Statistical Software Package (IBM Analytics, США). При этом определяли вариационные ряды, выборочное среднее, стандартную ошибку выбороч - ного среднего (SEM) и вероятность различия. Затем оцени - вали соответствие/несоответствие полученных результа- тов нормальному распределению с применением критерия Колмагорова — Смирнова. При статистической обработке для оценки достоверности различий средних значений между группами использовались непараметрические U-критерий Манна — Уитни, Н-критерий Краскелла — Уоллеса. При отсутствии нормального распре- деления данных применяли непараметрический критерий Вилкоксона (Statistical Methods for Research Workers) с уров - нем значимости p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ При микроскопическом исследовании полученных биоптатов эндометрия во всех образцах обнаружили фазы пролифера- ции менструального цикла — маточные железы с ровным контуром на фоне преобладания эпителиального компарт- мента над стромальным. По данным морфометрического анализа железистого ком- партмента эндометрия, статистически значимых различий в высоте клеток железистого эпителия, диаметре желез и их плотности на единицу площади в I и II группах по сравнению с группой контроля не было (р > 0,05). В биоптатах капсулы эндометриоидных кист пациен - ток с НГЭ на фоне стромы яичника определялись отдельные участки эктопического эндометрия, выстланные однослойным кубическим эпителием с единичными реснитчатыми клетками, частицы сплющенных эндометриоидных желез, а также отло- жения гематина и гемосидерина с признаками локального экстравазального гемосидероза. Описанная выше патоморфо- логическая картина свидетельствует о функциональной актив- ности процесса в виде пролиферативных изменений эпителия желез и эндометриоидных кист, ангиоматоза цитогенной стро- мы, скопления секрета в железах и кистах, высокой частоты «старых» кровоизлияний в железах, кистах и строме. Морфометрический анализ плотности ИГХ-маркирования VDR указывает на статистически значимые различия между подгруппами с и без дефицита 25(ОН)D у женщин с НГЭ- ассоциированной ТБ, а также между этими подгруппами и контролем. В подгруппе с дефицитом 25(ОН)D данный показатель составил 71,1 ± 3,7%, что в среднем превышает аналогичный показатель в подгруппе без него (44,2 ± 2,8%) в 1,6 раза (р < 0,05). По сравнению с группой контроля (31,5 ± 2,1%) иммунологическое маркирование VDR в под - группе с дефицитом 25(ОН)D было выше в 2,3 раза (р < 0,05). В то же время в ходе ИГХ-исследования капсул эндо- метриоидных кист в железистом эпителии стенок эндомет- риоидных кист яичников обнаружили увеличение доли ИГХ-позитивных на VDR клеток в 2,7 раза в подгруппе А (86,3 ± 2,2%) и в 2,0 раза в подгруппе В (63,6 ± 3,4%) по срав- нению с контролем (р < 0,05). Различие между подгруппами А и В также было статистически значимым (р < 0,05). В строме эндометриоидных кист яичников выявили уве- личение доли ИГХ-позитивных элементов на VEGF в 2,7 раза в подгруппе А (77,4 ± 3,5%) и в 2,0 раза в подгруппе В (56,3 ± 2,8%, р < 0,05) при значении в группе контроля 28,2 ± 1,1 (р < 0,05 для отличия от подгрупп женщин с НГЭ и ТБ). Фактор роста нервов (NGF) демонстрировал выраженную (3 балла) положительную стромальную реакцию в образ - цах биоптатов эндометрия и стенок эндометриоидных кист яичника I группы (НГЭ с ТБ), в группе контроля — слабую (1 балл) и местами умеренную (2 балла), но незначительную ГИНЕКОЛОГИЯ Гинекология № 7 (162), 2019 | | 39 ИГХ-реакцию. В эутопическом эндометрии женщин подгруп - пы IА (с дефицитом 25(ОН)D) наблюдали выраженное имму - номечение NGF (3 балла) во многих фокусах диффузного характера, преимущественно периваскулярно и перигланду- лярно (47,3 ± 3,2%), что соответствует наиболее значимым участкам тканевой иннервации эндометрия. В подгруппе без дефицита 25(ОН)D данный показатель составил 36,1 ± 2,8% (р < 0,05 для отличия от подгруппы IА), а в контроле — 15,7 ± 1,5% (р < 0,05 для отличия от подгрупп IА и IВ). В строме эндометриоидных кист яичника отмечали уве- личение доли ИГХ-позитивных клеток, экспрессирующих NGF, носивших периневральный и пери- и интраганглио - нарный характер, сопровождающих инфильтративный рост эндометриодной ткани: рост площади экспрессии в 4,1 раза в подгруппе А (63,7 ± 2,1%) и в 2,9 раза в подгруппе В (45,8 ± 1,9%, р < 0,05) по сравнению с группой контроля (15,7 ± 1,5%, р < 0,05). Данная картина предположительно обусловлена наруше- ниями в молекулярно-клеточных процессах в эндометрии, которые развиваются на фоне НГЭ и метаболического дисба- ланса 25(ОН)D и усиления неоангиогенеза. В ходе морфометрии в биоптатах эутопического эндомет- рия были установлены статистически значимые различия в относительной ИГХ-экспрессии CASP3 между подгруппа - ми I группы и группой контроля. В подгруппе с дефицитом 25(ОН)D на фоне НГЭ-ассоциированной ТБ показатель отно - сительной плотности маркирования составил 26,1 ± 1,5%, что в 1,1 раза выше аналогичного параметра у женщин без дефицита 25(ОН)D (28,4 ± 1,2%, р < 0,05) и в 1,2 раза ниже значений группы контроля (31,6 ± 1,7%, р < 0,05). В эпителии и местами в строме эндометриоидных кист яичника отмечали увеличение количества ИГХ-позитивных на CASP3 клеток в 1,5 раза в подгруппе IА (22,1 ± 1,7%) и в 1,2 раза в подгруппе IВ (28,4 ± 1,2%) по сравнению с группой контроля (32,3 ± 1,7%, р < 0,05). Различие между подгруппами также было статистически значимым (р < 0,05). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выявленные изменения показывают смещение пролифера - тивно-апоптотического индекса в сторону снижения актив- ности апоптоза в клетках эутопического и эктопического эндометрия при диагностированном дефиците 25(ОН)D. Результаты исследования свидетельствуют о дефектном метаболизме 25(ОН)D, изменения субстрат-ферментного соот - ношения косвенно подтверждают его дефицит. Аналогичная зависимость наблюдается в экспрессии VDR, что подтвержда - ет результаты проведенного ИГХ-исследования на маркиро- вание VDR в эндометрии и капсулах эндометриоидных кист у пациенток с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ). Она лежит в основе ведущего патогенетического механизма возникновения тазовой боли при НГЭ в условиях снижения антипролиферативного действия витамина D на ткани при его дефиците в сыворотке крови. Это сопровождается усилением локального неоангиогенеза и роста нервных волокон с изме- нением пролиферативно-апоптотического паттерна в сторону угнетения апоптоза и усиления пролиферации. ЛИТЕР АТУР А / REFERENCES 1. Burney R.O., Giudice L.C. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil. Steril. 2012; 98(3): 511–19. DOI: 10.1016/j. fertnstert.2012.06.029 2. Оразов М.Р., Хамошина М.Б., Оразмурадов А.А., Кайгородова Л.А., Марапов Д.И., Барсегян Л.К. Уровень витамина D у женщин с эндометриоз-ассоциированной тазовой болью. Доктор.Ру. 2017; 9(138): 17–20. [Orazov M.R., Khamoshina M.B., Orazmuradov A.A., Kaigorodova L.A., Marapov D.I., Barsegyan L.K. Vitamin D Levels in Women with Endometriosisassociated Pelvic Pain. Doctor.Ru. 2017; 9(138): 17–20. (in Russian)] 3. Доброхотова Ю.Э., Калиматова Д.М. Влияние витами - на D на эндометриоз. Фарматека. 2018; 6(359): 84–8. [Dobrokhotova Yu.E., Kalimatova D.M. Vliyanie vitamina D na endometrioz. Farmateka. 2018; 6(359): 84–8. (in Russian)] 4. Зазерская И.Е., Кузнецова Л.В., Дорофейков В.В. Вита- мин D и репродуктивное здоровье женщины: моногра - фия. СПб.: Эко-Вектор; 2017. 151 с. [Zazerskaya I.E., Kuznetsova L.V., Dorofeikov V.V. Vitamin D i reproduktivnoe zdo- rov'e zhenshchiny: monografiya. SPb.: Eko-Vektor; 2017. 151 s. (in Russian)] 5. Cermisoni G.C., Alteri A., Corti L., Rabellotti E., Papaleo E., Vigan ò P. et al. Vitamin D and endometrium: a systematic review of a neglected area of research. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(8): E2320. DOI: 10.3390/ijms19082320 6. Методика (метод) измерений массовой концентрации стеро - идных гормонов в пробах крови методом жидкостной хрома - тографии — тандемной масс-спектрометрии. МУ 08–47/376. Томск: ФГБОУ ВПО «Томский политехнический университет»; 2015. [Metodika (metod) izmerenii massovoi kontsentratsii steroidnykh gormonov v probakh krovi metodom zhidkostnoi khromatografii — tandemnoi mass-spektrometrii. MU 08–47/376. Tomsk: FGBOU VPO “Tomskii politekhnicheskii universitet”; 2015. (in Russian)]