Impact of surrounding tissue on microRNA expression in the eutopic endometrium in severe endometriosis

Эндометриоз – процесс, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию. Заболевание встречается примерно у 10% женщин репродуктивного возраста и является основной причиной тазовых болей, менструальных кровотечений и бесплодия [1]. Диагностика эндометриоза в ряде случаев затруднена в связи с разнообразием симптомов и жалоб. Отсутствие специфических симптомов и чувствительных молекулярных маркеров не позволяет не только верифицировать диагноз, но и провести раннюю диагностику заболевания в связи с поражением соседних органов. Золотым стандартом является диагностическая лапароскопия и проведение полномасштабной операции [2]. Этиология эндометриоза до сих пор остается недостаточно изученной. Предполагается роль различных факторов, обусловливающих развитие заболевания: ретроградная менструация, генетическая предрасположенность, нарушение иммунитета, внешние факторы и др. [3]. Кроме того, эктопический эндометрий может поражать различные внутренние органы, что дополнительно усложняет диагностику и терапию заболевания. Изучение фундаментальных молекулярных механизмов эндометриоза может помочь в разработке новых методов диагностики и терапии заболевания. В настоящее время ведутся активные исследования специфических особенностей экспрессии различных генов в нормальном и эктопическом эндометрии. Особое место среди них занимает изучение роли микроРНК в развитии эндометриоза [4]. МикроРНК – короткие одноцепочечные молекулы длиной 20–25 нуклеотидов, осуществляющие регуляцию экспрессии генов на посттранскрипционном уровне путем ингибирования синтеза белка с мРНК [5]. МикроРНК участвуют в регуляции большинства фундаментальных биологических процессов развития организма: делении клеток, смене фаз клеточного цикла, апоптозе, клеточной миграции и инвазии, ангиогенезе, формировании иммунного ответа. Многочисленные исследования показали, что повышение или снижение экспрессии определенных микроРНК ассоциируется с развитием пролиферативных заболеваний [6]. Исследования, проведенные в последние годы, показали, что многие микроРНК, меняющие свою экспрессию при опухолях, аналогичным образом проявляют себя и при тяжелых формах эндометриоза. В связи с этим в настоящей работе мы провели сравнительное исследование экспрессии восьми микроРНК – miR-9-5p, miR-20b-5p, miR-139-3p, miR-193a-3p, miR-200a-5p, miR-210-5p, miR-376c-5p и miR-378а-5р в эутопическом и эктопическом эндометрии у пациенток с тяжелой инфильтративной формой эндометриоза. Учитывая тот факт, что эктопический эндометрий представляет собой конгломерат эндометриоидной ткани и ткани органа, на котором он развивается, провели также оценку экспрессии этих же микроРНК в участках ткани вблизи пораженного участка. Материал и методы исследования В исследование были включены 22 женщины с тяжелым ретроцервикальным эндометриозом с поражением толстой кишки. У всех женщин в процессе операции забирали для исследования фрагмент ткани эктопического эндометрия и участок ткани пораженного органа рядом с эктопическим эндометрием. У 12 из этих женщин были взяты соскобы эутопического эндометрия под контролем гистероскопии для исключения внутриматочной патологии с последующей морфологический оценкой препарата. Забор тканей проводили в пролиферативной фазе менструального цикла. Средний возраст пациенток составлял 31±4 года. Ткань помещали в пробирки с лизирующим раствором из комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот «Проба-НК» (компания ДНК-Технология, Россия). Измерение уровня экспрессии микроРНК проводили методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием комплекта реактивов TaqMan miRNA Assay (Applied Biosystems) и детектирующего амплификатора ДТ-96 (компания ДНК-Технология, Россия). Выделение микроРНК из тканей проводили методом фенольной экстракции с использованием комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот «Проба-НК» в соответствии с инструкцией к нему. Количественную оценку микроРНК проводили с использованием метода ∆∆Cp по отношению к количеству ДНК в образце. Статистическую обработку результатов исследования уровней экспрессии микроРНК проводили методом непараметрического анализа с использованием программы Statistica 10, IBM SPSS Statistics v22. Для оценки различий в экспрессии микроРНК в эктопическом эндометрии и соседнем участке использовали критерий Вилкоксона для зависимых групп. Отличие экспрессии в эктопическом эндометрии от эутопического оценивали по U-критерию Манна–Уитни. Различие между группами полагали статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследования В таблице приведены результаты сравнительных исследований экспрессии 8 микроРНК (miR-9-5p, miR-20b-5p, miR-139-3p, miR-193a-3p, miR-200a-5p, miR-210-5p, miR-376c-5p и miR-378а-5р) в тканях эктопического и эутопического эндометрия и вблизи пораженного участка. Уровень экспрессии трех микроРНК (miR-9-5p, miR-20b-5p и miR-210-5p) существенно не различался в исследуемых тканях. Экспрессия miR-200a-5p в участке ткани с эктопическим эндометрием была снижена в 2,4 раза по сравнению с нормальным эндометрием и незначительно отличалась от уровня экспрессии в окружающей ткани. Уровень экспрессии miR-376c-5p в эктопическом эндометрии был в 10 раз выше, чем в эутопическом эндометрии и в 2 раза выше, чем в окружающей ткани; экспрессия miR-378а-5р в эктопическом эндометрии – в 3 раза выше, чем в нормальном эндометрии, но в 3 раз ниже, чем в соседнем не пораженном участке ткани. Обсуждение В настоящее время имеется много публикаций, в которых сравнивается уровень экспрессии микроРНК в тканях эутопического и эктопического эндометрия с целью выявления специфических для эндометриоза микроРНК [7–11]. Однако эктопический эндометрий представляет собой конгломерат клеток эндометрия и ткани, на которой развивается эндометриоидное поражение. При этом доля клеток пораженной ткани значительно превышает количество клеток эндометрия, и разные ткани имеют свой профиль микроРНК [12]. Это существенно осложняет идентификацию микроРНК, нарушение экспрессии которых может иметь отношение к измененному состоянию эндометрия. Впервые на это обратили внимание в работе Saare и соавт. [13], в которой, используя технологию высокопроизводительного секвенирования микроРНК, проводили сравнение экспрессии микроРНК не только в эктопическом и эутопическом эндометрии, но и в ткани, примыкающей к пораженному участку. Из нескольких сотен идентифицированных микроРНК выявили только 5 (miR-34с, miR-141, miR-200а, miR-200b и miR-449а), экспрессия которых в эктопическом эндометрии была значительно выше, чем в окружающей ткани и в эутопическом эндометрии. Для проведения настоящей работы были выбраны те микроРНК, которые ранее использовали для сравнения экспрессии между эктопическим и эутопическим эндометрием, но без сравнения с примыкающей окружающей тканью. По данным, полученным в наших исследованиях, с уверенностью можно говорить лишь об ассоциации miR-376c-5p с тяжелым наружным эндометриозом. Экспрессия этой микроРНК была в 10 раз выше, чем в эутопическом эндометрии, и в 2 раза выше, чем в примыкающем нормальном участке ткани. Это согласуется и с данными Filigheddu и соавт., показавшими 8-кратное превышение экспрессии miR-376c-5p в эктопическом эндометрии по сравнению с эутопическим [7]. Установлено, что повышенная экспрессия miR-376c-5p усиливает клеточную пролиферацию и блокирует Nodal-индуцируемый апоптоз путем прямого взаимодействия и инактивации мРНК гена ALK7 (activin receptor-like kinase 7) [14]. Выявленный нами повышенный уровень экспрессии miR-193a-3p и miR-378a-5p в эктопическом эндометрии, по сравнению с эутопическим, очевидно, обусловлен высокой экспрессией этих молекул в окружающей ткани. Аналогично и сниженный уровень экспрессии miR-200a-5p в эктопическом эндометрии обусловлен, скорее всего, низкой долей эндометриальных клеток в пораженном участке ткани. Уровень экспрессии других исследуемых в работе микроРНК (miR-9-5p, miR-20b-5p, miR-139-3p, miR-200a-5p, miR-210-5p, и miR-378а-5р) был практически одинаковым в эктопическом эндометрии и в примыкающем участке пораженной ткани. Для выяснения роли этих микроРНК при эндометриозе необходимо в дальнейшем дифференцировать и выделять эндометриоидную и поражаемую ткань с использованием микродиссекции. Заключение Таким образом, проведенные нами исследования показали, что прямое количественное сравнение макромолекул (микроРНК, пептидов и др.) в тканях эутопического и эктопического эндометрия часто не позволяет судить об обусловленности различий в уровне экспрессии микроРНК патологическим процессом. Экспрессионный профиль окружающей ткани может существенно как маскировать, так и модифицировать профиль микроРНК эндометриоидной ткани. Возможно, выделение ткани эктопического эндометрия методом микродиссекции позволит лучше оценить роль микроРНК в развитии эндометриоза.