Expression of ephrin receptor A3 in glandular epithelial cells of uterine endometrium in patients with endometriosis and endometrial cancer

Эндометриоз представляет собой одно из наиболее распространенных гинекологических заболеваний, значительно снижающих качество жизни больных [1]. Эндометриоз, определяемый, как наличие жизнеспособных эндометриоподобных тканей, включая железы и строму вне полости матки, связан с тазовой болью, дисменореей и бесплодием [2, 3]. Гистологически эндометриоз подразделяется на три различные формы: эндометриоз яичников, перитонеальный эндометриоз (ПЭ) и глубокий инфильтративный эндометриоз (ГЭ) [4]. Хотя эндометриоз считается доброкачественным состоянием, он имеет много схожих признаков со злокачественными клетками, включая инвазивность, адгезивность и метастатический потенциал [5]. Более того, эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что эндометриоз может вызывать злокачественные опухоли [6]. Схожесть процессов, протекающих при раке и эндометриозе, особенно при ГЭ, позволяет предположить возможность использования аналогичных терапевтических подходов. В этом отношении особый интерес представляют рецепторы эфрина (Eph), которые в экспериментах зарекомендовали себя в качестве перспективной мишени при лечении рака [7]. Эфриновые рецепторы (Eph) представляют крупнейшее семейство рецепторных тирозинкиназ, играющих важную роль в эмбриогенезе, обеспечивая межклеточные коммуникации, формирование актинового цитоскелета, клеточной подвижности [8]. Eph локализуются на клеточной поверхности и их функциональная активация происходит путем связывания через внеклеточный домен рецептора с соответствующим лигандом, эфрином. Известны 2 типа эфриновых рецепторов – EphA и EphB, различающихся спектром эфринов, с которыми они взаимодействуют. В свою очередь EphA подразделяются на 9 классов (EphA1–EphA8 и EphA10), которые связываются с пятью эфринами класса A (ephrin-A1–ephrin-A5), EphB – на 5 классов (EphB1– EphB4 и EphB6), связывающиеся с тремя эфринами класса B (ephrin-B1–ephrin-B3) [9]. Рецепторы и эфрины участвуют во многих важных физиологических процессах человека, таких как клеточная пролиферация, апоптоз, адгезия, миграция, ангиогенез, направленный рост сосудов и аксонов. Патологические изменения функции системы рецептор/эфрин ассоциируются со многими патофизиологическими процессами – рак, сердечно-сосудистые заболевания, диабет, болезнь Альцгеймера и другие [10]. В последнее время Eph привлекли внимание, как потенциальные терапевтические мишени при лечении рака [11]. Рецептор EphA3 является членом семейства рецепторов Eph, который в высокой степени экспрессируется в эмбриональных тканях [12]. EphA3 контролирует изменение формы клеток, их миграцию во время развития, участвует в схеме ветвления тканей эмбрионального происхождения, в частности, контролирует правильное ветвление нейронных сетей. Данных по экспрессии EphA3 при раке эндометрия (РЭ), как и при эндометриозе, мы не выявили в поисковых системах. В связи с этим целью работы было методом иммуногистохимии провести сравнительное исследование экспрессии EphA3 на эпителиоцитах желез слизистой тела матки в норме, при эндометриозе разной степени тяжести и РЭ. Материалы и методы Работа выполнена на базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. В исследование включены 46 женщин, которые были разделены на 4 группы: 1-ю группу составили 20 женщин с ГЭ, 2-ю – 21 женщина с ПЭ, 3-ю (группа сравнения) – 6 женщин с РЭ (гистологический тип IaT1aNxMO), и 4-ю (контрольную) группу – 9 женщин без эндометриоза. В качестве последних были выбраны пациентки, прооперированные по поводу трубно-перитонеального фактора бесплодия, обусловленного спаечным процессом в малом тазу, и у которых по данным гистологического заключения подтверждено отсутствие патологических изменений в эндометрии и отсутствие эндометриоза. У каждого пациента оценивалась окраска 3–5 желез. Критериями исключения послужили: наличие тяжелых экстрагенитальных заболеваний и другой онкопатологии. Исследование было одобрено Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России; все пациенты подписали информированное согласие на участие в данном исследовании. Для количественной оценки экспрессии EphA3 использовали стандартную технику иммуногистохимического окрашивания депарафинизированных препаратов моноклональными антителами к рецептору EphA3 фирмы Abcam Inc – кроличьи поликлональные антитела клона ab126261 в разведении 1:200. В качестве вторичных антител использовали козий антикроличий иммуноглобулин IgG H&L (HRP) – клон ab205718. Количественную оценку экспрессии EphA2 проводили, используя программу ImageJ с открытым исходным кодом для анализа и обработки изображений. В связи с тем, что EphA3 преимущественно окрашивается на поверхности мембраны клеток, курсором выделялся участок железы и фиксировался максимальный результат интенсивности окраски. У каждого пациента оценивалась окраска 5–6 желез. В качестве отрицательного контроля использовали срезы, окрашенные без специфических антител. Статистический анализ Статистический анализ проводили с использованием пакета программ MedCalc Statistical Software 11.5.0. Значимость различий между сравниваемыми группами определяли с применением непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Данные представлены в виде медианы (Ме) и квартилей Q1 и Q3 в формате Ме (Q1; Q3) Уровень статистической значимости при проверке нулевой гипотезы считали соответствующим p<0,5. Результаты Результаты, представленные в таблице, показали, что на поверхности эпителиоцитов желез нормального эндометрия экспрессия рецептора значимо выше в секреторной фазе, чем в пролиферативной, что может говорить об отсутствии прямой связи активности данного рецептора с пролиферативными процессами в эндометрии (28,0 и 20,0 у.е., соответственно, р=0,03). На рисунке (А, Б) представлены изображения, иллюстрирующие эти различия. Возможно, что отсутствие прямой связи EphA3 с клеточной пролиферацией объясняет и низкую экспрессию рецептора на эпителиоцитах желез эндометрия при РЭ. Экспрессия рецептора на раковых железах составила 20,0 у.е. (таблица) и значимо не отличалась от экспрессии на эпителиоцитах нормального эндометрия в пролиферативной фазе цикла. В эутопическом эндометрии в пролиферативной фазе и при ПЭ, и при ГЭ не выявлено значимого отличия экспрессии EphA3 от экспрессии в нормальном эндометрии в той же фазе менструального цикла (26,0 и 21,0, соответственно, таблица). В то же время в секреторной фазе на эпителиоцитах желез эутопического эндометрия экспрессия рецептора и при ПЭ, и при ГЭ была значимо выше, чем в секреторной фазе нормального эндометрия (52,0 и 39,5 у.е. в сравнении с 28,0 у.е., соответственно, таблица). Более того, экспрессия EphA3 на эпителиоцитах желез эутопического эндометрия в секреторной фазе и при ПЭ, и при ГЭ была значимо выше, чем на клетках ракового эндометрия. На рисунке (В, Г) представлены изображения, иллюстрирующие эти различия. Экспрессию EphA3 в эктопическом эндометрии исследовали, как в поверхностных очагах в перитонеальной полости, так и в глубоко инфильтрированных очагах в ткань кишечника. У пациенток с ПЭ в очагах на брюшине в обеих фазах цикла экспрессия EphA3 на железистых клетках была значимо выше, чем в соответствующих фазах нормального эндометрия. В глубоко инфильтрированных в ткань кишечника очагах эктопического эндометрия экспрессия EphA3 была в обеих фазах значимо выше, чем в нормальном эндометрии (33,0 у.е. в пролиферативной и 36,5 у.е. в секреторной фазе (таблица, рисунок Д, Е). В эутопическом эндометрии пациенток с ГЭ не было выявлено статистически значимых различий в экспрессии EphA3 по сравнению с нормальным эндометрием в фазе пролиферации и раком эндометрия (рисунок Ж), однако такие различия были выявлены в фазу секреции как по сравнению с нормальным пролиферативным эндометрием, так и по сравнению с раком эндометрия (рисунок З). В эктопическом очаге эндометрия при оценке очага глубокого эндометриоза у пациенток с ГЭ были выявлены статистически значимые различия и в фазу пролиферации, и в фазу секреции как по сравнению с нормальным эндометрием в фазе пролиферации, так и по сравнению с нормальным эндометрием в фазе секреции и раком эндометрия (рисунок И, К). В эктопическом очаге на брюшине были выявлены статистически значимые различия только при сравнении очага в фазе секреции с экспрессией Eph3 в раке эндометрия (рисунок Л–О). Обсуждение Проведенные нами исследования показали, что в нормальном эндометрии экспрессия EphA3 в железистых клетках не коррелирует с пролиферативной активностью ткани: в секреторной фазе менструального цикла экспрессия рецептора значимо выше, чем в пролиферативной. Похожие результаты ранее были получены группой австрийских исследователей, показавших более высокую экспрессию EphA3 в секреторной фазе в эпителиальных и мезенхимальных клетках и в тканях растущих сосудов в эндометрии, по сравнению с пролиферативной [13]. Это доказывает, что экспрессия EphA3 не связана с делением клеток и ростом эндометрия, и определяется, очевидно, функциональным состоянием слизистой тела матки в фазу секреции. В секреторной фазе формируется рецептивность эндометрия, сопровождающаяся активацией многочисленных рецепторов, необходимых для обеспечения миграции бластоцисты к месту прикрепления, адгезии на поверхности эндометрия и имплантации (инвазии) в полость матки [14]. На модели с раковыми клетками было показано, что в регуляции миграции, адгезии и инвазии активная роль принадлежит EphA3 [15, 16]. Сверхэкспрессия EphA3 была обнаружена при многих типах рака, включая рак легких, лейкемию, меланому, лимфому и карциному пищевода [17]. В то же время имеются другие публикации, в которых при повышении активности рецептора подавляется рост опухоли, а при снижении, наоборот, активируется пролиферация и подавляется апоптоз [18, 19]. Это говорит о неоднозначной роли EphA3 в канцерогенезе. Andretta et al. показали, что ни эксперментально индуцированная сверхэкспрессия, ни инактивация не влияют на рост, подвижность или метастатический потенциал в раковых клетках в экспериментах in vivo [19]. Кроме того, иммуногистохимический анализ уровня EphA3 в опухоли не выявил ассоциации с выживаемостью или клинико-патологическими особенностями больных колоректальным раком. Wang et al. показали высокую экспрессию белка EphA3 в нормальных почечных канальцах, в то время как в образцах ткани светлоклеточного почечно-клеточного рака уровень экспрессии был минимальный [20]. Более того, сниженный уровень экспрессии белка EphA3 в поздней стадии опухоли прямо коррелировал с увеличением диаметра опухоли. Опухоль-супрессирующая активность EphA3 выявлялась и при развитии ряда других онкологических заболеваний [17]. Эти противоречивые результаты подчеркивают сложность биологии EphА3 при формировании злокачественных опухолей, особенно там, где в зависимости от клеточного контекста и сопутствующих гормонов, цитокинов, ростовых факторов функции рецептора могут различаться. По-видимому, экспрессия EphA3 может варьировать в зависимости от стадии заболевания. В частности, при раке молочной железы EphA3 сильно экспрессируется в метастазирующей ткани, но не в первичной опухоли [21]. Возможно, что EphA3 может стать перспективным маркером для дифференциации первичной опухоли от ее производных, возникающих в результате метастазирования. В проведенных нами исследованиях мы также не выявили повышенной экспрессии EphА3 на железистых клетках РЭ; она была на уровне экспрессии рецептора в аналогичных клетках нормального эндометрия. Возможно, это объясняется тем, что в нашей работе были выбраны пациенты с ранней стадией опухолевого процесса и ни у кого из них не было выявлено метастазов. Отсутствие повышенной экспрессии рецептора в эпителиоцитах эндометрия при РЭ может быть использовано в дальнейшем для дифференциации между ГЭ и ранними стадиями РЭ. Как и в нормальном эндометрии, экспрессия EphA3 в эктопическом эндометрии в секреторной фазе была значимо выше, по сравнению с пролиферативной. Более того, в секреторной фазе, не зависимо от тяжести эндометриоза, экспрессия рецептора в железистых клетках значимо превосходила также повышенную экспрессию в секреторной фазе в норме. Сверхэкспрессированный уровень EphA3 делает ее перспективной мишенью для разработки профилактики и терапии эндометриоза. Заключение Проведенные исследования показали, что на мембране эпителиоцитов желез пораженного РЭ EphA3 не проявляет повышенную экспрессию, что, по-видимому, связано с ранней до метастатической стадией развития опухолевого процесса. В то же время и при ПЭ, и при ГЭ в секреторной фазе цикла выявлена значительно повышенная, по сравнению с нормой экспрессия EphA3 на мембране эпителиоцитов желез, как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии. Сверхэспрессия EphA3 в эктопическом эндометрии делает ее перспективной мишенью для разработки препаратов для профилактики и терапии эндометриоза.