HEPARAN SULFATES EXPRESSION IN SURGERY MATERIAL OF OVARIAN ENDOMETRIAL CYSTS

Full Text Эндометриоз яичников (ЭЯ) - эстроген-зависимое воспалительное заболевание с про-гредиентным ростом эктопических очагов эндометрия за пределами полости матки, клинически ассоциированное с болевым синдромом, бесплодием и потенциально - с риском опухолевой трансформации [1, 3, 4]. Фундаментальные характеристики предопухолевых изменений и опухолевого роста связаны с ремоделированием внеклеточного матрикса, в котором за исключением волокон соединительной ткани наибольший удельный вес приходится на протеогликаны (ПГ) -белково-углеводные макромолекулы, состоящие из коровых белков с ковалентно прикрепленными углеводными цепочками гликозаминогликанов [5]. Гепарансульфат протеогликаны (ГСПГ) являются одним из классов ПГ, организуют межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия и имеют тканевую специфичность. Среди них ведущие роли принадлежат синдекану-1 (SDC-1) и глипикану-1 (GPC-1), локализованным на плазмо-леммах, а также перлекану (HSPG2), экспрессируемому в базальных мембранах эпителиальных и эндотелиальных клеток [6]. Гепарансульфат протеогликаны связаны с различными белками внеклеточного матрикса и молекулами клеточной адгезии (интегрины, факторы роста, ламинин-1, фибронектин, коллаген IV типа и т.д.), участвуя в широком спектре физиологических и патологических процессов, в том числе опухолевых [5, 7]. Например, SDC-1 посредством передачи сигналов TGF-p модулирует инвазивный потенциал эндометриомы при ЭЯ [4]. Функциональная активность ГСПГ во многом определяется ферментом гепараназой (HPSE) [8], которая расщепляет углеводные цепи гепаран-сульфата (ГС), приводя к изменению архитектуры межклеточного матрикса и высвобождению биологически активных лигандов ГС - факторов роста, хемокинов и морфогенов, что лежит в основе ослабления межклеточных контактов при воспалении, инвазии и опухолевой трансформации [9]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ С помощью метода иммуногистохимии изучить экспрессию гепарансульфат протеогликанов в эутопическом и гетеротопическом эндометрии у пациенток с эндометриозом яичников. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Изучен операционный материал эндомет-риоидных кист яичников и биоптаты эндометрия 11 женщин с наружным генитальным эндометриозом III стадии в пролиферативной фазе цикла. С помощью иммуногистохимии (ИГХ) на парафиновых срезах исследована экспрессия суммарных ГСПГ, коровых белков SDC-1, HSPG2, GPC-1 и фермента деградации их углеводных цепей HPSE. Для визуализации суммарных ГСПГ в качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к углеводным цепям ГС млекопитающих («Millipore», разведение 1:100); первичные антитела к коровому белку SDC-1 («ThermoScientific», готовые к использованию); мышиные антитела к HSPG2 («Abcam», 1:100); кроличьи антитела к GPC-1 («Abcam», 1:100) и кроличьи антитела к HPSE («Abcam», 1:100). Продукты ИГХ-реакции визуализировали c помощью набора «HRP/DAB (ABC) Detection IHC kit («Abcam»). Результаты ИГХ-реакции изучали на 40-55 полях зрения (с обязательным наличием эпителия) на группу при увеличении 400 с помощью микроскопа Axio Scope.A1 с фотокамерой AxioCam MRc5 и программой анализа изображения Zen blue (^Zeiss). Статистическую обработку проводили с использованием пакета RStudio (http://www.rstudio.com/); применяли критерий Колмогорова - Смирнова для двух независимых выборок с нормальным распределением. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р < 0,05. Исследование одобрено этическим комитетом НГМУ (протокол № 63 от 27.03.2014). Пациентками подписано информированное согласие на хирургическое лечение и использование результатов исследования в научных целях. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При сравнительном светооптическом исследовании биоптатов эндометрия и операционного материала пациенток в пролиферативную фазу цикла выявлен гетерогенный характер экспрессии суммарных ГСПГ в эпителиальном компартменте и строме - от выраженного до незначительного. В биоптатах ГСПГ локализовались внутриклеточ-но, на плазмолеммах и в межклеточном матриксе; в эпителии желез реакция была очень гетерогенной, строма эндометрия характеризовалась менее интенсивной иммунопозитивной реакцией, в основном в межклеточном матриксе и за счет одиночных плазмоцитов. В гетеротопиях эндометрия суммарные ГСПГ локализовались также неравномерно, в основном в эпителии и межклеточном матриксе цитогенной стромы. Светооптически экспрессия суммарных ГСПГ в операционном материале менее интенсивна по сравнению с эуэндометрием, однако строма кист превосходила эуэндометрий, и площадь продуктов ИГХ-реакции статистически значимо (р = 0,0208) повышена в патологических очагах (рис.). Далее был изучен вклад индивидуальных представителей семейства ГСПГ в их суммарную экспрессию с помощью антител к коровым белкам синдекана-1, глипикана-1 и перлекана. В гетеротопиях экспрессия SDC-1 была минимальной, она отмечена лишь в базальных и базолатеральных цитолеммах эпителиоцитов. Реакция на HSPG2 была наибольшей в эпителии при очень слабой реакции в цитогенной строме и фиброзной части капсулы эндометриом. Однако реакция на GPC-1 была выраженной в строме и отсутствовала в эпителии. Следует отметить, что HSPG2 может действовать как п ро а нгиогенный фактор, способствуя усилению проницаемости сосудов и пролиферации эндоте-лиоцитов [5]. В целом, статистически значимое превышение площади продуктов реакции выявлено в операционном материале по сравнению с эуэндо-метрием тех же пациенток для всех коровых белков ГСПГ, однако наибольшая площадь продуктов реакции была установлена для GPC-1 (рис.), содержание которого повышено в опухолях яичников [10]. По данным [11], при эндометриозе экспрессия HPSE в эуэндометрии в первую фазу цикла находится на минимальном уровне и нарастает к концу секреторной фазы цикла, способствуя десквамации функционального слоя. В нашем исследовании HPSE в эуэндометрии локализовалась в одиночных эпителиоцитах и мелких очагах перигландулярной стромы, при этом в операционном материале экспрессия HPSE локализована в эпителиальной компоненте гетеро-топий и была повышенной (р = 0,0466). Ранее нами показано [2], что выраженная экспрессия HPSE в эпителии овариальных эндо-метриоидных кист у пациенток раннего репродуктивного возраста с эндометриозом яичников III стадии ассоциирована с воспалительноклеточной инфильтрацией и наличием болевого синдрома. Проведенный недавно кластерный генный анализ [4] продемонстрировал, что ткань эндо-метриоидных гетеротопий вариабельна в отношении паттерна экспрессии генов: из 15 образцов выделено всего 2 образца с высоким уровнем экспрессии генов SDC-1, SDC-4 и молекул, вовлеченных в TGF-p-сигналинг (TGF-p1, ESR1, CTNNB1, SNAI1, BMI1); остальные 13 из 15 образцов демонстрировали низкий профиль экспрессии указанных генов. Гепараназа р=0.0466 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, у пациенток с эндометриозом яичников III стадии сравнительный ИГХ-анализ содержания гепарансульфата, экспрессии коровых белков отдельных представителей ГСПГ и фермента биодеградации углеводных цепей ГС выявил статистически значимые различия между эутопическим и гетеротопическим эндометрием. Одновременное повышение уровня экспрессии коровых белков всех исследованных ГСПГ и содержания ГС в патологических тканях свид етельствует о важной роли гликозилиро-ванных молекул в патогенезе эндометриоза яичников. Авторы статьи благодарят заведующую лабораторией гликобиологии ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины» д. б. н. Григорьеву Эльвиру Витальевну за консультирование по протеогликанам и научного сотрудника лаборатории к. б. н. Казанскую Галину Михайловну за иммуногистохимическое окрашивание суммарных гепарансульфатов.About the authors S. V Aidagulova FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Email: [email protected] Yu. S Timofeeva FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation A. V Volchek FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation V. M Kuleshov FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation I. O Marinkin FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

- Маринкин И.О., Непомнящих Д.Л., Кулешов В.М. и др. Ультраструктурное исследование рецептивности эндометрия в условиях предгравидарной подготовки при привычном невынашивании беременности // Бюллетень Сибирского отделения РАМН - 2014. - Т. 34, № 2. - С. 29-33 - Маринкин И.О., Тимофеева Ю.С., Кулешов В.М., и др. Особенности экспрессии синдекана-1 и гепараназы в эпителии эндометриоидных кист яичников третьей стадии // Акушерство и гинекология. - 2018. - № 11. - С. 86-91 - Bulun S.E., Yilmaz B.D., Sison C., et al. Endometriosis // Endocr. Rev. - 2019. - Vol. 40 (4). - P. 1048-1079. - Ponandai-Srinivasan S., Saare M., Boggavarapu N.R., et al. Syndecan-1 modulates the invasive potential of endometrioma via TGF-p signalling in a subgroup of women with endometriosis // Hum. Reprod. - 2020. - Vol. 35 (10). -P. 2280-2293. - Iozzo R.V., Schaefer L. Proteoglycan form and function: A comprehensive nomenclature of proteoglycans // Matrix Biol. - 2015. - Vol. 42. - P. 11-55. - Annaval T., Wild R., Cretinon Y., Sadir R., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core p roteins to generate extensive structural and functional diversity // Molecules. - 2020. - Vol. 25 (18). - P. 4215. -doi: 10.3390/molecules25184215. - Farach-Carson M.C., Warren C.R., Harrington D.A., Carson D.D. Border patrol: Insights into the unique role of perlecan/heparan sulfate proteoglycan 2 at cell and tissue borders // Matrix Biol. - 2014. - Vol. 34. - P. 64-79. - Vlodavsky I., Gross-Cohen M., Weissmann M., et al. Opposing functions of heparanase-1 and heparanase-2 in cancer progression // Trends Biochem. Sci. - 2018. -Vol. 43. - P. 18-31. - Masola V., Bellin G., Gambaro G., Onisto M. Heparanase: A multitasking protein involved in extracellular matrix (ECM) remodeling and intracellular events // Cells. - 2018. - Vol. 7 (12). - P. 236-246. - Davies E.J., Blackhall F.H., Shanks J.H., et al. Distribution and clinical significance of heparan sulfate proteoglycans in ovarian cancer // Clin Cancer Res. - 2004. - Vol. 10 (15). - P. 5178-5186. - Xu X., Ding J., Ding H., Shen J., et al. Immuno-histochemical detection of heparanase-1 expression in eutopic and ectopic endometrium from women with endometriosis // Fertil. Steril. - 2007. - Vol. 88 (5). - P. 1304-1310.