Genotoxicity and acute toxicity of Hyunburikyung-tang: assessing the safety of prescribing traditional Korean medicine for dysmenorrhea

Genotoxicity and acute toxicity of Hyunburikyung-tang: assessing the safety of prescribing traditional Korean medicine for dysmenorrhea | Research Square window.SnipcartSettings = { analytics: { enabled: false } }; (function() { var accessVector = localStorage.getItem('access_vector') || ''; window.dataLayer = window.dataLayer || []; if (accessVector) { window.dataLayer.push({ user: { profile: { profileInfo: { snid: accessVector } } } }); } })(); (function(w,d,s,l,i){w[l]=w[l]||[];w[l].push({'gtm.start':new Date().getTime(),event:'gtm.js'});var f=d.getElementsByTagName(s)[0],j=d.createElement(s),dl=l!='dataLayer'?'&l='+l:'';j.async=true;j.src='https://www.googletagmanager.com/gtm.js?id='+i+dl;f.parentNode.insertBefore(j,f);})(window,document,'script','dataLayer','GTM-K279D39R'); Browse Preprints In Review Journals COVID-19 Preprints AJE Video Bytes Research Tools Research Promotion AJE Professional Editing AJE Rubriq About Preprint Platform In Review Editorial Policies Our Team Advisory Board Help Center Sign In Submit a Preprint Cite Share Download PDF Research Article Genotoxicity and acute toxicity of Hyunburikyung-tang: assessing the safety of prescribing traditional Korean medicine for dysmenorrhea Sung-young Jo, Sung-min hwang, Jun-sub Kim, Su-yeong Kim, Kyeong-wan Woo, and 2 more This is a preprint; it has not been peer reviewed by a journal. https://doi.org/ 10.21203/rs.3.rs-4542887/v1 This work is licensed under a CC BY 4.0 License Status: Under Review Version 1 posted 4 You are reading this latest preprint version Abstract Background Hyunburikyung-tang exerts an anti-inflammatory effect by suppressing pro-inflammatory cytokines and prostaglandin E2 and is clinically used to improve dysmenorrhea in Korea. It contains various medicinal plants including peach seeds ( Prunus persica Batsch) and safflower ( Carthamus tinctorius Linn). Peach seeds contain amygdalin, which demonstrates teratogenic effects, and safflower is reported to cause reproductive toxicity and teratogenic effects in mice. These findings raise concerns regarding the teratogenic potential of these substances. A potential correlation exists between genotoxicity and teratogenicity. Genotoxic substances can damage DNA and cause mutations or chromosomal abnormalities, which may result in developmental malformations. Therefore, we aimed to assess whether Hyunburikyung-tang causes acute toxicity or genotoxicity. Methods Male and female rats were orally administered Hynburikyung-tang to assess acute toxicity. Body weight measurements, general symptom observations, and autopsy examinations were used to confirm toxic responses. Genotoxicity assessment was conducted with bacteria, cells, and mice, according to the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) test guidelines. Results Regarding acute toxicity assessment, no toxic reactions were observed when male and female rats received oral doses of Hyunburikyung-tang (626, 1,250, or 2,500 mg/kg). The genotoxicity tests, which included assessments of reverse mutations, chromosomal aberrations, and micronucleus formation, showed no genotoxic responses. Conclusions Our findings suggested that Hyunburikyung-tang does not induce acute toxicity or genotoxicity. Nevertheless, follow-up research should be conducted to confirm toxicity caused by repeated administration. Hyunburikyung-tang Safety Genotoxicity Acute toxicity Korean medicine Traditional medicine Complementary and alternative medicine Bacterial reverse mutation test Chromosome aberration test Dysmenorrhea Background Dysmenorrhea is a prevalent gynecological issue, affecting approximately 90% of menstruating women [ 1 ]. Studies indicate that 78% of young women experience menstrual pain, which negatively impacts their quality of life [ 2 , 3 ]. The resultant decrease in academic or work efficiency among women due to menstrual pain results in socioeconomic loss. Modern medical research suggests that dysmenorrhea results from reduced intrauterine blood flow caused by uterine contractions. Studies have shown an increased ratio of prostaglandin F2a to prostaglandin E2 (PGE 2 ) and vasopressin in the plasma of women with dysmenorrhea, indicating that these substances may be linked to uterine contractions and menstrual pain. The use of anti-prostaglandins alleviates pain in approximately 80% of affected women, highlighting the role of prostaglandins and vasopressin in dysmenorrhea [ 4 – 6 ]. Several medications have been formulated to mitigate menstrual pain, e.g., prostaglandin synthase inhibitors, which offer analgesic and anti-inflammatory effects. However, these are not effective for all women (20–25%), and their prolonged use can result in side effects, such as liver, kidney, and gastrointestinal complications [ 7 ]. Oral contraceptives are not an option for women seeking pregnancy and may cause side effects including nausea, vomiting, and swelling with long-term use [ 8 ]. Gonadotropin-releasing hormone agonists may induce menopausal symptoms, reduce bone mineral density, and elevate the risk of coronary artery disease [ 9 ]. Among tocolytics, nitroglycerin is weakly effective for suppressing menstrual pain and causes side effects such as headaches. Nifedipine can effectively suppress menstrual pain but may lead to side effects such as facial redness, tachycardia, and pain [ 10 , 11 ]. Hyunburikyung-tang, a traditional prescription, suppresses PGE 2 and pro-inflammatory cytokines, and combined administration with piroxicam, a drug used for menstrual pain, is reported to increase the anti-inflammatory effect [ 12 ]. Hyunburikyung-tang is widely recognized as a treatment for dysmenorrhea and menstrual disorders, improves visual analog scale (VAS) scores and multidimensional verbal rating scale (MVRS) scores, and is frequently used in clinical settings [ 13 – 16 ]. However, Hyunburikyung-tang is potentially dangerous because it contains peach seeds ( Prunus persica Batsch), which are known to cause deformities, and safflower (Carthamus tinctorius Linn), which is known to be toxic to the testes and embryos [ 17 – 19 ]. Multiple studies have demonstrated that genotoxicity and teratogenicity are interconnected. Various parental factors, such as lifestyle habits, environmental toxin exposure, smoking, and alcohol consumption, can induce genotoxic effects in reproductive cells, potentially leading to congenital abnormalities in offspring [ 20 – 23 ]. Therefore, we aimed to determine whether Hyunburikyung-tang causes genotoxicity or acute toxicity and provide safety information. Materials and methods Samples and extraction. Hyunburikyung-tang was purchased from the Hocburi (The facility standard of herbal dispensaries, Gyeonggi Province, Korea), composed of 15 medicinal plants. Medicinal plants used in the preparation of Hyunburikyung-tang were analyzed by Good Manufacturing Practice (GMP)-certified pharmaceutical companies to determine whether they met the acceptance criteria of the Korean pharmacopoeia (KP) and Korean herbal pharmacopoeia (KHP) of the Korea Ministry of Food and Drug Safety (MFDS). Medicinal plants that were confirmed to meet the legal acceptance criteria were used for extraction (see Table 1 for composition and analysis data). Table 1 Composition and analysis data of Hyunburikyung-tang Number Scientific name Part Weight (g) Ratio (%) Origin Description Ash (%) SO 2 (ppm) Aflatoxin Quantification Heavy metal (ppm) Pesticide residues Company Name Ratio (%) 1 Angelica gigas Nakai Radix 3.8 6.1 Korea Suitable 5.8 7.0 - Decursin+ Decursinol angelate 8.000 < 0.0 N.D A 2 Prunus persica Batsch Semen 3.8 6.1 South Africa Suitable 4.7 2.6 N.D Amygdalin 2.400 < 0.10 N.D B 3 Aucklandia lappa Decne. radix 2.6 4.2 China Suitable 3.4 8.4 - Costunolide+ Dehydrocostus lactone 7.130 < 0.13 N.D B 4 Zingiber officinale Roscoe. Rhizoma Recens 1.5 2.4 Korea Suitable 1.0 1.0 - - - < 0.0 - A 5 Curcuma zedoaria (Berg.) Rosc Rhizoma 3.8 6.1 China Suitable 4.8 2.6 - - - < 4.92 N.D B 6 Lindera strichnifolia Fernandez-Villar Radix 5.6 9.0 China Suitable 0.6 11.4 - - < 1.16 N.D B 7 Cinnamomum cassia Blume Cortex Interior 2.6 4.2 Vietnam Suitable 2.0 4.0 - Cinnamic acid 0.100 < 1.00 N.D B 8 Paeonia lactiflora Pallas Radix Alba 3.8 6.1 Korea Suitable 2.8 3.0 - Albiflorin+ Paeoniflorin 3.800 < 0.0 N.D A 9 Citrus aurantium Linné Fructus Immaturus 3.9 6.3 China Suitable 2.6 5.4 - - - < 0.0 N.D A 10 Citrus unshiu Markovich Pericarpium 3.8 6.1 Korea Suitable 2.2 7.8 - Hesperidin 14.300 < 0.0 N.D B 11 Atractylodes lancea De Candlle Rhizoma 5.6 9.0 China Suitable 5.2 6.4 - - - < 0.00 N.D A 12 Cnidium officinale Makino Rhizoma 3.8 6.1 Korea Suitable 4.4 2.0 - - - < 0.2 N.D A 13 Cyperus rotundus Linné Rhizoma 11.3 18.1 Korea Suitable 2.5 3.0 - - - < 0.0 N.D A 14 Corydalis ternata Nakai Tuber 3.8 6.1 China Suitable 2.2 6.0 N.D Coptisine+ Tetrahydropalmatine 0.410 < 0.01 N.D A 15 Carthamus tinctorius Linn Flos 2.6 4.2 China Suitable 7.1 15.2 N.D Kaempferol 0.094 < 0.30 N.D A - 62.3 100.0 - Abbreviations: N (number), N.D (non-detection), Suitable (suitability with Korean herbal standards) Heavy metals: Sum of lead (Pb), cadmium (Cd), arsenic (As), and mercury (Hg) Pesticide residues: Total DDT, dieldrin, methoxychlor, total BHC, azocyclotin, azoxystrobin, aldrin, endosulfan, endrin, tebuconazole, pendimethalin, fenpropathrin, sethoxydim, fluazifop-butyl, etc. Company: Hando pharmaceuticals (A, Gyeonggi Province, Korea), Hyeongyoul pharmaceuticals (B, Gyeonggi Province, Korea). The preparation involved the addition of distilled water at 10 times the weight of the herbal materials, extraction at 115°C for 4 h, and filtration through a nonwoven material. The extract was subsequently concentrated to 10°Bx at 120°C and sterilized at 100°C for 30 min. The sterile extract was spray-dried into powder form, dissolved at appropriate concentrations, and utilized in the experiments. Breeding and environmental conditions The specific pathogen-free animal facility used in this study was maintained at a temperature of 22 ± 3°C, humidity of 30–70%, noise < 60 dB, ammonia concentration < 20 ppm, and a 12-hour light-dark cycle with 150–300 lux. The room received over 10 air changes per h of HEPA-filtered air and was cleaned with a disinfectant daily. Rats were housed individually in stainless steel cages for acute toxicity assessments, whereas mice for the in vivo micronucleus test were housed five per group in polycarbonate cages, with cages and water bottles replaced at least twice weekly. The rodents had free access to solid feed (PMI LabDiet® 5053) and UV-disinfected, reverse osmosis-purified water in polycarbonate bottles. Acute toxicity assessment The acute toxicity assessment was authorized by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the Korean Medicine Non-clinical Study Center (Approval number: NIKOM-2022-07) and the steering committee of the Good Laboratory Practice (Approval study number: N22006). Six-week-old Sprague-Dawley (SD) rats from Orient Bio (Gyeonggi Province, Korea) were acclimatized for five days and randomly assigned to the following groups: negative control (distilled water) group and low-dose (625 mg/kg), medium-dose (1,250 mg/kg), and high-dose (2,500 mg/kg) groups (5 per male and female group, total 50 animals). Test substances were administered after a 12 h fast, excluding water, using a sonde attached to a syringe. Feed was reintroduced 4 h post-administration. General symptoms and mortality were assessed shortly after dosing and daily thereafter until autopsy. Body weights were recorded on the day of administration and days 1, 3, 7, and 14 post-administration. Surviving animals were humanely euthanized with CO 2 , followed by a thorough autopsy to examine organs. Bacterial reverse mutation test The bacterial reverse mutation test was conducted following the OECD TG 471 guidelines using five strains: Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537, and Escherichia coli WP2 uvrA (MOLTOX, USA). Groups included a negative control, a positive control, and test substance treatment groups (61.7, 185.2, 555.6, 1,666.7, and 5,000 µg/plate). Three plates per group or concentration were used. The materials included 0.1 mL of the test substance or solvent, S9 mix for metabolic activation or phosphate buffer for no metabolic activation, 0.5 mL of strain culture, and 2 mL of top agar. These materials were mixed and incubated at 120 rpm and 37°C for 20 min, plated on minimal glucose agar (MGA) plates, and incubated for 48 h. Colonies were counted visually after the completion of the incubation period. Chromosomal aberration test Chromosomal aberration tests were conducted following OECD TG 473 guidelines using Chinese hamster lung (CHL/IU) cells. Cells were plated at a density of 5×10 5 cells/mL, cultured overnight in a 60 mm dish, and treated in duplicates for either 6 h (with or without metabolic activation) or 24 h (without metabolic activation). Following the 6 h treatment, cells were replenished with a normal medium devoid of the test substance and further incubated for 18 h. Two hours prior to harvesting, cells were treated with colcemid for 2 h and collected in a KCl solution. After fixation with an acetic acid/methanol solution (1:3), cells were stained with a 5% Giemsa solution. The number of cells exhibiting chromosomal aberrations per 300 cells was determined using two slide glasses obtained from each cell culture dish. Micronucleus test The micronucleus test was conducted following OECD TG 474 guidelines and approved by the IACUC of the Korean Medicine Non-clinical Study Center (Approval number: NIKOM-2022-29) and the steering committee of the Good Laboratory Practice (Approval study number: T22043). Six-week-old Institute of Cancer Research (ICR) mice were procured from Orient Bio (Gyeonggi Province, Korea) and acclimatized for five days. Five male mice (5 per group, total 25 animals) were allocated to the concurrent negative control group (distilled water without the test substance), concurrent positive control group (Mitomycin C), low-dose group (500 mg/kg), medium-dose group (1,000 mg/kg), and high-dose group (2,000 mg/kg). Hyunburikyung-tang was orally administered daily for two days. The concurrent positive control group received intraperitoneal injections of mitomycin C (2 mg/kg) 24 h before euthanasia. Animals were euthanized 24 h after the last administration, and bone marrow was collected by perfusion of the femur with fetal bovine serum. Cells were plated onto glass slides and stained with a 5% Giemsa solution following methanol fixation. The number of micronucleated polychromatic erythrocytes (mnPCE) per 4,000 PCE was determined using two slides per mouse. Standards for humane euthanasia The humane endpoints should be considered when experimental animals experience severe suffering and pain or are imminent at death, and detailed symptoms are as follows. (1) When unable to consume water or food, or recumbency, convulsions, or tremors. (2) When observed continuously pain, vocalization or self-mutilation Statistical analysis Weight measurement results in the acute toxicity assessment were expressed as means and standard deviations. Statistical analysis between groups was conducted using SPSS Statistics 25 (IBM Corp., Armonk, N.Y., USA). The significance of body weight differences among groups was assessed via one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett’s test ( p < 0.05). Fisher’s exact test was utilized in the chromosomal aberration test. Dunnett’s test was used in the micronucleus test to compare the frequency of micronucleus formation between the negative control group and the Hyunburikyung-tang treated or positive control groups. The Cochran–Armitage test was used to assess the concentration-response relationship among the groups, excluding the negative and positive control groups. Results Acute toxicity assessment We assessed standard acute toxicity indicators to determine the acute toxicity of orally administered Hyunburikyung-tang in male and female rats, including body weight, general symptoms, and autopsy findings. No statistically significant difference in body weight was observed after a single administration of Hyunburikyung-tang. Detailed individual weights are presented in Tables 2 and 3 . Moreover, no toxicological responses were observed regarding general symptoms 14 days post-administration, including appearance, body position, consciousness, behavior, and nervous system symptoms. Autopsy examination, which included assessment of systemic organs such as the liver, heart, kidneys, and testes (data not shown), showed no signs of abnormal reactions. Table 2 Individual body weights in acute toxicity assessment (male) Sex: Male (g) Group / Dose (mg/kg) Animal ID Day 0 1 3 7 14 G1 / 0 1101 208.1 233.6 254.0 280.5 322.6 1102 220.9 253.7 280.5 341.7 425.8 1103 216.2 251.8 275.2 320.0 382.3 1104 217.7 249.1 269.2 304.2 367.1 1105 213.3 246.9 266.8 310.2 372.8 Mean 215.2 247.0 269.1 311.3 374.1 S.D 4.8 7.9 10.0 22.4 36.9 N 5 5 5 5 5 G2 / 625 1201 203.1 231.2 257.0 295.5 354.9 1202 221.2 250.7 270.7 310.6 367.8 1203 210.8 244.6 271.2 309.9 366.2 1204 209.3 246.6 271.4 312.3 382.1 1205 214.9 243.7 268.4 317.8 380.6 Mean 211.9 243.4 267.7 309.2 370.3 S.D 6.7 7.3 6.1 8.3 11.2 N 5 5 5 5 5 G3 / 1,250 1301 220.4 257.4 287.6 343.1 432.7 1302 208.5 239.0 260.7 304.9 371.8 1303 219.0 248.9 275.6 321.4 383.4 1304 207.3 242.0 266.7 310.0 375.4 1305 215.2 249.6 274.0 319.3 384.8 Mean 214.1 247.4 272.9 319.7 389.6 S.D 6.0 7.2 10.1 14.7 24.7 N 5 5 5 5 5 G4 / 2,500 1401 197.0 228.7 250.8 295.3 359.7 1402 218.9 248.4 282.1 332.0 401.5 1403 217.6 248.0 281.7 339.9 427.8 1404 215.4 252.9 273.0 309.9 383.1 1405 216.6 239.5 271.7 311.1 361.8 Mean 213.1 243.5 271.9 317.6 386.8 S.D 9.1 9.6 12.7 18.1 28.6 N 5 5 5 5 5 Abbreviations: N (number of animals), S.D (standard deviation) Significance of body weight between groups by analysis of variance with Dunnett’s test ( * p < 0.05). Table 3 Individual body weights in acute toxicity assessment (female) Sex: Female (g) Group / Dose (mg/kg) Animal ID Day 0 1 3 7 14 G1 / 0 2101 148.8 173.8 184.8 201.1 230.3 2102 156.9 171.3 187.9 206.4 237.2 2103 151.5 170.2 185.1 203.5 220.3 2104 153.5 179.2 188.9 205.7 230.8 2105 154.0 173.1 185.1 197.1 225.3 Mean 152.9 173.5 186.4 202.8 228.8 S.D 3.0 3.5 1.9 3.8 6.4 N 5 5 5 5 5 G2 / 625 2201 158.4 181.9 193.5 212.0 231.8 2202 155.7 180.5 192.3 216.2 243.4 2203 149.8 174.4 183.8 197.9 219.3 2204 152.7 174.2 184.8 201.1 218.3 2205 151.3 178.0 193.6 212.5 236.4 Mean 153.6 177.8 189.6 207.9 229.8 S.D 3.5 3.5 4.9 8.0 10.9 N 5 5 5 5 5 G3 / 1,250 2301 152.6 172.6 182.7 205.5 226.0 2302 154.2 181.2 192.8 208.4 233.6 2303 148.5 170.4 186.7 204.6 235.5 2304 149.4 173.7 186.9 211.0 229.9 2305 155.6 174.9 183.1 198.4 218.8 Mean 152.1 174.6 186.4 205.6 228.8 S.D 3.0 4.1 4.1 4.7 6.7 N 5 5 5 5 5 G4 / 2,500 2401 160.8 183.4 192.8 212.2 239.1 2402 151.8 175.6 185.7 204.4 221.1 2403 157.1 178.3 186.2 199.0 236.7 2404 152.1 174.2 181.4 197.5 234.0 2405 153.8 172.4 180.3 194.2 209.4 Mean 155.1 176.8 185.3 201.5 228.1 S.D 3.8 4.3 4.9 7.0 12.5 N 5 5 5 5 5 Abbreviations: N (number of animals), S.D (standard deviation) Significance of body weight between groups by analysis of variance with Dunnett’s test ( * p < 0.05). Bacterial reverse mutation test A bacterial reverse mutation test was conducted to assess the mutagenic potential of Hyunburikyung-tang on bacterial strains (TA98, TA100, TA1535, TA1537, and WP2 uvrA). Test acceptability was verified using negative and positive controls. The highest concentration tested was 5,000 µg/plate, in line with the OECD guidelines. The results findings were confirmed by performing two individual experiments encompassing a total of five concentrations at approximately half-log (√10) intervals. Hyunburikyung-tang was added to both frameshift-type strains (TA98 and TA1537) and basepair-substitution-type strains (TA100, TA1535, and WP2 uvrA), with and without metabolic activation. The findings are summarized in Tables 4 and 5 . Table 4 Results of the bacterial reverse mutation test without metabolic activation Strain Dose (µg/plate) Primary Secondary Colony Mean S.D Ratio Colony Mean S.D Ratio TA 98 0 10 16 18 15 4.2 [1.0] 18 13 12 14 3.2 [1.0] 61.7 18 13 11 14 3.6 [1.0] 13 13 13 13 0.0 [0.9] 185.2 16 11 15 14 2.6 [1.0] 13 11 17 14 3.1 [1.0] 555.6 10 14 19 14 4.5 [1.0] 17 12 14 14 2.5 [1.0] 1,666.7 15 20 14 16 3.2 [1.1] 20 11 14 15 4.6 [1.0] 5,000.0 14 18 17 16 2.1 [1.1] 16 15 15 15 0.6 [1.1] 2-NF (0.5) 154 145 156 152 5.9 [10.1] 143 118 156 139 19.3 [9.9] TA 100 0 81 87 94 87 6.5 [1.0] 73 89 77 80 8.3 [1.0] 61.7 88 72 85 82 8.5 [0.9] 81 73 77 77 4.0 [1.0] 185.2 72 95 77 81 12.1 [0.9] 73 73 78 75 2.9 [0.9] 555.6 76 94 78 83 9.9 [0.9] 74 86 77 79 6.2 [1.0] 1,666.7 73 88 93 85 10.4 [1.0] 78 87 79 81 4.9 [1.0] 5,000.0 100 76 86 87 12.1 [1.0] 87 83 76 82 5.6 [1.0] SA (1.0) 736 643 608 662 66.2 [7.6] 601 576 632 603 28.1 [7.5] TA 1535 0 15 20 18 18 2.5 [1.0] 14 19 16 16 2.5 [1.0] 61.7 19 18 12 16 3.8 [0.9] 17 14 16 16 1.5 [1.0] 185.2 19 20 13 17 3.8 [0.9] 17 19 14 17 2.5 [1.0] 555.6 15 20 13 16 3.6 [0.9] 20 18 14 17 3.1 [1.1] 1,666.7 12 18 19 16 3.8 [1.0] 14 15 18 16 2.1 [1.0] 5,000.0 20 19 15 18 2.6 [1.0] 19 19 16 18 1.7 [1.1] SA(1.0) 696 719 651 689 34.6 [38.3] 586 612 702 633 60.9 [39.6] TA 1537 0 9 7 5 7 2.0 [1.0] 6 9 9 8 1.7 [1.0] 61.7 6 8 7 7 1.0 [1.0] 9 8 5 7 2.1 [0.9] 185.2 8 6 6 7 1.2 [1.0] 8 6 8 7 1.2 [0.9] 555.6 8 8 6 7 1.2 [1.0] 7 8 6 7 1.0 [0.9] 1,666.7 7 9 9 8 1.2 [1.2] 6 7 6 6 0.6 [0.8] 5,000.0 7 7 8 7 0.6 [1.0] 7 9 8 8 1.0 [1.0] 9-AA(40.0) 218 195 159 191 29.7 [27.3] 128 129 101 119 15.9 [14.9] WP2 uvrA 0 43 40 44 42 2.1 [1.0] 43 39 43 42 2.3 [1.0] 61.7 44 42 43 43 1.0 [1.0] 47 45 49 47 2.0 [1.1] 185.2 52 48 52 51 2.3 [1.2] 46 46 42 45 2.3 [1.1] 555.6 47 45 52 48 3.6 [1.1] 43 41 47 44 3.1 [1.0] 1,666.7 46 53 54 51 4.4 [1.2] 49 49 50 49 0.6 [1.2] 5,000.0 46 53 53 51 4.0 [1.2] 47 52 52 50 2.9 [1.2] 4-NQO(0.5) 820 833 844 832 12.0 [19.8] 778 815 800 798 18.6 [19.0] Abbreviation:s S.D (standard deviation), 0: distilled water, 2-NF (2-nitrofluorene), SA (sodium azide), 9-AA (9-amincoacridine), 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) Ratio: Indicates the percentage of the mean value compared to the negative control value. Table 5 Results of the bacterial reverse mutation test with metabolic activation Strain Dose (µg/plate) Primary Secondary Colony Mean S.D Ratio Colony Mean S.D Ratio TA 98 0 16 25 20 20 4.5 [1.0] 24 15 18 19 4.6 [1.0] 61.7 23 20 20 21 1.7 [1.0] 12 22 16 17 5.0 [0.9] 185.2 17 24 19 20 3.6 [1.0] 23 21 17 20 3.1 [1.1] 555.6 18 17 24 20 3.8 [1.0] 19 24 20 21 2.6 [1.1] 1,666.7 20 16 21 19 2.6 [0.9] 24 18 25 22 3.8 [1.2] 5,000.0 17 20 19 19 1.5 [0.9] 21 20 21 21 0.6 [1.1] B[a]P (1.0) 103 108 111 107 4.0 [5.4] 131 107 91 110 20.1 [5.8] TA 100 0 77 77 90 81 7.5 [1.0] 91 99 76 89 11.7 [1.0] 61.7 78 72 83 78 5.5 [1.0] 102 88 96 95 7.0 [1.1] 185.2 83 89 72 81 8.6 [1.0] 98 82 96 92 8.7 [1.0] 555.6 74 88 73 78 8.4 [1.0] 87 79 102 89 11.7 [1.0] 1,666.7 85 78 88 84 5.1 [1.0] 81 98 83 87 9.3 [1.0] 5,000.0 80 93 79 84 7.8 [1.0] 88 81 86 85 3.6 [1.0] 2-AA (0.5) 532 591 424 516 84.7 [6.4] 558 584 549 564 18.2 [6.3] TA 1535 0 20 16 14 17 3.1 [1.0] 15 16 13 15 1.5 [1.0] 61.7 14 20 20 18 3.5 [1.1] 14 13 16 14 1.5 [1.0] 185.2 15 22 20 19 3.6 [1.1] 18 16 16 17 1.2 [1.1] 555.6 19 18 21 19 1.5 [1.2] 18 14 18 17 2.3 [1.1] 1,666.7 15 18 15 16 1.7 [1.0] 14 16 17 16 1.5 [1.1] 5,000.0 14 18 17 16 2.1 [1.0] 13 12 19 15 3.8 [1.0] 2-AA (2.0) 353 345 323 340 15.5 [20.0] 279 311 239 276 36.1 [18.4] TA 1537 0 9 9 10 9 0.6 [1.0] 19 19 23 20 2.3 [1.0] 61.7 10 8 9 9 1.0 [1.0] 21 22 18 20 2.1 [1.0] 185.2 8 8 9 8 0.6 [0.9] 26 15 16 19 6.1 [0.9] 555.6 10 10 8 9 1.2 [1.0] 21 19 17 19 2.0 [0.9] 1,666.7 7 10 10 9 1.7 [1.0] 21 18 24 21 3.0 [1.0] 5,000.0 7 10 11 9 2.1 [1.0] 19 17 26 21 4.7 [1.0] 2-AA (2.0) 282 272 299 284 13.7 [31.6] 300 320 328 316 14.4 [15.8] WP2 uvrA 0 46 48 47 47 1.0 [1.0] 51 50 47 49 2.1 [1.0] 61.7 48 40 46 45 4.2 [1.0] 49 46 45 47 2.1 [0.9] 185.2 48 46 48 47 1.2 [1.0] 53 48 47 49 3.2 [1.0] 555.6 47 42 44 44 2.5 [0.9] 44 46 47 46 1.5 [0.9] 1,666.7 49 43 49 47 3.5 [1.0] 45 48 52 48 3.5 [1.0] 5,000.0 43 49 51 48 4.2 [1.0] 47 50 54 50 3.5 [1.0] 2-AA (4.0) 193 172 177 181 11.0 [3.9] 229 226 198 218 17.1 [4.4] Abbreviations: SD (standard deviation), B[a]P (benzo[a]pyrene), 2-AA (2-aminoanthracene) Ratio: Indicates the percentage of the mean value compared to the negative control value Conventionally, the bacterial reverse mutation test yields a mutagenic response when colony numbers show a two-fold increase compared to the negative control or in cases where a dose-response relationship is evident. However, we observed that exposure of the bacterial strains to Hyunburikyung-tang, with/without metabolic activation, did not result in a colony count increase of more than two-fold. These findings suggest no mutagenic potential of Hyunburikyung-tang up to a dose of 5,000 µg/plate. Chromosomal aberration test The chromosomal aberration test aimed to assess whether exposure of CHL/IU cells to Hyunburikyung-tang induced chromosomal abnormalities. The highest concentration of the short-time exposure (6 h) and long-time exposure (24 h) without metabolic activation was set to 2,000 µg/mL, and a total of three concentrations were set as twofold intervals. The highest concentration of 2,000 µg/mL was excluded in short-term exposure with metabolic activation to prevent false positive results due to cytotoxicity. Following metabolic activation, Hyunburikyung-tang reduced the relative increase in cell count (RICC) to < 50% after short-term exposure. Therefore, the highest concentration for short-term exposure with metabolic activation was set at 1,000 µg/mL, with four concentrations set at two-fold intervals. We found that Hyunburikyung-tang did not cause medium precipitation or affect pH or osmotic pressure at all the concentrations listed in Table 6 . Statistical analysis revealed significant differences between positive and negative controls for all treatment groups ( p < 0.001). Hyunburikyung-tang exposure did not lead to structural chromosomal abnormalities during short-term or long-term exposure, with or without metabolic activation. Additionally, the Cochran–Armitage test indicated no significant concentration-response relationship. Therefore, Hyunburikyung-tang did not induce chromosomal aberrations under the present experimental conditions. Table 6 Results of the chromosomal aberration test Sort Dose (µg/mL) S9 mix Treatment- Recovery time pH Osmotic pressure RICC (%) Chromosome Chromatid Others Aberrant cell/ total cell Total Aberration (%) Del Exc Del Exc Distilled water 0 + 6–18 8.38 290 100.0 0 0 2 0 0 2/300 0.67 Test substance 125 + 6–18 8.20 286 78.4 0 0 1 0 1 2/300 0.67 250 8.18 291 76.3 0 0 3 0 0 3/300 1.00 500 8.10 288 69.8 1 0 2 0 0 2/300 0.67 1,000 8.26 283 63.3 0 0 0 1 0 1/300 0.33 B[a]P 20 + 6–18 8.28 455 69.8 4 -0 11 126 1 42/300 14.00 * Distilled water 0 - 6–18 8.39 268 100.0 0 0 0 0 0 0/300 0.00 Test substance 500 - 6–18 8.39 267 100.0 1 0 2 0 0 3/300 1.00 1,000 8.33 284 95.5 0 0 1 1 0 2/300 0.67 2,000 8.33 269 84.2 0 0 1 1 0 2/300 0.67 MMC 0.1 - 6–18 8.32 282 61.7 2 0 7 26 5 39/300 13.00 * Distilled water 0 - 24 − 0 8.37 260 100.0 1 0 0 1 0 2/300 0.67 Test substance 500 - 24 − 0 8.51 304 100.0 0 0 1 1 0 2/300 0.67 1,000 8.28 265 95.5 1 0 1 0 0 2/300 0.67 2,000 8.25 276 91.0 0 0 0 1 0 1/300 0.33 MMC 0.1 - 24 − 0 8.33 294 63.9 4 0 16 43 0 56/300 18.67 * Abbreviations: B[a]P (benzo[a]pyrene), MMC (mitomycin C), RICC (relative increase in cell count), Del (deletion), Exc (exchange), Others (fragmentation and multiple aberrations). Significance of total aberration between groups by Fisher’s exact test ( * p < 0.05). Micronucleus test The micronucleus test aimed to assess micronucleus formation in bone marrow following oral administration of Hyunburikyung-tang. Administration was performed for 2 days at 24 h intervals, and general symptoms due to Hyunburikyung-tang administration were observed immediately post-administration and before sacrifice. No weight changes or toxic signs were observed among the groups after Hyunburikyung-tang administration (Table 7 ). The PEC/NCE ratio was assessed to evaluate bone marrow toxicity. No differences in the PEC/NCE ratio were observed in the bone marrow of experimental animals, and the micronucleus frequency did not reach statistical significance. Therefore, twice-daily administration of Hyunburikyung-tang up to 2,000 mg/kg did not induce micronuclei formation. Table 7 Results of the micronucleus test Group / Dose (mg/kg) 1st dosing 2nd dosing Sacrifice mnPCE Frequency (%) PCE/(PCE + NCE) B.W G.S B.W G.S B.W G.S PCE NCE Ratio (%) G1 / 0 36.32 N 35.96 N 35.98 N 3 0.08 237 263 47.4 34.67 N 34.46 N 33.35 N 3 0.08 248 252 49.6 34.36 N 33.79 N 32.96 N 3 0.08 237 263 47.4 33.83 N 34.59 N 32.98 N 5 0.13 242 258 48.4 33.51 N 33.68 N 33.53 N 2 0.05 239 261 47.8 Mean 34.54 - 34.50 - 33.76 - 3.2 0.08 240.6 259.4 48.1 S.D 0.98 - 0.81 - 1.13 - 1.1 0.03 4.6 4.6 0.9 G2 / 500 36.28 N 34.95 N 35.39 N 2 0.05 242 258 48.4 34.68 N 35.47 N 35.38 N 1 0.03 233 267 46.6 34.20 N 34.56 N 35.38 N 1 0.03 233 267 46.6 33.88 N 34.27 N 34.11 N 2 0.05 246 254 49.2 33.40 N 32.67 N 33.24 N 3 0.08 242 258 48.4 Mean 34.49 - 34.38 - 34.70 - 1.8 0.05 239.2 260.8 47.8 S.D 0.99 - 0.95 - 0.88 - 0.8 0.02 5.9 5.9 1.2 G3 / 1,000 35.58 N 35.08 N 34.50 N 1 0.03 233 267 46.6 35.15 N 35.24 N 35.54 N 2 0.05 246 254 49.2 34.13 N 33.42 N 32.68 N 5 0.13 239 261 47.8 33.92 N 33.33 N 32.62 N 3 0.08 237 263 47.4 33.26 N 32.40 N 31.60 N 3 0.08 241 259 48.2 Mean 34.41 - 33.89 - 33.39 - 2.8 0.07 239.2 260.8 47.8 S.D 0.84 - 1.09 - 1.43 - 1.5 0.04 4.8 4.8 1.0 G4 / 2,000 35.57 N 35.22 N 34.13 N 3 0.08 242 258 48.4 35.17 N 35.02 N 33.56 N 4 0.10 239 261 47.8 34.08 N 34.35 N 33.67 N 2 0.05 242 258 48.4 33.93 N 34.01 N 33.12 N 1 0.03 232 268 46.4 33.00 N 33.45 N 32.13 N 6 0.15 241 259 48.2 Mean 34.35 - 34.41 - 33.32 - 3.2 0.08 239.2 260.8 47.8 S.D 0.92 - 0.65 - 0.68 - 1.9 0.05 4.2 4.2 0.8 G5 / MMC 2 35.38 N 34.58 N 34.30 N 458 11.5 147 353 29.4 35.30 N 35.94 N 34.01 N 430 10.8 152 348 30.4 34.07 N 34.54 N 32.63 N 403 10.1 160 340 32.0 34.01 N 34.45 N 34.02 N 479 12.0 162 338 32.4 32.87 N 33.08 N 32.11 N 433 10.8 144 356 28.8 Mean 34.33 - 34.52 - 33.41 - 440.6 11.02 * 153.0 347.0 30.6 S.D 0.93 - 0.91 - 0.87 - 29.0 0.72 7.9 7.9 1.6 Abbreviations: B.W (body weights), G.S (general symptoms), mnPCE (micronucleated polychromatic erythrocytes), PCE (polychromatic erythrocytes), NCE (normochromatic erythrocytes). mnPCE frequency in 4,000 PCE per animal Significance of frequency between groups by Dunnett’s test ( * p < 0.05). Discussion In this study, the acute toxicity and genotoxicity of Hyunburikyung-tang were evaluated using bacteria, cells, and rodents. Previous toxicity studies have reported side effects associated with medicinal plants or ingredients found in Hyunburikyung-tang. Some medicinal plants are known to induce side effects such as teratogenicity, dyspnea, and arrhythmia in non-clinical studies and acute headaches, weakness, and dry mouth in clinical studies [ 24 – 31 ]. Peach seeds contain components such as tocopherols, cyanogenic glycosides, and carotenoids, which are experimentally reported to have anti-inflammatory, anti-oxidative, and anti-cancer effects. However, peach seeds also contain amygdalin (laetrile), which is known to cause toxicity [ 32 ]. Oral administration of amygdalin to humans causes cyanide poisoning, and combined administration with vitamin C decreases cysteine ​​levels in the body and inhibits the detoxification effect of amygdalin [ 33 ]. Moreover, teratogenic effects have been reported with oral but not intravenous administration in animal studies [ 33 ]. Malformations can result from various mechanisms, including oxidative stress, endocrine disruption, or enzyme-mediated induction. Genotoxicity is interconnected to teratogenicity and can arise from various mechanisms including oxidative stress and enzyme-mediated activation [ 35 – 37 ]. Multiple non-clinical studies have demonstrated the potential effect of genotoxicity induced in the parent generation on offspring; therefore, evaluating the safety, including genotoxicity, of consumed drugs and foods is crucial [ 38 – 42 ]. Amygdalin is hydrolyzed by beta-glucuronidase and converted to cyanide in the small intestine, and a 500 mg oral dose is reported to contain up to 30 mg of cyanide. Cyanide toxicity causes cell death by interfering with mitochondrial oxygen utilization. Cyanide binds to the ferric ion of cytochrome oxidase, inhibiting electron transport and oxidation mechanisms and causing hypoxia and lactic acidosis [ 43 ]. Hypoxia and lactic acidosis are related to genotoxicity. Reactive oxygen species caused by hypoxia can cause genotoxicity, and lactic acidosis, which is a tumor microenvironment factor, causes instability of mitotic chromosomes with concomitant glucose deficiency, resulting in centrosome amplification, micronuclei, or aneuploidy [ 44 , 45 ]. The bacterial reverse mutation test, in vitro chromosome aberration test, and in vivo micronucleus test are standard methods for evaluating genotoxicity. The bacterial reverse mutation test detects point mutations, including DNA base or base pair additions, deletions, or substitutions [ 46 ]. Such mutations are implicated in numerous genetic diseases, and evidence suggests that mutations in somatic cell tumor suppressor genes and oncogenes contribute to tumor formation in animals and humans [ 47 ]. Chromosomal abnormalities and micronuclei are commonly associated with cancer development [ 48 , 49 ]. Benzo[a]pyrene is hydrolyzed by beta-glucuronidase and causes genotoxicity only if metabolic activation occurs [ 50 ]. Amygdalin, which is similar to benzo[a]pyrene, is hydrolyzed by beta-glucuronidase and causes cyanide toxicity. Standard testing methods for genotoxicity evaluation were performed in this study, with no mutagenesis or genotoxicity observed with the administration of metabolic-activated Hyunburikyung-tang. Safflower ( Carthamus tinctorius Linn) affects developmental stages in mice and causes structural abnormalities in the placenta; however, the mechanisms of these effects remain unknown [ 51 ]. No genotoxicity was induced by treatment with Hyunburikyung-tang; however, a chromosomal aberration test confirmed that the cell toxicity increased with metabolic activation. Zebrafish models exposed to safflower extract were reported to have increased levels of antioxidant-related proteins and malonaldehyde (MDA) [ 51 ] Malondialdehyde is a byproduct of lipid oxidation and an indicator of oxidative stress. Oxidative stress damages the syncytial trophoblast membrane, weakens placental function, and adversely affects uterine and embryonic development [ 52 – 54 ]. Hyunburikyung-tang containing safflower did not induce genotoxicity in this study; nevertheless, further studies are required to determine whether it can induce oxidative stress with metabolic activation. An acute toxicity assessment was conducted to determine the lethal dose and potential side effects following a single dose [ 55 ]. In this study, several endpoints were measured to confirm the genotoxicity and acute toxicity of Hyunburikyung-tang, and no toxic reactions were observed. Based on our findings, the approximate lethal dose of Hyunburikyung-tang was expected to exceed 2,500 mg/kg in both male and female rats. Furthermore, Hyunburikyung-tang did not appear to induce genotoxicity under these test conditions. We anticipate that the findings from this study will serve as fundamental data for subsequent toxicity tests and provide non-clinical safety information for Hyunburikyung-tang. Conclusions In summary, Hyunburikyung-tang, a traditional medical prescription commonly used clinically for dysmenorrhea due to its anti-inflammatory effects, is potentially dangerous because it contains safflower and peach seeds, which are known to cause deformities. Hyunburikyung-tang did not cause acute toxicity or genotoxicity under the test conditions; however, increased cytotoxicity was observed with metabolic activation in an in vitro chromosomal aberration test. Safflower extract has potential teratogenic effects and is known to increase oxidative stress, which can weaken placental function and adversely affect embryonic development. Therefore, additional research is required to determine whether Hyunburikyung-tang causes oxidative stress or affects embryonic development. Abbreviations ANOVA Analysis of Variance GLP Good laboratory practice GMP Good manufacturing practice IACUC Institutional animal care and use committee MGA Minimal glucose agar mnPCE Micronucleated polychromatic erythrocyte NCE Normochromatic erythrocyte PCE Polychromatic erythrocyte RICC Relative increase in cell count SD Sprague Dawley SPF Specific pathogen fr Declarations Ethics approval and consent to participate The experiment for acute toxicity assessment was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of a Korean medicine non-clinical study center [Approval number: NIKOM-2022-07 (Acute toxicity assessment), NIKOM-2022-29 (Micronucleus test)]. All researchers participating in animal experiments complied with the standards for laboratory animal care. Consent for publication. Not applicable Availability of data and materials All data generated during this study are included in this article. Competing interests The authors declare no competing interests. Funding This work was supported by the GLP center construction business of Korean Traditional medicine (Ministry of Health and Welfare, Republic of Korea) to contribute evidence for the safe use of oriental medicine (Korea Health Industry Development Institute, RS-2023-KH139577) Authors’ contributions NJH designed the study; NJH, CSY, and HSM performed genotoxicity assessment; NJH and CSY wrote the manuscript; KJS performed acute toxicity assessment; KSY and CHW performed manuscript proofreading; WKW conducted test substance preparation; and CHW supervised the project. All authors approved the final manuscript. Acknowledgments Not applicable References Tataj-Puzyna U, Ilczuk P, Kalita-Kurzyńska K, Gotlib J. Women's experiences of dysmenorrhoea-preliminary study. Prz Menopauzalny. 2021;20:133-9. Lghoul S, Loukid M, Hilali MK. Prevalence and predictors of dysmenorrhea among a population of adolescent's schoolgirls (Morocco). Saudi J Biol Sci. 2020;27:1737-42. 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Cite Share Download PDF Status: Under Review Version 1 posted Editorial decision: Revision requested 26 Jun, 2024 Editor assigned by journal 26 Jun, 2024 Submission checks completed at journal 24 Jun, 2024 First submitted to journal 06 Jun, 2024 You are reading this latest preprint version Research Square lets you share your work early, gain feedback from the community, and start making changes to your manuscript prior to peer review in a journal. As a division of Research Square Company, we’re committed to making research communication faster, fairer, and more useful. We do this by developing innovative software and high quality services for the global research community. Our growing team is made up of researchers and industry professionals working together to solve the most critical problems facing scientific publishing. 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Studies indicate that 78% of young women experience menstrual pain, which negatively impacts their quality of life [\u003cspan citationid=\"CR2\" class=\"CitationRef\"\u003e2\u003c/span\u003e, \u003cspan citationid=\"CR3\" class=\"CitationRef\"\u003e3\u003c/span\u003e]. The resultant decrease in academic or work efficiency among women due to menstrual pain results in socioeconomic loss. Modern medical research suggests that dysmenorrhea results from reduced intrauterine blood flow caused by uterine contractions. Studies have shown an increased ratio of prostaglandin F2a to prostaglandin E2 (PGE\u003csub\u003e2\u003c/sub\u003e) and vasopressin in the plasma of women with dysmenorrhea, indicating that these substances may be linked to uterine contractions and menstrual pain. The use of anti-prostaglandins alleviates pain in approximately 80% of affected women, highlighting the role of prostaglandins and vasopressin in dysmenorrhea [\u003cspan additionalcitationids=\"CR5\" citationid=\"CR4\" class=\"CitationRef\"\u003e4\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR6\" class=\"CitationRef\"\u003e6\u003c/span\u003e].\u003c/p\u003e \u003cp\u003eSeveral medications have been formulated to mitigate menstrual pain, e.g., prostaglandin synthase inhibitors, which offer analgesic and anti-inflammatory effects. However, these are not effective for all women (20\u0026ndash;25%), and their prolonged use can result in side effects, such as liver, kidney, and gastrointestinal complications [\u003cspan citationid=\"CR7\" class=\"CitationRef\"\u003e7\u003c/span\u003e]. Oral contraceptives are not an option for women seeking pregnancy and may cause side effects including nausea, vomiting, and swelling with long-term use [\u003cspan citationid=\"CR8\" class=\"CitationRef\"\u003e8\u003c/span\u003e]. Gonadotropin-releasing hormone agonists may induce menopausal symptoms, reduce bone mineral density, and elevate the risk of coronary artery disease [\u003cspan citationid=\"CR9\" class=\"CitationRef\"\u003e9\u003c/span\u003e]. Among tocolytics, nitroglycerin is weakly effective for suppressing menstrual pain and causes side effects such as headaches. Nifedipine can effectively suppress menstrual pain but may lead to side effects such as facial redness, tachycardia, and pain [\u003cspan citationid=\"CR10\" class=\"CitationRef\"\u003e10\u003c/span\u003e, \u003cspan citationid=\"CR11\" class=\"CitationRef\"\u003e11\u003c/span\u003e].\u003c/p\u003e \u003cp\u003eHyunburikyung-tang, a traditional prescription, suppresses PGE\u003csub\u003e2\u003c/sub\u003e and pro-inflammatory cytokines, and combined administration with piroxicam, a drug used for menstrual pain, is reported to increase the anti-inflammatory effect [\u003cspan citationid=\"CR12\" class=\"CitationRef\"\u003e12\u003c/span\u003e]. Hyunburikyung-tang is widely recognized as a treatment for dysmenorrhea and menstrual disorders, improves visual analog scale (VAS) scores and multidimensional verbal rating scale (MVRS) scores, and is frequently used in clinical settings [\u003cspan additionalcitationids=\"CR14 CR15\" citationid=\"CR13\" class=\"CitationRef\"\u003e13\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR16\" class=\"CitationRef\"\u003e16\u003c/span\u003e]. However, Hyunburikyung-tang is potentially dangerous because it contains peach seeds (\u003cem\u003ePrunus persica\u003c/em\u003e Batsch), which are known to cause deformities, and safflower (Carthamus tinctorius Linn), which is known to be toxic to the testes and embryos [\u003cspan additionalcitationids=\"CR18\" citationid=\"CR17\" class=\"CitationRef\"\u003e17\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR19\" class=\"CitationRef\"\u003e19\u003c/span\u003e]. Multiple studies have demonstrated that genotoxicity and teratogenicity are interconnected. Various parental factors, such as lifestyle habits, environmental toxin exposure, smoking, and alcohol consumption, can induce genotoxic effects in reproductive cells, potentially leading to congenital abnormalities in offspring [\u003cspan additionalcitationids=\"CR21 CR22\" citationid=\"CR20\" class=\"CitationRef\"\u003e20\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR23\" class=\"CitationRef\"\u003e23\u003c/span\u003e]. Therefore, we aimed to determine whether Hyunburikyung-tang causes genotoxicity or acute toxicity and provide safety information.\u003c/p\u003e"},{"header":"Materials and methods","content":"\u003cp\u003e \u003cb\u003eSamples and extraction.\u003c/b\u003e \u003c/p\u003e \u003cp\u003eHyunburikyung-tang was purchased from the Hocburi (The facility standard of herbal dispensaries, Gyeonggi Province, Korea), composed of 15 medicinal plants. Medicinal plants used in the preparation of Hyunburikyung-tang were analyzed by Good Manufacturing Practice (GMP)-certified pharmaceutical companies to determine whether they met the acceptance criteria of the Korean pharmacopoeia (KP) and Korean herbal pharmacopoeia (KHP) of the Korea Ministry of Food and Drug Safety (MFDS). Medicinal plants that were confirmed to meet the legal acceptance criteria were used for extraction (see Table\u0026nbsp;\u003cspan refid=\"Tab1\" class=\"InternalRef\"\u003e1\u003c/span\u003e for composition and analysis data).\u003c/p\u003e \u003cp\u003e \u003cdiv class=\"gridtable\"\u003e\u003ctable float=\"Yes\" id=\"Tab1\" border=\"1\"\u003e \u003ccaption language=\"En\"\u003e \u003cdiv class=\"CaptionNumber\"\u003eTable 1\u003c/div\u003e \u003cdiv class=\"CaptionContent\"\u003e \u003cp\u003eComposition and analysis data of Hyunburikyung-tang\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003c/caption\u003e \u003ccolgroup cols=\"15\"\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c1\" colnum=\"1\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c2\" colnum=\"2\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c3\" colnum=\"3\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c4\" 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persica\u003c/em\u003e Batsch\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eSemen\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e3.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e6.1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eSouth Africa\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e4.7\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e2.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eAmygdalin\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e2.400\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.10\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eB\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e3\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eAucklandia lappa\u003c/em\u003e Decne.\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eradix\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e2.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e4.2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eChina\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e3.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e8.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eCostunolide+\u003c/p\u003e \u003cp\u003eDehydrocostus lactone\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e7.130\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.13\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eB\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eZingiber officinale\u003c/em\u003e Roscoe.\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eRhizoma Recens\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e1.5\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e2.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eKorea\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e1.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e1.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eA\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e5\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eCurcuma zedoaria\u003c/em\u003e (Berg.) Rosc\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eRhizoma\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e3.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e6.1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eChina\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e4.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e2.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;4.92\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eB\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eLindera strichnifolia\u003c/em\u003e Fernandez-Villar\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eRadix\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e5.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e9.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eChina\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e0.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e11.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e\u0026nbsp;\u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;1.16\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eB\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e7\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eCinnamomum cassia\u003c/em\u003e Blume\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eCortex Interior\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e2.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e4.2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eVietnam\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e2.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e4.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eCinnamic acid\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e0.100\u003c/p\u003e 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colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e2.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e3.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eAlbiflorin+\u003c/p\u003e \u003cp\u003ePaeoniflorin\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e3.800\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eA\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e9\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eCitrus aurantium\u003c/em\u003e Linn\u0026eacute;\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eFructus Immaturus\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e3.9\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e6.3\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eChina\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e2.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e5.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e 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\u003cp\u003eKorea\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e2.2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e7.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eHesperidin\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e14.300\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eB\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e11\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eAtractylodes lancea\u003c/em\u003e De Candlle\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eRhizoma\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e5.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e9.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eChina\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e5.2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e6.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e 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colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eA\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e14\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eCorydalis ternata\u003c/em\u003e Nakai\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eTuber\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e3.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e6.1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eChina\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e2.2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e6.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eCoptisine+\u003c/p\u003e \u003cp\u003eTetrahydropalmatine\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e0.410\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.01\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eA\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e15\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cem\u003eCarthamus tinctorius\u003c/em\u003e Linn\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eFlos\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e2.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e4.2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eChina\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eSuitable\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e7.1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e15.2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eKaempferol\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e0.094\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e\u0026lt;\u0026thinsp;0.30\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eN.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c15\"\u003e \u003cp\u003eA\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"3\" nameend=\"c3\" namest=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e62.3\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e100.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"10\" nameend=\"c15\" namest=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003c/tbody\u003e \u003c/colgroup\u003e \u003ctfoot\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"15\"\u003eAbbreviations: N (number), N.D (non-detection), Suitable (suitability with Korean herbal standards)\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"15\"\u003eHeavy metals: Sum of lead (Pb), cadmium (Cd), arsenic (As), and mercury (Hg)\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"15\"\u003ePesticide residues: Total DDT, dieldrin, methoxychlor, total BHC, azocyclotin, azoxystrobin, aldrin, endosulfan, endrin, tebuconazole, pendimethalin, fenpropathrin, sethoxydim, fluazifop-butyl, etc.\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"15\"\u003eCompany: Hando pharmaceuticals (A, Gyeonggi Province, Korea), Hyeongyoul pharmaceuticals (B, Gyeonggi Province, Korea).\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003c/tfoot\u003e \u003c/table\u003e\u003c/div\u003e \u003c/p\u003e \u003cp\u003eThe preparation involved the addition of distilled water at 10 times the weight of the herbal materials, extraction at 115\u0026deg;C for 4 h, and filtration through a nonwoven material. The extract was subsequently concentrated to 10\u0026deg;Bx at 120\u0026deg;C and sterilized at 100\u0026deg;C for 30 min. The sterile extract was spray-dried into powder form, dissolved at appropriate concentrations, and utilized in the experiments.\u003c/p\u003e \u003cdiv id=\"Sec3\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eBreeding and environmental conditions\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eThe specific pathogen-free animal facility used in this study was maintained at a temperature of 22\u0026thinsp;\u0026plusmn;\u0026thinsp;3\u0026deg;C, humidity of 30\u0026ndash;70%, noise\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;60 dB, ammonia concentration\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;20 ppm, and a 12-hour light-dark cycle with 150\u0026ndash;300 lux.\u003c/p\u003e \u003cp\u003eThe room received over 10 air changes per h of HEPA-filtered air and was cleaned with a disinfectant daily. Rats were housed individually in stainless steel cages for acute toxicity assessments, whereas mice for the in vivo micronucleus test were housed five per group in polycarbonate cages, with cages and water bottles replaced at least twice weekly. The rodents had free access to solid feed (PMI LabDiet\u0026reg; 5053) and UV-disinfected, reverse osmosis-purified water in polycarbonate bottles.\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec4\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eAcute toxicity assessment\u003c/h2\u003e \u003cp\u003e The acute toxicity assessment was authorized by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the Korean Medicine Non-clinical Study Center (Approval number: NIKOM-2022-07) and the steering committee of the Good Laboratory Practice (Approval study number: N22006).\u003c/p\u003e \u003cp\u003eSix-week-old Sprague-Dawley (SD) rats from Orient Bio (Gyeonggi Province, Korea) were acclimatized for five days and randomly assigned to the following groups: negative control (distilled water) group and low-dose (625 mg/kg), medium-dose (1,250 mg/kg), and high-dose (2,500 mg/kg) groups (5 per male and female group, total 50 animals). Test substances were administered after a 12 h fast, excluding water, using a sonde attached to a syringe. Feed was reintroduced 4 h post-administration.\u003c/p\u003e \u003cp\u003eGeneral symptoms and mortality were assessed shortly after dosing and daily thereafter until autopsy. Body weights were recorded on the day of administration and days 1, 3, 7, and 14 post-administration. Surviving animals were humanely euthanized with CO\u003csub\u003e2\u003c/sub\u003e, followed by a thorough autopsy to examine organs.\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec5\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eBacterial reverse mutation test\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eThe bacterial reverse mutation test was conducted following the OECD TG 471 guidelines using five strains: Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537, and Escherichia coli WP2 uvrA (MOLTOX, USA). Groups included a negative control, a positive control, and test substance treatment groups (61.7, 185.2, 555.6, 1,666.7, and 5,000 \u0026micro;g/plate). Three plates per group or concentration were used. The materials included 0.1 mL of the test substance or solvent, S9 mix for metabolic activation or phosphate buffer for no metabolic activation, 0.5 mL of strain culture, and 2 mL of top agar. These materials were mixed and incubated at 120 rpm and 37\u0026deg;C for 20 min, plated on minimal glucose agar (MGA) plates, and incubated for 48 h. Colonies were counted visually after the completion of the incubation period.\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec6\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eChromosomal aberration test\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eChromosomal aberration tests were conducted following OECD TG 473 guidelines using Chinese hamster lung (CHL/IU) cells. Cells were plated at a density of 5\u0026times;10\u003csup\u003e5\u003c/sup\u003e cells/mL, cultured overnight in a 60 mm dish, and treated in duplicates for either 6 h (with or without metabolic activation) or 24 h (without metabolic activation). Following the 6 h treatment, cells were replenished with a normal medium devoid of the test substance and further incubated for 18 h. Two hours prior to harvesting, cells were treated with colcemid for 2 h and collected in a KCl solution. After fixation with an acetic acid/methanol solution (1:3), cells were stained with a 5% Giemsa solution. The number of cells exhibiting chromosomal aberrations per 300 cells was determined using two slide glasses obtained from each cell culture dish.\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec7\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eMicronucleus test\u003c/h2\u003e \u003cp\u003e The micronucleus test was conducted following OECD TG 474 guidelines and approved by the IACUC of the Korean Medicine Non-clinical Study Center (Approval number: NIKOM-2022-29) and the steering committee of the Good Laboratory Practice (Approval study number: T22043).\u003c/p\u003e \u003cp\u003eSix-week-old Institute of Cancer Research (ICR) mice were procured from Orient Bio (Gyeonggi Province, Korea) and acclimatized for five days. Five male mice (5 per group, total 25 animals) were allocated to the concurrent negative control group (distilled water without the test substance), concurrent positive control group (Mitomycin C), low-dose group (500 mg/kg), medium-dose group (1,000 mg/kg), and high-dose group (2,000 mg/kg). Hyunburikyung-tang was orally administered daily for two days. The concurrent positive control group received intraperitoneal injections of mitomycin C (2 mg/kg) 24 h before euthanasia. Animals were euthanized 24 h after the last administration, and bone marrow was collected by perfusion of the femur with fetal bovine serum. Cells were plated onto glass slides and stained with a 5% Giemsa solution following methanol fixation. The number of micronucleated polychromatic erythrocytes (mnPCE) per 4,000 PCE was determined using two slides per mouse.\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec8\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eStandards for humane euthanasia\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eThe humane endpoints should be considered when experimental animals experience severe suffering and pain or are imminent at death, and detailed symptoms are as follows. (1) When unable to consume water or food, or recumbency, convulsions, or tremors. (2) When observed continuously pain, vocalization or self-mutilation\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec9\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eStatistical analysis\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eWeight measurement results in the acute toxicity assessment were expressed as means and standard deviations. Statistical analysis between groups was conducted using SPSS Statistics 25 (IBM Corp., Armonk, N.Y., USA). The significance of body weight differences among groups was assessed via one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett\u0026rsquo;s test (\u003cem\u003ep\u003c/em\u003e\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;0.05). Fisher\u0026rsquo;s exact test was utilized in the chromosomal aberration test. Dunnett\u0026rsquo;s test was used in the micronucleus test to compare the frequency of micronucleus formation between the negative control group and the Hyunburikyung-tang treated or positive control groups. The Cochran\u0026ndash;Armitage test was used to assess the concentration-response relationship among the groups, excluding the negative and positive control groups.\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e"},{"header":"Results","content":"\u003cdiv id=\"Sec11\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eAcute toxicity assessment\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eWe assessed standard acute toxicity indicators to determine the acute toxicity of orally administered Hyunburikyung-tang in male and female rats, including body weight, general symptoms, and autopsy findings. No statistically significant difference in body weight was observed after a single administration of Hyunburikyung-tang. Detailed individual weights are presented in Tables\u0026nbsp;\u003cspan refid=\"Tab2\" class=\"InternalRef\"\u003e2\u003c/span\u003e and \u003cspan refid=\"Tab3\" class=\"InternalRef\"\u003e3\u003c/span\u003e. Moreover, no toxicological responses were observed regarding general symptoms 14 days post-administration, including appearance, body position, consciousness, behavior, and nervous system symptoms. Autopsy examination, which included assessment of systemic organs such as the liver, heart, kidneys, and testes (data not shown), showed no signs of abnormal reactions.\u003c/p\u003e \u003cp\u003e \u003cdiv class=\"gridtable\"\u003e\u003ctable float=\"Yes\" id=\"Tab2\" border=\"1\"\u003e \u003ccaption language=\"En\"\u003e \u003cdiv class=\"CaptionNumber\"\u003eTable 2\u003c/div\u003e \u003cdiv class=\"CaptionContent\"\u003e \u003cp\u003eIndividual body weights in acute toxicity assessment (male)\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003c/caption\u003e \u003ccolgroup cols=\"10\"\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c1\" colnum=\"1\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c2\" colnum=\"2\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c3\" colnum=\"3\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c4\" colnum=\"4\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c5\" colnum=\"5\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c6\" colnum=\"6\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c7\" colnum=\"7\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c8\" colnum=\"8\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c9\" colnum=\"9\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c10\" colnum=\"10\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cthead\u003e \u003ctr\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003eSex: Male\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e\u0026nbsp;\u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e\u0026nbsp;\u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c5\" namest=\"c4\"\u003e\u0026nbsp;\u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c7\" 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(\u003csup\u003e*\u003c/sup\u003e\u003cem\u003ep\u003c/em\u003e\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;0.05).\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003c/tfoot\u003e \u003c/table\u003e\u003c/div\u003e \u003c/p\u003e \u003cp\u003e \u003cdiv class=\"gridtable\"\u003e\u003ctable float=\"Yes\" id=\"Tab3\" border=\"1\"\u003e \u003ccaption language=\"En\"\u003e \u003cdiv class=\"CaptionNumber\"\u003eTable 3\u003c/div\u003e \u003cdiv class=\"CaptionContent\"\u003e \u003cp\u003eIndividual body weights in acute toxicity assessment (female)\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003c/caption\u003e \u003ccolgroup cols=\"10\"\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c1\" colnum=\"1\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c2\" colnum=\"2\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c3\" colnum=\"3\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c4\" colnum=\"4\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv 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align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c4\" namest=\"c3\"\u003e \u003cp\u003e5\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c6\" namest=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e5\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c8\" namest=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e5\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e5\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e5\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003c/tbody\u003e \u003c/colgroup\u003e \u003ctfoot\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"10\"\u003eAbbreviations: N (number of animals), S.D (standard deviation)\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"10\"\u003eSignificance of body weight between groups by analysis of variance with Dunnett\u0026rsquo;s test (\u003csup\u003e*\u003c/sup\u003e\u003cem\u003ep\u003c/em\u003e\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;0.05).\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003c/tfoot\u003e \u003c/table\u003e\u003c/div\u003e \u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec12\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eBacterial reverse mutation test\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eA bacterial reverse mutation test was conducted to assess the mutagenic potential of Hyunburikyung-tang on bacterial strains (TA98, TA100, TA1535, TA1537, and WP2 uvrA). Test acceptability was verified using negative and positive controls. The highest concentration tested was 5,000 \u0026micro;g/plate, in line with the OECD guidelines. The results findings were confirmed by performing two individual experiments encompassing a total of five concentrations at approximately half-log (\u0026radic;10) intervals. Hyunburikyung-tang was added to both frameshift-type strains (TA98 and TA1537) and basepair-substitution-type strains (TA100, TA1535, and WP2 uvrA), with and without metabolic activation. The findings are summarized in Tables\u0026nbsp;\u003cspan refid=\"Tab4\" class=\"InternalRef\"\u003e4\u003c/span\u003e and \u003cspan refid=\"Tab5\" class=\"InternalRef\"\u003e5\u003c/span\u003e.\u003c/p\u003e \u003cp\u003e \u003cdiv class=\"gridtable\"\u003e\u003ctable float=\"Yes\" id=\"Tab4\" border=\"1\"\u003e \u003ccaption language=\"En\"\u003e \u003cdiv class=\"CaptionNumber\"\u003eTable 4\u003c/div\u003e \u003cdiv class=\"CaptionContent\"\u003e \u003cp\u003eResults of the bacterial reverse mutation test without metabolic activation\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003c/caption\u003e \u003ccolgroup cols=\"14\"\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c1\" colnum=\"1\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c2\" colnum=\"2\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c3\" colnum=\"3\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c4\" 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\u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eStrain\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eDose\u003c/p\u003e \u003cp\u003e(\u0026micro;g/plate)\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"6\" nameend=\"c8\" namest=\"c3\"\u003e \u003cp\u003ePrimary\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"6\" nameend=\"c14\" namest=\"c9\"\u003e \u003cp\u003eSecondary\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"3\" nameend=\"c5\" namest=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eColony\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003eMean\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eS.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003eRatio\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colspan=\"3\" nameend=\"c11\" namest=\"c9\"\u003e \u003cp\u003eColony\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003eMean\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003eS.D\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003eRatio\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\" morerows=\"6\" rowspan=\"7\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003eTA\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e98\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003e10\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e16\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e18\u003c/p\u003e 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colspan=\"14\"\u003e4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO)\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"14\"\u003eRatio: Indicates the percentage of the mean value compared to the negative control value.\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003c/tfoot\u003e \u003c/table\u003e\u003c/div\u003e \u003c/p\u003e \u003cp\u003e \u003cdiv class=\"gridtable\"\u003e\u003ctable float=\"Yes\" id=\"Tab5\" border=\"1\"\u003e \u003ccaption language=\"En\"\u003e \u003cdiv class=\"CaptionNumber\"\u003eTable 5\u003c/div\u003e \u003cdiv class=\"CaptionContent\"\u003e \u003cp\u003eResults of the bacterial reverse mutation test with metabolic activation\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003c/caption\u003e \u003ccolgroup cols=\"14\"\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c1\" colnum=\"1\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c2\" colnum=\"2\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c3\" 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\u003ctfoot\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"14\"\u003eAbbreviations: SD (standard deviation), B[a]P (benzo[a]pyrene), 2-AA (2-aminoanthracene)\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"14\"\u003eRatio: Indicates the percentage of the mean value compared to the negative control value\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003c/tfoot\u003e \u003c/table\u003e\u003c/div\u003e \u003c/p\u003e \u003cp\u003eConventionally, the bacterial reverse mutation test yields a mutagenic response when colony numbers show a two-fold increase compared to the negative control or in cases where a dose-response relationship is evident. However, we observed that exposure of the bacterial strains to Hyunburikyung-tang, with/without metabolic activation, did not result in a colony count increase of more than two-fold. These findings suggest no mutagenic potential of Hyunburikyung-tang up to a dose of 5,000 \u0026micro;g/plate.\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec13\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eChromosomal aberration test\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eThe chromosomal aberration test aimed to assess whether exposure of CHL/IU cells to Hyunburikyung-tang induced chromosomal abnormalities. The highest concentration of the short-time exposure (6 h) and long-time exposure (24 h) without metabolic activation was set to 2,000 \u0026micro;g/mL, and a total of three concentrations were set as twofold intervals. The highest concentration of 2,000 \u0026micro;g/mL was excluded in short-term exposure with metabolic activation to prevent false positive results due to cytotoxicity. Following metabolic activation, Hyunburikyung-tang reduced the relative increase in cell count (RICC) to \u0026lt;\u0026thinsp;50% after short-term exposure. Therefore, the highest concentration for short-term exposure with metabolic activation was set at 1,000 \u0026micro;g/mL, with four concentrations set at two-fold intervals.\u003c/p\u003e \u003cp\u003eWe found that Hyunburikyung-tang did not cause medium precipitation or affect pH or osmotic pressure at all the concentrations listed in Table\u0026nbsp;\u003cspan refid=\"Tab6\" class=\"InternalRef\"\u003e6\u003c/span\u003e. Statistical analysis revealed significant differences between positive and negative controls for all treatment groups (\u003cem\u003ep\u003c/em\u003e\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;0.001). Hyunburikyung-tang exposure did not lead to structural chromosomal abnormalities during short-term or long-term exposure, with or without metabolic activation. Additionally, the Cochran\u0026ndash;Armitage test indicated no significant concentration-response relationship. Therefore, Hyunburikyung-tang did not induce chromosomal aberrations under the present experimental conditions.\u003c/p\u003e \u003cp\u003e \u003cdiv class=\"gridtable\"\u003e\u003ctable float=\"Yes\" id=\"Tab6\" border=\"1\"\u003e \u003ccaption language=\"En\"\u003e \u003cdiv class=\"CaptionNumber\"\u003eTable 6\u003c/div\u003e \u003cdiv class=\"CaptionContent\"\u003e \u003cp\u003eResults of the chromosomal aberration test\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003c/caption\u003e \u003ccolgroup cols=\"14\"\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c1\" colnum=\"1\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c2\" colnum=\"2\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c3\" colnum=\"3\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c4\" colnum=\"4\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c5\" colnum=\"5\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c6\" colnum=\"6\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c7\" colnum=\"7\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c8\" colnum=\"8\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c9\" colnum=\"9\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c10\" colnum=\"10\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c11\" colnum=\"11\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c12\" colnum=\"12\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c13\" colnum=\"13\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c14\" colnum=\"14\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cthead\u003e \u003ctr\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c1\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eSort\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c2\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eDose\u003c/p\u003e \u003cp\u003e(\u0026micro;g/mL)\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c3\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eS9\u003c/p\u003e \u003cp\u003emix\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c4\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eTreatment-\u003c/p\u003e \u003cp\u003eRecovery time\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c5\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003epH\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c6\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eOsmotic pressure\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c7\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eRICC\u003c/p\u003e \u003cp\u003e(%)\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c9\" namest=\"c8\"\u003e \u003cp\u003eChromosome\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c11\" namest=\"c10\"\u003e \u003cp\u003eChromatid\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c12\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eOthers\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c13\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eAberrant cell/\u003c/p\u003e \u003cp\u003etotal cell\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c14\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eTotal\u003c/p\u003e \u003cp\u003eAberration (%)\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003eDel\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003eExc\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003eDel\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003eExc\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003c/tr\u003e \u003c/thead\u003e \u003ctbody\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003eDistilled\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003ewater\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003e+\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e6\u0026ndash;18\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e8.38\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e290\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e100.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e2\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e2/300\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003e0.67\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\" morerows=\"3\" rowspan=\"4\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003eTest\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003esubstance\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e125\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\" morerows=\"3\" rowspan=\"4\"\u003e \u003cp\u003e+\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\" morerows=\"3\" rowspan=\"4\"\u003e \u003cp\u003e6\u0026ndash;18\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e8.20\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e286\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e78.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e2/300\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003e0.67\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e 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\u003cp\u003e13.00\u003csup\u003e*\u003c/sup\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003eDistilled\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003ewater\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e24\u0026thinsp;\u0026minus;\u0026thinsp;0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e8.37\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e260\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e100.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" 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align=\"left\" colname=\"c4\" morerows=\"2\" rowspan=\"3\"\u003e \u003cp\u003e24\u0026thinsp;\u0026minus;\u0026thinsp;0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e8.51\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e304\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e100.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e2/300\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" 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\u003cp\u003e2/300\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003e0.67\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e2,000\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e8.25\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e276\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e91.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e1/300\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003e0.33\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003eMMC\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e0.1\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e24\u0026thinsp;\u0026minus;\u0026thinsp;0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e8.33\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e294\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e63.9\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e16\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e43\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c13\"\u003e \u003cp\u003e56/300\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c14\"\u003e \u003cp\u003e18.67\u003csup\u003e\u003cb\u003e*\u003c/b\u003e\u003c/sup\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003c/tbody\u003e \u003c/colgroup\u003e \u003ctfoot\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"14\"\u003eAbbreviations: B[a]P (benzo[a]pyrene), MMC (mitomycin C), RICC (relative increase in cell count), Del (deletion), Exc (exchange), Others (fragmentation and multiple aberrations).\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"14\"\u003eSignificance of total aberration between groups by Fisher\u0026rsquo;s exact test (\u003csup\u003e*\u003c/sup\u003e\u003cem\u003ep\u003c/em\u003e\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;0.05).\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003c/tfoot\u003e \u003c/table\u003e\u003c/div\u003e \u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003cdiv id=\"Sec14\" class=\"Section2\"\u003e \u003ch2\u003eMicronucleus test\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eThe micronucleus test aimed to assess micronucleus formation in bone marrow following oral administration of Hyunburikyung-tang. Administration was performed for 2 days at 24 h intervals, and general symptoms due to Hyunburikyung-tang administration were observed immediately post-administration and before sacrifice. No weight changes or toxic signs were observed among the groups after Hyunburikyung-tang administration (Table\u0026nbsp;\u003cspan refid=\"Tab7\" class=\"InternalRef\"\u003e7\u003c/span\u003e). The PEC/NCE ratio was assessed to evaluate bone marrow toxicity. No differences in the PEC/NCE ratio were observed in the bone marrow of experimental animals, and the micronucleus frequency did not reach statistical significance. Therefore, twice-daily administration of Hyunburikyung-tang up to 2,000 mg/kg did not induce micronuclei formation.\u003c/p\u003e \u003cp\u003e \u003cdiv class=\"gridtable\"\u003e\u003ctable float=\"Yes\" id=\"Tab7\" border=\"1\"\u003e \u003ccaption language=\"En\"\u003e \u003cdiv class=\"CaptionNumber\"\u003eTable 7\u003c/div\u003e \u003cdiv class=\"CaptionContent\"\u003e \u003cp\u003eResults of the micronucleus test\u003c/p\u003e \u003c/div\u003e \u003c/caption\u003e \u003ccolgroup cols=\"12\"\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c1\" colnum=\"1\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c2\" colnum=\"2\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c3\" colnum=\"3\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c4\" colnum=\"4\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c5\" colnum=\"5\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c6\" colnum=\"6\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c7\" colnum=\"7\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c8\" colnum=\"8\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c9\" colnum=\"9\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c10\" colnum=\"10\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c11\" colnum=\"11\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cdiv align=\"left\" class=\"colspec\" colname=\"c12\" colnum=\"12\"\u003e\u003c/div\u003e \u003cthead\u003e \u003ctr\u003e \u003cth align=\"left\" colname=\"c1\" morerows=\"1\" rowspan=\"2\"\u003e \u003cp\u003eGroup /\u003c/p\u003e \u003cp\u003eDose (mg/kg)\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colspan=\"2\" nameend=\"c3\" namest=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e1st dosing\u003c/p\u003e \u003c/th\u003e \u003cth align=\"left\" colspan=\"2\" 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\u003cp\u003e479\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e12.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e162\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e338\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e32.4\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e32.87\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003eN\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e33.08\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003eN\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e32.11\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003eN\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e433\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e10.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e144\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e356\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e28.8\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003eMean\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e34.33\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e-\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e34.52\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e-\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e33.41\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e-\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e440.6\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e11.02\u003c/b\u003e\u003csup\u003e*\u003c/sup\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e153.0\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e347.0\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003e30.6\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003ctr\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c1\"\u003e \u003cp\u003e\u003cb\u003eS.D\u003c/b\u003e\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c2\"\u003e \u003cp\u003e0.93\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c3\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c4\"\u003e \u003cp\u003e0.91\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c5\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c6\"\u003e \u003cp\u003e0.87\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c7\"\u003e \u003cp\u003e-\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c8\"\u003e \u003cp\u003e29.0\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c9\"\u003e \u003cp\u003e0.72\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c10\"\u003e \u003cp\u003e7.9\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c11\"\u003e \u003cp\u003e7.9\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003ctd align=\"left\" colname=\"c12\"\u003e \u003cp\u003e1.6\u003c/p\u003e \u003c/td\u003e \u003c/tr\u003e \u003c/tbody\u003e \u003c/colgroup\u003e \u003ctfoot\u003e \u003ctr\u003e\u003ctd colspan=\"12\"\u003eAbbreviations: B.W (body weights), G.S (general symptoms), mnPCE (micronucleated polychromatic erythrocytes), PCE (polychromatic erythrocytes), NCE (normochromatic erythrocytes). mnPCE frequency in 4,000 PCE per animal Significance of frequency between groups by Dunnett\u0026rsquo;s test (\u003csup\u003e*\u003c/sup\u003e\u003cem\u003ep\u003c/em\u003e\u0026thinsp;\u0026lt;\u0026thinsp;0.05).\u003c/td\u003e\u003c/tr\u003e \u003c/tfoot\u003e \u003c/table\u003e\u003c/div\u003e \u003c/p\u003e \u003c/div\u003e"},{"header":"Discussion","content":"\u003cp\u003eIn this study, the acute toxicity and genotoxicity of Hyunburikyung-tang were evaluated using bacteria, cells, and rodents. Previous toxicity studies have reported side effects associated with medicinal plants or ingredients found in Hyunburikyung-tang. Some medicinal plants are known to induce side effects such as teratogenicity, dyspnea, and arrhythmia in non-clinical studies and acute headaches, weakness, and dry mouth in clinical studies [\u003cspan additionalcitationids=\"CR25 CR26 CR27 CR28 CR29 CR30\" citationid=\"CR24\" class=\"CitationRef\"\u003e24\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR31\" class=\"CitationRef\"\u003e31\u003c/span\u003e].\u003c/p\u003e \u003cp\u003ePeach seeds contain components such as tocopherols, cyanogenic glycosides, and carotenoids, which are experimentally reported to have anti-inflammatory, anti-oxidative, and anti-cancer effects. However, peach seeds also contain amygdalin (laetrile), which is known to cause toxicity [\u003cspan citationid=\"CR32\" class=\"CitationRef\"\u003e32\u003c/span\u003e]. Oral administration of amygdalin to humans causes cyanide poisoning, and combined administration with vitamin C decreases cysteine ​​levels in the body and inhibits the detoxification effect of amygdalin [\u003cspan citationid=\"CR33\" class=\"CitationRef\"\u003e33\u003c/span\u003e]. Moreover, teratogenic effects have been reported with oral but not intravenous administration in animal studies [\u003cspan citationid=\"CR33\" class=\"CitationRef\"\u003e33\u003c/span\u003e]. Malformations can result from various mechanisms, including oxidative stress, endocrine disruption, or enzyme-mediated induction. Genotoxicity is interconnected to teratogenicity and can arise from various mechanisms including oxidative stress and enzyme-mediated activation [\u003cspan additionalcitationids=\"CR36\" citationid=\"CR35\" class=\"CitationRef\"\u003e35\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR37\" class=\"CitationRef\"\u003e37\u003c/span\u003e]. Multiple non-clinical studies have demonstrated the potential effect of genotoxicity induced in the parent generation on offspring; therefore, evaluating the safety, including genotoxicity, of consumed drugs and foods is crucial [\u003cspan additionalcitationids=\"CR39 CR40 CR41\" citationid=\"CR38\" class=\"CitationRef\"\u003e38\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR42\" class=\"CitationRef\"\u003e42\u003c/span\u003e]. Amygdalin is hydrolyzed by beta-glucuronidase and converted to cyanide in the small intestine, and a 500 mg oral dose is reported to contain up to 30 mg of cyanide. Cyanide toxicity causes cell death by interfering with mitochondrial oxygen utilization. Cyanide binds to the ferric ion of cytochrome oxidase, inhibiting electron transport and oxidation mechanisms and causing hypoxia and lactic acidosis [\u003cspan citationid=\"CR43\" class=\"CitationRef\"\u003e43\u003c/span\u003e]. Hypoxia and lactic acidosis are related to genotoxicity. Reactive oxygen species caused by hypoxia can cause genotoxicity, and lactic acidosis, which is a tumor microenvironment factor, causes instability of mitotic chromosomes with concomitant glucose deficiency, resulting in centrosome amplification, micronuclei, or aneuploidy [\u003cspan citationid=\"CR44\" class=\"CitationRef\"\u003e44\u003c/span\u003e, \u003cspan citationid=\"CR45\" class=\"CitationRef\"\u003e45\u003c/span\u003e].\u003c/p\u003e \u003cp\u003eThe bacterial reverse mutation test, in vitro chromosome aberration test, and in vivo micronucleus test are standard methods for evaluating genotoxicity. The bacterial reverse mutation test detects point mutations, including DNA base or base pair additions, deletions, or substitutions [\u003cspan citationid=\"CR46\" class=\"CitationRef\"\u003e46\u003c/span\u003e]. Such mutations are implicated in numerous genetic diseases, and evidence suggests that mutations in somatic cell tumor suppressor genes and oncogenes contribute to tumor formation in animals and humans [\u003cspan citationid=\"CR47\" class=\"CitationRef\"\u003e47\u003c/span\u003e]. Chromosomal abnormalities and micronuclei are commonly associated with cancer development [\u003cspan citationid=\"CR48\" class=\"CitationRef\"\u003e48\u003c/span\u003e, \u003cspan citationid=\"CR49\" class=\"CitationRef\"\u003e49\u003c/span\u003e].\u003c/p\u003e \u003cp\u003eBenzo[a]pyrene is hydrolyzed by beta-glucuronidase and causes genotoxicity only if metabolic activation occurs [\u003cspan citationid=\"CR50\" class=\"CitationRef\"\u003e50\u003c/span\u003e]. Amygdalin, which is similar to benzo[a]pyrene, is hydrolyzed by beta-glucuronidase and causes cyanide toxicity. Standard testing methods for genotoxicity evaluation were performed in this study, with no mutagenesis or genotoxicity observed with the administration of metabolic-activated Hyunburikyung-tang.\u003c/p\u003e \u003cp\u003eSafflower (\u003cem\u003eCarthamus tinctorius\u003c/em\u003e Linn) affects developmental stages in mice and causes structural abnormalities in the placenta; however, the mechanisms of these effects remain unknown [\u003cspan citationid=\"CR51\" class=\"CitationRef\"\u003e51\u003c/span\u003e]. No genotoxicity was induced by treatment with Hyunburikyung-tang; however, a chromosomal aberration test confirmed that the cell toxicity increased with metabolic activation. Zebrafish models exposed to safflower extract were reported to have increased levels of antioxidant-related proteins and malonaldehyde (MDA) [\u003cspan citationid=\"CR51\" class=\"CitationRef\"\u003e51\u003c/span\u003e] Malondialdehyde is a byproduct of lipid oxidation and an indicator of oxidative stress. Oxidative stress damages the syncytial trophoblast membrane, weakens placental function, and adversely affects uterine and embryonic development [\u003cspan additionalcitationids=\"CR53\" citationid=\"CR52\" class=\"CitationRef\"\u003e52\u003c/span\u003e\u0026ndash;\u003cspan citationid=\"CR54\" class=\"CitationRef\"\u003e54\u003c/span\u003e]. Hyunburikyung-tang containing safflower did not induce genotoxicity in this study; nevertheless, further studies are required to determine whether it can induce oxidative stress with metabolic activation.\u003c/p\u003e \u003cp\u003eAn acute toxicity assessment was conducted to determine the lethal dose and potential side effects following a single dose [\u003cspan citationid=\"CR55\" class=\"CitationRef\"\u003e55\u003c/span\u003e]. In this study, several endpoints were measured to confirm the genotoxicity and acute toxicity of Hyunburikyung-tang, and no toxic reactions were observed. Based on our findings, the approximate lethal dose of Hyunburikyung-tang was expected to exceed 2,500 mg/kg in both male and female rats. Furthermore, Hyunburikyung-tang did not appear to induce genotoxicity under these test conditions. We anticipate that the findings from this study will serve as fundamental data for subsequent toxicity tests and provide non-clinical safety information for Hyunburikyung-tang.\u003c/p\u003e"},{"header":"Conclusions","content":"\u003cp\u003eIn summary, Hyunburikyung-tang, a traditional medical prescription commonly used clinically for dysmenorrhea due to its anti-inflammatory effects, is potentially dangerous because it contains safflower and peach seeds, which are known to cause deformities. Hyunburikyung-tang did not cause acute toxicity or genotoxicity under the test conditions; however, increased cytotoxicity was observed with metabolic activation in an in vitro chromosomal aberration test. Safflower extract has potential teratogenic effects and is known to increase oxidative stress, which can weaken placental function and adversely affect embryonic development. Therefore, additional research is required to determine whether Hyunburikyung-tang causes oxidative stress or affects embryonic development.\u003c/p\u003e"},{"header":"Abbreviations","content":"\u003cp\u003eANOVA\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;\u0026nbsp;Analysis of Variance\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eGLP\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;\u0026nbsp;Good laboratory practice\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eGMP\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;Good manufacturing practice\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eIACUC\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;Institutional animal care and use committee\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eMGA\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;Minimal glucose agar\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003emnPCE\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;\u0026nbsp;Micronucleated polychromatic erythrocyte\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eNCE\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;\u0026nbsp;Normochromatic erythrocyte\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003ePCE\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;Polychromatic erythrocyte\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eRICC\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;Relative increase in cell count\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eSD\u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp;Sprague Dawley\u0026nbsp;\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eSPF \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; \u0026nbsp; Specific pathogen fr\u003c/p\u003e"},{"header":"Declarations","content":"\u003cp\u003e\u003cstrong\u003e\u003cem\u003eEthics approval and consent to participate\u003c/em\u003e\u003c/strong\u003e\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eThe experiment for acute toxicity assessment was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of a Korean medicine non-clinical study center [Approval number: NIKOM-2022-07 (Acute toxicity assessment), NIKOM-2022-29 (Micronucleus test)]. All researchers participating in animal experiments complied with the standards for laboratory animal care.\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003e\u003cstrong\u003e\u003cem\u003eConsent for publication.\u003c/em\u003e\u003c/strong\u003e\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eNot applicable\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003e\u003cstrong\u003e\u003cem\u003eAvailability of data and materials\u003c/em\u003e\u003c/strong\u003e\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eAll data generated during this study are included in this article.\u0026nbsp;\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003e\u003cstrong\u003e\u003cem\u003eCompeting interests\u003c/em\u003e\u003c/strong\u003e\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eThe authors declare no competing interests.\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003e\u003cstrong\u003e\u003cem\u003eFunding\u003c/em\u003e\u003c/strong\u003e\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eThis work was supported by the GLP center construction business of Korean Traditional medicine (Ministry of Health and Welfare, Republic of Korea) to contribute evidence for the safe use of oriental medicine (Korea Health Industry Development Institute, RS-2023-KH139577)\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003e\u003cstrong\u003e\u003cem\u003eAuthors’ contributions\u003c/em\u003e\u003c/strong\u003e\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eNJH designed the study; NJH, CSY, and HSM performed genotoxicity assessment; NJH and CSY wrote the manuscript; KJS performed acute toxicity assessment; KSY and CHW performed manuscript proofreading; WKW conducted test substance preparation; and CHW supervised the project. All authors approved the final manuscript.\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003e\u003cstrong\u003e\u003cem\u003eAcknowledgments\u003c/em\u003e\u003c/strong\u003e\u003c/p\u003e\n\u003cp\u003eNot applicable\u003c/p\u003e"},{"header":"References","content":"\u003col\u003e\n\u003cli\u003eTataj-Puzyna U, Ilczuk P, Kalita-Kurzyńska K, Gotlib J. Women\u0026apos;s experiences of dysmenorrhoea-preliminary study. Prz Menopauzalny. 2021;20:133-9.\u003c/li\u003e\n\u003cli\u003eLghoul S, Loukid M, Hilali MK. Prevalence and predictors of dysmenorrhea among a population of adolescent\u0026apos;s schoolgirls (Morocco). Saudi J Biol Sci. 2020;27:1737-42.\u003c/li\u003e\n\u003cli\u003eLee JC, Yu BK, Byeon JH, Lee KH, Min JH, Park SH. A study on the menstruation of Korean adolescent girls in Seoul. Korean J Pediatr. 2011;54:201-6.\u003c/li\u003e\n\u003cli\u003eColl Capdevila C. Dysfunctional uterine bleeding and dysmenorrhea. 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Toxicol Int. 2013;20:224-6.\u003c/li\u003e\n\u003c/ol\u003e"}],"fulltextSource":"","fullText":"","funders":[],"hasAdminPriorityOnWorkflow":false,"hasManuscriptDocX":true,"hasOptedInToPreprint":true,"hasPassedJournalQc":"","hasAnyPriority":false,"hideJournal":false,"highlight":"","institution":"","isAcceptedByJournal":true,"isAuthorSuppliedPdf":false,"isDeskRejected":"","isHiddenFromSearch":false,"isInQc":false,"isInWorkflow":false,"isPdf":false,"isPdfUpToDate":true,"isWithdrawnOrRetracted":false,"journal":{"display":true,"email":"[email protected]","identity":"bmc-complementary-medicine-and-therapies","isNatureJournal":false,"hasQc":true,"allowDirectSubmit":false,"externalIdentity":"bcam","sideBox":"Learn more about [BMC Complementary Medicine and Therapies](https://bmccomplementmedtherapies.biomedcentral.com/)","snPcode":"","submissionUrl":"","title":"BMC Complementary Medicine and Therapies","twitterHandle":"BMC_series","acdcEnabled":true,"dfaEnabled":true,"editorialSystem":"stoa","reportingPortfolio":"BMC Series","inReviewEnabled":true,"inReviewRevisionsEnabled":true},"keywords":"Hyunburikyung-tang, Safety, Genotoxicity, Acute toxicity, Korean medicine, Traditional medicine, Complementary and alternative medicine, Bacterial reverse mutation test, Chromosome aberration test, Dysmenorrhea","lastPublishedDoi":"10.21203/rs.3.rs-4542887/v1","lastPublishedDoiUrl":"https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4542887/v1","license":{"name":"CC BY 4.0","url":"https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/"},"manuscriptAbstract":"\u003ch2\u003eBackground\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eHyunburikyung-tang exerts an anti-inflammatory effect by suppressing pro-inflammatory cytokines and prostaglandin E2 and is clinically used to improve dysmenorrhea in Korea. It contains various medicinal plants including peach seeds (\u003cem\u003ePrunus persica\u003c/em\u003e Batsch) and safflower (\u003cem\u003eCarthamus tinctorius\u003c/em\u003e Linn). Peach seeds contain amygdalin, which demonstrates teratogenic effects, and safflower is reported to cause reproductive toxicity and teratogenic effects in mice. These findings raise concerns regarding the teratogenic potential of these substances. A potential correlation exists between genotoxicity and teratogenicity. Genotoxic substances can damage DNA and cause mutations or chromosomal abnormalities, which may result in developmental malformations. Therefore, we aimed to assess whether Hyunburikyung-tang causes acute toxicity or genotoxicity.\u003c/p\u003e\u003ch2\u003eMethods\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eMale and female rats were orally administered Hynburikyung-tang to assess acute toxicity. Body weight measurements, general symptom observations, and autopsy examinations were used to confirm toxic responses. Genotoxicity assessment was conducted with bacteria, cells, and mice, according to the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) test guidelines.\u003c/p\u003e\u003ch2\u003eResults\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eRegarding acute toxicity assessment, no toxic reactions were observed when male and female rats received oral doses of Hyunburikyung-tang (626, 1,250, or 2,500 mg/kg). The genotoxicity tests, which included assessments of reverse mutations, chromosomal aberrations, and micronucleus formation, showed no genotoxic responses.\u003c/p\u003e\u003ch2\u003eConclusions\u003c/h2\u003e \u003cp\u003eOur findings suggested that Hyunburikyung-tang does not induce acute toxicity or genotoxicity. Nevertheless, follow-up research should be conducted to confirm toxicity caused by repeated administration.\u003c/p\u003e","manuscriptTitle":"Genotoxicity and acute toxicity of Hyunburikyung-tang: assessing the safety of prescribing traditional Korean medicine for dysmenorrhea","msid":"","msnumber":"","nonDraftVersions":[{"code":1,"date":"2024-07-16 09:21:41","doi":"10.21203/rs.3.rs-4542887/v1","editorialEvents":[{"type":"communityComments","content":0},{"type":"decision","content":"Revision requested","date":"2024-06-26T12:17:23+00:00","index":"","fulltext":""},{"type":"editorAssigned","content":"","date":"2024-06-26T08:38:02+00:00","index":"","fulltext":""},{"type":"checksComplete","content":"","date":"2024-06-25T03:23:27+00:00","index":"","fulltext":""},{"type":"submitted","content":"BMC Complementary Medicine and Therapies","date":"2024-06-07T01:49:05+00:00","index":"","fulltext":""}],"status":"published","journal":{"display":true,"email":"[email protected]","identity":"bmc-complementary-medicine-and-therapies","isNatureJournal":false,"hasQc":true,"allowDirectSubmit":false,"externalIdentity":"bcam","sideBox":"Learn more about [BMC Complementary Medicine and Therapies](https://bmccomplementmedtherapies.biomedcentral.com/)","snPcode":"","submissionUrl":"","title":"BMC Complementary Medicine and Therapies","twitterHandle":"BMC_series","acdcEnabled":true,"dfaEnabled":true,"editorialSystem":"stoa","reportingPortfolio":"BMC Series","inReviewEnabled":true,"inReviewRevisionsEnabled":true}}],"origin":"","ownerIdentity":"8decc1e5-d5fd-4c60-8317-ac57e3f1c67a","owner":[],"postedDate":"July 16th, 2024","published":true,"recentEditorialEvents":[],"rejectedJournal":[],"revision":"","amendment":"","status":"under-review","subjectAreas":[],"tags":[],"updatedAt":"2025-09-18T10:08:53+00:00","versionOfRecord":[],"versionCreatedAt":"2024-07-16 09:21:41","video":"","vorDoi":"","vorDoiUrl":"","workflowStages":[]},"version":"v1","identity":"rs-4542887","journalConfig":"researchsquare"},"__N_SSP":true},"page":"/article/[identity]/[[...version]]","query":{"redirect":"/article/rs-4542887","identity":"rs-4542887","version":["v1"]},"buildId":"qtupq5eGEP_6zYnWcrvyt","isFallback":false,"isExperimentalCompile":false,"dynamicIds":[84888],"gssp":true,"scriptLoader":[]}