Mechanism of ALKBH5 mediated m6A regulation of Galectin-9 in the invasion, migration, and proliferation of endometrial stromal cell

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs），作为育龄期女性常见的慢性疾病之一，其病理生理机制涉及复杂的分子网络和调控通路[1-2]。随着近年来RNA修饰研究的不断深入，m6A修饰作为RNA甲基化修饰的重要形式，已逐渐成为生物医学领域的研究热点[3]。作为m6A去甲基化酶的关键成员，ALKBH5通过调控RNA的m6A修饰水平，在细胞功能调控和疾病进程中发挥着重要作用[4]。Galectin-9，作为一种多功能半乳糖苷结合蛋白，具有广泛的生物学效应，它广泛参与调控细胞增殖、凋亡、黏附及侵袭等生物学过程，并在多种疾病的发生发展中扮演关键角色[5]。在EMs中，Galectin-9的表达水平显著升高，提示其可能与疾病的进展和预后密切相关[6-8]。然而，关于Galectin-9在EMs中的具体作用机制，尤其是其与m6A修饰的关系，目前尚缺乏深入的研究。鉴于此，本研究旨在探究ALKBH5介导m6A修饰调控Galectin-9表达影响EMs进展的作用机制，为EMs发展的分子机制提供新的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 临床样本 本研究纳入2021年9月至2023年12月于武汉大学中南医院妇产科就诊的患者。纳入标准：①育龄女性，月经周期规律，术前6个月内无妊娠；②未接受激素治疗，无刮宫术病史；③未放置官内避孕器。排除标准：①近6个月内接受过激素类药物治疗；②生殖器官发育不良或有其他盆腔病理改变；③合并严重感染、出血、发热等症状；④合并严重心、肝、肾、肺或血液、内分泌系统疾病；⑤合并高血压、糖尿病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤或其他慢性疾病。行宫腔镜检查时，收集20例单纯性输卵管性不孕患者正常子宫内膜（normal endometrium，NC）样本组织；对超声诊断有巧克力囊肿的EMs患者，行腹腔镜手术期间收集20例异位子宫内膜（ectopic endometrium，EC）组织样本。另取正常增生期子宫内膜组织10例提取相应原代子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells，ESCs）。根据患者报告的末次月经日期推测及标本取下后的组织病理学验证，所有样本均在患者月经周期的增生期采集。所有患者均提前被告知可能出现的风险及注意事项，并签署知情同意书。本研究获得武汉大学中南医院伦理委员会批准（科伦预批2020070）。所收集临床样本分为两部分处理，一部分浸泡于4%多聚甲醛中，并将剩余部分迅速置于液氮中，30 min内送回实验室进行进一步研究。 1.1.2 实验试剂 胎牛血清(四季青) ；Ⅳ型胶原酶（美国Gibco公司）；DMEM/F12培养基(武汉普诺赛生物公司) ；Lipofectamine TM3000（美国Invitrogen公司）；青霉素-链霉素混合溶液、RIPA蛋白裂解液、BCA 蛋白定量检测试剂盒、0.25胰酶消化液( 武汉碧云天公司) ；RNA免疫共沉淀试剂盒、甲基化RNA免疫共沉淀试剂盒（中国伯信生物公司）、PGL3-CMV-LUC-MCS质粒套装（典君生物公司）、放线菌素D粉剂（美国Selleck 生物公司）、TRIZol试剂及RT-qPCR试剂盒Mon AmpSYBR Green qPCR Mix（北京擎科生物科技有限公司）；HiScript III RT SuperMix 试剂盒（南京诺唯赞生物公司）；m6A、ALKBH5（#16837-1-AP）、Galectin-9（#17938-1-AP）、Vimentin（#10366-1-AP）、E-cadherin（#20874-1-AP）、β-actin抗体（#66009-1-Ig）和山羊抗兔IgG二抗（#SA00001-2）(武汉ProteinTech公司)；Western Blot一抗稀释液（中国Biosharp 公司，#BL1060A）；10% PAGE凝胶试剂盒及ECL化学发光底物（上海雅酶生物科技有限公司）；PVDF膜（美国Millipore）；Transwell小室（美国Corning公司）；荧光定量 PCR 机（CFX Connect）（美国Bio-Rad公司）；梯度PCR仪（ABI Veriti 96well）（美国Applied Biosystems公司）；多功能酶标仪（美国PerkinElmer 公司）；电泳仪和凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）。 1.2 实验方法 1.2.1 原代子宫内膜基质细胞培养 原代人类ESCs从正常子宫内膜组织中获取并纯化。将新鲜子宫内膜剪切成1 mm大小碎片，然后在37 ℃、200转/min的摇床培养箱中用胶原酶II（Sigma Aldrich，中国上海）消化1 h。之后，分别通过150 μm及37.4 μm筛网过滤，留下ESCs和红细胞。使用红细胞裂解缓冲液（Beyotime，中国上海）去除红细胞。最后，通过120 x g离心5 min纯化ESCs，随后将其培养在含有10%胎牛血清（FBS）（Gibco，美国加利福尼亚州）和1%抗生素（Beyotime，中国上海，含100 U·mL-1青霉素和100 ug·mL-1链霉素）的DMEM/F12培养基（Gibco，美国加利福尼亚州）中，培养条件为37 ℃、5% CO2的湿度。 1.2.2 细胞免疫化学方法鉴定细胞纯度 采用常规方法制备ESCs爬片，先经4%多聚甲醛固定，再用预冷PBS清洗3次，并在含Triton-X100的PBS中渗透。将爬片转移至载玻片，加入内源性过氧化物酶阻断溶液，清洗后添加10%胎牛血清孵育。移除血清后，加入E-cadherin及Vimentin一抗进行孵育，4 ℃下孵育过夜。次日清洗，清洗后加DAB显色液，显微镜下观察并记录。 1.2.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR） 组织及细胞总RNA提取过程参照北京擎科生物科技有限公司提供的TRIzol操作指南进行。测定RNA的A260/280 值。使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA后行qRT-PCR检测目的基因表达。反应条件：50 ℃持续2 min； 95 ℃预变性，持续2 min；95 ℃变性15 s ；60 ℃退火延伸 30 s，共 40 个循环。使用 2-△△CT法计算目的mRNA的表达，实验独立重复3次。本研究所使用引物均由北京擎科生物有限公司设计、合成。引物序列见表1。 - 表格1 qRT-PCR引物序列 Table1.The primer sequence of qRT-PCR 1.2.4 Western blot检测 使用RIPA裂解液对细胞和组织进行充分裂解，并使用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白质浓度。使用12% SDS-PAGE凝胶对每个处理组样品中的总蛋白（30 μg/泳道）进行电泳分离，然后转印至PVDF膜。将载有目的蛋白的PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1 h。然后在4 ℃下与ALKBH5（1 ∶ 1 000稀释），Galectin-9（1 ∶ 1 000稀释）和β-actin（1 ∶ 5 000稀释）一抗孵育过夜。用含0.1% Tween 20 的Tris缓冲盐溶液（TBST）洗涤三遍后，在室温下孵育二抗1 h。使用ECL显影和凝胶成像可视化目标蛋白条带。β-actin作为内参。 1.2.5 细胞增殖能力检测（CCK-8） 将ESCs细胞转染后经消化重悬为单细胞悬液，接种至96孔板上，接种密度为5×103个/孔，每孔 100 μL 细胞悬液。分别于0、24、48及72 h后进行CCK-8检测。加入40 μL CCK-8试剂，避光培养4 h后，使用酶标仪于490 nm波长处测定OD值，进行统计学分析。 1.2.6 细胞转染 参照操作手册，使用Lipofectamine TM3000分别将ALKBH5过表达质粒（OV-ALKBH5）、空载质粒载体以及 Galectin-9 siRNA转染入ESCs，最终浓度为0.4 μg/mL。48 h后收集细胞，用于后续研究。siRNA干扰Galectin-9序列（Galectin-9 siRNA）、ALKBH5过表达质粒及空载质粒载体购自上海吉凯生物科技公司。 1.2.7 细胞侵袭实验 侵袭实验前，在上室预铺50 μL Matrigel基质胶（2 mg·mL-1），在37 °C下孵育至少1 h。ESCs经消化后，用无血清DMEM/F12培养基混匀。 计数后，将细胞浓度设定为1×106个/mL。随后上室添加200 μL细胞悬液，下室添加500 μL含10% FBS的DMEM/F12培养基。37 ℃孵育24 h后取出小室。用PBS清洗小室，用甲醛固定后使用0.1%结晶紫染色15 min，并在倒置显微镜下观察并采集图像。 1.2.8 甲基化RNA免疫共沉淀实验 采用广州博信生物技术有限公司提供的MeRIP试剂盒进行甲基化RNA免疫共沉淀（methylated RNA immunoprecipitation-quantitative PCR，MeRIP-qRT-PCR）实验。ESCs经过处理后，按照前述方法提取细胞RNA。采用超声波法将提取的RNA片段化为长约300个核苷酸的片段。随后，向片段化的RNA溶液中加入抗IgG抗体（伯信生物，4 μg）或抗m6A抗体（伯信生物，4 μg），并在4 ℃下孵育4 h进行免疫共沉淀。向溶液中加入孵育良好的蛋白A/G磁珠，以促进RNA的富集。随后使用苯酚-氯仿提取、纯化富集的RNA，进行逆转录，并采用qRT-PCR进行定量分析。 1.2.9 RNA免疫共沉淀 按照伯信生物RIP实验试剂盒说明书进行RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）操作，使用 qPCR对已纯化的RNA沉淀复合物进行定量分析。 1.2.10 qPCR 检测 Galectin-9 mRNA 稳定性 使用5 μg·L-1放线菌素D将不同处理组的ESCs细胞分别处理 0、8、16和24 h 后收集细胞样品，提取总RNA。随后使用 qPCR 实验检测Galectin-9 mRNA 表达变化。 1.2.11 免疫组织化学染色 石蜡包埋组织制成4 μm切片后，经脱蜡、水化，用pH6.0枸橼酸钠缓冲液修复抗原，室温封闭10 min。随后，加入1 ∶ 200稀释的TC-1一抗，4 ℃孵育过夜。次日，使用PBS冲洗并加入生物素标记的二抗，室温孵育1 h。再次PBS冲洗后，加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，室温孵育10 h。最后，经DAB和苏木素染色，中性树胶封片。评定结果依据阳性细胞比例与染色强度：细胞比例＜5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，＞75%为4分；染色强度未着色为0分，黄色为1 分，棕黄色为2分，棕色为3分。两者之和 ＜2分为阴性，≥2分为阳性。光镜下（×200）及光镜下（×40）分别观察免疫组织化学结果，每项实验至少重复三次。 1.2.12 生物信息学分析 登录SRAMP网站（http://www.cuilab.cn/sramp），选择“Prediction”栏目，将Galectin-9 mRNA序列填写后点击“Submit”，查询Galectin-9 mRNA上潜在的m6A修饰位点。 1.3 统计学分析 采用 GraphPad Prism 8 软件对实验结果进行统计分析并绘图，所有数据均以均数和标准差( ) 表示。两组间比较采用Student's t检验，多组比较采用方差分析（ANOVA）。P ＜0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 ALKBH5 及Galectin-9 mRNA及蛋白表达 免疫组织化学染色结果显示，与NC组织相比，EC组织中ALKBH5及Galectin-9的表达均升高（图1-A）。qRT-PCR和Western blot结果显示，EC组织的ALKBH5及Galectin-9 的mRNA及蛋白表达量显著高于NC组织，差异具有统计学意义（P＜0.05），详见图 1-B至图 1-E，表明在EMs组织中ALKBH5及Galectin-9均高表达。 - 图1 正常子宫内膜组织和异位子宫内膜组织中ALKBH5 及Galectin-9 的表达水平 Figure1.The expression level of ALKBH5 and Galectin-9 in NC tissue and EC tissue 注：A：免疫组织化学检测ALKBH5及Galectin-9蛋白在不同子宫内膜组织中的表达[放大倍数分别为×200（左图）和×400（右图）]；B：qRT-PCR检测ALKBH5表达；C：qRT-PCR检测Galectin-9 mRNA表达；D：Western blot检测ALKBH5和Galectin-9蛋白表达；E：定量分析ALKBH5及Galectin-9蛋白的两组间表达差异；NC：正常子宫内膜组织；EC：子宫内膜异位症异位子宫内膜组织；*P ＜0.05；**P＜0.01。 2.2 过表达ALKBH5对子宫内膜基质细胞增殖的影响 首先使用光镜观测原代ESCs的形态，并使用免疫细胞化学方法检测上皮细胞表型蛋白（E-cadherin）及间质细胞表型蛋白（Vimentin）来鉴定ESCs纯度。结果显示在ESCs中，Vimentin表达强烈，而E-cadherin表达强度极低，确认ESCs的纯度超过95%（图2-A）。qRT-PCR和Western blot结果显示，ALKBH5过表达组中ALKBH5 mRNA和蛋白表达水平显著高于阴性对照组和空载组（图2-B、图2-C）。CCK-8实验显示过表达ALKBH5 后，ESCs的生长速度显著升高（图2-D），表明ALKBH5可以增强ESCs的增殖能力。 - 图2 ALKBH5 对子宫内膜基质细胞增殖能力的影响 Figure2.Effects of ALKBH5 on the proliferation capacity of ESCs 注：A：光镜下观测原代ESCs形态，免疫细胞化学检测原代ESCs中E-cadherin及Vimentin的表达（照片放大倍数为×200）；B：过表达ALKBH5促进其mRNA表达；C：过表达ALKBH5促进其蛋白表达；D：过表达ALKBH5促进ESCs增殖能力；*P＜0.05；**P＜0.01。 2.3 过表达ALKBH5对异位内膜基质细胞侵袭、迁移的影响 Transwell实验结果显示，与阴性对照组及空载组相比，过表达ALKBH5后，ESCs穿过小孔侵袭/迁移至下层小室的数量均显著增多（图 3）。 - 图3 ALKBH5 对子宫内膜基质细胞侵袭和迁移的影响 Figure3.Effects of ALKBH5 on the invasion and migration of endometrial stromal cells 注：A：Transwell实验检测过表达ALKBH5对ESCs侵袭和迁移能力的影响（照片放大倍数为×200）；B：定量分析不同组间迁移和侵袭细胞数量；*P＜0.05；**P＜0.01。 2.4 ALKBH5介导m6A修饰促进Galectin- 9蛋白表达 SRAMP数据库预测Galectin-9序列中的m6A修饰位点，共发现63个位点，其中极高可信度位点1个，高可信度位点27个（图4-A）。qRT-PCR和Western blot结果显示，与阴性对照组和空载组相比，ALKBH5过表达组的Galectin-9 mRNA和蛋白表达均显著升高（图4-B、图4-C）。MeRIP-qRT-PCR检测结果显示，Galectin-9中存在m6A修饰，过表达ALKBH5后Galectin-9的m6A修饰水平显著下降（P＜0.05）（图4-D、图 4-E）。在ESCs中过表达ALKBH5后用放线菌素 D处理指定时间段，检测Galectin-9 mRNA 稳定性，结果表明与阴性对照组及空载组相比，过表达 ALKBH5 显著增强了Galectin-9 mRNA 的稳定性（图4-F）。 - 图4 ALKBH5介导m6A修饰调控Galectin-9表达 Figure4.ALKBH5-mediated m6A modification regulates Galectin-9 expression 注：A：在线软件SRAMP预测Galectin-9 RNA上的m6A位点；B：qRT-PCR检测Galectin-9 mRNA表达；C：Western blotting检测Galectin-9 蛋白表达；D：过表达ALKBH5 后，MeRIP检测Galectin-9 m6A水平；E：RIP 实验检测ALKBH5 和Galectin-9 的结合；F：使用放线菌素D（5 μg/ mL）处理0、8、16和24 h，采用 qRT-PCR检测细胞中Galectin-9 mRNA 的表达（n=3次独立重复实验）；*P＜0.05；**P＜0.01。 2.5 ALKBH5通过Galectin-9介导对子宫内膜基质细胞的侵袭、迁移和增殖的影响 Transwell实验结果显示，与空载组相比，过表达ALKBH5之后，ESCs的迁移和侵袭能力显著增强，而在过表达ALKBH5同时使用siRNA沉默Galectin-9则能够部分逆转过表达ALKBH5对ESCs侵袭迁移和增殖能力的促进作用（P ＜0.01，图5-A、图5-B）。后续CCK8实验证实，沉默Galectin-9明显抑制了ALKBH5介导的ESCs增殖能力（P＜0.05，图5-C）。 - 图5 沉默Galectin-9部分逆转过表达ALKBH5对ESCs侵袭迁移和增殖的促进作用 Figure5.Silencing of Galectin-9 partially reverses the promoting effects of ALKBH5 overexpression on ESCs invasion, migration and proliferation 注：A：Transwell实验检测过表达ALKBH5同时沉默Galectin-9对ESCs侵袭迁移和增殖的影响（照片放大倍数为 ×200）；B：统计分析Trasnwell实验结果；C：CCK-8实验检测过表达ALKBH5同时沉默Galectin-9对ESCs增殖能力的影响；*P＜0.05；**P＜0.01。 3 讨论 EMs作为一种病因不清、机制复杂的妇科常见疾病，其发生发展涉及多种生物学过程，包括细胞的迁移、侵袭、增殖过多和凋亡抵抗等[9]。正是因为这些生物学特点的存在导致其成为临床治疗难点问题，因此寻找导致EMs发生发展的关键调节分子迫在眉睫。 近年来，表观遗传学调控在EMs中的作用逐渐受到关注，特别是RNA甲基化修饰在基因表达调控中的关键角色[10-11]。ALKBH5作为m6A去甲基化酶，在mRNA生成、调控过程中发挥重要作用。有研究表示，ALKBH5在乳腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中均异常表达，参与恶性肿瘤的发生演进过程，但是关于调控ALKBH5表达对EMs发生发展的研究还鲜有报道。本研究发现在EMs组织中，ALKBH5的表达水平显著上调，这一发现与既往的研究报道[12-13]相一致，提示ALKBH5表达的上调参与EMs的发生发展。作为m6A去甲基化酶，ALKBH5能够降低RNA上的m6A修饰水平，从而影响RNA的稳定性、剪接和翻译等过程[14]。在肝癌细胞中，ALKBH5介导的TIRAP mRNA m6A去甲基化能够促进辐射诱导的肝纤维化并降低肝细胞癌的放射敏感性[15]。此外，ALKBH5可通过m6A修饰来上调ITGB1表达，进而促进卵巢癌中肿瘤相关淋巴管生成和淋巴结转移[16]。Shen等[17]研究发现ALKBH5通过YTHDF2依赖的m6A修饰来稳定RAB5A mRNA表达，进而促进结直肠癌细胞的侵袭迁移和增殖。本研究进一步发现过表达ALKBH5能够促进ESCs的迁移、侵袭和增殖能力，而沉默Galectin-9部分逆转了ALKBH5过表达对细胞侵袭、迁移和增殖的促进作用，提示ALKBH5对EMs增殖、侵袭和迁移能力的影响是通过Galectin-9实现的，二者协同作用促进EMs的侵袭、迁移和增殖。 Galectin-9作为一种重要的细胞外基质蛋白，广泛存在于人体组织、器官中，在炎症、肿瘤、免疫、生殖等方面发挥关键作用[18]。在EMs中，Galectin-9的表达水平异常升高，与疾病的进展密切相关，并有作为EMs诊断靶点的潜能[19]。已有研究表明，在多种疾病模型中Galectin-9参与了细胞生物学功能的调控，包括黏附、侵袭、转移、增殖和凋亡[20-22]。然而，对于Galectin-9在EMs中异常表达升高的调控机制，目前仍知之甚少。本研究结果显示过表达ALKBH5能够上调Galectin-9 mRNA表达水平，同时伴随着Galectin-9 mRNA的m6A甲基化修饰水平降低，这些结果说明ALKBH5可能通过调控Galectin-9 m6A甲基化修饰，从而增强Galectin-9 mRNA的稳定性来影响EMs的发生发展。 本研究仍存在一定局限性。首先，尽管本研究揭示了ALKBH5对Galectin-9 mRNA的m6A修饰调控作用，但具体的分子调控机制仍需进一步阐明。研究证实，多种m6A阅读蛋白具有保守的m6A结合结构域，可以通过识别并结合m6A去甲基转移酶所修饰的特定RNA序列来调控该基因的表达，进而对下游生物学功能发挥作用[23]。但是本研究中尚未鉴定出ALKBH5调控Galectin-9 m6A甲基化修饰的特定阅读蛋白，后续需要进一步实验验证。其次，本研究主要基于体外实验和临床样本的分析，未来还需要在动物模型中进行验证，以更全面地了解ALKBH5和Galectin-9在EMs发病中的作用。最后，EMs的发生发展涉及多个基因和通路的相互作用，未来研究还需要进一步探讨EMs微环境中ALKBH5和Galectin-9与其他相关因素，诸如雌孕激素水平变化、缺氧微环境以及炎症微环境的关系，以揭示其在EMs中的复杂作用机制。未来将继续深入研究ALKBH5和Galectin-9在EMs中的功能及机制。一方面，利用基因编辑技术、RNA干扰等手段，在细胞水平和动物模型中进一步验证ALKBH5对Galectin-9的m6A修饰调控作用及其对EMs发生发展的影响。另一方面，通过高通量测序、生物信息学分析等方法，挖掘与ALKBH5和Galectin-9相关的信号通路和互作网络，以揭示它们在EMs发生发展中的复杂作用机制。 综上所述，本研究揭示了ALKBH5以m6A依赖方式调控Galectin-9的 m6A水平来改变Galectin-9的表达水平，进而促进ESCs 的增殖、迁移和侵袭，从而参与EMs的发生发展。这一机制提示ALKBH5/ Galectin-9轴可能是EMs诊断和治疗的一个潜在有效的关键生物标志物。 1.Horne AW, Missmer SA. 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