Genetic and epigenetic mechanisms of genital endometriosis-associated infertility

В настоящее время эндометриоз рассматривается как мультифакторное заболевание, в возникновении которого задействованы генетические, средовые и эпигенетические факторы [1, 2]. Активно изучаются генетические (наследственная предрасположенность) и эпигенетические (влияние внешних и внутренних средовых факторов на экспрессию генов, не связанное с изменением последовательности ДНК) факторы патогенеза эндометриоза [2, 3]. Первая попытка понять генетическую основу эндометриоза с помощью общегеномных подходов была проведена в период с 1995 по 2005 гг. на основе изучения семейных связей. Было обнаружено, что две хромосомные области связаны с риском наследования эндометриоза – это 10q26 и 7p13-15 (включающие гены CYP2C19, INHBA, SFRP4 и HOXA10) [4]. CYP2C19 является геном цитохрома P450, который отвечает за метаболизм стероидов. Ген INHBA кодирует субъединицу ингибина β-А, регулирующего синтез фолликулостимулирующего гормона, дисфункция которого также обнаружена при аденокарциноме яичников. SFRP4 участвует в регулировании роста и дифференцировки клеток. Гены гомеобокса HOXA10 и HOXA11 являются транскрипционными факторами, регулирующими рецептивность эндометрия. Их пониженная экспрессия приводит к бесплодию посредством нарушения имплантации эмбриона [5]. С 2010 г. эндометриоз включен в исследование GWAS (Genome-Wide Association Studies – полногеномный поиск ассоциаций). Анализ GWAS, включавший более 12 000 пациенток с эндометриозом и более 33 000 здоровых женщин, позволил получить 9 значимых по всему геному локусов, которые в сумме объясняют приблизительно 4% наследуемости. Значимыми локусами явились rs7521902 гена WNT4, rs10859871 гена VEZT, rs12700667 на 7p15.2, rs1537377 гена CDKN2B-AS1, rs7739264 гена ID4, rs13394619 гена GREB1, rs1250248 гена FN1, rs4141819 на 2p14 и rs6542095 гена IL1A [6, 7]. Наследственные факторы эндометриоза были оценены на основе исследований близнецов. R. Saha и соавт. [4] исследовали в общей сложности 28 370 женщин-близнецов, включая монозиготных и дизиготных. Более высокая внутрипарная (тетрахорическая) корреляция наблюдалась среди монозиготных (0,47) по сравнению с дизиготными (0,20) близнецами, что говорит о существенном вкладе наследственных факторов в развитие эндометриоза. Следует отметить, что ассоциации генетических полиморфизмов с хирургически подтвержденным наружным генитальным эндометриозом значительно чаще наблюдались при III–IV стадиях заболевания, чем при I–II стадиях, что может указывать на роль молекулярно-генетических механизмов в патогенезе и прогрессировании заболевания. Обнаруженные локусы, ассоциированные с эндометриозом, располагаются в генах, патогенетически связанных с эстрогензависимой регуляцией клеток (GREB1), клеточной адгезией, миграцией, ростом и дифференцировкой клеток (VEZT, FN1), воспалением (IL1A), а также с путем передачи сигналов WNT/β-catenin. Сигнальный путь WNT/β-catenin широко задействован в эмбриогенезе, дифференцировке клеток и развитии различных заболеваний, включая эндометриоз. Считается, что данный сигнальный путь связан с развитием эпителиально-мезенхимального перехода, участвуя в инвазии и распространении эндометриоидных клеток, а также в фиброгенезе [8, 9]. Результаты GWAS относительно эндометриоза явно отстают от других сложных заболеваний с точки зрения количества обнаруженных локусов, по сравнению, например, с раком молочной железы (>90 локусов) или болезнью Крона (>140 локусов). В настоящее время продолжается новая фаза метаанализа GWAS по эндометриозу, которая, вероятно, приведет к выявлению новых локусов, вовлеченных в его развитие [8, 9]. Эпигенетические воздействия осуществляются путем метилирования ДНК, метилирования и ацетилирования гистоновых белков, а также действием микроРНК. Метилирование ДНК обычно происходит в цитозиновых остатках CG-динуклеотидов под действием специфических ДНК-метилтрансфераз, в частности DNMT3A и DNMT3B. Деметилирование также осуществляется специфическими ферментами, такими как TET, AID и GADD45. M.T. Dyson и соавт. (2014) исследовали почти 500 000 зон CG по всему геному в эутопическом эндометрии здоровых женщин и в эктопических очагах больных эндометриозом. Было идентифицировано 42 248 метилированных и деметилированных CG в очагах эндометриоза [10]. Значительные различия в метилировании были выявлены в 403 генах, которые преимущественно включали факторы транскрипции GATA. В частности, был затронут фактор GATA2, который регулирует ключевые гены, необходимые для гормональной дифференцировки здоровых стромальных клеток и гиперметилируется в эндометриоидных клетках, а также фактор GATA6, который регулирует экспрессию генов, участвующих в метаболизме стероидов и процессах децидуализации, и гипометилирован в эктопических очагах. Помимо факторов транскрипции, в очагах эндометриоза было отмечено нарушение метилирования в генах, кодирующих стероидогенный фактор-1 (SF1) и рецептор эстрогена-β (ERβ), что приводит к гиперпродукции местных эстрогенов и простагландинов и к подавлению рецепторов прогестерона [10]. В нескольких исследованиях показана роль гиперметилирования генов HOXA10 и HOXA11; гиперметилирование их промоторных участков приводит к сниженному содержанию как в эктопических очагах, так и в эутопическом эндометрии больных эндометриозом [8, 11, 12]. В недавнем проспективном клиническом исследовании C. Özcan и соавт. [13] сравнивали экспрессию гена HOXA10 в эутопическом эндометрии и ткани эндометриом у фертильных и бесплодных женщин с эндометриозом. В 1-ю группу вошли женщины без эндометриоза и бесплодия, во 2-ю – фертильные, а в 3-ю – бесплодные пациентки с эндометриомой, подтвержденной лапароскопически. В эутопическом эндометрии во 2-й и 3-й группах выявлено 1,871-кратное и 3,509-кратное снижение экспрессии гена HOXA-10 соответственно, по сравнению с 1-й группой. Экспрессия гена HOXA10 в эутопическом эндометрии была ниже в 1,778 раза у женщин из 3-й группы по сравнению со 2-й. Полученные результаты свидетельствуют о том, что сниженная экспрессия гена HOXA10 прямо или косвенно связана с бесплодием, вызванным эндометриозом. Однако в данное исследование были включены лишь 33 женщины, что говорит о необходимости дальнейших, более крупных исследований в данном направлении. Исследования по метилированию генома, имеющиеся на сегодняшний день, довольно описательны и не объясняют, каково происхождение данных аномалий в эутопической и эктопической тканях эндометрия. Также не до конца понятны последствия этих аномалий для патофизиологии, что требует более глубоких исследований. Гистоновый код представляет собой сложный эпигенетический способ регуляции генов. Гистоны – обширный класс ядерных белков, выполняющих две основные функции: участие в упаковке нитей ДНК в ядре и в эпигенетической регуляции таких ядерных процессов, как транскрипция, репликация и репарация. Существует пять различных типов гистонов: H1/Н5, H2A, H2B, H3, H4. При эндометриозе зафиксировано ацетилирование гистоновых белков H3 и H4 в эктопических очагах, что связано с изменением экспрессии соответствующих генов [14]. При эндометриозе ингибирование гистондеацетилазы (HDAC) приводит к реактивации E-кадгерина, ослаблению инвазии, уменьшению пролиферации эндометриоидных клеток. В 2012 г. Colon-Diaz [15] показал, что гистондеацетилазы HDAC1 и HDAC2 были активированы в эндометриоидных очагах. В 2013 г. Samartzis [16] в своем исследовании, в котором было оценено 74 образца тканей из эктопических очагов и 30 образцов нормальной ткани эндометрия, показал, что HDAC1 был повышен только в эктопических очагах, а уровни HDAC2/3 значительно не различались между группами. Более того, было показано, что повышенный уровень HDAC1 в очагах эндометриоза положительно коррелировал с экспрессией рецепторов эстрогена α и β и отрицательно – с экспрессией рецепторов прогестерона. В другом исследовании, Xiaomeng [17], было обнаружено снижение деацетилазы SIRT1 в эутопическом эндометрии больных эндометриозом и снижение HDAC1, а также метилтрансфераз гистонов SUV39H1, SUV39H2 и G9a в эктопических очагах. Однако исследование включало лишь 15 пациенток с эндометриозом. На сегодняшний день установлено, что гистоновый код может быть модифицирован лекарственными средствами, такими как ингибиторы HDAC (HDACi) [18]. HDACi, вероятно, способны выводить клетки из состояния молчания хроматина в состояние активации и дифференцировки, ограничивая пролиферацию. К HDACi относятся субероиланилидгидроксамовая кислота (SAHA или вориностат), ромидепсин, трихостатин A (TSA), а также вальпроевая кислота (VPA). Kawano Y. и соавт. [19] в своем исследовании обрабатывали ткань эндометриом яичников (25 образцов) и клетки эндометрия (22 образца) здоровых женщин вальпроевой кислотой. Было идентифицировано пять генов, модифицированных обработкой VPA: MT1G (×26,2), IL8 (×12), CEBPA (×10), PPP2R2B (×10) и ABCB1 (×5,9). Авторы сосредоточили свое внимание на гене CEBPA, кодирующем фактор транскрипции C/EBPα. Содержание белка снижено в эндометриоидной ткани, но обработка ее VPA вызывала накопление «открытых» гистоновых меток (ацетилирование H3/H4) на его промоторе и его индукцию. C/EBPα участвует в пролиферации, дифференцировке, а также подавлении роста опухолей. В других исследованиях сообщается об аномальных гистоновых метках на промоторах генов стероидогенного фактора-1 (SF1) и CYP19, кодирующего ароматазу, что объясняет избыточный синтез эстрогена при эндометриозе [20, 21]. Не вызывает сомнения, что модификация гистонового кода играет свою роль в развитии эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия. Однако требуются дальнейшие, более крупные исследования, чтобы точно установить, какие изменения гистонового кода и как именно влияют на прогрессирование эндометриоза. Малые некодирующие молекулы РНК (микроРНК) принимают участие в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, а также участвуют в большинстве патофизиологических процессов, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, ангиогенез и ремоделирование матрикса. При эндометриозе некоторые микроРНК, такие как miR-202-3p, miR-424-5p или miR-556-3p, могут способствовать снижению ангиогенной активности, наблюдаемой при эндометриоме яичника или при глубоком инфильтративном эндометриозе. Напротив, при малых формах эндометриоза профиль экспрессии miRNAs демонстрирует высокий потенциал ангиогенеза и инвазии [22]. Многочисленные исследования продемонстрировали потенциальную роль нескольких микроРНК в патогенезе эндометриоза посредством сверхэкспрессии синтеза эстрогенов путем активации генов COX-2 и PGE2 (miR-20a), индукции SF-1 (miR-23a, miR-23b), влияния на пролиферацию, ангиогенез и апоптоз (miR-145, miR-183, miR-196b, miR-199a-5p, 81) [23–26]. Недавно было продемонстрировано, что снижение уровня H19 lncRNA, длинной некодирующей РНК в эндометрии у женщин с эндометриозом, увеличивает активность let-7 miRNA, что, в свою очередь, ингибирует экспрессию инсулиноподобного фактора роста-1(Igf1r) на посттранскрипционном уровне. Это может привести к снижению пролиферации стромальных клеток эндометрия и нарушению его восприимчивости, что обусловливает бесплодие при эндометриозе [27]. Несмотря на кажущуюся простоту в понимании влияния микроРНК на развитие эндометриоза, отмечается поразительное отсутствие согласованности профилей микроРНК между различными исследованиями. Различия в экспрессии микроРНК могут быть обусловлены возрастом и этнической принадлежностью пациенток, тяжестью самого заболевания, влиянием циркадного ритма, а также зависеть от фазы менструального цикла. Тем не менее большинство из указанных факторов не были рассмотрены в вышеупомянутых публикациях, что подчеркивает необходимость дальнейших детальных исследований с учетом влияния различных внешних воздействий. Если рассматривать эндометриоз как мультифакторное заболевание, то, помимо генетических, в его развитии важна роль средовых факторов, которые как сами по себе, так и посредством активации эпигенетических процессов приводят к развитию и прогрессированию эндометриоза и связанного с ним бесплодия. К таким факторам в первую очередь можно отнести оксидативный стресс и иммунную дисфункцию. В настоящее время общепризнанно, что окислительный стресс, определяемый как дисбаланс между активными формами кислорода (АФК) и антиоксидантами, может быть вовлечен в патофизиологию эндометриоза и связанного с ним бесплодия. АФК образуются при нормальном кислородном обмене и являются медиаторами воспаления, которые, как известно, модулируют пролиферацию клеток. Антиоксидантная система представлена широким спектром факторов, таких как супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза, а также витаминами Е и С, которые инактивируют выработку АФК и восстанавливают повреждения клеток. Макрофаги, эритроциты и клетки эндометрия, которые трансплантируются в брюшную полость посредством ретроградной менструации, являются индукторами окислительного стресса; следовательно, перитонеальная продукция АФК может быть вовлечена в развитие эндометриоза [28]. Недавние исследования привлекли внимание к роли измененного метаболизма железа в развитии эндометриоза. У пациенток с эндометриозом происходит перегрузка железом в брюшной полости, усиленный метаболизм которого сидерофагами приводит к повышенному образованию АФК. Исследования на мышиной модели показали, что эпителиальные клетки в эндометриоидных поражениях увеличивают пролиферативную активность после инъекции эритроцитов, тогда как введение десферриоксамина, хелатора железа, ингибирует этот процесс. Продукция АФК при перегрузке железом вызывает увеличение продукции транскрипционного фактора NF-каппа В в перитонеальных макрофагах, что приводит к провоспалительным и ангиогенным эффектам. Маркеры оксидативного стресса были исследованы в сыворотке, перитонеальной и фолликулярной жидкостях, тканях яичника и эндометрия у женщин, страдающих эндометриозом. В сыворотке женщин, больных эндометриозом, было обнаружено повышенное содержание маркеров оксидативного стресса, таких как белок теплового шока HSP 70, малоновый диальдегид (MDA), гидроперекиси липидов (LOOH), а также окисленные липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) [29]. Напротив, содержание антиоксидантов, таких как параоксоназа-1 и супероксиддисмутаза, было понижено, что свидетельствует о снижении антиоксидантной способности у этих женщин [30]. Однако концентрации витамина Е и каталазы, которые также являются природными антиоксидантами, были повышены в сыворотке женщин, страдающих эндометриозом. Этот факт требует детальных исследований и объяснения [31, 32]. В перитонеальной жидкости больных эндометриозом были обнаружены высокие уровни продуктов окисления белков, нитритов и нитратов, а также окисленных ЛПНП. Так же, как и в крови, было обнаружено повышение уровней MDA и LOOH [33]. Другими маркерами окислительного стресса, обнаруженными в перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом, являются: 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, который является окисленным производным дезоксигуанозина, 8-изопростан, 8-изо-простагландин F2α и 25-гидроксихолестерин. Фолликулярная жидкость играет решающую роль в репродуктивной деятельности ооцитов. Дисбаланс между АФК и антиоксидантными системами в фолликулярной жидкости может быть причиной аномального развития ооцитов, вызывая повреждение их ДНК, цитоскелета и клеточной мембраны, что приводит к снижению их качества и бесплодию, связанному с эндометриозом [29]. В фолликулярной жидкости больных эндометриозом обнаружены более высокие уровни MDA, оксида азота и 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина. Высокие концентрации оксида азота соответствовали незрелым ооцитам и эмбрионам низкого качества. Антиоксиданты, такие как SOD, каталаза, глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза, были снижены в фолликулярной жидкости больных, страдающих эндометриозом. Концентрации витаминов A, C и E также были значительно снижены. Интересно, что содержание маркеров оксидативного стресса и антиоксидантов у пациенток с односторонней эндометриомой были схожи с их содержанием в контрольной группе [34, 35]. В ткани яичника у женщин с эндометриозом выявлено повышенное содержание таких маркеров окислительного стресса, как нитротирозин и 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин [36]. В клетках эутопического эндометрия обнаружена высокая концентрация супероксидных анионов, что также говорит о воздействии на него АФК. Окислительный стресс может приводить к бесплодию при эндометриозе различными путями, влияя на созревание ооцитов, стероидогенез в яичниках, овуляцию, имплантацию, образование бластоцисты, лютеолиз и поддержание лютеиновой системы на ранних сроках беременности [37]. АФК повреждают микротрубочки веретена деления ооцитов, а также блокируют образование новых микротрубочек, нарушая деление и сегрегацию хромосом в процессе мейоза [38, 39]. Экспериментальные доказательства нарушения сегрегации хромосом, вызванных окислительным стрессом, в ооцитах дрозофилы были опубликованы Perkins et al. [40].Было показано, что подавление генов, кодирующих выработку супероксиддисмутазы, индуцирует нерасхождение хромосом во время мейоза. В ряде исследований выявлено смещение веретена деления, а также анеуплоидия в ооцитах мышей, подвергшихся воздействию АФК [41, 42]. Mihalas и др. [43] в своем исследовании изучали влияние на ооциты перекиси водорода различной концентрации во время созревания in vitro и показали дозозависимое увеличение числа смещенных хромосом, аномалий веретена деления и анеуплоидии в обработанных ооцитах. Ряд исследований продемонстрировал способность антиоксидантов, включая витамин С, витамин Е, α-липоевую кислоту, ацетилкарнитин, ресвератрол и N-ацетилцистеин, защищать ооциты от повреждения геномной ДНК, дисфункции митохондрий, аномальной морфологии веретена деления и анеуплодий [44–46]. He С. и соавт. [47] показали, что митохондрии ооцитов мыши продуцируют мелатонин, который обладает антиоксидантными свойствами. Обработка ооцитов мелатонином in vitro снижает выработку АФК и ингибирует образование 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина. Это увеличивает количество копий митохондриальной ДНК, уменьшает долю ооцитов с аберрациями веретена деления, а бластоцисты из оплодотворенных ооцитов, которые были обработаны мелатонином, имеют более высокое качество. Окислительный стресс оказывает неблагоприятное воздействие не только на развитие ооцитов, но и на сперматозоиды человека. Lopes и соавт. [48] еще в 1998 г. показали, что прооксидантная ферментная система ксантин-ксантиноксидаза вызывает повышенную фрагментацию ДНК сперматозоидов человека. Проведенное в Иране рандомизированное тройное слепое плацебо-контролируемое клиническое исследование, в котором изучалось влияние такого антиоксиданта, как альфа-липоевая кислота, на спермограмму у бесплодных мужчин, показало, что она способна увеличить подвижность сперматозоидов и их количество [49]. Также доказано, что АФК препятствуют нормальному развитию эмбрионов, оказывая эмбриотоксический и тератогенный эффекты. В двух исследованиях культивируемые зиготы мышей обрабатывали перекисью водорода, и было показано, что у обработанных зигот наблюдалось нарушение активации контрольной точки G2/M в клеточном цикле, что приводило к снижению скорости бластуляции и увеличению числа апоптозов [50]. Заключение Таким образом, в развитии эндометриоза и связанного с ним бесплодия задействованы как генетические, так и средовые факторы, к которым в первую очередь относится оксидативный стресс. Оксидативный стресс, сопровождающий эндометриоз, помимо индукции эпигенетических воздействий, может являться самостоятельным фактором в развитии бесплодия. Изучение биомаркеров оксидативного стресса у пациенток с эндометриозом может быть полезным для определения риска развития ассоциированного с заболеванием бесплодия. Требуются дальнейшие исследования относительно точных механизмов воздействия АФК на гаметы и эмбрионы. Имеющиеся данные о том, что различные подтипы эндометриоза (легкие и тяжелые формы) имеют различное генетическое происхождение, могут свидетельствовать о различном происхождении эндометриоза, ассоциированного с бесплодием и не ассоциированного с ним. На сегодняшний день данные предположения остаются на уровне гипотезы и требуют доказательных крупномасштабных исследований.