The hyperexpressions of putative stem cells in the eutopic endometrium of patients with advanced endometriosis

Recently it has been proposed that stem cells may be associated with the pathogenesis of endometriosis. The purposes of this study are to investigate whether the eutopic endometrial cells of women with or without endometriosis show the characteristics of ste m cells in vitro and have a difference of the expressions of the undifferentiated stem cell markers as OCT-4 and CXCR4.

A total of 6 women with advanced endometriosis and a total of 10 women without endometriosis, adenomyosis or leiomyoma were included in this study. The eutopic endometrial cells, which were obtained from the menstrual blood at menstrual cycle day 2 to 4, were cultured in vitro for approximately 2 weeks, subsequently the putative very small stem cells were separated by Percoll density gradient

and were cultured. The expressions of OCT-4 and CXCR4 were analyzed by real time RT-PCR.

The eutopic endometrial cells of the group of endometriosis compared with the control group showed the different morphological characteristics in vitro; more commonly heterogeneous supportive cells, very small round cells less than 3 μm and 5~15 μm sized hyperchromatic round cells. After the separation of very small round cells by Percoll density gradient method, these cells showed the several characteristics of stem cells; self-renewal, asymmetric cell division, colony formation and embryoid body-like formation. Also These cells showed the similar characteristics of very small embryonic-like stem cells; the mobile cells smaller than erythrocyte, the cell migration or adhesion to supportive cells, the sphere formation by cell aggregation and the formation of new differentiated cell by cell fusion. The expressions of OCT-4 and CXCR4 in the group of endometriosis are respectively 5.66 times and 17.69 times as high as the control group ( P<0.05).

The very small round cells less than 3 μm and 5~15 μm sized hyperchromatic round cells, which showed the several characteristics of stem cells in vitro, were more common in eutopic endometrial cells of patients with endometriosis and the expressions of OCT-4 and CXCR4 were significantly higher. This study suggests that stem cells might play a key role in the pathogenesis of endometriosis and OCT-4 and CXCR4 might be used as a tool for diagnosis or follow-up. Key Words: Endometriosis, Stem cells, OCT-4, CXCR4 자궁내막증은 자궁내강 이외의 장소에 자궁내막 선과 기질 조직이 증식하는 질환으로서, 흔히 복막, 난소, 나팔 관, 더글라스와에서 발견되며, 드물게 흉막, 폐, 뇌에서 발 견되기도 한다. 자궁내막증은 가임기 여성의 3~10%에서 최종렬 외 6인. 진행성 자궁내막증 환자의 자궁내막에서 추정줄기세포의 과다발현 - 265 - 발생하는 흔한 질환으로서, 골반통을 호소하는 여성 중 5~20%, 불임 여성 중 20~50%에서 발견된다.1-3 자궁내막증의 병인으로는 월경혈 역류, 비정상적인 자 궁내막, 변화된 복강 환경, 증가된 혈관형성능, 부적절한 면역학적 반응, 유전적인 요인, 환경적인 요인 등이 복합 적으로 관여하며, 흔히 알려진 가설로는 월경혈 역류설 (retrograde menstruation theory), 체강상피 화생설 (coelomic metaplasia theory), 태생 잔존세포설 (embr- y o n i c r e s t t h e o r y ) , 림 프 혈 관 전 이 설 ( l y m p h o v a s c u l a r metastasis theory) 등이 있으나, 3-7 어느 한 가지 가설만 으로 자궁내막증의 병인을 완전히 설명할 수 없다. 최근 자궁내막에서 줄기세포 (stem cell)와 전구세포 (progenitor cell)가 자궁내막의 기저층과 기질의 혈관조 직 주위에 많이 존재하며 자궁내막조직의 성장, 증식 및 분화에 관여하는 것으로 알려지면서 자궁내막증을 이해하 기 위한 새로운 전환점을 맞이하고 있다. 8 또한 자궁내막 증이 줄기세포 혹은 전구세포에 의하여 발생한다는 가설이 새롭게 제시되고 있는데, 이는 이소성 자궁내막 (ectopic endometrium)의 발생과 관련된 여러 자궁내막증 가설들 을 세포 수준에서 설명할 수 있으며 자궁내막증과 연관된 신체 변화들을 설명할 수도 있다. 3 자궁내막 줄기세포 혹은 전구세포의 월경혈 역류설을 뒷받침하는 연구로서 자궁내막증 환자의 정상부위 자궁내 막 기저층과 이소성 자궁내막 간에 에스트로겐 수용체, 프 로게스테론 수용체, 사이토크롬 p450 표현형이 유사하다 는 보고가 있는데, 9 이는 줄기세포가 많이 존재하는 자궁 내막 기저층의 세포 중 일부가 이소성 자궁내막으로 이식 될 수 있음을 의미한다. Microarray를 이용한 다른 연구에 서는 자궁내막증 환자의 정상부위 자궁내막과 이소성 자궁 내막 간의 유전자 발현 양상이 다르며, 자궁내막증 환자와 정상인의 정상부위 자궁내막 간의 유전자 발현 양상에도 차이가 있었는데, 10 이는 자궁내막증 환자의 정상부위 자 궁내막에서 일반적인 자궁내막과는 다른 유전자 발현 양상 을 보일 수 있으며, 자궁내막의 기능 자체가 변할 수 있다 는 것을 뜻하고 있다. 줄기세포의 미분화표지자 OCT-4는 미분화 배아줄기세 포의 자가 재생, 다능성 (pluripotency) 유지 및 분화 방지 에 관여하는 전사인자로서 배아줄기세포의 표지자 단백질 로 알려져 왔는데, 최근에는 성체줄기세포와 종양에서도 발견되는 것으로 알려져 있다. 11 CXCR4는 기질에서 유래 하는 SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) 리간드와 상호 결합하는 수용체로서, 저산소성 손상시 기질에서 SDF-1을 분비하면 CXCR4를 지닌 줄기세포들이 유입되는 것으로 보고되고 있다. CXCR4는 배아줄기세포, 원시생식 세포 (primordial germ cell), 극소배아양줄기세포 (very small embryonic-like stem cell), 조혈모세포 (hemato- poietic stem cell), 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell), 혈관내피줄기세포, 신경줄기세포, 간, 근육, 상피 등 에서 발견되며 일부 종양에서도 발현이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 이외에도 배아의 착상시기 동안에 자궁내 막 내에서 증가되어 배아의 부착을 조장하는 것으로 알려 져 있다. 12,13 줄기세포는 손상된 조직의 재생과정에서 증가하는 것으 로 알려져 있는데, 자궁내막도 세포의 탈락 및 재생이라는 관점에서 비슷한 양상을 보일 것이다. 12 저자들은 자궁내막증이 줄기세포 혹은 전구세포로부터 발생한다면 월경 기간 중 탈락되는 자궁내막세포의 증식 및 분화 과정이 정상인과 다를 수 있으므로, 월경혈에서 자궁내막세포를 채취하여 세포의 증식 및 분화 과정을 관 찰하고, 줄기세포의 미분화표지자 OCT-4와 CXCR4의 발 현율을 비교하여 자궁내막증이 줄기세포와 관련된 질환인 지를 알아보고자 한다. 연구 대상 및 방법 1. 연구 대상 2009년 3월부터 7월까지 본원 산부인과를 방문한 25세 에서 40세 사이의 여성 중, 수술로 진단된 중등도 및 중증 자궁내막증 (moderate or severe endometriosis) 환자 6명을 실험군으로 하였으며, 초음파검사에서 자궁, 난소 및 나팔관 소견이 정상이면서 골반통 및 월경 장애 증상을 나타내지 않는 정상 월경주기의 여성 10명을 대조군으로 하였다. 2. 자궁내막세포의 채취 및 배양 자궁내막세포의 채취는 월경 주기 2일째에서 4일째 사 대한산부회지 제53권 제3호, 2010 - 266 - Table 1. cDNA primer pairs for undifferentiated markers of stem cells 26 Genes P r i m e r s e q u e n c e s OCT-4 Forward primer 5'-GGA AGG TAT TCA GCC AAA CG-3' Reverse primer 5'-TAG CCT GGG GTA CCA AAA TG-3' CXCR4 Forward primer 5'-AAT CTT CCT GCC CAC CAT CT-3' Reverse primer 5'-GAC GCC AAC ATA GAC CAC CT-3' Alpha-tubulin Forward primer 5'-GTA CCG TGG TGA CGT GGT TC-3' Reverse primer 5'-CTT GGC ATA CAT CAG GTC AA-3' 이에 시행하였으며, 흡입용 카테타를 이용하여 자궁내막의 손상을 최대한 줄이면서 월경혈을 1 mL 정도 채취하였다. 채취한 세포들은 digestion 용액 [DMEM/F-12+5% FBS (Hyclone, Logan, UT)+0.2% collagenase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)] 10 mL를 첨가한 후 20분마다 부드 럽게 피펫팅하면서 5% CO 2, 37℃ 환경에서 1시간 동안 배 양하였다. 이후 1,000 rpm 조건에서 10분간 원심분리를 시행하여 세포들만 따로 회수하였고, 회수된 세포들은 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% ampho- tericin B가 첨가된 DMEM/F-12 배지로 옮겨 48시간 동 안 배양하였다. 이후 적혈구 등의 부유물을 제거하기 위해 PBS 용액으로 3회 수세한 뒤 다시 10% FBS가 첨가된 DMEM/F-12 배지에서 배양하였다. 배양 2주 혹은 배양 접시의 70~80% 가량 세포가 배양된 후에는 0.05% trypsin-EDTA (Invitrogen, Gibco, USA) 처리하여 세포 를 회수하였다. Real time RT-PCR 검사를 위한 검체는 -79 ℃에서 냉동 보관하였으며, 일부 자궁내막증 환자의 검체는 Percoll density gradient method를 이용하여 적 혈구보다 작은 세포들을 따로 분리 배양하여 줄기세포의 특성을 나타내는지 관찰하였다. 3. Real time RT-PCR 검사 분리 자궁내막세포에서 total RNA는 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 추출을 하 였다. 추출 과정을 간단히 요약하면 먼저 Trizol reagent 1 mL를 넣고 분리된 자궁내막 세로를 분해시킨 후, 200 μL chloroform을 첨가하여 12,000 rpm, 4℃에서 15분간 원 심 분리하였다. 이후 상층액을 채취하여 500 μL isopro- panol을 첨가하여 RNA를 침전시킨 뒤 12,000 rpm, 4℃ 에서 10분간 원심분리를 하였다. 이후 상층액을 제거한 다 음 pellet을 75% 알콜로 2회 세척하고 건조시킨 뒤 DEPC-water로 pellet을 희석하여 60℃에서 10분 동안 방 치 -80℃에서 보관하였다. 추출된 total RNA 3 μg을 Oligo (dT)12-18 Primer,10 mM dNTP Mix, 0.1 M DTT, 5x F i r s t - S t r a n d b u f f e r , M - M L V R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 시약을 이용하여 reverse transcriptase실시하여 cDNA을 합성하였다. 선정된 유전 자의 PCR amplification을 위하여 제작된 forward p r i m e r 와 r e v e r s e p r i m e r 서 열 은 T a b l e 1 과 같 으 며 , alpha-tubulin은 internal control로 사용하였다. 합성된 cDNA 2 μg를 사용하여 iQ SYBR Green supermix (Bio-RAD, Hercules, CA, USA) 반응액과 총 20 μL을 96 w e l l p l a t e 에 서 i Q 5 r e a l - t i m e P C R d e t e c t i o n s y s t e m (Bio-RAD, Hercules, CA, USA)을 이용하여 PCR하였다. 반응 조건은 95℃에서 3분, 그 후 94℃에서 15초, 60℃ 에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40 cycles 반응시켰다. 유 전자 발현의 relative quantification은 2−ΔΔCT method을 이용하여 분석하였다. 분석된 그룹의 평균값의 비교는 SPSS 10.0 (Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 사용하여 two-sample t-test로 통계 분석하였으며, P<0.05 미만 인 경우를 통계유의성 있음으로 판정하였다. 결 과 1. 대조군 자궁내막세포의 증식 양상 배양 1~2일 째에 대조군의 자궁내막세포들은 대부분 다 각형 과립모양 상피세포와 길쭉한 기질세포가 배양접시에 부착되어 있었다. 간헐적으로 군집으로 뭉쳐진 세포군들이 최종렬 외 6인. 진행성 자궁내막증 환자의 자궁내막에서 추정줄기세포의 과다발현 - 267 - A B Fig. 1. The epithelial cells (A) and stromal cells (B) in the control group. Most of epithelial cells and stromal cells in the control group show homogeneous pattern. The colonies (arrow), which are compo sed of approximately 5~15 μm hyperchromatic round cells and very small round cells less than 3 μm, are rarely as compared with the group of endometriosis (scale bar: 50 μm). A B Fig. 2. The epithelial cells (A) and stromal cells (B) in the group of endometriosis. The supportive cells in the group of endometriosis show heterogeneous pattern. Very small round cells (arrow) and the colonies such as Figure 1-A are more common in the group of endometriosis compared with the control group. Very small round cells show the similar characteristics of very small embryonic-like stem cells; the mobile cells smaller than erythrocyte, the cell migration or adhesion to supportive cells, the cell aggregation (arrow) and sphere formation (scale bar: 50 μm). 발견되었으나 자궁내막증 환자군에 비하면 현저히 드물다. 군집으로 뭉쳐진 세포군 중에는 다수의 상피세포가 관찰되 었으며, 이외에도 과다염색질 원형세포들 (hyperchro- matic round cells)과 적혈구보다 작은 3 μm 미만의 극소 원형세포들 (very small round cells)이 관찰되기도 하였 다 (Fig. 1). 배양 3~4일 째에는 군집을 이룬 세포들의 증 식, 이주 및 변연부 부착을 확실히 관찰할 수 있었으며, 배 양 7일 째에는 섬유아세포와 유사한 세포 (fibroblastoid cell)들이 많이 관찰되었다. 배양 14일 째로 갈수록 20~30 μm 이상의 커다란 세포 위주의 증식 및 대칭분열이 관찰 되었다. 2. 실험군 자궁내막세포의 증식 양상 배양 1~2일 째에 배양접시에 부착된 상피세포와 기질세 포들은 대조군에 비하여 현저히 많았으며, 특징적으로 부 착된 지지세포들은 편평형, 원형, 원주형, 방추형, 별모양 형 등 이질적인 형태를 나타내었다. 이 외에도 대조군에서 대한산부회지 제53권 제3호, 2010 - 268 - A B Fig. 3. The asymmetric cell division of sphere-shaped cells derived from very small round cells. Very small round cells form the sphere-shaped cells (arrow) by cell aggregation. These sphere-shaped cells adhere to other site for the undifferentiated cells (A) or adhere to for the differentiated cell by cell fusion and nuclear recombination (B) (scale bar : 50 μm). A B Fig. 4. Colony formation (A) and embryoid body-like formation (B). These phenomena are the morphological characteristics of stem cells in vitro culture (scale bar: 100 μm). 관찰되었던 군집으로 뭉쳐진 세포군들이 더욱 흔히 관찰되 었는데, 군집의 중심부에는 약 5~15 μm 크기의 과다염색 질 원형세포들과 3 μm 미만의 극소원형세포들이 다수 관 찰되었다. 배양 3~4일 째에는 3 μm 미만의 극소원형세포 들이 현저히 관찰되었는데, 이 세포들 중 어떤 세포들은 지지세포 없이 움직이거나 또는 지지세포 위를 타고 이동 하였으며, 또 다른 세포들은 지지세포 위에 부착되어 있거 나 다발적으로 존재하는 것도 관찰되었다 (Fig. 2). 일부 세포들은 서로 다발적으로 응집되면서 10~20 μm 크기의 구형세포들 (sphere-shaped cells)을 형성한 후 지지세포 에서 떨어져나가 이주하여 다른 장소에 부착하였다. 구형 세포들 중 일부 세포들은 내부에 존재하는 극소원형세포들 이 융합하면서 전혀 다른 세포 형태로 분화하였는데, 이러 한 과정은 마치 상실배, 포배아, 부화를 거치는 배아의 발 달 과정과 유사한 면을 보였다 (Fig. 3). 배양 7일 째에는 초기에 다발적으로 부착한 세포를 중심으로 더욱 많은 세 포들이 생성되었고, 부착했던 장소의 주변에는 섬유아세포 와 유사한 길쭉한 세포들이 가득 증식한 것을 관찰할 수 있었다. 배양 14일 째에는 섬유아세포 모양의 세포들이 배 양 접시의 대부분을 차지하였고, 편평형 혹은 원주형 세포 가 대부분이었다. 특징적으로 초기에 다발적으로 부착한 세포를 중심으로 시간이 흐를수록 과다염색질 원형세포들 최종렬 외 6인. 진행성 자궁내막증 환자의 자궁내막에서 추정줄기세포의 과다발현 - 269 - A B Fig. 5. Self renewal (A) and embryoid body-like formation (B) of very small round cells. At day 7 in vitro culture, the very small round cells separated by Percoll density gradient method are confluent on petri dish. Thereafter these cells differentiate gradually larger cells by cell fusion (filled arrow) or form embryoid body-like formation (open arrow) (scale bar: 50 μm). A B Fig. 6. Asymmetric cell division (A) and neuron-like cells (B). The sphere-shaped cells derived from very small round cells show frequently asymmetric cell division (arrow). Especially neuron -like cells are often detected (scale bar: 50 μm). 과 극소원형세포들이 더욱 치밀히 뭉쳐지면서 마치 자갈돌 (cobble stone) 모양을 나타내었다 (Fig. 4). 세포 밀도가 높아지면 수많은 극소원형세포들과 구형세포들이 서로 응 집하여 배아체 (embryoid body)와 유사한 형성을 나타내 기도 하였다 (Fig. 4). 극소원형세포들만 따로 분리하여 7일 정도 배양을 해 보면 배양 접시를 가득 메운 극소원형세포들을 확인할 수 있으며, 이후에는 점진적으로 극소원형세포들이 모이면서 커다란 세포로 분화해 나가거나 배아체와 유사한 형성을 나타내는 것을 확인할 수 있다 (Fig. 5). 초기에 형성되는 세포들은 편평형, 원형, 원주형, 방추형, 별모양형 등 여러 가지 이질적인 형태의 세포들이 관찰되고 간헐적으로 신경 세포와 유사한 세포들도 관찰되었다. 배양을 지속할수록 섬유아세포와 유사한 기질세포 위주의 증식이 관찰되었다 (Fig. 6). 3. 미분화 줄기세포 표지자 OCT-4와 CXCR4 발현율 배양된 자궁내막세포를 대상으로 줄기세포의 미분화표 지자인 OCT-4와 CXCR4의 발현율에 차이가 있는지를 대한산부회지 제53권 제3호, 2010 - 270 - c o n t r o l e n d o m e t r i o s i s c o n t r o l e n d o m e t r i o s i s 25 20 15 10 5 0 OCT-4 CXCR4 P<0.05 P<0.0535 30 25 20 15 10 5 0 * * Fig. 7. Real time RT-PCR for OCT-4 and CXCR4. The expressions of OCT-4 and CXCR4 in the group of endometriosis are respec- tively 5.66 times and 17.69 times as high as the control group (P<0.05). real time RT-PCR 방법으로 조사하였다. 실험군의 자궁 내막세포는 대조군에 비하여 OCT-4와 CXCR4 모두에서 높은 발현율을 나타내었는데, OCT-4의 발현율은 5.66배 ( P<0.05), CXCR4의 발현율은 17.69배 높게 발현되었다 (P<0.05) (Fig. 7). 고 찰 자궁내막증의 발생 가설로서 월경혈 역류설, 체강상피 화생설, 태생 잔존세포설, 림프혈관 전이설 등이 있으나, 아직까지 자궁내막증의 병인을 완전히 설명할 수 있는 가 설은 없다. 최근 제시되고 있는 자궁내막증이 줄기세포 혹 은 전구세포에 의해 발생한다는 가설은 세포 수준에서 앞 에서 제시된 대표적인 자궁내막증 가설들과 신체 내에서 일어나는 여러 현상들을 모두 설명할 수 있어 매우 설득력 이 높다. 3 월경혈 역류설은 기저층에 상주하고 있는 자궁 내막 줄기세포가 월경 기간 중 복강 내로 탈락 이식되어 자궁내막증이 발생한다고 설명할 수 있으며, 체강상피 화 생설은 장막이나 복막에 존재하는 자궁내막 혹은 기타 부 위 유래의 줄기세포가 어떤 자극인자와 함께 상호작용하여 체강상피 화생을 일으킨다고 설명할 수 있으며, 태생 잔존 세포설은 뮬러관에 잔존해 있던 줄기세포가 어떠한 자극인 자에 의해 자궁내막증으로 유도된다고 설명할 수 있으며, 림프혈관 전이설은 자궁내막 줄기세포가 림프혈관을 통하 여 원거리 전이로 발생한다고 설명할 수 있다. 3 이외에도 자궁내막증 환자의 비정상적인 사이토카인, 성장인자, 기 질금속단백분해효소의 증가 현상은 줄기세포의 손상된 조 직의 재생 과정에서 일어나는 현상과 유사한 면이 있으며, 부적절한 면역 기능은 줄기세포 고유의 면역회피 능력으로 설명할 수 있다. 이러한 줄기세포 가설을 뒷받침하는 근거로는 첫째, 자 궁내막의 기저층과 기질의 혈관 주위에서 자궁내막의 줄기 세포 혹은 전구세포가 다수 발견된다는 점, 8 둘째, 자궁내 막의 줄기세포와 전구세포로부터 평활근, 뼈, 연골, 지방 으로 분화할 수 있다는 점,14 셋째, 생리혈에서 발견된 자 궁내막 줄기세포가 3배엽의 9가지 조직으로 분화할 수 있 다는 점,15 넷째, 자궁내막증 환자의 정상부위 자궁내막, 이소성 자궁내막, 자궁근층에서 신경세포가 발견된다는 점, 16 다섯째, 심부층 자궁내막조직의 섬유근층 분화 과정 은 이소성 자궁내막과 그 주변조직의 상호 반응의 결과라 는 점,17 여섯째, 자궁내막증 환자의 복강액 중 줄기세포인 자의 농도가 증가되어 있으며 이소성 자궁내막조직에 수용 체 지표인 c-kit가 발현된다는 점,18 일곱째, 줄기세포의 활성도 검사, 즉 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용 체, 사이토크롬 p450 표현형 검사에서 자궁내막증과 자궁 선근증 병변은 자궁내막 기저층과 유사한 주기적 패턴을 보인다는 점, 9 여덟째, microarray를 이용한 연구에서 자 궁내막증 여성의 정상부위 및 이소성 자궁내막이 정상인과 는 다른 유전자 변화를 나타낸다는 점,10 아홉째, 복강 내 부착된 이소성 자궁내막조직에 줄기세포의 특성을 나타내 는 미분화된 세포가 많다는 점 19 등이 있다. 줄기세포는 반복 분열하여 자가 재생능이 있으면서 더 욱 분화된 세포를 생산할 수 있는 미분화된 세포로서 일반 적으로 배아줄기세포와 성체줄기세포로 크게 나눈다. 배아 줄기세포는 배반포 유래의 세포로서 3배엽으로 모두 분화 할 수 있는 미분화세포를 말하며, 성체줄기세포는 발생이 끝난 이후에도 신체의 각 부분에 남아있는 미분화세포이 다. 성체줄기세포의 대표적인 특징으로는 자가 재생능 (self-renewal), 비대칭 분열 (asymmetric cell divi- sion), 분화 유연성 (differentiation plasticity)이 있다. 최종렬 외 6인. 진행성 자궁내막증 환자의 자궁내막에서 추정줄기세포의 과다발현 - 271 - 자가 재생능은 줄기세포가 미분화성과 다중분화능을 가진 세포를 재생산해내는 것을 말하고, 비대칭 분열은 일부는 미분화 세포로 분열하고 나머지 일부는 분화된 세포로 분 열이 일어나는 것을 말하며, 분화의 유연성은 본래 세포가 가지고 있던 분화의 프로그램과는 다른 종류의 세포로 분 화하는 것을 말한다. 대표적인 성체줄기세포의 예로는 조 혈모세포, 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 제대혈 줄기세 포, 각종 조직 특유의 줄기세포 (tissue committed stem cell) 등이 있으며 자궁에서도 줄기세포가 발견되었다. 8 최 근 기존의 알려진 줄기세포 이외에도 낭배 (gastrula)의 외피 (epiblast) 유래의 만능줄기세포로 추정되는 극소배 아양줄기세포가 존재한다고 보고되고 있는데, 이 세포는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄 기세포, 조직 특유의 줄기세포로 분화할 수 있으며, 쥐의 모든 장기, 인간의 제대혈, 골수 및 말초혈액에서 발견되 었다. 12,20-22 줄기세포 여부를 확인하는 방법으로는 in vitro 평가방 법과 in vivo 평가방법이 있다. in vitro 평가방법에는 군 집형성능 (clonogenicity), 증식능, 자가 재생능, 분화능을 조사하는 방법이 있고, in vivo 평가방법에는 조직재구성 법, label-retaining cell (LRC), 자가 재생능 평가방법을 사용하기도 한다. 이러한 줄기세포를 신체에서 손쉽게 찾 아낼 수 있는 방법을 연구 중에 있으나 아직까지는 한계가 있으며, 최종적으로 줄기세포 여부를 확인하기 위해서는 여러 평가방법을 사용해야 한다. 3,8 본 연구에서는 줄기세포 여부를 확인하기 위하여 in vitro 평가방법을 이용하여 배양시 줄기세포의 특징적인 현상들이 나타나는지 관찰하였고, 보조적으로 줄기세포의 미분화표지자 발현양에 차이가 있는지 조사하였다. 자궁내 막증 환자의 월경혈에서 채취한 자궁내막세포들 중에는 매 우 이질적인 모양의 부착된 기질세포들이 다수 발견되며, 이후 지속적으로 배양해 보면 점진적으로 섬유아세포와 유 사한 세포들로 배양 접시를 채워 나가는 것을 볼 수 있는 데, 이러한 현상들은 중간엽 줄기세포가 포함된 조직 배양 시에 나타나는 특징들이다. 특히 자궁내막증 환자의 세포 들 중에는 적혈구보다 작은 극소원형세포들이 다수 발견되 었는데, 이 세포들은 여러 문헌에서 보고하고 있는 극소배 아양 줄기세포의 형태학적 특징 및 움직임들과 매우 유사 하다. Kucia 등은 생쥐의 모든 조직과 인간의 골수에서 유 세포 분석기 (flow cytometry)를 이용하여 극소배아양 줄 기세포를 동정하였는데, OCT-4, SSEA-4, CXCR4 등을 발현하는 6-8 μm 세포라고 보고하였다.12,20-22 이 외에도 Virant-Klun 등은 인간의 난소 표면 상피에서 SSEA-4, OCT-4, Nanog, SOX-2, c-kit를 발현하는 2-4 m 줄기 세포가 존재한다고 보고하였으며, 23 McGuckin 등은 인간 의 제대혈에서 OCT-4, SOX-2를 발현하는 2-3 μm 줄기 세포가 존재한다고 보고하였으며,24 Hung 등은 3 μm보다 더욱 작은 줄기세포가 인간의 골수에 존재한다고 보고하였 다.25 저자들이 관찰한 이 세포들이 줄기세포인지를 다시 확 인 하 기 위 하 여 추 가 적 으 로 P e r c o l l d e n s i t y g r a d i e n t method를 이용하여 분리 및 배양하였더니 자가 재생, 세 포 융합 및 구형 세포 형성, 비대칭 분열, 군집 형성, 배아 체양 형성, 핵의 재조합과 같은 줄기세포의 전형적인 특징 들이 모두 나타났다. 저자들은 이러한 세포배양 관찰을 토대로 자궁내막증 군과 대조군 간에 추정줄기세포의 양적인 차이가 있는지를 확인하기 위하여 OCT-4와 CXCR4 발현율을 real time RT-PCR 방법으로 조사하였으며, 자궁내막증에서 정상인 과 비교시 OCT-4는 5.66배 그리고 CXCR4는 17.69배 높 게 발현되었다 ( P<0.05). 이러한 결과들을 보았을 때 자궁 내막증 환자는 월경기 동안에 많은 자궁내막 추정줄기세포 들이 탈락되는 것을 간접적으로 알 수 있다. 한편 극소원형세포들이 OCT-4와 CXCR4 발현과 직접 적인 상관관계가 있는지를 추가적으로 확인할 필요성이 있 어, 현재 저자들은 극소원형세포가 직접적으로 OCT-4와 CXCR4를 발현시키는 것인지 혹은 극소원형세포에서 유래 한 세포가 OCT-4와 CXCR4를 발현시키는 것인지를 연구 중에 있다. 또한 본 연구는 연구 대상자가 적어 향후 더 많 은 모집단을 대상으로 한 연구가 필요할 것이며, 추가적으 로 이 추정줄기세포들이 월경기에 자궁으로 유입된 것인 지, 월경 이전 분비기에 자궁으로 유입된 것인지, 또는 만 성적으로 자궁에 다량 잠복되어 있는 것인지에 대한 연구 도 필요할 것으로 생각된다. 대한산부회지 제53권 제3호, 2010 - 272 - 참고문헌 1. 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방법으로 분리 및 배양하면서 세포의 특징을 관찰하였다. OCT-4와 CXCR4 발현율 차이는 real time RT-PCR을 이용하 여 분석하였다. 결과: 자궁내막증 환자의 자궁내막세포들은 대조군에 비하여 형태학적으로 다른 특징을 나타내었는데, 이질적인 지지세포들 과 3 μm 미만의 극소원형세포들과 약 5~15 μm의 과다염색질 원형세포들이 더욱 흔히 관찰되었다. 이후 3 μm 미만의 극소원 형세포들만 다시 분리하여 배양한 결과, 자가 재생, 비대칭 분열, 군집 형성, 배아체 형성과 같은 줄기세포의 여러 특징들을 나타내었다. 3 μm 미만 극소원형세포들은 극소배아양 줄기세포와 유사한 특성을 나타내었는데, 적혈구보다 작은 세포가 움직이거나, 지지세포로 이동 혹은 부착하기도 하고, 세포 응집을 통해 구형세포를 형성하거나, 세포 융합을 통해 새로운 분화된 세포를 형성하기도 하였다. real time RT-PCR을 이용한 OCT-4와 CXCR4 검사에서는 자궁내막증 환자가 대조군에 비하여 각각 5.66배, 17.69배 높게 발현하였다 (P<0.05). 결론: 자궁내막증 환자의 자궁내막세포에서 줄기세포의 특성을 나타내는 3 μm 미만의 극소원형세포와 약 5~15 μm의 과다염색 질 원형세포들이 더욱 흔히 존재하였으며, 자궁내막증 환자 군의 OCT-4와 CXCR4의 발현율은 통계학적으로 유의하게 높았 다. 이는 줄기세포가 자궁내막증의 병인에 있어 주된 역할을 할 수도 있다는 것을 암시하며, 향후 OCT-4와 CXCR4가 자궁내 막증의 진단 또는 경과관찰에 유용한 도구로 사용될 수도 있을 것으로 사료된다. 중심단어: 자궁내막증, 줄기세포, OCT-4, CXCR4