and methods. Newborn female Wistar rats (n=29) were used for the experiment. At the first stage, to stimulate adenomyosis, rats (main group, n=21) were orally administered with a selective estrogen receptor modulator (tamoxifen 20 mg) at the calculated rate of 1 mg of the drug/kg of animal weight 1 time per day from 2 to 5 days of postembryonic development (P2—P5). The control group of 8 rats received distilled water. At the second stage, rats from the main group were divided into two subgroups. In the first experimental subgroup (n=15), animals received atosiban at a dosage of 0.5 mg/kg/day intraperitoneally from 40 to 60 days of life; in the second experimental subgroup (n=6) the drug was not used. To assess the pain syndrome and general hyperalgesia, before removing the animals from the experiment, a hot plate test was performed twice with an interval of 24 hours with the calculation of the average value.
Results. Based on the results of a histological study in the first subgroup after the use of an oxytocin receptor inhibitor, adenomyosis with the presence of single glands in the myometrium was noted in 1 rat out of 15 (6.7%); in the second subgroup, adenomyosis was observed in all 6 rats (100%). There were statistically significant differences according to Fisher’s exact test. In rats of the control group (n=8), endometrial glands were absent in the myometrium. According to the results of the hot plate experiment, the lowest latency was in the second subgroup (tamoxifen only, no atosiban treatment) — 40.1 [32.1; 50.1] sec. In the atosiban treatment subgroup, the latency was higher — [58.4 (38.8; 75.4] sec, and in the control group it was the highest (74.3 [52.5; 82.9] sec), while there were statistically significant differences between groups according to the Kruskal—Wallis test.
Conclusion. The use of the oxytocin receptor inhibitor atosiban is highly effective in rats with experimental adenomyosis and justifies the need for its further study as a targeted therapy for the disease.
***
В.И. Киселев, Л.А. Ашрафян
Институт онкогинекологии и маммологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
E-mail:
[email protected],
[email protected]
Исследования в области эпигенетики различных патологий человека существенно расширились за последнее десятилетие. Для пролиферативных заболеваний органов женской репродуктивной системы эпигенетические изменения рассматриваются как важнейший элемент патогенеза таких заболеваний, как миома, аденомиоз, эндометриоз. Накоплен большой объем данных, указывающих на значение эпигенетических изменений в геноме клеток эндометрия. Очевидно, что эти исследования открывают перед нами новые возможности как в диагностике, так в лечении этих патологии.
Необходимо отметить, что изменения генетической программы, возникающие в результате воздействия патологических факторов на генетический код, не сопровождаются изменением структуры ДНК. То есть речь не идет о мутациях, так как первичная последовательность генома не нарушается, а лишь изменяется спектр экспрессируемых генов. И это важнейшая особенность эпигенетических изменений, так как она создает предпосылки для лекарственной регуляции этих процессов.
Сегодня мы довольно хорошо понимаем механизмы эпигенетического перепрограммирования клетки. Можно выделить три основных механизма, осуществляющих изменение генетической программы, которые активируются при действии патологических факторов на клетку. Это ДНК метилтрансферазы, которые метилируют гены, что приводит к их умолканию, гистондеацетилазы, изменяющие конформацию хроматина, и микроРНК, которые могут блокировать работу генов на уровне матричных РНК. Органы женской репродуктивной системы обладают особой чувствительностью к эпигенетическим изменениям. Видимо, это обусловлено гормонзависимой цикличностью их функционирования.
В настоящей работе обсуждаются процессы метилирования ДНК при различных патологиях эндометрия. Есть по меньшей мере три причины, по которым именно этот механизм привлекает наше внимание: 1. ДНК-метилирование — важнейший механизм регуляции генов при различных пролиферативных заболеваниях включая злокачественные процессы и гиперпластические заболевания эндометрия. 2. ДНК-метилирование довольно легко измерять в лабораторных условиях. 3. ДНК-метилирование — это обратимый процесс, следовательно, можно восстановить активность генов через процесс деметилирования!
Установлено, что при хроническом эндометрите наблюдается интенсивное метилирование генов HOX10 и HOX11, ответственных за рецептивность эндометрия. Показано, что значительно чаще гиперметилирование этих генов наблюдается у женщин с диагнозом «бесплодие». Эти данные согласуются с ранее полученными результатами у женщин с нарушением фертильности на фоне эндометриоза. Высказано предположение, что эпигенетические модификации в виде метилирования генов могут играть важную роль в патогенезе патологий эндометрия, включая нарушения фертильности. На экспериментальной модели эндометриоза показана высокая терапевтическая эффективность лекарственного средства на основе индол-3-карбинола, обладающего ингибирующей активностью в отношении ДНК-метилтрансфераз. В экспериментах in vitro показана способность индол-3-карбинола деметилировать гены, что приводит к восстановлению их экспрессии. Обсуждается возможность терапии бесплодия, обусловленного гиперметилированием генов рецептивности, с применением лекарственных средств на основе индол-3-карбинола.
V.I. Kiselev, L.A. Ashrafyan
Institute of Oncogynaecology and Mammology of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology Named after Academician V. I. Kulakov, Moscow, Russia
E-mail:
[email protected],
[email protected]
Studies of epigenetics of various human conditions have significantly expanded over the last decade. For proliferative diseases of the female reproductive system, epigenetic changes are the most important element in the pathogenesis of such diseases as myoma, adenomyosis, and endometriosis. A large body of data has been accumulated indicating the significance of epigenetic changes in the genome of endometrial cells. These studies open up new opportunities both in diagnostics and treatment of these disorders.
It should be noted that changes in the genetic program resulting from the impact of pathological factors on the genetic code are not accompanied by changes in the DNA structure. So, it is not about mutations since the primary genome sequence is not altered, but only the spectrum of expressed genes is changed. And this is the most important feature of epigenetic changes since it creates the prerequisites for drug-mediated regulation of these processes.
Today we understand the mechanisms of epigenetic cell reprogramming quite well. We can distinguish three main mechanisms of the genetic program alterations, activated upon the action of pathological factors on the cell. These are DNA methyltransferases methylating genes leading to their silencing, histone deacetylases changing chromatin conformation, and microRNA blocking gene function at the level of matrix RNA. The organs of the female reproductive system are particularly sensitive to epigenetic changes due to the hormone-dependent cycling of their functioning.
This paper addresses DNA methylation processes in various endometrial disorders. There are at least three reasons why this mechanism is relevant. 1. DNA methylation is the most important mechanism of gene regulation in various proliferative diseases, including malignant processes and hyperplastic endometrial disorders. 2. DNA methylation is quite easy to measure in vitro. 3. DNA methylation is a reversible process; hence, it is possible to restore gene activity through the demethylation process!
Intensive methylation of HOX10 and HOX11 genes responsible for endometrial receptivity was reported in chronic endometritis. Hypermethylation of these genes was shown to be significantly more frequent in women diagnosed with infertility. These findings are consistent with those previously obtained in women with impaired fertility due to endometriosis. It is suggested that epigenetic modifications by gene methylation may play an important role in the pathogenesis of endometrial disorders, including fertility disorders. The high therapeutic efficacy of a drug based on indole-3-carbinol with inhibitory activity against DNA methyltransferases was shown in an experimental model of endometriosis. In vitro experiments showed the ability of indole-3-carbinol to demethylate genes, which leads to the restoration of their expression. The prospects of therapy of infertility caused by hypermethylation of receptivity genes using drugs based on indole-3-carbinol are discussed.
***
В.Ф. Беженарь, В.А. Линде, В.В. Новак
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
E-mail:
[email protected]
МикроРНК — класс малых некодирующих молекул РНК, принимающих участие в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, отвечающих за синтез и секрецию различных белков. Известно, что в сложную и до конца не выясненную генную сеть эндометриоза и, в частности, одну из наиболее распространенных его форм — аденомиоз, входят гены, контролирующие более 30 различных метаболических путей. На первом этапе была оценена активность 85 микроРНК, ассоциированных с эндометриозом или другими пролиферативными заболеваниями. Из них 6 (7,1%) микроРНК проявляли активность только в контрольной группе. Экспрессия 27 (31,8%) микроРНК была зафиксирована только в эндометрии женщин, страдающих аденомиозом. На втором этапе для изучения участия микроРНК в патогенезе аденомиоза и ассоциированного с ним бесплодия были выбраны CD20, CD56, CD138 как маркеры активности иммунокомпетентных процессов в эндометрии. Обнаружено наличие высоких корреляционных связей между CD20 и микроРНК mir 10b-5p и mir195-5p. Выявлена высокая положительная корреляционная связь между CD20, CD56 и CD138. Показано, что изменение активности CD20 и CD138 в эндометрии могут служить в качестве диагностического критерия при оценке степени тяжести течения аденомиоза.
V.F. Bezhenar, V.A. Linde, V.V. Novak
Pavlov University, St. Petersburg, Russia
E-mail:
[email protected]
MicroRNAs are a class of small non-coding RNA molecules involved in the transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression responsible for the synthesis and secretion of various proteins. It is known that the complex and not fully elucidated gene network of endometriosis and, in particular, one of its most common forms, adenomyosis, includes genes controlling more than 30 different metabolic pathways. The activity of 85 microRNAs associated with endometriosis or other proliferative diseases was evaluated first.Six microRNAs (7.1%) showed activity only in the control group. The expression of 27 microRNAs (31.8%) was detected only in the endometrium of women with adenomyosis. Further, CD20, CD56, and CD138, as markers of immunocompetent process activity in the endometrium, were chosen to study microRNA involvement in the pathogenesis of adenomyosis and associated infertility. A strong correlation was found between CD20 and mir10b-5p and mir195-5p microRNAs. A strong positive correlation between CD20, CD56 and CD138 was found. It was shown that changes in CD20 and CD138 activity in the endometrium might be used as a diagnostic criterion in assessing the severity of adenomyosis.
***
Цзичан Ни (Jichan Nie)1, Юньхуа И (Yunhua Yi)1, Сиши Лю (Xishi Liu)1, 2, Сунь-Вэй Го (Sun-Wei Guo)1, 2
1Шанхайская акушерско-гинекологическая больница Фуданьского университета, Шанхай, Китай;
2Главная лаборатория Шанхая по эндокринно-репродуктивным заболеваниям у женщин Фуданьского университета, Шанхай, Китай
E-mail:
[email protected]
Сигнальные пути простагландина Е2 (ПГЕ2) широко изучены как ключевой механизм повышенного локального синтеза эстрогенов, воспаления и медиации боли. ПГЕ2 является продуктом метаболизма арахидоновой кислоты, из которой под действием циклооксигеназы (ЦОГ) образуется простагландин H2 (ПГН2), который затем расщепляется синтазами ПГЕ (MPGES-1, MPGES-2 и cPGES) с образованием ПГЕ2. В данной цепочке реакций ЦОГ-2 является основным лимитирующим ферментом, однако mPGES-1, mPGES-2 и cPGES-1 также играют важную роль в синтезе. После синтеза действие ПГЕ2 опосредуется его рецепторами, EP1–EP4. Описана сверхэкспрессия ЦОГ-2, EP2 и EP4 при эндометриозе. 15-Гидроксипростагландин-дегидрогеназа (15-PGDH, кодируется HPGD) катализирует разрушение простагландинов, в основном ПГЕ2. Однако известно, что ПГЕ2 также обладает антифибротическим действием. Учитывая недавнюю публикацию о том, что уровни окрашивания на ЦОГ-2, EP2 и EP4 в очагах поражения отрицательно коррелируют со степенью фиброза очага поражения, проведено данное исследование для дополнительной оценки иммуногистохимического окрашивания на ЦОГ-2, EP2, EP4 и mPGES-1, mPGES-2, cPGES-1 и 15-PGDH в эндометриоме яичника (ЭЯ), глубоком эндометриозе (ГЭ) и аденомиозе (АМ), а также в контрольной ткани эндометрия. Мы проводили отбор пораженных тканей у 19 пациентов с ЭЯ и по 20 пациентов с ГЭ и АМ. В качестве контроля образцы нормальной ткани эндометрия (НЭ) получали после письменного информированного согласия от 20 женщин с нормальным менструальным циклом, сопоставимых по возрасту и менструальной фазе с пациентками с ЭЯ, ГЭ и АМ, перенесших тотальную гистерэктомию по поводу плоскоклеточного интраэпителиального поражения высокой степени (HSIL), но не имеющих эндометриоза и аденомиоза. Оценивали иммуногистохимическое окрашивание на ЦОГ-2, EP2, EP4 и mPGES-1, mPGES-2, cPGES-1 и 15-PGDH, а также степень фиброза очага поражения. Уровни иммуногистохимического окрашивания на ЦОГ-2, EP2, EP4, mPGES1, mPGES-2 и cPGES-1 были значимо снижены при ЭЯ, ГЭ и АМ по сравнению с НЭ. И наоборот, уровень иммуногистохимического окрашивания 15-PGDH и степень фиброза в очаге поражения были значимо повышены при ЭЯ, ГЭ и АМ. Наблюдалась значимая отрицательная корреляция между уровнями окрашивания на ЦОГ-2, EP2, EP4, mPGES1, mPGES-2 и cPGES-1 и степенью фиброза в тканях эктопического эндометрия. Однако не обнаружено корреляции между экспрессией 15-PGDH и степенью фиброза. В совокупности наши данные свидетельствуют о том, что активность сигнальных путей ПГЕ2 снижается постепенно и пропорционально степени фиброза в эктопическом эндометрии. Однако разрушение ПГЕ2, по-видимому, в меньшей степени связано с фиброзом. Полученные результаты имеют большое значение для фундаментальных исследований и клинической практики, поскольку ставят вопрос о роли ПГЕ2 в локальной продукции эстрогенов и об использовании селективных ингибиторов ЦОГ-2 или ингибиторов EP2/EP4 в качестве терапевтических средств.
Jichan Nie1, Yunhua Yi1, Xishi Liu1, 2, Sun-Wei Guo1, 2
1Shanghai OB/GYN Hospital, Fudan University, Shanghai, China;
2Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine-Related Diseases, Fudan University, Shanghai, China
E-mail:
[email protected]
Prostaglandin E2 (PGE2) signaling is widely viewed as a key molecule in the increased local estrogen synthesis, inflammaton and as a pain mediator. PGE2 is converted from substrate arachidonic acid by cyclooxygenase (COX) to PGH2, which is then catalyzed by PGE synthases (MPGES-1, MPGES-2, and cPGES) to produce PGE2. Among them, COX-2 is the main rate-limiting enzyme and mPGES-1, mPGES-2, and cPGES-1 also play important roles in synthesis. Once synthesized, the actiton of PGE2 is mediated by its recetpors, EP1-EP4. Overexpression of COX-2, EP2 and EP4 has been reported in endometriosis. 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (15-PGDH, encoded by HPGD) catalyzes the degradation of prostaglandins, mainly PGE2. However, PGE2 also is known to be anti-fibrotic. Given the recent report that lesional staining levels of COX-2, EP2 and EP4 correlate negatively with extent of lesion fibrosis, this study was undertaken to further evaluate the immunostaining of COX-2, EP2, EP4 and mPGES-1, mPGES-2, cPGES-1 and 15-PGDH in ovarian endometrioma (OE), deep endometriosis (DE) and adenomyosis (AD), as well as in control endometrium. We collected lesional tissues from 19 patients with OE, 20 patients each with DE and AD. As controls, normal endometrial tissue samples (NE) were obtained after written informed consent from 20 cycling women, age- and menstrual phase-matched with patients with OE, DE and AD, who underwent total hysterectomy for high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL), but free of endometriosis and adenomyosis. Immunohistochemical staining of COX-2, EP2, EP4 and mPGES-1, mPGES-2, cPGES-1 and 15-PGDH, along with the extent of lesional fibrosis, was evaluated. The immunohistochemical staining levels of COX-2, EP2, EP4, mPGES1, mPGES-2, and cPGES-1 were reduced significantly in OE, DE and AD as compared with NE. In contrast, the immunohistochemical staining levels of 15-PGDH and the extent of lesional fibrosis was significantly elevated in OE, DE, and AD. There was a significant negative correlation between COX-2, EP2, EP4, mPGES1, mPGES-2, and cPGES-1staining levels and the extent of fibrosis in the ectopic endometrial tissues. But there was no correlation between 15-PGDH expression and the degree of fibrosis. Taken together, our data indicate that the PGE2 signaling is reduced progressively and in proportional to the extent of lesional fibrosis in ectopic endometrium. However, the degradation of PGE2 seems to be less related to fibrosis. This has important implications to basic research and to clinical management as well, since it raises the question for the role of PGE2 in local estrogen production and for the use of selective COX-2 inhibitors or EP2/EP4 inhibitors as therapeutics.
***
В.А. Печеникова, А.Д. Корчинская
ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», Санкт-Петербург, Россия
E-mail:
[email protected]
Введение. Аномально высокая выживаемость клеток эндометрия при эндометриозе объясняется снижением клеточного иммунитета при данном заболевании. Некоторые исследователи считают, что эндометриоз — не что иное как «болезнь макрофагов».
Материал и методы. Проведен морфологический и иммуногистохимический (ИГХ) анализ операционного материала 23 наблюдений эндометриоза послеоперационного рубца. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу Ван Гизона. ИГХ-исследование выполнено по стандартной авидин-биотиновой методике с использованием моноклональных мышиных антител к макрофагам (CD68), трансформирующему фактору роста b-1 (TGF-b-1), α-SMA гладкомышечному актину (DAKO, Дания).
Результаты. Макроскопически эндометриоз послеоперационного рубца представлял собой плотные узлы из белесой волокнистой ткани без четкой истиной капсулы, хорошо отграниченные от окружающих тканей. Размеры узлов варьировали от 2 до 8 см в диаметре. На разрезе были видны щели и полости величиною от нескольких миллиметров до 1,0—1,5 см, заполненные густой коричневой жидкостью или темной кровью. При морфологическом исследовании эндометриоз послеоперационных рубцов характеризовался наличием эндометриоидных гетеротопий, представленных цитогенной стромой и железами, выстланными эпителием эндометриоидного типа, «старыми и свежими» кровоизлияниями, отложением гемосидерина. В очагах преобладали регрессивные изменения в виде микро- и макрокистозной трансформации желез и фиброза цитогенной стромы, что, вероятно, свидетельствует о длительности их существования. Вокруг и между гетеротопиями были обнаружены поля соединительной ткани с большим количеством коллагеновых волокон. Характерной особенностью эндометриоза была диффузная и очаговая лимфо-макрофагальная инфильтрация цитогенной стромы гетеротопий и окружающих их тканей. Наиболее выраженной она была в местах отложение гемосидерина. В некоторых случаях лимфо-макрофагальная инфильтрация была очаговой по типу микроабсцессов. В инфильтратах была обнаружена положительная экспрессия CD-68 положительных клеток — 15,5 [2,0; 42,0]. Макрофаги обнаруживались преимущественно в местах отложения гемосидерина. В цитогенной строме гетеротопий была обнаружена положительная экспрессия TGF-β-1, она варьировала от 12,8 до 24,5%. Перифокально в виде «муфт» вокруг эндометриоидных гетеротопий была обнаружена положительная экспрессия α-SMA гладкомышечного актина. В цитогенной строме очагов эндометриоза были выявлены концентрические пролифераты миофибробластов, в которых также экспрессировался α-SMA гладкомышечный актин.
Заключение. Пролиферация миофибробластов с последующим фиброзом является одним из этапов прогрессии эндометриоза, закономерным регенераторным процессом в ответ на повреждение и следствием воспалительной реакции пораженной ткани на эндометриоидную гетеротопию. Активная миграция макрофагов в очаг воспаления приводит к продукции TGF-β-1 — одного из ингибиторов апоптоза и стимулятора пролиферации, в том числе миофибробластов и неоангиогенеза. Таким образом, ранняя диагностика и лечение эндометриоза представляются важными с точки зрения предотвращения процессов фиброзирования и склероза пораженных тканей и органов, приводящих к их деформации и нарушению функций.
V.A. Pechenikova, A.D. Korchinskaya
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
E-mail:
[email protected]
Introduction. The abnormally high survival rate of endometrial cells in endometriosis is explained by a decrease in cellular immunity in this disease. Some researchers believe that endometriosis is nothing more than a «macrophage disease».