Interferon signaling is enhanced by ATR inhibition in glioblastoma cells irradiated with X-rays, protons or carbon ions

Background and purpose:  Interferon signaling plays an important role in antitumor immune responses. Inhibitors of  the DNA damage response, such as ATR inhibitors, can increase interferon signaling upon  conventional radiotherapy with X‐rays. However, whether such inhibitors also increase  interferon (IFN) signaling after high linear energy transfer (LET) particle irradiation is not  known.

Human glioblastoma U‐251 and T 98G cells were treated with X‐rays, protons (linear energy  transfer (LET): 7 and 38 keV/m) and carbon ions (LET: 28 and 73 keV/m), with and without  ATR inhibitor (VE822) or ATM inhibitor (AZD1390). DNA damage signaling and cell cycle  distribution were assayed by immunoblotting and flow cytometry, and radiosensitivity by  clonogenic survival. IFN‐ secretion was measured by ELISA and STAT1 a ctivation by  immunoblotting.

High‐LET protons and carbon ions caused stronger activation of the DNA damage response  compared to low‐LET protons andX‐rays at similar radiation dose. G2 checkpoint arrest was  abrogated by the ATR inhibitor and prolonged by the ATM inhibitor after all radiatio n types.  The inhibitors increased radiosensitivity, as measured after X‐ and carbon‐ion‐irradiation.  ATR inhibition increased IFN signaling after both low‐LET and high‐LET irradiation in both cell  lines. In T98G, IFN signal ing was also enhanced by ATM inhibition. Notably, T98G cells  secreted markedly more IFN‐ when the inhibitors were combined with high‐LET compared  to low‐LET irradiation.

Our results show that ATR inhibition can increase IFN signaling after both X‐, proton‐ and  carbon‐ion‐irradiation. Additionally, IFN induction is strongly dependent on LET in on e of the  tested cell lines.                                        .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 3

Glioblastoma (GBM) is the most common and deadliest type of brain cancer.  Radiotherapy is part of the standard treatment, but treatment efficacy is limited by tumor  radioresistance and damage to the normal brain [1]. Particle irradiation with carbon ions or  protons may potentially improve GBM treatment [2, 3]. The advantageous depth dose  distribution of particle beams allows sparing of normal tissue [4, 5]. Furthermore, carbon  ions or protons with high linear energy transfer (LET) induce clustered DNA damage, which  can be harder to repair and thus more potent in eliminating tumor cells [2]. To further  enhance the tumor cell killing, radiotherapy may be combined with inhibitors of cell cycl e  checkpoints and DNA repair pathways [6, 7]. It was previously thought that such inhibitors  would not sensitize to high‐LET irradiation, based on an assumption that the clustered DNA  damage would be mostly irreparable [8]. However, more recent studies indicate that DNA  repair is also important upon high‐LET irradiation [9‐11] . Radiosensitizing effects have for  example been observed with ATR and PARP inhibitors in combination with carbon ion  irradiation [12‐16]. Interestingly, combining radiotherapy with DNA damage response inhibitors may also  trigger antitumor immune effects. For instance, abrogation of the radiation‐induced G2  checkpoint by ATR inhibition results in increas ed micronucleus formation that can induce a  type 1 interferon (IFN) response in various cell types. The micronuclei are prone to rupture,  and DNA from ruptured micronuclei can be recognized by the cytosolic DNA sensor cGAS,  leading to type 1 interferon secretion via the cGAS‐STING‐TBK1‐IRF3 pathway. Altern atively,  increased IFN production may be triggered by cytosolic RNA via the RNA sensor RIG‐I [17,  18]. Inhibiting ATR or ATM in combination with irradiation also promotes antitumor immune  responses in mouse tumor models [19‐22]. Moreover, ongoing clinical trials are investigating  combinations of ATR inhibitors and immunother apy, with and without radiotherapy [23].     While previous preclinical studies have shown enhanced antitumor immune signaling  upon combination of DNA damage response inhibitors and X‐irradiation, it is not clear  whether such inhibitors also increase the immune signaling when combined with proton or  carbon ion irradiation. Furthermore, little is known about interferon signaling after  irradiation and DNA damage respo nse inhibition in GBM. Here we show that ATR inhibition  can abrogate the G2 checkpoint and increase type 1 IFN signaling in two GBM cell lines after  X‐, proton and carbon‐ion‐irradiation. In addition, ATM inhibition increases IFN signaling in  one of the cell lines, des pite a lack of G2 checkpoint abrogation. Our results suggest that  DNA damage response inhibitors could be useful in combination with proton or carbon ion  therapy to increase tumor cell radiosensitivity and type 1 IFN responses.

Cell culture  Human glioblastoma cell lines T98G and U‐251 were cultur ed in Dulbecco’s modified  Eagle’s medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Biowest) and 1%  penicillin/streptomycin solution (10000 U/mL) (ThermoFisher Scientific), at 37°C in a  .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 4 humidified atmosphere with 5% CO2. T98G was kindly provided by Dr. Theodossis  Theodossiou and U‐251 was purchased from CLS Cell Line Servic (Eppelheim, Germany). Both  cell lines were verified by short tandem repeat analysis (Eurofins).     Drug treatment  Inhibitors of ATM (AZD1390) and ATR (VE‐822/berzosertib), both from Selleck  Chemicals, were given to cells 15‐30 min prior to irradiation for X‐ray and carbon ion  experiments , or immediately after irradiation for proton experiments. In clonogenic survival  assays the inhibitors were removed after 24 hours of exposure, otherwise they were present  until the end of the experiment.   Cell irradiation    Proton irradiation was performed at the Oslo cyclotron labor atory (University of  Oslo) with an MC‐35 cyclotron (Scanditronix) with a beam energy of 15.5 MeV. The beamline  and setup has been described previously [24, 25]. The cells were irradiated in two positions;  in front of the Bragg peak and at the distal end. The dose rate was the same for both  positions. The medium was removed during irradiation and fresh mediu m was added  immediately after irradiation. Carbon ion irradiation was performed using the IRABAT 95  MeV beam line at the GANIL facility (Caen, France), with further details described in [26]. X‐ rays (160 kV, 6.3 mA, Faxitron) were delivered at 1 Gy/min (filtration 0.8 mm Be + 0.5 mm  Cu).    The LET valu es for carbon ions were estimated at 28 and 73 keV/µm and for protons  7 and 38 keV/µm. In our study we have termed the lowest LET value for each particle type  "low‐LET" wit h  the purpose of separately comparing the two LET values within each  radiation modality. The LET for 160 kVp X‐rays is ~4 keV/µm [27].   Flow cytometry    Cells were fixed in 70% ice cold ethanol. To eliminate sample‐to‐sample variation, we  added an aliquot of barcoded reference cells stained with Alexa Fluor 647 Succinimid yl Ester  (0.02 µg/µL) (ThermoFisher Scientific) to all samples. Samples were stained with mouse anti‐ γH2AX (Ser139), clone JBW301 (Millipore), conjugated to FITC (1:1000) or not (1:500), the  latter followed by Alexa Fluor 488 anti‐mouse IgG (1:500, Molecular Probes). DNA was  stained with Hoechst 33258 (Sigma‐Aldrich). Samples were analysed on an LSR II flow  cytometer (BD Life Sciences) or on a CytoFLEX (V5‐B4‐R3) (B eckman Coulter). Results were  analysed in FlowJo v.10.6.1 software (BD Life Sciences), using the Watson Pragmatic  algorithm for cell cycle analysis. Instrument service on the LSR II was provided by the Flow  Cytometry Core Facilit y (OUS).    Clonogenic survival assay    Cells were seeded in triplicate 6 cm dishes (500‐6000 cells/dish), 18‐24 h prior to  treatment with X‐rays and inhibitors. When colonies appeared (10‐14 days), cells were fixed  with 70 % ethanol and stained with methylene bl ue. Colonies with >50 cells were counted.  For experiments with carbon ions, the same procedure was followed, except that cells were  seeded in T‐25 culture flasks at densities of 750‐15000 cells/flask.      Western blotting  .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 5 Cell lysis and immunoblotting was performed as previously described [28], with the  exception that Criterion TGX Stain‐free gels (Bio‐Rad) were used. Protein concentration was  not measured in samples shown in Figure 1. The antibodies used are listed in Table S1.  Protein bands were quantified in the ImageLab 4.1 software. A dilution series of one of the  samples was included for accurat e quantification.   Enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) of secreted IFNβ  Growth medium supernatants were collected from the cell samples. Duplicates of 50  µl of concentrate were subjected to IFN‐β measurement by ELISA (Human IFN‐beta DuoSET  ELISA, R&D Systems), af ter 20X upconcentration (Amicon Ultracel‐10, Merck) of the  supernatants as previously described [28]. The protein concentration of remaining adherent  cells at time of harvest was measured as described above for western blot samples, and used  for normalization of ELISA IFN‐β read‐outs.    Statistics  One‐ or two‐sample, two‐tailed Student’s t test with significance lev el set to 0.05 was  used to obtain p‐values, indicated with an asterisk for p < 0.05 in bar charts.

To investigate effects of ATM and ATR inhibitors in combination with low‐ and high‐ LET irradiation, we first characterized DNA damage signaling after irradiation alone.  Immunoblot ting on samples harvested at 1 and 4 h after proton irradiation showed that  high‐LET protons induced more phosphorylation of ATM and the ATR target CHK1 compared  to low‐LET protons at similar radiation dose (Fig. 1A, 1B). These effects were seen in both  T98G and U 251 cells. Furthermore, flow cytometry analysis of the DNA‐damage marker  H2AX at 0.5 h after irradiation also showed much stronger signals for the high‐LET as  compared to low‐LET protons (Fig 1C). The H2AX levels in T98G exposed to 6 Gy of high‐LET  protons were comparabl e to that observed in cells X‐irradiated with 12 Gy (Fig. S1A, S1B). To  study potential differences in repair rate between cells exposed to low‐ and high‐LET  irradiation we also assessed H2AX at 24 h. The ratio between the signal at 24 and 0.5 h was  similar for cells irradiat ed with 6 Gy of low‐LET protons and X‐rays, whereas the ratio for 6  Gy of high‐LET protons was comparable to that seen for 15 Gy X‐ray (Fig. S1B, right). The  high‐LET protons thus likely induce DNA damage that is harder to repair.   Since DNA da mage  signaling leads to activation of cell cycle checkpoints, we also  obtained cell cycle profiles at 24h after low‐ and high‐LET proton and carbon ion irradiation.  We found that activation of the G2 checkpoint, in both U‐251 and T98G, was stronger upon  6 Gy of the high‐LET tha n  low‐LET proton irradiation, as seen by the presence of more cells in  G2/M phase (Fig. 1D). The high‐LET carbon ions (73 keV/µm) also showed stronger G2  checkpoint activation compared to the low‐LET carbon ions (29 keV/µm) (Fig. 1E). These

are in agreement with more CHK1 phosphorylation observed wit h high‐LET  irradiation (Fig 1A, 1B), as the radiation‐induced G2 checkpoint is typically dependent on  ATR‐CHK1 activation [6].    Next, we investigated how the radiation‐induced G2 arrest was affected by co‐ treatment with inhibitors of the DNA damage response proteins ATR and ATM.  In line with  previous stu dies [28, 29], the ATR inhibitor abrogated, and the ATM inhibitor prolonged, G2  .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 6 arrest at 24 h after irradiation with X‐rays in both cell lines (Fig. 2A). These effects of the  inhibitors were also seen with high‐LET carbon ions and protons (T98G) (Fig. 2B, 2C, S2).  Moreover, both inhibitors decreased clonogenic survival of U‐251 cells when combined with  X‐rays and both LETs of ca rbon ions (Fig. 3). These data add to the studies showing that DNA‐ repair inhibitors can indeed sensitize cells to high‐LET particle irradiation [13‐15]. However,  the sensitizing effect of the inhibitors appeared slightly smaller in combination with the high‐ LET carbon ions compared to with X‐rays and was lower for the ATM inhibitor than the ATR  inhibitor (Fig. 3 and Tab le 1).  Since abrogation of the radiation‐induced G2 cell cycle checkpoint by ATR inhibition  is known to induce a type 1 interferon response upon X‐irradiation, we asked whether  similar responses would be induced after high‐LET irradiation. We first examined  phosphorylation of ST AT1 (phospho‐STAT1), a commonly used surrogate marker for  extracellular type 1 IFN [30], by immunoblotting of U‐251 cells three days after X‐ and  carbon‐ion‐irradiation in combination with inhibitor treatment. The time point was chosen  as previous studies have shown increased IFN signaling three days after ATR inhibition and X‐ irradiation in various cancer ce ll lines [18, 28]. Phospho‐STAT1 was increased by ATR  inhibition, but very little by ATM inhibition, after 4‐6 Gy of X‐irradiation (Fig. 4A). Similar

were obtained in cells irradiated with 4 Gy of carbon ions, with little difference  between th e low‐ and high‐LET (Fig. 4B). The amount of IFN‐β in the growth medium was  also directly measured by ELISA in U‐251 cells treated with X‐irradiation and inhibitors. The  total levels varied between experiments (Fig. S3A), but the highest levels were de tected  after co‐treatment with ATR inhibitor and X‐rays, and overall correlated well with phospho‐ STAT1 signals measured in corresponding cell lysates (Fig. 4C). Notably, the observed  phospho‐STAT1 levels of samples irradiated with carbon ions would not correspond to  higher IFN‐β levels compared to X‐irradiated samples (Fig. 4C, red color).    Phosph o‐STAT1 levels were also detected by immunoblotting in T98G cells treated  with combinations of inhibitors and X‐ray, proton or carbon ion irradiation. For all radiation  modalities, an increase in phospho‐STAT1 signal was observed for both inhibitors as  compared to irradiation alone (Fig. 5A, S3B). However, the inc rease was not particularly  strong and appeared similar for low‐ and high‐LET particles. Moreover, the signal intensity  did not correlate well with IFN‐β secretion measured in the cell growth medium in X‐ irradiated samples (Fig. S3C). This could be due to partly defective IFN receptor signaling as  has been reported for other cancer cell lin es [28]. Interestingly, IFN‐β levels in the growth  medium of T98G cells exposed to high‐LET particle irradiation in combination with the  inhibitors were clearly higher than that measured in growth medium of cells exposed to low‐ LET particles or X‐rays (Fig. 5B). This was found al so when compared to very high doses of X‐ rays (30 Gy). IFN‐β levels were high for both LETs of carbon ions co‐treated with ATR  inhibitor, whereas only the high‐LET irradiation produced such high levels for protons.  However, as previously mentioned, the low LET of carbon ions is comparable to the high LET  of protons. Also noteworthy is that in combination with prot on irradiation, inhibition of ATM  leads to an IFN‐β secretion level similar to that seen after ATR inhibition (Fig. 5B). This was  not the case for samples irradiated with carbon ions. Taken together, these results show that  ATR inhibition increases IFN secretion after irradi ation with X‐rays, protons or carbon ions in  both cell lines, and in T98G this is also highly LET‐dependent. In addition, ATM inhibition can  increase radiation induced IFN‐β secretion in T98G.        .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 7

Radiotherapy with high energy X‐rays is a cornerstone of cancer treatment. Recently,  the interest in understanding radiation‐induced immune effects has escalated, with the goal  to optimize combination treatments with immunotherapy. Inhibitors of DNA repair may  counteract tumor radioresistance, and may in addition enhance the antitumor immune  effects. Part icle radiotherapy with protons or carbon ions is currently being expanded in  many countries, and increased immune signaling has also been observed in response to  these radiation modalities [31, 32]. However, knowledge about how DNA repair inhibitors  modulate antitumor immune effects after particle irradiation has been lacking. To our  knowledge, our study is the first to report effects on the IFN response after treatmen t with  ATR and ATM inhibitors in combination with high‐LET particle irradiation.     Notably, these inhibitors may be even more suitable for combinations with particles  as opposed to conventional X‐ray radiotherapy. The radiosensitizing effects of the inhibitors  on the surrounding nor mal tissue, including immune cells, will likely be reduced, due to the  beneficial depth dose distribution of particle radiation. We thus expect improved tumor‐ selective radiosensitizing effects and possibly improved antitumor immune response with  particle irradiation. In support of the latter, recent clinical reports suggest that proton and  carbon ion radiotherapy induce less lymphopenia compared to classical radiotherapy [33,  34] . Our data suggest that a further benefit from combining ATR and ATM inhibitors with  particle irradiation may be obtained through activation of the innate immune response  within the tumor cells themselves.   In U‐251 cells the radiation‐induced IFN‐β signali ng correlated with abrogation of the  G2 checkpoint. Cells treated with the ATR inhibitor were not arrested and showed increased  IFN‐β signaling. The ATM inhibitor, by contrast, prolonged the G2  arrest and gave little  increase in IFN signaling. In T98G cells, both inhibitors induced IFN‐β signaling, even though  their eff ect on the G2 checkpoint was similar to that observed in U‐251. Cytosolic exposure  of DNA from ruptured micronuclei is most likely a main cause for increased IFN‐β production  after ATR inhibition in both cell lines, as previously reported for combination with X‐ irradiation in other cell types [28, 35]. However, other mechanisms are likely at play after  ATM inhibition, as the G2 arrest is prolonged. In the absence of irradiation, ATM inhi bition  causes leakage of mitochondrial DNA into the cytosol [36]. This response may be enhanced  by radiation‐induced mitochondrial damage. Furthermore, a more direct effect of ATM  inhibition on signal transduction has been shown, where reduced ATM activity caus es  elevated SRC phosphorylation leading to TBK1 activation [22].   Interestingly, the levels of secreted IFN‐β from T98G were much higher when the  inhibitors were combined with high‐LET than low‐LET irradiation. The mechanism underlying  this effect is not known and would be interesting to explore in future studies. Pointin g  towards possible mechanisms, studies have shown that more micronuclei are formed in cells  exposed to high‐LET than low‐LET irradiation [13, 37, 38], likely due to induction of more complex DNA damage. Furthermore, in addition to cytosolic DNA of nuclear or  mitochondrial origin [18, 30, 39, 40], IFN‐β signali ng may also be triggered by cytosolic RNA  as described in previous studies with X‐irradiation [17, 18]. The RNA can be transcribed from  cytosolic DNA or leak from mitochondria [41], but could also stem from reactivation of  retroelements [42, 43] through radiation‐induced decompaction of chromatin. Notably, a  recent study showed a more pronounced IFN‐β signaling after proton as compared to X‐ .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 8 irradiation, which was caused by proton‐induced derepression of transposable elements  [44].      In conclusion, we have shown that ATR inhibition combined with low‐ or high‐LET  irradiation enhances type 1 IFN signaling in GBM cells. Furthermore, ATM inhibition can also  enhance IFN signaling, as shown for one of the cell lines. The ATR and ATM inhibitors used in  this study hav e been combined with classical radiotherapy in clinical trials for brain  metastases (NCT02589522) and GBM (NCT03423628), respectively. GBM is typically highly  radioresistant as well as invasive. Our results suggest that ATR or ATM inhibitors could  increase tumor cell radiosensitivity and may als o  enhance radiation‐induced immune  signaling. The combination of these inhibitors with radiotherapy could thus likely facilitate  eradication of the main tumor, and also help eliminating invasive cells outside the irradiation  field by promoting antitumor immune effects. Likely, triple combinations of radiotherapy,  radiosensitizing drug and immune checkpoint blockade might be most useful. In this  approach the ATR/ATM inhibitor is us ed to increase tumor radiosensitivity and the  antitumor immune effects of radiotherapy, while potential immunosuppressive effects, such  as increased PD‐L1 presentation, are counteracted by the immune checkpoint inhibitor.       Author Contributions    Conceptualization (GER, MT, DIS, RGS); Formal analysis (GER, AEM, RGS) ;  Funding acquisition  (DIS, RGS); Investigation (GER, MT, AMS, AEM, AG); Methodology (NFJE, EM, FC, MT, GER);  Project administration (DIS, RGS); Resources (DIS, FC, EM, RGS); Supervision (DIS, FC, RGS);  Visualization (GER, AEM, MT, RGS);Writing ‐ original draft (GER, RGS); and Writing ‐ review &  editing (all authors).

This work was funded by Norway Romania Grant RO‐NO‐2019‐0510, contract no.  41/2021grant. Irradiations with carbon ions were performed at Ganil, France, using beam  time obtained under experiment number P1243‐H of the iPAC 2020 call. The GANIL  dosimetry te am and beam operators are acknowledged for extensive support. We also  acknowledge the operators at the Oslo Cyclotron Laboratory and memb ers of the  Malinen/Edin research group for excellent assistance with proton irradiation experiments.

[1] Frosina G. Radiotherapy of high‐grade gliomas: dealing with a stalemate. Crit Rev Oncol  Hematol. 2023;190:104110.  [2] Aiyappa‐Maudsley R, Chalmers AJ, Parsons JL. Factors affecting the radiation response in  glioblastom a. Neurooncol Adv. 2022;4:vdac156.  [3] Combs SE, Bruckner T, Mizoe JE, Kamada T, Tsujii H, Kieser M, et al. Comparison of  carbon ion radiotherapy to photon radiation alone or in combination with temozolomide in  patients with high‐grade gliomas: explorative hypothesis‐generating retrospective analysis.  Radiother Oncol. 2013;108:132‐5.  [4] Grau C, Durante M, Georg D, Langendijk JA, Weber DC. Particle th erapy in Europe. Mol  Oncol. 2020;14:1492‐9.  .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 9 [5] Mohan R, Liu AY, Brown PD, Mahajan A, Dinh J, Chung C, et al. Proton therapy reduces  the likelihood of high‐grade radiation‐induced lymphopenia in glioblastoma patients: phase  II randomized study of protons vs photons. Neuro Oncol. 2021;23:284‐94.  [6] Hauge S, Eek Mariampillai A, Rødland GE, Bay LTE, Landsverk HB, Sy ljuåsen RG. Expanding  roles of cell cycle checkpoint inhibitors in radiation oncology. Int J Radiat Biol. 2023;99:941‐ 50.  [7] Huang RX, Zhou PK. DNA damage response signaling pathways and targets for  radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduct Target Ther. 2020;5:60.  [8] Hall EJ, Giaccia AJ. Radiobiology for the Radiologist. 6th ed. Philadelphia, PA 19106 USA:  lIPPINCOTT wILLIAM & wILKINS; 2006.  [9] Flint DB, Bright SJ, McFadden CH , Konishi T, Ohsawa D, Turner B, et al. Cell lines of the  same anatomic site and histologic type show large variability in intrinsic radiosensitivity and  relative biological effectiveness to protons and ca rbon  ions. Med Phys. 2021;48:3243‐61.  [10] Furusawa Y, Nakano‐Aoki M, Matsumoto Y, Hirayama R, Kobayashi A, Konishi T.  Equivalency of the quality of sublethal lesions after photons and high‐linear energy transfer  ion beams. J Radiat Res. 2017;58:803‐8.  [11] Guerra Liberal FDC, Parsons JL, McMahon SJ. Most DNA repair defects do not mo dify  the relationship between relative biological effectiveness and linear energy transfer in  CRISPR‐edited cells. Med Phys. 2024;51:591‐600.  [12] Cesaire M, Ghosh U, Austry JB, Muller E, Cammarata FP, Guillamin M, et al. Sensitization  of chondrosarcoma cells with PARP inhibitor and high‐LET radiation. J Bone Oncol.  2019;17:100246.  [13] Fujisawa H, Nakajima NI, Sunada S, Lee Y, Hirakaw a H, Yajima H, et al. VE‐821, an ATR  inhibitor, causes radiosensitization in human tumor cells irradiated with high LET radiation.  Radiat Oncol. 2015;10:175.  [14] Lesueur P, Chevalier F, El‐Habr EA, Junier MP, Chneiweiss H, Castera L, et al.  Radiosensitization Effect of Talazopa rib, a Parp Inhibitor, on Glioblastoma Stem Cells  Exposed to Low and High Linear Energy Transfer Radiation. Sci Rep. 2018;8:3664.  [15] Ma H, Takahashi A, Yoshida Y, Adachi A, Kanai T, Ohno T, et al. Combining carbon ion  irradiation and non‐homologous end‐joining repair inhibitor NU7026 effi ciently kills cancer  cells. Radiat Oncol. 2015;10:225.  [16] Xue L, Yu D, Furusawa Y, Okayasu R, Tong J, Cao J, et al. Regulation of ATM in DNA  double strand break repair accounts for the radiosensitivity in human cells exposed to high  linear energy transfer ionizing radiation. Mutat Res. 2009;670:15‐23.  [17] Chen J, Harding SM, Natesan R, Tian L, Benci JL, Li W, et al. Cell Cycle Checkpoint s  Cooperate to Suppress DNA‐ and RNA‐Associated Molecular Pattern Recognition and Anti‐ Tumor Immune Responses. Cell reports. 2020;32:108080.  [18] Feng X, Tubbs A, Zhang C, Tang M, Sridharan S, Wang C, et al. ATR inhibition pot entiates  ionizing radiation‐induced interferon response via cytosolic nucleic acid‐sensing pathways.  EMBO J. 2020;39:e104036.  [19] Dillon MT, Bergerhoff KF, Pedersen M, Whittock H, Crespo‐Rodriguez E, Patin EC, et al.  ATR Inhibition Potentiates the Radiation‐induced Inflammatory Tumor Microenvironment.  Clin Cancer Res. 2019;25:3392‐403.  [20] Jin WJ, Zangl LM, Hyun M, Massoud E, Schroeder K, Alexandridis RA , et al. ATM  inhibition augments type I interferon response and antitumor T‐cell immunity when  combined with radiation therapy in murine tumor models. J Immunother Cancer. 2023;11.  .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 10 [21] Vendetti FP, Karukonda P, Clump DA, Teo T, Lalonde R, Nugent K, et al. ATR kinase  inhibitor AZD6738 potentiates CD8+ T cell‐dependent antitumor activity following radiation.  J Clin Invest. 2018;128:3926‐40.  [22] Zhang Q, Green MD, Lang X, Lazarus J, Parsels JD, Wei S, et al. Inhibition of AT M   Increases Interferon Signaling and Sensitizes Pancreatic Cancer to Immune Checkpoint  Blockade Therapy. Cancer Res. 2019;79:3940‐51.  [23] Yano K, Shiotani B. Emerging strategies for cancer therapy by ATR inhibitors. Cancer Sci.  2023;114:2709‐21.  [24] Dahle TJ, Rykkelid AM, Stokkevag CH, Mairani A, Gorgen A, Edin NJ, et al. Monte Carlo  simulations of a low energy proton beamlin e for radiobiological experiments. Acta Oncol.  2017;56:779‐86.  [25] Görgen A, Guttormsen M, Larsen AC, Siem S, Adli E, Edin NFJ, et al. The Oslo Cyclotron  Laboratory. The European Physical Journal Plus. 2021;136:181.  [26] Durantel F, Balanzat E, Cassimi A, Chevalier F, Ngono‐Ravache Y, Madi T, et al.  Dosimetry for radiobiology experiments at GANIL. Nuclear Instruments and Methods in  Physics Research Section A: Accel erators, Spectrometers, Detectors and Associated  Equipment. 2016;816:70‐7.  [27] Li X, McConnell KA, Che J, Ha CS, Lee SE, Kirby N, et al. DNA Dosimeter Measurement of  Relative Biological Effectiveness for 160 kV p  and 6 MV X Rays. Radiat Res. 2020;194:173‐9.  [28] Eek Mariampillai A, Hauge S, Øynebraten I, Rødland GE, Corthay A, Syljuåsen RG.  Caspase activation counteracts interferon signaling after G2 checkpoint abrogation by ATR  inhibition in irradiated human cancer cells. Front Oncol. 2022;12:981332.  [29] Hong JH, Gatti RA, Huo YK, Chiang CS, McBride WH. G2/M‐phase arrest and rel ease in  ataxia telangiectasia and normal cells after exposure to ionizing radiation. Radiat Res.  1994;140:17‐23.  [30] Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mitotic progression  following DNA damage enables pattern recognition within micronuclei. Nature.  2017;548:466‐70.  [31] Mirjolet C, Nicol A, Limagne E, Mur a C, Richard C, Morgand V, et al. Impact of proton  therapy on antitumor immune response. Sci Rep. 2021;11:13444.  [32] Hu W, Zhang Z, Xue Y, Ning R, Guo X, Sun Y, et al. Carbon ion irradiation exerts  antitumor activity by inducing cGAS‐STING activation and immune response in prost ate  cancer‐bearing mice. Cancer Med. 2024;13:e6950.  [33] Li Y, Fan X, Yu Q, Zhai H, Mo M, Sun J, et al. Proton and Carbon Ion Radiation Therapy  Decreased Severe Lymphopenia by Reducing Thoracic Vertebra and Aortic Doses in Non‐ Small Cell Lung Cancer Ve rsus  Intensity Modulated Radiation Therapy. Int J Radiat Oncol Biol  Phys. 2023;116:579‐89.  [34] Wang X, van Rossum PSN, Chu Y, Hobbs BP, Grassberger C, Hong TS, et al. Severe  Lymphopenia During Chemoradiation Therapy for Esophageal Cancer: Comprehensive  Analysis of Randomized Phase 2B Trial of Proton Beam Therapy Versus Intensity Modulated  Radiation Therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2024;118:368‐77.  [35] Sheng H, Huang Y, Xiao Y, Zhu Z, Shen M, Zhou P, et al. ATR inhibitor AZD6738 e nhances  the antitumor activity of radiotherapy and immune checkpoint inhibitors by potentiating the  tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer.  2020;8.  .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 11 [36] Hu M, Zhou M, Bao X, Pan D, Jiao M, Liu X, et al. ATM inhibition enhances cancer  immunotherapy by promoting mtDNA leakage and cGAS/STING activation. J Clin Invest.  2021;131.  [37] Michaelidesova A, Vachelova J, Puchalska M, Brabcova KP, Vondracek V, Sihver L, et al.  Relative biological effectiveness in a proton spre ad‐out Bragg peak formed by pencil beam  scanning mode. Australas Phys Eng Sci Med. 2017;40:359‐68.  [38] Wang ZZ, Li WJ, Zhi DJ, Qu Y, Jing XG. Micronuclei induction in human lymphocytes  induced by carbon ions exposion along the penetrate depth of ions in water. Nuclear  Instruments and Methods in Physics Resear ch Section B: Beam Interactions with Materials  and Atoms. 2009;267:2521‐4.  [39] Mackenzie KJ, Carroll P, Martin CA, Murina O, Fluteau A, Simpson DJ, et al. cGAS  surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature.  2017;548:461‐5.  [40] West AP, Khoury‐Hanold W, Staron M, Tal MC, Pineda CM, Lang SM, et al. Mitochondrial  DNA stress primes the antiviral innate immune response. Na ture. 2015;520:553‐7.  [41] Tigano M, Vargas DC, Tremblay‐Belzile S, Fu Y, Sfeir A. Nuclear sensing of breaks in  mitochondrial DNA enhances immune surveillance. Nature. 2021;591:477‐81.  [42] Du J, Kageyama SI, Yamashita R, Tanaka K, Okumura M, Motegi A, et al. Transposable  elem ents potentiate radiotherapy‐induced cellular immune reactions via RIG‐I‐mediated  virus‐sensing pathways. Commun Biol. 2023;6:818.  [43] Lee AK, Pan D, Bao X, Hu M, Li F, Li CY. Endogenous Retrovirus Activation as a Key  Mechanism of Anti‐Tumor Immune Response in Radiotherapy. Radiat Res. 2020;193:305‐17.  [44] Davide Cinat RvdW, Mirjam Baa nstra, Abel Soto‐Gamez, Anne L. Jellema‐de Bruin, Marc‐ Jan van Goethem, Marcel A.T.M. van Vugt, Lara Barazzuol, Rob P. Coppes. Derepression of  transposable elements enhances interferon beta signaling and stem/progenitor cell activity  after proton irradiation. Preprint in bioRxiv: bioRxiv; 2024.                 .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 12 Figure legends    Figure 1. Activation of the DNA damage response is stronger in GBM exposed to high‐LET  as compared to low‐LET irradiation at similar radiation dose.     (A) Representative immunoblot from T98G, showing phosphorylated ATM and CHK1 at 1  and 4 h after 2 and 6 Gy of proton irradiation. Left: a dilution curve showing dynamic range  of antibodies. (B) Quantification of signal intensity of the indicated markers from two or  more experiments similar to that shown in A, for both T98G and U‐251. Values are  normalized to the 6 Gy hig h‐LET sample. Dots indicate individual experiments. Error bars:  SEM (n = 3). (C) Quantification of γH2AX intensity as measured by flow cytometry 0.5 h after  proton irradiation. Error bars: SEM (n = 4). (D) DNA profiles obtained by flow cytometry  showing cell cycl e distribution at 24 h after exposure to 6 Gy of low‐ vs. high‐LET protons.  Upper panels: U‐251, lower panels: T98G. (E) Cell cycle distribution of U‐251 cells 24 h after  irradiation with 4 Gy of carbon ions (C‐ions), comparing low and high LET.     Figure 2. The radiation‐induced G2 checkpoint is abrogated by ATR inhibition and  prolonged by ATM inhibition.  (A) DNA profiles showing cell cycle distribution at 24 h after treatment with ATR and ATM  inhibitors in combination with X‐irradiation. Left: T98G, right: U‐251. (B) DNA profiles at 24 h  after treatment with the inhibitors and carbon ions, comparing low and high LET. (C)  Quantification from cell cycle anal ysis  performed on data as in B. Error bars: SEM (n = 3).      Figure 3. ATM and ATR inhibitors enhance radiosensitivity after both low and high‐LET  irradiation     Clonogenic survival of U‐251 cells irradiated with 2 and 4 Gy of X‐ray (left panel) or 1 and 2  Gy of carbon ions (middle and right panels) in combination with ATR and ATM inhibitors.  Survival fractions relative to non‐irradiated samples are plotted. The average survival  fractions after treatment with the inhibitors alone were 0.6 (A TRi) and 0.8 (ATMi) for the  experiments with X‐rays, and 0.7 (ATRi) and 0.9 (ATMi) for the experiments with carbon ions.  Error bars: SEM (n = ≥3).       Figure 4. ATR inhibition increases type 1 IFN signaling after both low‐LET and high‐LET  irradiation in U‐251 cells  (A) Left: Representative immunoblot showing phosphorylated STAT1 (pSTAT1) in U‐251 cells  at 72 h after treatment with 4, 5 and 6 Gy of X‐ray in combination with indicated inhibitors.  Asterisk indicates a dilution of the sample treated with 5 Gy and 250nM ATRi.  Right:  Quantification of pSTAT1 relative to total protein, normalized to the sam ple treated with 5  Gy in combination with 250 nM of ATRi, Error bars: SEM (n = 7). (B) Left: Representative  immunoblot showing pSTAT1 in U‐251 cells at 72 h after treatment with 4 Gy of low‐ and  high‐LET carbon ion irradiation in combination with indicated inhibitors. Asterisk indicates a  dilution of th e sample treated with 4 Gy high LET and 250nM ATRi. Right: Quantification of  pSTAT1 relative to total protein, normalized to the sample treated with 4 Gy high LET in  .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 13 combination with 250 nM of ATRi, Error bars: SEM (n = 3). (C) Correlation analysis between  pSTAT1 and IFN‐β secretion in X‐irradiated samples. Signal intensity of pSTAT1 as measured  by immunoblotting on samples as in A (relative to 6 Gy ATRi 250 nM) are plotted against  levels of secreted IFN‐β measured in growth medium from the same samples. The IFN‐β  values have been normalized to the amount of pro tein of the adherent cells at time of  harvest. The red dots show pSTAT1 signals from carbon ion irradiated samples that have  been analyzed in the same immunoblot as the X‐irradiated sa mples, in order to estimate the  IFN‐β level upon co‐treatment with C‐ions and ATRi. (n.s.: not significant).      Figure 5. IFN signaling is heavily induced in T98G cells treated with high‐LET irradiation  combined with ATR inhibitor.    (A) Analysis of pSTAT1 in T98G cells, similarly as in Fig 4A except that values are normalized  to the sample treated with 5 Gy and 100 nM ATRi. Error bars: SEM (n ≥ 5). (B) Levels of  secreted IFN‐β measured by ELISA relative to the amount of protein of the adherent cells at  time of harvest, compari ng all radiation modalities. Proton and carbon ion irradiated  samples are from the same experiments as in S3B. For X‐ray irradiated samples n ≥ 3. Data  from individual experiments are displayed as dots.        .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint 14   Table 1 RBE at SF50                        Dose (Gy)        RBE X‐ray        C‐ion       C‐ion    low  high low high ‐  3.0 1.6   1.1 1.9 2.7 ATMi 10 nM  1.5 0.9   0.8 1.7 2.0 ATRi 100 nM  2.0 1.1   0.9 1.9 2.3   RBE values of C‐ions with radiation doses of C‐ions and X‐rays required for killing 50 % of U‐251 cells  in a clonogenic survival assay.     .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint .CC-BY-NC-ND 4.0 International licensemade available under a (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is The copyright holder for this preprintthis version posted June 14, 2024. ; https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598643doi: bioRxiv preprint