{"paper_id":"b27fcf08-00a4-41fe-b071-196fab91c241","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nDEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA \n \n \n \n \n \n \nALINE GONÇALVES SAWA \n \n \n \n \nEfeito da administração intrauterina de CXCL12 ou de células tronco mesenquimais nos \nresultados de gestação em camundongos com endometriose induzida \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \nMai 2023 \n\nALINE GONÇALVES SAWA \n \n \n \n \nEfeito da administração intrauterina de CXCL12 ou de células tronco mesenquimais nos \nresultados de gestação em camundongos com endometriose induzida \n \n \n \nVersão Corrigida \n \n \n \nDissertação apresentada ao Programa de \nPós-Graduação em Ginecologia e \nObstetrícia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto para obtenção do título de \nMestre em Ciências \n \nÁrea de Concentração: Ginecologia e \nObstetrícia \n \nOrientadora: Profª. Drª. Ana Carolina \nJapur de Sá Rosa e Silva \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2023 \n\nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSawa, Aline Gonçalves \n \n            Efeito da administração intrauterina de CXCL12 ou de células tronco \nmesenquimais nos resultados de gestação em camundongos com endometriose in duzida / \nAline Gonçalves Sawa; O rientadora, Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Sil va. Ribeirão Preto: \nFMRP, 2023. 67 p \n             Dissertação (Mestrado em Ciências) – Programa de Pós -Graduação em \nGinecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São \nPaulo, São Paulo, 2023. \n   Versão corrigida \n             1. Endometriose; 2. Células estromais mesenquimais; 3. CXCL12 ; 4. \nMigração celular. \n  \n \n \n \n \n\nNome: SAWA, Aline Gonçalves \n \nTítulo: Efeito da administração intrauterina de CXCL12 ou de células tronco mesenquimais \nnos resultados de gestação em camundongos com endometriose induzida \n \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto para obtenção do título de \nMestre em Ciências. \n \nAprovado em: 22/03/2023 \n \nBanca Examinadora \n \nProfª. Drª.: Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva \nIntituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP) \nJulgamento: Aprovado \n \nProfº. Drº: Maira da Costa Cacemiro \nIntituição: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP) \nJulgamento: Aprovado \n \nProfº. Drº.: João Sabino Lahorgue da Cunha Filho \nIntituição: Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) \nJulgamento: Aprovado \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nAGRADECIMENTOS \nAgradeço a Deus pela força e fé nesse período. \n \nÀ minha orientadora Profª Drª Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva pela oportunidade; por \ntodo suporte, auxílio, dedicação, paciência, ensinamentos e confiança depositada em mim \nnesse período de crescimento científico e pessoal. \n \nÀ Cleide Lúcia Araújo Silva por possibilitar o desenvolvimento da pesquisa no Laboratório \nde Estudos Experimentais em Animais do Hemocentro;  pelo apoio e suporte sempre que \nnecessário. \n \nÀ Profª Drª Fabiola Attié de Castro e Maira da Costa Cacemiro p or todo suporte  e \nensinamentos para o desenvolvimento de novos protocolos por nosso grupo de pesquisa. \n \nÀ Adriana de Andrade Batista Murashima pelos ensinamentos e paciência  no auxílio para \nrealização da análise de imunohistoquímica do presente projeto. \n \nÀ minha família por sempre me apoiar e impulsionar à realização dos meus sonhos. \n \nÀ minha namorada e amigos que me deram todo suporte emocional e incentivo ao longo \ndesse período e sempre. \n \nAos colegas do grupo de pesquisa  do laboratório  e da pós -graduação pelos momentos \ncompartilhados. \n \nÀ Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES). \n \nA todos àqueles que contribuíram p ara o desenvolvimento deste trabalho, meu muito \nobrigada! \n \n \n \n \n \n\nRESUMO \n \nSAWA, A.G. Efeito da administração intrauterina de CXCL12 ou de células tronco \nmesenquimais nos resultados de gestação em camundongos com endometriose induzida . \n2023. Tese (Mestrado em Ciências) – Programa de Pós -Graduação em Ginecologia e \nObstetrícia, Faculdade de M edicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão \nPreto, 2023. \n \nSabe-se que mulheres com endometriose possui a fertilidade comprometida, entretanto, os \nmecanismos pelos quais isso ocorre são pouco esclarecidos; um dos possíveis fatores \nenvolvidos é a implantação embrionária que parece estar prejudicada devido à baixa \nreceptividade endometrial. Essa característica pode estar relacionada com a possível  redução \ndo tráfico de células tronco para o processo de reparo endometrial devido ao possível tr áfego \ndessas células reparativas aos focos ectópicos da doença . Nesse contexto, a quimiocina \nCXCL12 e seu ligante CXCR4 criam um gradiente químico que redireciona a migração de \ncélulas tronco não hematopoiéticas para o local administrado, além de sta substâ ncia estar \nenvolvida na angiogênese e reparação tecidual do local. Também como alternativ a \nterapêutica, as células estromais  mesenquimais multipotentes (C EM) injetadas localmente \npoderiam auxiliar nessa reparação tecidual. O presente projeto tem como objet ivo avaliar o \nefeito da administração de CXCL12 e das C EM injetadas diretamente no ú tero sobre as taxas \nde gestação e  características de placenta em camundongos subférteis com endometriose \ninduzida em relação ao s animais  sham. Para isso, camundongos C57 BL/6 selvagens  foram \nsubmetidos a  indução da endometriose cirúrgica, com sutura de  fragmentos uterinos de \ndoadora (quatro hemicornos) no peritônio parietal  bilateralmente. E no grupo sham, também \ncirúrgico, foi realizado somente os pontos únicos de sutura sem tecido uterino.  Quatro \nsemanas depois, esses dois grupos foram subdivididos para receber  um de três  tratamentos: \ninjeção intrauterina de CXCL12 ou C EM (de doadores GFP+) , ou ainda placebo. As fêmeas \nde todos os grupos (EndoCX, EndoC EM, EndoPl, ShamCX, ShamCEM e ShamPl) foram \ncolocadas para acasalar por até quatro semanas com machos fértei s uma semana após receber \no tratamento . Após serem identificadas como grávidas, estas fêmeas foram submetida s a \ncesárea, próxima ao termo,  para coleta das placentas com  fragmento uterino e cordão \numbilical adjacentes. Além disso, foi coletado fragmen to uterino das fêmeas que \nengravidaram e o corno uterino completo das fêmeas consideradas inférteis . Obteve-se como \ndesfechos clínicos reprodutivos  nos grupos ShamPl, ShamCX e ShamCE M de 100,0% de \n\ngestação. Já no grupo EndoPl observou -se somente 50,0% de gestação,  havendo recuperação \ndas taxas de gestação  nos grupos endometriose induzida tratados com CXCL12 e CE M, com \ntaxas de gestação  de 100% em ambos os grupos  (p=0,0168). Porém, na análise  de \nimunofluorescência não foram identificadas CEM nos complexos placenta -endométrio \ndecidualizado dos grupos tratados com CE M. Sendo assim, é possível  que as CEMs, seja por \natração pelo CXCL12 ou injetadas diretamente no tecido uterino, t enham tido um efeito \nfavorecedor do desenvolvimento placentário, porém sem participação direta na composição da \nmesma. Dessa forma, pode ter ocorrido secreção de substâncias locais ou desencadeamento de \nprocessos moleculares não avaliados neste estudo, como moléculas envolvidas no processo de \nreceptividade endometrial para a implantação embrionária. \n \nPalavras-chave: Endometriose , C élulas Estromais  Mesenquimais Multipotentes, CXCL12, \nMigração celular. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nABSTRACT \n \nSAWA, A.G. Effect of intrauterine administration of CXCL12 or mesenchymal stem \ncells on pregnancy outcomes in mice with induced endometriosis . 2023. Thesis (Master \nDegree in Sciences ) – Graduated Program in Ginecology and Obstetrics, Ribeirão Preto  \nMedical School, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2023. \n \nIt´s well known that women with endometriosis have their fertility compromised, however, \nthe mechanisms by which this occurs are unclear; one of the possible factors involved is \nembryonic implantation, which seems to be impaired due to low endometrial receptivity. This \ncharacteristic may be related to the possible reduction of stem cell trafficking for the \nendometrial repair process due to the possible traffic of these reparative cells to the ectopic \nfoci of the disease. In this context, the chemokine CXCL12 and its ligand CXCR4 create a \nchemical gradient that redirects the migration of non -hematopoietic stem cells to the \nadministered site, in addition to this substance being involved in angiogenesis and tissue \nrepair at t he site. Also as a therapeutic alternative, multipotente mesenchymal stromal  cells \n(MSCs) injected locally could help in this tissue repair. This project aims to evaluate the \neffect of administering CXCL12 and MSCs injected directly into the uterus on preg nancy \nrates and placental characteristics in subfertile mice with induced endometriosis compared to \nsham animals. For this, wild -type C57BL/6 mice were submitted to surgical endometriosis \ninduction, with suturing of donor uterine fragments (four hemihorns)  in the parietal \nperitoneum bilaterally. And in the sham group, also surgical, only single suture points without \nuterine tissue were performed. Four weeks later, these two groups were subdivided to receive \none of three treatments: intrauterine injection of  CXCL12 or MSC (from GFP+ donors), or \nplacebo. Females  from all groups (EndoCX, Endo MSC, EndoPl, ShamC X, Sham MSC and \nShamPl) were allowed to mate for up to four weeks with fertile males one week after \nreceiving treatment. After being identified as pregnant, these animals were submitted to \ncesarean section, close to term, to collect the placentas with adjacent uterine fragment and \numbilical cord. In addition, a uterine fragment was collected from females that became \npregnant and the complete uterine horn from females considered infertile. Reproductive \nclinical outcomes were obtained in the ShamPl, ShamCX and  ShamMSC groups of 100.0% \npregnancy. In the EndoPl group, only 50.0% of pregnancy was observed, with recovery of \npregnancy rates in the endometriosis groups treated with CXCL12 and MSC, with pregnancy \nrates of 100% in both groups  (p=0,0168). However, in the immunofluorescence analysis, \n\nMSCs were not identified in the placenta -decidualized endometrial complexes of the groups \ntreated with MSCs. Therefore, it is possible that MSCs, whether attracted by CXCL12 or \ninjected directly into the uterine tissue, had a favorable effect on placental development, but \nwithout direct participation in its composition. Thus, there may have been secretion of local \nsubstances or t he triggering of molecular processes not evaluated in this study, such as \nmolecules involved in the process of endometrial receptivity for embryonic implantation. \n \nKeywords: Endometriosis, Mesenchymal Stromal Cells, CXCL12, Cell migration. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1 – Desenho do estudo...................................................................................................29 \nFigura 2 – Cultivo das células estromais mesenquimais multipotentes....................................31 \nFigura 3 – Cirurgia de indução de endometriose......................................................................34 \nFigura 4 – Procedimento sham..................................................................................................34 \nFigura 5 - Cornos uterinos antes e após injeção dos tratamentos.............................................36 \nFigura 6  – Fenotipagem da população de células estromais mesenquimais multipotentes \nisoladas, cultivadas e injetadas nos animais dos grupos CEM.................................................46 \nFigura 7 – Gráfico das taxas de gestação por grupo do estudo.................................................47 \nFigura 8 – Distribuição de peso das fêmeas grávidas no momento da cesárea........................48 \nFigura 9 – Representação do processo  de coleta dos complexos placenta -endométrio \ndecidualizado............................................................................................................................49 \nFigura 10 – Análise histomorfométrica das placentas por meio de coloração HE...................51 \nFigura 11 – Marcação para GFP por imunofluorescência no complexo placenta -endométrio \ndecidualizado nos grupos que receberam a injeção das CEMs.................................................52 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nLISTA DE SIGLAS \n \nα-MEM Meio Essencial Mínimo Alfa \nBSA  Albumina Sérica Bovina  \nCD11b  Cluster de Diferenciação 11b \nCD34  Cluster de Diferenciação 34 \nCD31  Cluster de Diferenciação 31 \nCD45  Cluster de Diferenciação 45 \nCEUA  Comissão de Ética no Uso de Animais \nCEM  Célula Estromal Mesenquimal Multipotente \nCXCL12 Quimiocina C-X-C com Ligante 12 \nCXCR4 Receptor 4 da quimiocina C-X-C \nDAPI  4’,6’-diamino-2-fenil-indol \nEDTA  Ácido etilenodiamino tetra-acético \nEUA  Estados Unidos da América  \nFMRP  Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto  \nGFP  Proteína verde fluorescente \nGnRH  Hormônio liberador de gonadotrofina \nLEEA  Laboratório de Estudos Experimentais em Animais \nNK  Natural killer  \nPBS  Solução Salina Tampão de Fosfato \nPE  Ficoeritrina \nPL  Placebo \nSCA-1  Antígeno de Célula Tronco 1 \nSFB  Soro Fetal Bovino  \nSUS  Sistema Único de Saúde  \nUSP  Universidade de São Paulo \n \n \n \n \n \n \n \n\nLISTA DE SÍMBOLOS \n \n+ Adição  \n± Mais ou menos \nºC Grau Celsius  \n% Porcentagem  \n= Igual  \nƩ Somatória \n< Menor  \nμL Microlitro  \nμg Micrograma \nµm Micrometro \ncm Centrímetro \nc/ Com  \nCO2  Gás carbônico  \ng Grama \nh Hora  \nkg Quilograma \nM Molar  \nmg Miligrama \nmm3  Milímetro cúbico \nmL Mililitro \nmm² Milímetro quadrado \nmin Minutos  \nn Número  \nrpm Rotação por minuto  \nseg Segundos \nv/v Porcentagem em volume  \nX  Vezes \n \n \n \n \n \n\nSUMÁRIO \n1. Introdução...........................................................................................................................14 \n1.1. Endometriose: Sintomas e Diagnóstico.......................................................................15 \n1.2. O tratamento da Endometriose....................................................................................16 \n1.3. Endometriose e Células Estromais Mesenquimais Multipotentes...............................17 \n1.4. Endometriose e CXCL12.............................................................................................20 \n2. Justificativa.........................................................................................................................22 \n3. Objetivos.............................................................................................................................24 \n3.1. Objetivo primário.........................................................................................................25 \n3.2. Objetivos secundários..................................................................................................25 \n4. Hipóteses.............................................................................................................................26 \n5. Material e Métodos.............................................................................................................28 \n5.1. Animais........................................................................................................................29 \n5.2. Desenho do estudo.......................................................................................................29 \n5.3. Isolamento de células estromais mesenquimais multipotentes....................................30 \n5.4. Fenotipagem das CEM cultivadas...............................................................................31 \n5.5. Indução de endometriose e sham cirúrgico..................................................................32 \n5.6. Injeção uterina dos tratamentos propostos...................................................................34 \n5.7. Acasalamento dos animais...........................................................................................36 \n5.8. Resolução da gestação por cesárea..............................................................................37 \n5.9. Coloração com Hematoxilina e Eosina  e análise histomorfométrica dos complexos \nplacenta-endométrio decidualizado.............................................................................37 \n5.10. Imunofluorescência dos complexos placenta -endométrio decidualizado  dos grupos \ntratados com CEM (GFP positivas)....................................................................................38 \n5.11. Descrição dos desfechos............................................................................................39 \n5.12. Cálculo amostral........................................................................................................40 \n5.13. Análise estatística.......................................................................................................40 \n6. Resultados e Discussão.......................................................................................................41 \n7. Conclusão............................................................................................................................57 \nREFERÊNCIAS..................................................................................................................59 \nANEXOS............................................................................................................................64 \nANEXO A – Representação da população de CEM por citometria de fluxo.....................65 \nANEXO B - Aprovação para execução do projeto pelo CEUA.........................................66 \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1. Introdução \n \n \n14 \n\n1.1. Endometriose: Sintomas e Diagnóstico \n \nA endometriose é uma desordem crônica inflamatória dependente de estrogênio. Ela é \ncaracterizada pela presença de tecido endometrial glandular ou estromal fora da cavidade \nuterina (Giudice & Kao, 2004; Miller et al., 2 017). É considerada uma doença multifatorial, \npossuindo fatores genéticos, endócrinos, imunológicos, microbiológicos e ambientais \nrelacionados à sua gênese (Giudice & Kao, 2004; Senapati & Barnhart, 2011; ASRM, 2012). \nEssa doença acomete de 6 a 10% das mul heres em idade reprodutiva e de 35 a 50% das \nmulheres que apresentam infertilidade e/ou dor pélvica  associadas (Senapati & Barnhart, \n2011; ASRM, 2012). \nO diagnóstico da doença é muito difícil, devido à heterogeneidade dos sintomas, que \nnormalmente incluem dor pélvica inte nsa, dismenorreia, dispareunia , sintomas evacuatórios \nou urinários pré -menstruais, sangramento menstrual intenso e irregular  e infertilidade. Além \ndisso, mulheres com endometriose possuem maior risco de desenvolver infecções, alergias, \ndoenças autoimun es, síndromes metabólicas  e ocorrência de alguns tipos de câncer, \nprincipalmente o câncer de ovário e mama (Wang et al., 2020).  \nExistem ainda os transtornos psicológicos, emocionais e sociais frequentemente \nrelacionados à endometriose devido a o impacto dos sintomas associados à doença e a \ninterferência na qualidade de vida da mulher, gerando impactos negativos na relação social e \nconjugal da mesma (Nácul & Spritzer, 2010). \nAlém disso, existem casos assintomáticos (por volta de 16  a 25 % das pacientes \nacometidas pela doença), dificultando ainda mais o diagnóstico. Atualmente, o diagnóstico \ndefinitivo ocorre somente após laparoscopia  ou videolaparoscopia seguida ou não de biópsia \ndas lesões. Porém também são utilizados exames menos invasivos para auxiliar esse processo, \ncomo os exames físicos, laboratoriais e de imagem, sendo estes: ultrassom transvaginal, \nressonância magnética e tomografia computadorizada (Kitawaki et al., 2003; Giudice & Kao, \n2004). \nNormalmente, o tempo até um diagnóstico defi nitivo é muito extenso. Estima -se que o \ntempo médio entre os primeiros sintomas e a confirmação do diagnóstico pode levar até oito \nanos e normalmente as mulheres são diagnosticadas apenas na sua terceira ou quarta década \nde vida. Com isso, frequentemente o corre à progressão da doença e de seus sintomas  até o \ninício do tratamento (Giudice & Kao, 2004; Hogg & Vyas, 2015). \nEstima-se que de 35 a 50% das mulheres com endometriose possuem infertilidade como \num sintoma associado à doença (Bulletti et al., 2010; Stilley et al., 2012; Rosa -e-Silva et al., \n \n \n15 \n\n2019). Neste contexto, existem diversos mecanismos biológicos que procuram explicar essa \nrelação, tais como anatomia pélvica distorcida , principalmente quando a doença está em fase \navançada. Dessa forma, podem ocorr er anormalidades no transporte uterotubário  devido a \naderências locais que ocasionam alterações anatômicas na região pélvica. Além disso , ainda \npodem ocorrer anormalidades endócrinas, alterações no sistema de imunidade humoral e \ncelular e foliculogênese alterada (ASRM, 2012; Fox et al., 2016; Miller et al., 2017). \nOutro importante fator encontrado na relação endometriose e infertilidade, apesar de ainda \ncontroverso, é a implantação embrionária prejudicada devido à baixa receptividade \nendometrial apr esentada por mulheres acometidas pela doença. Um estudo demonstrou que \nmulheres com endometriose possuíam uma expressão endometrial reduzida de αVβ3 integrina \ndurante o período de implantação embrionária. Além disso, algumas mulheres apresentaram \nníveis reduzidos de uma enzima envolvida na síntese do ligante endometrial com a L -seletina, \nproteína presente no trofoblasto embrionário (Bulletti et al., 2 010). Outros estudos \ndemonstraram que m ulheres com endometriose apresentam citocinas pró -inflamatórias e \nquimiocinas envolvidas com inflamação, angiogênese e fatores de crescimento tecidual \nalterado no plasma e líquido peritoneal , podendo afetar a receptiv idade endometrial das \nmesmas (Stilley et al., 2012; Miller et al., 2017; Rosa-e-Silva et al., 2019). \n \n1.2. O tratamento da Endometriose \n \nA endometriose não possui cura, mas é controlada clinicamente para se evitar a \nprogressão da doença. O tratamento da mesma é individualizado para cada mulher, \ndependendo da progressão da doença, sintomas, idade e desejo de concepção. \nPara controle da doença normalmente são utilizados medicamentos como os \ncontraceptivos orais combinados, agonista de GnRH e anti-inflamatórios não esteroidais, além \ndo procedimento cirúrgico para retirada do tecido endometrial ectópico  nos casos refratários \naos tratamentos clínicos ou  na tentativa de restabelecer a anatomia normal da pelve feminina  \ngeralmente nos casos de infertilidade  (Giudice & Kao, 2004; Bulletti et al., 2010; Hogg & \nVyas, 2015). \nEm mulheres com desejo de concepção  os tratamentos orais não são indicados , pois \ngeralmente s ão medicações anticoncepcionais  com inibição  da ovulação. Além disso, \ncomprometem o preparo do endométri o para posterior implantação embrionária e futura \ngestação (Nácul & Spritzer, 2010). \nDe acordo com estudo publicado em 2009, a ablação cirúrgica das lesões parece não \n \n \n16 \n\nmelhorar as taxas de gravidez espontânea após nove a doze meses da cirurgia excisional, e em \nmetanálise recente o procedimento cirúrgico não melhorou a fertilidade das mulheres com \nendometriose (Leonardi et al., 2020). Além disso, a intervenção cirúrgica ainda apresenta \ntaxas significativa s de morbidade e complicações (Filip et al., 2020)  e um número \nsignificativo de pacientes apresenta recidiva dos sintomas (Cezar & Freitas, 2009). \nDessa forma , a única alternativa para  possibilitar a gestação em  mulheres com \nendometriose e desejo de concepção é a utilização das técnicas de reprodução assistida de \nbaixa e/ou alta complexidade , já que atualmente não existem tratamentos medicamentosos \nque incrementem a fertilidade natural dessas mulheres (Tomassetti & D’Hooghe, 2018). \nPorém, as técnicas de reprodução assistida ainda são inacessíveis para a maioria da \npopulação, principalmente nos países em desenvolvimento, como o Brasil. Os cuidados com a \ninfertilidade são frequentemente negligenciados pelos governos locais, sendo assim, esse \nserviço apresenta-se indisponível ou apenas disponível a custos muito altos para a maioria da \npopulação (Makuch et al., 2011). \nUm estudo mostrou que 19 dos 25 estados nacionais não possuem atendimento para \ninfertilidade. No país foram identificados apenas 13 centros que oferecem serviços de atenção \nde baixa e/ou alta complexidade na área que atendem pelo Sistema Único de Saúde (SUS). \nAlém da baixa oferta desse serviço no país, existe uma fila de espera de três meses a seis anos \nnos locais em que é possível se utilizar desses serviços gratuitamente ou a custos menores \nquando comparados a clínicas privadas de fertilização assistida (Makuch et al., 2010; 2011; \n2012). \nDiante do exposto, faz -se necessário a busca de novas alternativas terapêutic as \nmedicamentosas pouco -invasivas que incre mentem a fertilidade natural destas  mulheres \ninférteis com endometriose.  \n \n1.3. Endometriose e Células Estromais Mesenquimais Multipotentes \n \nO processo de reparo endometrial fisiológico cíclico ocorre com a participação de diversas \npopulações celulares envolvidas na regeneração de vasos, glândulas e estroma. Para esse \nprocesso ocorre o recrutamento de células endoteliais locais provenientes de vasos sanguíneos \nvizinhos; células progenitoras endoteliais circul antes no sangue periférico proveniente da \nmedula óssea; além de células estromais  advindas também da medula óssea  (Mints et al., \n2008; Gargett et al., 2012; Zhao et al., 2015; Hufnagel et al., 2015;  Pluchino & Taylor, \n2016).  Esses achados em modelo murino estão em consonância com os achados em humanos, \n \n \n17 \n\ndescrito por Taylor e colaboradores (2004) em que mulheres receptoras de transplante \nalogênico de medula óssea apresentaram células endometriais dos doadores em biópsias \nendometriais. \nSendo assim, pode-se sugerir que de fato as células estromais  derivadas da medul a óssea \n(ou seja, células estromais não uterinas) podem diferenciar-se em endométrio uterino humano, \npodendo então auxiliar no processo de regeneração desse tecido e contribuir futur amente na \nmelhora da implantação embrionária. \nEm 2005 a Sociedade Internacional de Terapia Celular introduziu o seguinte termo: \ncélulas estromais mesenquimais multipotentes (do inglês multipotente mesenchymal stromal  \ncells) para referir -se à  população celu lar com características típicas de uma célula tronco. \nDessa forma , essas células possuem características de crescimento aderentes ao plástico \nformando colônias, apresentam alta capacidade multipotencial in vitro  de proliferação e \ndiferenciação em diferentes tipos celulares, além de morfologia fibrobla stoide (Lindner et al., \n2010; Castro-Manrreza & Montesinos, 2015). \nAs células estromais mesenquimais multipotentes (CE Ms) são células estromais  adultas \nde linhagem não -hematopoiética, que contribuem com a homeo stase tecidual. Sendo assim, \npodem contribuir com a regeneração de tecidos mesenquimais, como ósseo, cartilaginoso e \nadiposo, além de dar suporte à hematopoiese da região (Pittenger et al., 1999). Além disso, foi \ndescoberto que são células capazes de se diferenciarem também em diferentes tipos celulares, \ncomo neurônios, hepatócitos, cardiomiócitos e células endoteliais.  Então, o emprego das \nCEMs é uma importante fonte de estudo para tratamento de diversas doenças, como cardíacas, \nneurológicas e também no sistema reprodutor feminino (Nombela-Arrieta et al., 2011). \nAs CE Ms podem ser isoladas a partir de diversos tecidos, como músculo esquelético, \ntecido adiposo, sangue menstrual, cordão umbilical, tecidos fetais e mais comumente a partir \nda medula óssea. Porém, normalmente as CE Ms estão presentes em pequenas quantidades \nnesses locais. Por exemplo, na m edula óssea, há cerca de 0,01 a 0,001% de células \nmesenquimais em relação ao número total celular (Castro-Manrreza & Montesinos, 2015 ). \nDessa forma, faz -se necessário a utilização de protocolos para o  isolamento e caracterização \ndessas células, como realizado pelo presente projeto  com base nos estudos de Zhu e \ncolaboradores (2010). \nAs células tronco totais e especificamente estromais mesenquimais provenientes da \nmedula óssea podem estar relacionadas com o processo reparativo do endométrio feminino. \nEm 200 7, Du e Taylor  realizaram um transplante de células tronco  totais provenientes da \nmedula óssea de camundongos machos em fêmeas. Após o transplante, 0,1% das células do \n \n \n18 \n\nestroma e 0,04% das células epiteliais do útero eram de origem do doador. Com isso, sugere -\nse a contribuição de células extra -uterinas na regeneração do endométrio ectópi co. De forma \nanáloga Tal e colaboradores (2016) demonstra ram a presença de células estromais  da medula \nóssea de camundongos transgênicos GFP positivo em 71,8% das células do estroma \nendometrial de camundongos não transgênicos que receberam o transplante. \nDe acordo com estudos anteriores, a migração de células tronco /estromais da medula para \neste processo reparativo parece estar comprometido na presença da endometriose (Pluchino & \nTaylor, 2016), e este defeito pode ser reproduzido em modelo de endome triose experimental \ninduzida em camundongos (Sakr et al., 2014). A indução de endometriose em camundongos \nfêmea causou perda parcial da fertilidade destes animais, reduzindo pela metade a taxa de \ngravidez mensal (Rosa -e-Silva et al., 2019). Considerando -se este comprometimento na \ncapacidade de atrair células de reparo para o útero e a redução na expressão de genes \nrelacionados a marcadores de receptividade endometrial presentes nos indivíduos portadores \nde endometriose, poderia se aventar a possibilidade de  que estes m ecanismos estejam \ninterligados. Sendo assim, a menor migração de células tronco /estromais impactaria na \ncapacidade deste tecido em expressar moléculas básicas para o processo de implantação \nembrionária como um dos mecanismos de infertilidade li gados à endometriose (Rosa -e-Silva \net al., 2019).  Em contrapartida, o uso de quimioatrator nos animais com endometriose \ninduzida, recuperou parcialmente a capacidade reprodutiva dos animais (Rosa -e-Silva et al., \n2022). \nNeste sent ido, a infusão de células e stromais mesenquimais, provenientes da medula \nóssea, diretamente na cavidade uterina promove melhorias histológicas no endométrio, como \naumento da espessura endometrial e no número de glândulas e capilares endometriais em \ncomparação com o grupo controle , na espécie murina . Neste mesmo estudo foi demonstrado  \num aumento na expressão de genes marcadores de receptividade endometrial (αVβ3 integrina \ne LIF) no grupo transplantado, aproximando-se ao grupo controle (Zhao et al., 2015). \nHufnagel e colaboradores (2015) sugeriram a importância do tráfico celular em murinos \ncom endometriose induzida cirurgicamente  e sua correlação com a ba ixa rec eptividade \nendometrial dos mesmo s. No estudo, camundongos selvagens sofreram endometriose \ninduzida por meio de  cornos GFP positivos, e  esses animais  curiosamente expressaram a \nproteína GFP em células endometriais na camada basal do endométrio, e não no revestimento \nepitelial do lúmem ou dentro das glândulas.  Além disso, essas células apresentavam uma \nexpressão aumentada de Snail1, Snail3, Goosecoid e baixa express ão de Zeb2, genes \nassociados à transição celular epitelial à mesenquimal. Essas células, provenientes da \n \n \n19 \n\nendometriose, iniciaram uma ativação da via de sinalização Wnt, indicando que elas possuíam \ncaracterísticas epiteliais, mas ao mesmo tempo elas não se encontravam no epitélio. Com isso, \nhavia uma sinalização ineficiente do gradiente de moléculas de sinalização entre o epitélio e o \nestroma, uma atividade essencial para a receptividade endometrial murina (Pluchino & \nTaylor, 2016; Ojosnegros et al., 2021). \nDessa forma, sugere -se que a presença dessa população celular pode ser de grande \nimportância para um novo potencial tratamento da relação endometriose e infertilidade devido \na possível baixa receptividade endometrial ligada à doença. \n \n1.4. Endometriose e CXCL12 \n \nO CXCL12 é uma quimiocina que possui como um de seus ligantes o CXCR4. \nNaturalmente, o CXCL12 é produzido em células epiteliais e estromais endometriais, e \nnormalmente expresso em locais de inflamação e lesão, assim como ocorre em mu lheres \nacometidas com endometriose (Hufnagel et al., 2015; Wang et al., 2015; Moridi et al., 2017).  \nO estradiol estimula a produção de CXCL12 a partir de células estromais endometriais e de \nCXCR4 em células tronco derivadas da medula óssea, sugerindo um p apel desta quimiocina \nno recrutamento de células tronco/estromais para o útero (Wang et al., 2015). \nA mobilização e localização das células tronco /estromais são reguladas por quimiocinas, \nsendo assim, a concentração de CXCL12 cria um gradiente químico que direciona a migração \nde células tronco  não hematopoiéticas, além de estar envolvido na an giogênese e reparação \ntecidual. Porém, estudos sugerem que as células estromais  advindas da medula óssea podem \nser atraídas para os focos de lesão de endometriose, pela via de sinalização CXCL12 e seu \nreceptor CXCR4; dessa forma , o endométrio tópico (intrauterino) pode apresentar \nrecrutamento reduzido dessa população celular, podendo prejudicar assim sua capacidade \nregenerativa local, sugerindo uma infertilidade devido à baixa receptividade endometrial local \n(Sakr et al., 2014, Wang et al., 2015). \nEstudo de Koo e colaboradores (2021) demonstrou que o CXCL12 auxilia na angiogênese \nendometrial por meio da contribuição na formação de células endoteliais microvasculares do \nendométrio murino, por exemplo. Além disso, está relacionada com a ativação de sinalização \nintra e intercelular da quimiocina e seus receptores, auxiliando na relação embrião-endométrio \ndurante a implantação embrionária. \nUm estudo previamente desenvolvido por nosso grupo  de pesquisa demonstrou que o uso \ndo CXCL12 em camundongos subférteis com endometriose induzida promoveu aumento das \n \n \n20 \n\ntaxas de gestação nos animais doentes, de 50% para 78%, aproximando a capacidade \nreprodutiva destes animais à do grupo controle sem endometriose (Rosa -e-Silva et al., 2022). \nPorém, o  mecanismo pelo qual esta melhora ocorreu não está completamente elucidado. \nVerificou-se uma melhora na expressão de marcadores de  receptividade endometrial, tais \ncomo aumento na expressão de receptores de progesterona e de αV β3 integrina, porém não se \nsabe se por ação direta sobre o tecido endometrial ou mediado por células tronco /estromais, \npor exemplo. Neste mesmo estudo, os animais haviam sido transplantados com células tronco \ntotais (incluindo as estromais mesenquimais GFP positivas), via intravenoso, antes do uso do \nCXCL12, porém não foram encontradas células GFP no útero das fêmeas após o parto. Para \nisso foram aventadas duas possibilida des, ou as células haviam tido um papel importante na \ndecidualização do endométrio e eventualmente na composição da placenta ou houve um efeito \nsecundário do CXCL12 diretamente sobre o tecido uterino. Este estudo pretende verificar o \nefeito da injeção direta de CEMs no útero pré-gestacional e verificar se há ou não participação \ndas mesmas no desenvolvimento placentário, bem como verificar o efeito do CXCL12 sobre a \nestrutura da placenta. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n21 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2. Justificativa \n \n \n22 \n\nA endometriose é uma doença que acomete de 6 a 10% das mulheres em idade \nreprodutiva e de 35 a 50% das mulheres que apresentam infertilidade . Acredita -se que a \ndoença possa estar relacionada com piora da receptividade endometrial e, portanto, redução \ndas taxas de implantação embrionária. Porém, os mecanismos envolvidos nessa relação ainda \nnão estão bem elucidados e esclarecidos. \nAcredita-se que na ocorrência da doença, os focos de tecido endometrial ectópicos \ndirecionam as células estromais mesenquimais locais e estruturas de regeneração tecidual para \nsi, reduzindo a migração destas células para o útero. Portanto, a regeneração do útero e sua \nreceptividade para implantação embrionária poderia estar afetada devido a esse fator. \nNesse contexto, há estudos sugerindo que células estromais  mesenquimais provenientes \nda medula óssea podem estar relacionadas com o processo reparativo do endométrio feminino \ne a utilização de cél ulas estromais  mesenquimais como potencialmente promissoras no \ntratamento de doenças inflamatórias, como a endometrios e. Além disso, é sugerida por outros \nestudos a importância da quimiocina CXCL 12 na migração de células estromais  \nmesenquimais para a re gião em que ela é administrada. Já foi demonstrado por nosso grupo \nde pesquisa que a utilização de CXCL12 no útero de cam undongos fêmeas com endometriose \ninduzida cirurgicamente promoveu aumento na taxa de gestação desses animais em relação ao \ncontrole, bem como o aumento na marcação imunohistoquímica de receptores de \nprogesterona e αV β3 integrina no endométrio dos animais t ratados, ambos marcadores \nrelacionados à receptividade endometrial para implantação. Porém, não foi possível elucidar \nse a melhora nos resultados reprodutivos ocorreu ou não pela  intermediação de células \nestromais mesenquimais. \nSendo assim, o presente estu do pretende verificar o efeito da injeção direta de CE Ms no \nútero pré-gestacional e verificar se há ou não participação das mesmas no desenvolvimento \nplacentário, bem como verificar o efeito do CXCL12 sobre as estruturas da placenta. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n23 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3. Objetivos \n \n \n24 \n\n3.1. Objetivo primário \n \nAvaliar o efeito da  administração de células estromais  mesenquimais ou de CXCL12 \ninjetados diretamente no útero de camundongos fêmeas  sobre as taxas de gestação de \ncamundongos subférteis portadores de endometriose induzida cirurgicamente em relação ao \ncontrole. \n \n3.2. Objetivos secundários \n \n• Comparar a morfologia da placenta dos seis grupos estudados. \n• Avaliar a presença ou  não de células estromais  mesenquimais no complexo placenta-\nendométrio decidualizado.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n25 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4. Hipóteses \n \n \n26 \n\n• A administração de células estromais mensenquimais ou de CXCL12 isoladamente \nno útero dos animais dos grupos com endometriose induzida terá efeito benéfico \nnos desfechos reprodutivos. \n• Existirão CEMs na estrutura da placenta no grupo que recebeu a injeção uterina \ndessas células como tratamento. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n27 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5. Material e Métodos \n \n \n28 \n\n5.1. Animais \n \nComo modelo experimental foram utilizados camundongos ( Mus musculus) selvagens da \nlinhagem C57BL/6 e C57BL/6 transgênicos (GFP positivos)  de seis a oito semanas  de vida. \nOs animais foram ambientados no Laboratório de Estudos Experimentais em Animais \n(LEEA) – Hemocentro de Ribeirão Preto. Eles foram distribuídos em gaiolas adequadas (n  = \n4 a 5 animais/caixa), com acesso a água e ração ad libitum. Houve controle ambiental, com \nciclo de claro e escuro de 12 horas cada (0 6h00 – 18h00), temperatura de 22 ± 2ºC. Todos os \nanimais foram tratados seguindo os protocolos aprovados pela Comissão de Ética no Uso de \nAnimais (CEUA) da FMRP-USP (Anexo B). \n \n5.2. Desenho do estudo \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 1. Fluxograma do desenho do estudo. \nC57BL/6 \n(6 a 8 semanas) \nn = 36 animais \nIsolamento e cultivo \nde células \nmesenquimais \nn = 4 machos GFP+ \nAguardado 4 semanas \nEndometriose \nn = 18 animais \nSham \nn = 18 animais \nAguardado 1 semana \nCXCL12 \nn = 6 \nanimais \nCels mesenquimais \nn = 6 animais \nImunofluorescência \n \nIdentificação de \ncélulas GFP+  \n \n \nPlacebo \nn = 6 \nanimais \nCXCL12 \nn = 6 \nanimais \nCels mesenquimais \nn = 6 animais \nPlacebo \nn = 6 \nanimais \nDoadoras de \ncorno uterino \nn = 18 animais \nContato das fêmeas com \nmachos (cruzamento) \n \nDuração: até 4 semanas \nCesárea das fêmeas grávidas, \ncoleta das placentas e \nfragmentos uterinos \n \nColeta de corno \nuterino das \nfêmeas inférteis \n \nAnálises posteriores \n \n \n \n29 \nColoração de \nHematoxilina e Eosina \n \nAnálise \nhistomorfométrica \n \n \n\n5.3. Isolamento de células estromais mesenquimais multipotentes  \n \nPara o isolamento foi utilizado o protocolo descrito por Zhu e colaboradores (2010). Para \nisso, camundongos machos da linhagem C57 BL/6 transgênicos (GFP positivos; n = 4 ) foram \neutanasiados com sobredose de anestésico  Ketamina (90 -120 mg/kg – Fort Dodge Animal \nHealth) e Xilazina (5 -10 mg/kg - Lioyd Laboratories) via i ntraperitoneal, seguido por \ndeslocamento cervical e lavados livremente em etanol 70% (v/v). \nEm seguida, foi realizada uma incisão na pele da região inguinal do animal, desassociando \nos músculos, separando os fêmures abaixo da cabeça femoral e desconectando  os membros \nposteriores do tronco. Após isso, os úmeros foram dissecados, excisando a pata dianteira dos \naxilares. \nEntão, foi realizada dissecação dos músculos e tendões de úmeros, tíbias e fêmures para \nremoção de todo o tecido mole aderido ao osso. Após isso, as epífises foram removidas e a \ncavidade medular lavada com PBS 1X  (Gibco) até os ossos se tornarem pálidos. Em seguida, \nos ossos foram fragmentados em lascas de 1 a 3 mm 3. Os mesmos foram digeridos em 2 mL \nde α-MEM + 1 mg/mL colagenase II + 20% SFB (v/v) por 1 a 2 horas em shaker (200 rpm). \nApós a digestão em colagenase, os fragmentos ósseos foram semeados em garrafa de \ncultura na presença de 5 mL de α-MEM + 20% SFB (v/v) e incubados (5% CO2 a 37ºC) por 3 \ndias. Nesse período as células mesenquim ais migram da região medula r óssea para a garrafa \n(Figura 2.A e 2 .B). Em seguida, o meio de cultura foi completamente removido e substituído \npor novo. Após 5 dias foi realizado o mesmo processo. Em seguida, o mesmo procedimento a \ncada dois dias até atingir  confluência de  crescimento de  80% de células na superfície da \ngarrafa. \nApós confluência celular ideal  (Figura 2.C e 2 .D) foi realizada a tripsinização do cultivo. \nPara isso, foi retirado todo sobrenadante e adicionado 3  mL de tripsina 0,25% 10X c/ EDTA, \nincubado por 2  min (5% CO2 a 37ºC) e então adicionado 3  mL de de α -MEM + 5% SFB \n(v/v). Após isso, as células (agora no sobrenadante  – Figura 2.E) foram transferidas para um \ntubo cônico Falcon 15 mL e centrifugadas a 1200 rpm por 5 min. O sobrenadante foi retirado, \ne as células ressuspendidas em α -MEM + 20% SFB (v/v). Em seguida, foi realizada a \ncontagem das células mesenquimais arredondadas e refringentes em câmera de Neubaeur, \napós coloração em azul de tripan 0,4% (Figura 2.F), um corante vital de tecidos e células. \nUma parte das células cultivadas foi utilizada para o tratamento dos grupos experimentais \ne outra parte das células sob as mesmas condições de cultivo foram identificad as por \nfenotipagem em citometria de fluxo. As células foram consideradas ideais para a utilização no \n \n \n30 \n\nestudo na passagem cinco, ou seja, após cinco tripsinizações e replaqueamentos. \n \n \nFigura 2. Cultivo das células estromais mesenquimais. \nLegenda: A) Células mesenquimais em cultura migrando da medula óssea para a superfície da garrafa \nde cultura (aumento 10X) (* = fragmento de ossos longos) . B) Células mesenquimais em passagem 1 \n(primeiro plaqueamento) aderidas à garrafa (aumento 10X). C , D) Células mensenquimais em \npassagem cinco com confluência de aproximadamente 80% (C - aumento 10X e D - aumento 40X). E) \nCélulas mesenquimais tripsinizadas, livres no meio de cultura,  não aderidas à garrafa . F) Contagem \ndas células mesenquimais em câmera de Neubauer, após coloração com azul de tripan 4% , \nevidenciando praticamente 100% de células viáveis (refringentes). Fonte: imagens autorais.  \n \n5.4. Fenotipagem das CEM cultivadas \n \nAs células estromais  mesenquimais em passagem cinco do cultivo, condição em que \nforam injetadas no útero, foram submetidas a fenotipagem, por meio de citometria de fluxo  \n(BD FACsCanto) . A fenotipagem para reconhecimento da característica mesenquimal das \ncélulas foi realizada por meio da identificação dos seguintes  marcadores: SCA-1-PE, CD11b-\nPE, CD34 -PE, CD31 -PE e CD45 -PE (todos BD -Pharmingen), além de um tubo sem \nmarcação e um tubo com o isótopo controle ficoeritrina (PE, do inglês phycoerythrin). \n \nA B \nD \nC \nE F \n* \n* \n \n \n31 \n\nTabela 1 – Identificação dos marcadores de superfície celular utilizados na fenotipagem das \ncélulas estromais mesenquimais. \nAnticorpo Característica Resultado esperado Referência \nAntígeno de células \ntronco 1 (SCA-1) \nMarcador de células \ntronco  \nPositivo Baustian et al., 2015 \nAntígeno de \nmacrófago-1b  \n(CD11b) \nMarcador de células \nimunes \nNegativo Baddoo et al., 2003 \nCluster de \ndiferenciação 31 \n(CD31) \nMarcador de células \nendoteliais \nNegativo Baddoo et al., 2003 \nCluster de \ndiferenciação 34 \n(CD34) \nMarcador de células \nhematopoiéticas  \nNegativo Sung et al., 2008 \nCluster de \ndiferenciação 45 \n(CD45) \nMarcador de células \nhematopoiéticas \nNegativo Jabeen et al., 2022 \n \nPara isso, foi realizada a tripsinazação das células, como descrito anteriormente (item 5.3) \ne o volume de solução contendo o equivalente a  1 milhão de células foi distribuído em tubos \nFACS, em volumes iguais. Após isso, o material foi centrifugado (1800  rpm) por 3 min e o \nsobrenadante foi descartado . As células foram ressuspendidas em 200  μL de PBS estéril 1X \n(Gibco). \nEm seguida, em  cada tubo com as células estromais  mesenquimais foi adicionado 3  μL \ndos marcadores utilizados. Os tubos foram incu bados no escuro  por 20 min à temperatura \nambiente. Em seguida, foi acrescentado 2  mL de PBS a todos os tubos, e realizada \ncentrifugação (1800 rpm) por 3 min novamente. \nApós isso, foi retirado o sobrenadante por inversão dos tubos. As células, agora marcadas, \nforam ressuspendidas em 200 μL de PBS 1X e em seguida foi realizada análise por citometria \nde fluxo. \n \n5.5. Indução de endometriose e sham cirúrgico \n \nOs animais foram divididos em dois grupos: endometriose  induzida (n = 18 animais) e \nsham (n = 18 animais), conforme descrito nos procedimentos abaixo. O protocolo de indução \n \n \n32 \n\nde endometriose cirúrgica foi definido com base em estudos prévios do grupo de pesquisa que \nidentificou uma quantidade e tamanho de fragmentos que ocasionaram  lesões bem \nconsolidadas de endometriose  induzida em 100% dos animais operados  e diminuíram \nsignificantemente a fertilidade desses animais em relação aos animais  do controle cirúrgico \n(sham; Rosa-e-Silva et al., 2019). \nForam utilizadas fêmeas C57BL/6 como doadoras  (n = 18 animais)  dos cornos uterinos \npara viabilizar a indução de endometriose de suas respectivas receptoras. Todos os animais \nforam anestesiados via inalatória com indução inicial e controle de pressão de saída de \nIsofluorano (Virbac) 3,0% de concentração alveolar . A manutenção durante o procedimento \ncirúrgico foi realizada com concentração de 1,5 a 2,0% do mesmo anestésico citado \nanteriormente. Além disso, anterior a cirurgia e anestesia do animal, foi administrado  \nMeloxicam 0,2% na dosagem de 5 mg/kg via subcutânea para analgesia dos animais. Após a \nanestesia foi realizada uma incisão laparotômica na linha média do abdômen e retirados os \ndois cornos uterinos das doadoras. Os animais doadores foram eutanasiados após a retirada \ndos cornos uterinos  por meio de sobredosa gem dos anestésicos Ketamina (90 -120 mg/kg – \nFort Dodge Animal Health) e Xilazina (5-10 mg/kg - Lioyd Laboratories). \nPosteriormente, ambos cornos foram lavados em PBS, abertos longitudinalmente e \ntransversamente dividido s em dois fragmentos com 5 mm² cada . Para a indução de \nendometriose, as fêmeas receptoras foram também submetida s aos mesmos procedimentos \nanalgésico e anestésico  descritos anteriormente durante  e antes  da realização das cirurgias. \nCom os animais sedados, foi realizada incisão mediana de cerca de 1,5 cm, por planos (pele e \nmúsculo separadamente). Em seguida, utilizando -se Vicryl 5 -0 quatro fragmentos uterinos \n(preparo descrito acima) foram suturados ao peritônio parietal dos camundongos fêmeas \nreceptoras, simetricamente distribuídos na parede  peritoneal, dois de cada  lado, com ponto \núnico (Figura 3 .A). Posteriormente, a parede abdominal das receptoras foi fechada em dois \nplanos, utilizando -se Vicryl 4 -0. Como controle, os animais do grupo sham receberam os \nmesmos quatro pontos de sutura peritoneal, porém sem o tecido endometrial (Figura 4.A). \nApós o procedimento cirúrgico, o processo de analgesia dos animais foi realizado por \nmeio de Meloxicam 0,2%, na dosagem de 5 mg/kg via subcutânea, uma vez ao dia, por dois \ndias consecutivos, além de admini stração imediatamente antes da cirurgia de indução de \nendometriose e sham. \nQuatro semanas após a cirurgia de indução de endometriose sabe -se que os animais \napresentam características muito semelhantes à endometriose, como inflamação e adesão \ntecidual na re gião dos focos ectópicos da doença , como demonstrado em estudos anteriores \n \n \n33 \n\ndesenvolvidos pelo mesmo grupo de pesquisa (Figura 3.B e 3.C).   \n \n \nFigura 3. Cirurgia de indução de endometriose. \nLegenda: A) Fragmento uterino suturado em ponto único ao peritônio parietal logo após cirurgia de \nindução de endometriose. B e C) Lesão de endometriose induzida no peritônio parietal após quatro \nsemanas da indução. Fonte: imagens autorais. \n \nAlém disso, nos animais sham , é possível visualizar o ponto único de sutura com fibrose \ntecidual ao redor do mesmo (Figura 4.B). \n \n \nFigura 4. Procedimento sham. \nLegenda: A) Ponto de sutura único no peritônio parietal, logo após cirurgia de sham. B) Procedimento \nsham com pequena fibrose e aderência do fio de sutura ao peritônio após quatro semanas da cirurgia. \nFonte: imagens autorais. \n \n5.6. Injeção uterina dos tratamentos propostos \n \nApós quatro semanas d o procedimento de indução de endometriose ou sham, o s animais \nde cada grupo  foram subdivididos para receber a administração uterina de CXCL12 \nA B C \nA B \n \n \n34 \n\n(Recombinant Mouse SDF -1α, Gemini -Bio®, West Sacraento -CA, EUA , n = 6 \nanimais/grupo), ou de células estromais mesenquimais previamente isoladas (descrito no item \n5.3., n = 6 animais/grupo) ou placebo ( PBS estéril, n = 6 animais/grupo). O tempo de quatro \nsemanas foi definido  com base  em estudos prévios do grupo de pesquisa que identificou a \npresença de le sões bem consolidadas de endometriose induzida em 100% dos animais \noperados após esse período (Rosa-e-Silva et al., 2019). A presença de lesão foi confirmada no \nintraoperatório desta segunda laparotomia. \nPara a injeção uterina os animais foram anestesiados via inalatória e receberam analgesia \nvia subcutânea como descrito anteriormente  (item 5.5.). Depois de realizada incisão mediana \npor planos, os cornos foram expostos para a injeção de 75 µL/corno, diretamente na parede \nuterina da quimiocina (CXCL12), ou células mesenquimais ou somente placebo, utilizando-se \nseringa e agulha de insulina (Figura 5 ). O volume de 75 µL/corno foi considerado após testes \nrealizados pelo mesmo grupo de pesquisa, considerando a variação do volume dos cornos \nuterinos em cada fase reprodutivas das fêmeas. Sendo assim, o volume utilizado fica \ncompletamente retido no interior dos corn os uterinos, sem extravasamento  na região \nperitoneal, o que poderia  levar a possíveis efeitos secundários inesperados e não desejados \ndevido ao  tratamento não estar concentrado na região de interesse no momento da injeção \nuterina. \nA dose de CXCL12 administrada foi de 2,5 µg/animal diluídos em água estéril com 0,1% \nBSA, com base em estudos anteriores utilizando a mesma substância em trabalhos análogos \nao presente proj eto, além de trabalhos anteriores do mesmo grupo de pesquisa  (Rosa-e-Silva \net al., 2022). \nPara o grupo de células estromais mesenquimais foram injetados uma concentração de \n1x106 de células n o total, ou seja, aproximadamente 500  mil células por corno uteri no. Essa \nconcentração foi definida com base em  estudos que utilizaram células mesenquimais como \nalternativa terapêutica, injetadas diretamente no local de ação (Chan et al., 2007; Ezquer et al., \n2008; Guillot et al., 2008; Bazoobandi et al., 2020 ). Já p ara o grupo placebo foi utilizado \napenas PBS estéril  (diluente das células mesenquimais). Após as injeções a parede foi \nsuturada por planos com Vicryl 4-0. \n \n \n35 \n\n \nFigura 5. Cornos uterinos antes e após injeção dos tratamentos. \nLegenda: A) Cornos uterinos anteriores a injeção de um dos  três tratamentos propostos. B) Cornos \nuterinos após injeção de um dos três tratamentos propostos. Fonte: imagens autorais. \n  \n5.7. Acasalamento dos animais \n \nApós uma semana da administração de CXCL12, células mesenquimais ou placebo, as \nfêmeas dos seis grupos: endometriose + CXCL12 – (EndoCX); endometriose + células \nestromais mesenquimais (EndoCE M); endometriose + placebo (EndoPL); sham + CXCL12 \n(ShamCX); sham + células  estromais mesenquimais (S hamCEM) e sham + placebo \n(ShamPL) foram expostas a machos férteis , previamente testados,  por um período de  até 4 \nsemanas seguidas (com alternância dos machos entre as caixas semanalmente). \nPara verificar a ocorrência de prenhez a s fêmeas foram pesadas logo antes de serem \nexpostas aos machos, novamente após uma semana de exposição aos machos e posteriormente \na cada dois ou três dias para verificar um ganho anormal de peso o que seria s ugestivo de \nprenhez. Fêmeas que possuíam mais de 24 g e um incremento equivalente a um grama por dia \neram consideradas potencialmente grávidas e então, separadas dos machos.  \nAs fêmeas que chegavam próximo ao peso de 28  a 30 g  durante esse período foram \nsubmetidas a parto cirúrgico (cesárea) e posteriormente foram eutanasiadas com sobredose de \nanestésico (como descrito no item 5.5.). As fêmeas que não engravidaram durante o período \nde exposição aos machos, foram isoladas e obse rvadas por um período adicional de 10 a 15 \ndias após o isolamento (sem contato com machos)  para confirmar a não ocorrência da \ngestação, somente após este período foram consideradas como inférteis . As fêmeas inférteis  \ntambém tiveram seus cornos uterinos coletados para análise histológica posterior. \n \n \nA B \n \n \n36 \n\n5.8. Resolução da gestação por cesárea \n \nAs fêmeas grávidas  com peso de aproximadamente (28  a 30  g) foram submetidas à \nanalgesia e anestesia conforme descrito anteriormente  (item 5.5.). Depois de  confirmada a \nperda de consciência, foi realizada uma incisão laparotômica na linha média do abdômen e \nexpostos os dois cornos uterinos. Em seguida, ambos cornos foram abertos na região mais \ndistal, ex pondo o(s) conjunto(s) placenta /feto. Com isso, o número de placentas em cada \ncorno uterino foi contabilizado e retirado para posterior análise em conjunto com o tecido  \nuterino adjacente, sendo assim os fragmentos coletados apresentavam de um lado o  cordão \numbilical e do outro  a parede uterina  adjacente à placenta . Além disso, um fragmento do \ncorno uterino sem placenta foi coletado para análise histológica posterior (Figura 9). \n \n5.9. Coloração com Hematoxilina e  Eosina e análise histomorfométrica dos complexos \nplacenta-endométrio decidualizado \n \nAs amostras coletadas do s complexos placenta -endométrio decidualizado foram fixa das \nem parafor maldeído 4% (Sigma) por até 24 h em temperatura ambiente. Em seguida foi \nrealizado o processo de desidratação do tecido com banhos seriados de 30 min cada em álcool \netílico 50%, 70%  e 80% (v/v) também em temperatura ambiente. Nessa última etapa o \nmaterial ficou armazenado por até 1 mês a 4ºC , até completar a  coleta de todo o material e \nprocessamento no mesmo momento . Depois disso, o material biológico sofreu banhos \nseriados de 30 min cada em álcool 90%  e 95% (v/v), seguido de álcool absoluto 1X, álcool \nabsoluto 2X e álcool absoluto 3X. Em seguida, o material foi submetido a banhos seriados de \n30 min cada, em: mistura em partes iguais de álcool absoluto 3X e xilol, seguido de xilol 1X, \nxilol 2X e xilol 3X. Posteriormente o material foi emblocado  em parafina. Em seguida, foram \nrealizados cortes com  5 µm de espessura, os quais foram montado s em lâminas silanizadas. \nAs lâminas foram  codificadas por números seriados p ara evitar viés de interpretação no \nmomento da leitura das mesmas. \nPara a coloração, os cortes de tecido foram desparafinizados colocando as lâminas por 30 \nmin em estufa a 60 ºC, se guido de 2 banhos de xileno de 10 min cada. Para reidratação das \namostras foram realizados banhos seriados de 5 min cada em álcool absoluto 2X, álcool 95%, \n90%, 80%, 70% e 50% (v/v), seguido de banho em água corrente 3 vezes. \nEm seguida, as lâminas foram coradas com Hematoxilina por 40 seg  por imersão no \ncorante, e então lavadas em água corrente para retirar o excesso do corante. Após isso, as \n \n \n37 \n\nlâminas foram coradas com Eosina por 10 seg e novamente desidratadas com banhos seriados \nde 5 min cada em álcool etílico 50%, 70%, 80%, 90% e 95% (v/v), seguido de álcool absoluto \n1X, álcool absoluto 2X e álcool absoluto 3X. Após isso, as lâminas sofreram banhos de 2 \nminutos cada de xilol 1X, xilol 2X e xilol 3X e foram montadas com auxílio de bálsamo do \nCanadá para preservação do tecido. As lâminas prontas foram  lidas em microscópio  de \nvarredura (VS120 Scanner, Olympus Corporation), a qual foi realizada um escaneamento total \nda placenta em aumento de 10X, para análises posteriores no software Image J. \n \n5.10. Imunofluorescência dos complexos placenta -endométrio decidual izado dos \ngrupos tratados com CEM (GFP positivas) \n \nPara a marcação de imunofluorescência as lâminas foram desparafinizadas e reidratadas \ncomo de scrito anteriormente no item 5.9 ., a exceção do banho em água corrente que neste \ncaso ocorreu em água destilada.  Em seguida as lâminas foram colocadas em banho maria  \nimersas em citrato de sódio  a 60  ºC para recrutamento antigênico por 1 hora . Após o \nresfriamento com auxílio de banhos em PBS 0,1 M , as lâminas foram fixadas novamente com \nsolução de metanol a -20 ºC por 10 min. Em seguida, as lâminas foram lavadas em três \nbanhos de PBS 0,1  M. Posteriormente as lâminas for am imersas em solução de glicina para \nbloqueio da atividade enzimática por 30 min. Após isso, as lâminas foram novamente lavadas \nem três banhos de PBS 0,1 M. \nApós esta etapa, as lâminas foram incubadas no escuro  por uma hora  em temperatura \nambiente, com soro de bloqueio (BSA - Sigma) a 10%. Em seguida, foi realizada incubação \novernight com o anticorpo primário Anti-GFP (1:1000; Abcam, refab66 73, San Diego, \nCalifornia, EUA) a 4ºC, também no escuro. \nNo dia seguinte, as lâminas foram lavadas cinco vezes em PBS 0,1 M em banhos de 5 min \ncada. Após isso, foi realizada a incubação com o anticorpo secundário  fluorescente específico \nrabbit anti-goat IgG (1:1000; Abcam, refab150141, San Diego, California, EUA ), no escuro e \nem temperatura ambiente, por uma hora . Em seguida, as lâminas sofreram banho de Sudan \nBlack (Sigma) diluído em álcool etílico a 70% (v/v) para bloqueio da autofluorescência. \nAs lâminas foram montadas no escuro, utilizando-se DAPI e lamínula. As lâminas prontas \nforam mantidas a 4ºC, no escuro, até a leitura em microscópio  de varredura (VS120 Scanner, \nOlympus Corporation) , durante a qual foi realizado o  escaneamento total do complexo \nplacenta-endométrio decidualizado em aumento de 40X, para análises posteriores no software \nImage J.  A quantificação de CEMs GFP positivas encontradas por esta técnica foi apenas \n \n \n38 \n\ndescritiva devido ao esperado baixo número de células marcadas. \n \n5.11.  Descrição dos desfechos \n \nComo desfecho foi considerado  primeiramente o desfecho clínico (taxa de gestação dos \nanimais (1) em cada um dos grupos de estudo  e taxa de aborto  dos animais (2) em cada um \ndos grupos de estudo ). Além disso,  como desfechos secundários, a mediana de placentas \ncoletadas por animal , a mediana de placentas coletadas por corno uterino  em cada um  dos \ngrupos de estudo  e a quantidade de placentas coletadas no corno esquerdo vers us o corno \ndireito. \nConsiderou-se o evento “aborto” quando foi identificada a presença de placenta \nhemorrágica sem feto. Sendo assim, foi considerada também  a mediana de placentas \nhemorrágicas por cornos uterino direito ou esquerdo. Além disso, a  quantidade de placentas \nhemorrágicas coletadas no corno esquerdo versus corno direito. \nA seguir é possível identificar como foi realizada cada uma das taxas consideradas no \nestudo: \nDesfecho clínico: \n1. Taxa de gestação=  \nn fêmeas grávidas\nn total de fêmeas do grupo  x 100  \n \n2. Taxa de aborto=  \nn fêmeas com pelo menos uma placenta hemorrágica\nn total de fêmeas grávidas do grupo  x 100 \n \n5.12. Cálculo amostral  \n \nO cálculo do N amostral foi feito utilizando -se a calculadora do site Sealed Envelope \n(https://www.sealedenvelope.com/power/binary-superiority/). Considerando a taxa de \ngestação como desfecho clínico principal com base em estudos anteriores do grupo de \npesquisa em que foi verificada uma taxa de gestação de 100% nos animais do grupo sham \n(aqui con siderados controle) e de 50% no grupo de endometriose induzida tratado com \nplacebo, para um poder de teste  (beta) de 8 0% e nível de significância  (alfa) de 5% , são \nnecessários 8 animais por grupo de estudo. \n \n \n \n \n \n39 \n\n5.13. Análise estatística \n \nOs dados foram analisados utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0. A  distribuição \ndas variáveis foi  avaliada usando-se o teste de Kolmogorov -Smimov para testar a \nnormalidade da amostra.  Para a comparação entre as taxas de gestação foi utilizado o teste \nExato de Fisc her. Já para as variáveis quantitativas (peso das fêmeas, média de placentas \ncoletadas saudáveis, hemorrágicas e totais tanto por corno uterino quanto por animal, área da \nplacenta total e por regiões) foi utilizado o teste de Kruskal -Wallis. Foi  considerado como \nsignificativo valores de p < 0,05.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n40 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. Resultados e Discussão \n \n \n41 \n\nEfeito da administração intrauterina de CXCL12 ou de células tronco mesenquimais nos \nresultados de gestação em camundongos com endometriose induzida \n \nSAWA, Aline Gonçalves; ROSA-E-SILVA, Ana Carolina Japur de Sá. \nDepartamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, \nUniversidade de São Paulo. \n \nResumo \nCamundongos C57BL/6 selvagens foram induzidos cirurgicamente à endometriose e sham. \nDepois de uma semana do tratamento de CXCL12, ou células estromais mensenquimais \n(CEM) ou placebo as fêmeas foram colocadas com machos férteis para acasalamento por até \n4 semanas . O tratamento com CXCL12 e CE M aumentou a taxa de gestação do grupo \nendometriose de 50% (EndoP l) para 100% (EndoCX e EndoCE M), igualando-se aos grupos  \nsham, que ta mbém obtiveram taxa de gestação de 100% em todos os  tratamentos (ShamCX, \nShamCEM, ShamPl).  Não houve diferença no tamanho da ninhada, nem na prevalência de  \naborto nos grupos  estudados. Além disso, também não houve diferença na análise \nhistomorfométrica r ealizada nas placentas , tanto na  área por camadas quanto em sua \ntotalidade. Na imunofluorescência  não foram identificadas CE M nos complexos placenta -\nendométrio decidualizado analisados. Dessa forma, pode-se aventar que a ação dessa s células \ntanto por si só, quanto por meio da ação q uimioatratora do CXCL12, pode estar relacionada a \nmecanismos moleculares indiretos. Entretanto, mais estudos são necessários para confirmação \ndos possíveis mecanismos de ação das CEM no incremento da fertilidade. \n \nIntrodução \nA endometriose é uma desordem crônica inflamatória dependente de estrogênio, caracterizada \npela presença de tecido endometrial glandular ou estromal fora da cavidade uterina 1. Ela não \npossui cura e seu tratamento em mulheres que possuem  desejo de concepção basicamente se \nresumem a utilização das  técnicas de reprodução assistida de baixa  e/ou alta \ncomplexidade2,3,4,5. Estima-se que 35 a 50% das mulheres com endometriose possuem \ninfertilidade como um sintoma associado à doença 6. Algumas relações causais diretas são \nmais facilmente encontradas para correlacionar essa situação , como alterações anatômicas na \nregião pélvica devido a aderências locais provocadas por focos ectópicos da d oença. Porém, \ntambém existem algumas relações indiretas ainda em estudos, pois seus mecanismos e vias de \nsinalização ainda não estão bem caracterizadas, como a implantação embrionária prejudicada \n \n \n42 \n\ndevido à baixa receptividade endometrial7,8,9.  \nEstudos relacionados à infertilidade e possíveis efeitos terapêuticos medicamentosos \nnormalmente são limitados ao uso de modelo animal experimental, devido às normas éticas de \npesquisas em seres humanos. Além disso, muitas vezes os tratamentos medicamentos os ainda \nnão estão aprovados para o uso em humano para esse fim, dificultando ainda mais os estudos \ndessa área em seres humano. Sendo assim, em sua maioria, os estudos acontecem no modelo \nmurino, como descrito nesse artigo. \nSugere-se que os focos ectópicos  da endometriose direcionam as células reparativas \nprovenientes da medula óssea para si, comprometendo o processo reparativo endometrial na \npresença de endometriose induzida cirurgicamente em camundongos, além de causar perda \nparcial da fertilidade nesses anima is devido à diminuição da receptividade \nendometrial10,11,12,13. Nesse sentido, o uso de células estromais mesenquimais (CEM) vem \nsendo empregado como alternativas terapêutica s em diversos tratamentos, como doenças \ncardíacas14 e neurológicas15. Portanto, o presente artigo pretende avaliar o efeito da \nadministração de CEM ou de CXCL12 (uma quimiocina de células tronco) em camundongos \nfêmeas com endometriose induzida com relação aos desfechos reprodutivos e avaliar o \npotencial destas terapias  como alternativa de tratamento a mulheres com endometriose e \ninfertilidade. Além d isso, este estudo avalia a distribuição na placenta e decídua de células \nestromais mesenquimais (GFP positivas) injetadas no útero pré-concepcional dos animais. \n \nMaterial e Métodos \nAnimais \nCamundongos (Mus musculus) selvagens da linhagem C57BL/6 com seis a oito semanas de \nvida foram utilizados no estudo, seguindo todos os protocolos aprovados pela Comissão de \nÉtica no Uso Animais da FMRP-USP. \n \nIsolamento de células estromais mesenquimais \nPara o isolamento das CEM foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6 \ntransgênicos (GFP positivos ; n  = 4) e foi seguido o protocolo descrito por Zhu e \ncolaboradores (2010) 16. Já para a fenotipagem das células foi realizada citometria de fluxo \n(BD FACsCanto) dos seguintes marcadores: SCA -1-PE, CD11b -PE, CD34 -PE, CD31 -PE e \nCD45-PE (todos BD -Pharmingen), além do controle ficoeritrina (PE, do inglês \nphycoerythrin). \n \n \n \n43 \n\nEndometriose e sham cirúrgico \nA indução de endometriose cirúrgica  (n = 18) ocorreu após analgesia com Meloxicam 0,2% \nna dosagem de 5 mg/kg via subcutânea e anestesia inalatória de Isofluorano (Virbac) 3,0% \nconcentração alveolar para induçã o inicial e de 1,5 a 2,0% do mesmo anestésico para \nmanutenção durante o procedimento cirúrgico. Inicialmente foi realizada a retirada dos cornos \nuterinos doadores (n = 18), lavados em PBS e divididos em dois fragmentos de 5 mm² cada. \nEm seguida, os fragmentos uterinos foram suturados ao peritônio parietal das fêmeas \nreceptoras simetricamente distribuídos dois de cada lado, com ponto único. Como controle, os \nanimais do grupo sham  (n = 18) receberam os mesmos quatro pontos de sutura peri toneal, \nporém sem o tecido endometrial.  \n \nTratamentos \nApós quatro semanas foram realizados os tratam entos: 1 x 10 6 CEM/animal e 2,5 µg/animal \nde CXCL12 e placebo (PBS), injetando 75  µL/corno diretamente em cada corno uterino das \nfêmeas. Sendo assim, foram formados seis grupos de estudo: endometriose + CXCL12 – \n(EndoCX; n = 6); endometriose + células estromais mesenquimais (EndoC EM; n = 6); \nendometriose + placebo (EndoPl; n = 6); sham + CXCL12 (ShamCX; n = 6); sham + células \nestromais mesenquimais (ShamCEM; n = 6) e sham + placebo (ShamPl; n = 6). \n \nAcasalamento com machos e gestação \nApós uma semana da injeção de um dos três tratamentos, as fêmeas foram expostas a machos \nférteis previamente testados para acasalamento por até 4 semanas. Fêmeas consideradas \ngrávidas (acima de 24 g) eram separadas e constantemente pesadas até atingirem \naproximadamente 2 8 a 30 g para a eutanásia e coleta dos complexos p lacenta-endométrio \ndecidualizado e um fragmento de corno uterino de região não adjacente à placenta. \n \nHistomorfometria dos complexos placenta-endométrio decidualizado. \nAs amostras do s complexos placenta -endométrio decidualizado foram fixadas em \nparaformaldeído 4% (Sigma) por até 24 h. Em seguida foi realizado processo de desidratação \ndo tecido, seguido de emblocamento em parafina e montagem dos cortes do tecido em \nlâminas silanizadas. Após isso, as lâminas foram desparafinizadas e reidratadas, em seguida \ncoradas com Hematoxilina por 40 seg, lavadas com água corrente e coradas novamente, agora \ncom Eosina por 10 seg. Finalmente, as lâminas foram desidratadas e montadas com auxílio de \nbálsamo de Canadá.  As lâminas prontas foram  lidas em microscópio  de varredura (VS120 \n \n \n44 \n\nScanner, Olympus Corporation) , a qual foi realizad o um escaneamento total da placenta em \naumento de 10X, para análises posteriores no software Image J. Foram analisadas a área total \nda placenta e a área das seguintes reg iões separadamente: decídua materna, zona juncional e \nlabirinto dos materiais coletados. \n \nImunofluorescência para GFP \nPara a imunofluorescência as lâminas com os cortes de tecido foram previamente desidratadas \ne emblocadas em parafina . Para a marca ção de Anti-GFP (1:1000; Abcam, refab66 73, San \nDiego, California, EUA), o material foi desparafinizado e reidratado. Após isso, foi realizado \nbanho em citrato de sódio (1 h, 60 ºC), seguido de banho em solução de metanol (10  min, -20 \nºC) e banho em solução de glicina (30  min, temperatura ambiente). Em seguida, as lâminas \nforam incubadas, no escuro, com soro de bloqueio 10% (BSA, 1  h, temperatura ambiente). \nDepois, o material foi incubado também no escuro com o anticorpo primário Anti-GFP \n(1:1000, overnight, 4 ºC). No dia seguinte, foi realizada a incubação  no escuro com anticorpo \nsecundário específico rabbit anti -goat IgG (1:1000; Abcam, refab150141, San Diego, \nCalifornia, EUA – 1 h, temperatura ambiente ). Depois as lâminas sofreram banho Sudan \nBlack (70% v/v em álcool etílico, Sigma) para bloqueio da autofluorescência  e então elas \nforam montadas no escuro com DAPI. \n \nDesfechos analisados \nForam analisados os desfechos clínicos: taxa de gestação dos animais em cada um dos grupos \nde estudo e taxa de aborto dos animais em cada um dos grupos de estudo.  Além disso, foram \nanalisados de sfechos secundários:  distribuição do peso das fêmeas grávidas, mediana de \nplacentas coletadas por animal em cada grupo, mediana de placentas coletadas por animal por \ncorno uterino (direito e esquerdo) em cada um dos grupos do estudo, quantidade de placentas \ncoletadas no corno esquerdo versus corno direito,  mediana de placentas hemorrágicas \ncoletadas por a nimal por c orno uterino (direito e esquerdo) e a quantidade de placentas \nhemorrágicas coletadas no corno esquerdo versus corno direito. \n \nAnálise estatística \nOs dados foram analisados utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0. A  distribuição das \nvariáveis foi  avaliada quanto a normalidade pelo teste de Kolmogorov -Smimov. Para a \ncomparação entre as taxas de gestação foi utilizado o teste Exato de Fischer. E para as \nvariáveis quantitativas (peso das fêmeas, média de placentas coletadas saudáveis, \n \n \n45 \n\nhemorrágicas e totais tanto por corno uterino quanto por animal, área da placenta total e por \nregiões) foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis. Foi considerado como significativo valores de \np < 0,05.  \n \nResultados \nFenotipagem celular \nNa análise de  citometria de fluxo  foram analisados  os seguintes marcadores de superfície \ncelular: SCA-1 (Antígeno de Célula Tronco 1) , CD11b (marcador de células imunes) , CD34, \nCD31 e CD45 (marcadores de células hematopoiéticas). Foi obtido um total de 5 mil eventos \ne foi observado que as células utilizadas são 99,9% positivas para SCA -1 e 99,2%, 99,2%, \n100% e 99,5% não marcadas para os respectivos marcadores: CD11b , CD34, CD31 e CD45 . \nPortanto, essas características sugerem que as células utilizadas são células estromais \nmesenquimais com quase 100% de pureza. \n \n \nFigura 6. Fenotipagem da população de células estromais mesenquimais isoladas, cultivadas e \ninjetadas nos animais dos grupos CEM. \nLegenda: Marcação das CEMs utilizadas por citometria de fluxo. A) Marcação com SCA -1, B) \nMarcação com CD11b, C) Marcação com CD34, D) Marcação com CD31, E) Marcação com CD45. \nA B C \nD E \n \n \n46 \n\nDesfechos clínicos \nA taxa de gestação em todos os  grupos sham foi de 100%,  sendo eles: ShamC EM (6/6), \nShamCX (6/6) e ShamPl (6/6). Já no  grupo endometriose, o grupo que recebeu placebo teve \numa taxa de gestação de 50% (3/6), enquanto que os grupos tratados com CX (6/6) e com \nCEM (6/6) tiveram ambos taxas de gestação de 100% (p=0,0168), igualando -se aos grupos \nsham (Figura 7). \n \nFigura 7. Gráfico das taxas de gestação por grupo do estudo. \nLegenda: EndoCEM (endometriose induzida tratado com células estromais mesenquimais), EndoCX \n(endometriose induzida tratado com CXCL12), EndoPl (endometriose induzida tratado com placebo), \nShamCEM (sham tratado com células estromais mesenquimais), ShamCX (sham tratado com \nCXCL12) e Sha mPl (sham tratado com placebo). L etras diferentes representam diferenças (p<0,05). \nEntende-se por taxa de gestação a porcentagem de fêmeas que ficaram grávidas em relação ao total de \nfêmeas de cada grupo. \n  \nDistribuição de peso das fêmeas grávidas \nEm relação ao peso das fêmeas no momento da cesárea para a coleta dos complexos placenta-\nendométrio decidualizado foi observada uma diferença estatística entre os grupos EndoC EM, \nEndoCX, EndoPl e ShamC EM em relação aos grupos ShamCX e ShamPl. Sendo que os \núltimos apresentaram maior  peso quando comparados  aos d emais grupos do estudo (Figura \n8). \n \n0\n20\n40\n60\n80\n100\n120\nTaxa gestação\np = 0,0168\n \n \n47 \n\n \n \nFigura 8. Distribuição de peso das fêmeas grávidas no momento da cesárea. \nLegenda: EndoCEM (endometriose induzida tratado com células estromais mesenquimais), EndoCX \n(endometriose induzida tratado com CXCL12), EndoPl (endometriose induzida tratado com placebo), \nShamCEM (sham tratado com células estromais mesenquimais), ShamCX (sham tratado com \nCXCL12) e ShamPl (sham tratado com placebo). Letras diferentes representam diferenças (p<0,05).  \n \nAnálise dos complexos placenta-endométrio decidualizado \nForam coletadas todas as placentas com desenvolvimento normal e placentas hemorrágicas. \nEstas foram consider adas resquícios de placentas inicialmente formadas, mas que não \ncontinuaram seu desenvolvimento normalmente, sendo assim, não estavam completamente \ndesenvolvidas e não apresentavam fetos (Figura 9 .B). Neste caso, foi considerado que um \naborto ocorreu. \n \n \n \n \n \nPeso (g) \n \n \n48 \n\n \nFigura 9. Representação do processo de coleta dos complexos placenta-endométrio decidualizado. \nLegenda: A e B) Cornos uterinos com conjunto placenta/feto em seu interior, B) Placenta hemorrágica \nindicada pela seta. C) Conjuntos placenta/feto separados para coleta das amostras, envoltos pela bolsa \namniótica. D) Conjuntos placenta/feto evidenciando o cordão umbilical indicado pela seta. E) \nComplexo placenta-endométrio decidualizado subjacente  (seta superior) e cordão umbilical (seta \ninferior) coletados após eutanásia. \n \nEm relação a o número  de placentas saudáveis, hemorrágicas e totais  coletadas das fêmeas \ngrávidas de a mbos os grupos (endometriose e sham) e tratamentos (CXCL12, Células  \nEstromais Mesenquimais ou Placebo) não foi observada nenhuma diferença  estatística \n(Tabela 2 ). Curiosamente foi observado um maior número de placentas no corno direito \nquando comparado ao corno esquerdo,  em média foram coletadas 1,26 placentas a mais no \ncorno direito em relação ao esquerdo (p= 0,0092). \nNão houve diferença na prevalência de abortos entre os grupos no geral e tampouco na \navaliação por cornos separadamente (Tabela 2). \n \nA B \nC D E \n \n \n49 \n\nTabela 2 – Quantidade de placentas coletadas por corno uterino e totais. \nVariável Parâmetro EndoCEM EndoCX EndoPl ShamCEM ShamCX ShamPl p-value \n Mediana 4,0 3,5 4,0 4,0 3,5 4,0  \n0,8134 PL-CE Mínimo 3,0 1,0 2,0 1,0 1,0 3,0 \n Máximo 6,0 4,0 6,0 4,0 7,0 5,0 \n Mediana 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0  \n. \n0,4524 PLH-CE Mínimo 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 \n Máximo 1,0 2,0 1,0 0,0 2,0 1,0 \n Mediana 5,0 4,0 5,0 5,0 4,5 5,5  \n. \n0,1716 PL-CD Mínimo 4,0 2,0 2,0 5,0 2,0 4,0 \n Máximo 6,0 5,0 6,0 7,0 7,0 7,0 \n Mediana 0,0 1,0 0,0 0,0 0,0 0,5  \n. \n0,0812 PLH-CD Mínimo 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 \n Máximo 1,0 3,0 1,0 0,0 2,0 1,0 \n Mediana 9,0 8,0 9,0 9,0 9,0 10,0  \n. \n0,0812 PL-T Mínimo 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 \n Máximo 10,0 11,0 10,0 9,0 10,0 11,0 \nLegenda: temos que PL -CE (placentas saudáveis coletadas no corno esquerdo), PLH -CE (placentas \nhemorrágicas coletadas no corno esquerdo), PL -CD (placentas saudáveis coletadas no corno direito), \nPLH-CD (placentas hemorrágicas coletadas no corno direito) e PL -T (placentas totais – somatório de \nsaudáveis e hemorrágicas – coletadas em ambos os cornos direito e esquerdo). \n \nAnálise histomorfométrica de placenta \nPara as análises morfológicas e morfométricas foram analisadas: área de placenta total e área \ndas camadas placentárias separadamente  (decídua materna, zona juncional e labirinto ) das \nimagens previamente escaneadas em aumento de 10X. Não foi encontrada nenhuma diferença \nsignificativa histomorfométrica dos parâmetros analisados entre os grupos do estudo (p > \n0,05). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n50 \n\n \nFigura 10. Análise histomorfométrica das placentas por meio da coloração HE. \nLegenda: A) Visão global da placenta e divisão nas regiões analisadas: 1 – região uterina materna, 2 -  \nregião da decídua materna, 3 – região da zona juncional, 4 – região do labirinto. B) Região da decídua \nmaterna evidenciando os vasos maternos  em aumento de 10 X. C) R egião da zona juncional \nevidenciando a s células trofoblásticas gigantes parietais  (*) e espongiotrofoblastos  em aumento de \n10X. D) Região do labirinto evidenciando a rica vascularização local em aumento de 10X. \n \nImunofluorescência Anti-GFP de células estromais mesenquimais \nAs imagens foram analisadas após escaneamento total do s complexos placenta -endométrio \ndecidualizado em aumento de 40X. No controle positivo (corno uterino de uma fê mea \nC57BL/6 transgênica GFP positiva) é possível observar a marcação do Anti -GFP e do DAPI. \nNo controle negat ivo (material place ntário coletado sem a ação do anticorpo  primário Anti-\nGFP) é possível observar apenas a marcação do DAPI, sem marcação do Anti -GFP. Já nos \ngrupos tratados com células estromais mesenquimais, tanto endometriose quanto sham, não \nfoi possível encontrar marcação de Anti-GFP como demonstrado na Figura 11. \n1 \n2 \n3 \n4 \nA B \nC \nD \n* \n \n \n51 \n500 μm \n25 μm \n25 μm \n25 μm \n\n \n \nFigura 11. Marcação para GFP por imunofluorescência no complexo placenta -endométrio \ndecidualizado nos grupos que receberam a injeção das CEMs. \nLegenda: Análise das lâminas de imunohistoquímica dos grupos tratados com células estromais \nmesenquimais GFP positivas. A) Controle negativo (placenta) apenas com coloração DAPI e ausência \nde marcação com Anti -GFP. B) Controle posi tivo (corno uterino proveniente de fêmea transgênica - \nGFP positiva) com marcação do Anti-GFP. C) Células marcadas com Anti-GFP em aumento de 40X. \nD) Placenta do grupo Endometriose + células estromais mesenquimais apenas com coloração DAPI e \nausência de marcação Anti -GFP. E) Células marcadas do respectivo grupo (EndoC EM) em aumento \nde 40X. F) Placenta do grupo Sham + célul as estromais mesenquimais apenas com coloração DAPI e \nausência de marcação Anti -GFP. E) Células marcadas do respectivo grupo (ShamC EM) em aumento \nde 40X. \n \nA B \nC \nD \nE \nF \nE \n G \n \n \n52 \n500 μm 25 μm \n25 μm 25 μm \n\nDiscussão \nNeste estudo pudemos inicialmente confirmar achados de estudos prévios do grupo em que a \nindução de endometriose em camundongos fêmeas de acordo com a técnica descrita \ncompromete a fertilidade destes animais, reduzindo de 100% para 50% a taxa de gestação. \nTambém ficou demonstrado neste estudo que o uso de células estromais mesenquimais \n(CEM) e  também da quimiocina  CXCL12, administrados separadamente, promoveu a \nrecuperação da fertilidade dos animais estudados . Além disso, não foram encontradas \ndiferenças no ta manho de ninhada (baseado pelo númer o de placentas saudáveis ) tanto por \nanimal quanto comparado por corno uterino, nem diferença na prevalência de aborto (baseada \npelo número de placentas hemorrágicas ) tanto por animal quanto por corno uterino.  O \nmecanismo exato pelo qual as terapias agiram na melhora dos desfechos reprodutivos ainda \nnão está claro. \nSabe-se que a s células estromais mesenquimais possuem diferentes efeitos diante dos \ndiferentes tipos celulares, incluindo a imunidade inata e adaptativa. Estudos sugerem que as \ncélulas mesenquimais ocasionam alterações anti -inflamatórias, como reduzir ativação e \ncitotoxicidade das células NK e células T reguladoras, por exemplo. Sendo assim, são células \npotencialmente promissoras no tratamento de doenças inflamatórias, como a endometriose17. \nEssas células  contribuem com a homeostase tecidual, estando relacionadas com o processo \nreparativo de diversos tecidos, como do endométrio feminino, por exemplo 18,19. Estudos \nanteriores levantaram a hipótese de existir uma menor migração de células estromais \nprovenientes da medula óssea para o endométrio tópico a fim de auxiliar no processo \nreparativo cíclico endometrial na presença da endometriose, já que essas células poderiam ser \natraídas pelos focos ectópicos da doença 10,11,20. Nesse sentido, pessoas com endometriose e  \nconsequente reduzida capacidade de atrair células de reparo para o endométrio poderiam \napresentar menor capacidade desse tecido em expressar moléculas básicas para a o processo \nde implantação embrionária, atuando então como um possível mecanismo indireto de \ninfertilidade ligado à endometriose12,21.  \nNesse sentido, sabendo -se que as células estromais mesenquimais possuem propriedades \ncomo alto potencial de diferenciação, capacidade imunorreguladora e de migração in vivo \npara locais lesados 18,22. Sendo assim,  elas tornam-se potencialmente candidatas ao uso como \nterapêutica na reparação de diversos danos teciduais e doenças, como doenças cardíacas 23, \nneurológicas24, inflamatórias25 e mais recentemente para tratamento de pac ientes de COVID-\n19 severa26,27. Além dis so, as C EM são amplamente estudadas para o tratamento no sistema \nreprodutor feminino, melhorando a  fertilidade28,29,30,31, atuando na regene ração endometrial \n \n \n53 \n\nrelacionada ao incremento na receptividade endometrial 32,33 de endom étrio fino 34,35 e de \nendométrio com injúria s, como a Síndrome de Asherman 36,37, por exemplo . Esses achados \ndevem-se principalmente pela atuação das células estromais mesenquimais, assim como \noutras populações celulares que estão envolvidas no processo de angiogênese e regeneração  \nendometrial, por meio de recomposição de vasos, glândulas e estroma10,13,38,39. \nSendo assim, nossos achados tanto por meio do uso C EM diretamente quanto intermediada \npelo uso do CXCL12, um quimioatrator de células tronc o/estromais sistêmicas20 para o local \nde administração, podem ter mediado os efeitos de incremento nos desfechos clínicos \nencontrados, ass im como alguns dos achados citados anteriormente.  Não foi possível \nidentificar um efeito direto dos  tratamentos testados neste estudo sobre a  anatomia das \nestruturas endometriais e placentárias, uma vez que não houve diferença histomorfométrica de \nárea total, além de áreas por regiões placentárias (decídua materna, zona juncional e labirinto) \nanalisadas. Além disso, também não foram encontradas células marcadas positivamente para \nAnti-GFP na imunofluorescência do complexos placenta-endométrio decidualizado de ambos \nos grupos tratados com C EM (endometriose e sham). Portanto, provavelmente as C EM \ninjetadas diretamente no útero ou endógenas, atraídas pela quimiocina, não têm um papel \nestrutural na composição da placenta, pr ovavelmente atuando  indiretamente por meio da \nsecreção de substâncias que favoreçam a receptividade endometrial.  \nEstudos demonstram que mulheres com endometriose possuem a morfologia d as células \nlúteas alteradas, diminuindo então a produção de progesteron a, um importante fator na \nreceptividade endometrial 40. Estudos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa \ndemonstraram que o uso do CXCL12 restaurou a expressão de receptores de progesterona no \nendométrio de  camundongos induzidos a endometriose, além do au mento na expressão de \nαVβ3 integrina outro importante fator favorável a receptividade endometrial 41. Este fato está \nem consonância com os achados na literatura, indicando que o uso de CXCL12 tem papel na \nmelhora da receptividade endometrial42,43,44 e angiogênese local45.  \nOutro potencial mecanismo de ação indireto das células estromais mesenquimais é a \npromoção de processos angiogênicos  (secreção de VEGFs e Prostaglandinas) 46,47,48,49, \ndecidualização intrauterina 50 mediada pelas células estromais endom etriais51, reparação \ntecidual52,53,54 e prevenção de apoptose 55, que podem ocorrer tanto diretamente pela ação das \nCEM como pelos exossomos altamente produzidos e liberados pelas mesma s, possuindo \npropriedades e ações muito semelhantes56. \nSendo assim , acreditamos que a ação benéfica no incremento dos desfechos reprodutivos \nencontrados tanto pela ação diretamente das C EMs, quanto pela ação ind ireta das mesmas \n \n \n54 \n \n \n54 \n\ncélulas endógenas atraídas pelo uso da quimiocina  CXCL12, ocorreu por meio de \nmecanismos moleculares indiretos. Uma hipótese seria a promoção da expressão de moléculas \ne/ou fatores de crescimento que favoreçam a implantação embrionária. Porém, mais estudos \navaliando-se marcadores ligados ao processo de implantação e placentação são necessários \npara confirmação desta hipótese.  Ademais, temos que independente do mecanismo de ação  \ndessas células , estes achados clínicos abrem um leque de  novas possibilidades terapêuticas  \npouco-invasivas para pacientes com endometriose associada a infertilidade. \n \nReferências \n1. Giudice, L.C.; Kao, L.C. Endometriosis. The Lancet. v. 364, n. 9447, p. 1789-1799, 2004. \n2. Tomassetti, C.; D’Hooghe, T. Endometriosis and infertility: insights into the causal link \nand management strategies. Best. Pract. Res. Clin. Obstet. v. 51, p. 25-33, 2018. \n3. Makuch, M. et al. Barriers to access to infertility care and assisted reproductiv e technology \nwithin the public health sector in Brazil. FVV Ob. Gyn. v. 4, n. 4, p.221-226, 2012. \n4. Makuch, M. et al. Inequitable acess to assisted reproductive technology for the low -income \nBrazilian population: a qualitative study. Hum. Reprod. v. 26, n. 8, p. 2054-2060, 2011. \n5. Makuch, M. et al. Low priority level for infertility services within the public health sector: \na Brazilian case study. Hum. Reprod. v. 25, p. 430-435, 2010. \n6. ASRM. American Society for Reproductive Medicine. Endometriosis and infertility: a \ncommittee opinion. Fertil. Steril. v. 98, n. 3, p. 591-598, 2012. \n7. Miller, J.E. et al.  Implications of imune dysfunction on endometriosis associated infertility. \nOncotarget. v. 8, n. 4, p. 7138-7147, 2017. \n8. Bulletti, C. et al. Endometriosis and infertility. J. Assist. Reprod. Genet. v. 27, n. 8, p. 441 -\n447, 2010. \n9. Filip, L. et al. Endometriosis associated infertility: a critical review and analysis on \netiopathogenesis and therapeutic approaches. Medicina, v. 56, n. 460, p. 1-23, 2020. \n10. Pluchino, N.; Taylor, H.S. Endometriosis and stem cell trafficking. Reprod. Sci. v. 23, n. \n12, p. 1616-1619, 2016. \n11. Sakr, S. et al. Endometriosis impairs boné marrow -derived stem cell recruitment to the \nuterus whereas bazedoxifene treatment leads to endometriosis regression and improved \nuterine stem cell engrafment. Endocrinology. v. 155, n. 4, p. 1489-1497, 2014. \n12. Rosa-e-Silva, A.C.J.S. et al. Dose-dependent decreased fertility in response to the burden \nof endometriosis in a murine model. Reprod. Sci. 2019. \n13. Zhao, J. et al. Uterine infusion with bone marrow mesenchymal stem cells improves \nendometrium thickness in a rat modelo of thin endometrium. Reprod. Sci. v. 22, n. 2, p. 181 -\n188, 2015. \n14. Yu, G. et al. The therapeutic potencial of mesenchymal stem cells for cardiovascular \ndiseases. Cell Death Dis. v. 11, n. 349, 2020. \n15. Andrzejewska, A. et al. Mesenchymal st em cells for neurological disorders. Adv. Sci. v. \n8, n. 7, 2021. \n16. Zhu, H. et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse \ncompact bone. Nature, v. 5, n. 3, p. 550-560. 2010. \n17. Castro-Manrreza, M. E.; Montesinos, J. J. Immunoregulation by mesenchymal stem cells: \nbiological aspects and clinical applications. J. Immunol. Res. 2015. \n18. Du, H.; Taylor, H.S. Contribution of bone marrow -derived stem cells to endometrium and \nendometriosis. Stem Cells. v. 25, n. 8, p. 2028-2026, 2007. \n \n \n55 \n \n \n55 \n\n19. Tal, R. et al. A murine 5-fluorouracel-based submyeloablation model for the study of bone \nmarrow-devided cell trafficking in reproduction. Endocrinology. v. 157, n. 10, p. 3749 -3759, \n2016. \n20. Wang, X. et al. Chemoattraction of bone marrow -derived stem cells towards human \nendometrial stromal cells is mediated by estradiol regulated CXCL12 and CXCR4 expression. \nStem Cell Res. v. 15, n. 1, p. 14-22, 2015. \n21. Hufnagel, D. et al. The role of stem  cells in the etiology and pathophysiology of \nendometriosis. Semin. Reprod. Med. v. 33, n. 5, p. 333-340, 2015. \n22. Brown, C. et al. Mesenchymal stem cells: cell therapy and regeneration potential. J. \nTissue Eng. Regen. Med. v. 13, n. 9, 2019. \n23. Miao, C. et al. A brief review: the therapeutic potencial of bone marrow mesenchymal \nstem cells in myocardial infarction. Stem Cell Res. Ther. v. 8, n. 242, 2017. \n24. Uccelli, A. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other \nneurological diseases. Lancet Neurol. v. 10, n. 7, p. 649-656, 2011. \n25. Regmi, S. et  al. Mesenchymal stem cell therapy for the treatment of inflammatory \ndiseases: challenges, opportunities, and future perspectives. v. 98, 2019. \n26. Golchin, A. et al. Mesenchymal stem cell therapy for COVID -19: present or future. Stem \ncell rev. v. 16, p. 427-433, 2020. \n27. Rajarshi, K. et al. Combating COVID -19 with mesenchymal stem cell therapy. \nBiotechnol. Rep. v. 26, 2020. \n28. Rungsiwiwut, R. et al. Mesenchymal stem cells for restoring endometrial function: an \ninfertility perspective. Reprod. Med. Biol. 2020. \n29. Zhao, Y. Using mesenchymal stem cells to treat female infertility: an update on female \nreproductive diseases. Stem Cells Int. 2019. \n30. Chang, Z. et al. Mesenchymal stem cells in preclinical infertility cytotherapy: a \nretrospective review. Stem Cells Int. 2021. \n31. Gao, M. et al. Mesenchymal stem cells therapy: a promising method for the treatment of \nuterine scars ans premature ovarian failure. Tissue. Cell. v. 74, 2022. \n32. Esmaeilzadeh, S. et al. Receptivity markers in endometrial mesenchymal stem cells of \nrecurrent implantation failure and non -recurrent implantation failure women: a pilot study. J. \nObstet. Gynaecol. Res. v. 46, n. 8, p. 1393-1402, 2020. \n33. Wang, G. et al. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on repair and receptivity \nof damaged endometrium in rats. J. Obstet. Gynaecol. Res. v. 47, n. 9, p. 3223-3231, 2021. \n34. Sapozhak, L. M. et al. Application of autologous endometrial mesenchymal stromal/stem \ncells increases thin endometrium receptivity: a case report. J. Med. Case Rep. v. 14, n. 190, \n2020. \n35. Tersoglio, A. E. et al. Regenerative therapy by endometrial mesenchymal stem cells in \nthin endometrium with repeat implantation failure. A novel strategy. JBRA Assist. Reprod. v. \n24, n. 2, p. 118-127, 2020. \n36. Zhu, X. et al. Stem cells ans endometrial regenerative: from basic research to clinical trial. \nCurr. Stem Cell Res. Ther. v. 14, p. 293-304, 2019. \n37. Strug, M.; Aghajanova, L. Making more womb: clinical perspectives supporting the \ndevelopment and utilization of mesenchymal stem cell therapy for endometrial regeneration \nand infertility. J. Pers. Med. v. 11, n. 1364, 2021.  \n38. Mints, M. et al. Endometria l endotelial cells are derived from donor stem cells in a bone \nmarrow transplant recipiente. Hum. Reprod. v. 23, n. 1, p. 139-143, 2008. \n39. Gargett, C. E. et al. Endometrial regeneration and endometrial stem/progenitor cells. Rev. \nEndocr. Metab. Disord. v. 13, n. 4, p. 235-251, 2012.  \n40. Cunha-Filho, J.S. et al. Physiopathological aspects of corpus luteum defect. In infertile \npatients with mild/minimal endometriosis. J. Assist. Reprod. Genet. v. 20, p. 117-121, 2003. \n \n \n56 \n\n41. Rosa-e-Silva, A.C.J.S. et al. Uter ine administration of CXCL12 increases pregnancy rates \nin mice with induced endometriosis. F&S Science. 2022. \n42. Yi, K.W. et  al. Bone marrow -derived cells or C -X-C motif chemokine 12 (CXCL12) \ntreatment improve thin endometrium in mouse model. Biol. Reprod. v. 100, n. 1, 2019. \n43. Zlotkowska, A.; Andronowska, A. Chemokines as the modulators of endometrial epitelial \ncells remodelling. Sci. Rep. v. 9, n. 12968, 2019. \n44. Mclntosh, S.Z. et al. CXCR4 signaling at the fetal – maternal interface may drive \ninflammation and syncytia formation during ovine pregnancy. Biol. Rep. v. 104, n. 2, 2021. \n45. Koo, H.S. et al. CXCL12 enhances preg nancy outcome via improvement of endometrial \nreceptivity in mice. Sci. Rep. v. 11, n. 7397, 2021. \n46. Kasper, G. et al. Mesenchymal stem cells regulate angiogenesis according to their \nmechanical environment. Stem Cells. v. 25, n. 4, 2007. \n47. Bronckaers, A . Mesenchymal stem/stromal cells as a pharcological and therapeutic \napproach to accelerate angiogenesis. Pharmacol. Ther. v. 143, n. 2, 2014. \n48. Kwon, H.M. Multiple paracrine factors secreted by mesenchymal stem cells contribute to \nangiogenesis. Vasc. Pharacol. v. 63, n. 1, 2014. \n49. Tao, H. et  al. Proangiogenic features of mesenchymal stem cells and their therapeutic \napplications. Stem Cells Int. 2016. \n50. Nafeesa, A.; Reshef, T. Endometrial stem cells: origin, biological function, and \ntherapeutic applications for reproductive disorders. Curr. Opin. Obstet. v. 33, n. 3, 2021. \n51.Xiaofang, K.; Hongcheng, Z. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) enhance \nendometrial stromal cell migration and epitelial -mesenchymal transition in adenomyosis \nthrough upregulation of neuropilin 1. J. Biomater. Tissue Eng. v. 12, n. 2, 2022. \n52. Fu, X. et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. v. 8, n. 8, 2019. \n53. Gnecchi, M. et al. Paracrine mechanisms of mesenchymal stem cells in tissue repair. \nMethods Mol. Biol. P. 123-146, 2016. \n54. Yang, J. et al. Role of TGF -β3 and boné marrow mesenchymal stem cells on regeneration \nof myometrial injury in rats. Sciences. v. 15, n. 4, 2022. \n55. Kot, M. et al. Secretion, migration and adhesion as key process in the therapeutic activity \nof mesenchymal stem cells. Acta. Biochim. Pol. v. 66, n. 4, p. 499-507, 2019. \n56. Merino -Gonzalez, C. Mesenchymal stem cell -derived extracelular vesicles promote \nangiogenesis: potencial clinical application. Front. Physiol. v. 09, 2016. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n57 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7. Conclusão \n \n \n58 \n\nO tratamento com células estromais mesenquimais e com CXCL12 isola damente, \npromoveram aumento das taxas de gestação em camundongos fêmeas com endometriose \ninduzida, igualando-as aos animais do grupo sham.  \nTambém não foi verificada a presença de células GFP+, ou seja, de C EMs nas placentas \nou no leito placentário nos animais que receberam injeção destas células pré -concepcionais, \nsugerindo que o beneficio em termos reprodutivos foi secundário a não por meio de uma \nparticipação direta destas células na composição da estrutura placentária ou decidual. \nDesta forma, acreditamos que a melhora nas taxas de gestação ocorrida tanto pela injeção \ndo CXCL12 como das C EMs nos cornos uterinos deva estar relacionada a mecanismos \nmoleculares indiretos, por meio da promoção da expressão de mol éculas e/ou fatores de \ncrescimento que favoreçam a implantação embrionária. Entretanto, mais estudos são \nnecessários, avaliando-se marcadores ligados ao processo de implantação e placentação para \nconfirmação desta hipótese. \nIndependente do mecanismo de açã o, estes achados  clínicos abrem um leque de  novas \npossibilidades terapêuticas para pacientes com endometriose associada a infertilidade. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n59 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nREFERÊNCIAS \n \n \n60 \n\nAchache, H.; Revel, A. Endometrial receptivity markers, the journey to sucessful embryo \nimplantation. Human. Reprod. Up. v. 12, n. 6, p, 731-746, 2006. \n \nASRM. American Society for Reproductive Medicine.  Endometriosis and infertility: a \ncommittee opinion. Fertil. Steril. v. 98, n. 3, p. 591-598, 2012. \n \nBaddoo, M. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow \nby negative selection. J. Biol. Chem. v. 89, n. 6, p. 1235-1249, 2003. \n \nBastian, C. et al. Isolation, selection and culture methods to enhance clonogenicity of mouse \nbone marrow derived mesenchymal stromal cell precursors. Stem Cell Res. Ther. v. 6, n. 151, \n2015. \n \nBastu, E. et al. Role of Mucin 1 and Glycodelin A in recurr ent implantation failure. Fertil. \nSteril. v. 103, n. 4, p. 1059-1064, 2015.  \n \nBazoobandi, S. et al. Preventive effects of intrauterine injection of bone marrow -derived \nmesenchymal stromal cell -conditioned media on uterine fibrosis immediately after \nendometrial curettage in rabbit. Stem Cells Int. 2020. \n \nBudiu, R.A. et al.  A conditional mouse model for human MUC1 -positive endometriosis \nshows the presence of anti -MUC1 antibodies and Foxp3+ regulatory T cells. Dis. Model. \nMech. v. 2, n. 11-12, p. 593-603. 2009. \n \nBufang, X. et al. Pinopodes, leukemia inhibitory fator, integrin -β3, and mucin-1 expression in \nthe peri -implantation endometrium of women with unexplained recurrent pregnancy loss. \nFertil. Steril. v. 98, n. 2, p. 389-395, 2012. \n \nBulletti, C. et al. Endometriosis and infertility. J. Assist. Reprod. Genet. v. 27, n. 8, p . 441-\n447, 2010. \n \nCastro-Manrreza, M.E.; Montesinos, J.J. Immunoregulation by mesenchymal stem cells: \nbiological and clinical applications. J. Immunol. 2015.   \n \nChan, J. et al. Widespread distribution and muscle differentiation of human fetal \nmeshenchymal stem cells after intrauterine transplantation in dystrophic mdx mouse. Stem \nCells. v. 25, n. 4 p. 875-884, 2007. \n \nCezar, M.; Freitas, G. Endometriose minima e técnicas de reprodução assistida: uma revisão. \nReprod. Clim. v. 24, n. 3, p. 100-106, 2009.  \n \nDu, H.; Taylor, H.S. Contribution of bone marrow -derived stem cells to endometrium and \nendometriosis. Stem Cells. v. 25, n. 8, p. 2028-2026, 2007. \n \nEzquer, F.E. et al. Systemic administration of multipotent mesenchymal stromal cells reverts \nhypoglycemia an d prevents nephropathy in type 1 diabetic mice. Biol. Blood Marrow \nTransplant. v. 14, n. 6, p. 631-640, 2008. \n \nFilip, L. et al. Endometriosis associated infertility: a critical review and analysis on \netiopathogenesis and therapeutic approaches. Medicina, v. 56, n. 460, p. 1-23, 2020. \n \n \n61 \n\n \nFox, C. et al. Local and systemic factors and implantation: what is the evidence? Fertil. Steril. \nv. 105, n. 4, p. 873-884, 2016. \n \nGargett, C.E. et al. Endometrial regeneration and endometrial stem/progenitor cells. Re v. \nEndocr. Metab. Disord. v. 13, n. 4, p. 235-251, 2012. \n \nGiudice, L.C.; Kao, L.C. Endometriosis. The Lancet. v. 364, n. 9447, p. 1789-1799, 2004. \n \nGiudice, L.C. et al. The molecular basis for implantation failure in endometriosis: on the road \nto Discovery. Ann. N. Y. Acad. Sci. v. 955, p. 252-264, 2002. \n \nGuillot, P.V. et al. Intrauterine transplantation of human fetal mesenchymal stem cells from \nfirst-trimester blood repairs bone and reduces fracture in osteogenesis imperfecta mice. Blood. \nv. 111, n. 3, p. 1717-1725, 2008. \n \nHogg, S.; Vyas, S. Endometriosis. Obstet. Gynaecol. Reprod. Med. v. 25, n. 5, p. 133 -141, \n2015. \n \nHufnagel, D. et al. The role of stem cells in the et iology and pathophysiology of \nendometriosis. Semin. Reprod. Med. v. 33, n. 5, p. 333-340, 2015. \n \nJabeen, S. et al. Isolation and dentification of murine mesenchymal stem cells from bone \nmarrow. Int. J. Endorsing health Sci. Res. v. 10, n. 2, p. 150-156, 2022. \n \nKitawaki, J. et al. Endometriosis: the pathophysiology as na estrogen -dependent disease. J. \nSteroid. Biochem. Mol. Biol. v. 83, n. 1-5, p. 149-155, 2003. \n \nKoo, H.S. et al. Embryo -derived chemokine CXCL12 enhance pregnancy outcome via \nimprovement of endometrial receptivity. Sci. Rep. v. 11, n. 1, 2021. \n \nLeonardi, M. et al. When to do surgery and when not to do surgery for endometriosis: a \nsystematic review and meta -analysis. J. Minim. Invasive Gynecol. v. 27, n. 2, p. 390 -407, \n2020. \n \nLindner, U. et al. Mesenchymal stem ou stromal cells: toward a better un derstanting of their \nbiology? Transfus. Med. Hemother. v. 37, n. 2, p. 75-83, 2010. \n \nMakuch, M. et al. Barriers to access to infertility care and assisted reproductive technology \nwithin the public health sector in Brazil. FVV Ob. Gyn. v. 4, n. 4, p.221-226, 2012. \n \nMakuch, M. et al. Inequitable acess to assisted reproductive technology for the low -income \nBrazilian population: a qualitative study. Hum. Reprod. v. 26, n. 8, p. 2054-2060, 2011. \n \nMakuch, M. et al. Low priority level for infertility services with in the public health sector: a \nBrazilian case study. Hum. Reprod. v. 25, p. 430-435, 2010. \n \nMiller, J.E. et al.   Implications of imune dysfunction on endometriosis associated infertility. \nOncotarget. v. 8, n. 4, p. 7138-7147, 2017. \n \n \n \n62 \n\nMints, M. et al. Endometrial endotelial cells are derived from donor stem cells in a bone \nmarrow transplant recipient. Hum. Reprod. v. 23, n. 1, p. 139-143, 2008. \n \nMoridi, I. et al. Bone marrow stem cell chemotactic activity is induced by elevated CXCL12 \nin endometriosis. Reprod. Sci. v. 24, n. 4, p. 526-533, 2017. \n \nNácul, A.; Spritzer, P. Current aspects on diagnosis and treatment of endometriosis. Rev. \nBras. Ginecol. Obstet. v. 32, n. 6, p. 298-307. \n \nNombela-Arrieta, C et al. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. \nRev. Mol. Cell. Biol. v. 12, n. 2, p. 126-131, 2011.  \n \nOjosnegros, S. et al. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. \nHum. Reprod. v. 27, n. 3, p. 501-530, 2021. \n \nPittenger, M. F. et al. Multilineage potencial of adult human mesenchymal stem cells. \nScience, v. 284, n. 5411, p. 143-147, 1999. \n \nPluchino, N.; Taylor, H.S. Endometriosis and stem cell trafficking. Reprod. Sci. v. 23, n. 12, \np. 1616-1619, 2016. \n \nRosa-e-Silva, A.C.J.S. et al. Uterine administration of CXCL12 increases pregnancy rates in \nmice with induced endometriosis. F&S Science. 2022. \n \nRosa-e-Silva, A.C.J.S. et al. Dose-dependent decreased fertility in response to the burden of \nendometriosis in a murine model. Reprod. Sci. 2019. \n \nSakr, S. et al. Endometriosis impairs bone marrow -derived stem cell recruitment to the uterus \nwhereas bazedoxifene treatment leads to endometriosis regression and improved uterine stem \ncell engraftment. Endocrinology. v. 155, n. 4, p. 1489-1497, 2014. \n \nSampson, J.A. Metastatic or embolic endometriosis, due to the menstrual dissemination of \nendometrial tissue into the venous circulation. Am. J. Pathol. v. 3, n. 2, p. 93-110, 1927. \n \nSenapati, S.; Barnhart, K. Managing endometriosis associated infertility. Clin. Obstet. \nGynecol. v. 54, n. 4, p. 720-726, 2011. \n \nStilley, J.A. et al. Cellular and molecular basis for and ometriosis-associated infertility. Cell \nTissue Res. v. 349, n. 3, p. 849-862, 2012. \n \nSung, J.H. et al. Isolation and characterization of mouse mesenchymal stem cells. Transplant. \nProc. v. 40, n. 8, p. 2649-2654, 2008. \n \nTal, R. et al. A murine 5-fluorouracel-based submyeloablation model for the study of bone \nmarrow-devided cell trafficking in reproduction. Endocrinology. v. 157, n. 10, p. 3749 -3759, \n2016. \n \nTaylor, H.S. Endometrial cells derived from donor stem cells in bone marrow transplant \nrecipients. JAMA, v. 292, n. 1, p. 81-85, 2004. \n \n \n \n63 \n\nTomassetti, C.; D’Hooghe, T. Endometriosis and infertility: insights into the causal link and \nmanagement strategies. Best. Pract. Res. Clin. Obstet. v. 51, p. 25-33, 2018.  \n \nWang, X. et al. Chemoattraction of bone marrow -derived stem cells towards human \nendometrial stromal cells is mediated by estradiol regulated CXCL12 and CXCR4 expression. \nStem Cell Res. v. 15, n. 1, p. 14-22, 2015. \n \nWang, Y. et al. The origin and pathogenesis of endometriosis. Annu. Rev. Pathol. v. 15, p. 71-\n95, 2020. \n \nWei, Q.M.A. et al. Reduced expression of biomarkers associated with the implantation \nwindow in women with endometriosis. Fertil. Steril. v. 91, n. 5, p. 1686-1691, 2009. \n \nZanatta, A. et al. The role of the Hoxa10 gene in the etiology of the endometriosis a nd its \nrelated infertility: a review. J. Assist. Reprod. Genet. v. 27, n. 12, p. 701-710, 2010. \n \nZhao, J. et al. Uterine infusion with bone marrow mesenchymal stem cells improves \nendometrium thickness in a rat modelo of thin endometrium. Reprod. Sci. v. 22, n. 2, p. 181 -\n188, 2015. \n \nZhao, Y. Using mesenchymal stem cells to treat female infertility: an update on female \nreproductive diseases. Stem Cells Int. 2019. \n \nZhu, H. et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse \ncompact bone. Nature, v. 5, n. 3, p. 550-560. 2010. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n64 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nANEXOS \n \n \n65 \n\nANEXO A – Representação da população de Células Estromais Mesenquimais por citometria \nde fluxo \n \nNota: Foram obtidos um total de 5 mil eventos e para as análises dos marcadores de superfície \ncelular (SCA-1, CD11b, CD34, CD31 e CD45) foram eliminados os debris e células mortas. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n66 \n\n \nAnexo B - Aprovação para execução do projeto pelo CEUA \n \n \n \n67","source_license":"CC0","license_restricted":false}