{"paper_id":"88ad9c5e-43e5-4471-bb64-de39cfbc977f","body_text":"1 \n \n \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLUANA GOMES VELOSO WATANABE \n \n \n \n \n \n \n \nEfeito da administração uterina de CXCL12 (SDF-1), sobre genes reguladores da \nexpressão dos receptores de progesterona sobre o endométrio de camundongos fêmeas com \nendometriose induzida \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2023 \n\n1 \n \nLUANA GOMES VELOSO WATANABE \n \n \n \n \n \n \n \n \nEfeito da administração uterina de CXCL12 (SDF-1), sobre genes reguladores da \nexpressão dos receptores de progesterona sobre o endométrio de camundongos fêmeas com \nendometriose induzida. \n \n \n \n \n \n \nVersão corrigida. A versão original \nencontra-se disponível tanto na Biblioteca \nda Unidade que aloja o Programa, quanto na \nBiblioteca Digital de Teses e Dissertações \nda USP (BDTD) \nDissertação apresentada ao Programa de  \nPós-graduação em Ginecologia e \nObstetrícia da Faculdade de Medicina de  \nRibeirão Preto da Universidade de São  \nPaulo para a obtenção do Título de \nMestre em Ciências Médicas. \nÁrea de concentração: Ginecologia e \nObstetrícia \nOrientador: Profª. Drª. Ana Carolina \nJapur de Sá Rosa e Silva. \n \n \nRibeirão Preto \n2023 \n\n3  \n \nWatanabe, Luana Gomes Veloso \n \nEfeito da administração uterina de CXCL12 (SDF-1), sobre genes \nreguladores da expressão dos receptores de progesterona sobre o endométrio \nde camundongos fêmeas com endometriose induzida/ Luana Gomes Veloso  \nWatanabe. Orientadora: Profª. Drª. Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva.  \n2023. 52p. \nDissertação (Mestrado)  - Programa de Pós -Graduação em Ginecologia e  \nObstetrícia, opção Biologia da reprodução - Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2023. \n \nOrientadora: Silva, Ana  \nVersão corrigida. \n1. endometriose; 2- expressão gênica; 3- perfil de expressão; 4- \nmodelo experimental; 5-cxcl12 \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n \n \n\n3  \nWATANABE, L.G.V. Efeito da administração uterina de CXCL12 (SDF -1), sobre genes  \nreguladores da expressão dos receptores de progesterona sobre o endométrio de camundongos \nfêmeas com endometriose induzida. 2023. 52p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2023. \n \n \nAprovado em: \n \nBanca Examinadora \n \nProf. Dr.           \nInstituição:  \nJulgamento:     \n \n \n \n \n \nProf. Dr.           \nInstituição:  \nJulgamento:     \n \n \n \n \n \nProf. Dr.           \nInstituição:  \nJulgamento:     \n\n5 \n3 \n \n \nAGRADECIMENTOS \nAgradeço primeiramente a Deus e a Nossa Senhora por ter permitido desenvolver \nmeu projeto em uma área tão estimada. \nAgradeço a Profª Ana Carolina por ter me orientado, amparado, ensinado e  \ntambém por ter sido empática em muitas circunstâncias. \nÀ minha mãe que sempre foi um exemplo de mulher batalhadora, me incentivando \nnos estudos, se abdicando de muitas coisas para me proporcionar o melhor. Agradeço a  \nminha rede de apoio (sogra, tios e tias), sem eles não seria possível ter concluído essa  \netapa tão importante na minha vida. \nAo meu marido que sempre me apoio u, me aconselhou e esteve ao meu lado a  \ntodo momento, dividindo todas as tarefas do nosso lar. \nAgradeço aos meus filhos, Benício e Lorena, que vieram e transformaram a minha \nvida. Me fizeram ser uma pessoa melhor e me motivaram a batalhar todos os dias. Mesmo \nnão tendo idade para compreender as minhas responsabilidades e dificuldades, me \nacalentaram com muito carinho nessa caminhada. É por vocês essa conquista. \nAos profissionais que me ensinaram técnicas, me acolheram e compartilharam de \nsuas experiências. \nAgradeço aos colegas da Pós Graduação pela convivência e apoio mútuos. \n \n \n“O presente trabalho foi realizado com apoio do CNPq, Conselho Nacional de \nDesenvolvimento Científico e Tecnológico – Brasil” \n\n6 \n3 \n \n \nRESUMO \n \n \n \nWATANABE, L.G.V. Efeito da administração uterina de CXCL12 (SDF -1), sobre \ngenes reguladores da expressão dos receptores de progesterona sobre o endométrio de \ncamundongos fêmeas com endometriose induzida. 2023. 52p. Dissertação (Mestrado) \n– Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2023. \n \nINTRODUÇÃO: Tendo em vista que a progesterona é indispensável no preparo \nendometrial pré-implantação, este assunto é cada vez mais relevante quando se estud a o \ncomprometimento de fatores reprodutivos. A endometriose é uma desordem ginecológica \ncuja infertilidade é um dos seus sintomas. As hipóteses que comprovam tal associação  \npermanecem controversas, mas acredita -se que seja consequência do comprometimento  \ndesses fatores, já que estudos recentes mostram que há uma redução na expressão dos  \nreceptores de progesterona no endométrio de mulheres portadoras dessa doença, afetando \nnegativamente as taxas de implantação em ciclos de reprodução assistida. No presente  \ntrabalho utilizamos o CXCL12 (substância com propriedade quimiotática de células  \ntronco), que em estudo anterior do nosso grupo promoveu um aumento dos receptores de \nprogesterona, melhorando assim as taxas de gestação no grupo de animais com \nendometriose induzida tratado com a quimiocina. OBJETIVO: este estudo propôs \ninvestigar o mecanismo pelo qual o tratamento com o CXCL12 promoveu o aumento dos \nreceptores de progesterona. MATERIAL E MÉTODOS: Para isso foram utilizados 32  \ncamundongos fêmeas da linhagem C 57BL/6J, em metade dos animais foi realizada a  \nindução de endometriose peritoneal e na outra metade foi realizado um procedimento  \nsham. Cada grupo foi subdividido para receber CXCL12 ou placebo. Os animais foram  \nentão colocados para acasalamento para verificar fertilidade e após o nascimento, \nsubmetidos a histerectomia. O tecido uterino foi então analisado quanto à expressão dos  \ngenes para o receptor de progesterona, do CXCL12 e de seu receptor CXCR4, além de  \ncoativadores do receptor de progesterona ( SRC-1, SRC -2 e SRC -3). RESULTADOS:  \nCom relação às taxas de gestações com nascimento, embora não tenha havido uma  \ndiferença estatística houve um aumento de 37,5% para 62,5% entre os animais com  \nendometriose que receberam placebo ou CXCL12, o que consideramos  clinicamente \nrelevante. Na análise molecular verificamos semelhança na expressão do PGR, CXCL12, \nCXCR4 e SRC-1, SRC-2 e SRC-3 entre os grupos sham e endometriose -placebo, porém \nao tratar com CXCL-12 houve redução na expressão de todos os genes estudados. Ao \nanalisar a correlação entre os genes, encontramos uma forte correlação entre todos os  \ngenes selecionados aos se considerar todos os grupos juntos ou mesmo dentro de cada  \ngrupo separadamente, porém houve perda das correlações do PGR com todos os outros  \ngenes no grupo endometriose -CX. CONCLUSÃO: Nossos achados apresentam grande  \nimpacto supressor do CXCL12 sobre a expressão de genes estudados ligados às vias da  \nprogesterona, sugerindo que a melhora das taxas de gestação não ocorra por ação direta  \nna expressão do PGR ou dos coativadores estudados. \n \n \n \nPalavras-chaves: endometriose, infertilidade, progesterona, CXCL12, coativadores. \n\n7 \n3 \n \n \n \n \nABSTRACT \nWATANABE, L.G.V. Effect of uterine administration of CXCL12 (SDF-1) on genes \nthat regulate the expression of progesterone receptors on the endometrium of female  \nmice with induced endometriosis. 2023. 52p. Masters dissertation – Ribeirao Preto  \nMedical School, University of São Paulo, 2023. \n \nINTRODUCTION: Considering that progesterone is essential in pre-implantation \nendometrial preparation, this issue is increasingly relevant when studying the impairment \nof reproductive factors. Endometriosis is a gynecological disorder whose infertility is one \nof its symptoms. The hypotheses that prove this association remain controversial, but it  \nis believed to be a consequence of the impairment of these factors, since recent studies  \nshow that there is a reduction in the expression of progesterone receptors in the \nendometrium of women with this disease, nega tively affecting rates implantation in  \nassisted reproduction cycles. In the present work, we used CXCL12 (chemokine \nsubstance with chemotactic property of stem cells), used in a previous study of our group \nwhere an increase in progesterone receptors occurred, thus improving pregnancy rates in \nthe group of animals with induced endometriosis treated with the chemokine. \nOBJECTIVE: The aim of our study was to identify to investigate the mechanism by which \ntreatment with CXCL12 promoted an increase in progesterone receptors. MATERIAL  \nAND METHODS: For this, 32 female mice of the C57BL/6J strain were used, in half of  \nthe animals peritoneal endometriosis induction was performed and in the other half a  \nsham procedure was performed. Each group was subdivided  to receive CXCL12 or  \nplacebo. The animals were then placed for mating to check for fertility and after birth,  \nunderwent hysterectomy. The uterine tissue was then analyzed for the expression of genes \nfor the progesterone receptor, CXCL12 and its receptor C XCR4, in addition to We  \nselected some progesterone receptor coactivators (SRC -1, SRC-2 and SRC -3) that are  \nrelated with progesterone to verify if there was also a relationship between them and this \nchemokine and if such a relationship could have contributed to this outcome. RESULTS: \nRegarding the rates of pregnancies with birth, although there was no statistical difference \nin our findings, there was an increase from XXX 37.5% to XXX 62.5% among animals  \nwith endometriosis that received placebo or CXCL12, which we consider clinically  \nrelevant. . there was an increase in pregnancy rates in the endometriosis group treated  \nwith CXCL12. In the molecular analysis, we found a similarity in the expression of PGR, \nCXCL12, CXCR4 and SRC-1, SRC-2 and SRC-3 between the sham and endometriosis- \nplacebo groups, but when treating with CXCL-12 there was a reduction in the expression \nof all genes studied . When analyzing the correlation between genes, we found a strong  \ncorrelation between all selected genes when considerin g all groups together or even  \nwithin each group separately, but also a difference in the expression of CXCL12 in the  \nEndometriosis group treated with this chemokine, having There was a loss of PGR  \ncorrelations with all other genes in the latter in the endometriosis-CX group. \nCONCLUSION: Our findings show a great suppressive impact of CXCL12 on the  \nexpression of studied genes linked to progesterone pathways, thus suggesting a role of  \nthis chemotactic agent in which the improvement in pregnancy rates and incr ease in the \nexpression of progesterone receptors in the endometrium does not occur by direct action  \non the endometrium. expression of PGR or coactivators studied. \nKeywords: endometriosis, infertility, progesterone, CXCL12, coactivators. \n\n8 \n3 \n \n \nSUMÁRIO \n \n \n \n \nINTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA .......................................................... 9 \nEndometriose .................................................................................................................... 9 \nEndometriose e Infertilidade ........................................................................................... 11 \nO quimiotático SDF-1 (CXCL12) e sua relação com a endometriose ............................ 12 \nRegeneração endometrial: relação entre células-tronco, progesterona e do quimiotático \nSDF-1 (CXCL12) ................................................................................................................ 14 \nA receptividade endometrial na endometriose está comprometida? ............................... 15 \nCoativadores de receptores de esteroides ....................................................................... 18 \nOBJETIVOS ................................................................................................................. 22 \nObjetivo Primário ........................................................................................................... 22 \nObjetivo Secundário ........................................................................................................ 22 \nMATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 22 \nRESULTADOS ............................................................................................................. 30 \nDISCUSSÃO ................................................................................................................. 37 \nCONCLUSÃO ............................................................................................................... 41 \n\n\n9 \n3 \n \n \n \n \nREVISÃO DE LITERATURA \n \n \nEndometriose \n \nA endometriose é caracterizada pelo crescimento do endométrio fora da cavidade \nuterina, resultando no estabelecimento de lesões endometrióticas que podem ser \nencontradas na superfície dos órgãos da cavidade pélvica, dos ovários e eventualmente  \nem órgãos extra-pélvicos (Sharif, Hanyia et al. 2014). \nA patogênese da doença é multifatorial e existem diversas hipóteses na literatura  \nsobre sua etiologia, sendo a teoria da menstruação retrógada, proposta por Sampson, a  \nexplicação mais aceita. (Halme, Hulka et al . 1984). Lesões endometrióticas também  \nforam localizadas em locais extrapélvicos, em mulheres que fizeram histerectomia e  \ntambém em homens. Apontando para outras vertentes no desenvolvimento da doença,  \nnão se limitando apenas à teoria de Sampson. (Taylor et al., 2021) (Figura 1). \nEm relação ao quadro clínico, apesar de haver casos assintomáticos, os seus  \nsintomas, quando presentes, incluem: dismenorreia, dor pélvica, dispareunia e a \ninfertilidade, a qual está presente em 10 a 15% das mulheres em idade repro dutiva \n(Andres et al., 2020; Nácul & Spritzer, 2010). \nAproximadamente mais de 176 milhões de mulheres são portadoras de \nendometriose, embora seja alta sua prevalência, o diagnóstico costuma ser tardio. Para  \nesse, estima-se que demore em torno de 4 a 11 anos. Todo esse atraso está relacionado a \ndiagnósticos incorretos, visto que a  maioria das mulheres relatam que os  sintomas \napresentados são considerados inadequadamente normais (Taylor et al., 2021). \nAlém da dificuldade de diagnóstico pela inespecificidade dos sintomas , na prática \nclínica o diagnóstico definitivo para endometriose é feito através da laparoscopia, sendo \n\n10 \n3 \n \n \nesse mais um obstáculo para que se obtenha um diagnóstico precoce (Ozkan et al., 2008; \nTaylor et al., 2021) . \nSendo a endometriose uma doença estrogênio-dependente, o tratamento se baseia \nno controle da doença utilizando fármacos que promovam o hipoestrogenismo, como os  \nanálogos do GnRH, ou que antagonizem o efeito endometrial do estrogênio, como por  \nexemplo o uso de progestagênios. É importante também que seja um tratamento \nindividualizado, de forma que leve em consideração os sintomas da paciente e o impacto \nda doença e de seu tratamento sobre a sua qualidade de vida (Cesar Rosa Silva et al.,  \n2021). A mediação desses fármacos promove a menor atividade dos focos de endométrio \nectópico, diminuindo o processo inflamatório e consequentemente amenizando as dores  \nassociadas a doença (Crosignani, Bergqvizt et al. 2006; Cesar Rosa Silva et al., 2021). A \nopção cirúrgica é consi derada em pacientes que relatam dor refratária ao tratamento  \nclínico, lesões profundas com acometimento de órgãos adjacentes e excepcionalmente em \ncasos de infertilidade, uma vez que nestes casos a reprodução assistida é o tratamento de  \nescolha para estas mulheres (Arafah et al., 2021; Cesar Rosa Silva et al., 2021). \n \n \nFigura 1. Diversas teorias sobre a etiologia da endometriose. Extraído de: Arafah, M., Rashid, S., & Akhtar, \nM. (2021). Endometriosis: A Comprehensive Review. Advances in Anatomic Pathology, 28(1), 30–43. \nhttps://doi.org/10.1097/PAP.0000000000000288 \n\n11 \n3 \n \n \n \n \n \nEndometriose e Infertilidade \n \nApesar dessa patologia estar relacionada a infertilidade ou baixa fecundidade, as  \nhipóteses que comprovam tal associação permanecem controversas (Taylor et al., 2021;  \nKuroda, Kitade et al. 2009; Mahmood, Arumugam et al. 1991). A inflamação crônica,  \nconsequência de tal patologia, pode afetar negativamente a função endometrial, onde foi  \ndemonstrado que o endométrio eutópico de mulheres com endometriose passa por \nalterações relacionadas as células inflamatórias e imunológicas, afetando assim a \nreceptividade endometrial e contribuindo ao desenvolvimento da resistência a \nprogesterona (Arafah et al., 2021; Taylor et al., 2021). \n \n \nFigure 2. Fatores associados à redução da fertilidade em mulheres portadoras de \nendometriose. \nExtraído de: Stilley JA, Birt JA, Sharpe-Timms KL. Cellular and molecular basis for endometriosis-associated \ninfertility. Cell Tissue Res. 2012 Sep;349(3):849-62. \n \n \nOutros fatores, com menor evidência na literatura, também tem sido relacionados \na um comprometimento da função reprodutiva destas mulheres. A foliculogênese, por  \nexemplo, e seus mecanismos regulatórios é um destes fatores. Parecer haver uma \ndisfunção que altera as vias de feedback da hipófise, comprometendo o pico de LH \n\n\n12 \n3 \n \n \nresponsável pela ovulação. (Cahill, Wardle et al. 1995). Além disso, essa redução do LH \nparece levar a um menor número de folículos pré-ovulatórios maduros (Doody et al. 1988; \nCahill et al.1995; Dlugi et al. 1989). Logo após a ovulação, há um processo de \ndiferenciação das células tecais e granulosas em células luteais, a partir dessa \ndiferenciação inicia-se o processo de produção da progesterona, cujo objetivo é o preparo \ndo endométrio para a nidação (Kumar, 1998); em mulheres com endometriose a \nmorfologia das células luteais encontra-se alterada (presença de células luteais grandes e \npequenas) com consequenteprodução deficiente de progesterona (Cheesman et al., 1983; \nCunha-Filho et al., 2003). \nSendo o papel da progesterona fundamental para a adequada receptividade \nendometrial para implantação, pode-se entender a menor taxa de implantação descrita por \nalguns autores em mulheres com endometriose. (Stilley et al., 2012) \n \n \nO quimiotático SDF-1 (CXCL12) e sua relação com a endometriose \n \nAs quimiocinas constituem uma ampla família de pequenas citocinas e são \nconhecidas pelas suas características pró-inflamatórias e também pela sua função \nquimiotática, que permite o controle d a migração celular durante o desenvolvimento ou  \nmanutenção de algum tecido (Palomino & Marti, 2015). \nO CXCL12 (também conhecido como fator 1 derivado do estroma [SDF -1]) tem \ncomo receptor o CXCR4, e juntos possuem ação parácrina no câncer, favorecendo para o \ncrescimento e desenvolvimento do tumor através do seu papel no controle da \nangiogênese, invasão e metástase, proliferação e crescimento celular. (Palomino & Marti, \n2015; Zlotnik et al., 2006; Vandercappellen et al. 2008). \nO ligante e o seu receptor são essenciais nos processos reprodutivos, \ndesempenhando funções desde a implantação, placentação e embriogênese. Na \n\n13 \n3 \n \n \nplacentação, por exemplo, o eixo CXCL12-CXCR4 é responsável pela interação entre o  \ntrofoblasto e o endométrio receptivo. Dado o CXCL12 como um biomarcador de \nreceptividade endometrial, em um recente estudo, a exposição ao tabaco diminuiu \nsignificativamente essa quimiocina, tendo como consequência uma receptividade \nendometrial prejudicada em mulheres que fumavam. Por outro lado, visto que essa  \nquimiocina também está implicada na patogênese da endometriose, mulheres que faziam \no uso de tabaco possuíam um efeito protetor em relação a doenças proliferativas (Wang  \net al. 2015; Sahin Ersoy et al., 2017). \nAinda sobre desfechos reprodutivos, o CXCL12 está implicado no que diz respeito \na boa qualidade de embriões e isso é devido a sua função antiapoptótica. Segundo o estudo \nde Kryczek et.al, foi demonstrado que as células da granulosa de folículos pré ovulatórios \nhumanos produzem o CXCL12 e esse é responsável pelo recrutamento de leucócitos e  \njuntos controlam a sobrevivência das células da granulosa por meio do controle da  \napoptose. Tudo isso implica em uma melhora na qualidade embrionária, dado que alguns \nautores advertem que o processo de apoptose das células da granulosa prejudica as taxas \nde gravidez. Sendo assim a ação antiapoptótica do CXCL12 juntamente aos linfócitos,  \ncontribuem para um embrião de melhor qualidade (Kryczek et al., 2005). \nNa endometriose ocorre a produção de quimiocina s e o CXCL12 é uma dessas,  \nsendo responsável pela mobilização e o homing de células -tronco advindas da medula  \nóssea (BMDSCs) para o endométrio (Moridi et al., 2017). Em mulheres portadoras da  \ndoença essa sinalização encontra-se elevada e possui um fator determinante na migração \ndessas células para as lesões (Moridi et al., 2017; Pluchino et al., 2020). Nesses casos, as \ncélulas-tronco derivadas da medula óssea (BMDSCs) estão implicadas no que se refere a \npatogênese da doença, contribuindo assim para o desenvolvimento das lesões de \nendometriose. Em um estudo realizado utilizando um antagonista de CXCR4 (receptor de \n\n14 \n3 \n \n \nCXCL12), observou-se que o bloqueio do eixo CXCL12/CXCR4 resultou em uma redução \nsignificativa no enxerto das BMDSCs na endometriose, confirmando o papel das células- \ntronco no desenvolvimento da doença. Além disso, o tratamento com o antagonista \nCXCR7 e AMD3100 (Plerixafor) diminuiu o tamanho das lesões (Pluchino et al., 2020). \nAs justificativas para o aumento da produção do CXCL12 e o recrutamento de \ncélulas tronco na endometriose, podem ser baseadas em diversos mecanismos, sendo um \ndeles a sinalização aberrante ao estrogênio e a resistência à progesterona, que também \natua no eixo CXCL12-CXCR4 (Petit et al., 2007; Glace et al.,2009; Wang et al., 2015). \n \n \n \nRegeneração endometrial: relação entre células-tronco, progesterona e o \nquimiotático (CXCL12) \n \nO endométrio é constituído por duas camadas, classificadas como camada \nfuncional e camada basal. É na camada basal que o processo de crescimento e \ndiferenciação de diversas células  ocorre. Durante a menstruação  há descamação da  \ncamada funcional e sua regeneração ocorrerá a partir da camada basal (Padykula et al.  \n1984; Padykula, 1991; Spencer et al. 2005; Jabbour et al. 2006;  Chan et al. 2004). Essa  \nregeneração permitirá o desenvolvimento de um novo epitélio, propício para uma futura  \nnidação ou, caso essa não ocorra, haverá nova descamação do endométrio (menstruação). \nA regeneração e remodelação endometrial sofrem influência d e hormônios, sendo que o  \nestrogênio é responsável pela proliferação epitelial e estromal, e a progesterona pela  \ndecidualização (Du and Taylor, 2012; Masuda et al., 2007). \nPara elucidar a questão sobre o papel da célula -tronco na regeneração cíclica do  \nendométrio, foi demonstrado que situações em que ocorreu uma isquemia ou trauma  \nuterino, as taxas de migração destas células tronco foram dobradas, enfatizando sua  \nfunção na reparação da lesão endometrial quando comparada a uma regeneração cíclica \n\n15 \n3 \n \n \n(Du and Taylor, 2012; Zhou, Gan et al. 2011). Sabendo que a função das células -tronco \ncontribui de maneira significativa para a homeostase tecidual, em doenças ginecológicas \npode haver o comprometimento dessa função em relação a uma proliferação endometrial \nanormal. Com isso, foram pautadas relações entre células -tronco e a  Endometriose \n(Gargett, Schwab et al. 2015). \n \nEstudos anteriores mostraram que as lesões endometrióticas interferem no \nrecrutamento de células-tronco, por isso o entendimento dos mecanismos específicos que \nregulam esse tráfico torna -se importante. Foi demonstrado que o eixo CXCL12-CXCR4 \ntem papel fundamental nesta regulação de células-tronco para o endométrio (Wang, et al. \n2015). Como mencionado anteriormente, a citocina CXCL12 tem sido investigada no que \ndiz respeito a sua ação em lesões da endometriose. Foi observado um aumento tanto da  \nsua expressão quanto a do seu receptor CXCR4 no endométrio de pacientes portadores de \nendometriose (Leconte et al. 2014; Van et al. 2013). \n \nA migração das células-tronco para um local distante do útero pode afetar \nnegativamente a receptividade. Terapias que visam o restabelecimento do fluxo de \ncélulas-tronco para o útero e melhora na regeneração endometrial, poderiam contribuir  \npara o sucesso da implantação (Sharif, Hanyia et al, 2014). \n \n \nA receptividade endometrial na endometriose está comprometida? \n \nComo mostrado anteriormente, a porcentagem de mulheres portadoras de \nendometriose que são inférteis é alta. No que se refere a receptividade endometrial,  \nembora ainda controverso, vários estudos demonstram que a endometriose está \nrelacionada a diversas alterações, comprometendo a fertilidade. (Lessey & Kim, 2017). \n\n16 \n3 \n \n \nO processo de implantação é complexo e depende de vários fatores, sendo assim, \npara que esse seja bem sucedido é necessário uma combinação entre um embrião saudável \ne um endométrio receptivo. A receptividade endometrial corresponde a um período  \ndelimitado, no qual por influência hormonal o endométrio se transforma em um estado  \nfuncional transitório para que possa ocorrer a implantação do blastocisto e assim resultar \nno início de uma gravidez (Lessey & Kim, 2017; Neykova et al., 2020). Quanto a  \nprodução hormonal, há uma predominância da atividade da proges terona em relação ao  \nestrogênio. Em mulheres com endometriose as ações desempenhadas pela progesterona  \nencontram-se reduzidas, afetando negativamente na receptividade endometrial (Stilley et \nal., 2012). \nJá foi descrito por alguns autores maiores taxas de falha de implantação \n(Tomassetti et al, 2006), aborto recorrente e aumento das perdas de gestações tardias em  \nmulheres com endometriose em relação a mulheres sem a doença (Yanushpolsky et al,  \n1998). \nA decidualização é mediada pela ação da progesterona, cujo  processo ocorre  \ndurante a janela de implantação e é caracterizada pela produção de substâncias que  \nincluem: fatores de crescimento, componentes da matriz celular e citocinas. Essas \nsubstâncias serão responsáveis pelo controle da invasão trofoblástica, redução da resposta \nimune materna e resistência a insultos inflamatórios (Gurpide, Tabanelli et al. 1992;  \nDimitriadis Jones et al. 2005). \nÉ sabido que o sucesso  de uma implantação depende diretamente da  \nreceptividade uterina, e essa está relacionada a proc essos que envolvem uma regulação  \nhormonal de moléculas de adesão e também citocinas. Podemos avaliar a receptividade  \nuterina através de integrinas, principalmente a integrina αVβ3. Em pacientes com \nendometriose, a integrina αVβ3 encontra-se diminuída ou ausente (Aghajanova and \n\n17 \n3 \n \n \nGiudice 2008; Donaghay e Lessey 2007). Em modelo animal de endometriose induzida  \ntambém foi demonstrada menor expressão de receptores de integrina no endométrio,  \nassociado à uma menor expressão de receptores de progesterona e menor taxa de gestação \ne nascimento (Rosa-e-Silva et al, 2022). Uma explicação para essa deficiência da αVβ3,  \nestá no desequilíbrio da função do HOXA 10, fator de transcrição responsável pela  \nestimulação da integrina (Eun and Taylor 2004). \nJuntamente com o receptor PR (receptor de progesterona), está presente também  \no receptor de estrogênio ESR1, que será regulado negativamente pela progesterona. A  \npersistência desses receptores no epitélio glandular está relacionada com a resistência a  \nprogesterona e como resultado pode causar um quadro de infertilidade devido à defeitos  \nna implantação. Essa resistência à progesterona tem sido correlacionada a fatores \ninflamatórios presentes no endométrio (Lessey et al., 2017; Marquardt et al., 2019; Li et  \nal., 2013). \nEm um estudo recente desenvolvido por nosso grupo (Rosa e Silva et.al, 2022) o  \nuso de CXCL-12 injetado diretamente no útero de camundongos com endometriose  \naumentou as taxas de gestação, e este aumento correlacionou -se com a recuperação da  \nexpressão imunohistoquímica de receptores de progesterona e de integrina αVβ3 no  \nendométrio. Parece haver uma influência desta substância na expressão destes \nmarcadores de receptividade endometrial, que estão incialmente reduzidos em \ncamundongos com endome triose (Rosa e Silva et.al, 2022). A redução na expressão de  \nintegrinas também foi observada por outros autores que responsabilizaram a inflamação  \nda doença por esta queda, o que levaria a menor capacidade de adesão do embrião na  \nmatriz extracelular, o que justificaria uma implantação deficiente (Lessey, Castelbaum et \nal. 1996; Meyer et al., 1997). \n\n18 \n3 \n \n \nAtravés de alguns mecanismos responsáveis pela indução e expressão gênica, uma \ntransformação ocorre na janela de implantação, alterando assim os fatores endócrinos,  \nmediado pela progesterona, para fatores parácrinos e autócrinos. Resumidamente, as  \nações diretas da progesterona tornam-se ações indiretas. Defeitos nessa mudança estariam \nassociados a infertilidade, afetando negativamente a implanta ção (Large, Demayo et al.  \n2012; Lessey 2003; Li, Large et al. 2013). \n \n \nCoativadores de receptores de esteroides \n \nOs SRC desempenham funções de coativadores de receptores de esteroides e são  \ncomposto por uma família de três membros: SRC-1 (NCOA-1), SRC-2 (NCOA-2) e SRC- \n3 (NCOA-3). Todos os três demonstram interação com o domínio de ligação da \nprogesterona, sendo essa interação do tipo dependente do ligante (Mukherjee et al., 2006; \nSzwarc et al., 2015). \nEles podem modular a atividade de outros fatores de transcrição, porém a \nregulação da ação do hormônio de esteroide ainda é a principal. Com isso, os coativadores \ntornaram-se alvo de estudo no que se refere a regulação da biologia reprodutiva, sendo  \neles críticos no trato reprodutivo feminino, nesse caso, desde a ovulação, implantação e  \nparto (Szwarc et al., 2015). \nEm estudos in vitro foi constatado que a transcrição mediada pela progesterona  \ndepende da relação com os membros de coativadores de receptores de esteroides. Com  \nbase nisso, foi pressuposto que t al interação teria como intuito recrutar um ou mais  \nmembros do SRC para um subconjunto de genes alvo da progesterona, onde tal \ntranscrição apresentaria uma resposta fisiológica particular à exposição a progesterona  \n(Mukherjee et al., 2006). \n\n19 \n3 \n \n \nAtravés de estudos com modelos de camundongos KO para cada um dos membros \nde coativadores, determinou -se o papel de coativador dos membros SRC em processos  \nfisiológicos mediados pela progesterona. Os resultados demonstraram que o modelo SRC- \n1 KO teve sua reposta decidual prejudicada, corroborando para a importância da função  \ndesse coativador no processo de remodelação de tecido, que é dependente da sinalização \nde progesterona. No caso do modelo SRC-3 KO ele está presente em modificações  \nmamária, que também são mediadas pela progesterona. Já o SRC-2 KO foi implicado  \ncomo um coativador essencial aos processos de transcrição mediados pela progesterona  \nno que se refere a manutenção da fecundidade feminina. Nesse estudo, o modelo SRC-2 \nKO apresentou infertilidade e falhas de implantação, presumindo que para que ocorra  \numa resposta decidual completa, é necessário que a transcrição mediada pela \nprogesterona envolva também do coativador SRC-2. Tal estudo ressaltou que esse \ncoativador é indispensável nas respostas uterinas dependentes de progesterona que \ndeterminam o processo de implantação embrionária (Mukherjee et al., 2006). \nTodos os membros da família SRC podem ter uma relação direta com a \nprogesterona e os seus diferentes subtipos podem ativar genes específicos. Portanto o  \nrecrutamento diferencial dos membros de SRC corresponde à um modo importante pela  \nqual a progesterona medeia seus efeitos diferentemente. A conclusão do estudo citado  \nanteriormente foi a de que SRC-2 junto à progesterona desempenham funções \nproliferativas em relação a função uterina (Mukherjee et al., 2006), sendo o endométrio  \num dos tecidos mais estudados em relação a ação desses coativadores (Szwarc et al.,  \n2015), uma vez que a decidualização depende da ação dos esteró ides sexuais (Szwarc et \nal., 2015). \n\n20 \n3 \n \n \nA ação dos coativadores também está relacionada à inúmeras anormalidades do  \ntecido reprodutivo, incluindo a endometriose. Os achados de alguns estudos relatam uma \nnova isoforma de SRC-1, também referida como SRC-1 truncada de 70 kDa; essa proteína \npoderia bloquear a apoptose, favorecendo a sobrevivência das células em lesões \nendometrióticas ( Mukherjee et al., 2006; Han et al., 2012; Szwarc et al., 2015) \nNo caso da endometriose, as SRC-1 de comprimento total as lesões de \nendometriose apresentam baixas concentrações quando comparadas ao endométrio \neutópico. Já a nova isoforma do SRC-1 está aumentada em células estromais \nendometrióticas, em comparação com as lesões ectópicas e na correlação com a \nprogressão da doença foi constatada uma elevação no processamento de SRC-1 (Han et \nal., 2012). \nNo tecido endometriótico de camundongos com endometriose induzida também  \nforam descritas alterações nas formas SRC-2 e SRC-3, ainda assim as formas truncadas  \nde SRC-2 e SRC-3 ficaram restritas apenas às lesões ectópicas (Han et al., 2012). Em  \nestudo de Wang et al., foi verificada uma expressão maior do coativador SRC-1 no \nendométrio ectópico na fase secretora e isso acompanhou o aumento também da \nquimiocina CXCL12. A fim de estudar os papeis dos coativadores, notou -se que ao  \nsilenciar o  gene SRC-1 ocorreu uma diminuição  da expressão do  CXCL12 que foi  \ninduzido pelo estrogênio. Também se verificou que o coativador SRC-2 é necessário para \nque a progesterona faça a inibição do CXCL12 produzido pelo estrogênio. Concluiu -se \nque embora os coativadores SRC-1 e SRC -2 pertençam a mesma família, no que diz  \nrespeito a expressão do CXCL12 eles diferem em suas funções, sendo que o primeiro é  \nmais significativo para a expressão da quimiocina induzida pelo estrogênio e o SRC-2 é \nfundamental para a atividade da progesterona em relação a inibir o CXCL12 (Shi et al., \n2014). \n\n21 \n3 \n \n \nComo mencionado anteriormente, os SRC além de regularem os recepto res de  \nesteroides, também exercem funções em outros fatores de transcrição. Sendo assim eles  \npossuem capacidade em modular várias vias, fazendo deles alvos para fins terapêuticos,  \nseja para inibição ou ativação (Szwarc et al., 2015). \n \n \nFigura 3: Funções dos coativadores na biologia reprodutiva a nível fisiológico e patológico. Szwarc, M.  \nM., Lydon, J. P., & O’Malley, B. W. (2015). Steroid receptor coactivators as therapeutic targets in the  \nfemale reproductive system. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 154, 32–38. \nhttps://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2015.06.010 \n \n \nO estudo anterior do grupo que demonstrou um efeito positivo da aplicação uterina \nde CXCL-12 nas taxas de gestação e nascimento em camundongos fêmea com \nendometriose induzida, aco mpanhado da recuperação na expressão dos receptores de  \nprogesterona no endométrio nos levou a questionar qual seria o mecanismo pelo qual o  \nCXCL12 teria levado a este efeito (Rosa e Silva et, 2022). Inicialmente desenhado para  \natrair células tronco mesenquimais da medula óssea (BMDSCs) e promover melhora das \ntaxas de implantação neste modelo, obtivemos sim a melhora na implantação, mas não  \nidentificamos um efeito mediado pelas BMDSCs, o que nos levou a considerar a \n\n\n22 \n3 \n \n \npossibilidade de um efeito direto do CXCL12 sobre estes marcadores. Sendo assim, este \nestudo foi desenhado com a finalidade de explorar algumas das vias relacionadas à  \nexpressão dos receptores de progesterona e o efeito do CXCL12 sobre elas. \n \n \n \n \nOBJETIVOS \n \nObjetivo Primário \n \nAvaliar o impacto da administração de CXCL12 no útero de camundongos fêmeas com  \nendometriose induzida nas vias envolvidas na expressão de receptores de progesterona  \nno endométrio e nas taxas de gravidez. \n \nObjetivo Secundário \n \nAvaliar o impacto da administração de CXCL12 no útero de camundongos fêmeas com  \nendometriose induzida nos desfechos reprodutivos: taxa de gestação, tempo para o \nnascimento e tamanho da ninhada. \n \n \nMATERIAIS E MÉTODOS \n \nAnimais e Desenho Experimental \n \nO experimento foi realizado em camundongos selvagens C57BL/6J fêmeas. Os animais  \nforam mantidos no Biotério do Departamento de Obstetrícia, Ginecologia e Ciência  \nReprodutivas da Escola de Medicina da Universidade de São Paulo (USP), em gaiolas de \n4 a 5 anima is, em ambiente com 12 horas de ciclo claro/escuro (7:00 am –15 7:00 pm), \ncom acesso à água e comida ad libitum. Todos os animais foram tratados seguindo os \n\n23 \n3 \n \n \nprotocolos aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) para os  \ncuidados com animais. \nIndução de endometriose cirúrgica: \nOs animais foram divididos em dois grupos para serem submetidos ou não à indução  \ncirúrgica de endometriose ou sham. Para a indução da endometriose foi realizada uma  \nincisão laparotômica na linha média do abdome do animal, com xilasina (Lloyd \nLaboratories) e quetamina (Fort Dodge Animal Health) nos animais C57BL/6 (doses  \ndescritas em detalhes logo abaixo), as doadoras fêmeas foram utilizadas para retirada de  \ntodo o útero, o qual foi lavado em PBS e dividido em dois cornos. O lúmen de cada  \nfragmento uterino foi aberto longitudinalmente e transversamente dividido em dois \npedaços (com 5x5mm² cada um). Utilizando-se Vicryl 5-0, quatro fragmentos de \nendométrio (útero) foram suturados ao peritônio parietal dos camundongos fêmeas \nreceptoras, simetricamente distribuídos na parede peritoneal. Como controle, a outra  \nmetade dos animais foi  submetida ao procedimento sham, com 4 pontos de sutura  \nperitoneal sem tecido endometrial, em cada animal. \nO fechamento da parede abdominal das receptoras foi realizado em dois planos, \nutilizando-se Vicryl 4-0. No processo de analgesia dos animais pós-operatório utilizamos \ncomo droga analgésica o Meloxicam 0,2%, na dose de 5 mg/kg, via subcutânea, uma vez \nao dia, por três dias consecutivos. A figura 4 ilustra o procedimento cirúrgico descrito e \na figura 5 a formação das lesões. \n\n24 \n3 \n \n \n \n \n \nFigura 4 – Representação dos fragmentos de endométrio suturados ao peritônio parietal. \n \n \nFigura 5 – Lesões endometrióticas \n \n \n \n \n \n \n \nInjeções uterinas de CXCL-12 \n \n \nApós 3 semanas dos procedimentos cirúrgicos tanto o grupo com endometriose  \nquanto o grupo sham foram subdivididos para receber CXCL12 (Recombinant Mouse \nSDF-1α, Gemini-Bio®, West Sacraento - CA, USA) ou placebo através de injeções na \nparede uterina durante laparotomia (figura 6). \n \nA dose de CXCL-12 utilizada foi de 2,5mcg, diluídos em 150μl de água estéril  \ncom 0,1%BSA, injetados 75μl em cada corno uterino, utilizando-se seringa e agulha de \n\n\n25 \n3 \n \n \ninsulina. Nos gr upos placebo foi utilizado o mesmo volume de água estéril com BSA  \n0,1%, sem o CXCL-12. \nApós 2 semanas da administração de CXCL12 ou placebo, os animais dos quatro \ngrupos foram colocados para acasalamento por quatro semanas, após os quais foram  \navaliados os  desfechos reprodutivos (taxas de gestação, tempo para o nascimento e  \ntamanho da ninhada). Após o nascimento dos filhotes as fêmeas foram eutanasiados e  \nhisterectomizados, sendo os cornos fixados em RNA later para a avaliação da expressão  \ngênica dos genes selecionados. \n \n \nFigura 6 – Injeções na parede uterina durante laparotomia \n \n \n \n \n \n \n \nAnestesia e Analgesia \n \nA indução cirúrgica das lesões foi realizada após injeção intraperitoneal  \ncom quetamina associado a xilasina, sendo as doses de: 5-10mg/kg IP de xilasina \n(Lloyd Laboratories) e 90 - 120 mg/kg IP de quetamina (Fort Dodge Animal  \nHealth). Analgesia dos animais no pós -cirúrgico foi realizada com Meloxicam  \n0,2%, na dose de 5 mg/kg, via SC, uma vez ao dia, por 3 dias consecutivos,  \niniciado no pré-operatório. \n\n\n26 \n3 \n \n \n \n \nAcasalamento \n \nApós três semanas da injeção de CXCL12 ou placebo os animais dos  \nquatro grupos: Endometriose + CXCL12, Endometriose + Placebo, Sham + \nCXCL12 e Sham + Placebo, foram colocados em gaiolas com machos férteis, por \naté quatro semana, sendo 3 a 4 fêmeas e 1 macho por gaiola, perfazendo um total \nde 8 machos (1 por grupo de estudo). Após 7 dias do início do período de  \nacasalamento, as fêmeas foram pesadas em dias alternados para a identificação de \ngestação, um ganho maior ou igual 2g em 48 horas foi considerado sugestivo de  \ngestação. A curva ascendente de peso por 6 dias consecutivos confirmou a \ngestação, quando então a fêmea foi retirado da gaiola coletiva e da presença do  \nmacho e colocada em uma gaiola separada até o nasc imento. As fêmeas que não  \napresentaram sinais de gravidez após 4 semanas de acasalamento foram retiradas  \nda presença do macho, e antes de considerá-la infértil, aguardamos um período de \n7 dias para os casos de gestação iniciada nos últimos dias com o macho. \n \n \nDeterminação do ciclo estral, eutanásia e coleta do útero: \n \nDe 24 a 48 horas após o parto ou após os 7 dias separadas dos machos, as fêmeas \nforam recolocadas com o macho para um segundo acasalamento, com finalidade de  \ndesencadear a transformação endometrial para diestro. Consideramos a presença de plug \nvaginal após o coito como o dia 1 da gestação, no dia 4 foi colhida a citologia realizando- \nse flush vaginal com 10 microlitros de PBS injetados com pipeta, montados em lâmina e \nlamínula e visualizados em microscópio óptico. Confirmando o diestro (figura 7) foi  \nrealizada a eutanásia do animal seguida da histerectomia para armazenamento da amostra. \n\n27 \n3 \n \n \nOs animais que se apresentaram em outra fase estral foram acompanhados no ciclo até a \npresença de diestro. \n \n \nFigura 7 – Esfregaço vaginal para classificação estral. Diestro com predomínio de leucócitos. \n \n \n \nOs animais foram eutanasiados utilizando-se administração, por via \nintraperitoneal de sobredosagem de quetamina 300mg /kg +  xilazina 30mg/kg, após  \nalguns minutos confirma-se a perda de consciência e morte. Em seguida foi feita abertura \nda parede abdominal, liberação dos cornos uterinos e remoção do útero. O material foi  \nguardado em solução de RNA later e guardado em freezer a -80°C. \n \n \n \nSeleção dos genes alvos coativadores de Receptores de esteroides \n \n \nInicialmente foi proposto realizar a avaliação da expressão dos genes PGR \n(receptor de progesterona), CXCL12 e CXCR4, entretanto, buscávamos analisar também \noutros genes reguladores da expressão do receptor de progesterona no endométrio. \nOs genes alvos SRC-1, SRC-2 e SRC-3 foram selecionados após busca na literatura \npor genes relacionados a partir da cascata de ativação e síntese dos receptores de \nesteroides. Além disso, a associação funcional e a integração da rede biológica para estes \ncoativadores e para os genes PGR, CXCR4 e CXCL12 foram determinadas nos sites \n\n\n28 \n3 \n \n \nGeneMANIA (Warde-Farley et al., 2010) (https://genemania.org/) e STRING database  \n(v11.5 at a low confidence score (0.150) - (https://version-11-5.string- \ndb.org/cgi/network?networkId=bxS9AFSYn6mM) \n \n \n \nExtração do RNA total e síntese do cDNA \n \n \nAs amostras foram lavadas em solução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na2HPO4  \n1,11g/L; Na2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH2PO4 0,20g/L pH7,0) e armazenadas em \nRNAlater® RNA Stabilization Solution (#AM7021, Ambion, Life Technologies, USA) \na - 80°C. Após a retirada do RNA later, 50 mg de tecido foi macerado com o aparelho  \nPolytron PT 1200E (Kinematica AG, Switzerland), seguido da extração do RNA total  \nutilizando o PureLink RNA Mini Kit (#12183018A, Ambion, Thermo Fisher Scientific,  \nUSA) conforme orientações do fabricante. O RNA total foi tratado com Ambion DNA - \nfree Kit (#AM1906, Invitrogen, USA) para a remoção de contam inação por DNA. As  \nconcentrações de RNA total foram determinadas no espectrofotômetro NanoDrop 2000C \n(Thermo Fisher Scientific, USA). Um total de 99 ng RNA total foi transcrito reversamente \nutilizando o High Capacity cDNA Archive Kit (#4387406, Thermo Fisher Scientific,  \nUSA) segundo as orientações do fabricante. Posteriormente fizemos uma curva de \neficiência a fim de encontrarmos a melhor diluição, chegando à conclusão de diluição 1:4 \nem água DPC. \n \nQuantificação da expressão por PCR em tempo real (RT-qPCR) \n \n \nA quantificação relativa (RQ) para os genes alvos foi realizada através do \nTaqMan® Gene Expression Assays (≠ 4331182, Applied Biosystems, USA): SRC -1 \n(#Mm01318933_m1), SRC-2(#Mm01226633_m1), SRC-3 (Mm00500775_m1), PGR \n\n29 \n3 \n \n \n(#Mm00435628_m1), CXCR4 (#Mm01292123_m1) e CXCL12 (#Mm00445553_m1). \n \nUtilizamos para controle os genes endógenos GAPDH (#Mm99999915_g1) e PPIA \n(#Mm02342430_g1) baseado no estudo de Andrusiewicz et al., 2016. A quantificação da \nexpressão foi determinada no equipamento 7500 Fast Real Time PCR System (Applied \nBiosystems, Warrington, UK). A reação foi preparada utilizando um volume de 5.0 µL \nde TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X) (# 4444557, Applied Biosystems, USA), 0.5 \nµL of hydrolysis probe (20X) (≠ A25576, Applied Biosystems, USA), 4.5 µL of cDNA \n(diluição 1: 4), nuclease-free e água para completar o volume final de 10 µl. As amostras \nforam executadas em triplicatas com uma diferença máxima entre os valores de Ct até 0,3 \nciclos. Seguimos as orientações padrão de amplificação, sendo: primeiro ciclo 95 °C por \n20s, 40 ciclos de 95 °C por 15s e 60 °C por 20s. O RQ para cada alvo escolhido foi \ndeterminado utilizando o método 2-ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001) disponível de \nforma gratuita na plataforma da Thermo Fisher Connect. \n(https://www.thermofisher.com/br/en/home/digital-science/thermo-fisher-connect.html). \nUm pool das amostras de cDNA do grupo sham foi usada como controle e os genes \nendógenos GAPDH e PPIA também foram utilizados para normalizar os dados do CT. \nAlém disso foram testadas as eficiências de amplificação das sondas utilizando curva de \ndiluição seriada (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 and 1:32), sendo aceitas variações entre 90 e 110%. \n \n \n \nDescrição Estatística \n \n \nO cálculo do N amostral foi feito utilizando -se a calculadora do site Sealed  \nEnvelope (https://www.sealedenvelope.com/power/binary-superiority/ ), considerando a \ntaxa de gestação como desfecho clínico principal, com base em estudos anteriores do  \ngrupo em que foi verificada uma taxa de gestação de 100% nos animais do grupo sham \n\n\n30 \n3 \n \n \n(aqui considerados controle) e de 50% no grupo de endometriose induzida tratado com  \nplacebo, para um poder de teste (beta) de 80% e nível de significância (alfa) de 5%, são  \nnecessários 8 animais por grupo de estudo. \n \nRESULTADOS \n \nDesfechos clínicos \n \n \nUtilizamos modelo experimental para a indução de endometriose, totalizando 32  \nanimais operados, sendo 16 com endometriose induzida e a outra metade grupo SHAM  \n(apenas suturas na cavidade abdominal sem a implantação de tecido). As cirurgias foram \nrealizadas no departamento de Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina de  \nRibeirão Preto. Do total de animais operados tivemos perda de três animais, no pós - \noperatório precoce, provavelmente por complicações pós-cirúrgicas que não foram \nidentificadas. Como resultados (gráfico 1) obtivemos dos grupos sham uma taxa de  \ngravidez de 75% e 66,6% (ShamPl e ShamCX, respectivamente, p> 0,05). Já no grupo  \nendometriose placebo tivemos apenas 37,5% de gr avidez e após receber a injeção de  \nCXCL12 os animais com endometriose apresentaram uma elevação para 62,5% na taxa  \nde gravidez (p=0.46). Embora tenha sido um aumento clinicamente relevante nas taxas  \nde gestação, não foi estatisticamente significativo. \n\n31 \n3 \n \n \nTAXAS DE GESTAÇÃO \n(p = 0,46) \n80 \n \n70 \n \n60 \n \n50 \n \n40 \n \n30 \n \n20 \n \n10 \n \n0 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n Endometriose CX Endometriose PL Sham - CX Sham - PL \nPorcentagem 62,5 37,5 66,66 75 \n \nGráfico 1 – Taxas de gestação em relação aos diferentes grupos \n \n \nAnálise da expressão gênica \n \nFoi analisada a expressão dos genes PGR (responsável pela expressão dos \nreceptores de progesterona), CXCL12 e CXCR4 (receptor do CXCL12), bem como dos  \ncoativadores do PGR no endométrio dos animais, sendo a amostra coletada por \nhisterectomia após o reestabelecimento de ciclo estral, após o nascimento dos filhotes. O \nciclo estral foi caracterizado por coleta de citologia vaginal e a histerectomia foi realizada \nna fase de diestro (que equivaleria a fase lútea).  Os resultados desta expressão estão  \ndemonstradas na seguinte tabela 1: \n\n32 \n3 \n \n \n \n \n \nTabela 1. Expressão gênica dos genes relacionados aos receptores de progesterona e ao CXCL12: \n \n \nGRUPO \n \nGENES \n \nMÉDIA \nDESVIO \nPADRÃO \n CXCL12 1.36740 1.82551 \nSHAM CX CXCR4 1.65520 2.05750 \n SRC-1 1.70140 2.26994 \n SRC-2 1.17040 1.42124 \n SRC-3 1.30800 1.67267 \n PGR 1.18760 1.66062 \n CXCL12 0.86775 1.05237 \nSHAM PL CXCR4 1.29638 1.68596 \n SRC-1 1.07088 1.24053 \n SRC-2 0.84363 1.17552 \n SRC-3 1.38200 1.90234 \n PGR 0.40288 0.48761 \n CXCL12 0.00350 0.00321 \nENDOM. CX CXCR4 0.00583 0.00306 \n SRC-1 0.00367 0.00163 \n SRC-2 0.00167 0.0008165 \n SRC-3 0.00667 0.00327 \n PGR 0.00200 0.00126 \n \nENDOM. PL \n \nCXCL12 \n \n0.93967 \n \n1.66155 \n CXCR4 0.94744 1.51851 \n SRC-1 0.58522 0.86859 \n SRC-2 0.42778 0.64935 \n SRC-3 2.28300 4.85375 \n PGR 0.34756 0.52198 \n \n \n \n \n \nNa comparação da expressão dos genes entre os grupos estudados verificou-se que \nnão houve expressão diferencial entre os grupos Sham (placebo ou CXCL12), indicando  \nque em condições não patológicas o uso de CXCL12 não afeta a expressão dos genes \n\n33 \n3 \n \n \navaliados. Também não foi verificada expressão diferencial entre os grupos sham e o  \ngrupo endometriose tratado com placebo, indicando que a endometriose em si parece não \nafetar a expressão dos mesmos. \nJá em relação ao emprego do CXCL12 em animais com endometriose, este \nresultou em redução na expressão de todos os genes avaliados (figura 8). Sendo assim \nna expressão do PGR, o grupo Endometriose CX foi menor que nos grupos Sham \nPlacebo e Endometriose Placebo (p<0,05, para ambas as comparações). Para o gene \nCXCL12 o grupo Endometriose CX teve expressão inferior ao grupo Sham Pl (p<0,05), \nnão diferindo dos demais grupos; entretanto, a expressão do CXCR4 foi menor no grupo \nEndometriose CX em relação aos placebos tanto com endometriose como Sham (p<0,05 \npara ambos). Por fim, em relação aos coativadores, todos os SRCs (SRC-1, SRC- 2 e \nSRC-3) seguiram o mesmo padrão de expressão semelhante entre os grupos sham e o \ngrupo Endometriose Placebo, com redução da expressão no grupo Endometriose CX \n(figura 8). \n\n \n \n34 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 8. Expressão gênica dos genes em relação aos diferentes grupos. \n\n35 \n3 \n \n \nFoi realizada também a correlação de Spearman entre os genes estudados. \nInicialmente, numa tentativa de se comprovar uma correlação entre eles independente de \nintervenções ou morbidades, realizou -se a análise de correlação com todos os animais  \nestudados em conjunto (em um mesmo grupo) (Figura 9). Verificou-se haver uma \ncorrelação direta entre a expressão do gene PGR e a expressão dos genes do CXCL-12 e \ndo CXCR-4 no endométrio dos animais, com coeficientes de correlação de 0,82 \n(p<0,0001) e 0,83 (p<0,0001), respectivamente. Como esperado também houve \ncorrelação direta entre o PGR e os genes dos coativadores (SRC1, SRC2 e SRC3), sendo \nos coeficientes todos maiores que 0,8 (p<0001). \n \n \nFigura 9. Correlação entre as expressões gênicas dos genes analisados considerando-se todos os grupos \nde estudo conjuntamente. \n \n \n \nAinda considerando-se todos os grupos conjuntamente, também foi verificada a  \ncorrelação direta entre a expressão do CXCL-12 com o CXCR-4 (p<0,0001), e a \ncorrelação de ambos com todos os coativadores estudados, sendo sempre a correlação \n\n\n36 \n3 \n \n \ndireta. Por fim, a correlação entre os coativadores entre si também foi comprovada, sendo \nas correlações entre os coativadores maiores que 0,97 (p>0,0001) (tabela 2). \nAo observar as correlações entre os genes analisando-se separadamente os grupos \nde estudo, os dois grupos sham (placebo e CXCL12), mantiveram as correlações da  \navaliação global (somados todos os grupos). O grupo endometriose e placebo mantiveram \nas correlações entre CXCL12 e CXCR4 e as correlações entre estes dois com os \ncoativadores, porém o PGR perdeu a correlação com todos os genes avaliados: CXCL12, \nCXCR4 e os SRCs 1, 2 e 3 (tabela 2). \n \n \n CXCL12 CXCR4 SRC1 SRC2 SRC3 PGR \nCXCL12 1.00000 0.83414 0.8341 0.8112 0.8517 0.52697 \n  0.0052 4 1 0 0.1449 \n   0.0052 0.0080 0.0036  \nCXCR4 0.83414 1.00000 1.0000 0.9957 0.9831 0.52144 \n 0.0052  0 9 9 0.1500 \n   <.0001 <.0001 <.0001  \nSRC1 0.83414 1.00000 1.0000 0.9957 0.9831 0.52144 \n0.0052 <.0001 0 9 9 0.1500 \n    <.0001 <.0001  \nSRC2 0.81121 0.99579 0.9957 1.0000 0.9789 0.52365 \n0.0080 <.0001 9 0 1 0.1479 \n   <.0001  <.0001  \nSRC3 0.85170 0.98319 0.9831 0.9789 1.0000 0.50435 \n0.0036 <.0001 9 1 0 0.1662 \n   <.0001 <.0001   \nPGR 0.52697 0.52144 0.5214 0.5236 0.5043 1.00000 \n0.1449 0.1500 4 5 5  \n   0.1500 0.1479 0.1662  \nTabela 2. Correlação entre as expressões gênicas dos genes analisados no grupo endometriose tratado com \nplacebo \n \n \nE finalmente, quando analisadas as correlações entre os genes no grupo \nendometriose e CXCL12, além da perda da correlação entre o PGR com todos os demais \ngenes, a expressão do gene CXCL12 passou a ter correlação inversa com a expressão dos \ncoativadores SRC1, SRC2 e SRC3, sendo os coeficientes de -0,73, -0,88 e -0,73, \n\n37 \n3 \n \n \nrespectivamente (p<0,05) (tabela 3). Os coativadores mantiveram suas correlações diretas \nentre si e com o CXCR4. \n CXCL12 CXCR4 SRC1 SRC2 SRC3 PGR \nCXCL12 1.00000 -0.69825 - - - 0.29032 \n  0.1228 0.7392 0.8853 0.7392 0.5768 \n   5 6 5  \n   0.0931 0.0190 0.0931  \nCXCR4 -0.69825 1.00000 0.9856 0.9258 0.9856 -0.15179 \n0.1228  1 2 1 0.7741 \n   0.0003 0.0080 0.0003  \nSRC1 -0.73925 \n0.0931 \n0.98561 \n0.0003 \n1.0000 \n0 \n0.9393 \n4 \n1.0000 \n0 \n-0.21561 \n0.6816 \n    0.0054 <.0001  \nSRC2 -0.88536 0.92582 0.9393 1.0000 0.9393 -0.22954 \n0.0190 0.0080 4 0 4 0.6617 \n   0.0054  0.0054  \nSRC3 -0.73925 0.98561 1.0000 0.9393 1.0000 -0.21561 \n0.0931 0.0003 0 4 0 0.6816 \n   <.0001 0.0054   \nPGR 0.29032 \n0.5768 \n-0.15179 \n0.7741 \n- \n0.2156 \n- \n0.2295 \n- \n0.2156 \n1.00000 \n   1 4 1  \n   0.6816 0.6617 0.6816  \nTabela 3. Correlação entre as expressões gênicas dos genes analisados no grupo endometriose tratado com \nCXCL12 \n \n \n \n \n \n \nDISCUSSÃO \n \nNossos resultados clínicos, mesmo que sem significância estatística, \nconsideramos que foram clinicamente relevantes, uma vez que quase dobrou a taxa de  \ngestação sendo relevante no que diz respeito a melhora nos desfechos reprodutivos. \nAlém disso, esses achados confirmam a reprodução do estudo anterior, cujos  \nresultados foram compatíveis com os achados deste estudo, evidenciando uma redução  \nnas taxas de gestação em modelos de endometriose não tratados e uma melhora no grupo \ntratado com o CXCL12 (Rosa e Silva et al., 2022). \n\n38 \n3 \n \n \nInicialmente o CXCL12 foi proposto no estudo de Rosa e Silva e colabor adores \ncom o intuito de atrair células troncos da medula para o endométrio a fim de melhorar a  \nqualidade endometrial, uma vez que foi demonstrado por Sakr et al (2014), que há uma  \nredução da migração de células tronco da medula para o endométrio tópico de \ncamundongos com endometriose, com migração preferencial destas células para os focos \nde lesão. Sendo o CXCL-12 um quimiotático de células tronco, acreditava -se que a  \ninfusão desta substância diretamente nos cornos uterinos recuperaria a migração para o  \nendométrio e melhoraria as taxas de gestação reduzida nestes animais. Entretanto, apesar \nde conseguir recuperar, ao menos parcialmente as taxas de gestação, não foi possível  \ncomprovar o maior influxo destas células para o útero (Rosa e Silva et al, 2022). Dua s \nseriam as possíveis explicações para estes achados: 1. o tempo entre a histerectomia e a  \ninjeção de CXCL12 foi muito longo e intermediado por uma gestação que poderia ter  \nconsumido estas células incorporando -as na placenta dequitada ou 2. o mecanismo de  \nação do CXCL12 sobre a expressão dos receptores de progesterona no endométrio não foi \nmediado por células tronco, havendo possibilidade de um efeito local direto. Com este  \nracional, este presente estudo propôs tentar esclarecer algumas questões relacionadas com \no mecanismo de ação do CXCL12 na expressão. \nNo estudo de Rosa e Silva e colaboradores foi verificado que o aumento nas taxas \nde gestação no grupo endometriose tratado com o CXCL12 se associou ao aumento dos  \nreceptores de progesterona e também ao aumento das integrinas αVβ3 no endométrio  \ntópico dos animais, havendo inclusive uma proporcionalidade entre as taxas de gestação  \ne a expressão dos receptores de progesterona. Por esse motivo aventou-se a possibilidade \nde um efeito do CXCL12 direto sobre o endométrio. Na tentativa de encontrar o \nmecanismo pelo qual o tratamento com o CXCL12 promoveu o aumento dos receptores  \nde progesterona e integrinas, optamos por verificar a expressão de alguns genes ligados \n\n39 \n3 \n \n \nà estes receptores, em especia l ao receptor de progesterona. A hipótese era de que o  \nCXCL12 poderia ter influenciado no aumento da proteína de receptor de progesterona  \nendometrial e esse aumento se correlaciona com a melhora nas taxas de gestação. \nSendo assim, a busca foi realizada na  literatura e também no site GeneMANIA  \n(Warde-Farley et al., 2010) (https://genemania.org/) e STRING database v11.5 at a low  \nconfidence score (0.150) (see in https://version-11-5.string- \ndb.org/cgi/network?networkId=bxS9AFSYn6mM) (Szklarczk et al., 2019) .  Os genes  \nescolhidos foram o SRC-1, SRC-2 e SRC-3. \nA expressão dos genes estudados foi semelhante entre os grupos sham placebo,  \nsham CXCL12 e Endometriose placebo, inclusive os genes PGR e seus coativadores SRC- \n1, SRC-1 e SRC-3. Com base no achado imunohi stoquímico, a expectativa era de que o  \ngene PGR estivesse hiperexpresso, uma vez que o receptor está mais expresso no \nendométrio, porém, deve haver um mecanismo de regulação intermediário ou a via  \nativada para o aumento do receptor de progesterona deve ser distinta da escolhida. \nA resistência à progesterona na endometriose já vem sendo discutida por \ndiferentes autores, no estudo de Arafah et al., 2021) e foi demonstrado que o endométrio \neutópico de mulheres portadoras de endometriose passa por alterações que se relacionam \ncom células inflamatórias e imunológicas, afetando de forma negativa a receptividade  \nendometrial e contribuindo ao desenvolvimento da resistência à progesterona (Arafah et  \nal., 2021) No tecido endometrial normal este hormônio inibe a atividade estrogênica que \nacaba por promover a atrofia do endométrio, entretanto, havendo resistência à ação da  \nprogesterona ocorre uma tendência ao efeito inverso. Os receptores de progesterona A e  \nB (PRA e PRB) são responsáveis pela transcrição de proteínas expressas no tecido  \nendometrial, porém no tecido endometriótico há transcrição somente de proteínas \n\n40 \n3 \n \n \ntranscritas pelo PRA, o que parece promover alterações na resposta final da progesterona \n(Attia, Edwards et al. 2000; Reis, Lhullier et al. 2005). \nTendo a expressão deste receptor semelhante entre os grupos sham e o grupo  \nEndometriose Placebo, poderíamos supor que pode haver genes reguladores com \nexpressão alterada ou interações anormais pela presença da doença. Verificamos que a  \nexpressão dos demais genes escolhidos são semelhantes entre estes grupos também, o que \nfaz presumir que os genes envolvidos nesta regulação são outros. Ao analisar a correlação \nentre estes genes, houve forte correlação positiva entre eles no grupo sham. Porém nos  \ngrupos endometriose houve a perda de todas as correlações da expressão do PGR com os \ndemais genes, independente de receber tratamento ou placebo. Na Endometriose Placebo \nas correlações entre CXCL12 e o CXCR4 e do CXCL12 com os coativadores do PGR \nestão preservadas; bem como a correlação dos coativadores entre si. \nJá no grupo Endometriose CX não só houve perda das correlações do PGR com todos os \noutros genes, como também o CXCL12 perdeu sua correlação com o seu receptor CXCR4 \ne passou a haver correlação i nversa do CXCL12 com os coativadores. É provável que o  \ngrande influxo de CXCL12 banhando o tecido uterino reduziu a necessidade da expressão \npara a produção local do mesmo e reduziu a necessidade de expor seus receptores  \n(CXCR4). Verifica-se então que existe um grande impacto do CXCL12 sobre a expressão \nde genes ligados às vias da progesterona sugerindo assim um papel do CXCL12 na \nmelhora das taxas de gestação e aumento da expressão de receptores de progesterona no  \nendométrio, interferindo nos mecanismos reguladores da expressão dos receptores \ndeprogesterona. \nHá uma relação entre o coativador SRC-1 e o quimiotático CXC12, onde esse \núltimo é regulado pelo estrogênio e tem a sua produção aumentada em tecidos ectópicos, \nimpactando negativamente para a progressão da endometriose (Shi et al., 2014). \n\n41 \n3 \n \n \nOs coativadores são responsáveis pela atividade transcricional de uma variedade  \nde receptores nucleares, tendo preferência pelo receptor de progesterona (Szwarc et al.,  \n2015). Ao investigar os papeis de SRC-1 e SRC-2 na expressão do CXCL12 eles \nencontraram a estimulação da produção de CXCL12 pelo estrogênio e também por outro \nlado a inibição de sua expressão pela progesterona. Através da técnica de silenciamento  \nbaseada em siRNA, foi demonstr ado que há uma diminuição da expressão de CXCL12 \nquando o coativador SRC-1 está comprometido. Apontando para um relação direta entre  \nesses dois. E também a progesterona consegue inibir a produção de CXCL12 de maneira \ndependente do SRC-2 (Shi et al., 2014). \nA confirmação das correlações entre os genes selecionados em nosso estudo  \nlevanta a importância da relação deles no que se refere tanto ao que diz respeito a  \nendometriose e também aos desfechos reprodutivos, visto que eles estão implicados em  \nambos. Estudos futuros são necessários a fim de que levando em consideração o impacto \ne relação dos coativadores na expressão do CXCL12 induzida pelo estrogênio, possa ser  \nbenéfico e acrescentar para a melhora e correções da resistência a progesterona. Vimos  \nque não só a transcrição mediada pela progesterona requer o coativador SRC-2 para lançar \numa resposta decidual completa, mas também outros coativadores são necessários \n(Mukherjee et al., 2006). Considerando os nossos achados onde foi apresentada forte  \ncorrelações entre os genes, não descarta a hipótese de que o CXCL12 poderia se comportar \ncom um coativador adjuvante. A identificação de mecanismos reguladores da expressão  \nde moléculas ligadas ao processo de preparo de endométrio para a implantação tem  \ngrande importância para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas em situações de  \ndoença que afetam diretamente a receptividade endometrial e a implantação. A \nendometriose parece estar associada a menores taxas de implantação em ciclos de \nreprodução assistida, entretanto, os mecanismos exatos e as moléculas envolvidas neste \n\n42 \n3 \n \n \nprocesso ainda não estão bem definidos. A literatura sobre o assunto tem sugerido uma  \nredução da concentração de receptores de progesterona no endométrio tópico de \nindivíduos com endometriose, que acompanha de resistência à ação deste hormônio.  \nSendo a progesterona um elemento imprescindível para o adequado desenvolvimento  \nendometrial pré-implantacão, este poderia ser um dos motivos que justificariam a redução \nna receptividade endometrial na presença de endometriose. A literatura tem descrito  \nsistematicamente um efeito regulador da progesterona sobre a expressão do CXCL12 em \ndiferentes tecidos, entretanto, não há a informação inversa sobre um potencial efeito do  \nCXCL12 sobre a expressão de receptores de progesterona. A confirmação de um efeito  \ndo CXCL12 na correção da resistência à ação da progesterona em indivíduos com  \nendometriose abre uma possibilidade de nova opção terapêutica para mulheres com  \ninfertilidade associada à endometriose, com objetivo de melhorar resultados reprodutivos. \n \n \n \nCONCLUSÃO \n \n \nNeste presente estudo, o emprego de CXCL12 aplicado diretamente no útero de \ncamundongos fêmea com endometriose induzida promoveu a supressão da expressão de  \ngenes ligados à via da progesterona, tais como PGR e seus coativadores SRC1, SCR2 e \nSCR3. \nExiste uma correlação positiva entre a expressão do PGR com o CXCL12 e seu receptor \nCXCR4 no endométrio de animais com e sem endometriose induzida, a qual é perdida  \napós a injeção de CXCL12. \nA presença de endometriose promoveu a perda da correlação do PGR com o CXCL12 e \ncom seus coativadores. \n\n43 \n3 \n \n \nA injeção de CXCL12 diretamente no útero de animais com endometriose, levou à  \ninversão da correlação na expressão do gene do CXCL12 com os coativadores do PGR \n(SCR1, SCR2 e SCR3). \n \n \n \n- \n\n44 \n3 \n \n \nREFERÊNCIAS \n \nAghajanova L, Hamilton AE, Giudice LC (2008) Uterine receptivity to human embryonic \nimplantation: histology, biomarkers, and transcriptomics. 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