{"paper_id":"5f645378-606b-4083-bd72-75ef4844cd01","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nPROLIFERAÇÃO E APOPTOSE EM ENDOMÉTRIO \nTÓPICO E ECTÓPICO DE PACIENTES COM \nENDOMETRIOSE PERITONEAL, OV ARIANA E DE \nSEPTO RETO-VAGINAL \nFlávia Maciel de Aguiar \nRIBEIRÃO PRETO - SP \n2007 \n\nFlávia Maciel de Aguiar \nPROLIFERAÇÃO E APOPTOSE EM ENDOMÉTRIO \nTÓPICO E ECTÓPICO DE PACIENTES COM \nENDOMETRIOSE PERITONEAL, OV ARIANA E DE \nSEPTO RETO-VAGINAL \nDissertação de Mestrado apresentada à \nFaculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto da Universidade de São Preto para \nobtenção do título de Mestre em \nMedicina, Área de concentração -\nGinecologia e Obstetrícia \nOrientador: Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani \nRIBEIRÃO PRETO - SP \n2007 \n\nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \nAguiar, Flávia Maciel de. \nProliferação celular e apoptose em endométrio tópico e ectópico de \npacientes com endometriose peritoneal, ovariana e de septo reto-vaginal, \nRibeirão Preto, 2007. \n72p. : il. ; 29,7cm \nTese de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto/USP -Área de concentração: Tocoginecologia. \nOrientador: F erriani, Rui Alberto \n1. Endometriose, 2. Endométrio, 3. Proliferação celular,\n4. Apoptose, 5. PCNA, 6.fas.\n\nDEDICO ESTE TRABALHO: \n\"Àquele que é poderoso para fazer tudo muito mais abundantemente além daquilo que \npedimos ou pensamos, segundo o poder que em nós opera, à Ele seja a glória .... \" \n(Ef.3:20-21). \nÁ Beatrice e Nelson, exemplos de integridade e caráter, pai zelosos e amorosos, pilares \nde uma família unida e feliz. Devo tudo a vocês!!!! \n\nAGRADECIMENTOS \nAo meu orientador Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani, pela oportunidade de aprender e \ntrabalhar com pesquisa científica, pelas portas abertas sempre, pelo exemplo de \ncapacidade, integridade, ousadia e espírito de liderança. \nAo Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia, por nos ter aberto o seu laboratório com \nsimpatia, nos ajudando no entendimento das técnicas de imunohistoquímica, além de \nter-nos auxiliado com suas preciosas colaborações. A funcionária Rose do laboratório \nde Patologia, pela ajuda e amizade. \nAo Prof Dr. Maurício Abrão pela presença e inestimável colaboração. É uma \nhonra ter em minha banca uma sumidade em endometriose. Minha admiração sempre! \nÀs mulheres que gentilmente se propuseram a participar deste estudo. Sem vocês \neste trabalho não se realizaria. \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto, por ter-me acolhido em 2001 e propiciado meios para o meu \ndesenvolvimento profissional e agora também científico, casa querida e amada, de onde \nsempre levarei as mais doces lembranças. A todos os docentes e funcionários, meu \nmuito obrigado. \nÀ Comissão de Pós-graduação em Tocoginecologia, pela oportunidade de fazer \neste mestrado. Sinto-me muito orgulhosa de pertencer a uma casa tão conceituada e \nprimorosa. Um carinho especial para Ilza e Taisa. \nMinha especial gratidão ao Dr. Júlio César Rosa Sá e Silva, amigo querido, \nprofissional brilhante, meu tutor em quem me espelho. Seu estímulo constante e sua \ninestimável ajuda me levaram adiante nos momentos de desânimo. Muito obrigada!! \n\nAos amigos queridos do departamento de Ginecologia que sempre me ajudaram \nem tudo. Um especial agradecimento à: Ana Carolina Sá, Carol Sales, Well, Lauriane, \nMarianinha, Elaine. \nAo meus amigos pessoais que me sustentaram aqui em Ribeirão Preto, se \ntomando uma família pra mim: Claudinha, Conrado, Flavia Raquel, Renato, Maria Rita, \nSterania, Luciana, Daniela, Nelson Sato, Ed Kauss, Daniela de Curitiba. \nAs minhas amigas de Vitória, que sempre me apoiaram em tudo: Camilinha, \nKarol, Fabiana e Renata. \nA minha querida dupla de trabalho Alexandre que sempre me ajudou e apoiou \nem tudo, com quem aprendo a cada dia. Admiro muito você!!! \nAos meus companheiros de trabalho da Clínica Mater Bella (Dra. Patrícia, Ora. \nLetícia, Dra. Rosângela, Dr. Fernando, Dr. Simão (anestesista)) e às minhas secretárias \nMarcinha e Carol, sempre prontos a ajudar. \nAos meus irmãos preciosos da Primeira Igreja Batista de Ribeirão Preto e em \nespecial à amiga Renatinha, fonte de conselhos maravilhosos e um pilar de oração pra \nmim. \nÀ minha vovó Ely, meus irmãos Nelsinho, Fernanda e Thiago, cunhadas Lílian e \nKarol, cunhado Aloyr e sobrinhas Bia e Malu que, mesmo morando tão longe, torcem e \nse orgulham de mim. Amo vocês e sinto por vocês não poderem estar aqui neste dia \nespecial. \nA todos que, direta ou indiretamente colaboraram com este trabalho. \n\nSUMÁRIO \nLISTA DE FIGURAS \nLISTA DE TABELAS \nLISTA DE ABREVIATURAS \nRESUMO \nSUMMARY \n1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1 \n1.1 Conceito .................................................................................................................. 2 \n1.2 Patogenia ................................................................................................................. 4 \n1.2.1 Proliferação Celular e Apoptose - a Homeostase Tecidual.. ......................... 6 \n1.2.1.1 - Proliferação Celular ......................................................................... 7 \n1.2.1.2 - Apoptose celular .............................................................................. 8 \n1.2.2 - Como as células endometriais refluídas aderem ao peritônio pélvico ....... 15 \n1.2.3 - Como as células endometriais aderidas invadem a MEC .......................... 15 \n1.2.4 - Como os novos implantes crescem e sobrevivem ..................................... 16 \n1.2.5 - O sistema imune ........................................................................................ 17 \n1.2.6 - Estresse Oxidativo ..................................................................................... 21 \n1.2. 7 - Os fatores hormonais na gênese da endornetriose ..................................... 23 \n1.2.8 - Marcadores séricos e Regulação Gênica na Endornetriose ....................... 25 \n2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 28 \n3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 30 \n3 .1 Material ................................................................................................................. 31 \n3.2 Método Imunohistoquírnico .................................................................................. 32 \n3 .2 .1 : Marcadores Imunohistoquímicos ................................................................ 3 2 \n3.2.2: Técnica de Imunohistoquímica ................................................................... 32 \n\n3.3 - Critérios de avaliação imunohistoquímica ......................................................... 33 \n3.4 - Análise estatística ............................................................................................... 34 \n4. RESULTADOS ......................................................................................................... 35 \n4.1 Avaliação do Índice de Proliferação Celular (IPC) .............................................. 36 \n4.1.1 -Tecido Glandular ....................................................................................... 36 \n4.1.2 - Tecido Estromal ........................................................................................ 36 \n4.2 Avaliação do Índice Apoptótico (IA) ................................................................... 38 \n4.2.1 -Tecido Glandular. ...................................................................................... 38 \n4.2.2 - Tecido Estromal ......................................................................................... 39 \n5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 43 \nProliferação Celular .................................................................................................... 44 \nApoptose ..................................................................................................................... 4 7 \n6. CONCLUSÕES ......................................................................................................... 50 \n7. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 52 \nANEXOS ........................................................................................................................ 68 \n\nLISTA DE FIGURAS \nFigura 1: Esquema do processo de ativação da apoptose pela via dos receptores /as-fasL \ne pela via mitocondrial .................................................................................................... 11 \nFigura 2: Possíveis alterações fisiopatológicas na cavidade peritoneal de mulheres com \nendometriose. O endométrio anormal da endometriose em ROS ( espécies reativas de \noxigênio), antioxidantes, metaloproteinases e seus inibidores (MMPs e TIMPs). \n(adaptado de Wu & Ho, 2003) ........................................................................................ 21 \nFigura 3: Mecanismo de estresse oxidativo na endometriose. (adaptado de \nLangendonckt et ai, 2002 ................................................................................................ 23 \nFigura 4: Marcação com PCNA em tecido glandular (setas) -aumento de 400 x ......... 38 \nFigura 5: Marcação pelo/as em glândula (setas)- aumento de 400 x ........................... 42 \n\nLISTA DE TABELAS \nTabela 1 - Resultado do IPC nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos- GLÂNDULA ....................... 37 \nTabela 2 - Resultado do IPC nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos-ESTROMA .......................... 37 \nTabela 3 - Resultado do IA nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos - GLÂNDULA ....................... 41 \nTabela 4 - Resultado do IA nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos - ESTROMA .......................... 41 \n\nLISTA DE ABREVIATURAS \nCO - dióxido de carbono \nDISC - Death Inducing Signalling Complex \nER - receptores estrogênicos \nEGF - fator de crescimento epidérmico \nENDO-1- Proteína Endometriose -1 \nF ADD - Fas-associated death domain \nFGF - fator de crescimento de fibroblastos \nfas- fasL - fas-fas Ligante \nIA - Índice Apoptótico \nICAM - moléculas de adesão intracelular \nIL - interleucina \nIPC- Índice de Proliferação Celular \nHSP - Heat shok proteins \nLF A-1 - antígeno de função leucocitário \nMEC - matriz extra celular \nMMPs - metaloproteases \nNK - Natural Killer\nNO - óxido nítrico \nNOS - óxido nítrico sintase \nPCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen \nPCR - proteína C reativa \nPCR - polymerase chain reaction \nPDGF - fator de crescimento derivado das plaquetas \n\nPGE2 - prostaglandina E2 \nPR -receptores progestagênicos \nROS -espécies reativas de oxigênio \nSAA -proteína sérica amilóide A \ns-ICAM -moléculas de adesão intracelular -solúveis\nTIMPs-tissue inhibitors of metalloproteases \nTNF-a - fator de necrose tumoral - a \nTUNEL -TdT - mediated dUTP - biotin nick end - labelling \nVEGF- Vascular Endothe/ial Growth Factor \nv-FLIP -F ADD-like ICE inhibitory proteins\n17 p - HSD -17 P- hidroxiesteróide desidrogenase \n\nRESUMO \n\nRESUMO \nAguiar FM. Proliferação e Apoptose em endométrio tópico e ectópico de pacientes \ncom endometriose peritoneal, ovariana e de septo reto-vaginal. Dissertação de \nMestrado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, \nRibeirão Preto. \nTanto o endométrio tópico quanto o ectópico de mulheres com endometriose exibem \numa série de anormalidades. A importância da proliferação celular e da apoptose na \ngênese da endometriose vem sendo estudada, mas os resultados ainda são controversos. \nO objetivo desse estudo foi comparar o padrão de proliferação celular e de apoptose no \nendométrio tópico e ectópico de pacientes com endometriose, avaliando separadamente \nas lesões peritoneais, os endometriomas ovarianos e as lesões de septo reto-vaginal. \nFoi avaliada a expressão do marcador de proliferação celular PCNA e o marcador de \napoptose fas em 22 amostras de endométrio tópico e ectópico de mulheres com \nendometriose, na fase proliferativa do ciclo menstrual (lesão peritoneal = 6 casos; lesão \novariana = 10 casos; lesão de septo reto-vaginal = 6 casos), avaliando separadamente \ntecido glandular e estromal. \nFoi observado maior índice de proliferação celular (IPC) no componente glandular do \ntecido endometrial ectópico quando comparado ao tópico (0,12 ± 0,04 e 0,18 ± 0,06, \nrespectivamente) (p= 0,034). No tecido ectópico, foi observado maior IPC na lesão \nperitoneal quando comparada somente com a lesão de septo reto-vaginal (0,14 ± 0,07 e \n0,01 ± 0,01, respectivamente) (p=0,009). Na avaliação do estroma, encontramos \nmaiores IPC no tecido tópico do que no ectópico (0,05 ± 0,01 e 0,02 ± 0,01, \nrespectivamente) (p= 0,01). O estroma do endométrio tópico das lesões peritoneais \napresentou maior IPC que o correspondente da lesão ovariana (0,09 ± 0,02 e 0,04 ± \n\n0,01, respectivamente) (p= 0,04). Não foi observado diferença na expressão do \nmarcador fas entre o endométrio tópico e ectópico, ou entre as diversas lesões \nendometrióticas. \nOs resultados confirmam a participação de mecanismos de proliferação celular na \ngênese da endometriose, com especial importância nas lesões peritoneais, reforçando a \nteoria de que estas lesões sofrem regulação distinta dos seus mecanismos intrínsecos de \ncrescimento e manutenção. A via de apoptose relacionada às proteínas de membrana da \nfamília do faslfas-L parece não ser importante, mas futuros trabalhos são necessários \npara confirmar estes dados. \nPalavras-chave: Endometriose, endométrio, proliferação celular, apoptose, PCNA,fas. \n\nSUMMARY \n\nSUMMARY \nAguiar FM. Proliferation and apoptosis in eutopic and ectopic endometrium from \npatients with peritoneal, ovarian and rectovaginal septum endometriosis. Master \nTese - Ribeirão Preto Medical School Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. \nEctopic and eutopic endometrium of women with endometriosis show a variety of \nanomalies. Different studies have been performed to evaluate cell proliferation and \napoptosis in endornetriosis, but results are still controversial. ln the present study we \naimed to compare cell proliferation and apoptosis pattems in eutopic and ectopic \nendometriurn in women suffering from endometriosis, evaluating separately peritoneal, \novarian and rectovaginal septum endometriosis. Here we studied the expression of cell \nproliferation protein PCNA and apoptosis protein fas in 22 proliferative eutopic and \nectopic endometrium (peritoneal=6 cases; ovarian = 1 O cases and rectovaginal septum = \n6 cases), evaluating separately glandular and stromal cells. \nEvaluating PCNA in glandular cells, the mean proliferation cell índex (PCI) was \nsignificantly greater in ectopic tissue compared with eutopic (0,12 ± 0,04 and 0,18 ± \n0,06, respectively) (p= 0,034). Peritoneal endometriosis showed higher PCI than in \nrectovaginal septum endometriosis (0,09 ± 0,01 and 0,13 ± 0,07, respectively) \n(p=0,009). PCI in stromal endometriurn was higher in eutopic endometrium than in \nectopic endometrium (0,05 ± 0,01; and 0,02 ± 0,01, respectively) (p: 0,01). The stromal \ncells of the eutopic endometrium in peritoneal lesions showed higher PCI than in \novarian lesions (0,09 ± 0,02 e 0,04 ± 0,01, respectively) (p= 0,04). No significant \ndifference in expression of fas was seen between eutopic and ectopic endometrium, or \nbetween the three different endometriotic lesions. This study confirms the role of cell \n\nproliferation in endometriosis, in special in peritoneal endometriosis. These data \nreinforce the concept that endometriotic lesions have different growth and maintenance \nprofiles. According with our data, the apoptotic pathway related withfasifas-L system is \nnot important in the physiopathology of endometriosis. We need future data to confinn \nour finds. \nKey-words: endometrium, endometriosis, cell proliferation, apoptosis, PCNA, Fas. \n\n1. INTRODUÇÃO\n\n2 \n1.1 Conceito \nA endometriose se caracteriza pela presença de tecido endometrial ectópico, ou \nseja, fora da cavidade endometrial. Sua incidência é controversa devido ao grande \nnúmero de casos não diagnosticados e devido à grande variação de acordo com a \npopulação estudada, sofrendo influência da idade, grau de instrução, presença de \ncirurgias abdomino-pélvicas prévias, padrão hormonal, entre outros fatores, mas \nacredita-se que cerca de 10% da população feminina global seja portadora de \nendometriose (Dabrosin et ai, 2002) e que 50% das pacientes com infertilidade e dor \npélvica tenham endometriose (Comillie et ai, 1990). \nAs repercussões clínicas desta patologia são extremamente variáveis e dependem \nda gravidade da endometriose e do local afetado. A dor pélvica crônica é bastante \ncomum e é uma das maiores preocupações do ginecologista, visto que muitas vezes é \nincapacitante, com grave interferência na rotina da paciente e na qualidade de vida \n(Whiteside & Falcone, 2003; Falconnier & Chapron, 2005). Em casos severos a \nendometriose pode invadir tecidos de maneira mais profunda e produzir lesões de \nórgãos circunjacentes com comprometimento de alguns sistemas, corno invasão de reto \ne sigmóide, com necessidade de reto-sigmoidectomia, e até mesmo de vasos pélvicos \ncalibrosos, corno a artéria uterina, com risco de vida para a paciente (Janicki et a!,\n2002). \nA associação entre endornetriose e infertilidade é inequívoca (Wheeler & \nMalinak, 1988; Wheeler, 1989). Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda não estão \ntotalmente esclarecidos. É facilmente explicável sua relação com endometriose quando \nhá alteração da anatomia normal de estruturas pélvicas (Seibel & Zilberstein, 1998; \nSurrey & Halme, 1989). Todavia, quando isto não ocorre, como nos casos de \n\n3 \nendometriose mínima e leve, encontra-se dificuldade para explicá-la. Neste caso, os \nmecanismos propostos compreendem: ( 1) alterações no microambiente folicular ou no \noócito; (2) falência na implantação; (3) disfunção ovulatória; (4) defeitos imunológicos \ninclusive relacionados a processo auto-imune; (5) hiperativação dos macrófagos \nperitoneais (Wu & Ho et ai, 2003); (6) alterações nas citocinas no fluido folicular e na \ncirculação sanguínea; (7) síndrome do folículo luteinizado não roto; (8) alterações no \ndesenvolvimento embrionário precoce; (9) apoptose celular aumentada em células da \ngranulosa; e (1 O) alterações endócrinas como fase lútea inadequada e hiperprolactinemia \n(Moura et ai, 1999). Estima-se que entre 30 e 50% das mulheres com endometriose \ntenham infertilidade, e que, até 58% das pacientes inférteis tenham endometriose em \nseus graus variados (Wheeler et ai, 1989). \nCada vez mais busca-se entender os mecanismos etiopatogenéticos da \nendometriose, visando o desenvolvimento de novas drogas e abordagens terapêuticas, \npermitindo maior qualidade de vida e cura a estas mulheres. \n\n4 \n1.2 Patogenia \nA etiopatogenia da endometriose não está muito bem estabelecida embora venha \nsendo alvo de estudos em todos os campos de pesquisa. A teoria mais aceita para a \netiologia da endometriose é a postulada por Sampson em 1927, que acreditava que as \nlesões endometrióticas surgiriam de aderências de tecido endometrial pós-menstrual na \ncavidade peritoneal e demais órgãos após fluxo tubário retrógrado (Sampson et ai, \n1927). Mas, apesar da teoria encontrar fundamento, há falhas em alguns pontos, como, \npor exemplo, a comprovação de que praticamente 90% das mulheres que têm trompas \npérvias apresentam fluxo retrógrado e, no entanto, a maioria não apresenta \nendometriose (Halme et ai, 1984; Abrão et ai, 2000). Em vista disso, fica clara a \nimportância de outros fatores além do fluxo retrógrado que permitam a implantação \ndeste tecido na cavidade peritoneal. \nOs estudos atuais se propõem a estudar as alterações moleculares tanto no \nendométrio tópico quanto no microambiente peritoneal que favorecem a formação das \nlesões endometrióticas. Parece que ambos encontram-se alterados, permitindo adesão, \ninvasão, proliferação e crescimento das lesões. \nOutras teorias tentam explicar a presença de lesões de endometriose fora da \ncavidade peritoneal. A metaplasia das células da linhagem peritoneal explica a \nendometriose em homens (Schrodt et ai,· 1980), em pré-púberes (Clark, 1948) em \nmulheres que nunca menstruaram (El-Mahgoub et al,1980) e em sítios atípicos, como \ncavidade pleural (Hobbs et ai, 1940). A constatação da presença de células endometriais \nviáveis na luz de vasos sanguíneos e linfáticos sugere que focos distantes de \nendometriose podem surgir a partir da disseminação de células endometriais por via \n\n5 \nhematogênica ou linfática. Esta teoria explica lesões na pleura, cicatriz umbilical, \nespaço retro-peritoneal, vagina e colo do útero (Sampson, 1927; Javert, 1952). \nA endometriose é uma doença complexa, com múltiplas manifestações e \ndiferentes formas de apresentação. De acordo com Nisolle & Donnez, 1997, a \nendometriose peritoneal, o endometrioma ovariano e a endometriose de septo reto­\nvaginal podem ser consideradas três entidades diferentes, com origens etiopatogênicas e \ncomportamentos clínicos diferentes. \nA principal teoria para a gênese da endometriose peritoneal é a implantação direta \nde células menstruais refluídas na superficie peritoneal. Essa hipótese é corroborada por \nestudos morfométricos que sugerem que as lesões peritoneais vermelhas e o endométrio \ntópico são tecidos muito similares, podendo corresponder a células implantadas \nrecentemente (Nisolle & Donnez, 1997). Laparoscopicamente são divididas em lesões \nvermelhas ( em chama de vela, excrescências glandulares, lesões petequiais e áreas de \nhipervascularização) e lesões brancas ( opacificações brancas, aderências sub-ovarianas, \nlesões tipo \"café-com-leite\" e defeitos peritoneais) (Abrão, 2000). As lesões vermelhas \nsão mais vascularizadas e apresentam maior índice mitótico que as lesões brancas \n(Nisolle et ai, 1993); provavelmente o aspecto macroscópico corresponde a um \nprocesso evolutivo das lesões, sendo que as vermelhas indicariam um primeiro estádio \nde implantação peritoneal, apresentando maior poder de invasão. Com o sangramento \nmenstrual sucessivo, o endométrio ectópico descama e inicia-se uma reação \ninflamatória, produzindo um processo de cicatrização, podendo deformar o peritônio e \nresultar na formação de aderências (Nisolle et ai, 1994). \nPara a formação do endometrioma ovariano, existem três teorias: o acúmulo de \ndebris menstruais e posterior invaginação e inversão do córtex para o interior do ovário, \nformando o cisto endometriótico (Hughesdon, 1957); por envolvimento secundário de \n\n6 \ncistos funcionais por implantes localizados na superficie do ovário, ou por metaplasia \ncelômica nos cistos de inclusão ovariano (Donnez & Nisolle, 1996). \nA endometriose de septo reto-vaginal é uma das formas mais profundas da \ndoença, podendo ter bases fisiopatogênicas distintas das demais lesões. \nHistologicamente, é composta essencialmente por células musculares, epitélio ativo e \nestroma escasso. A hiperplasia destas células musculares provoca reação inflamatória, \nretração e fibrose nos tecidos adjacentes. Para explicar a endometriose de septo reto­\nvaginal, duas teorias foram propostas: ou trata-se de metaplasia de remanescentes \nmullerianos daquela musculatura em glândulas e/ou estroma que formariam nódulos \nlocais ou é a evolução natural de uma endometriose peritoneal que invadiu o septo reto­\nvaginal (Nisolle & Donnez, 1997). \nSomente uma teoria não é capaz de explicar a totalidade dos casos de \nendometriose. Vários aspectos da patogenia da endometriose permanecem obscuros, \nsendo necessário um aprofundamento no entendimento de todos os fatores envolvidos \nna formação das lesões endometrióticas e na diferenciação destes três tipos de lesão. \n1.2.1 -Proliferação Celular e Apoptose - a Homeostase Tecidual \nA \"homeostase tecidual\" normalmente é produto de um equilíbrio entre \nmecanismos de destruição ou degradação celular ( apoptose) e de proliferação celular. A \napoptose, que ocorre na fase secretória e no período menstrual do ciclo feminino, é um \ndos processos cruciais no controle do turn-over celular no endométrio (Otsuki et al, \n1994). \nO ciclo de crescimento de uma célula consiste nas fases G 1 (pré-síntese), S \n(síntese do DNA), 02 (pré-mitótico), M (mitose) e GO (estado quiescente). Inúmeros \n\n7 \nfatores podem estimular ou inibir a divisão e a morte celular, dependendo das \nnecessidades da célula adaptar-se ao meio ambiente. Na endometriose, parece haver um \ndesequilíbrio nesta homeostase, com maior proliferação celular nas lesões \nendometrióticas e menor apoptose, aumentando a viabilidade das lesões e, portanto, \npermitindo a sobrevivência e crescimentos das mesmas (Fujishita et ai, 1999; Dmowski \net ai, 2001; Braun et ai., 2002). \nEstudos mais recentes utilizando drogas bloqueadoras da proliferação celular ou \nindutoras de apoptose têm provado a importância destes mecanismos na etiopatogenia \ndestas lesões, e aberto novas perspectivas para futuras intervenções terapêuticas. \n1.2.1.1 - Proliferação Celular \nEm relação ao comportamento do endométrio tópico de mulheres com \nendometriose, alguns estudos mostram maiores índices de proliferação celular, mas \nsomente na fase proliferativa do ciclo menstrual, tanto no tecido glandular quanto \nestromal (Shuang-fang Li, 1993; Wingfield et ai, 1995; Johnson et ai, 2005; Buriev et \nal, 2006), porém outros trabalhos não encontraram diferenças significantes (Jurgensen \nA, 1996; Scotti S, 2000; Beliard et al, 2004;). \nO comportamento das lesões endometrióticas em relação à proliferação celular \ntambém ainda não é de todo conhecido. Um dos estudos pioneiros foi o de Shuan-fang \nLi, 1993, que encontrou maior IPC através de PCNA no tecido glandular das lesões \nendometrióticas, ao longo de todo ciclo menstrual. Ao contrário, outros estudos não \nmostram diferenças entre os endométrios tópicos e ectópicos, ou mesmo mostram \nmenor proliferação no tecido ectópico, tanto no tecido glandular quanto no estroma. \nOutra característica observada no tecido ectópico é a perda de variação ao longo do \n\n8 \nciclo menstrual (Jones et ai, 1995; Nisolle et ai, 1997; Scotti et ai, 2000; Beliard et ai, \n2004). \nNovas drogas com ação anti-proliferativa vêm sendo testadas in vitro, com \nresultados promissores. Laschke, 2006, estudou a ação da rapamicina, um conhecido \nanti-fúngico e imunossupressor, em lesões endometrióticas induzidas em hamsters. A \nadministração desta droga resultou na redução do tamanho das lesões, associado a uma \nredução na produção de VEGF e menor marcação celular pelo PCNA (Laschke et ai, \n2006). O efeito das estatinas também foi avaliado em células endometrióticas estromais \nem meio de cultura, sendo observado redução da proliferação celular após \nadministração da droga (Piotrowski et ai, 2006). \nFuturamente, drogas que atuam nos mecanismos de controle da proliferação \ncelular poderão ser utilizadas in vivo, alargando as opções terapêuticas na endometriose. \n1.2.1.2 - Apoptose celular \nA apoptose é um processo de morte celular programada que acontece após \nestímulo específico, no qual há condensação da cromatina e fragmentação do DNA, do \nnúcleo e da célula em si, com posterior fagocitose por macrófagos. A apoptose é \ncontrolada pela proporção de BCL2 e BAX, duas proteínas intracelulares, sendo que a \nBCL2 tem função de bloquear a apoptose, aumentando a sobrevida da célula e a BAX \ntem função contra-reguladora, acelerando o processo de apoptose (Nogueira et ai, \n2000). A função exata da BCL-2 é desconhecida. No endométrio, a proteína BCL-2 tem \nsua máxima expressão durante a fase proliferativa, diminuindo gradualmente até a fase \nsecretora, quando praticamente não é encontrada, coincidindo com o aumento da \nincidência de apoptose nessa fase do ciclo menstrual. \n\n9 \nMeresman et ai, 2000, descreveu uma maior expressão de BCL-2 e ausência da \nexpressão de BAX na fase proliferativa tardia no endométrio tópico de mulheres com \nendometriose comparado com o endométrio de mulheres normais. Tem sido observado \num aumento do número de macrófagos BCL2+ em tecido endometrial ectópico \nanalisado por imunohistoquímica, sugerindo maior \"resistência\" do tecido (Nogueira et \nai, 2000). Além disso, também tem sido descrita uma redução do número de \nmacrófagos e de células apoptóticas no endométrio tópico de pacientes com \nendometriose quando comparado com endométrio de pacientes sem a doença, podendo \njustificar um aumento na viabilidade deste tecido pata implantação futura (Braun et ai, \n2002). \nMe Laren et ai, 1997, mediram as proteínas BCL-2 e BAX em tecido endometrial \ne em macrófagos de líquido peritoneal de pacientes com endometriose e observaram \nque, em tecido endometrial tópico ou ectópico, a expressão do BCL-2 acompanha o \nciclo menstrual, com aumento na fase proliferativa e declínio até níveis não \nmensuráveis na segunda metade da fase secretora, enquanto a expressão do BAX não se \naltera, independentemente da fase do ciclo ou tecido endometrial tópico ou ectópico. \nAdicionalmente, macrófagos expressando a proteína BCL-2 estavam presentes em \nnúmero significativamente maior em pacientes com endometriose e apresentavam \nvariação cíclica, com declínio de seu número até próximo de valores encontrados em \nmulheres sem endometriose, na fase secretora. Nas pacientes sem endometriose, não \nhouve variação cíclica destes macrófagos. Em relação aos macrófagos que expressavam \nproteína BAX, um número significativo maior deles foi encontrado em pacientes sem \nendometriose, porém em ambos os grupos, sem alterações com a fase do ciclo. O estudo \nirnunohistoquímico revelou população de macrófagos BCL-2 positivo e BAX negativo \npresentes apenas em tecido ectópico endometrial (presentes em todas as fases do ciclo, \n\n10 \nsem descrição de variações quantitativas de acordo com a fase do ciclo) e que a \nexpressão da proteína BCL-2 com a ausência da proteína BAX poderia conferir a estas \ncélulas maior resistência a estímulos apoptóticos, aumentando a expectativa de vida \ndestas células. Postularam ainda que, apesar de ser reconhecido que a ativação de \nmacrófagos, freqüentemente, resultasse em apoptose, a maior quantidade de macrófagos \nBCL-2 positivos em pacientes com endometriose poderia resultar em maior número de \ncélulas que sobrevivam ao processo de ativação, sendo, portanto, um dos mecanismos \npelo qual se observa maior quantidade de macrófagos ativados no líquido peritoneal de \npacientes com endometriose. \nO Sistema fas-fas ligante \nAlém dessas duas proteínas reguladoras, a apoptose pode ser regulada através da \nativação de receptores chamados \"death receptors \", ou seja, receptores de morte. Entre \nesses receptores, temos as proteínas do sistemafas-fas ligante (fas-fasL). Enquanto ofas \né expresso na maioria das células do organismo, seu ligante fasL é observado nas \nmembranas das células citotóxicas da resposta imune, hepatócitos, em linfócitos T \nativados e em células oculares. A apoptose via fas-fasL é desencadeada pela interação \nentre fas e fasL. Quando ela ocorre, os receptores formam agregados que, na forma de \ntrimeros, ligam-se à proteína adaptadora FADO (Fas-associated death domain) presente \nno citoplasma. Ocorre, então, a ligação dessas moléculas à pró-caspase-8, resultando na \nformação de um complexo denominado DISC (Death Inducing Signalling Complex), \nque culmina na auto-clivagem e ativação da caspase-8. A caspase-8 pode, assim, \ndiretamente ou pela via mitocondrial, ativar a caspase-3 efetora, o que resulta na \napoptose celular. (Medema et ai, 1997; Chinnaiyan et ai, 1995; Yanagisawa et ai, \n1997). O recrutamento e ativação da pró-caspase-8 são regulados por proteínas anti-\n\n11 \napoptóticas, como o v-FLIP (FADD-like ICE inhibitory proteins) and c-FLIP. Essas \nproteínas competem com a caspase-8 pelo sítio de ligação do complexo Fas-FADD e \ninibem a apoptose celular (Deveraux et ai, 1998) (Figura 1 ). \nFigura 1: Esquema do processo de ati vação da  apoptose pela via dos receptores fa s-fasL e pela via \nmitocondrial. \nEmbora o amplo espectro de ação do sistema fas-fasL não tenha sido de todo \ndeterminado, este sistema já foi bem determinado nos processos de imunomodulação. \nTanto o fas quanto seu ligante são super-expressos na superficie celular dos linfócitos T \nativados, tendo papel importante na resposta imune. Apesar desta super-expressão, estes \nlinfócitos só se tomam sensíveis à apoptose após um período de alguns dias de \nsensibilização. Esta sensibilização é facilitada, pelo menos em parte, pela redução dos \nníveis de BCL-2 e BCL-X. Desta forma, estes linfócitos citotóxicos têm sua ação \nliberada por um curto período de tempo, sendo logo em seguida eliminadas via apoptose  \n\n12 \ninduzida pelo sistemafas-fasL (Peter et al, 1997). Este mecanismo previne o acúmulo \nde células efetoras auto-imunes direcionadas a auto-antígenos. \nA importância do sistema fas-fasL na imunomodulação normal é demonstrada pela \npresença de doenças auto-imunes e linfoproliferativas em ratos que apresentam \nmutações tanto do /as quanto do fasL (N agata, 1997). Em humanos, várias mutações \ndiferentes nos genes do sistema fas-fasL já foram demonstradas em crianças com \nsíndromes auto-imune linfoproliferativas, uma rara condição auto-imune com maciça \nlinfadenopatia (Rieux-Laucat et al, 1995; Fischer et al, 1995). Estes achados enfatizam \na importância crucial deste sistema na homeostase imune e na tolerância periférica. \nRecentemente, a expressão do fasL foi relatada em células não-imunes, \nprincipalmente em tecidos onde processos imunológicos ocorrem com muita importância, \ncriando um status imunológico privilegiado, permitindo maior sobrevivência celular. \nExistem relatos de expressão de fasL em macrófagos e em células da MEC \npresentes em estroma de tecido endometriótico, assim como no fluido peritoneal de \nmulheres com endometriose (Selam et al, 2002) Além disso, os fatores de crescimento \nderivados de macrófagos presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose \nparecem estimular a expressão de fasL. \nO tecido endometrial tópico de mulheres com endometriose apresentam maior \nexpressão de fasL quando comparado com endométrio de mulheres normais. Esta up­\nregulação do fasL leva a apoptose dos linfócitos T, facilitando o desenvolvimento das \nlesões endometrióticas, já que o clearence destas células ficaria prejudicado pela falha \ndo sistema imune. A IL-8, PDGF e TGF-�1 presente em grande quantidade no fluido \nperitoneal de mulheres com endometriose também pode levar a uma super-expressão de \nmoléculas/asL (Garcia e Velasco et al, 2003). \n\n13 \nGarcia e V elasco, 2003, também observaram que mulheres com endometriose \nmoderada a severa apresentam altos níveis de fasL tanto no soro quanto no fluido \nperitoneal quando comparados com controles saudáveis, reafirmando mais uma vez o \npapel deste sistema na sobrevivência e na implantação de tecido endometrial ectópico. \nAlguns estudos têm avaliado apoptose através da técnica do TUNEL (TdT -\nmediated dUTP - biotin nick end - labelling). Dmowsiki et al, 2001, observaram menor \níndice apoptótico entre as células glandulares, mas não nas estremais de pacientes com \nendometriose quando comparadas a mulheres sadias. Em mulheres normais, o índice \napoptótico foi maior durante a fase secretora/ menstrual e fase proliferativa inicial; em \nmulheres com endometriose esta cíclicidade não foi observada. Houve uma tendência a \nmenores índices apoptóticos em fases mais avançadas da doença, porém sem \nsignificância estatística. \nOutros estudos procuraram correlacionar índice apoptótico com os diferentes \ntipos de lesão de endometriose. Poucos trabalhos avaliaram o padrão de marcação do \nfas nas lesões endometrióticas. Harada et al, 1996, não encontrou diferença entre o \ntecido tópico e ectópico quando analisou a marcação do fas. W atanabe et al, 1997, \nobservou marcação pelo fas somente nas células glandulares e não nas estremais, e \nperda da variação cíclica ao longo das fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, \ntanto no tecido tópico quanto ectópico. Não houve diferença na marcação do fas entre o \ntecido tópico e ectópico. \nDufoumet et ai, 2005, estudou vários marcadores imunohistoquímicos para \napoptose (p53, p21, BAX, BCL-2 efas) no endométrio tópico e nos três tipos de lesão \nendometriótica. Na análise qualitativa, estes autores encontraram diferenças entre as \nlesões somente nos marcadores BCL-2 efas. A lesão peritoneal diferiu das demais com \nmaior marcação pelo BCL-2 e pelo fas. Na avaliação semi-quantitativa, a expressão do \n\n14 \nBCL-2 foi menor na lesão ovariana quando comparada com as demais, resultados \ncompatíveis com relatos prévios (Suganuma et ai, 1997; Me Laren et ai, 1997, Nezhat \net al, 2002). Este autor também encontrou altos índices de BCL-2 na lesão colon-retal, \nsugerindo uma menor sensibilidade deste tecido a apoptose. \nAs proteínas de choque quente (Heat shok proteins - HSP) são proteínas \nsintetizadas como resposta a uma série de estímulos fisicos e químicos, como choque, \nesteróides e dano oxidativo. Estudos sugerem que as HSP estão diretamente \nrelacionadas a componentes do sistema imune, como processamento, apresentação e \nligação de antígenos (Sharpe-Timms, 2001 ). Algu mas HSP variam de acordo com a \nfase do ciclo menstrual; as HSP 27, 60 e 70 estão aumentadas na fase secretora \n(Tabibzadebh et a!, 1996). Estudos recentes mostram maior expressão de HSP 27 e 70 \nno endométrio de mulheres com endometriose quando comparadas a mulheres \nsaudáveis; entretanto, foi encontrada uma expressão menor destas proteínas no \nendométrio ectópico quando comparada com o endométrio tópico (Nip et al, 1994; Ota \net al, 1997). Estes achados sugerem que as HSP protegem as células de sofrerem \napoptose, reduzindo os efeitos citotóxicos das citocinas acumuladas na fase secretória. \nEm resumo, vários autores mostraram uma redução significativa da apoptose no \nendométrio de mulheres com endometriose quando comparado com controles normais, \nprincipalmente nas fases secretora, menstrual e fase proliferativa inicial, e também uma \nredução da apoptose no endométrio ectópico quando comparado com o endométrio \ntópico nas mulheres com endometriose, porém existem dados que não corroboram com \nestes achados. \n\n15 \n1.2.2 - Como as células endometriais refluídas aderem ao peritônio pélvico \nDurante a menstruação, ocorre fluxo retrógrado de células endometriais viáveis \npelas trompas. Os mecanismos que envolvem a adesão destas células na superfície \nperitoneal têm sido exaustivamente estudados (Witz, 2003). Fazem parte da constituição \nda matriz extra celular (MEC): o colágeno, a elastina, os proteoglicanos e as \nglicoproteínas adesivas (fibronectinas, lamininas, vitronectinas, osteopontina e \nfibrinogênio ). As células peritoneais expressam várias moléculas que permitem a adesão \na estes componentes, coma integrinas, caderinas, selectinàs e moléculas da superfamília \nde imunoglobulinas. \nVários autores encontraram maior expressão de integrinas a2P 1, a3 p 1, a4P 1, \na5Pl , além de E-caderinas no endométrio tópico de pacientes com endometriose (Koks \net ai., 2000; Beliard et ai., 1997; Grosskinsk et ai., 1995). Todos estes estudos apontam \npara uma maior capacidade de aderência das células endometriais de mulheres com \nendometriose à superfície peritoneal; este fenômeno de adesão celular seria o primeiro \ndentro da cascata de eventos envolvidos na formação das lesões endometrióticas. \n1.2.3 - Como as células endometriais aderidas invadem a MEC \nApós o processo de adesão, a invasão da MEC é necessária para o crescimento dos \nimplantes endometrióticos. Acredita-se que esta invasão ocorra devido a um \ndesequilíbrio entre enzimas de degradação de componentes da matriz extracelular e seus \nreguladores. Estudos mostram que várias enzimas podem estar envolvidas nesse \nprocesso, em especial as metaloproteases e a catepsina. \n\n16 \nAs metaloproteases (MMPs) são enzimas zinco-dependentes, capazes de degradar \ntodos os componentes da MEC, dentre as quais podemos citar as colagenases, as \ngelatinases e as lisinas estromais (Osteen KG et ai, 2003). No processo de remodelação \nda MEC, ocorre um balanço entre a expressão das MMPs e de seus inibidores (TIMPs­\ntissue inhibitors of metalloproteases). A expressão gênica das MMPs é induzida por \ncitocinas inflamatórias, incluindo IL-1, IL-6 e TNF-a, além de fator de crescimento \nepidérmico (EGF), fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) e fator de \ncrescimento de fibroblastos (FGF) (Malik et ai, 1996; Schonbeck et al, 1997). \nVários estudos têm observado. um aumento de algu mas MMPs e redução de \nTIMPs produzidos pelo endométrio tópico e ectópico de pacientes com endometriose, o \nque conferiria uma maior capacidade invasora do tecido refluído do fluxo menstrual \nretrógrado (Osteen et ai, 2003). As principais MMPs envolvidas na endometriose são a \nMMP-1, MMP-3 e MMP-7, aumentadas principalmente durante a segu nda fase do ciclo \nmenstrual, correspondendo a uma resposta falha à ação da progesterona. Além disso, \nparece haver uma menor expressão do RNA-m da TIMP-3 no endométrio tópico de \npacientes com endometriose. Há também uma menor concentração da TIMP-1 no fluido \nperitoneal de mulheres com endometriose (Osteen et al, 2003). A identificação das \nalterações moleculares que levam a este desbalanço entre MMPs e TIMPs pode abrir \ncaminhos para a descoberta de novos regimes terapêuticos. \n1.2.4 - Como os novos implantes crescem e sobrevivem \nAcredita-se que após a invasão peritoneal, a viabilidade do foco endometriótico \nseja mantida pela neoformação vascular local desenvolvida sob estímulo de substâncias \nangiogênicas como o VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular). O VEGF é \n\n17 \nproduzido e secretado no fluido peritoneal por macrófagos ali presentes, e tem a \ncapacidade de promover crescimento endotelial, aumento da permeabilidade vascular e \nmodulação da secreção de enzimas proteolíticas relacionadas a angiogênese. \nNo endométrio normal, os níveis máximos de RMA-m de VEGF são atingidos na \nfase proliferativa final e secretora (Shifren et ai, 1996). Recentes estudos apontam para \num papel modulador dos estrógenos e progestágenos na ação do VEGF (Shifren et ai, \n1996; Cullinan et ai, 1993). Hipóxia, IL-1�, PDGF, EGF e PGE2 aumentam a expressão \ndo VEGF (Lebovic et ai, 2001 ). Há estudos descrevendo a presença de VEGF \naumentado no fluido peritoneal e no soro de pacientes com endometriose, e sua \nconcentração pode estar relacionada com o estadiamento da endometriose (Shifren et ai, \n1996; Nogueira et ai., 2000). Mulheres com endometriose também apresentam maiores \nconcentrações de VEGF no tecido endometrial tópico quando comparadas com \nmulheres controles, na fase secretora do ciclo menstrual (Donnez et ai, 1995). \nTodas essas alterações favorecem a implantação do tecido ectópico e o \nestabelecimento da lesão \n1.2.5 - O sistema imune \nEm situação fisiológica o tecido endometrial refluído pelas trompas é fagocitado e \neliminado da cavidade pélvica sem maiores repercussões. Nas pacientes com \nendometriose esta resposta imune está prejudicada. \nAlterações tanto no sistema imune celular quanto humoral são descritas. O fluido \nperitoneal de pacientes com endometriose apresenta um maior número de macrófagos, \nporém com menor atividade fagocítica, além de produzirem maior quantidade de fatores \nde crescimento e citocinas que estimulam a adesão celular e expressão de MMPs, \n\n18 \nfavorecendo a formação dos implantes endometrióticos (Halme et ai., 1983; Zeller et ai., \n1987; Dunselman et ai., 1988). As células NK (Natural Killer) também apresentam uma \nmenor capacidade de clearence das células regurgitadas (Wilson et ai., 1994). O \nendométrio tópico de mulheres com endometriose libera uma grande quantidade de \nsubstâncias inibidoras das células NK, quando comparado com o endométrio de \nmulheres normais (Mizumoto et ai, 1996; Somigliana et ai, 1996). Entre os linfócitos, \nhá uma dominância na atividade dos linfócitos da subpopulação Th2 em relação  à Thl \n(Wu & Ho et ai, 2003). \nAs células endometriais, in vitro, liberam moléculas de adesão intracelular -\nsolúveis (s-ICAM), principalmente durante a fase proliferativa do ciclo menstrual. Esta \nmolécula é capaz de modular a ação de linfócitos CD8+ e células NK, assim como foi \ndemonstrado em certos tipos de melanomas. O s s-ICAM competem com os ICAM na \nligação com uma proteína que toma os leucócitos ativos, o antígeno de função \nleucocitário (LFA-1). Quando os sICAM se ligam aos LFA-1, eles tomam os leucócitos \nmenos expostos a ligação com os ICAM presentes na superficie celular, prevenindo a \nativação destes leucócitos. Estudos mostram que as células estromais do endométrio de \nmulheres com endometirose expressam altas concentrações de sICAM, quando \ncomparadas a mulheres sem a doença. Além disso, a expressão de s-ICAM é ainda \nmaior no endométrio ectópico do que no tópico neste grupo de mulheres (Somigliana et \nai, 1996; Vigano et ai, 1998). \nQuanto à imunidade humoral, sugere-se a associação entre endometriose e \ndoenças auto-imunes. Em estudo realizado com 313 mulheres inférteis com \nendometriose (261 estágios I e II; 62 estágios III e IV) e 1 O 1 mulheres inférteis sem \nendometriose, houve níveis mais elevados de auto-anticorpos do tipo antifosfolípide \ncontra inositol, cardiolipina, etanolrunida e J32glicoproteína nas pacientes com \n\n19 \nendometriose, sendo mais exuberante naquelas nos estágios I e II. Além disso, 40% das \npacientes com endometriose graus mínimo e leve apresentaram anticorpos anti-zona \npelúcida (Gallová et ai., 2002). Adicionalmente, níveis elevados de citocinas no fluido \nperitoneal de pacientes com endometriose foram relatados em diversos estudos. Entre \nelas estão IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, TNFa, TGF� (Wu & Ho et ai, 2003) (Figura \n2). \nA IL-6 corresponde a uma interleucina das mais importantes na etiopatogenia da \nendometriose. Está envolvida com a produção esteroidogênica ovariana, foliculogênese \ne implantação embrionária, apresenta atividade multifuncional e possui efeitos \nangiogênicos, induzindo a expressão de VEGF. A IL-6 também estimula a produção da \naromatase em células adiposas (Witz et ai, 2000), e, em elevadas concentrações, é \nembriotóxica em ratos (Wu & Ho et ai, 2003) (Figura 2). Ela é produzida pelas células \ndo sistema imune, células endometriais glandulares e estromais. Foi observado que o \nestroma derivado de endometriomas ovarianos apresenta níveis elevados de IL-6 \nquando comparados com níveis de estroma derivados de endométrios normais. Por \noutro lado, o endométrio tópico de mulheres com endometriose apresenta níveis \nintermediários de IL-6 (Tseng et ai, 1996). \nA IL-1 exerce um papel importante na inflamação e no sistema imune. Ela é \nsecretada principalmente por macrófagos e monócitos ativados, além de linfócitos B, T \ne células NK. Existem duas moléculas distintas de IL-1, provenientes de dois genes \ndiferentes: a IL-1 a e a IL-1 B- A IL-1 B é secretada principalmente pelos macrófagos \nperitoneais e encontra-se em níveis elevados na endometriose, podendo exercer \nimportante papel na neovascularização dos focos de endometriose. Após exposição a \nesta interleucina, as células endometriais respondem aumentando a expressão do RNA­\nm das proteínas VEGF e IL-6; este fenômeno não ocorre no endométrio de mulheres \n\n20 \nnormais. A IL-1 � também aumenta os níveis de sICAM-1, interferindo nos mecanismos \nde sobrevivência celular (Lebovic et ai, 2000; Vigano et ai, 1998). \nA IL-8 é um potente fator angiogênico produzido por células mesoteliais, \nmacrófagos e células endometriais. Estudos têm demonstrado que a IL-8 estimula a \nproliferação de células endometriais e células estromais endometrióticas (Iwabe et ai, \n1998; Arici et ai 1998). Outros estudos mostram que a IL-8 está elevada no fluido \nperitoneal de mulheres com endometriose e seus níveis estão relacionados com a \nseveridade da doença (Gasvani et ai, 1998; Arici et ai, 1996). A IL-8 também estimula a \nadesão celular à fibronectina, sugerindo um possível papel nos eventos que iniciam a \ndoença ( Garcia-V e lasco et ai, 1999). \nPor todo o processo inflamatório que se desenvolve no ambiente intra-cavitário \nabdominal é de se esperar que al gu ns marcadores de atividade inflamatória como o PCR \n(proteína C reativa) e a SAA (proteína sérica amilóide A), estejam aumentados na \navaliação destas pacientes, marcadores estes que são inespecíficos no diagnóstico \netiológico, mas que quando associados a outros fatores diagnósticos podem indicar \natividade da doença e podem ser úteis no segu imento do controle da resposta \nterapêutica. Os níveis destes marcadores inflamatórios em pacientes com endometriose \nsão maiores no período menstrual do que na fase folicular tardia, sugerindo relação com \no processo inflamatório gerado pelo sangramento menstrual dos focos de endometriose.\nEm al gu ns casos o nível sérico de SAA pode sugerir doença avançada, o que auxilia no \nplanejamento da abordagem cirúrgica destas pacientes (Abrão et ai, 1997). \n\n!;,' . . ai\n\"t::liil\"' \n·;o \" \n... _, a,. \nMacrófago \nIL 1, IL6, IL8, IL 10 \nTNFa, TGFl3; VEGF t \nMMTPsfflMPs \nBcl-2/Bax \n• ROS/antioxidantes\nTh1 \n�-1\" \n21 \nFigura 2: Possíveis alterações fisiopatológicas na cavidade peritoneal de mulheres com endometriose. O \nendométrio anormal da endometriose em ROS (espécies reativas de oxigênio), antioxidantes, \nmetaloproteinases e seus inibidores (MMPs e TIMPs). Thl = subpopulação de linfócitos l; Th2 = \nsubpopulação de linfócitos 2. sICAM-1: molécula de adesão intercelular forma solúvel. VEGF= fator de \ncrescimento vascular endotelial. Bcl-2 e Bax = proteínas anti-apoptóticas. (adaptado de Wu & Ho, 2003). \n1.2.6 - Estresse Oxidativo \nAcredita-se que a cavidade peritoneal de pacientes com endometriose \nrepresente um ambiente pró-oxidante, com produção de substâncias denominadas \nespécies reativas de oxigênio (ROS) que podem contribuir para a reação inflamatória \nassociada à endometriose (Langendonckt et ai., 2002). As espécies reativas de \noxigênio são substâncias intermediárias produzidas normalmente no metabolismo do \noxigênio e, para proteção contra seus efeitos deletérios, as células desenvolveram \nurna variedade de sistemas antioxidantes. Os antioxidantes enzimáticos \n\n22 \ncorrespondem à superóxido disrnutase, catalase, glutationa redutase e os \nantioxidantes não enzimáticos à vitamina E, vitamina C, taurina e glutationa. Por \noutro lado, moléculas corno o óxido nítrico, os metais e os poluentes ambientais são \ntidos corno pró-oxidantes. Quando ocorre um predomínio destas espécies reativas de \noxigênio em detrimento dos antioxidantes, há o estresse oxidativo celular \n(Langendonckt et ai., 2002). \nExistem algumas evidências de estresse oxidativo na endornetriose: (1) A \nenzima óxido nítrico-sintetase encontra-se super expressa levando a urna maior \nprodução de óxido nítrico; (2) aumento da peroxidação lipídica corn_produção de \nprodutos reativos corno o rnalonaldeído e lisofosfatidilcolina; (3) expressão \naumentada de enzimas antioxidantes no endométrio de pacientes com endornetriose, \nque ocorreria em resposta à presença de maior quantidade de espécies reativas de \noxigênio; ( 4) níveis reduzidos de vitamina E no fluido peritoneal de mulheres com \nendornetriose consumida durante reações de oxidação; (5) presença de indutores \npotenciais de estresse oxidativo na cavidade peritoneal corno eritrócitos, debris \ncelulares e rnacrófagos (Langendonckt et ai., 2002; Szczepanska et ai., 2003). Os \nefeitos sobre a fertilidade residem na toxicidade do fluido peritoneal sobre os \nespermatozóides, defeitos na ovulação e alterações no desenvolvimento embrionário \npré-implantação e implantação {Langendonckt et ai, 2002) (Figura 3). \n\n...... , \nDebris \ncelulares : \nDioxina, \nagentes tóxicos \n. . \n1 \nNOS \ni \n/ \ni\n,,\"\",.- .. ,. ....................... .. Estresse \noxidativo \n........•• NO \n◄······-·.,. \n. \nMacrófagos : \n.. ' . ♦ -.. . . ' . ', Vasodilatação \ni Menstruação \nretrógrada -Hemácias -Hemoglobina- Heme - Ferro+ Biliverdina +co\nSangramento da \nlesão endometriótica \n23 \nFigura 3: Mecanismo de estresse oxidativo na endometriose. (adaptado de Langendonckt et ai., 2002). \n(CO = dióxido de carbono; NO= óxido nítrico; NOS= óxido nítrico sintase). \n1.2.7 - Os fatores hormonais na gênese da endometriose \nA endometriose é, sabidamente, uma doença estrogênio-dependente. Os estudos \natuais de biologia molecular revelam que existem tipos distintos de receptores \nestrogênicos e progesterônicos. Os receptores estrogênicos (ER) estão presentes \nprincipalmente na fase proliferativa tardia e secretora inicial, enquanto os receptores \nprogestagênicos (PR) aumentam um pouco mais tardiamente, na fase média e final da \nfase secretória (Lessey et ai, 1988). \nExistem duas isoformas de receptores estrogênicos, os ER-a e os ER-P, ambos \npresentes nas células epiteliais e estromais do endométrio humano. Igualmente, os \nreceptores progestagênicos também se apresentam de duas isoformas, os PR-A e PR-B. \nAlterações na expressão destes subtipos de receptores têm sido descritas em células \nisoladas e em tecidos de mulheres com endometriose (Me Donell et ai, 1995; Attia et ai, \n\n24 \n2000; Brandemberg et ai, 1999). Estas alterações levam a uma maior exposição ao \nestrogênio e uma menor sensibilidade à ação da progesterona. \nA aromatase, por sua vez, corresponde a uma enzima responsável por catalisar a \ntransformação de andrógenos (testosterona, androstenediona) em estrógenos (estradiol, \nestrona, respectivamente). Existem indicativos de alterações desta enzima na \nendometriose: ( 1) trata-se de uma doença do menacme, portanto, sua etiopatogenia \npossivelmente se relaciona com a esteroidogênese e a aromatase está diretamente \nenvolvida neste processo (Bulun et ai., 2002;) (2) a aromatase é uma enzima \nintrinsecamente relacionada à esteroidogênese folicular e sabe-se que um \nmicroambiente estrogênico é vital para a dominância folicular, influenciando a \nqualidade oocitária e possivelmente a infertilidade na endometriose (Speroff et al, 1999) \ne, (3) alterações das concentrações da aromatase na endometriose já foram relatadas: \nníveis muito elevados da aromatase foram encontrados, por meio de PCR (polymerase \nchain reaction), em implantes endometrióticos e em endometriomas (Noble et ai, 1996). \nTambém foi detectado RNA-m da aromatase em endométrio eutópico de pacientes com \nendometriose, não sendo encontrado em mulheres sem a doença (Bulun et ai, 1995). \nA prostaglandina E2 (PGE2) é um potente estimulador da aromatase; o \nestrogênio, produto final da reação, por sua vez, é um potente estimulador da PGE2, \nformando assim um ciclo vicioso que permite altas concentrações locais de estrogênio \nnas lesões (Bulun et ai, 1998). Estas informações podem embasar futuras intervenções \nterapêuticas, como alguns estudos que já mostram alívio da dor e redução do tamanho \ndos implantes com o uso de inibidores da aromatase (Attar et al, 2006; Ailawadi et ai, \n2004; Amsterdam et al, 2005; Soysal et ai, 2004). \nAlém disso, na endometriose encontramos baixos níveis de 17 �- hidroxiesteróide \ndesidrogenase (17 � - HSD) tipo 2, uma enzima que converte o estradiol, um estrógeno \n\n25 \npotente, em estrona, um estrógeno com menor atividade biológica. Esta enzima também \né induzida pela ação da progesterona. Por outro lado, a 17 � - HSD tipo 1, que faz a \nreação oposta, ou seja, converte estrona em estradiol, está expressa na endometriose \n(Andersson et ai, 1997; Zeitoun et ai, 1998). \n1.2.8 - Marcadores séricos e Regulação Gênica na Endometriose \nO CA-125, uma glicoproteína de alto peso molecular com menor quantidade de \ncarboidratos que de mucinas (Jacob et ai, 1989), é um determinante antigênico expresso \nna superficie celular dos derivados do epitélio celômico ( como o peritônio, pericárdio, \npleura e trato genital); foi originalmente descrito como marcador para tumores epiteliais \nde ovário, principalmente os cistoadenocarcinomas (Bast et ai, 1983). Posteriormente \nNilof, em 1984 descreveu pela primeira vez o aumento dos níveis séricos deste \nmarcador em pacientes com endometriose (Niloff et ai, 1984). A relação da \nendometriose com o CA-125 é justificada tanto pela maior concentração desse marcador \nno endométrio ectópico comparado ao tópico como pela reação inflamatória associada \nao processo, alterando a capilaridade do endotélio e facilitando a chegada do CA-125 à \ncirculação (Masahashi et ai, 1988 e Barbieri et ai, 1986). Estudos mostram que em \nmulheres com endometriose a expressão do CA-125 está aumentada em 2 a 4 vezes no \nendométrio tópico, tanto na fase secretória inicial quanto tardia do ciclo menstrual \n(McBean et ai, 1993). \nVários trabalhos têm relatado o uso do CA-125 como marcador para diagnóstico \ne, principalmente, para seguimento de mulheres em tratamento para a endometriose. A \nelevação deste marcador nas pacientes com endometriose está presente em cerca de \n50% dos casos (Watanabe et ai, 1990). Algun s autores sugerem existir uma correlação \n\n26 \nentre os níveis séricos do CA-125 e a atividade proliferativa das células epiteliais das \nlesões endometrióticas (Toki et ai, 2000). \nRecentemente, o CA 19-9 vem sendo citado também como marcador para \nendometriose. Trata-se de antígeno do grupo sanguíneo Lewisª sialilado expresso como \num monosialogangliosído em glicoproteínas mucosas secretadas em tumores \ngastrointestinais, pancreáticos e pulmonares (Magnani et ai, 1983). É uma glicoproteína \nde alto peso molecular amplamente utilizada como marcador sérico para a identificação \ndestes tumores (Tatsuya et ai, 2002). A sua utilização como marcador de tumores \novarianos (cistoadenocarcinomas mucinosos) e de endometriose vem sendo observada \npor alguns autores (Tatsuya et ai, 2002), estando presente em níveis aumentados em \n52% das pacientes (Watanabe et ai, 1990 e Matalliotakis et ai, 1998). \nA sensibilidade do CA-125 e do CA 19-9 é da ordem de cerca de 50% cada um \nisoladamente para identificação de pacientes com endometriose, mas segundo Watanabe \n(Watanabe et ai, 1990), a associação dos dois marcadores séricos aumenta a \nsensibilidade para 71,4%, Mesmo assim, a sua aplicação e interpretação devem ser \nsempre acompanhadas da avaliação clínica da paciente e muitas vezes de outros exames \ncomplementares, de imagem e até mesmo da laparoscopia, e na prática são mais \nutilizados para seguimento de pacientes em uso de alguma terapia, seja ela clínica ou \ncirúrgica. \nA Proteína Endometriose -1 (ENDO-1) é uma haptoglobulina produzida e \nsecretada particularmente pelo tecido endometrial ectópico (Sharpe-Timms et ai, 1998). \nSua expressão está aumentada neste tecido quando comparada com o tecido endometrial \ntópico. Acredita-se que esta proteína atue nos processos inflamatórios, imunes e na neo­\nangiogênese (Sharpe-Timms et ai, 1998). \n\n27 \nOs genes da família HOX são genes relacionados à produção de fatores \nreguladores importantes na embriogênese humana. Atuam no desenvolvimento \nembrionário, no desenvolvimento dos duetos de Müller, e continuam a ser expressos \npelo útero adulto. Taylor descreveu os papéis dos genes HOXA 1 O e HOXA 11 na \nregulação do crescimento endometrial durante o ciclo menstrual. Este autor mostrou a \nimportância destes genes na implantação embrionária em camundongos e parecem ter \npapel similar em humanos. Ao avaliar os níveis de HOXA 10 e HOXAI 1 nas mulheres \ncom endometriose, Taylor demonstrou que a expressão destes genes não atingia os \nvalores esperados na fase lútea média, quando comparados com controles. A expressão \naberrante destes genes pode explicar a gênese da infertilidade a nível endometrial neste \ngrupo de mulheres (Taylor et ai, 2000; Taylor et ai, 1997; Taylor et ai, 1999). \nSão inúmeros os fatores que, presentes em determinadas mulheres susceptíveis, \npodem levar ao desenvolvimento da endometriose. Este é um vasto campo de pesquisa \nque há muitas décadas vem sendo explorado, mas ainda há muita controvérsia em \nrelação à determinação de quais fatores seriam realmente importantes na endometriose. \nAinda não conhecemos com clareza o comportamento da proliferação celular e da \napoptose na endometriose, sendo necessário novos estudos. Este entendimento abrirá \ncaminho para o desenvolvimento de drogas mais eficazes, melhorando assim o \nprognóstico clínico e reprodutivo destas mulheres acometidas. \n\n2. OBJETIVOS\n\n29 \nO presente trabalho tem como objetivos: \n2.1 - Objetivos gerais: \nComparar proliferação e apoptose celular de células glandulares e estromais do \nendométrio tópico e ectópico de pacientes com endometriose, correlacionando os \nachados com as localizações das lesões endometrióticas. \n2.2 - Objetivos específicos: \nA vali ar em células glandulares e estromais de tecido endometrial tópico e ectópico de \nmulheres com endometriose: \na) índice de proliferação celular através da técnica do PCNA (proliferative cell\nnuclear antigen ); \nb) apoptose através da marcação do anticorpo fas;\nc) relacionar os achados histológicos com a localização da lesão (peritoneal,\novariana e septo reto-vaginal) e comparar os resultados com os obtidos de amostras \nteciduais de endométrio tópico destas mesmas pacientes. \n\n3. MATERIAL E MÉTODOS\n\n31 \n3.1 - Material \nForam avaliadas amostras teciduais de endométrio tópico e ectópico de mulheres \nno mecname, apresentando ciclos menstruais regulares, com idade entre 18 e 40 anos, \nsubmetidas à laparoscopia por dor pélvica crônica e/ou infertilidade conjugal em \nHospital Universitário Terciário. As amostras foram colhidas por biópsias de diferentes \nlesões endometrióticas para estudo histopatológico e imuno-histoquímico através de \ninstrumental laparoscópico e biópsia de endométrio tópico através de cureta de Novak. \nNenhuma das mulheres havia usado contraceptivos hormonais orais ou injetáveis nos \núltimos 3 meses, ou acetato de medroxiprogesterona de depósito nos últimos 9 meses ou \nanálogos do GnRH nos últimos 6 meses. \nO trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, sob número 3318/2004. Todas as pacientes \nforam informadas sobre o estudo e aquelas que concordaram em participar assinaram \nTermo de Consentimento Informado. \nForam incluídas 29 pacientes com amostras de endométrio tópico e ectópico (8 \npacientes com lesão peritoneal, 14 com endometrioma ovariano e 7 com lesão \ninfiltrativa profunda, todas de localização no septo reto-vaginal). O material foi imerso \nem gel de crioprotetor e mantido congelado em criotubos, após imersão em nitrogênio \nlíquido e armazenamento posterior em Freezer à temperatura de -70ºC. Após o \nprocessamento do material, foram excluídas amostras devido a baixa marcação \nirnunohistoquímica ( 4 pacientes com endometrioma ovariano, 2 pacientes com lesão \nperitoneal e 3 pacientes com lesão de septo reto-vaginal). Portanto, foram analisadas \nneste estudo um total de 22 amostras (10 endometriomas, 6 lesões peritoneais e 6 lesões \nde septo reto-vaginal). \n\n32 \n3.2 - Método imunohistoquímico \n3.2.1 - Marcadores Imunohistoquímicos: \nPCNA: - Proliferating Cell Nuclear Antigen - (Novocastra Laboratório Ltda - clone \nPC 1 O) - anticorpo monoclonal de camundongo; imunoglobulina da classe lgG2a. Este \nantígeno funciona como um co-fator da DNA polimerase na fase S do ciclo celular e \ntambém está associado com mecanismos de reparos do DNA. As células em \nproliferação celular ficam então marcadas pelo PCNA. Utilizamos diluição 1 :200 e \nconsideramos a marcação nuclear. \nfas: (Novocastra Laboratório Ltda - clone GM 30) - anticorpo monoclonal de \ncamundongo; imunoglobulina da classe IgG 1. Também conhecido como antígeno CD \n95, é uma glicoproteína transmembrana que media a apoptose através de ligação com \nreceptor próprio. Utilizamos diluição 1: 100 e consideramos a marcação citoplasmática. \n3.2.2 - Técnica de lmunohistoquímica: \nAs reações de imunohistoquímica foram realizadas em cortes histológicos de 4-5µ \natravés de reação antígeno-anticorpo seguida de revelação da reação com marcador \nvisível ao microscópio. As lâminas desparafinadas e hidratadas foram recuperadas \nantigenicamente através de incubação em panela a vapor em meio tamponado por 40 \nminutos. Após resfriamento do material, as peroxidases teciduais endógenas foram \nremovidas pela adição de peróxido de hidrogênio e ligações inespecíficas do anticorpo \nprimário foram evitadas por adição de soro de cavalo. As lâminas foram então \n\n33 \nincubadas com anticorpo primário por 12 horas em câmara úmida. Em seguida, houve a \nincubação com anticorpo secundário e, por último, a etapa avidina-biotina. A reação foi \nidentificada após a revelação por tratamento com DAB (Sigm a-Aldrich Inc., USA) por \ncinco minutos e contra coloração com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das \nlâminas. \n3.3 - Critérios de avaliação imunohistoquímica \nNa avaliação do PCNA, utilizamos método quantitativo, com contagem de células \nmarcadas pela imunohistoquímica em 1000 células contadas na lâmina, contando-se \ncélulas nos quatro quadrantes de cada lâmina. Com base neste cálculo, obtivemos o \nÍndice de Proliferação Celular (IPC): número de células marcadas para o PCNA em \n1000 células contadas, tanto células glandulares quanto estromais, que foram analisadas \nseparadamente. \nA marcação com fas foi feita por análise semi-quantitativa, com marcação em \ncruzes, a saber: O= ausência de células marcadas na lâmina; +/4 = até 25% de células \nmarcadas; ++/4 = entre 25% a 50% de células marcadas; +++/4 = entre 50% e 75% de \ncélulas marcadas;++++ /4 = >75% de células marcadas. \nTodas as lâminas foram analisadas por dois patologistas com experiência em \nimunohistoquímica, sem identificação do tipo de tecido analisado. A análise da glândula \ne do estroma foi realizada na mesma lâmina. \n\n34 \n3.4 - Análise estatística \nTodos os resultados foram expressos em média± desvio padrão da média para o \nIPC e em porcentagem para a avaliação da apoptose. Foi utilizado o programa de \nanálise estatística GraphPad Prisma 3.0 Os dados com distribuição normal foram \nestatisticamente analisados utilizando o teste t student e, para variáveis não­\nparamétricas, o teste de Mann-Whitney. Para a avaliação dos resultados de apoptose, \nutilizamos o teste de Qui-quadrado. A diferença entre os grupos foi considerada \nsignificante quando o p < 0,05. \n\n4.RESULTADOS\n\n36 \n4.1 Avaliação do Índice de Proliferação Celular (IPC) \n4.1.l - Tecido Glandular\nObservou-se maior proliferação celular no endométrio ectópico do que no \nendométrio tópico (IPC 0,12 ± 0,04 e 0,18 ± 0,06, respectivamente, p= 0,034), \nconsiderando todas as amostras juntas (Figura 4). Quando avaliados separadamente, não \nhouve diferença entre o IPC dos três tecidos endometriais ectópicos comparados aos \nseus respectivos endométrios tópicos (Tabela 1 ). Observou-se maior IPC na lesão \nperitoneal quando comparada com a lesão de septo reto-vaginal (p = 0,009). Não houve \ndiferença entre o IPC de lesões peritoneais e endometrioma ou entre endometrioma e \nlesões de septo reto-vaginal Os endométrios tópicos correspondentes às diversas lesões \nnão apresentaram diferenças entre si (Tabela.1 ). \n4.1.2 - Tecido Estromal\nObservou-se que o estroma do tecido tópico apresenta maior proliferação celular \nque o estroma das lesões endometrióticas (IPC 0,05±0,01 e 0,02±0,01, respectivamente, \np: 0,016). Quando avaliados separadamente, não houve diferença entre o IPC estromal \ndos 3 tecidos endometriais ectópicos comparados aos seus respectivos endométrios \ntópicos. Observou-se um maior IPC no endométrio tópico correspondente à lesão \nperitoneal quando comparado ao endométrio tópico correspondente à lesão ovariana \n(Tabela 2). \n\n37 \nTabela 1 - Resultado do IPC nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos - GLÂNDULA. \nLesão N Endométrio ectópico Endométrio tópico \nEndometrioma 10 0,34 ± 0,13 0,08 ± 0,03 \nSepto reto-vaginal 6 0,01± 0,01 * 0,15± 0,13 \nPeritôneo 6 0,14 ± 0,07* 0,15 ± 0,09 \n* p = 0,009\nTabela 2 - Resultado do IPC nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos - ESTROMA. \nLesão N Endométrio ectópico Endométrio tópico \nEndometrioma 10 0,014 ±0,01 0,04 ±0,01 * \nSepto reto-vaginal 6 0,014 ±0,01 0,06 ±0,02 \nPeritôneo 6 0,05 ± 0,02 0,09 ± 0,02* \n*p=0,04\n\n38 \nFigura 4: Marcação com PCNA em tecido glandular (setas) - aumento de 400 x. \n4.2 Avaliação do Índice Apoptótico (IA) \n4.2.1 - Tecido Glandular \nAo avaliarmos todas as lesões endometrióticas, observou-se que das 22 lâminas de \nlesões, 16 não apresentaram marcação imunohistoquímica parafas (72,7%). Dentre as \nseis lâminas marcadas (27,3%), todas elas apresentaram marcação fraca de 1 +/4 (Fig.2). \nNa avaliação do endométrio tópico, encontrou-se resultado semelhante: 15 lâminas não \nmarcaram para fas (68,1%); entre as 7 lâminas (31,9%) que foram marcadas, todas \napresentaram marcação fraca de 1 +/4. Não houve diferença quando comparou-se o \nendométrio ectópico com o tópico (p= 1,00) \n\n39 \nDentre as lesões peritoneais, 2/6 apresentaram marcação fraca de 1 +/4 pelo fas\n(33,3%) e no endométrio tópico correspondente, 3/6 apresentaram marcação 1 +/4 (50%, \np=I,00) \nNo endometrioma ovariano, 8 entre 1 O lesões não apresentaram qualquer \nmarcação (80%). As duas lesões marcadas (20%) apresentaram marcação 1 +/4. O \nendométrio tópico correspondente a essas lesões apresentou o mesmo comportamento: 8 \nlesões não marcadas (80%) e 2 lesões (20%) com marcação de 1 +/4 (p= 1,42) \nNas lesões de septo reto-vaginal, 2/6 lesões (33,3%) apresentaram marcação de \n1 +/4 e no endométrio tópico correspondente houve resultados semelhantes (2/6 lesões \nmarcadas p= 1,45). \nNão houve diferença na marcação pelo fas entre as diversas localizações de \ntecido ectópico (marcação fraca em 2/1 O endometriomas, 2/6 lesões de septo reto­\nvaginal, 2/6 lesões peritoneais,p=0,60). \nOs resultados estão representados na tabela 3. \n4.2.2 - Tecido Estromal \nAo avaliarmos todas as lesões endometrióticas, observou-se marcação com o fas \nem 5/22 lesões endometrióticas (22,7%), sendo que 4 apresentavam marcação 1+/4 e 1 \nlesão apresentou marcação 2+/4. No endométrio tópico, 10/22 apresentaram marcação \npelo/as (45,4%), sendo que 6 apresentavam marcação 1+/4, 2 apresentavam 2+/4 e 2 \n3+/4. Não encontramos diferenças significantes entre a apoptose no estroma do \nendométrio tópico e ectópico (p= 0,31) \nAo avaliar separadamente cada localização, observou-se que nas lesões \nperitoneais, 2/6 lesões apresentaram marcação (33,3%), sendo 1 lesão 1 +/4 e 1 lesão \n\n40 \n2+/4. Em relação ao endométrio tópico correspondente, todas as 6 lâminas foram \nmarcadas, sendo que 3 apresentaram marcação de 1 +/4 (50%), 2 apresentaram marcação \n2+/4 (33,3%) e 1 apresentou marcação 3+/4 (16,6%), sem sign ificância estatística entre \na marcação de apoptose na lesão peritoneal e no seu endométrio tópico (p= 0,09) \nEntre as lesões de endometrioma ovariano, 1/9 apresentou marcação (10%) \napresentou fraca marcação ( 1 +/ 4) e no endométrio tópico correspondente, 4/ 1 O lâminas \nmarcaram para fas, sendo 3 com marcação fraca (1 +/4 - 75%) e 1 marcação 3+/4 \n(25%), sem significância estatística (p= 0,28). \nEntre as 6 lesões de septo reto-vaginal, 2/6 apresentavam marcação (33,3%), \ntodas elas fracas (1 +/4). No endométrio tópico correspondente, em nenhuma das 6 \nlâminas obtivemos marcação pelo/as, sem sign ificância estatística (p= 0,12). \nQuando comparados os diversos tipos de lesão entre si, não observou-se \ndiferenças entre a lesão peritoneal x ovariana (p= 0,36); peritoneal x septo-reto vaginal \n(p=0,51) ou entre ovariana x septo reto-vaginal (p= 0,52) para a marcação pelo fas. \nOs resultados estão representados na tabela 4. \n\n41 \nTabela 3 - Resultado do IA nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos - GLÂNDULA. \nIA - endométrio tópico IA - endométrio ectópico\nTipo de lesão 0+/4 l+/4 2+/4 3+/4 0+/4 1+/4 2+/4 3+/4 p \nPeritoneal o 3 2 1 4 1 1 o 1,0\nOvariana 6 3 o 1 9 1 o o 1,42 \nSepto reto-vaginal 6 o o o 4 2 o o 1,45 \nTotal 12 6 2 2 17 4 1 o 1,0\nTabela 4 - Resultado do IA nos diferentes tipos de lesão endometriótica quando \ncomparados com seus respectivos endométrios tópicos - ESTROMA. \nIA - endométrio tópico IA - endométrio ectópico\nTipo de lesão o+/4 1+/4 2+/4 3+/4 0+/4 1+/4 2+/4 3+/4 p \nPeritoneal 3 3 o o 4 2 o o 0,09 \nOvariana 8 2 o o 8 2 o o 0,28 \nSepto reto-vaginal 4 2 o o 4 2 o o 0,12 \nTotal 15 7 o o 16 6 o o 0,31 \n\n42 \nFigura 5: Marcação pelofas em glândula (setas)- aumento de 400 x. \n\n5. DISCUSSÃO\n\n44 \nAlterações intrínsecas de controle de proliferação celular e apoptose vêm sendo \nexaustivamente estudadas na endometriose. À luz dos estudos atuais já podemos afirmar \ncom segurança que o endométrio tópico destas pacientes apresenta uma série de \nalterações nos mecanismos de controle de proliferação celular e apoptose, dentre outros, \nque permitem que este tecido tenha maior viabilidade na cavidade pélvica e, portanto, \nmaior capacidade de sobrevivência, implantação e proliferação, dando origem aos focos \nde endometriose. (Wingfield et al;1994; S S Seo et ai, 2000; Jonhson et ai, 2005; \nNalbanski et ai, 2004). \nNas mulheres com endometriose, além das alterações próprias do endométrio, \npossivelmente alterações do microambiente e da superficie de aderência peritoneal \ncontribuem também para tomar este tecido refluído ainda mais favorável à implantação \ne sobrevivência na cavidade pélvica. Ao compararmos as lesões endometriais com seus \nrespectivos endométrios tópicos, estudamos indiretamente os efeitos que os \ncomponentes deste microambiente peritoneal possam exercer sobre este tecido refluído. \nProliferação Celular \nInúmeros trabalhos tentam definir o comportamento tanto do endométrio normal \nquanto do endométrio de mulheres com endometriose em relação ao padrão de \nproliferação, porém ainda há resultados controversos. \nNo endométrio de mulheres normais, a proliferação do tecido glandular da \ncamada funcional do endométrio tem um padrão cíclico, com proliferação máxima na \nfase proliferativa tardia, com decréscimo importante ao longo da fase secretora, até \npraticamente ausente na fase menstrual. O tecido estromal, ao contrário, apresenta dois \npicos de proliferação celular, um na fase proliferativa e outro na fase pré-menstrual. \n\n45 \nEste mesmo padrão é mantido em mulheres com endometriose, tanto no tecido \nglandular quanto estromal (Shuang-fang Li et ai, 1993; Wingfield et ai, 1995; Jurgensen \net ai, 1996; Nisolle e Donnez, 1997; Beliard et ai, 2004). \nEm relação ao comportamento do endométrio tópico de mulheres com \nendometriose, alguns estudos mostram maiores IPC quando comparados a controles, \nmas somente na fase proliferativa do ciclo menstrual, tanto no tecido glandular quanto \nestromal (Wingfield et ai, 1995; Shuang-fang Li et ai, 1993; Johnson et ai, 2005), \nporém outros trabalhos não encontraram diferenças significantes (Jurgensen et ai, 1996; \nScotti et ai, 2000; Beliard et ai, 2004). \nNo nosso trabalho, encontramos, no tecido glandular, um maior IPC no tecido \nendometrial ectópico quando comparado com o tecido tópico. Vários estudos anteriores \ncorroboram os nossos achados. Um dos estudos pioneiros foi o de Shuan-fang Li et ai, \n1993, que encontrou maior IPC através de PCNA nas lesões endometrióticas, ao longo \nde todo ciclo menstrual. Assim como no nosso estudo, este comportamento restringiu-se \nao tecido glandular. \nAo contrário, outros estudos não mostram diferenças entre os endométrios tópicos \ne ectópicos, ou mesmo mostram menor proliferação no tecido ectópico, tanto no tecido \nglandular quanto no estroma. Essas diferenças entre os estudos provavelmente devem-se \nàs diferentes metodologias empregadas e aos tipos diferentes de lesões endpmetrióticas \nestudadas. Outra característica relatada na literatura é a perda de variação ao longo do \nciclo menstrual no tecido ectópico (Jones et ai, 1995; Nisolle et ai, 1997; Scotti et ai, \n2000; Beliard et ai, 2004;). \nPoucos estudos avaliam e comparam separadamente os diferentes tipos de lesão, e \nnão encontramos na literatura nenhum que avalie PCNA nas lesões peritoneais, \novariana e de septo reto-vaginal. Nisolle e Donnez, primeiros autores a postularem a \n\n46 \nhipótese de que os diferentes tipo s de lesão são entid ades diferentes, estudaram, em \n1997, o IPC através do Ki6 7 comparando lesões peritoneais negras, vermelhas e \nendornetriornas ovarianos, juntamente com o endométrio tópi co. No tecido glandular, na \nfase proliferativa, dentre as 3 lesões, a que apresentou mai or IPC foi a lesão peritoneal \nvermelha, entretanto, comparada com o endométrio tópico, apresentou urn menor IPC \nestatisticamente significante. Fujishita et ai, 1999, tarnbérn encontrou maior marcação \nde PCNA nas lesões vermelhas quando comparadas com as lesões negras e brancas. \nAssim também, encontramos maior IPC na lesão perito neal quando comparada a de \nsepto reto-vagi nal, mas não encontramos diferença com seu respectivo endométrio \ntópico. Apesar de numericamente a lesão ovariana apresentar maio res IPC no nosso \ntrabalho, não encontramos di ferenças estatísticas entre esta lesão e as demais. Isso \nprovavelmente deveu-se a grande vari ação do IPC neste grupo. No estudo de Nisolle \ntambém não houve diferença entre a lesão ovariana e as lesões peritoneais. \nUrn dado interessante destes autores foi a presença de proliferação celular na fase \nsecretora do ciclo no tecid o ectópico, enquanto ausente no endométrio tópic o. \nA presença do estrorna parece ser papel preponderante no desenvolvimento da \nendornetriose. Vários autores definem histologi camente endornetriose somente se o estroma \nesti ver presente. Quando avaliamos o estroma, encontramos mai ores IPC no endométrio \ntópico em relação às lesões. Estes resultados também são corroborados com os de Nisolle e \nDonnez et ai, 1997, que encontraram resultados significantes na fase proliferativa do ciclo, \ncom menor IPC nas lesões peritoneais  e ovarian a em relação ao endométrio tópico. \nNo nosso estudo, a lesão que apresentou maior IPC do estroma foi a lesão \nperiton eal, embora sem resultados estatisticamente significant e. Os próprios Ni solle e \nDonnez, em estudos anteriores, encontraram urna maior vascularização do estrorna \ndestas lesões  peritoneais,  em  especial  as  lesões  vermelhas, consideradas as lesões  mais  \n\n47 \nativas. Quando avaliamos os endométrios correspondentes às lesões de endometriose, \nencontramos maior atividade proliferativa no endométrio da lesão peritoneal quando \ncomparado ao endométrio da lesão ovariana. Não encontramos na literatura dados a \nrespeito de diferenças entre os endométrios tópicos correspondentes às várias lesões \nendometrióticas, mas alterações na estrutura deste endométrio poderiam ser \nresponsáveis pela definição da localização da lesão. De acordo com nossos resultados, \nalterações estromais intrínsecas do endométrio podem ser implicadas na etiopatogenia \ndeste tipo específico de lesão. \nNossos resultados mostram ainda um baixo IPC nas lesões de septo reto-vaginal. \nEstudos avaliando o comportamento histológico destas lesões mostraram diferenças \nimportantes, com mínimo componente estromal e grande componente de células \nmusculares. O comportamento clínico mais agressivo deste tipo de lesão possivelmente \nnão se correlaciona com maior atividade proliferativa (Nisolle e Donnez et ai, 1997). \nApoptose \nVárias alterações tanto qualitativas quanto quantitativas na expressão de proteínas \nrelacionadas com apoptose vêm sendo exaustivamente estudadas, tanto no endométrio \ntópico de mulheres com e sem endometriose, quanto no tecido endometrial ectópico. \nDurante o ciclo menstrual, ocorre uma série de alterações nos mecanismos de controle \ncelular, com maiores índices de apoptose na fase secretora e menstrual. Isto foi \ndemonstrado por diversos autores (Dmowski et ai, 2001; Watanabe et ai, 1997; Beliard et \nai, 2004; Jonhson et ai, 2005), utilizando várias metodologias (técnica do TUNEL, \nproteínas pró-apoptóticas como p53, p21, BAX e Fas; e proteínas anti-apoptose, como o \nBCL-2 e BCL-X). \n\n48 \nResultados são controversos em relação ao comportamento da apoptose no \nendométrio tópico das mulheres com endometriose. Vários autores encontraram \nmenores índices de apoptose neste grupo de pacientes, utilizando também várias \nmetodologias (Meresman et al, 2000; Braus et al, 2002; Gebel et al 1998; Jonhson et al, \n2005; Symanowski et al, 2006), porém outros autores não confirmam estes resultados \n(Beliard et ai, 2004; Jones et ai, 1998). Possivelmente estas variações nos resultados \ndevam-se a diferenças na metodologia utilizada. \nNo tecido endometrial ectópico, também encontramos resultados controversos. \nJones et al, 1998, Dmowski et al.2001 e Beliard et al, 2004, encontraram menos \napoptose nas lesões quando comparados ao endométrio tópico. Consistentemente os \ntrabalhos também mostram perda da variabilidade cíclica da apoptose nestas lesões. \nNishida et al, 2005, não encontrou diferenças entre os tecidos endometriais tópicos de \nmulheres com e sem endometriose e nas lesões endometrióticas quando estudou fas e \nfas-L, mas encontrou maior marcação por BCL-2 e BCL-X no tecido endometrial \nectópico. Variações nos diversos tipos de lesão também vêm sendo estudadas. De \nacordo com alguns autores, a expressão de BCL-2 é menor nas lesões císticas em \nrelação às lesões peritoneais (Haranda et al, 1996; Nezhat et al, 2002). \nPoucos trabalhos avaliam o padrão de marcação do fas nas lesões endometrióticas. \nHarada et al, 1996, não encontrou diferença entre o tecido tópico e ectópico quando \nanalisou a marcação do/as. Watanabe et al, 1997, observou marcação pelo/as somente \nnas células glandulares e não nas estromais, e perda da variação cíclica ao longo das \nfases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, tanto no tecido tópico quanto \nectópico. Não houve diferença na marcação do fas entre o tecido tópico e ectópico. \nDufoumet et al, 2005, estudaram vários marcadores imunohistoquímicos para \napoptose (p53, p21, BAX, BCL-2 e fas) no endométrio tópico e nos três tipos de lesão \n\n49 \nendometriótica (peritoneal, ovariana e de septo reto-vaginal). Na análise qualitativa, estes \nautores encontraram diferenças entre as lesões somente nos marcadores BCL-2 e fas. A \nlesão peritoneal diferiu das demais com maior marcação pelo BCL-2 e pelo fas. Na \navaliação semi-quantitativa, a expressão do BCL-2 foi menor na lesão ovariana quando \ncomparada com as demais, resultados compatíveis com relatos prévios (Suganuma et ai, \n1997; Me Laren et a!, 1997, Nezhat et a!, 2002). Este autor também encontrou altos índices \nde BCL-2 na lesão colon-retal, sugerindo uma menor sensibilidade deste tecido a apoptose. \nEsta diferença no padrão de apoptose pode ser explicada pela teoria de Nisolle e Donnez, \nque defendem etiopatogenias distintas para estes dois tipos de lesão. Neste trabalho ainda, \nos autores encontraram menor expressão do f as na lesão ovariana e colon-retal quando \ncomparada com a lesão peritoneal. Estes resultados sugerem que cada tipo de lesão pode \nutilizar diferentes mecanismos de apoptose. \nNos estudos de Beliard et ai, 2004, a lesão peritoneal expressou maior quantidade \nde BCL-2, quando comparada com endométrio tópico de mulheres com e sem \nendometriose. \nVários trabalhos existem avaliando marcadores de apoptose na endometriose, mas \nem relação ao marcador fas isto ainda não é verdade, principalmente quando o objetivo \né avaliar os diferentes tipos de lesão, justificando a necessidade de novos trabalhos \nnesta área. Em nossa casuística, não encontramos diferenças estatísticas entre o padrão \nde marcação com fas quando comparamos as lesões com os endométrios tópicos ou \nmesmo quando comparamos os diversos tipos de lesões. Nossos resultados apontam \npara outras vias relacionadas a apoptose, que não a via do fas/fasL, na gênese da \nendometriose e na diferenciação dos diversos tipos de lesões. \n\n6. CONCLUSÕES\n\n1. O IPC é maior no tecido glandular endometrial ectópico.\n51 \n2. A glândula da lesão peritoneal apresenta maior IPC que a glândula da lesão de\nsepto reto-vaginal\n3. O estroma do endométrio tópico apresenta-se mais proliferado que o estroma das\nlesões endometriais.\n4. O estroma do endométrio tópico da lesão peritoneal é mais proliferado que o\nestroma do endométrio tópico do endometrioma.\n5. O padrão de apoptose não difere entre as lesões endometriais e entre os\nrespectivos endométrios tópico.\n\n7. BIBLIOGRAFIA\n\n53 \n1) Abrão MS, Podgaec S, Filho BM, Ramos LO, Pinotti JA, de Oliveira RM. Toe\nuse of biochemical markers in the diagnosis of pelvic endometriosis. Hum\nReprod 1997; 12(11): 2523-2527.\n2) Abrão MS, Ikeda F. O impacto da laparoscopia no diagnóstico da endometriose.\nln: Abrão MS (Eds). Endometriose: uma visão contemporânea. Livraria e\nEditora Revinter Ltda. 2000; cap 9.\n3) Ailawadi RK, Jobanputra S, Kataria M, Gutares B, Bulun SE. 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Justificativa e objetivo da pesquisa:\nA endometriose é uma doença que ainda não tem bem estabelecida a \nsua causa, o seu modo de agir e a sua cura. Milhares de estudos estão \nsendo realizados na tentativa de esclarecer todos estes aspectos tendo \ncomo principal finalidade encontrar uma cura para esta doença. \nQueremos com este estudo avaliar o comportamento de sua lesão de \nendometriose e de seu endométrio ( camada mais interna do útero) \natravés de estudo histológico ( estudo da microscopia das células) no \nsentido de entender melhor como e porque estas lesões surgem e como \nse comportam. \nPara o diagnóstico de endometriose normalmente fazemos \nlaparoscopia (cirurgia que se faz por um corte no umbigo e se observa a \ncavidade abdominal através de uma mini câmara). A certeza absoluta da \npresença da endometriose é dada pela análise microscópica de um \npedacinho da lesão que é retirado durante a cirurgia (biópsia). Fazemos \ntambém biópsia do endométrio das pacientes com endometriose, pois \nparece que o endométrio de pacientes com endometriose pode ter \npropriedades diferentes dos endométrios de pacientes sem \nendometriose. \n\n70 \nA proposta deste estudo é estudar um pouco mais este tecido de \nendométrio que será retirado, com o uso de técnicas que permitem ver \ncomo é a proliferação deste tecido, e estamos solicitando sua \nautorização para este estudo. \n2. Os procedimentos que serão utilizados e seus propósitos:\nPara se ter o diagnóstico de certeza da endometriose é necessário \nrealizar laparoscopia, uma cirurgia geralmente sob anestesia geral, na qual \nse introduz uma mini câmara pelo umbigo. Para esta cirurgia, indicada pela \nequipe médica que está acompanhando o seu caso, será dado um Termo de \nConsentimento específico. Como nem sempre só de olhar pode-se ter \ncerteza que a . doença está presente, é necessário retirar um pedacinho da \nlesão presente para mandar para exame. Pequenina quantidade de lesão é \nnecessária para diagnóstico. Geralmente sobra material que pode ser \nestocado em freezer para estudar outras coisas e é isso que estamos \npropondo neste estudo, utilizar este material que sobra para avaliar a \nproliferação da lesão. \nPara estudar o endométrio, é necessário realizar uma biópsia dentro \ndo útero. Neste estudo, ela será feita após a laparoscopia, quando você \nainda estiver anestesiada. \nOs pedacinhos de lesões de endometriose e de endométrio colhidos \nficarão armazenados no freezer e serão todos juntos enviados para análise \nno laboratório. Será estudado o índice de proliferação celular e a apoptose \npara saber se a doença está em atividade \n3. Os desconfortos e riscos esperados:\nAs biópsias do endométrio dentro do útero ou fora dele ( que é a lesão \nda endometriose) têm como principal risco a perfuração do útero e, mais \nraramente pode ter infecção da cavidade uterina ou um pequeno \nsangramento. Estes riscos são pequenos. \nComo os procedimentos serão todos realizados sob anestesia, não há \nnenhum desconforto devido a eles, e são procedimentos rápidos que não \naumentam o tempo de cirurgia. \n\n71 \n4. Formas de ressarcimento e indenização:\nNão haverá recompensa financeira para os pacientes que \nparticiparem do estudo. Porém o preço dos medicamentos para tratamento \nda endometriose é alto e nem todos eles são fornecidos pelo SUS. Todos os \nmedicamentos utilizados neste estudo para o seu tratamento da \nendometriose serão fornecidos de graça. \nQuanto à indenização, esclarecemos que se trata de um projeto sem \nfinanciamento externo e que será desenvolvido com recursos próprios da \ninstituição. Assim sendo, não há uma previsão de seguro para cobertura de \nindenização. Neste sentido, este projeto não se diferencia dos outros que \nnão contam com financiamento externo, e que ainda assim, são \nregularmente desenvolvidos sob responsabilidade do pesquisador e da \nInstituição correspondente. Entretanto, em nenhum momento desconsidera­\nse o direito da paciente obter indenização por eventuais danos que julgar \npertinente. \nRibeirão Preto,_ de _________ de __ _ \nFlávia Maciel de Aguiar \nPesquisadora Responsável \nCRM/SP 103.074 \nFone para contato: (16)91767273 ou (16) 602 2815 \n\nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E \nESCLARECIDO \nEu, \n-' \n72 \nRG Nº _________ , abaixo assinada, tendo sido devidamente \nesclarecida sobre todas as condições que constam no documento \n\"ESCLARECIMENTOS AO SUJEITO DA PESQUISA\", de que trata o \nProjeto de Pesquisa entitulado \"Proliferação celular e apoptose em \nendométrio tópico e ectópico de pacientes com endometriose peritoneal, \novariana e de septo reto-vaginal\" que tem como pesquisador responsável \na Sra. Flávia Maciel de Aguiar, especialmente no que diz respeito ao \nobjetivo da pesquisa, aos procedimentos que serei submetida, aos riscos e \naos benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, \nbem como a forma de indenização por danos decorrentes da pesquisa, \ndeclaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que \nme foram assegurados, a seguir relacionados: \n1. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento\nde qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de\noutras situações relacionadas com a pesquisa a que serei submetido;\n2. A liberdade de retirar o meu consentimento e deixar de participar do\nestudo, a qualquer momento, sem que isso me traga qualquer prejuízo;\n3. A segurança de que não serei identificada e que será mantido o caráter\nconfidencial da informação relacionada a minha privacidade;\n4. O compromisso de que me será prestada informação atualizada durante\no estudo, ainda que esta possa afetar a minha vontade de continuar dele\nparticipando;\n5. O compromisso de que serei devidamente acompanhada e assistida\ndurante todo o período de minha participação no projeto;\nDeclaro ainda, que concordo inteiramente com as condições que me\nforam apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade erri \nparticipar do referido projeto. \nRibeirão Preto, __ de _________ de __ _\nAssinatura da paciente","source_license":"CC0","license_restricted":false}