{"paper_id":"5329d8f1-b7a2-42f9-8871-2d5a01537b1e","body_text":"Local cytokine production in patients with external genital endometriosis\n- Authors: Selkov S.A.1, Kramareva N.L.1, Pavlov O.V.1, Yarmolinskaya М.I.1\n-\nAffiliations:\n- Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott\n- Issue: Vol 51, No 3 (2002)\n- Pages: 57-62\n- Section: Scientific activity\n- Submitted: 25.12.2021\n- Accepted: 25.12.2021\n- Published: 27.12.2021\n- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/91097\n- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD91097\n- ID: 91097\nCite item\nFull Text\nAbstract\nThe article presents the results of the investigation of cytokine production by endometrioid heterotopias in organotypic cultivation in comparison with the cell secretory activity of peritoneal fluid and endometrial tissue in women with external genital endometriosis.\nThe obtained results show systemic changes of regulation of cytokine production in the process of external genital endometriosis development.\nFull Text\nЭндометриоз, по определению В. П. Баскакова [1], - опухолевидное гормонозависимое заболевание, сущность которого заключается в разрастании ткани, сходной по своему строению и функции с эндометрием, но находящейся за пределами границ нормального расположения слизистой оболочки матки, развивающееся на фоне нарушения иммунного гомеостаза.\nПо меткому выражению M. R. Cohen ( 1982) «Эндометриоз является почти эпидемией XX века от менархе до менопаузы».\nНаружный генитальный эндометриоз (НГЭ) не относится к классическим онкологическим заболеваниям, но представляет собой весьма удобную модель для изучения нарушений иммунитета при патологическом разрастании тканей, особенно эктопически расположенных.\nВажная роль иммунитета в контроле пролиферации и дифференцировки клеток является одной из основных догм фундаментальной иммунологии. Это позволяет рассматривать неопластические процессы как результат «поломки» надзорных функций иммунной системы. Такие представления дают возможность не только улучшения диагностики, но и развития методов терапии, связанных с изменениями функций различных компонентов иммунной системы, определяющих противоопухолевый иммунитет. В этом плане большой интерес представляет изучение различных компонентов иммунной системы у больных эндометриозом. Исходя из предположения, что эндометриоз является заболеванием с нарушением «надзорных» функций иммунной системы [2], ранее нами были изучены изменения некоторых основных ее компонентов, определяющих противоопухолевый иммунитет. В частности было показано, что у больных НГЭ значительно снижены цитотоксическая активность NK-клеток и способность лимфоидных клеток к секреции б/в и г-интерферонов.\nОднако несмотря на несомненную важность определения системных изменений иммунитета, можно предполагать, что основное значение имеет местное взаимодействие компонентов иммунной системы и патологически измененных клеток. Именно в очаге локализации эндометриоидных гетеротопий происходят те драматические события, которые определяют пути развития заболевания — или в сторону его прогрессирования, или в направлении регресса (лизирования имплантов). В этом плане огромное значение может иметь динамика и интенсивность продукции различных цитокинов в области разрастаний патологических очагов, а также клетками микроокружения.\nЦитокины являются посредниками межклеточных взаимодействий, регулируют кроветворение, иммунный ответ, клеточный цикл в различных тканях, участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Имеющиеся литературные данные относительно продукции цитокинов у больных НГЭ немногочисленны и противоречивы, что диктует необходимость дальнейшего изучения этой проблемы. Цитокины в первую очередь регулируют развитие местных компенсаторно-приспособительных реакций в тканях с участием различных клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев с формированием типичной воспалительной реакции [3].\nЦелью наших исследований было изучение спектра и интенсивности продукции некоторых цитокинов эндометриоидными гетеротопиями в условиях органотипического культивирования, в сопоставлении с секреторной активностью клеток перитонеального эксудата и тканью эндометрия у женщин с наружным генитальным эндометриозом.\nРисунок 1. Содержание IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий\nРисунок 2. Содержание IL-2, TNF и IL-10 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий\nМатериалы и методы исследований\nПроведено обследование 34 пациенток с НГЭ в возрасте от 19 до 35 лет. Диагноз генитального эндометриоза у всех больных верифицирован при лапароскопии и подтвержден данными гистологического исследования. Степень распространения наружного генитального эндометриоза определялась в баллах по пересмотренной классификации Американского Общества Фертильности R-AFS [5], оценивающей глубину инвазии, площадь эндометриоидных очагов и выраженность спаечного процесса.\nСогласно этой классификации из 34 больных I степень НГЭ была диагностирована у 7 пациенток, II степень у 10, III степень у 8 и IV степень у 9 пациенток.\nВ контрольную группу вошли 15 здоровых женщин репродуктивного возраста, у которых была выполнена хирургическая стерилизация.\nВо время лапароскопии были произведены заборы эндометриоидных гетеротопий, эндометрия и перитонеальной жидкости.\nДля оценки локальной продукции цитокинов тканями проводилось органотипическое культивирование эндометриоидных гетеротопий и эндометрия. Использовалась методика J. Hirata [4] с нашими модификациями. Эндометриоидные гетеротопии и ткань эндометрия после получения незамедлительно помещались в стерильный раствор Хэнкса, трижды отмывались стерильным раствором PBS и помещались в стерильную пробирку, содержащую 1 мл RPM1 1640 с 10% ЭТС и антибиотиками (100 ME/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Далее проводилась инкубация в CO2 инкубаторе (при t=37,0 °C,5% CO2) в течение 1,5 часов. Затем надосадочная жидкость удалялась, к ткани добавлялся 1 мл RPMI 1640 без ЭТС и помещался в CO2-инкубатор на 24 часа. После этого супернатант отбирался и замораживалсяся в стерильных полипропиленовых пробирках при t=-20 °C.\nВ полученных супернатантах эндометриоидных гетеротопий и эндометрия определяли содержание фактора некроза опухоли (TNF), интерлейкина-1ß (IL-1ß), IL-2, IL-6 и IL-8. Концентрацию цитокинов в культуральных средах оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем для определения TNF («Віотаг Diagnostic Systems»), IL-1ß, IL-2, IL-6 и IL-8 («Протеиновый контур», Санкт-Петербург). Уровни указанных цитокинов также определены в перитонеальной жидкости, взятой во время проведения лапароскопии у больных НГЭ и для сравнения у женщин контрольной группы.\nРезультаты исследования\nПри анализе содержания цитокинов в супернатантах культур эндометриоидных гетеротопий были получены следующие результаты: наиболее высоким установлено содержание IL-8, которое составило в среднем 1360,7 пг/мг ткани. Значение IL-6 составило 326,6 пг/мг ткани. Содержание IL-1(3, IL-2 и TNF в абсолютном выражении было невелико (рис. 1,2).\nИзменения содержания в зависимости от степени распространенности НГЭ выявлены в отношении IL-1ß (рис. 3). Так, при I степени НГЭ уровень IL-1(3 составил 1,8 пг/мг, при НГЭ II\nстепени - 2,96 пг/мг, при НГЭ III степени - 8,4 пг/мг и при НГЭ IV степени - 6,18 пг/мг. IL-1 является одним из главных медиаторов, ответственных за развитие местной воспалительной реакции. Местная воспалительная реакция хотя и усиливается при переходе от «малых» форм НГЭ к более тяжелым, но, возможно, является недостаточной для регресса болезни.\nРисунок 3. Содержание интерлейкина-1ß в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространененности НГЭ\nРисунок 4. Содержание IL-8 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространенности НГЭ\nРисунок 5. Содержание IL-6 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространенности НГЭ\nУровень IL-8 зависел от степени распространенности НГЭ и составил при I степени - 254,43 пг/мг, при II степени НГЭ - 910,7 пг/мг, при III степени НГЭ - 3059 пг/мг и при НГЭ IV степени - 789 пг/мг (рис. 4). Такое прогрессивное повышение выработки IL-8 от малых степеней НГЭ к более тяжелым, указывает на усиление пролиферативных процессов, так как именно IL-8 играет ключевую роль в пролиферативной активности эпителиальных клеток и ангиогенезе очага эндометриоза. В то же время снижение уровня IL-8 при IV степени НГЭ может свидетельствовать об уменьшении или истощении резервных секреторных возможностей иммунокомпетентных клеток.\nПодобная динамика отмечалась и при определении уровня IL-6. Содержание IL-6 при НГЭ I степени составило 64 пг/мг, при НГЭ II степени - 311,8 пг/мг, при НГЭ III степени - 1029 пг/мг и при НГЭ IV степени -613,2 пг/мг. На рис. 5 отражено, что наиболее высокие значения содержания IL-6 были отмечены при III и IV степенях НГЭ, что свидетельствует об усилении воспалительной реакции в эндометриоидном очаге при прогрессировании заболевания.\nПри определении содержания IL-2 показано его достоверное повышение, зависисящее от степени тяжести заболевания (минимальное значение при I степени, максимальное при IV степени НГЭ). Так, значение IL-2 при НГЭ I степени составило 4,73 пг/мг, при НГЭ II степени -6,8 пг/мг, при НГЭ III степени - 10,47 пг/мг и при НГЭ IV степени - 26,3 пг/мг. Прогрессивное возрастание продукции IL-2 в зависимости от степени распространенности НГЭ можно расценивать как защитную реакцию иммунной системы, так как основной биологический эффект IL-2 заключается в стимуляции лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью, усиление продукции IFN-γ и противоопухолевой активности.\nДостоверных различий в содержании TNF у пациенток с различной степенью эндометриоза нами обнаружено не было. В среднем его содержание составило 2,31 пг/мг ткани.\nРисунок 6. Содержание IL-2 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространенности НГЭ\nС целью выявления соответствия продукции цитокинов эндо метриоидными гетеротопиями и тканью эндометрия, произведено изучение цитокинового профиля ткани эндометрия больных НГЭ.\nУ всех женщин исследование проводилось во второй фазе менструального цикла. Так, максимальные значения установлены в отношении содержания IL-8 - 2340,5 пг/мг ткани. Выявлены различия в количественном содержании исследуемых цитокинов (IL-1ß, IL-2, IL-6, IL-8 и TNF) в образцах эндометрия (рис. 6). Уровень IL-6 составил 463,2 пг/ мг ткани, IL-2 - 11,8 пг/мг ткани, IL-1ß - 3,85 пг/мг и TNF - 4,66 пг/мг ткани (рис. 7,8).\nРисунок 7.Содержание IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометрия больных НГЭ\nРисунок 8. Содержание IL-2, TNF и IL-1ß в супернатантах эндометрия больных НГЭ\nСреднее содержание IL-8 в супернатантах эндометрия от женщин, больных НГЭ, составило 2340,5 пг/мг, тогда как в контрольной группе 1287,66.\nСреднее содержание IL-6 в супернатантах эндометрия составило 463,16 пг/мг, а в контрольной группе 172,04 пг/мг ткани (рис. 9).\nРисунок 9. Содержание IL-8 IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометрия больныхНГЭ и контрольной группы\nСущественных различий в содержании IL-1(3, IL-2 и TNF в супернатантах эндометрия больных НГЭ и здоровых женщин отмечено не было (рис. 10).\nРисунок 10. Содержание IL-ip, IL-2 и TNF в супернатальных эндометрии больных НГЭ и контрольной группы\nПри анализе образцов перитонеальной жидкости больных НГЭ и женщин контрольной группы, выявлены достоверные отличия в содержании IL-1 ß, TNF, IL-6,IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометрия больных НГЭ и контрольной группы\nРисунок 11. Содержание IL-1ß, IL-6 и IL-8 в перитонеальной жидкости\nРисунок 12. Содержание IL-2 и TNF в перитонеальной жидкости больных\nНГЭ и контрольной группы в то же время при сравнении уровней IL-2 и IL-8 больных НГЭ с аналогичными показателями контрольной группы, достоверных отличий выявлено не было (рис. 11,12).\nИнтересно отметить, что концентрация IL-1ß в перитонеальной жидкости больных эндометриозом более чем в два раза превышала концентрацию IL-1ß в перитонеальной жидкости здоровых женщин.\nУровень TNF в перитонеальной жидкости больных эндометриозом превышал в 7 раз, а IL-6 в два раза по сравнению с аналогичными показателями здоровых женщин.\nОбсуждение результатов исследования\nПри анализе полученных данных выяснено, что при развитии эндометриоза повышен уровень провоспалительных цитокинов как в перитонеальной жидкости, так и в строме эндометрия.\nВозможно, определенную роль в прогрессировании эндометриоза играет IL-8, как важный ангиогенный фактор, способствующий васкуляризации эктопических эндометриальных внедрений.\nПри изучении зависимости концентрации IL-8 от степени распространенности процесса, выявлено его максимальное значение при III-ей степени заболевания, т. е. при переходе от начальной стадии в более тяжелую, при которой усиливаются пролиферативные процессы. В то же время снижение уровня IL-8 при IV степени НГЭ может свидетельствовать о снижении или истощении резервных секреторных возможностей иммунокомпетентных клеток.\nПри изучении уровня IL-8 в супернатантах эндометрия выявлено увеличение его концентрации в 2 раза в эндометрии женщин с генитальным эндометриозом по сравнению с эндометрием здоровых женщин. Возможно, именно стимулирующее действие IL-8 на адгезию клеток эндометрия к брюшине вносит вклад в возникновение эктопических очагов эндометрия, а изменение концентрации этого цитокина отражает выраженность пролиферативного процесса.\nПри анализе содержания IL-6 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий также обращает на себя внимание его повышение в зависимости от степени распространения процесса. Известно, что IL-6 - мультифункциональный цитокин, регулирующий иммунный ответ, острофазную воспалительную реакцию. Этот цитокин отсутствует в сыворотке крови в нормальных: физиологических условиях, но количество его резко повышается при многих иммунологических реакциях, воспалении или повреждениях ткани. Максимальный уровень IL-6 установлен при III степени НГЭ. Можно предположить, что повышение IL-6 при переходе от «малых» форм (I и II степени НГЭ) к более тяжелым (III и IV степени) связано с усилением воспалительной реакции в ответ на повреждение. Парадоксальная реакция в отношении снижения продукции ИЛ-6 при переходе от III к IV степени распространения НГЭ также может быть объяснена достижением при III степени НГЭ максимальной активности клеток, продуцирующих IL-6, и истощением их компенсаторных возможностей при IV степени.\nПовышение более чем в 2 раза продукции IL-1ß и TNF в перитонеальной жидкости больных НГЭ свидетельствует о высоком уровне активности мононуклеарных фагоцитов (о достижении максимального уровня их активации).\nУчитывая тот факт, что IL-6 является антагонистом IL-1ß и TNF, синхронное повышение продукции этих цитокинов можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на снижение уровня продукции про- воспалительных цитокинов, попытку сохранения баланса в цитокиновой сети.\nС нашей точки зрения, повышение продукции IL-6 иммунокомпетентными клетками, участвующих в осуществлении воспалительной реакции и иммунного ответа в перитонеальной жидкости у больных НГЭ, можно расценивать как компенсаторную реакцию в ответ на повышение продукции TNF и IL-1ß.\nВыявленные соответствия в изменении продукции провоспалительных цитокинов тканями эндометриоидных гетеротопий, эндометрия и клетками перитонеального эксудата могут свидетельствовать о системных изменениях регуляции продукции цитокинов в процессе развития НГЭ. Не совсем ясно, почему активированные макрофаги не фагоцитируют эндометриальные клетки, как в здоровом организме, а продолжают выделять интерлейкины, TNF, отсутствующие в таком большом количестве у здоровых женщин. По мнению Dmowski W.P. [6], «переключение» фагоцитарной активности на секреторную перитонеальных макрофагов зависит от «перегрузки» иммунной системы брюшной полости вследствие поступления большого количества эндометриальных клеток, или скорее является проявлением специфических нарушений клеточно-опосредованного иммунитета у больных эндометриозом.\nПри анализе содержания IL-2 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий, отмечено прямое возрастание его концентрации в зависимости от тяжести заболевания. Такое повышение содержания IL-2 в очагах эндометриоза можно объяснитъ как защитную реакцию со стороны иммунной системы, направленную на стимуляцию главным образом функций Т-лимфоцитов и макрофагов, что приводит к развитию клеточного типа ответа. Однако отсутствие ожидаемого повышения уровня IL-2 в супернатантах эндометрия и перитонеальной жидкости больных НГЭ, может свидетельствовать о системных дефектах Т-клеточного звена иммунитета при эндометриозе.\nТаким образом, изучение цитокинового профиля супернатантов эндометрия, эндометриоидных гетеротопий, а также перитонеальной жидкости больных НГЭ позволяет конкретизировать механизмы иммунных нарушений на локальном уровне при эндометриозе. Возможно, именно изменения местного иммунитета создают условия для возникновения и развития очагов эндометриоза.\nДальнейшие исследования в этой области позволят расширить диагностические возможности и выбрать необходимую патогенетически обоснованную терапию, в частности, с использованием генноинженерных аналогов естественных цитокинов.\nAbout the authors\nS. A. Selkov\nResearch Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott\nAuthor for correspondence.\nEmail: info@eco-vector.com\nRussian Federation, Saint Petersburg\nN. L. Kramareva\nResearch Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott\nEmail: info@eco-vector.com\nRussian Federation, Saint Petersburg\nO. V. Pavlov\nResearch Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott\nEmail: info@eco-vector.com\nRussian Federation, Saint Petersburg\nМ. I. Yarmolinskaya\nResearch Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott\nEmail: info@eco-vector.com\nRussian Federation, Saint Petersburg","source_license":"CC0","license_restricted":false}