{"paper_id":"4861a24a-130f-4101-b878-255995cfdfbf","body_text":"Programa de Doctorado en Biomedicina \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nEstudio y caracterización de células \nestromales uterinas procedentes de mujeres \nsanas y con endometriosis \n \nMemoria presentada por Tatiana Llorca Colomina para \noptar al título de Doctora por la Universidad de Granada \n \nGranada, 2024 \n\n\n \n2 \n \nRESUMEN \n \nEstudio y caracterización de células \nestromales uterinas procedentes de mujeres \nsanas y con endometriosis \nTESIS DOCTORAL \nBajo la dirección del Dr. Enrique García Olivares y la Dra. María José \nRuiz Magaña \nTatiana Llorca Colomina \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nEditor: Universidad de Granada. Tesis Doctorales \nAutor: Tatiana Llorca Colomina \nISBN: 978-84-1195-251-4 \nURI: https://hdl.handle.net/10481/90820 \n \n\n \nIII \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA mis padres, Jorge y Conchi \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nIV \n \nAgradecimientos \n“¿Has pensado en seguir el próximo año con la investigación y empezar la tesis doctoral?” Sí, \nLA TESIS DOCTORAL. Siendo sincera, en aquel momento no tenía ni idea de lo que implicaba \nembarcarse en esta aventura que ha sido el doctorado, pero lo hice y ya han pasado más de 6 \naños. No ha sido un camino fácil, de hecho ha sido bastante duro, pero puedo decir con total \nconvencimiento que no me arrepiento de la decisión que tomé. Tras vivir una pandemia y un \nincendio en el centro de investigación, y a pesar de todos los problemas que surg en en el día a \ndía de un investigador (por ejemplo, que el citómetro decida no funcionar cuando tienes el \nexperimento preparado, que el pedido de cámaras Transwell tarde seis meses en llegar, que al \n-80°C se le ocurra pararse en fin de semana, que de 5 muestras de endometriosis solo llegue a \ncrecer una, que los linfocitos y monocitos no quieran migrar…), puedo decir que todos estos \nobstáculos no han sido nada en comparación con todas las cosas maravillosas que me ha \npermitido vivir el doctorado. Y en particular, quiero aprovechar estas líneas para agradecer a todas \nlas personas que han hecho posible que pueda conseguir mi objetivo. A todos vosotros… \nMUCHAS GRACIAS. \nMis primeras palabras de agradecimiento son para mis directores: Enrique y María José. \nEnrique, muchas gracias por considerar que yo podía formar parte de tu equipo de investigación; \npor brindarme esta oportunidad; por confiar en mí desde aquella primera entrevista del máster; por \nestar siempre muy pendiente de mi trabajo y valorarlo; por en señarme a investigar; y, en estos \núltimos meses, por tu inestimable ayuda y guía en la redacción y corrección de esta tesis. Siempre \nme encantó escuchar cómo razonabas y llegabas a interpretar los resultados que te presentaba \nde una manera lógica y sencill a, gracias por hacerlo todo más fácil. Espero seguir apre ndiendo \nmuchas cosas de ti. \nMaría José, tú fuiste quien me planteó aquella primera pregunta: “¿has pensado en seguir el \npróximo año con la investigación y empezar la tesis doctoral?” . Confiaste en mí desde el primer \nmomento y no puedo sentirme más agradecida. Tu labor no fue solamente el de una codirectora, \ngracias por convertirte en una madre en el laboratorio. Durante todos los momentos difíciles \n(cuando he recibido malas noticias; cuando los exp erimentos no me han salido bien; cuando \nsentía tanta incertidumbre , que no sabía qué decisión era la más adecuada para mí y lo mejor \npara mi futuro), tú has estado ahí, dispuesta a escucharme y a aconsejarme de la mejor manera \nposible. Las dos sabemos que estos años tampoco han sido fáciles para ti, pero tengo que decirte \nque estoy muy contenta y orgullosa de ver que has alcanzado la meta que tanto deseabas. Sin \nduda, te lo mereces. \nNo puedo olvidarme de otras dos personas que también fueron mis maestras en muchos \nmomentos: Mari Carmen y Ana. Gracias a las dos por todas las sugerencias y buenos consejos \nque me habéis dado en los seminarios de grupo. Siempre he intentado ponerlos en práctica y \naprender mucho de vosotras y de vuestra experiencia investigadora. También me gustaría dar las \ngracias a Blanco. Tus intervenciones en los seminarios muchas veces aclaraban todas las dudas \nque tenía. Gracias también por estar siempre dispuesto a compartir una alícuota de anticuerpos \ncuando lo he necesitado. \nQuiero agradecer a Pepe su colaboración en la obtención y el envío constante de muestras de \nendometriosis; sin ello, parte de esta tesis no se hubiera podido realizar. \nMe gustaría dedicar unas líneas a José Antonio Galindo. En primer lugar, infinitas gracias por \ntu paciencia Jos é, cuando te preguntaba constantemente si tenías noticias del pedido de las \n\n\n \nV \n \nTranswell. Tu labor hace que el trabajo diario en el laboratorio sea mucho más sencillo. Gracias \npor estar dispuesto a ayudarme cuando te he necesitado y por ser una persona tan generosa. \nPero sin duda, lo que más valoro son los ratitos de charla que he tenido contigo. Me encanta \nescucharte porque siempre aprendo muchas cos as de ti. Intentaré recordar los sabios consejos \nque me has dado a lo largo de estos años. \nY llega el momento de hablar de MI FAMILIA EN EL LABORATORIO. Todo hubiese sido \nmucho más difícil sin tener a mi lado a estas cinco maravillosas personas: Salva, Ro cío, Laura, \nCris y Patri. \nTener la oportunidad de trabajar al lado de Salva, Rocío y Laura hizo que , durante los primeros \naños del doctorado, aprendiera muchas técnicas y desarrollara habilidades que me han sido muy \nútiles después. Siempre os admiraré y o s querré mucho porque en el ámbito laboral sois mi \nejemplo a seguir. Salva, recuerdo que cuando era alumna del máster me quedaba mirándote y \npensaba: “¿cómo es posible que haga tantas cosas a la vez y le salga todo tan bien? ”. La \nrespuesta es sencilla: por tus ganas de trabajar y de aprender, por tu entusiasmo y por tu \ndedicación. Gracias porque, aunque no tenías ninguna obligación de hacerlo, siempre estuviste \ndispuesto a darme el mejor consejo y a compartir tu experiencia conmigo. Te admiro mucho y \nestoy muy feliz de ver todo lo que has conseguido en los últimos años. \nRoci, fuiste un apoyo muy grande durante mis inicios. En infinidad de ocasiones antepusiste \nayudarme con el diseño de mis experimentos a continuar con tu trabajo. Gracias por tu \ngenerosidad, por tu bondad, por compartir todo lo que sabías, por ponerte en mi lugar y ayudarme \nsiempre que te necesité . Puedo decir que gran parte de mis conocimientos sobre biología \nmolecular te los debo a ti. \nLaura, empezamos este camino juntas y se puede decir que también lo terminamos juntas, y \nesto me hace muy feliz. Recuerdo que ir al laboratorio cada día era mucho más sencillo y divertido \nporque tú estabas allí, en la mesa de al lado. Tras muchas dese nsibilizaciones, citometrías y \nWestern Blot; pero también tras muchos sustos y shawarmas (o falafel) en la salita de comida, se \nforjó una amistad que permaneció a pesar del tiempo y la distancia (que ha sido muy grande) y \ndeseo de corazón que esto siga siendo así. \nEn los últimos años también he tenido a dos pers onas a mi lado que han sido compañeras, \namigas e incluso hermanas. Cris (mi Cristi), tú fuiste quien sustituyó a Laura en la mesa de al lado. \nRecuerdo que le decía: “ha entrado una chica nueva de TFM que se sienta en tu sitio y es un \nencanto”. No solo eres un encanto de persona, eres mi mano derecha y un refugio tanto en los \nbuenos como en los malos momentos . La complicidad que tenemos cuando trabajamos juntas \nhace que el trabajo diario sea mucho más sencillo, ameno y divertido. Y hablando del trabajo en \ncomún, ¿recuerdas la cantidad de horas metidas en la salita del microscopio haciendo fotos de la \ninvasión? Ahí descubrí que vas a ser una grandísima investigadora, una investigadora muy \ndisciplinada que realiza un trabajo constante y minucioso. Sé que vas a brillar en todo lo que te \npropongas. \nPatri, eres la sonrisa del 244. Ahora estás un poquito más lejos , pero tanto Cris como yo \ncontamos los meses para volver a verte entrar por la puerta del laboratorio. Admiro mucho tu \nvalentía para afrontar nuevos retos , retos bastante difíciles. Estoy muy orgullosa de ver que \naquella alumna del máster que hacía ICP e irradiaciones semana sí, semana también, se ha \nconvertido en una excelente investigadora y mejor persona. \n\n\n \nVI \n \nEstos años también he tenido la oportunidad de m entorizar a diferentes estudiantes de máster. \nGracias a ellas he descubierto cuá nto me gusta enseñar y que deseo dedicarme a ello en un \nfuturo, espero, no muy lejano. Gracias Olga, Lucía y Blanca por ser unas alumnas muy aplicadas; \ngracias por vuestras ganas de aprender y por aportar vuestro granito de arena en la publicación \ndel artículo que respalda esta tesis. \nDeseo destacar el vínculo tan bonito que hemos creado con otros compañeros y compañeras \ndel centro de investigación. Especial mención merece Ma ribel y las chicas del 247, Carmen e \nInma. Pero no quiero olvidarme de Ali, Carlos, Dani y Paula. También quiero agradecer a María \nPedrosa el ánimo que siempre me ha dado y que me recordara , muchas veces, que soy capaz de \nalcanzar esta meta. \nLa vida en Granada no sería lo mismo sin mis amigos, que tanto me han apoyado, animado y \ncuidado. Ellos son mi segunda familia y , vaya donde vaya , los llevaré en el corazón porque \ncompartimos lo más importante. Gracias, mi querida Albaicín; merci, m a chère assemblée \nfrançaise. \n Estas últimas palabras de agradecimiento son para las personas más importantes de mi vida y \na quienes va dedicada esta tesis: MIS PADRES. Sin ninguna duda, esto no habría sido posible sin \nvuestro apoyo y confianza en mí. Gr acias por intentar entender el mundo de la ciencia que es (o \nera) completame nte desconocido para vosotros. Me habéis levantado en los momentos más \ndifíciles, habéis sufrido conmigo ; pero sé que ahora estáis muy orgullosos de ver que he \nconseguido llegar al final. Y vuestra alegría me hace inmensamente feliz. \n I, finalment, moltes gràcies a mi mateixa, per no haver tingut por d’escollir aquest camí, per \nhaver arribat a la fi sense rendir -me i per tenir sempre present que “tots els que gaudeixen \nd’aquestes obres grandioses les estudien”. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nVII \n \nAbreviaturas \n ADN: ácido desoxirribonucleico \n ADNc: ADN complementario \n ALDH1A1: isoforma A1 de la aldehído deshidrogenasa 1 \n AMPc: adenosín monofosfato cíclico \n AMV: transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar \n ANGPT1: angiopoyetina 1 \n ANGPT2: angiopoyetina 2 \n AP: fosfatasa alcalina \n APC: aloficocianina/célula presentadora de antígenos \n ARN: ácido ribonucleico \n ARNm: ARN mensajero \n α-SMA: alfa actina de músculo liso \n ATCC: “American Type Culture Collection” \n BAFF: factor activador de células B \n BAFFR: receptor del factor activador de células B \n BSA: albúmina sérica bovina \n CCL2: quimioquina 2 con motivo CC. También conocida como MCP-1 \n CCL3: quimioquina 3 con motivo CC. También conocida como MIP-1α \n CCL4: quimioquina 4 con motivo CC. También conocida como MIP-1β \n CCL5: quimioquina 5 con motivo CC. También conocida como RANTES \n CCL7: quimioquina 7 con motivo CC. También conocida como MCP-3 \n CCL11: quimioquina 11 con motivo CC \n CCL16: quimioquina 16 con motivo CC \n CCL19: quimioquina 19 con motivo CC \n CCL21: quimioquina 21 con motivo CC \n CCL22: quimioquina 22 con motivo CC \n CCL25: quimioquina 25 con motivo CC \n CDKN1A: inhibidor 1A de la quinasa dependiente de ciclina \n CDKN1B: inhibidor 1B de la quinasa dependiente de ciclina \n CDKN2A: inhibidor 2A de la quinasa dependiente de ciclina \n C/EBP-α: proteína de unión al enhancer CCAAT alfa \n C/EBP-β: proteína de unión al enhancer CCAAT beta \n CHEK2: proteína quinasa-serina/treonina CHK2 \n CIC-CIBM: Centro de Instrumentación Científica. Sede en el Centro de Investigación Biomédica \n CKBP: “chemokine binding proteins” o proteínas de unión a quimioquinas \n CRH: hormona liberadora de corticotropina \n CSF-1 (M-CSF): factor estimulante de colonias 1. También conocido como factor estimulante \nde colonias de macrófagos \n CT: “cycle threshold” o ciclo umbral \n CXCL1: quimioquina 1 con motivo CXC. También conocida como GRO-α \n CXCL2: quimioquina 2 con motivo CXC. También conocida como MIP-2α \n CXCL8: quimioquina 8 con motivo CXC \n CXCL9: quimioquina 9 con motivo CXC. También conocida como MIG (monoquina inducida por \ninterferón gamma) \n\n\n \nVIII \n \n CXCL10: quimioquina 10 con motivo CXC. También conocida como IP-10 (proteína 10 inducida \npor interferón gamma) \n CXCL11: quimioquina 11 con motivo CXC. También conocida como I-TAC (quimioquina alfa de \ncélulas T inducible por interferón) \n CXCL12: quimioquina 12 con motivo CXC. También conocida como SDF-1 \n CXCL13: quimioquina 13 con motivo CXC \n CXCL14: quimioquina 14 con motivo CXC \n CX3CL1: quimioquina 1 con motivo CX3C \n CXCR3: receptor de quimioquinas CXC tipo 3. También conocido como CD183 \n CXCR4: receptor de quimioquinas CXC tipo 4. También conocido como CD184 \n DAMP: patrones moleculares asociados a daño \n DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro \n DC: célula dendrítica \n dDSC: célula decidual estromal decidualizada \n deEnSC: célula endometriósica estromal decidualizada \n dEnSC: célula endometrial estromal decidualizada \n DEPC: dietilpirocarbonato \n DNAsa I: desoxirribonucleasa I \n dNTP: desoxinucleótidos trifosfato \n DO: densidad óptica \n DR6: receptor de muerte celular 6 \n EDC: químico disruptor endocrino \n EDTA: ácido etilendiaminotetraacético \n ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas \n eMSC: célula madre mesenquimal endometrial \n ER-α: receptor de estrógenos alfa \n ER-β: receptor de estrógenos beta \n FasL: ligando de Fas \n FBS: suero bovino fetal \n FC: “fold change” o porcentaje de cambio \n FGF2: factor de crecimiento de fibroblastos 2 \n FITC: isotiocianato de fluoresceína \n FOXO1: factor de transcripción “Forkhead box protein O1” \n FSH: hormona foliculoestimulante \n GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa \n GM-CSF: factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos \n GnRH: hormona liberadora de gonadotropina \n GPCR: receptor acoplado a proteína G \n hESC: célula madre embrionaria humana \n HGF: factor de crecimiento de hepatocitos \n HLA-DR: antígeno leucocitario humano (clase II, locus DR) \n HOXA10: factor de transcripción “Homeobox A10” \n HRP: enzima peroxidasa de rábano \n ICAM-1 (CD54): molécula de adhesión intercelular 1 \n IDO: indolamina-2,3-dioxigenasa \n IDT: “Integrated DNA technologies” \n IFN-γ: interferón gamma \n IGF-1: factor de crecimiento similar a la insulina 1 \n\n\n \nIX \n \n IGF-1R: receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 \n IGFBP-1: proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina \n IL-1β: interleucina 1β \n IL-2: interleucina 2 \n IL-4: interleucina 4 \n IL-6: interleucina 6 \n IL-8: interleucina 8 \n IL-10: interleucina 10 \n IL-11: interleucina 11 \n IL-13: interleucina 13 \n IL-15: interleucina 15 \n IL-15Rβ: subunidad β del receptor de la IL-15 \n IL-17: interleucina 17 \n IL-18: interleucina 18 \n IL-24: interleucina 24 \n IL-33: interleucina 33 \n ILC: célula linfoide innata \n ILC-3: célula linfoide innata tipo 3 \n IMF: intensidad media de fluorescencia \n IP: ioduro de propidio \n IPBLN: Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra \n IRF-1: factor de transcripción regulador de interferón 1 \n ISCT: “International Society for Cellular Therapy” o Sociedad Internacional de Terapia Celular \n KIR: receptor similar a inmunoglobulina de células NK \n LH: hormona luteinizante \n LIF: factor inhibidor de la leucemia \n LTi: célula inductora de tejido linfoide \n LTi-like: célula similar a la inductora de tejido linfoide \n LTo: célula organizadora de tejido linfoide \n M1: macrófago proinflamatorio \n M2: macrófago antiinflamatorio \n MC: medio condicionado \n MCP-1: proteína quimiotáctica de monocitos 1. También conocida como CCL2 \n MCP-3: proteína quimiotáctica de monocitos 3. También conocida como CCL7 \n M-CSF (CSF-1): factor estimulante de colonias de macrófagos. También conocido como factor \nestimulante de colonias 1 \n MEC: matriz extracelular \n MIC-1: citoquina 1 inhibidora de macrófagos \n MIF: factor inhibidor de la migración de macrófagos \n MIP-1β: proteína inflamatoria de macrófagos 1 beta. También conocida como CCL4 \n MMP-2: metaloproteinasa de la matriz 2 \n MMP-9: metaloproteinasa de la matriz 9 \n MMR (CD206) : receptor de manosa de macró fagos/ “mismatch repair genes” o sistema de \nreparación de errores de emparejamiento del ADN \n MSC: célula madre mesenquimal \n MWCO: “molecular weight cut off” o corte de peso molecular \n NCAM-1 (CD56): molécula de adhesión celular neural 1 \n\n\n \nX \n \n NCR: receptor de citotoxicidad natural \n NFC: “negative fold change” o porcentaje de cambio negativo \n NFW: “nuclease-free water” o agua libre de nucleasas \n NK: célula “natural killer” o asesina natural \n NP-40: nonilfenol etoxilado \n pb: pares de bases \n PBL: linfocitos de sangre periférica \n PBMC: células mononucleares de sangre periférica \n PBS: tampón fosfato salino \n PCR: reacción en cadena de la polimerasa \n PE: ficoeritrina \n PFA: paraformaldehido \n PGE2: prostaglandina E2 \n PGF: factor de crecimiento placentario \n PHA: fitohemaglutinina-M \n PKA: proteína quinasa A \n PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo \n PPARγ2: “peroxisome proliferator-activated receptor-gamma 2” \n PR-A: receptor de la progesterona, isoforma A \n PR-B: receptor de la progesterona, isoforma B \n preDSC: célula pre-decidual estromal (no decidualizada) \n preeEnSC: célula pre-endometriósica estromal (no decidualizada) \n preEnSC: célula pre-endometrial estromal (no decidualizada) \n PRL: prolactina \n PVDF: difluoruro de polivinilideno \n RANKL: ligando de receptor activador para el factor nuclear κB \n RNAsa: ribonucleasa \n rpm: revoluciones por minuto \n SD: desviación estándar \n SDS: dodecilsulfato sódico \n SLO: órgano linfoide secundario \n SSEA-1: antígeno embrionario 1 específico de estadío \n ST2: receptor supresor de tumorigenicidad 2 \n STAT3: transductor de señal y activador de la transcripción 3 \n STAT5: transductor de señal y activador de la transcripción 5 \n SUSD2: “sushi domain containing 2” \n Tc: célula T citotóxica \n TCIF: factor inhibidor de la quimiotaxis de células T \n TGF-β1: factor de crecimiento transformante β1 \n Th1: célula T cooperadora tipo 1 \n Th2: célula T cooperadora tipo 2 \n Th17: célula T cooperadora tipo 17 \n TLR: receptor “Toll-like” \n Tm: temperatura de “melting” o fusión del ADN \n TMB: tetrametilbencidina \n TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa \n TNFR: receptor del factor de necrosis tumoral \n\n\n \nXI \n \n Treg: célula T reguladora \n uNK: célula NK uterina \n VCAM-1 (CD106): molécula de adhesión celular vascular 1 \n VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular \n VEGF-C: factor de crecimiento endotelial vascular C \n \nLa nomenclatura empleada en nuestro estudio es la siguiente: \n1. EnSC: célula endometrial estromal (obtenida de sangre menstrual) \na) preEnSC: célula endometrial estromal no decidualizada \nb) dEnSC: célula endometrial estromal decidualizada \n \n2. DSC: célula decidual estromal \na) preDSC: célula decidual estromal no decidualizada \nb) dDSC: célula decidual estromal decidualizada \n \n3. eEnSC: célula endometriósica estromal \na) preeEnSC: célula endometriósica estromal no decidualizada \nb) deEnSC: célula endometriósica estromal decidualizada \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nXII \n \nÍndice de contenidos \nRESUMEN ................................ ................................ ................................ ................................ .... 18 \nINTRODUCCIÓN ................................ ................................ ................................ .......................... 21 \n1. EL ENDOMETRIO ................................ ................................ ................................ .................. 22 \n1.1. El ciclo endometrial ................................ ................................ ................................ ..... 22 \n1.1.1. Fase menstrual ................................ ................................ ................................ .... 22 \n1.1.2. Fase proliferativa ................................ ................................ ................................ .. 24 \n1.1.3. Fase secretora ................................ ................................ ................................ ..... 25 \n2. CELULAS ENDOMETRIALES ESTROMALES ................................ ................................ ............... 26 \n2.1. Regeneración epitelial ................................ ................................ ................................ . 26 \n2.2. Regeneración estromal y vascular ................................ ................................ .............. 27 \n3. LA DECIDUALIZACION ................................ ................................ ................................ ............ 29 \n3.1. Señalización hormonal ................................ ................................ ................................ 29 \n3.2. Efecto de la decidualización sobre el fenotipo y las funciones celulares ...................... 30 \n3.2.1. Cambios tisulares ................................ ................................ ................................ . 30 \n3.2.2. Características celulares y ultraestructurales ................................ ....................... 31 \n3.2.3. Secretoma y marcadores de decidualización ................................ ....................... 31 \n4. LA DECIDUA ................................ ................................ ................................ ......................... 32 \n4.1. La inmunología del embarazo ................................ ................................ ..................... 33 \n4.1.1. La implantación y placentación constituyen una etapa proinflamatoria ................. 33 \n4.1.2. El crecimiento fetal constituye una etapa antiinflamatoria................................ ..... 33 \n4.1.3. El parto se desencadena tras una etapa proinflamatoria ................................ ...... 34 \n5. CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES ................................ ................................ ..................... 34 \n5.1. Origen mesenquimal de las DSC ................................ ................................ ................ 35 \n5.2. Efecto de las DSC sobre las células inmunitarias de la decidua ................................ .. 35 \n5.3. Efecto de las células inmunitarias deciduales sobre las DSC ................................ ...... 38 \n6. ENDOMETRIOSIS ................................ ................................ ................................ .................. 39 \n6.1. Etiopatogenia de la endometriosis ................................ ................................ ............... 39 \n6.1.1. Origen a partir de endometrio uterino ................................ ................................ ... 39 \n6.1.2. Origen a partir de endometrio extrauterino ................................ ........................... 40 \n6.2. Células endometriósicas estromales ................................ ................................ ........... 41 \n6.3. Factores que intervienen en el establecimiento de la enfermedad .............................. 41 \n6.3.1. Predisposición genética ................................ ................................ ....................... 41 \n6.3.1.1. Apoptosis ................................ ................................ ................................ .......... 42 \n6.3.2. Papel de la epigenética ................................ ................................ ........................ 43 \n6.3.3. Factores endocrinos ................................ ................................ ............................. 43 \n6.4. El microambiente inmunitario de la lesión endometriósica ................................ ........... 44 \n6.4.1. El sistema inmunitario innato en la endometriosis ................................ ................ 44 \n6.4.2. El sistema inmunitario adaptativo en la endometriosis ................................ ......... 46 \nHIPÓTESIS ................................ ................................ ................................ ................................ ... 49 \nOBJETIVOS ................................ ................................ ................................ ................................ . 51 \nMATERIAL Y MÉTODOS ................................ ................................ ................................ ............. 53 \n1. CULTIVOS CELULARES ................................ ................................ ................................ .......... 54 \n1.1. Células endometriales estromales procedentes de sangre menstrual ......................... 54 \n1.1.1. Obtención y cultivo de EnSC ................................ ................................ ................ 54 \n1.2. Células deciduales estromales ................................ ................................ .................... 55 \n\n\n \nXIII \n \n1.2.1. Obtención y cultivo de DSC ................................ ................................ .................. 55 \n1.2.1.1. Eficiencia clonogénica ................................ ................................ ...................... 56 \n1.2.1.2. Diferenciación mesenquimal ................................ ................................ ............. 56 \n1.2.1.3. Ensayo de contracción del gel de colágeno ................................ ...................... 57 \n1.3. Células procedentes de quiste de endometriosis................................ ......................... 57 \n1.3.1. Obtención y cultivo de eEnSC ................................ ................................ .............. 57 \n1.4. Células madre mesenquimales de médula ósea ................................ ......................... 58 \n1.4.1. Obtención y cultivo de MSC ................................ ................................ ................. 58 \n1.5. Decidualización ................................ ................................ ................................ ........... 59 \n1.6. Células mononucleares de sangre periférica ................................ ............................... 59 \n1.6.1. Aislamiento de monocitos................................ ................................ ..................... 59 \n1.6.2. Aislamiento y activación de linfocitos ................................ ................................ ... 60 \n1.6.2.1. Bloqueo del receptor CXCR3 en linfocitos ................................ ........................ 61 \n1.7. Líneas celulares tumorales ................................ ................................ .......................... 61 \n2. OBTENCIÓN Y TRATAMIENTOS DE LOS MEDIOS CONDICIONADOS ................................ .............. 62 \n2.1. Diálisis ................................ ................................ ................................ ......................... 62 \n2.2. Tratamiento térmico ................................ ................................ ................................ .... 62 \n3. ENSAYO DE MIGRACIÓN CELULAR EN CÁMARA TRANSWELL ................................ ..................... 62 \n4. CITOMETRÍA DE FLUJO ................................ ................................ ................................ .......... 63 \n4.1. Análisis fenotípico de EnSC, DSC, eEnSC y MSC ................................ ...................... 63 \n4.2. Análisis fenotípico de monocitos de sangre periférica y células THP-1 ....................... 66 \n4.3. Análisis fenotípico de PBL activados y células Jurkat ................................ .................. 67 \n4.4. Determinación de células apoptóticas ................................ ................................ ......... 69 \n5. INMUNOCITOQUÍMICA Y MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA ................................ ..................... 69 \n6. INMUNOHISTOQUÍMICA Y MICROSCOPÍA CONFOCAL ................................ ................................ . 70 \n7. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ................................ ................................ ..................... 71 \n7.1. Extracción de ARN ................................ ................................ ................................ ...... 71 \n7.2. Retrotranscripción ................................ ................................ ................................ ....... 72 \n8. PCR ................................ ................................ ................................ ................................ ... 74 \n8.1. PCR cualitativa ................................ ................................ ................................ ............ 74 \n8.1.1. Análisis de ADN complementario ................................ ................................ ......... 74 \n8.1.2. Visualización del producto de PCR en gel de agarosa ................................ ......... 78 \n8.2. PCR cuantitativa................................ ................................ ................................ .......... 78 \n9. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOT ................................ ........................ 81 \n10. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS POR ELISA ................................ ................................ ..... 83 \n11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO................................ ................................ ................................ ......... 84 \nRESULTADOS ................................ ................................ ................................ ............................. 85 \n1. CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES HUMANAS ................................ ................................ ...... 86 \n1.1. Características generales de las DSC ................................ ................................ ......... 86 \n1.2. DSC como células madre mesenquimales ................................ ................................ .. 88 \n1.2.1. Fenotipo antigénico compatible con MSC de médula ósea ................................ .. 88 \n1.2.2. Funciones asociadas a MSC. Formación de colonias y diferenciación mesenquimal\n ……………………………………………………………………………………………..88 \n1.2.3. Decidualización de preDSC y MSC ................................ ................................ ...... 89 \n1.3. DSC como células perivasculares ................................ ................................ ............... 90 \n1.3.1. Características de pericitos de las preDSC ................................ .......................... 90 \n1.3.2. Localización perivascular de las preDSC ................................ ............................. 91 \n1.4. Clonos de DSC ................................ ................................ ................................ ........... 94 \n1.5. Decidualización de preDSC ................................ ................................ ......................... 96 \n\n\n \nXIV \n \n1.5.1. Comparación del fenotipo de preDSC y dDSC ................................ ..................... 96 \n1.5.2. Expresión y secreción de citoquinas por preDSC y dDSC ................................ .... 97 \n1.5.3. Expresión de factores angiogénicos por preDSC y dDSC ................................ .. 100 \n1.5.4. Efecto antitumoral de preDSC y dDSC ................................ ............................... 101 \n1.6. Actividad quimiotáctica de DSC ................................ ................................ ................. 102 \n1.6.1. Actividad quimiotáctica de DSC sobre células T obtenidas de sangre periférica 102 \n1.6.1.1. Fenotipo antigénico de PBL activados ................................ ............................ 102 \n1.6.1.2. Quimiotaxis de PBL activados debida a los factores secretados por DSC ...... 103 \n1.6.1.3. Efecto de los MC de DSC sobre la quimiotaxis de las subpoblaciones de PBL \nactivados ................................ ................................ ................................ ...................... 106 \n1.6.2. Actividad quimiotáctica de DSC sobre las líneas tumorales Jurkat y THP-1 ....... 108 \n2. CÉLULAS ENDOMETRIALES ESTROMALES HUMANAS ................................ .............................. 109 \n2.1. Características generales de las EnSC ................................ ................................ ..... 109 \n2.2. Fenotipo antigénico compatible con MSC de médula ósea ................................ ....... 111 \n3. DIFERENCIAS ENTRE DSC Y ENSC ................................ ................................ ..................... 111 \n3.1. Marcadores y funciones asociadas a la decidualización ................................ ............ 111 \n3.2. Expresión de proteínas relacionadas con la decidualización ................................ ..... 112 \n3.3. Comparación del fenotipo antigénico de preDSC y preEnSC ................................ .... 114 \n3.4. Expresión y secreción de quimioquinas por DSC y EnSC ................................ ......... 116 \n3.5. Actividad quimiotáctica de DSC y EnSC sobre células T obtenidas de sangre periférica\n …………………………………………………………………………………………………117 \n4. ENDOMETRIOSIS ................................ ................................ ................................ ................ 118 \n 4.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS EENSC ................................ ............................ 118 \n4.2. Fenotipo compatible con MSC de médula ósea ................................ ........................ 120 \n5. DIFERENCIAS ENTRE ENSC Y EENSC ................................ ................................ ..................... 121 \n5.1. Marcadores y funciones asociadas a la decidualización ................................ ............ 121 \n5.2. Comparación del fenotipo antigénico de preEnSC y preeEnSC ................................ 122 \n5.3. Expresión y secreción de quimioquinas por EnSC y eEnSC ................................ ..... 124 \n5.4. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC ................................ ................................ 125 \n5.4.1. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC sobre PBL activados de sangre \nperiférica ................................ ................................ ................................ .......................... 125 \n 5.4.1.1. Efecto de los MC de EnSC y eEnSC sobre la quimiotaxis de las subpoblaciones \nde PBL activados ................................ ................................ ................................ ............. 127 \n5.4.2. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC sobre monocitos de sangre periférica\n ……………………………………………………………………………………………128 \n5.4.2.1. Cambios en el fenotipo antigénico de monocitos de sangre periférica en \ncontacto con los MC de EnSC y eEnSC ................................ ................................ ....... 130 \n5.4.2.2. Fenotipo antigénico de los monocitos quimioatraídos por los MC de EnSC y \neEnSC…………………………………………………………………………………………...130 \n5.4.3. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC sobre células tumorales: Jurkat y THP-1\n ……………………………………………………………………………………………132 \n5.4.3.1. Cambios en el fenotipo antigénico de células THP-1 en contacto con los MC de \nEnSC y eEnSC ................................ ................................ ................................ ............. 133 \n5.4.3.2. Fenotipo antigénico de células THP-1 quimioatraídas por los MC de EnSC y \neEnSC…………………………………………………………………………………………...134 \nDISCUSIÓN ................................ ................................ ................................ ................................ 136 \nCONCLUSIONES ................................ ................................ ................................ ....................... 156 \nBIBLIOGRAFÍA ................................ ................................ ................................ .......................... 158 \n\n\n \nXV \n \nÍndice de ilustraciones, figuras y tablas \n \nIlustraciones \nIlustración 1. Esquema representativo del ciclo endometrial: niveles hormonales y células \ninmunitarias en cada fase del ciclo ................................ ................................ ............................... 23 \nIlustración 2. Células progenitoras epiteliales presentes en las glándulas endometriales ............ 27 \nIlustración 3. Ubicación de las células progenitoras en el estroma endometrial........................... 28 \nIlustración 4. Mecanismo bioquímico de la decidualización en las EnSC y DSC.. ...................... 30 \nIlustración 5. La decidualización de las células estromales: cambios morfológicos y bioquímicos..\n ................................ ................................ ................................ ................................ ..................... 32 \nIlustración 6. Efectos de las DSC sobre las células NK.. ................................ ............................. 36 \nIlustración 7. Efectos de las DSC sobre las DC ................................ ................................ ........... 37 \nIlustración 8. Efectos de las DSC sobre monocitos y macrófagos. ................................ .............. 37 \nIlustración 9. Efectos de las DSC sobre células T.. ................................ ................................ ..... 38 \nIlustración 10. Representación esquemática del microambiente inmunitario en la lesión de \nendometriosis. ................................ ................................ ................................ .............................. 45 \nIlustración 11. Respuestas inmunitarias en la endometriosis. ................................ ...................... 48 \nIlustración 12. Esquema resumen de los ensayos de migración en cámara Transwell. ............... 63 \nIlustración 13. Esquema representativo de los parámetros empleados en la retrotranscripción. . 73 \nIlustración 14. Esquema representativo de los parámetros empleados en la PCR cualitativa. .... 74 \nIlustración 15. Esquema representativo de los parámetros empleados en la PCR cuantitativa. .. 79 \nIlustración 16. Esquema representativo del ELISA tipo sándwich. ................................ .............. 84 \nIlustración 17. Esquema representativo de la evolución de la expresión de diferentes marcadores \nen DSC durante el proceso de decidualización ................................ ................................ ........... 142 \nIlustración 18. Esquema representativo del posible mecanismo de acción de los factores \nsecretados por DSC en la decidua humana, en un embarazo normal y en un contexto patológico..\n ................................ ................................ ................................ ................................ ................... 148 \nIlustración 19. Esquema representativo de la decidualización de células endometriales \nestromales precursoras (preEnSC) a células endometriales estromales decidualizadas (dEnSC) y \nde la decidualización de células deciduales estromales precursoras (preDSC) a células deciduales \nestromales decidualizadas (dDSC) ................................ ................................ ............................. 151 \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nXVI \n \nFiguras \nFigura 1. Características generales de líneas de preDSC. ................................ ........................... 87 \nFigura 2. Características de MSC presentadas por líneas de preDSC. ................................ ........ 89 \nFigura 3. Análisis comparativo de la decidualización de preDSC y MSC. ................................ ..... 90 \nFigura 4. Características de pericitos de líneas de preDSC................................. ......................... 91 \nFigura 5. Células perivasculares deciduales. ................................ ................................ ............... 94 \nFigura 6. Características de clonos de preDSC. ................................ ................................ ........... 95 \nFigura 7. Fenotipo antigénico de líneas de DSC no decidualizadas (preDSC) y decidualizadas \n(dDSC). ................................ ................................ ................................ ................................ ......... 97 \nFigura 8. Efecto de la decidualización (14 días) en la expresión de citoquinas por preDSC y \ndDSC. ................................ ................................ ................................ ................................ ........... 98 \nFigura 9. Efecto de la decidualización (8 días) en la expresión de citoquinas por preDSC y dDSC.\n ................................ ................................ ................................ ................................ ................... 100 \nFigura 10. Efecto de la decidualización en la expresión de factores angiogénicos. .................... 101 \nFigura 11. Actividad antitumoral de los factores secretados por preDSC y dDSC. ..................... 102 \nFigura 12. Perfil fenotípico de PBL activados. ................................ ................................ ............ 103 \nFigura 13. Efecto de la decidualización en la actividad quimiotáctica de DSC humanas sobre PBL \nactivados................................. ................................ ................................ ................................ .... 106 \nFigura 14. Estudio del fenotipo antigénico de los PBL quimioatraídos………………………… 107 \nFigura 15. Efecto quimiotáctico de los MC de preDSC y dDSC en las líneas tumorales Jurkat y \nTHP-1. ................................ ................................ ................................ ................................ ........ 108 \nFigura 16. Características generales de líneas de preEnSC. ................................ ..................... 110 \nFigura 17. Análisis comparativo de la respuesta a la decidualización en EnSC y DSC. ............. 112 \nFigura 18. Expresión de PR, PKA y FOXO1 en respuesta a la decidualización.......................... 113 \nFigura 19. Comparación del perfil fenotípico entre preDSC y preEnSC……………………………115 \nFigura 20. Comparación del efecto de la decidualización en la expresión de citoquinas por DSC y \nEnSC. ................................ ................................ ................................ ................................ ......... 117 \nFigura 21. Comparación de la actividad quimiotáctica de DSC y EnSC sobre PBL activados. ... 117 \nFigura 22. Características generales de líneas de preeEnSC. ................................ ................... 119 \nFigura 23. Análisis comparativo de los efectos de la decidualización en las preEnSC y preeEnSC.\n ................................ ................................ ................................ ................................ ................... 122 \nFigura 24. Comparación del perfil fenotípico entre preEnSC y preeEnSC………………………...123 \nFigura 25. Comparación del efecto de la decidualización en la expresión de citoquinas por EnSC y \neEnSC. ................................ ................................ ................................ ................................ ....... 125 \nFigura 26. Análisis comparativo de la migración de PBL con MC de EnSC y eEnSC. ................ 126 \nFigura 27. Análisis comparativo del efecto de los MC de EnSC y eEnSC en la quimioatracción de \ndiferentes subpoblaciones de PBL activados. ................................ ................................ ............. 128 \nFigura 28. Análisis comparativo de la migración de monocitos de sangre periférica con MC de \nEnSC y eEnSC. ................................ ................................ ................................ .......................... 129 \nFigura 29. Estudio del fenotipo antigénico de monocitos de sangre periférica en contacto con MC \nde EnSC y eEnSC durante 48 horas. ................................ ................................ .......................... 130 \nFigura 30. Análisis comparativo del fenotipo antigénico de monocitos de sangre periférica que han \nexperimentado quimiotaxis en los MC de EnSC y eEnSC. ................................ .......................... 131 \nFigura 31. Análisis comparativo de la migración de células Jurkat y THP-1 con MC de EnSC y \neEnSC. ................................ ................................ ................................ ................................ ....... 133 \nFigura 32. Estudio del fenotipo antigénico de células THP-1 en contacto con MC de EnSC y \neEnSC durante 48 horas. ................................ ................................ ................................ ............ 134 \n\n\n \nXVII \n \nFigura 33. Análisis comparativo del fenotipo antigénico de células THP-1 que han experimentado \nquimiotaxis en los MC de EnSC y eEnSC. ................................ ................................ .................. 135 \n \nTablas \nTabla 1. Listado de anticuerpos empleados en la caracterización fenotípica de las EnSC, DSC, \neEnSC y MSC………………………………………………………………………………………………64 \nTabla 2. Listado de anticuerpos empleados en la caracterización fenotípica de monocitos, células \nTHP-1, PBL activados y células Jurkat. ................................ ................................ ........................ 68 \nTabla 3. Listado de anticuerpos empleados en la caracterización fenotípica de las poblaciones \ncelulares de la decidua por microscopía confocal. ................................ ................................ ........ 71 \nTabla 4. Reactivos empleados en la retrotranscripción. ................................ ................................ 73 \nTabla 5. Reactivos empleados en la PCR cualitativa. ................................ ................................ ... 74 \nTabla 6. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar los marcadores de células madre pluripotentes. ................................ ..... 75 \nTabla 7. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar los marcadores de diferenciación mesenquimal................................. ..... 75 \nTabla 8. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar los factores angiogénicos. ................................ ................................ ...... 76 \nTabla 9. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar citoquinas y quimioquinas. ................................ ................................ ...... 77 \nTabla 10. Reactivos empleados en la PCR cuantitativa. ................................ ............................... 78 \nTabla 11. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncuantitativa para estudiar citoquinas y quimioquinas. ................................ ................................ .... 80 \nTabla 12. Listado de anticuerpos empleados en la inmunodetección de proteínas por Western \nBlot. ................................ ................................ ................................ ................................ .............. 82 \nTabla 13. Expresión de antígenos, determinada por citometría de flujo, en líneas de preDSC y \nMSC de médula ósea obtenidas en las mismas condiciones. ................................ ....................... 87 \nTabla 14. Expresión de antígenos por tres clonos de preDSC, determinada por citometría de flujo.\n ................................ ................................ ................................ ................................ ..................... 94 \nTabla 15. Expresión de antígenos, determinada por citometría de flujo, en líneas de preEnSC y \nMSC de médula ósea obtenidas en las mismas condiciones. ................................ ..................... 110 \nTabla 16. Expresión de antígenos, determinada por citometría de flujo, en líneas de preeEnSC y \nMSC de médula ósea obtenidas en las mismas condiciones. ................................ ..................... 120 \nTabla 17. Comparativa entre las propiedades de las preDSC y las MSC................................. ... 138 \nTabla 18. Comparativa entre las propiedades de las preDSC y los pericitos. ............................. 141 \nTabla 19. Características de preDSC y dDSC. ................................ ................................ ........... 144 \n \n \n \n \n \n\n\n \n18 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRESUMEN \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nRESUMEN \n \n \n19 \n \nLas propiedades inmunoreguladoras de las células mesenquimales estromales (MSC) hacen \nque la investigación sobre estas células sea un recurso prometedor para el tratamiento de \nenfermedades inflamatorias y autoinmunes. De ahí radica la necesidad de encontrar una fuente de \ncélulas con las propiedades de las MSC que sea fácil de obtener y que no implique métodos \ninvasivos. \nEn relación a ello, existen dos tipos celulares que se encuentran en tejidos adultos y cumplen \nestos requisitos, las células endometriales estromales (EnSC) y las células deciduales estromales \n(DSC). Las EnSC y las DSC presentan las características propias de las células progenitoras, \ntales como la clonogenicidad, la autorenovación y la capacidad de diferenciación a distintos linajes \nde origen mesenquimal. Además, se encuentran en una localización perivascular en el endometrio \nno gestante (EnSC) y en la decidua (DSC). Ambos tipos de células son capaces de decidualizarse \nen respuesta a la acción conjunta de las hormonas ováricas o placentarias (progesterona y \nestradiol) y otros factores endocrinos. Este proceso de diferenciación morfológica y bioquímica \ninducido durante la fase secretora del ciclo tiene la finalidad de preparar al endometrio para la \nimplantación del embrión. Si hay embarazo, el proceso de decidualización se m antiene hasta \ncompletarse. En este contexto, el éxito del embarazo depende de la modulación inmunológica y la \ninducción de tolerancia materno-fetal por parte de las DSC. Estas propiedades inmunoreguladoras \ndeterminan que las DSC y sus antecesores en el endometrio, las EnSC, puedan ser utilizadas en \nel tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes. \nPor otra parte, el estudio y caracterización de las células estromales uterinas en condiciones \npatológicas es necesario para poder entender mejor la patogenia de enfermedades ginecológicas, \ncomo la endometriosis. Esta patología se caracteriza por la presencia de tejido endometrial fuera \nde la cavidad uterina, en localizaciones ectópicas. Las células endometriósicas estrom ales \n(eEnSC) se caracterizan por la resistencia a la progesterona, la baja sensibilidad a la apoptosis y \npor establecer una comunicación intercelular con el sistema inmunitario que evita que este pueda \neliminar el tejido endometrial ectópico. \nEn base a ello, el objetivo general de esta investigación es estudiar el origen, la diferenciación y \nlas derivaciones patológicas de las células estromales uterinas. Por esta razón, hemos analizado \nlas características fenotípicas y funcionales de las células estromales uterinas humanas \nprocedentes del endometrio no gestante, de la decidua y del endometrioma ovárico, y su \ncomparación con las MSC. \nNuestros resultados muestran que las células precursoras de las EnSC (preEnSC) y de las \nDSC (preDSC) tienen un fenotipo antigénico similar y compatible con el de MSC de médula ósea . \nTambién hemos comprobado, en el caso de las preDSC, la capacidad de diferenciación a células \nde tres linajes mesenquimales, la expresión de marcadores de células madre y la clonogenicidad . \nEstos datos apoyan la hipótesis de que las MSC de médula ósea son la fuente o el origen de las \nEnSC y las DSC . Además, hemos demostrado que las preDSC expresan antígenos propios de \npericitos, factores angiogénicos, presentan actividad contráctil y una localización in vivo alrededor \nde los vasos sanguíneos ; todas ellas son características propias de pericitos, que son células \nestrechamente relacionadas o idénticas a las MSC. Estos resultados nos indican que las preDSC \nconstituyen el nicho perivascular de las MSC en la decidua humana. \n \n\n\nRESUMEN \n \n \n20 \n \nAunque las preEnSC y las preDSC son el mismo tipo celular, se encuentran en dos contextos \nfisiológicos diferentes ; por lo que, según nuestros resultados, compa rten el mismo fenotipo \nantigénico y funciones. Sin embargo, hemos demostrado que las preDSC tienen una mayor \ncapacidad de decidualización que las preEnSC, evidenciada por las funciones asociadas a este \nproceso de diferenciación: secreción de prolactina (PRL) e IL-15, inducción de apoptosis y cambio \na una morfología redondeada. Estas diferencias son atribuibles a los distintos ambientes \nfisiológicos en los que se encuentran, es decir, no gestación y gestación. \nLa decidualización de las preDSC cambia algunas de sus características, tales com o la \nlocalización perivascular (que pasa a ser extravascular), el descenso de la expresión de antígenos \nasociados a pericitos, la menor contractilidad celular y el desarrollo de un perfil más \ninmunoregulador que contribuy e a la tolerancia inmunológica materno -fetal. Concretamente, \nhemos estudiado la actividad quimiotáctica de las DSC sobre linfocitos T activados, los cuales \npodrían tener una actividad proabortígena al llegar a la decidua. Hemos demostrado que en las \nDSC decidualizadas (dDSC) se inhibe la secreción de CXCL9, CXCL10 y CXCL11, quimioquinas \ncon capacidad de atraer a células Th1 y Tc. Además, las dDSC producen un factor termoestable y \nde bajo peso molecular que inhibe activamente la migración de células T activa das. También \nhemos observado que las dDSC inhiben la expresión de TNF -α e IFN-γ en las células T activadas \nquimioatraídas. Todos estos mecanismos evitan la llegada de linfocitos T con actividad \nproabortígena a la decidua. \nEn el contexto patológico de la endometriosis, hemos comprobado que las eEnSC son \nresistentes a la decidualización, ya que conservan en su mayoría la morfología fibroblástica, \napenas producen PRL y no sufren apoptosis. Sin embargo, las preeEnSC secretan má s CXCL9 \nque las preEnSC y, paralelamente, presentan una mayor actividad quimiotáctica sobre linfocitos T \ny células NK activadas. Nuestros datos sugieren que estas células inmunitarias, atraídas por las \npreeEnSC, pueden estar implicadas en la patogenia de la endometriosis. \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n21 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nINTRODUCCIÓN \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n22 \n \n1. El endometrio \nEl endometrio es un tejido mucoso que tapiza la cavidad uterina. Se encuentra dividido \nestructural y funcionalmente en dos capas: funcional y basal. La capa funcional se extiende \ndesde el lumen uterino hasta la capa basal y comprende los dos tercios superiores de la mucosa \nendometrial. Histológicamente esta capa está formada por un epitelio simple prismático luminal y \nglándulas verticales que se introducen en un estroma compuesto por fibroblastos, tejido conectivo, \narteriolas espirales y disti ntas poblaciones leucocitarias. Mientras que l a capa funcional sufre una \nimportante remodelación cíclica , l a capa basal es permanente y está formada por un denso \nestroma con glándulas basales dispuestas horizontalmente y vasos sanguíneos. Algunos autores \nconsideran que e n esta capa se encuentran las células progenitoras responsables de la \nregeneración de la capa funcional después de la menstruación. Dichas células pueden \ndiferenciarse en células estromales y epiteliales, permitiendo así el mantenimiento de la integridad \nendometrial tras la menstruación1,2. \nLa regeneración natural y completa que experimenta el endometrio hace de él un tejido único \nen un contexto muy dinámico, ya que durante la etapa reproductiva el endometrio se desprende y \nse repara alrededor de 400 ciclos. Además, también se restaura por completo tras el parto1. \nLos procesos que ocurren en el endometrio, tanto durante el ciclo endometrial como en el \nembarazo, están sujetos a la influencia del sistema inmunitario. Por eso, los leucocitos son una \npoblación celular muy importante en el endometrio humano y representan del 10 -20% del total de \ncélulas endometriales3. Dicho sistema ejerce una doble función; por un lado, es capaz de generar \nuna respuesta protectora frente a patógenos y, por otro lado, inicia el desarrollo de una respuesta \ntolerogénica hacia el feto semialogénico cuando hay embarazo4. \n1.1. El ciclo endometrial \nEl eje hipotalámico -hipofisario-gonadal regula la secreción cíclica de estradiol (17β-estradiol o \nE2) y progesterona (P4) en el ovario a lo largo del ciclo. En respuesta a estas hormonas, se \nproducen cambios en el aparato repro ductor femenino para facilitar el desarrollo de procesos \ncomo la ovulación, la fecundación, la implantación y el embarazo. Los niv eles de las hormonas \nmencionadas también definen las distintas etapas en que se divide el ciclo endometrial: fase \nmenstrual, fase proliferativa o folicular, fase intermedia en la que tiene lugar la ovulación y \nfase secretora o lútea5. \n1.1.1. Fase menstrual \nEl ciclo se inicia con la fase menstrual (días 1 -5 aproximadamente) tras un significativo \ndescenso de los niveles de E2 y P4. En esta etapa tiene lugar la descamación del endometrio y, \ncomo consecuencia, el sangrado. A medida que avanza la menstruación se produce, de manera \nsimultánea, la reparación de la superficie endometrial mediante la reepitelización. \nLas células endometriales estromales (EnSC), que expresan el receptor de P4 (PR ), perciben \nel descenso en la concentración de esta hormona e inician una serie de procesos inflamatorios. \nEntre estos destaca la translocación nuclear del factor de transcripción NF -κB, el cual regula la \nrespuesta inmunitaria innata y adaptativa. La activación de NF-κB lleva a la producción progresiva \nde citoquinas, quimioquin as y prostaglandinas proinflama torias. Esta respuesta favorece el \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n23 \n \nreclutamiento de leucocitos en el endometrio y ellos mismos secretan una serie de citoquinas \nproinflamatorias que reclutan más leucocitos en el endometrio, lo cual exacerba la inflamación \npresente en el tejido durante la menstruación 1. En la transición de fase secretora tardía a fase \nmenstrual, se activa el inflamasoma NLRP3 , tanto en las células endometriales decidualizadas \ncomo en los leucocitos residentes en el tejido endometrial, dando lugar a la secreción de IL -1β e \nIL-18 activas, lo cual impulsa una serie de procesos inflamatorios y proteolíticos que resultan en la \ndegradación del tejido6. \nLas células inmunitarias desempeñan una función muy importante en la fase menstrual. De \nhecho, en los momentos previos a la menstruación, el 50% de las células presentes en el tejido \nendometrial son leucocitos; del 6 -15% de las células del estroma de la ca pa funcional son \nneutrófilos CD11bbright/CD66b+/CD16+ y hay una proporción equivalente de macrófagos \nCD16+/CD68+/CD163+ y de células NK uterinas (uNK) CD56+/CD16 -7; la presencia de \neosinófilos, mastocitos (ambos del 3-5%) y linfocitos T (1-2%) es menor1 (Ilustración 1). \nIlustración 1. Esquema representativo del ciclo endometrial: niveles hormonales y células \ninmunitarias en cada fase del ciclo (el tamaño celular es indicativo de la proporción de cada célula \ninmunitaria en el endometrio). Imagen creada con el software BioRender. \n \nLa elevada proporción de neutrófilos en la fase menstrual es determinante para la \ndescomposición del tejido endometrial mediante la libe ración de enzimas degradativas, como la \ncatepsina C, la elastasa, la metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP -9) y la proteinasa 3. Los \nneutrófilos también aumentan la defensa inmunitaria innata, por ejemplo ejerciendo acciones \nquimiotácticas sobre los monocitos, tras la alteración de la barrera epitelial8,9. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n24 \n \nAl igual que ocurre con los neutrófilos, el número de monocitos/macrófagos también se \nincrementa en el estroma endometrial perimenstrual, como consecuencia de la regulación \nhormonal10. Esto, en parte, se debe al efecto del E2 en la ex presión de la proteína quimiotáctica \nde monocitos 1 (MCP -1 o CCL2) por parte de las células endometriales estromales. Se ha \nobservado que la expresión de dicha quimioquina es mayor cuando los niveles de E2 son bajos, \nde manera que el reclutamiento de macró fagos endometriales aumenta 11. Además de CCL2, la \nexpresión de otras quimioquinas que atraen a monocitos, como CCL7 (proteína quimiotáctica de \nmonocitos 3, MCP-3), CCL16, CCL22 y CX 3CL1 también se incrementa en esta fase del ciclo 10,12. \nLos monocito s reclutados se diferencian y adquieren un fenotipo proinflamatorio, lo cual es \nimportante para la degradación tisular. \nPor lo que respecta a las células uNK, estas expresan los antígenos CD9, CD69 y CD94, pero \nno expresan CD8 ni CD57, a diferencia de las células NK del torrente sanguíneo ; además, son \nmayoritariamente CD56bright/CD16-, mientras que en sangre periférica son CD56dim/CD16+. El nivel \nde expresión de CD56 es aproximadamente 10 veces mayor en las uNK que en las células NK del \ntorrente circulatorio10. Por otra parte, las células uNK producen citoquinas proinflamatorias, tales \ncomo el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), IL-8 e IFN-γ, de \nmanera que promueven la respuesta inflamatoria, inducen la activación de macrófagos y la \ngeneración de células T citotóxicas8. \n1.1.2. Fase proliferativa \nDurante los días 7 a 13 del ciclo aproximadamente, el endometrio se encuentra en fase \nproliferativa, durante la cual aumenta la secreción en la adenohipófisis de la hormona \ngonadotropina foliculoestimulante (FSH) y luteinizante (LH). En el folículo, las células foliculares \nováricas de la granulosa y de la teca actúan de manera coordinada y regulada por las \ngonadotropinas. La LH estimula a las células de la teca para que sinteticen andrógenos a partir del \ncolesterol; estos difunden hasta las células de la granulosa que, estimuladas por la FSH, \nconvierten los andrógenos en estrógenos (E2). Es por esto que los niveles de E2 empiezan a \naumentar progresivamente hasta que este alcanza su concen tración máxima, alrededor de 24 -36 \nhoras antes de la ovulación. La FSH induce la aparición de receptores de la LH en las células \nfoliculares ováricas de la granulosa, que secretan P4 junto con E2. Ambas hormonas actúan \nproduciendo una retroalimentación positiva y estimulan la secreción de LH y FSH para que tenga \nlugar la ovulación1. \nEl proceso regenerativo de los compartimentos epitelial (glandular) y estromal se debe a la \npresencia de células progenitoras endometriales , que son células madre adultas que se \nencuentran en la capa basal del endometrio 1,2,13. Estas células responden a E2 y P4 para generar \ntejido endometrial. Es por esto que e l progresivo aumento de los niveles de E2 durante la fase \nproliferativa estimula el crecimiento de células epiteliales y estromales e induce un aumento de la \nexpresión de los receptores de P4 y de estrógenos en el epitelio y el estroma1. \nLas diferentes poblaciones de células inmunitarias desarrollan su función a nivel endometrial \ndurante la fase proliferativa ( Ilustración 1). En su papel de células presentadoras de antígenos \n(APC), los macrófagos y las células dendríticas (DC) son importantes para la generación de \nrespuestas inmunitarias adaptativas. La quimioatracción de monocitos desde sangre periférica es \nmediada por las quimioquinas secre tadas por las células endometriales estromales, tales como \nCCL4 (proteína inflamatoria de macrófagos 1 beta, MIP -1β), CCL7, CCL16, CCL22 y CX 3CL112. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n25 \n \nLos macrófagos representan entre el 1 -2% del total de células del endometrio durante la fase \nproliferativa y expresan los marcadores de adhesión y activación CD 54, CD69 y CD71, lo cual \nmuestra su función en la regeneración y la proliferación de la capa funcional; además , son los \nleucocitos más abundantes durante el proceso de reparación del endometrio. El aumento del \nnúmero de macrófagos y, en consecuencia, de los factores secretados por ellos, como CCL4, el \nfactor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) y CSF -1, son fundamentales para crear un \nmicroambiente proinflamatorio que desempeña un papel esencial en la preparación del \nendometrio antes de la ventana de implantación (fase secretora)14. \nEn cuanto a las células uNK, los niveles permanecen bajos inicialmente, pero aumentan a \nmedida que avanza el ciclo. \nDurante la fase proliferativa también desarrollan su función de presentación antigénica en el \nendometrio las DC, que residen tanto en el estroma sub -epitelial de la capa funcional como en la \ncapa basal, y son mucho menos abundantes que otras células inmunitarias. La frecuencia de DC \ninmaduras CD1a+ aumenta durante la fase proliferativa, mientras que la población de DC \nmaduras CD83+ permanece relativamente constante4. \nEl sistema inmunitario adaptativo, representado por los linfocitos T y B, también se encuentra \npresente a nivel endometrial durante la fase proliferativa. De la población total de leucocitos, \naproximadamente el 50% son linfocitos T, entre los cuales hay al menos dos tercios de linfocitos T \nCD8+. Estas células se pueden encontrar dispersas en el estroma endometrial, en una \nlocalización intraepitelial o formando agregados linfoides. Dichos agregados empiezan a \ndesarrollarse en la capa basal endometrial durante la fase proliferativa y están formados por un \nnúcleo de linfoc itos B rodeado de linfocitos T, que son mayoritariamente CD8+; la región de \nlinfocitos T está, a su vez, rodeada de macrófagos. Estos agregados aumentan su tamaño durante \nla fase proliferativa y la acumulación progresiva de linfocitos T es el resultado de su migración \ndesde sangre periférica hacia el endometrio y no a la proliferación de clones residentes, ya que \nhay un bajo nivel de división celular dentro de los agregados linfoides 3,4. La función de estos está \nrelacionada con el mantenimiento de un equilibrio entre la creación de un ambiente protector \ncontra los patógenos y, posteriormente, el establecimiento de un ambiente inmunosupresor que \npermita preparar el endometrio para proteger al embrión3,4. \nPor otra parte, también aumenta el número de linfocitos T reguladores (Treg) \nCD4+CD25+Foxp3+, que controlan la re spuesta inmunitaria y alcanzan su número máximo \ndurante la fase proliferativa tardía (días 9 a 13). Dicho aumento en un estadi o preovulatorio se \nrelaciona directamente con el incremento de los niveles de estrógenos y se debe a la necesidad \nde inducción de tolerancia inmunológica para facilitar la implantación del embrión15. \n1.1.3. Fase secretora \nTras la ovulación, que tiene lugar entre 10 -12 horas después del pico de LH, se inicia la fase \nsecretora a nivel endometrial. Desde los días 15 a 28, descienden los niveles de LH y FSH, y el \ncuerpo lúteo secreta cantidades crecientes de P4 y E2, aunque los niveles de este último son \nmenores que anteriormente. La capa funcional comienza a diferenciarse o a decidualizarse bajo la \ninfluencia de la P4, preparando al endometrio para la implantación del blastocisto. En ausencia de \nfecundación, los niveles de E2 y P4 descienden provocando el desprendimiento del tejido \nendometrial y el inicio de la menstruación1. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n26 \n \n En cuanto a la regulación del sistema inmunitario ( Ilustración 1), el número de células uNK \ndurante la fase secretora alcanzan niveles de , aproximadamente, el 70% de la población total de \nleucocitos y, a menudo, se encuentran cerca del epitelio luminal, en la porción superior de las \nglándulas endometriales. Producen factores de crecimiento angiogénicos y el factor inhibidor de la \nleucemia (LIF), los cuales son necesarios para la formación de los vasos sanguíneos 8. La \nproliferación de las células uNK se debe al incremento de los niveles de IL -15 secretada por \nmonocitos y a la llegada de células NK desde el torrente sanguíneo16. \nPor otra parte, el número de macrófagos aumenta al 3-5% del total de células del endometrio. \nEstos desempeñan una función importante en la regulación de la homeostasis. Las quimioquinas \nresponsables de la atracción de monocitos desde sangre periférica son diversas; por ejemplo, los \nniveles de ex presión de CCL7, CCL22 y CX3CL1 son equivalentes a los de la fase proliferativa; \nademás, al inicio de la fase secretora predominan las quimioquinas CCL4, CCL14, y CCL16, pero \ndurante la fase secretora tardía solamente hay expresión de CCL14 12,14. El incremento de la \npoblación de macrófagos durante la fase secretora también se debe a la proliferación de dichas \ncélulas in situ14. \nTanto en la capa funcional como en la capa basal, también se encuentran DC. Tal como ocurre \ndurante la fase proli ferativa, la frecuencia de DC inmaduras CD1a+ aumenta durante la fase \nsecretora tardía y el número de DC maduras CD83+ permanece relativamente constante4. \nEn esta etapa los agregados linfoides están completamente formados, pero se ve disminuida la \ncapacidad citotóxica de los linfocitos T CD8+, ya que en este momento puede producirse la \nconcepción y se precisa el establecimiento de un estado temporal de inmunosupresión 4. Además, \ntiene lugar una elevada reducción del número de linfocitos Treg CD4+CD25+Foxp3+15. \n \n2. Células endometriales estromales \nLa capacidad regenerativa del endometrio es indicativa del importante papel q ue desempeñan \nlas células progenitoras somáticas en el proceso de regeneración y crecimiento que experimentan \nlos compartimentos epitelial y estromal 1. Desde que en 1989 se propusiera por primera vez la \npresencia de células progenitoras somáticas en la capa basal del endometrio, estas han sido \nampliamente caracterizadas y estudiadas en el contexto de la regeneración endometrial13. \nEn el endometrio humano adulto se han identificado diferentes poblaciones celulares que \npresentan las características propias de las células progenitoras, tales como la clonogenicidad, la \nautorenovación y la capacidad de diferenciación a distintos linajes 17. Estos tipos de células \nincluyen las células progenitoras epiteliales, las células progenitoras mesenquimales \nendometriales (eMSC) y las “side population cell” (SP)18. \n2.1. Regeneración epitelial \nEl componente glandular de la capa basal del endometrio, que permanece durante la \nmenstruación, contiene células progenitoras epiteliales, las cuales son responsables de la \nreepitelización de la superficie luminal. Estas células expresan el antígeno embrionar io 1 \nespecífico de estadi o (SSEA -1, CD15 o Lewis X). Las células progenitoras epiteliales SSEA -1+ \nexpresan niveles más bajos del receptor de estrógenos -α (ER -α) y del PR que las células \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n27 \n \nepiteliales SSEA-1-, las cuales se encuentran mayoritariamente en la capa funcional; esto implica \nuna menor diferenciación de las células SSEA -1+. Por otra parte, las células SSEA -1+ tienen \ntelómeros más largos y una mayor actividad telomerasa, siendo esta una c aracterística del \nendometrio regenerativo18,19. \nSe han identificado otros marcadores que caracte rizan a las células progenitoras epiteliales, \ntales como el factor de transcripción SOX9 y la molécula de adhesión N -cadherina, que fue el \nprimer marcador descrito de células epiteliales endometriales con función de células progenitoras \ny se expresa en la base de las glándulas. Además, existen distintas poblaciones de células \nepiteliales endometriales en función de la expresión de los marcadores mencionados (Ilustración \n2). En concreto, las células epiteliales clonogénicas más primitivas en la base de las glándulas son \nN-cadherina+/SSEA-1-/SOX9-; estas generan una pequeña población de células N -\ncadherina+/SSEA-1+/SOX9+; a continuación, en el límite entre la capa basal y la capa funcional, \nse extienden las células N -cadherina-/SSEA-1+/SOX9+. En la capa funcio nal se encuentran las \ncélulas epiteliales proliferativas con un fenotipo N -cadherina-/SSEA-1-/SOX9-, que se extienden \nhasta el epitelio luminal donde se encuentran las células N -cadherina-/SSEA-1+/SOX9+1,19,20,21. \nRecientemente se ha demostrado que el marcador de células progenitoras epiteliales ALDH1A1 \n(isoforma A1 de la aldehído deshidrogenasa 1), que cataliza la producción de ácido retinoico, \ntambién colocaliza con el 78% de las células epiteliales N -cadherina+ de la capa basal más \nprofunda del endometrio1,20,22. \nIlustración 2. Células progenitoras epiteliales presentes en las glándulas endometriales. Adaptado de \nSalamonsen et al.1 \n \n2.2. Regeneración estromal y vascular \nLa regeneración del estroma endometrial está mediada por células con las características \npropias de las células madre mesenquimales o MSC , las células endometriales estromales \n(EnSC). La Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) ha definido a las MSC humanas \nde médula ósea como células adherentes al plástico en condiciones de cultivo estándar; con \ncapacidad clonogénica y de diferenciación in vitro a los linajes mesodérmicos adipogénico, \nosteogénico y condrogénico; con un fenotipo antigénico CD73+/CD90+/CD105+ y ausencia de \nexpresión de los marcadores CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 y HLA-DR23. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n28 \n \nLas EnSC son eMSC que se clasifican en diferentes subpoblaciones en función de los \nmarcadores expresados 1,18. Las eMSC CD140b+ /CD146+/CD45- representan aproximadamente \nel 1,5% de todas las células endometriales estromales y presentan las características típicas de \nMSC de médula ósea 24. Estas eMSC se encuentran en una localización perivascular, tanto en la \ncapa funcional como en la capa basal del endometrio, de ahí que puedan obtenerse a partir de \nmuestras de biopsia endometrial y también a partir de sangre menstrual 25. Las células \nCD140b+/CD146+, por su ubicación alrededor de los vasos sanguíneos, se encuentran muy cerca \nde las célula s endoteliales (CD31+/CD140b -/CD146+) y se ha propuesto su identificación como \npericitos, que son células murales que se encuentran en la parte abluminal de los vasos \nsanguíneos y están en íntimo contacto con las células endoteliales de la microvasculatura 24 \n(Ilustración 3). \nEl marcador de células perivasculares SUSD2 (“sushi domain containing 2”) se expresa \ntambién en eMSC (Ilustración 3) y se ha propuesto como marcador único para el aislamiento de \neMSC clonogénicas con alta capacidad proliferativa, con las propiedades descritas por la ISCT y \nubicadas alrededor de los vasos sanguíneos en la capa basal y la capa funcional del endometrio26. \nLa mayoría de las células SUSD2+ también expresan CD140b+, mientras que todas las células \nSUSD2+/CD146+ expresan CD140b+. La subpoblación de células SUSD2+ /CD140b+/CD146+ \ndesarrolla un papel importante en el crecimiento del estroma de la capa funcional del endometrio \ndurante la fase proliferativa. Además, se ha comprobado que el 60% de las células SUSD2+ \ntambién expresan STRO-1, marcador de células mesenquimales de médula ósea18,26. \nPor otra parte, el endometrio humano contiene aproximadamente un 5% de células madre \nadultas SP. La población de células SP es heterogénea, ya que está formada por células \nendoteliales CD31+ (51%), células epiteliales CD326+ (EpCAM, molécula de adhesión de células \nepiteliales) (27%) y células estromales CD10+ o CD140b+ /CD146+ (10-14%) (Ilustración 3); de \nmanera que las células SP endometriales se encuentran tanto en el compartimento epitelial como \nen el estromal. Las células SP epiteliales y estromales presentan las características típicas de \nMSC in vitro; tienen un patrón intermedio de actividad telomerasa, en comparación con las células \nmadre embrionarias (hESC) y las células diferenciadas; además, al igual que las células \nendoteliales vasculares endometriales, no expresan ER-α y PR, pero sí el ER-β18,27,28. \n \n \n \n \n \n \nIlustración 3. Ubicación de las células progenitoras en el estroma endometrial. Adaptado de Gargett et \nal. 18 \n \n \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n29 \n \n3. La decidualización \nLa decidualización es un proceso de diferenciación morfológica y bioquímica que \nexperimentan las EnSC durante la fase secretora del ciclo endometrial, cuya finalidad es preparar \nal endometrio para la implantación del embrión. Si hay embarazo, el proceso de decidualización \nse mantiene hasta completarse29,30. En este caso, las células que experimentan dicho proceso de \ndiferenciación son las células deciduales estromales (DSC) presentes en la d ecidua, que es el \ncomponente materno de la placenta. \n3.1. Señalización hormonal \n Durante la fase secretora , el estroma endometrial está expuesto a la acción de la P4 , cuya \nacción está mediada por la unión y activa ción de su receptor nuclear, el cual tiene dos isoformas: \nPR-A y PR -B. Generalmente, la isoforma PR -A es transcripcionalmente menos activa y actúa \ncomo inhibidor dominante de la transcripción de PR -B y de otros receptores de esteroides 31. No \nobstante, la PR-A es la isoforma dominante durante el proceso de decidualización y participa en el \nreclutamiento de una serie de factores de transcripción activados, directa o indirectamente, por la \nvía de señalización del AMPc 29,32. Además, la expresión de los genes relacionados con la \ndecidualización no parece encontrarse bajo el control transcripcional directo del PR activado, \nprueba de ello es la baja capacidad de la P4 de inducir diferenciación en EnSC in vitro, siendo \nnecesarios varios días de exposición a esta hormona para el aumento de los niveles intracelulares \nde AMPc29,30,33 (Ilustración 4). \nLas EnSC durante la fase secretora del ciclo no solamente están expuestas a la acción de la \nprogesterona, sino también a otros factores capaces de unirse a receptores acoplados a proteínas \nG (GPCR), lo cual provoca la activación de la adenilato ciclasa, la formación de adenosín \nmonofosfato cíclico (AMPc) como segundo mensajero y la activación de la proteína quinasa A \n(PKA). Entre estos ligandos se encuentran la prostaglandina E2 (PGE2), la hormona liberadora de \ncorticotropina (CRH), la relaxina, la procineticina 2 y las gonadotropinas hipofisarias29,30,34. La \nacción conjunta de estos factores junto a la de las hormonas ováricas (P4 y estradiol) induce la \nacumulación de AMPc intracelular33,34,35. La señalización del AMPc puede transmitirse mediante la \nregulación directa de la re gión promotora de algunos genes (PRL e IGFBP1) o mediante la \nactivación de la PKA. Además, la inducción de la expresión de PRL e IGFBP1 en EnSC sometidas \na decidualización in vitro con AMPc está estrechamente relacionada con una alta acetilación de \nhistonas de las regiones promotoras de estos genes, que hace que estas regiones pr omotoras \nsean más accesibles a los factores de transcripción que regulan la expresión génica 36,37,38 \n(Ilustración 4). \nEl aumento de la concentración de AMPc promueve la expresión y la acumulación nuclear de \nfactores de transcripción como C/EBP β (proteína de unión al enhancer CCAAT beta), F OXO1 \n(“Forkhead box protein O1 ”) y los transductores de señal y activadores de la transcripción STAT3 \ny STAT5. Estos factores interaccionan con PR-A y se inicia la transcripción de genes específicos \npara la s íntesis de PRL, IGFBP -1, IL-1β, IL-6, IL-11, IL-15, LIF, activina A, entre otros 29,30,39,40,41 \n(Ilustración 4). Estos actúan de forma autocrina y paracrina, y activan genes que controlan los \ncambios morfológicos y funcionales asociados a la decidualización, la implantación del blastocisto, \nla proliferación e invasión del trofoblasto y el reclutamiento de leucocitos. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n30 \n \n \nIlustración 4. Mecanismo bioquímico de la decidualización en las EnSC y DSC. Imagen creada con el \nsoftware BioRender. \n \n3.2. Efecto de la decidualización sobre el fenotipo y las funciones \ncelulares \nAl decidualizarse, t anto EnSC como DSC adquieren una morfología poligonal, aumentan de \ntamaño, acumulan glucógeno y lípidos en el cit oplasma, y secretan PRL e IGFBP-1. Además, al \nigual que a las células no decidualizadas, se les atribuye una función inmunológica ya q ue son \ncapaces de secretar citoquinas y quimiocinas determinantes para el reclutamiento de leucocitos al \nsitio de implantación. El resultado de este proceso es una regulación positiva de genes que \ncodifican para factores de crecimiento, receptores de neurotransmisores, neuromoduladores y \nmoduladores de la apoptosis y sus receptores; todo ello es indicativo de la importancia de la \nseñalización paracrina en el endometrio y en la decidua durante los primeros estadi os de un \nembarazo42,43. \n3.2.1. Cambios tisulares \nEn su estudio sobre las características histológicas del endometrio durante el ciclo endometrial, \nNoyes et al. observaron un marcado aumento del citoplasma de las células estromales situadas \ncerca de las arterias espirales terminales, alrededor del día 23 del ciclo. Posteriormente, el día 25, \nla mayor parte de las células del estroma de la capa funcional más superficial pr esentaba esta \ncaracterística y eran semejantes a las células del tejido decidual. En la fase secretora tardía, la \ncapa funcional se vuelve cada vez más compacta y los cambios en la permeabilidad vascular \npromueven la infiltración leucocitaria. Esto deriva en una amplia interacción entre las EnSC y las \ncélulas inmunitarias43,44, entre las que destaca la presencia de las células uNK (Ilustración 5). \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n31 \n \nDurante la decidualización en el endometrio, las uNK CD56bright/CD16- constituyen \naproximadamente del 30% -40% de las células del compartimento estromal, aunque son \nrelativamente escasas en el estroma subyacente al epitelio luminal. Estas células presentan una \nbaja citotoxicidad y participan en la remodelación de las arterias espirales antes y dura nte la \ninvasión del trofoblasto. Las uNK experimentan quimioatracción en respuesta a quimioquinas \ncomo CXCL9, CXCL10, CXCL12 y CXCL14; además, las citoquinas producidas por las EnSC \n(DSC en el contexto del embarazo), como IL-11, IL-15 e IL-33, están implicadas en la proliferación \ny maduración de las células uNK 43,45,46,47,48,49. A su vez, estas células inmunitarias producen \ncitoquinas, como el factor estimulante de colonias de macrófagos (M -CSF), el factor estimulante \nde colonias de granulocitos y macrófagos (GM -CSF), IFN -γ, TNF -α, TGF -β y LIF; así como \nfactores angiogénicos, como el factor de crecimiento placentario (PGF), el factor de crecimiento \nendotelial vascular C (VEGF -C) y angiopoyetina 2 (ANGPT2). Por ello, contribuyen al \nremodelamiento vascular, a la neovascularización uterina durante el ciclo endometrial y al \naumento de la permeabilidad del epitelio endometrial (mediada por VE GF); posteriormente, \ndurante el embarazo, favorecen el crecimiento fetal 42,43,50. Otras células inmunitarias que se \nacumulan en el estroma de la capa funcional durante la decidualización son los macrófagos \nCD163+, las DC uterinas y los linfocitos T 14,51. \n3.2.2. Características celulares y ultraestructurales \nLa transformación de las EnSC, tanto in vivo como in vitro, en respuesta a la exposición a los \nfactores decidualizantes resulta en un cambio morfológico, de manera que las células adquieren \nuna forma más redondeada, así como también su núcleo; un mayor número de nucléolos; la \ndilatación del retículo endoplasmático rugoso y el complejo de Golgi; y la acumula ción de \nglucógeno y gotas lipídicas en el citoplasma. Además, las células estromales decidualizadas \npresentan actividad fagocítica, por lo cual pueden contribuir a la extensa remodelación de la matriz \nextracelular (MEC)43,52. Durante este proceso , las EnSC abandonan su localización perivascular y \nse localizan en la zona extravascular del es troma endometrial. La decidualización empieza \nalrededor de los vasos sanguíneos y se extiende hasta alcanzar los dos tercios superiores del \nendometrio53. \nPor otra parte, la comunicación intercelular en el estroma endometrial es importante para el \nestablecimiento de una interfaz materno-fetal funcional. En este contexto, la molécula de adhesión \ncadherina 11 se expresa en las EnSC durante la decidualización, especialmente en las células \nestromales que rodean las arterias espirales y puede facilitar las uniones homofílicas entre células \nadyacentes, previamente a la formación de uniones tipo gap (“gap junctions”). Esta molécula de \nadhesión también se expresa en las células trofoblásticas, de manera que se estab lecen uniones \nhomofílicas entre ellas y las DSC, evitando así una migración invasiva excesiva de las células del \ntrofoblasto54. La decidualización también se caracteriza por cambios en la composición de la MEC; \npor ejemplo, el colágeno tipo IV y la laminina aumentan significativamente alrededor de las EnSC \nque experimentan decidualización. De esta manera, la membrana basal participa en l a \npermeabilidad selectiva de macromoléculas y en el soporte estructural tisular55 (Ilustración 5). \n3.2.3. Secretoma y marcadores de decidualización \nLos marcadores indicativos de decid ualización más estudiados son la PRL y la IGFBP-1 \n(Ilustración 5). La producción de PRL en el endometrio empieza alrededor del día 22 del ciclo 56, \nlo cual coincide con la regulación positiva de la expresión de su re ceptor, que se localiza \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n32 \n \nprincipalmente en las células epiteliales glandulares del endometrio. Durante la fase secretora \ntardía, la PRL regula la expresión del factor de transcripción regulador de interferón (IRF -1), de \nforma paracrina en el compartimento glandular. Este factor, a su vez, participa en la regulación de \ndiversos genes implicados en el crecimiento celular, la diferenciación, la adhesión y la apoptosis57. \nEn la decidua, las funciones de la PRL se relacionan con la diferencia ción de las células \nepiteliales; el control de la invasión del trofoblasto, mediante la unión a su receptor expresado por \nlas células del sincitiotrofoblasto; el estímulo de la angiogénesis en las primeras etapas del \nembarazo; y la prevención del rechazo , mediante la regulación de la proliferación y diferenciación \nde las células inmunitarias43,58,59,60. \nOtro factor producido durante la decidualización de las EnSC es la IGFBP -1. Esta proteína \nregula la biodisponibilidad del factor de cre cimiento similar a la insulina (IGF). Los IGF regulan \npositivamente el fenotipo invasivo de los trofoblastos del primer trimestre de embarazo, al \nestimular la proliferación y supervivencia celular. La función de la IGFBP -1 se modifica según su \ngrado de fos forilación, el cual se incrementa a medida que avanza la gestación siendo más \nefectiva para unirse a la IGF-1 y, por lo tanto, restringir la invasión del trofoblasto43,61. \nEntre las citoquinas producidas por las células decidualizadas destacan la IL -11 y la IL -15 \n(Ilustración 5 ). La IL -11 desempeña funciones autocrinas y paracrinas sobre las células \nestromales y tiene un papel importante en la preparación del endometrio para la implantación 62. \nPor su parte, la IL -15 estimula la proliferación de las células uNK en el endometrio secretor y la \ndecidua, sin estimular la citotoxicidad de estas, ya que esto sería perjudicial para el trofoblasto63. \nIlustración 5. La decidualización de las células estromales: cambios morfológicos y bioquímicos. \nImagen creada con el software BioRender. \n \n4. La decidua \nEn el embarazo humano, la implantación del embrión se produce sobre la pared mucosa \nespecializada del útero, llamada decidua (o endometrio gestante); por lo que puede considerarse \ncomo un tejido constituido a partir de células procedentes del endometrio. L a decidua es el \ncomponente materno de la interfase materno -fetal; se encuentra en estrecho contacto con el \ntrofoblasto; y está formada por glándulas, vasos sanguíneos y linfáticos, células deciduales \nestromales (DSC) y células del sistema inmunitario. Entr e sus funciones, destaca el aporte de \nfactores de crecimiento y citoquinas para el desarrollo embrionario, el control de la invasión del \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n33 \n \ntrofoblasto y la inducción de tolerancia hacia el embrión semialogénico . Además, la relación \nfisiológica entre la madre y el feto en esta interfase es determinante para el desarrollo \nembrionario, la homeostasis vascular y la inmunoregulación34. \n4.1. La inmunología del embarazo \nEl éxito de un embarazo depende del establecimiento de un equilibrio entre la capacidad \ninvasiva del trofoblasto y la receptividad de la decidua materna. Además de las DSC y las células \nendoteliales, las células inmunitarias representan un componente muy importante de la decidua \nmaterna. La respuesta inmunitaria en la interfaz materno -fetal facilita la recepción, el \nestablecimiento y el crecimiento del blastocisto implantado64. \nAproximadamente, el 70% del total de leucocitos presentes en la decidua son uNK; del 20-25% \nson macrófagos; del 3-10% son linfocitos T y el 1,7% son DC. Los linfocitos B están presentes en \ncantidad bajas64,65,66,67,68. \nLa modulación inmunitaria y la inducción de tolerancia son necesarias al comienzo del \nembarazo para facilitar la implantación del blastocisto; pero para que el embarazo te nga éxito y \nllegue a término , también es imprescindible proteger a la madre y al feto de las agresiones \nambientales y, para ello, se precisa un sistema inmunitario receptivo y activo. Por esta razón, el \nmicroambiente inmunitario de la decidua es único, sujeto a modulación y dinámico64. \nEn cada una de las fases del embarazo, el sistema inmunitario desempeña unas funciones \nconcretas y diferentes entre sí, dando lugar a una pr imera etapa proinflamatoria, una segunda \netapa antiinflamatoria y una tercera etapa proinflamatoria. La primera etapa proinflamatoria se \nasocia con la implantación y la placentación; la segunda etapa antiinflamatoria se relaciona con el \ncrecimiento y desar rollo fetal; y la tercera etapa proinflamatoria es responsable del inicio del \nparto64. \n4.1.1. La implantación y placentación constituyen una etapa proinflamatoria \nLa unión del blastocisto al epitelio luminal del útero y la placentación implican la degradación y \nreestructuración de la decidua materna. El gradiente inflamatorio que se crea en el sitio de \nimplantación permite la aposición y adhesión del blastocisto al epitelio. La inflamación se \ncaracteriza por la presencia de citoquinas, como IL -6, IL -8, IL -15, GM -CSF y TNF -α; y \nquimioquinas, como CXCL1 y CCL4. Estos factores son producidos por las DSC y por las células \ninmunitarias que se infiltran en el tejido decidual. La presencia de DC uterinas CD11c+ aumenta la \nreceptividad uterina regulando la remodelación tisular y la angiogénesis. Los factores secretados \npor las DC y los macrófagos eliminan la capa de mucina del epitelio luminal, exponiendo \nmoléculas de adhesión que facilitan la implantación. Por otra parte, las células uNK en la decidua \ntemprana también regulan la invasión del trofoblasto , mediante la secreción de IL -8 y \nquimioquinas, como CXCL10; además, son potentes secretoras de factores angiogénicos que \ninducen el crecimiento vascular64,69. \n4.1.2. El crecimiento fetal constituye una etapa antiinflamatoria \nEl desarrollo del feto necesita el establecimiento de un entorno antiinflamatorio de tipo Th2 y \ncualquier señal proinflamatoria continua en esta etapa puede provocar un aborto espontáneo. Las \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n34 \n \ndiferentes poblaciones inmunitarias, entre las que predominan los macrófagos, las uNK y los \nlinfocitos Treg, contribuyen a crear el microambiente antiinflamatorio64. \nLos macrófagos de la decidua presentan un fenotipo predominantemente M2, el cual se \nasocia con la renovación tisular y con la secreción de citoquinas antiinflamatorias 70. Su capacidad \nfagocítica les permite eliminar de manera eficaz células apoptóticas procedentes del trofoblasto, \nimpidiendo así la liberación de aloantígenos paternos, lo cual podría desencadenar una respuesta \ninmunitaria contra el feto 64,71. Las uNK CD56bright/CD16- presentan una baja citotoxicidad e \ninteractúan con los macrófagos deciduales (CD14+/CD86+/CD206+/CD2 09+/PDL1+) que inducen \nla generación de linfocitos Treg, mediante la producción de TGF -β e indolamina-2,3-dioxigenasa \n(IDO)72. Los linfocitos Treg Foxp3+ son muy importantes en esta etapa, ya que evitan respuestas \ninmunitarias de tipo efector contra los aloantígenos paternos. Además, el embarazo estimula \nselectivamente la acumulación de linfocitos Treg maternos con especificidad fetal y, después del \nparto, estas células persisten en niveles elevados, manteniendo la tolerancia al antígeno fetal \npreexistente73. Dichas células Treg también regulan la actividad de los linfocitos Th17, una \npoblación celular menos numerosa , que contribuye a proteger la interfaz materno -fetal de \ninfecciones microbianas74. \n4.1.3. El parto se desencadena tras una etapa proinflamatoria \nDespués del completo desarrollo del feto, el establecimiento de un microambiente \nproinflamatorio es indispensable para el inicio del parto. Concretamente, la vía de señalización de \nNF-κB en el tejido decidual inicia el parto y es determinante para el progr eso del mismo. En este \nestadio hay un importante incremento de citoquinas proinflamatorias ( como TNF-α, IL-1β, IL-6 e \nIL-8), originado como consecuencia de la infiltración leucocitaria, pero también de la secreción por \nparte de las DSC, las células del miometrio y las células placentarias. La expresión de NF-κB es \ninducible por los estímulos proinflamatorios y puede desencaden ar una retroalimentación positiva \nque da lugar a una amplificación de la producción de citoquinas. Por otra parte, la entrada de \ncélulas inmunitarias en el miometrio es necesaria para promover la contracción del útero y la \nseparación de la placenta64,75. \n \n5. Células deciduales estromales \nLas DSC son las células más abundantes de la decidua humana y están implicadas en la \nimplantación del embrión, en el desarrollo del embarazo y en el establecimiento de los \nmecanismos de tolerancia inmunológica materno -fetal76,77,78,79,80,81,82. Estas células se originan a \npartir de precursores fi broblásticos perivasculares que son capaces de decidualizarse, como \nrespuesta al aumento de los niveles de hormonas ováricas, placentarias y otros factores, tal como \nse ha explicado anteriormente 83. Como resultado de este proceso, las DSC abandonan su \nlocalización perivascular y se localizan en la zona extravascular del estroma decidual 53. Las DSC \npueden aislarse del tejido decidual, cultivarse y decidualizarse in vitro al ser incubadas con P4 y \nAMPc, experimentando un cambio a una morfología redondeada y secretando PRL (el marcador \nde decidualización más estudiado in vitro)84,85. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n35 \n \n5.1. Origen mesenquimal de las DSC \nLas MSC pueden ser aisladas de diferentes tejidos y están estrechamente relacionadas con las \ncélulas del nicho perivascular. Esta asociación permite a las MSC ser una fuente de células para \nla regeneración fisiológica tisular y para la reparación de lesiones locales 86,87,88,89. Se ha \ndemostrado que los pericitos presentan un panel de expresión de marcadores similar al de las \nMSC; concretamente, expresan CD44, CD73, CD90 y CD105, que son moléculas de superficie \ncomúnmente utilizadas como marcadores de células progenitoras mesenquimales 90. Además, los \npericitos son capaces de diferenciarse en diferentes linajes de origen mesenq uimal in vitro, dando \nlugar a adipocitos, condrocitos y osteoblastos91,92,93. Entre sus funciones destaca el mantenimiento \nde la homeostasis vascular y, por ello, producen factores angiogénicos y desempeñan actividad \ncontráctil, fagocítica, quimiotáctica e inmunoreguladora94,95,96,97,98. \n Los estudios recientes demuestran una estrecha relación fenotípica de las DSC con los \npericitos y las MSC. Entre estas propiedades destaca la expresión de los antígenos cl ásicamente \nasociados a MSC CD44, CD73, CD90 y CD105. Otros dos marcadores característicos de las DSC \nson STRO -1 y CD34 99. Mientras que STRO -1 es un antígeno que identifica a los precursores \nestromales de médula ósea, la expresión de CD34 caracteriza a células precursoras \nhematopoyéticas y precursoras estroma les. Este hecho sugiere que CD34 está implicado en la \nadhesión e interacción entre ambos tipos de células precursoras para la regulación de la \nhematopoyesis100. En el microambiente decidual esta propiedad es determinante, ya que la \ndecidua contiene una alta proporción de leucocitos impl icados en el establecimiento de la \ntolerancia inmunológica. Además, las DSC expresan los marcadores de las células del estroma \nendometrial CD10 y CD29 80. Por otra parte, la proteína del citoesqueleto vimentina y el \nmicrofilamento contráctil α-actina de músculo liso (α-SMA) caracterizan a las DSC y las relacionan \ncon las células perivasculares, determinando su actividad contráctil101,102. \nAlgunas funciones comunes entre DSC y MSC son la contractilidad celular, la resistencia a la \napoptosis y la inhibición de la apoptosis de linfocitos. En primer lugar, la contractilidad celular \npresentada por las DSC indica que estas desempeñan una función de regulación del flujo \nsanguíneo en la decidua y, por lo tanto, de la llegada de células inmunitarias a la interfaz materno-\nfetal102. La formación de la decidua durante el embarazo implica procesos de proliferación, \ndiferenciación y apoptosis de DSC. Por ello, la regulación de la apoptosis celular es necesaria \npara la fisiología normal de un embarazo. Se ha demostrado que las DSC experimentan apoptosis \nin vitro durante la decidualización, aunque son resistentes a diversos estímulos apoptóticos. Esto \nimplica que la muerte celular es un proceso estrictamente regulado que ocurre en condiciones \nsimilares a las que se encuentran durante el embarazo 103. Las DSC también desempeñan una \nfunción protectora, ya que secretan citoquinas (como IL -1β, IL-6 e IL-11), quimioquinas y factores \nde crecimiento (como VEGF) que actúan de manera paracrina y proporcionan un microambiente \nadecuado que favorece la supervivencia de linfocitos T y uNK 62,104,105,106,107. Estas moléculas \nactivan vías de señalización para la supervivencia celular o regulan positivamente la expresión de \nfactores antiapoptóticos108,109. \n5.2. Efecto de las DSC sobre las células inmunitarias de la decidua \nEl microambiente decidual influye en las características fenotípicas y funcionales de los \nleucocitos presentes en la decidua y en los que son reclutados desde sangre periférica durante el \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n36 \n \nembarazo. En dicho contexto, las DSC desempeñan un papel muy importante en esta función \nreguladora. \nEl porcentaje más elevado de leucocitos en la decidua corresponde a las células uNK. \nMediante la secreción de quimioquinas, como CXCL10, CXCL12 y CX 3CL1, las DSC participan en \nel reclutamiento de células NK desde sangre periférica hasta el tejido decidual 110. Las DSC \ntambién son capaces de inducir cambios en la expresión antigénica de las NK atraídas desde \nsangre periférica y diferenciarlas a uNK; los factores secretados responsables de inducir dichos \ncambios son TGF -β, IL -15, IL -18 e IL -24; y las NK quimioatraídas adquieren la expresión de \nmarcadores de uNK, tales como CD9, CD49a, CD103 y CXCR4, e incrementan la expresión de \nCXCR3111,112,113. Además, la decidua contiene precursores hematopoyéticos CD34+/CD45+ que \npueden diferenciarse a uNK CD56 bright/CD16-, debido al afecto de la IL -15 secretada por las DSC, \nque se une a su receptor ( IL-15Rβ; también llamado CD122) en las células CD34+ 111,114. Por otra \nparte, las DSC son capaces de inhibir la regulación positiva de la expresión de los principales \nreceptores activadores de células NK atraídas desde sangre periférica y, por lo tanto, disminuir su \ncitotoxicidad; la PGE 2, la IDO, el TGF -β y la IL -24 median el efecto inhibidor de las DSC 113,115. \nDicho efecto también lo ejercen sobre las uNK al secretar IL -33, de manera que en es tas células \ninmunitarias se incrementa la expresión de citoquinas propias de Th2 (IL -4, IL -10 e IL -13)116; la \nsecreción de IGF-1 por las DSC decidualizadas también regula negativamente la citotoxicidad de \nlas células uNK mediante la interacción con su receptor IGF-1R117 (Ilustración 6). \n \nIlustración 6. Efectos de las DSC sobre las células NK. Imagen creada con el software BioRender. \n \nOtras células inmunitarias también adquieren una función específica al interactuar con las DSC, \nque al expresar PGE2, IDO y la citoquina 1 inhibidora de macrófagos (MIC -1) ejercen un efecto \ninhibidor sobre la diferenciación de DC atraídas desde sangre periférica, de manera que también \nse inhibe su capacidad de inducir respuestas de linfocitos T potencialmente dañinas 115,118 \n(Ilustración 7). \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n37 \n \nIlustración 7. Efectos de las DSC sobre las DC. Imagen creada con el software BioRender. \n \nPor otra parte, durante la decidualización, las DSC son capaces de expresar el receptor del \nfactor activador de células B (BAFFR) y secretar la forma soluble de esta proteína, la cual inhibe \nlas funciones de monocitos y macrófagos atraídos desde sangre per iférica; por ejemplo, inhibe \nla expresión de HLA -DR y la secreción de TNF -α e IL -6 por parte de estas células. Ya que la \nfunción principal del HLA-DR es la presentación de antígenos peptídicos a los linfocitos T CD4+, la \ninhibición de su expresión en monoc itos y macrófagos atenúa la activación de linfocitos T119. \nAdemás, los monocitos quimioatraídos desde sangre periférica se diferencian ad quiriendo un \nfenotipo M2 antiinflamatorio (CD14 bright/CD163+/CD209+/CD86dim), el cual es inducido por el M -\nCSF secretado por DSC 120. Otra función de las DSC sobre los macrófagos decidua les implica la \nsecreción de IL-24, la cual promueve la renovación y la homeostasis de estos121 (Ilustración 8). \n \nIlustración 8. Efectos de las DSC sobre monocitos y macrófagos. Imagen creada con el software \nBioRender. \n \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n38 \n \nEn cuanto a la influencia de las DSC sobre el sistema inmunitario adaptativo, destaca el efecto \nen los linfocitos Treg, una población fundamental para promover la tolerancia materno-fetal. Se ha \ndemostrado que la señalización mediante TGF -β es el principal inductor de linfocitos Treg \nCD4+/CD25bright/Foxp3+ en la decidua a partir de linfocitos T CD4+ de sangre periférica 120. Otro \nfactor que induce dicha diferenciación es IDO 122. Estudios realizados en modelo murino señalan \nque la IL-33, secretada por DSC, regula las respuestas inmunitarias de tipo Th2 durante la etapa \nantiinflamatoria del embarazo 123. Otra investigación llevada a cabo en ratones muestra que, \ndurante la decidualización, en las DSC se inhibe la expresión de las quimioquinas CXCL9, \nCXCL10, CXCL11 y CCL5 que atraerían a células Th1 y Tc proinflamatorias a la interfaz materno -\nfetal81. Por otra parte , la secreción de citoquinas antiinflamatorias Th2, como IL -4 e IL -10, y la \ninhibición de la secreción de quimioquinas proinflamatorias Th1, como TNF -α e IFN -γ, se ve \nfavorecida por el efecto de CCL2 sobre estas células 124. Esta quimioquina también induce la \nmigración de linfocitos Th17 periféricos, con funciones reguladoras y protectoras; las células Th17 \nsecretan IL-17 que promueve la proliferación y la invasión del trofoblasto125 (Ilustración 9). \n \nIlustración 9. Efectos de las DSC sobre células T. Imagen creada con el software BioRender. \n \n5.3. Efecto de las células inmunitarias deciduales sobre las DSC \nTeniendo en cuenta que la señalización entre dos tipos celulares diferentes frecuentemente \nresulta en una comunicación bidireccional, los factores secretados por las células inmunitarias \ntambién influyen en las características que presentan las DSC 82. En relación a ello, hay estudios \nque demuestran que las células linfoides innatas (ILC) desempeñan funciones relacionadas con \nla remodelación, la homeostasis y la defensa inmunitaria innata en el tejido decidual. Las células \nlinfoides innatas tipo 3 (ILC -3) están presentes en la decidua humana durante el primer trimestre \nde embarazo126. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n39 \n \nVacca et al. identificaron dos subconjuntos de ILC-3: las células similares a las inductoras de \ntejido linfoide (LTi-like) y las ILC-3 NCR+ (receptor de citotoxicidad natural). Las células inductoras \nde tejido linfoide (LTi) están involucradas en el desarrollo embrionario de órganos linfoides \nsecundarios (SLO). Durante el desarrollo embrionario humano y murino, las células estromales de \nlos SLO derivan de células organizadoras de tejido linfoide (LTo) que son células con una \nubicación perivascular y están relacionadas con las MSC. Las células LTo interaccionan con las \ncélulas LTi, que son ILC -3. De forma equivalente a la interacción embrionaria entre LTo y LTi en \nlos SLO para la formación de ganglios linfáticos, tanto las célu las ILC-3 NCR+ como las células \nLTi-like interactúan con las DSC. Esto aumenta la expresión de las moléculas de adhesión ICAM-1 \ny VCAM -1 por parte de las DSC 126,127,128. Esta regulación positiva puede estar implicada en la \nremodelación tisular, la placentación y el reclutamiento leucocitario. \nOtro factor que contribuye a la interacción entre las DSC y las células inmunitarias es el tejido \ntrofoblástico. Se ha demostrado, en modelo murino, que las células del trofoblasto modulan la \nproliferación de las células estromales, pero dicha proliferación solo se produce si hay una \ncomunicación intercelular eficaz de las DSC con las uNK y las DC de la decidua129. \n \n6. Endometriosis \nLa endometriosis es una enfermedad ginecológica que se caracteriza por la presencia de \ntejido endometrial fuera de la cavidad uterina, en localizaciones ectópicas. Las propiedades \nhistopatológicas de las lesiones endometriósicas muestran la presencia de tejido endometrial , \nestromal y glandular. Se asocia a síntomas como el dolor pélvico crónico y la infertilidad. No \nobstante, existe una gran heterogeneidad entre los pacientes respecto a las manifestaciones \nfenotípicas de la enfermedad y la gravedad de los síntomas. Afecta, aproximadamente, a una de \ncada diez mujeres en edad reproductiva en todo el mundo, las cuales ven disminuida \nconsiderablemente su calidad de vida. Aunque se ha investigado mucho la endometriosis en estos \núltimos años, a día de hoy no existe un marcador di agnóstico no invasivo y tampoco un \ntratamiento curativo130,131. \n6.1. Etiopatogenia de la endometriosis \nSe han propuesto diversas teorías para explicar el origen de la endometriosis, las cuales se \nincluyen en dos grupos en función de si el origen de los implantes es el endometrio uterino o \nextrauterino. Estas teorías podrían no ser excluyentes y estar implic adas en las diferentes \nmanifestaciones de la enfermedad. \n6.1.1. Origen a partir de endometrio uterino \nTeoría de la menstruación retrógrada . Una de las teorías más aceptadas es la menstruación \nretrógrada o retroperitoneal, propuesta por Sampson et al. en la década de 1920; la cual explica \nque, durante la menstruación , las células del tejido endometrial se desplazan a través de las \ntrompas de Falopio y se implantan en el tejido y/o en los órganos pélvicos 132. Esta teoría se \nconsolidó al observar tejido endometrial de procedencia menstrual en la cavidad peritoneal \ndurante la menstruación y también al encontrar un mayor volumen de sangre y tejido endometrial \nen la pelvis de mujeres con endometriosis 131,133. Aunque el aumento del reflujo menstrual puede \npredisponer a la enfermedad, la prevalencia de menstruación retrógrada en mujeres sanas es del \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n40 \n \n76-90%, por lo tanto se trata de un evento fisiológico común133. Además, esta teoría no es capaz \nde explicar la presencia de end ometriosis fuera de la cavidad peritoneal (piel, mucosa nasal, \npulmones, estómago, intestinos, riñones…), que ocurre en el 10% de los casos; su aparición en la \npubertad temprana; en mujeres afectadas por el síndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser \n(se caracteriza por un defecto en el desarrollo de los conductos de Müller que forman el útero, las \ntrompas de Falopio y la vagina durante la embriogénesis); y en varones134,135,136,137. \nDiseminación hematógena o linfática del tejido endometrial (Teoría de Halban) . Esta teoría \nindica que las células endometriales pueden aparecer en órganos extrapélvicos a través de la \ndiseminación linfática o hematógena. Además, la tendencia del adenocarcinoma endometrial a \ndiseminarse a través de la circulación linfática prueba que las células endometriales pueden ser \ntransportadas por esta vía138. \n6.1.2. Origen a partir de endometrio extrauterino \nTeoría de la metaplasia celómica (Teoría de Meyer) . La metaplasia celómica implica la \ntransformación del tejido peritoneal normal en tejido endometrial ectópico , por lo que esta teoría \nexplicaría la presencia de lesiones en el peritoneo. El mesotelio, q ue se origina en el epitelio \ncelómico que recubre el ovario, posee un import ante potencial metaplásico. Puede sufrir \ninvaginación hacia la corteza ovárica y dichas inclusiones mesoteliales tienen la capacidad de \ntransformarse en endometriosis a través de m etaplasia139,140,141. Esta teoría podría explicar por \nqué solo un pequeño porcentaje de las mujeres que presentan menstruación retrógrada tiene \nendometriosis, así como la presencia de la enfermedad en ausencia de menstruación. N o \nobstante, la ausencia de enfermedad en otros tejidos que derivan del epitelio celómico contradice \nesta teoría. \nTeoría de los restos Müllerianos . Sugiere como origen de la endometriosis la migración de \ncélulas embrionarias residuales procedentes de los c onductos de Müller embrionarios, las cuales \npueden diferenciarse dando lugar a las lesiones ectópicas. Según esta teoría, dichas células \nembrionarias permanecen inactivas hasta la pubertad y, tras la estimulación con estrógenos, \nempieza el desarrollo de la lesión. Mediante esta teoría se explicaría la aparición de focos de \nendometriosis en el peritoneo profundo y la bolsa de Douglas; y la endometriosis en varones, ya \nque los conductos de Wolff también albergan células embrionarias140. \nTeoría del “Homing erróneo” de células madre de médula ósea . I nvestigaciones recientes \nproponen a las células progenitoras extra uterinas procedentes de médu la ósea como posible \norigen de l a endometriosis. T endría lugar un “homing erróneo” de los precursores de EnSC \nrelacionados con MSC que desde médula ósea, a través de la sangre, llegan a tejidos \nperitoneales y extraperitoneales. Esta teoría explicaría los c asos de endometriosis fuera de la \ncavidad peritoneal y los casos de endometriosis en varones. En este contexto patológico, el eje \nCXCL12/CXCR4 sería determinante al participar en el reclutamiento de MSC en tejidos \nendometriales, tanto eutópicos como ectópicos. Las células endometriales en tejidos inflamados o \nlesionados expresan la quimioquina CXCL12, que es ligando del receptor CXCR4 expresado por \nlas células progenitoras. La activación de este eje promovería el reclutamiento de MSC al lugar de \nla lesión y la angiogénesis140,142. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n41 \n \n6.2. Células endometriósicas estromales \nLos focos de endometriosis (peritoneales, ováricos y extraperitoneales) contienen tanto células \nendometriósicas estromales (eEnSC) como células epiteliales. La detección de células \nepiteliales y estromales, procedentes del donante, en el endometrio de mujeres trasplantadas de \nmédula ósea sugiere la existencia de un precursor común que da origen a ambos linajes celulares, \ntanto epitelial como estromal; o la exi stencia de dos precursores independientes que se \ndesarrollan en la médula ósea y lu ego colonizan el endometrio 142,143. Estos resultados coinciden \ncon experimentos llevados a cabo en modelo murino, en los que se demuestra que células de \nmédula ósea humana colonizan el endometrio y los focos de endometriosis diferenciándose en \ncélulas epiteliales y estromales 144. Dadas estas dos posibilidades y en base a las investigaciones \nrealizadas hasta la fecha, parece poco probable que dos precursores independientes de la médula \nósea puedan colonizar cada uno de manera errónea un tejido extrape ritoneal, para producir focos \nde endometriosis extraperitoneales. Es más probable que haya un solo precursor que dé origen \ntanto a células epiteliales como estromales. El hecho de que tanto l as MSC como las eEnSC \npuedan diferencia rse en células epiteliales respalda la existencia de un solo pr ecursor, \nrelacionado con las MSC y las eEnSC 145. Este precursor puede colonizar el endometrio en \ncondiciones normales, donde se diferencia en células epi teliales y estromales. En el caso de la \nendometriosis, el precursor puede formar los focos (tanto peritoneales como extraperitoneales), \ndiferenciándose también en células epiteliales y estromales. \n6.3. Factores que intervienen en el establecimiento de la enfe rmedad \nAunque las teorías mencionadas anteriormente pueden explicar la aparición de células \nendometriales en la cavidad peritoneal o en otras localizaciones, el desarrollo de los implantes de \nendometriosis es consecuencia de su adhesión al epitelio e invasión; de la evasión de la \neliminación por parte del sistema inmunitario ; y del desarrollo de neovascularización , que permite \nel crecimiento de los implantes. Para que se den estas condiciones deben intervenir factores \ngenéticos, epigenéticos, inmunitarios, endocrinos y ambientales, que hacen que la endometriosis \nsea una enfermedad multifactorial. \n6.3.1. Predisposición genética \nLa endometriosis es una enfermedad con un importante componente hereditario. Se ha \ndemostrado que es significativamente más frecuente en mujeres que tienen una familiar de primer \ngrado afectada 146. Además, en un estudio llevado a cabo con 16 parejas de gemelas \nmonocigóticas, se observó una concurrencia del 87%147. \nAunque la base genética de la enfermedad no se conoce completamente, se han identificado \ndiversos genes implicados en el inicio y progresión de la endometriosis; por ejemplo, genes \nrelacionados con la regulación del ciclo celular, moléculas de adhesión, respuesta inflamatoria, \nfactores de crecimiento y receptores hormonales. Los factores genéticos contribuyen a la \nenfermedad a través de la inestabilidad de microsatélites, inestabilidad cromosómica, polimorfismo \nde un solo nucleótido, mutaciones génicas, pérdida de heterocigosidad y/o mutaciones del ADN \nmitocondrial134. Además, teniendo en cuenta que en el endometrio hay un elevado grad o de \nrecambio celular, aumentan las probabilidades de la aparición de errores en la recombinación \ngenética. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n42 \n \nLa inestabilidad de microsatélites y la alteración de los genes de reparación del ADN (MMR) \nson características de las células cancerosas. La expre sión de MMR se incrementa en el cáncer \nde ovario, aunque en la endometriosis disminuye. Hay estudios que sugieren que las anomalías \nen MMR pueden llevar a la transformación maligna de las lesiones de endometriosis134. \nLa inestabilidad cromosómica es otro factor importante que implica la alteración maligna de una \ncélula con un número de copias cromosómicas anormal. La reducción del número de copias del \ncromosoma 1p, 22q y X, así como el aumento del número de copias del cromosoma 6p, 20q y 17q \nse r elacionan con el desarrollo de la endometriosis 134,148. Diferentes estudios de asociación de \ngenoma completo han demostrado que la expresión de las regiones cromosómicas 10q26 y \n7p15.2 se relaciona con una mayor susceptibilidad a desarrollar la enfermedad149,150. \nUn estudio reciente aporta nuevos datos sobre la implic ación de químicos disruptores \nendocrinos (EDC), como parabenos y benzofenonas, en la patogénesis y fisiopatología de la \nendometriosis. La exposición de las mujeres a estos compuestos se asocia con un perfil alterado \nde la expresión de genes relacionados co n vías de señalización celular determinantes para el \ndesarrollo de la enfermedad; tales como la adhesión celular, la invasión, la migración, la \ninflamación, la angiogénesis, la proliferación celular y la estimulación hormonal. Teniendo en \ncuenta que el microambiente inflamatorio complejo que caracteriza a la endometriosis favorece los \nprocesos de adhesión, invasión y proliferación de las células endometriósicas, así como la \nvascularización, se ha descrito que la exposición a EDC puede contribuir a la genera ción de \ninflamación en el tejido ectópico, mediante la regulación positiva de genes como IL1RL1, IL6ST \nTNFRSF1B y NR3C1151. \n6.3.1.1. Apoptosis \nUn proceso implicado en el mantenimiento de la homeostasis y el recambio celular en el \nendometrio es la muerte celular programada o apoptosis. La apoptosis se caracteriza por una \nserie de cambios morfológicos y bioquímicos, tales como la reducción del volumen celular y \nnuclear debido a la condensación del citoplasma y la cromatina. Una de las características más \nimportantes de la apoptosis es la fragmentación oligonucleosomal del ADN en fragmentos de 180-\n200 pb, o múltiplos d e estos, por la acción de las endonucleasas. Además, muchas proteínas \ncelulares sufren proteólisis catalizada por caspasas. Simultáneamente, tiene lugar la dilatación del \nretículo endoplasmático dando lugar a la formación de vesículas. Finalmente, la célul a se \nfragmenta en cuerpos apoptóticos que son fagocitados por macrófagos y otras células para ser \neliminados; de esta manera se evita la liberación del material intracelular y su exposición al \nsistema inmunitario, lo cual provocaría que se desencadenara una respuesta inflamatoria152. \nLos niveles de las proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas varían permitiendo el control del \nproceso de muerte celular programada, pero los defectos en la regulación de la apoptosis dan \nlugar a numerosos procesos patológicos. Las investigaciones recientes han demostrado que \ncuando el tejido endometrial se sitúa en localizaciones ectópicas, se diferencia del tejido \nendometrial eutópico en la expresión de algunos marcadores de apoptosis. La menor s ensibilidad \nde las células endometriósicas a la apoptosis puede promover la diseminación e implantación de \nestas células en sitios ectópicos 153. Esta resistencia a la apoptosis se debe, en parte, a la \nsobreexpresión del gen antiapoptótico Bcl-2154. También se ha encontrado una expresión alterada \ndel ligando de muerte FasL, secretado por células endometriales o inmunitarias; de manera que el \nlíquido peritoneal de mujeres con endometriosis moderada o grave contiene altas concentraciones \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n43 \n \nde FasL soluble, en comparación con las mujeres con endometriosis leve o sin endometriosis. \nEsto contribuye a la m ayor eliminación de las células inmunitarias que expresen Fas en su \nmembrana, permitiendo así la supervivencia de las células endometriósicas en la localización \nectópica155. \n6.3.2. Papel de la epigenética \nLos cambios epigenéticos son alteraciones hereditarias de la expresión genética , sin ninguna \nvariación en las secuencias de ADN , que controlan el desarrollo y la diferenciación celular. Las \nalteraciones epigenéticas también se observan en la endometriosis y tienen un papel clave en la \nregulación de la expresión génica a través de modificaciones postraduccionales de las histonas \n(histonas metiltransferasas, histonas acetil transferasas e histonas deacetilasas ), metilación del \nADN, silenciamiento de microARN, ARN no codificante, ARN no codificante largo intergénico y \nreparación del ADN. \nInvestigaciones recientes identificaron varios genes que están hipoacetilados en la \nendometriosis; por ejemplo, el gen que codifica para ER-α; el factor de transcripción homeobox \nA10 (HOXA10); la proteína de unión al enhancer CCAAT alfa (C/EBP-α); las proteínas \nreguladoras del ciclo celular p16 ( CDKN2A), p21 ( CDKN1A) y p27 ( CDKN1B); la proteína \nreguladora de puntos de control del ciclo celular y la apoptosis CHEK2; el receptor de muerte \ncelular 6 (DR6) y la E-cadherina156. \nTambién se ha comprobado que l a hipermetilación del ADN en la endometriosis afecta a la \nexpresión de genes implicados en la capacidad de respuesta a la progesterona y el proceso de \ndecidualización. Entre los genes afectados se encuentran el gen que codifica para el PR -B, \nHOXA10, IGFBP-1, factor esteroidogénico 1 (NR5A1) y aromatasa (CYP19A1)157. \nLa hipermetilación del promotor específico de PR -B se considera una causa para el desarrollo \nde la resistencia a la P4 que caracteriza a la endometriosis. Por otra parte, se ha demostrado que \nlos niveles de expresión de l ER-α en las células del endometrio ectópico son más bajos que los \ndel endometrio eutópico; mientras que el ER-β se sobreexpresa en las células endometriósicas en \ncomparación con las células endometriales eutópicas. La metilación deficiente del promotor de \nER-β da como resultado su sobreexpresión patológica en las células endometriósicas. El aumento \nde la proporción ER-β/ER-α en la endometriosis , al comparar con el tejido endometrial sano, se \nasocia a la supresión del PR, lo que contribuye la resistencia a la P4158,159. \n6.3.3. Factores endocrinos \nLa endometriosis es una enfermedad dependiente de estrógenos. El estradiol es el estrógeno \nbiológicamente activo y se produce en los ovarios y en otros tejidos periféricos, gracias a la \naromatización de los andrógenos ováricos y suprarrenales. En todos estos sitios, la expresión de \nla enzima aromatasa es esencial para la producción de estradiol. El propio tejido endometriósico \ntambién es capaz de sintetizar estradiol al expresar aromatasa, que convierte la androstenediona \nen estrona; y la 17-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1, que convierte la estrona en estradiol. \nDe esta manera, los estrógenos locales producidos por el tejido endometriósico ejercen un efecto \nautocrino sobre el mismo tejido 159. Además, el ambiente estrogénico también se favorece por un \ndéficit de la enzima 17 -β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2, que desactiva los estrógenos al \nconvertir el estradiol en estrona160. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n44 \n \nEl tejido endometrial eutópico no expresa aromatasa, pero sí produce 17 -β-hidroxiesteroide \ndeshidrogenasa tipo 2 en respuesta a la P4. Por este motivo, la P4 durante la fase secretora \nestimula la inactivación del estradiol mediante su conversión a estrona. No obstante, a diferencia \ndel tejido eutópico, el tejido endometriósico es resistente a la acción de la P4, por lo que se impide \nla atenuación del estímulo estrogénico160. \nUna mayor comprensión de los mecanismos genéticos, epigenéticos, moleculares y celulares \nimplicados en la etiología y fisiopatología de la endometriosis conducirá a mejores métodos de \ndiagnóstico y tratamientos más específicos. \n6.4. El microambiente inmunitario de la lesión endometriósica \nLa incapacidad del sistema inmunitario de eliminar tejido endometrial ectópico puede provocar \na lo largo del tiempo una disregulación inmunitaria. No obstante, no está claro si esa disregulación \nes causa o consecuencia de la endometriosis. De ahí la necesidad de poder dilucidar cuáles son \nlos mec anismos que explican el fracaso de la eliminación de las células endometriales en los \nfocos ectópicos o endometriomas130. \nLa lesión endometriósica se establece en un microambiente complejo y dinámico en el que \nintervienen factores inflamatorios, angiogénicos y endocrinos. Además, el perfil transcriptómico de \nlas células endometriales ectópicas (eEnSC), en comparaci ón con el de las células endometriales \neutópicas de pacientes y de donantes sanas, muestra una expresión elevada de genes asociados \ncon el reclutamiento de células inmunitarias, la interacción entre citoquinas y sus receptores, la \nadhesión celular y la apo ptosis. Estos datos corrobora n la existencia de la di sregulación \ninmunitaria que a menudo se observa en el líquido peritoneal de las pacientes 161. En relación a \nello, Suryawanshi et al. mostraron que el perfil inflamatorio de la lesión endometriósica se asemeja \nal de un tumor y esto es particularmente importante , ya que la lesión ectópica puede ser \nprecursora de algunos tumores endometrioides y ováricos162. \nEntre las poblaciones de células inmunitarias innatas implicadas en la fisiopatología de la \nendometriosis destacan los neutrófilos, los mac rófagos, las células NK y las DC . En cuanto a los \ncomponentes del sistema inmunitario adaptativo , destaca la inmunidad celular mediada por \nlinfocitos T y la inmunidad humoral mediada por linfocitos B productores de anticuerpos130. \n6.4.1. El sistema inmunitario innato en la endometriosis \nLa elevada concentración de IL -8, un quimioatrayente de neutrófilos, en el líquido peritoneal \nde las pacientes de endometriosis conlleva un aumento de la infiltración de estas células en el \nperitoneo, en comparación con mujeres sanas 163,164,165. Además, probablemente los neutrófilos \ntengan una función importante en los primeros estadios del desarrollo de la lesión, ya que se ha \ndemostrado, en un modelo murino de endometriosis, que tiene lugar una infiltración máxima de \nneutrófilos en el tejido endometrial ectópico durante una etapa temprana de formación de la lesión \n(días 1 a 5), mientras que posteriormente (días 6 y 7) disminuye el número total de estas células. \nAdemás, este estudio demostró que los neutrófilos promueven la angiogénesis en la e tapa \ntemprana mediante la secreción de VEGF 166. En el foco inflamatorio, el reclutamiento de \nneutrófilos también se ve favorecido por la presencia de quimioquinas secretadas por macrófagos \ny mastocitos, dos poblaciones celulares que están aumentadas en la lesión endometriósica 167,168 \n(Ilustración 10). \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n45 \n \n \nIlustración 10. Representación esque mática del microambiente inmunitario en la lesión de \nendometriosis. Adaptado de Symons et al.130 \n \nEn cuanto a lo s macrófagos, el número total de estas células se encuentra elevado en el \nlíquido peritoneal de mujeres con endometriosis, aunque son más abundantes en el tejido \nectópico167,169. El reclutamiento de estas células no es solamente un evento temprano en el \ndesarrollo del foco ectópico, sino un hecho necesario para el establecimiento de la lesión, por lo \nque la comunicación entre las eEnSC y los macrófagos es determinante. Tras el aislamiento de \nmacrófagos de pacientes, se ha demostrado que presentan una capacidad fagocítica reducida, \nasociada a una menor expresió n del receptor “scavenger” CD36; esta es una molécula capaz de \nreconocer y captar li poproteínas modificadas, patógenos, neutrófilos apoptóticos y actuar como \ncorreceptor de los receptores “Toll -like” (TLR) para que tenga lugar una respuesta inflamatoria \neficiente170. Al comparar con mujeres sanas, los macrófagos peritoneales también presentan una \nmayor activación de NF-κB y una mayor secreción de citoquinas y quimioquinas proinflamatoria s, \ncomo TNF-α, IL-1β, IL-6, CCL3 y CXCL2 166,171,172. El crecimiento del endometrioma se puede ver \nfavorecido por la presencia de macrófagos, ya que se ha demostrado que el cocultivo de \nmacrófagos con eEnSC aumenta la proliferaci ón y la capacidad invasiva de estas células 173. Otra \nfunción de los macrófagos está relacionada con la generación del dolor que experimentan las \nmujeres con endometriosis, ya que se ha comprobado que en las lesiones ectópicas hay un \nelevado número de macrófagos que colocalizan e interaccionan con fibras nerviosas 174. Además, \nal igual que los neutrófilos, los macrófagos promueven la angiogénesis en la etapa temprana de \nformación de la lesión, mediante la secreción de VEGF166. \nLa plasticidad celular para adquirir un fenotipo proinflamatorio (M1) o un fenotipo \nantiinflamatorio (M2) es una propiedad que caracteriza a los macrófagos. Bacci et al. demostraron \nque los macrófagos M2 son más abundantes en el líquido peritoneal de mujeres con \nendometriosis. Además, la transferencia intraperitoneal de estos, en modelo murino, facilitó el \ncrecimiento de las lesiones y la neovascularización 167. No obstante, dada la complejidad del \nmicroambiente inflamatorio en las lesiones de endometriosis, probablemente la polarización de los \nmacrófagos cambie según el estadio de la enfermedad o la localización de estos 130. Una \nposibilidad es que los macrófagos M1 contribuyan al entorno inflamatorio, mientras que los \nmacrófagos M2 favorezcan la angiogénesis que caracteriza a la enfermedad175 (Ilustración 10). \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n46 \n \nOtras células inmunitarias innatas implicadas en la patología son las células NK. El entorno \nperitoneal suprime la actividad citotóxica de dichas células, las cuales muestran una expresión \naberrante de algunos receptores activadores e inhibidores, al comparar con mujeres sanas. Por \nejemplo, en mujeres con endometriosis se observó, tanto en líquido peritoneal como en sangre \nperiférica, un incremento de la expresión de los receptores inhibidores d e NK (KIR), que \nreconocen el HLA-C en las células diana e inhiben la activación de las células NK, estableciendo \nasí un mecanismo de tolerancia 176. Además, se ha descubierto que en el fluido del peritoneo de \nlas pacientes se incrementa la concentración de las moléculas de histocompatibilidad no clásicas \nMICA y MICB, que son ligan dos solubles del receptor tipo lectina NKGD2 en células NK . E l \naumento de las formas solubles de MICA y MICB en el líquido peritoneal implica una menor \nexpresión de estos ligandos en la superficie de las células endometriales ectópicas, lo que \nconduce a una mayor evasión del r econocimiento de las células NK y a la inhibición de su \ncitotoxicidad177. La actividad citotóxica de las células NK también se ve dis minuida por la \npresencia de algunas citoquinas y quimioquinas, como IL -6 y TGF-β1 en el líquido peritoneal; IL -\n15 secretada por las eEnSC; e IL -10 y TGF - β como producto de la interacción entre eEnSC y \nmacrófagos178,179,180,181 (Ilustración 10). \nPor lo que respecta a las DC, estas están implicadas en la angiogénesis y en el desarrollo de la \nlesión. Hay estudios que demuestran que las DC CD1a+ (inmaduras) están presentes en el \ninterior de la lesión ectópica y en el fluido peritoneal, aunque la presencia de DC CD83+ \n(maduras) es muy baja. Ambas poblaciones celulares no se detectan en el peritoneo de mujeres \nsanas. Estos datos sugieren que las eEnSC o los factores presentes en el fluido peritoneal de las \nmujeres enfermas reclutan DC CD1a+ para ini ciar la captación y posterior eliminación de \nantígenos ectópicos extraños 182. Las DC BDCA -1+/CD206+ son capaces de fagocitar restos \ncelulares procedentes de las eEnSC y contribuyen al incremento de la inflamación, mediante la \nsecreción de IL-1β e IL-6183 (Ilustración 10). \nOtros mediadores de la inmunidad innata son los patrones moleculares asociados a daño \n(DAMP), moléculas endógenas estimuladoras del sistema inmunitario que se liberan como \nrespuesta a una lesión o inflamación tisular130. Una de estas moléculas, que tienen un papel activo \nen la progresión de la endometriosis , es la IL-33. Se observan concentraciones elevadas de IL -33 \nen el líquido peritoneal de mujeres con endometriosis infiltrante profunda, en comparación con \nmujeres sanas. Además, las lesiones ectópicas en un estadio avanzado de la enfermedad también \nexpresan altos niveles de IL -33, así como de su receptor ST2 ( supresor de tumor igenicidad 2). \nEsto es indicativo de que las eEnSC contribuyen a la producción de IL-33 pero también responden \na este factor presente en el microambiente184 (Ilustración 10). \n6.4.2. El sistema inmunitario adaptativo en la endometriosis \nEn cuanto a los mecanismos de inmunidad adaptativa, la endometriosis se caracteriza por la \nbaja actividad de los linfocitos T citotóxicos , la regulación de la expresión de citoquinas por los \nlinfocitos Treg y la producción de autoanticuerpos por los linfocitos B185. \nLos estudios que evaluaron los linfocitos T en pacientes con endometriosis mostraron una \nmayor proporción de células CD4+ que de células CD8+ en el líquido peritoneal; aunque la \nconcentración de ambas poblaciones celulares se incrementa, en comparación co n mujeres \nsanas. Las lesiones ectópicas también contienen linfocitos T, pero la proporción de células \nCD4+/CD8+ es equivalente185,186. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n47 \n \nEn el contexto de la endometriosis predomina una respuesta inmunitaria Th2 y, por lo tanto, las \ncitoquinas secretadas por estas células, como la IL -4 y la IL -10, en el líquido peritoneal de las \npacientes187,188 (Ilustración 10). \nLa proporción de linfocitos Th17 en el líquido peritoneal de las mujeres enfermas aumenta con \nrespecto a las mujeres sanas, de manera que también se incrementan los niveles de la principal \ncitoquina secretada por estas células, la IL -17. Esta molécula contribuye a la fisiopatología de la \nendometriosis al estimular la producción de citoquinas qu e inducen angiogénesis e inflamación \ncrónica, para el establecimiento y mantenimiento de las lesiones 130,189. Se ha descubierto que a \nmedida que progresa la enfermedad, el porcentaje de linfocitos Th17 en el peritoneo aumenta 190 \n(Ilustración 10). \nLos linfocitos Treg tienen una función supresora en el sitio de desarrollo de la lesión. El número \nde células Treg CD4+/CD25+/Foxp3+ es elevado en el líquido peritoneal de las mujeres enfermas, \nen comparación con mujeres sanas; además, también están presentes en el endometrioma 191,192. \nSe ha demostrado que los macrófagos y las eEnSC secretan la quimioquina CCL25, la cual \nestimula la diferenciación de linfocitos Treg y la producción de IL -10 y TGF -β193. A su vez, e stas \ncitoquinas estimulan la proliferación e invasión de las eEnSC , al regular positivamente la \nexpresión de las metaloproteinasas de la matriz extracelular 2 y 9 (MMP -2 y MMP-9), lo que lleva \nal crecimiento de la lesión y la progresión de la endometriosis194 (Ilustración 10). \nFinalmente, los linfocitos B contribuyen a la patogénesis de la endometriosis mediante la \ngeneración de anticuerpos antiendometriales ( autoanticuerpos IgG e IgA) que están presentes \nen el suero y el líquido peritoneal de las pacientes 195,196. Además, las células B contribuyen a la \nproducción local y sistémica de citoquinas, como IL-6, GM-CSF e IL-17, de manera que participan \nen la generación del microambiente inflamatorio165,189,197 (Ilustración 10). \nLos estudios realizados hasta el momento proporcionan información sobre la implicación del \nsistema inmunitario en la patogénesis de la enfermedad ( Ilustración 11 ). No obstante, s igue \nsiendo necesario dilucidar la composición exacta del microambiente inmunitario en la lesión \nendometriósica y su relación con las diferentes etapas y síntomas asociados a la endometriosis; \nasí como comprender las alteraciones de las propiedades funcionales de las célula s inmunitarias \ninnatas y adaptativas dentro de las lesiones y cómo esto contribuye a que el sistema inmunitario \nno elimine el tejido endometrial en localizaciones ectópicas130. \n\n\nINTRODUCCIÓN \n \n \n48 \n \n \nIlustración 11. Respuestas inmunitarias en la endometriosis. Adaptado de Riccio et al.185 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n49 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nHIPÓTESIS \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nHIPÓTESIS \n \n \n50 \n \nLas propiedades inmunoreguladoras de las MSC hacen que la investigación sobre estas \ncélulas sea un recurso prometedor para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y \nautoinmunes198. De ahí radica la necesidad de encontrar una fuente de células con las \ncaracterísticas de las MSC que sea fácil de obtener y que no implique procedimientos invasivos. \nEn relación a ello, en esta tesis se han investigado dos tipos celulares que se encuentran en \ntejidos adultos, concretamente, las EnSC y las DSC . Tomamos como base que investigaciones \nprevias sugerían que tanto las EnSC en el endometrio no gestante, como l as DSC en el \nendometrio gestante se encuentran relacionadas con las MSC y con células \nperivasculares79,101,102,199,200,201,202,203. Además, el estudio y caracterización de las células \nestromales uterinas en condiciones sanas es nece sario para poder entender mejor la \ninmunopatología de enfermedades ginecológicas, como la endometriosis204. \nPor todo lo expuesto anteriormente, proponemos las siguientes hipótesis: \n1. Las células precursoras de las DSC (preDSC) constituyen el nicho perivascular de las MSC \nen la decidua humana. \n \n2. La decidualización de las DSC (dDSC) produce cambios en sus características fenotípicas \ny funcionales que favorecen el perfil inmunomodulador de estas células. \n \n3. Aunque las DSC y las EnSC son el mismo tipo de célula, el hecho de que cada una de ellas \nse encuentre en un contexto fisiológico diferente (decidua y endometrio no gestante, \nrespectivamente) determina diferencias fenotípicas y funcionales entre ambos tipos \ncelulares. \n \n4. Las eEnSC presentan cambios en su f enotipo y funciones respecto a las EnSC , que están \nrelacionados con la inmunopatología de la enfermedad. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n51 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nOBJETIVOS \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nOBJETIVOS \n \n \n52 \n \nObjetivo general \nEsta tesis doctoral tiene como objetivo general estudiar el origen, la diferenciación y las \nderivaciones patológicas de las células estromales uterinas. Para ello, analizaremos las \ncaracterísticas fenotípicas y funcionales de las células estromales uterina s humanas procedentes \ndel endometrio no gestante, del endometrio gestante o decidua y del endometrioma ovárico, y su \ncomparación con las MSC. \n \nObjetivos específicos \n1. Estudio de las propiedades de MSC y pericitos en precursores de las DSC (preDSC). \n \n2. Análisis del efecto del proceso de decidualización en el fenotipo antigénico y en las \npropiedades inmunoreguladoras de las DSC. \n \n3. Estudio comparativo del fenotipo antigénico y de las funciones de DSC y EnSC. \n \n4. Comparación del fenotipo antigénico y de las funciones de EnSC y eEnSC, para esclarecer \nla inmunopatología de la endometriosis. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n53 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n54 \n \n1. Cultivos celulares \n1.1. Células endometriales estromales procedentes de sangre \nmenstrual \n1.1.1. Obtención y cultivo de EnSC \nLas muestras de sangre menstrual se obtuvieron de 10 donantes voluntarias sanas, de un \nrango de edad comprendido entre 20 y 35 años. Las donantes no padecían ningún trastorno \nginecológico ni autoinmune y no estaban recibiendo tratamiento hormonal anticonceptivo. Las \nmuestras se obtuvieron previo conse ntimiento informado de t odas las donantes que participaron \nen el estudio. Se ha elegido la sangre menstrual como fuente de células endometriales sanas \nporque se sigue un procedimiento sencillo, no invasivo y se puede disponer fácilmente de un \nnúmero elevado de donantes. \nEn todos los casos, la muestra se recogió el primer o segundo día de la fase menstrual, \nempleando tampones o copa menstrual. Este es un momento óptimo para obtener un mayor \nvolumen de sangre. \nSe recogieron, aproximadamente, de 2 a 5 mL de sangre menstrual que se vertieron en frascos \nde polipropileno estériles para la recogida de muestras clínicas (150 mL). La sangre se diluyó en \nproporción 1:2 con tampón fosfato salino (PBS) estéril (Thermo Fisher Scientific, Waltham, \nMassachusetts, EEUU ) hasta obtener una mezcla más fluida y homogénea . Dicha mezcla se \nsometió a un gradiente de densidad con Ficoll-Paque (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) a razón \nde 4 mL de reactivo por cada 10 mL de sangre diluida. Tras una centrifugación a 2200 rpm (20 \nmin a 20 °C), se recogió la inte rfase, donde se encuentran las EnSC, y se centrifugó en PBS \n(Thermo Fisher Scientific ) a 1500 rpm (5 min a 20 °C). El pellet de células obtenido se \nresuspendió en medio de cultivo Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 3% de \nsuero bovino fetal (FBS) descomplementado, 100 U/m L de penicilina/estreptomicina y 0,25 μg/mL \nde anfotericina B (todo de Thermo Fisher Scientific ). Las células se sembraron en un frasco de \ncultivo de 25 cm 2 de superficie y se mantuvieron durante 24 horas a 37 °C, permitiendo así su \nadherencia al frasco. Tran scurrido este tiempo, se realizó un lavado con PBS (Thermo Fisher \nScientific) para retirar las células que quedan en suspensión. \nLas EnSC en cultivo se mantuvieron realizando cambios de medio cada 2 o 4 días, en función \nde la confluencia, hasta llegar a una confluencia del 80% aproximadamente. En ese momento, se \nrealizó un pase o subcultivo utilizando Tripsina -EDTA 1x ( Merck KGaA ) y las células se \ntransfirieron a un frasco de cultivo de 75 cm 2 de superficie, donde se mantuvieron de forma \nrutinaria. \nLos cultivos celulares permanecieron a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de dióxido \nde carbono (CO 2) con cambios de medio cada 2 -3 días y tripsinizaciones a l alcanzar una \nconfluencia del 80%. Todos los experimentos s e realizaron usando EnSC con un bajo número de \npases (P2-P6) para asegurar la conservación de su fenotipo original. \nPara confirmar la pureza de cada línea obtenida, se realizaron estudios, mediante citometría de \nflujo, de la coexpresión de los marcadores CD10/CD29, CD44/CD29 y CD73/CD29 (90 -100% de \ncélulas positivas) y la ausencia de los marcadores CD45 (identifica leucocitos) , CD31 (identifica \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n55 \n \ncélulas endoteliales) y citoqueratina (identifica cél ulas epiteliales). El cultivo en un medio con un \nbajo contenido en suero (3% de FBS) permite que las células presenten un fenotipo antigénico \nestable y actividades funcionales durante 8-12 semanas (hasta 5-6 pases)99. \n1.2. Células deciduales estromales \n1.2.1. Obtención y cultivo de DSC \nDurante toda la investigación se trabajó con DSC que habían sido previamente congeladas. \nEstas células fueron obtenidas anteriormente por otros miembros del grupo de investigación, a \npartir de muestras de decidua, procedentes de interrupciones voluntarias de embarazos del primer \ntrimestre (6 -11 semanas de gestación) de mujeres sanas , con un rango de edad comprendido \nentre 20 y 30 años. Fueron excluidas las mujeres que estuvieran recibiendo tratamiento \nfarmacológico o que presentaran alguna infección o enfermedad autoinmune. Las muestras fueron \nobtenidas vía vaginal, por legrado, en la Clínica El Sur (Málaga, España) y en la Clínica \nGinegranada (Granada, España). Se obtuvo el consentimiento informado de cada donante y el \nestudio fue autorizado por el comité ético del Hospital Universitario San Cecilio en Granada. \nCon anterioridad a la presente investigación, l os tejidos deciduales fueron examinados y \nprocesados según el protocolo descrito por Kimatrai et al ., 2003 102. La pureza de las células \ndeciduales había sido confirmada, mediante citometría de flujo, por la detección de la coexpresión \nde los marcadores CD10/CD29, CD44/CD29 y CD73/CD29 (90 -100% de células positivas) y la \nausencia de CD45 , CD31 y citoqueratina. Posteriormente, las diferentes líneas de DSC fueron \ncongeladas y mantenidas a -196 °C en nitrógeno líquido, hasta su uso. \nPara nuestra investigación se descongelaron 10 líneas de DSC. Tras una centrifugación a 1500 \nrpm (5 min a 20 °C), el pellet de células se resuspendió en medio de cultivo Opti -MEM (Thermo \nFisher Scientific ) completo, con un 3% de FBS ( Thermo Fisher Scientific ), y las células se \nsembraron en frascos de cultivo de 25 cm 2 de superficie . Se mantuvieron durante 24 horas a \n37 °C, permitiendo su adherencia al plástico. A continuación, se realizó un lavado con PBS \n(Thermo Fisher Scientific) para retirar las células que no se habían adherido. El medio Opti -MEM \n(Thermo Fisher Scientific ) se cambió cada 2 días hasta llegar a una confluencia del 80% , \naproximadamente. Posteriormente, se real izó un pase o sub cultivo mediante tripsinización y las \nDSC se transfirieron a un frasco de cultivo de 75 cm 2 de superficie, donde se mantuvieron de \nforma rutinaria. Las DSC en cultivo permanecieron a 37 °C en una atmósfera humidifica da al 5% \nde CO2, con cambios de medio cada 2 días y tripsinizaciones al alcanzar una confluencia del 80%. \nTodos los experimentos se realizaron usando DSC con pocos pases (P2-P6). \nLos clonos de preDSC se obtuvieron por el método de dilución limitante en placas de 96 \npocillos, empleando medio Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo suplementado con un \n10% de FBS (Thermo Fisher Scientific). Tres días después de la siembra, se revisaron las placas \nmediante observación por microscopía óptica y se seleccionaron los pocill os que contenían una \núnica célula. Después de dos semanas, estas células formaron colonias que fueron tripsinizadas y \nsembradas en placas de cultivo de 24 pocillos con medio Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) \ncompleto suplementado con un 3% de FBS (Thermo Fisher Scientific). Los clonos se expandieron \ny se realizaron los correspondientes estudios morfológicos, fenotípicos y funcionales. \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n56 \n \n1.2.1.1. Eficiencia clonogénica \nPara estudiar la eficiencia en la formación de colonias de las líneas de preDSC, se sembraron \n100 preDSC/cm2 en placas de 6 pocillos con 2 mL de medio de cultivo Opti -MEM (Thermo Fisher \nScientific) completo, con un 3% de FBS ( Thermo Fisher Scientific ). Las placas permanecieron a \n37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO 2 durante 15 días. Las col onias fueron \nobservadas diariamente mediante microscopía óptica. Posteriormente, las colonias fueron teñidas \ncon cristal violeta (Merck KGaA) al 0,1% durante 5 min a temperatura ambiente. Transcurrido este \ntiempo, se realizaron 2-3 lavados con agua destilada. Finalmente, se llevó a cabo un recuento de \ncolonias, contando únicamente aquellas con más de 50 células, y se calculó la eficiencia \nclonogénica con la siguiente fórmula: \nEficiencia clonogénica (%) = \n𝐍ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐚𝐬 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐚𝐝𝐚𝐬\n𝐍ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐬𝐞𝐦𝐛𝐫𝐚𝐝𝐚𝐬 \n1.2.1.2. Diferenciación mesenquimal \nEn primer lugar, para la diferenciación osteogénica, se sembró un número de preDSC \nsuficiente para llegar a una confluencia del 80 -90% en 24 horas. El medio empleado en el cu ltivo \nfue Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) completo, con un 3% de FBS ( Thermo Fisher Scientific). \nLas células se mantuvieron durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de \nCO2, permitiendo así su adherencia, y después se lavaron con PBS (Thermo Fisher Scientific ). \nSeguidamente, se añadió el medio de cultivo necesario para la diferenciación a osteoblastos. Para \nello, el medio Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo se suple mentó con ácido ascórbico \n10 nM, β-glicerolfosfato 10 nM y dexametasona 100 nM (todo de Merck KGaA). Las células fueron \nincubadas con este medio a 37 °C y un 5% de CO 2. El medio consumido se cambió cada 3 días \npor medio fresco , necesario para la diferencia ción. El proceso de diferenciación osteogénica se \ncompletó en 21-28 días y fue verificado por la formación de osteoblastos con morfología alargada \ny con una disposición muy compacta. Además, la matriz mineralizada se detectó mediante tinción \ncon alizarina (Merck KGaA). \nEn segundo lugar, para la diferenciación adipogénica, las preDSC se sembraron en placas de \ncultivo con medio Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo, suplementado con un 5% de \nFBS (Thermo Fisher Scientific ), y se incubaron a 37 °C y un 5% de CO 2. Tras llegar a una \nconfluencia del 80 -90%, se indujo la diferenciación cultivando las células en medio Opti -MEM \n(Thermo Fisher Scientific ) completo al que se añadió 3 -isobutil-1-metilxantina 100 μM, \ndexametasona 1 μM, indometacina 100 μM (todo de Merck KGaA) y 10 μg/mL de insulina ( Novo \nNordisk, Bagsvaerd, Dinamarca). La diferenciación se completó en 15 días y se verificó por la \nvisualización de gotas lipídicas teñidas con solución Oil Red O (Merck KGaA). \nEn tercer lugar, para la diferenciación condrogénica, las células deben ser cultivadas en tubos \nEppendorf de polipropileno, ya que se diferencian produciendo agregados. El medio empleado en \neste caso fue Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) sin FBS y suplem entado con 10 ng/mL de \nTGF-β1 (Merck KGaA). En primer lugar, colonias de preDSC fueron tripsinizadas y se realizó un \nrecuento. Se centrifugaron alícuotas de 2 x 10 5 células en 1 mL de medio en tubos de \npolipropileno cónicos. El pellet de células se incubó a 37 °C y un 5% de CO 2 durante 24 horas. \nUna vez transcurrido este tiempo, se observó que las células formaron un agregado que no se \nadhirió a las paredes del tubo de polipropileno. El medio de cultivo se cambió cada 2 -3 días y los \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n57 \n \nagregados se obtuvieron durante intervalos de tiempo de hasta 21 días. Para poder detectar \nproteoglicanos, se tiñeron, con una solución de safranina O (Merck KGaA), secciones congeladas \nde 4 μm de grosor de los agregados obtenidos. \n1.2.1.3. Ensayo de contracción del gel de colágeno \nEstos ensayos se llevaron a cabo tal y como se ha descrito en investigaciones previas102,205. En \nprimer lugar, se preparó una solución estéril de colágeno dérmico bovino purificado y solubilizado \ncon pepsina , siguiendo las instrucciones del fabricante ( Vitrogen, Cohesion Tech nologies Inc. , \nPalo Alto, California, EEUU). A la solución de colágeno se añadieron 25 x 10 4 preDSC. A \ncontinuación, la mezcla de colágeno y células se colocó en placas de cultivo (100 μL/pocillo) para \nla polimerización durante 30 min a 37 °C. Seguidamente, a cada pocillo se añadieron 2 mL de \nmedio Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo, con un 3% de FBS (Thermo Fisher \nScientific). Al medio se añadieron diferentes concentraciones de la citoquina TNF (10, 25 y 50 \nng/mL), de la citoquina IL -10 (0,1, 1, 10 y 50 ng/mL) o de P4 (30, 75, 150 y 300 ng/mL) (todo de \nMerck KGaA). Se reservaron otros pocillos como control (sin tratamiento). T ras una incubación de \n24 horas, se midió la altura (h) y el diámetro (d) de cada gel con el micrómetro de un microscopio \ny se calculó el volumen del gel con la siguiente fórmula: V = 𝟏 𝟔⁄ x π x h x (3d 2 + h 2). Se \nrealizaron 3 medidas por muestra para calcu lar una media que permitiera estimar el volumen del \ngel. Los datos se representan como una variación porcentual en volumen del gel de colágeno en \nlas preDSC cultivadas con citoquinas o con P4 , en comparación con las preDSC cultivadas en \nausencia de estas, empleando para el cálculo la siguiente fórmula: \nVariación del volumen del gel = \n(𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞𝐧 𝐜𝐨𝐧 𝐩𝐫𝐞𝐃𝐒𝐂 𝐭𝐫𝐚𝐭𝐚𝐝𝐚𝐬 − 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞𝐧 𝐜𝐨𝐧 𝐩𝐫𝐞𝐃𝐒𝐂 𝐧𝐨 𝐭𝐫𝐚𝐭𝐚𝐝𝐚𝐬)\n𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞𝐧 𝐜𝐨𝐧 𝐩𝐫𝐞𝐃𝐒𝐂 𝐧𝐨 𝐭𝐫𝐚𝐭𝐚𝐝𝐚𝐬 x100 \n \n1.3. Células procedentes de quiste de endometriosis \n1.3.1. Obtención y cultivo de eEnSC \nLas muestras de endometriosis proceden de endometriomas ováricos (“quiste de chocolate”) y \nfueron obtenidas mediante laparoscopia realizada en el Servicio de Ginecología y Obstetricia del \nHospital Materno Infantil Virgen de las Nieves (Granada, España) y en el Hospital Universitario \nRuber Juan Bravo (Madrid, España) . Durante este estudio se recibieron 10 muestras que \nprocedían de mujeres en edad reproductiva que no habían recibido terapia hormonal en los tres \nmeses anteriores . Además, no se incluyeron en el estudio mujeres que presentaran otras \npatologías endometriales u hormonales. Las muestras se obtuvieron pr evio consentimiento \ninformado de todas las donantes. \nEn todos los casos, el diagnóstico de endometriosis fue intraoperatorio y se confirmó, \nposteriormente, mediante el estudio histológico de la muestra. Según la clasificación establecida \npor la Sociedad A mericana de Medicina Reproductiva , todas las donantes presentaban \nendometriosis de moderada a grave (estadíos III-IV de la enfermedad). \nSe ha escogido el quiste de chocolate como fuente de células endometriósicas porque es la \nforma más frecuente de presen tación de la enfermedad y supone una forma de menstruación \nintraquística. \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n58 \n \nPara el procesamiento de cada muestra, se trabajó con el contenido interno del endometrioma \novárico o “chocolate” que se diluyó en PBS ( Thermo Fisher Scientific ). A continuación, l a \npreparación se centrifugó a 2200 rpm (20 min a 20 °C) sobre Ficoll-Paque (Merck KGaA ). \nTranscurrido este tiempo, se recogió la interfase, donde se encuentran las eEnSC, y se centrifugó \nen PBS ( Thermo Fisher Scientific ) a 1500 rpm (5 min a 20 °C). El pellet de células obtenido se \nresuspendió en medio de cultivo Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo, con un 3% de \nFBS (Thermo Fisher Scientific), y las células se sembraron en un frasco de cultivo de 25 cm 2 de \nsuperficie. A continuación, se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada \nal 5% de CO 2. Tras el p eriodo de incubación, se realizó un lavado con PBS ( Thermo Fisher \nScientific) para eliminar las células en suspensión y las eEnSC quedaron adheridas al frasco de \ncultivo. \nDebido al crecimiento más lento de estas células, al principio el cultivo se mantuvo realizando \ncambios de medio cada 4 días . Posteriormente, se realizaron cambios de cultivo cada 2 -3 días \nhasta llegar a una confluencia del 80%, aproximadamente. En ese momento, se realizó un pase o \nsubcultivo, las eEnSC se tripsinizaron y transfirieron a un frasco de cultivo de 75 cm2 de superficie, \ndonde se mantuvieron de forma rutinaria. Todas las eEnSC empleadas en los experimentos tenían \nun bajo número de pases (P2-P6). \nLa pureza de los cultivos de eEnSC se evaluó, por citometría de flujo, estudiando la doble \nexpresión de los marcadores CD10/CD29, CD44/CD29 y CD73/CD29 (90 -100% de células \npositivas) y la ausencia de CD45, CD31 y citoqueratina. \n1.4. Células madre mesenquimales de médula ósea \n1.4.1. Obtención y cultivo de MSC \nPara establecer líneas de MSC, se partió de aspirados de médula ósea de 7 donantes sin \npatologías hematológicas, que se obtuvieron en el Hospital de Baza (Baza, Granada, España). \nTodos los participant es en el estudio dieron su consentimiento informado y el Comité de \nInvestigación y Ética de la Universidad de Granada aprobó esta investigación. \nEl procesamiento de las muestras empezó con la dilución en PBS (Thermo Fisher Scientific) del \naspirado de médul a ósea y la posterior centrifugación en un gradiente de densidad con Ficoll -\nPaque ( Merck KGaA). Las células obtenidas fueron mantenidas en medio de c ultivo Opti -MEM \n(Thermo Fisher Scientific) completo, con un 3% de FBS (Thermo Fisher Scientific), y cambios de \nmedio cada 2-3 días. Las MSC en cultivo fueron expandidas al llegar a una confluencia del 80%, \naproximadamente. Todos los experimentos se realizaron usando MSC con un bajo número de \npases (P2-P6). \nLa pureza del cultivo se confirmó mediante el estudio, por citometría de flujo, de la doble \nexpresión de CD10/CD29, CD44/CD29 y CD73/CD29 (90-100% de células positivas) y la ausencia \nde CD45, CD31 y citoqueratina. \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n59 \n \n1.5. Decidualización \nPara reproducir in vitro el proceso de decidualización que tiene lugar durante la fase secretora \ndel ciclo endometrial y continúa si se p roduce embarazo, se decidualizaron 10 líneas de EnSC, \nDSC y eEnSC, y 7 líneas de MSC . Dicha decidualización se indujo añadiendo al medio de cultivo \nOpti-MEM (Thermo Fisher Scientific) completo, con un 3% de FBS (Thermo Fisher Scientific), los \nsiguientes factores: P4 a una concentración de 300 nM y AMPc a una concentración de 500 μM \n(ambos de Merck KGaA). \nPara cada línea celular, se mantuvo un frasco de cultivo de 75 cm 2 con células que sirven de \ncontrol (sin tratamiento ) y un frasco de cultivo de 75 cm 2 con células decidualizad as. La \ndecidualización se inició cuando el cultivo alcanzó , aproximadamente, el 70% de confluencia y se \nmantuvo durante 20 días, realizando cambios de medio c ada 4 días. Los días 4, 8, 12, 16 y 20 se \nrecogió el sobrenadante del cultivo de las células no tratadas y tratadas, y se reemplazó por medio \nfresco con P4 y AMPc. Los medios condicionados (MC) recogidos se almacenaron a -20 °C hasta \nsu uso. \nLa decidualización se confirmó por la observación del cambio de morfología fibroblástica a \npoligonal (redondeada) y la toma de imágenes que verifican dicho cambio. A par tir de estas \nimágenes, se realizó un recuento y comparación del número de células redondeadas en cada uno \nde los medios (sin tratamiento y con tratamiento). El software empleado para la toma de imágenes \nes AnalySIS getIT. Por otra parte, la presencia de PRL e IL -15 se detectó en el MC mediante \ninmunoensayo de electroquimioluminiscencia ( Roche, Indianapolis, EEUU y R&D Systems , \nMinneapolis, Minnesota, EEUU). Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del \nfabricante y todas las muestras se analizaron por duplicado. \n1.6. Células mononucleares de sangre periférica \nLas muestras de sangre periférica se obtuvieron de 10 donantes voluntarias sanas, con un \nrango de edad entre 20 y 45 años. Se tuvo en cuenta que en el momento de la extracción y en las \nsemanas previas las donantes no hubiesen presentado síntomas de infección, ni hubiesen \nrecibido tratamiento inmunosupresor. Las muestras se obtuvieron previo consentimiento informado \nde todas las donantes. \nLas células mononucleares de sangre periférica ( PBMC) se aislaron mediante una \ncentrifugación de gradiente de densidad utilizando Ficoll -Paque (Merck KGaA). En la interfase se \nencuentran dichas células , que fueron recogidas y centrifugadas en PBS ( Thermo Fisher \nScientific) a 1500 rpm (5 min a 20 °C). Seguidamente, se procedió a realizar la separación de \nlinfocitos y monocitos. \n1.6.1. Aislamiento de monocitos \nLos monocitos se obtuvieron mediante separación inmunomagnética, por selección negativa, \ncon el kit Dynabeads Untouched Human Monocytes ( Thermo Fisher Scientific ) siguiendo el \nprotocolo descrito por el fabricante. Se describe brevemente a continuación. \nEn primer lugar, p artiendo de un pellet de PBMC, se añadió el reactivo de bloqueo de \nreceptores Fc de monocitos y una mezcla de anticuerpos (IgG biotinilados) que reconocen los \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n60 \n \nsiguientes antígenos: CD3, CD7, CD16 (específico para CD16a y CD16b), CD19, CD56, CDw123 \ny CD235a. Se realizó una incubación de 20 minutos a 4 °C. A continuación, se llevó a cabo una \ncentrifugación con PBS ( Thermo Fisher Scientific) a 1500 rpm (5 min a 4 °C). Seguidamente, las \nbolas magnéticas (de poliestireno y revestidas co n estreptavidina) se incubaron con las células \ndurante 15 minutos a 4 °C y en agitación, permitiendo así su unión a los anticuerpos \nanteriormente indicados. Tras la incubación, se aplicó un imán magnético a la preparación y se \nmantuvo durante 2 minutos (este paso se realizó dos veces) . Como resultado , se obtuvo una \nfracción con los monocitos de interés no seleccionados por los anticuerpos y una fracción de \ncélulas no monocíticas pegada a la columna magnética. \nLa pureza de la prepa ración se confirmó midiendo, por citometría de flujo, el porcentaje de \ncélulas CD14 positivas, que siempre fue superior a un 95%. \nLos monocitos de sangre periférica purificados fueron incubados durante 48 horas con 600 μL \nde los medios de cultivo correspondientes: Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo \n(Control), con un 3% de FBS (Thermo Fisher Scientific); medios condicionados de EnSC, DSC y \neEnSC no decidualizadas (MC de preEnSC, MC de preDSC y MC de preeEnSC); y medio s \ncondicionados de EnSC, DSC y eEnSC decidualizadas (MC de dEnSC, MC de dDSC y MC de \ndeEnSC). Este cultivo se realizó en placas de 24 pocillos a razón de 2,5x105 células/pocillo, con el \nobjetivo de estudiar por citometría de flujo el fenotipo antigénico de los monocitos tras la \nincubación con los MC. \n1.6.2. Aislamiento y activación de linfocitos \nLos linfocitos de sangre periférica (PBL) se obtuvieron a partir de las PBMC que se aislaron \npreviamente. A continuación, se dejó que los monocitos se adhirieran al plástico del frasc o de \ncultivo de 75 cm 2 durante 2 horas a 37 °C, en medio de cultivo RPMI 1640 (Thermo Fisher \nScientific). Dicho medio se suplementa con un 10% de FBS descomplementado, 100 U/mL de \npenicilina/estreptomicina y L-glutamina 2 mM (todo de Thermo Fisher Scientific). Tras el tiempo de \nincubación, se recogió el sobrenadante con los PBL y se realizó una centrifugación a 1500 rpm (5 \nmin a 20 °C). Así se obtuvo un pellet con los linfocitos de interés para los estudios fenotípicos y \nfuncionales. \nLa activación d e los PBL se realizó mediante cultivo en medio RPMI 1640 (Thermo Fisher \nScientific) completo a una concentración de 2x10 6 células/mL en presencia de 5 μg/mL PHA \n(fitohemaglutinina-M) (Merck KGaA) y 1 μg/mL del anticuerpo monoclonal anti-CD28 (BioLegend, \nSan Diego, California , EEUU) durante 20 horas, aproximadamente. Tras este periodo de \nincubación, se realizó una centrifugación a 1500 rpm (5 min a 20 °C) y, después, los linfocitos se \ncultivaron durante 6 días en medio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific ) completo a una \nconcentración de 1x10 6 células/mL con 25 U/mL de IL-2 (National Institutes of Health AIDS \nReagent Program , Rockville, Maryland, EEUU ). Cada 2 días se realizó una centrifugación y \nposterior recuento celular. Después las células se incubaron en medio fresco con IL -2. \nTranscurrido los 6 días de tratamiento , se determinó la pureza del cultivo de PBL activados por \ncitometría de flujo (>95% CD45+, >90% CD3+). \nLos PBL purificados fueron incubados durante 48 horas con 600 μL de los medios de cultivo \ncorrespondientes: Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo (Control), con un 3% de FBS \n(Thermo Fisher Scientific); medios condicionados de EnSC, DSC y eEnSC no decidualizadas (MC \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n61 \n \nde preEnSC, MC de preDSC y MC de preeEnSC); y medios condicionados de EnSC, DSC y \neEnSC decidualizadas (MC de dEnSC, MC de dDSC y MC de deEnSC). Este cultivo se realizó en \nplacas de 24 pocillos a razón de 2,5x10 5 células/pocillo, con el objetivo de estudiar por citometría \nde flujo el fenotipo antigénico de los PBL tras la incubación con los MC. \n1.6.2.1. Bloqueo del receptor CXCR3 en linfocitos \nCon la intención de bloquear el receptor de quimioquinas CXCR3 en los PBL activados, \nobtenidos de 3 donantes diferentes, se incubaron 2,5x10 5 células con dosis crecientes del \nanticuerpo monoclonal anti-CXCR3 (Ultra-LEAF Purified anti-human CD183) (BioLegend) durante \n45 min a temperatura ambiente . Las dosis empleadas fueron las siguientes: 1,25 μg/mL, 5 μg/mL \ny 10 μg/mL. Como control negativo se usó el anticuerpo monoclonal que sirve de isotipo (Mouse \nIgG1, κ Isotype Control) ( BioLegend). Una vez bloqueado el receptor CXCR3, los PBL activados \nse emplearon para llevar a cabo los ensayos de migración celular. \n1.7. Líneas celulares tumorales \nLas líneas celulares tumorales humanas utilizadas en este estudio se cultivaron tal y como \nrecomienda la American Type Culture Collection (ATCC) y fueron las siguientes: Jurkat (leucemia \nlinfoblástica; ATCC), Raji (linfoma de Burkitt; ATCC), THP-1 (leucemia monocítica; ATCC), A375 \n(melanoma; ATCC), Cal33 (carcinoma de células escamosas de la lengua; Instituto Leibniz, \nBraunschweig, Alemania) , HeLa (adenocarcinoma cervical; ATCC) y SKBR3 (cáncer de mama; \nATCC). \nLas células Jurkat, A375, HeLa y SKBR3 fueron cultivadas en medio RPMI 1640 ( Thermo \nFisher Scientific) completo, mientras que las células Raji y Cal33 se cultivaron en medio DMEM \n(Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 10% de FBS descomplementado y 100 U/mL de \npenicilina/estreptomicina (todo de Thermo Fisher Scientific). Las células THP -1 fueron cultivadas \nen medio RPMI 1640 ( Thermo Fisher Scientific ) al que se añadió piruvato sódico 1 mM, tampón \nHEPES 25 mM , 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, L -glutamina 2 mM y un 10% de FBS \ndescomplementado (todo de Thermo Fisher Scientific). Todas las líneas celulares se mantuvieron \na 37 ºC en una atmósfera humidificada al 5% de CO2, con cambios de medio cada 2-3 días. \nEn el caso de las células en suspensión ( líneas Jurkat, Raji y THP-1), la confluencia del cultivo \nnunca excedió 1x106 células/mL, tal y como recomienda la ATCC. Todos los experimentos fueron \nrealizados usando células con un máximo de 12 -14 pases, ya que en ese momento empiezan a \nperder su turgencia y forma redondeada. \nLas células THP -1 fu eron incubadas durante 48 horas con 600 μL de los medios de cultivo \ncorrespondientes: Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo (Control), con un 3% de FBS \n(Thermo Fisher Scientific); medios condicionados de EnSC, DSC y eEnSC no decidualizadas (MC \nde pr eEnSC, MC de preDSC y MC de preeEnSC); y medio s condicionados de EnSC, DSC y \neEnSC decidualizadas (MC de dEnSC, MC de dDSC y MC de deEnSC). Este cultivo se realizó en \nplacas de 24 pocillos a razón de 2,5x10 5 células/pocillo, con el objetivo de estudiar por citometría \nde flujo el fenotipo antigénico de las THP-1 tras la incubación con los MC. \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n62 \n \n2. Obtención y tratamientos de los medios condicionados \nLos MC necesarios para los estudios funcionales se obtuvieron a partir del sobrenadante del \ncultivo de EnSC, DSC, eEnSC y MSC no decidualizadas y decidualizadas en frascos de cultivo de \n75 cm 2, tal como se explicó anteriormente. El volumen recolectado por cada una de las líneas \nestudiadas fue aproximadamente de 10 mL . Para eliminar restos celulares, dicho volumen se \ncentrifugó a 1500 rpm (5 min a 20 °C), se filtró por un diámetro de poro de 0,2 μm y se almacenó \na -20 ºC en tubos de polipropileno cónicos y estériles de 15 mL, hasta su uso. \n2.1. Diálisis \nLos MC de preDSC y dDSC , obtenidos a partir del cultivo de 3 líneas diferentes , fueron \ndializados empleando una membrana de diál isis Spectra/Por 1 (Repligen, Waltham, \nMassachusetts, EEUU) que permite el paso de moléculas con un peso molecular inferior a 6000 -\n8000 Da (“Molecular Weight Cut Off” MWCO 6000-8000 Da). \nEn primer lugar, se hidrató la membrana de diálisis con medio de cultivo Opti -MEM (Thermo \nFisher Scientific). A continuación, se añadieron 5 mL de medio Control (Opti -MEM completo, con \nun 3% de FBS) y del MC correspondiente en el interior de diferentes fragmentos de membrana, \nlos cuales se introdujeron en 500 mL de medio de cultivo Opti -MEM (Thermo Fisher Scient ific) \ncompleto, con un 3% de FBS (Thermo Fisher Scientific ). Para permitir el intercambio de \nmoléculas, se llevó a cabo una incubación durante 24 horas a 4 °C y en agitación. Una vez \ntranscurrido este tiempo, se recogieron los medios del interior de la membrana y se filtraron por un \ndiámetro de poro de 0,2 μm, antes de usarse en los ensayos de migración celular. \n2.2. Tratamiento térmico \nLos MC de preDSC y dDSC, así como el medio Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) completo, \ncon un 3% de FBS (Thermo Fisher Scientific), se sometieron a un tratamiento térmico a 60 °C \ndurante 45 min. Posteriormente, dichos medios se emplearon en los estudios de migración celular. \n \n3. Ensayo de migración celular en cámara Transwell \nLos ensayos de migración celular se llevaron a cabo empleando cámaras Transwell de 24 \npocillos (Corning Incorporated, Nueva York, EEUU ) (Ilustración 12). El diámetro de poro de los \ninsertos dependió del tamaño de las células e studiadas en cada experimento. Se emplearon \ninsertos con un diámetro de poro de 3 μm para PBL y monocitos de sangre periférica, y para las \ncélulas tumorales se usaron insertos con un diámetro de poro de 5 μm. El fondo de los pocillos de \nla cámara Transwell se cubrió con 600 μL del medio correspondiente: Opti -MEM (Thermo Fisher \nScientific) completo (Control) con un 3% de FBS (Thermo Fisher Scientific); medios condicionados \nde EnSC, DSC y eEnSC no decidualizadas (MC de preEnSC, MC de preDSC y MC de \npreeEnSC); y medios condicionados de EnSC, DSC y eEnSC decidualizadas (MC de dEnSC, MC \nde dDSC y MC de deEnSC). En la parte superior del inserto se añadieron 2,5x10 5 células en 100 \nμL de medio Opti -MEM (Thermo Fisher Scientific ) completo, con un 3% de FBS (Thermo Fisher \nScientific). Las células sembradas en los ensayos de migración fueron PBL no activados y \nactivados, monocitos de sangre periférica, células Jurkat y THP -1. Después de periodos de \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n63 \n \nincubación de 24 y 48 horas (en función del experimento) a 37 ºC, se retiraron los inser tos y se \nrecogieron y contaron las células que habían experimentado quimiotaxis y que, por lo tanto, se \nencontraban en el fondo de los pocillos. El número total de células migradas se determinó con un \nhemocitómetro ( Zuzi, Auxilab, España ) y los resultados se expresaron como porcentaje de \nmigración celular calculado con la siguiente fórmula: \nMigración celular (%) = \n𝐍ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐦𝐢𝐠𝐫𝐚𝐝𝐚𝐬\n𝐍ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥 𝐝𝐞 𝐜é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐬𝐞𝐦𝐛𝐫𝐚𝐝𝐚𝐬 x 100 \n \nIlustración 12. Esquema resumen de los ensayos de migración en cámara Transwell. Imagen creada \ncon el software BioRender. \n \n4. Citometría de flujo \n4.1. Análisis fenotípico de EnSC, DSC, eEnSC y MSC \nLas líneas de EnSC, DSC, eEnSC y MSC fueron analizadas para confirmar su fenotipo y \npureza. Para ello, se tripsinizaro n las células (Tripsina -EDTA 1x; Merck KGaA ) del frasco de \ncultivo de 75 cm 2 y después fueron centrifugadas a 1500 rpm (5 min a 20 ºC). A continuación, el \npellet de células fue resuspendido en PBS (Thermo Fisher Scientific) suplementado con 0,5 % de \nalbúmina sérica bovina (BSA) y EDTA 2 Mm (Merck KGaA) y se añadieron 5x10 4 de células/tubo \nen 100 μL. Seguidamente, se añadió el anticuerpo correspondiente (dilución 1/50) (anticuerpos \ndirectos y controles de isotipo) (Tabla 1) por tubo y se incubaron las muestras durante 30 min a 4 \nºC, en oscuridad. Tras la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 1500 rpm (5 min a 4 ºC). \nFinalmente, el pellet obtenido se resuspendió en 200 μL de PBS/tubo y las muestras fueron \nanalizadas en el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, \nEEUU). En el caso del marcaje indirecto, se realizó una segunda incubación durante 30 min a 4 ºC \ny en oscuridad con el anticuerpo secundario ( Tabla 1), conjugado con ot ro fluorocromo (dilución \n1/500). \nPara el marcaje de antígenos intracitoplásmaticos, se requirió un paso previo de fijación de las \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n64 \n \ncélulas con paraformaldehido al 4% (PFA) ( Merck KGaA) durante 20 min a 4 ºC, y un posterior \nlavado y permeabilización con PBS saponina al 0,05% ( Merck KGaA ). Después se realizó el \nmarcaje descrito anteriormente. \nDurante la adquisición de las muestras, los parámetros forward scatter y side scatter fueron \nempleados para exclu ir regiones de restos celulares. Se midió la fluorescencia emitida por las \ncélulas con los detectores FL1, FL2 y FL4, y el porcentaje de células positivas para cada marcaje \nfue calculado comparando con el correspondiente isotipo. El análisis de los resulta dos obtenidos \nse llevó a cabo usando el software FlowJo (v.10, FlowJo LLC, BD Biosciences). \nTabla 1. Listado de anticuerpos empleados en la caracterización fenotípica de las EnSC, DSC, eEnSC \ny MSC. Se muestra el fluorocromo conjugado al anticuerpo, el clon y la casa comercial. \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n65 \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n66 \n \nFITC: isotiocianato de fluoresceína; APC: aloficocianina; PE: ficoeritrina. Casa comercial: BioLegend (San \nDiego, California, EEUU); Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EEUU); DHSB \n(Developmental Studies Hybrid oma Bank, University of Iowa, Iowa City, EEUU); Merck KGaA (Darmstadt, \nAlemania); R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, EEUU); Abcam (Cambridge, UK). \n \n4.2. Análisis fenotípico de monocitos de sangre periférica y células \nTHP-1 \nEl fenotipo antigénico de los monocitos purificados y de las células THP -1 se determinó por \ncitometría de flujo. Este estudio se realizó tanto en las células antes de ser sembradas en placa , \ncomo después de haber estado en conta cto con los MC; por un lado , en placa de 24 pocillos \ndurante 48 horas y, por otro lado, tras haber experimentado quimiotaxis en cámara Transwell \ndurante 48 horas. \nPartimos de, aproximadamente, 1x10 5 de células/tubo resuspendidas en 100 μL de PBS \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n67 \n \n(Thermo Fisher Scientific ) suplementa do con 0,5 % de BSA y EDTA 2mM (Merck KGaA ) que \nincubamos con el anticuerpo bloqueante Fc -block (anti-CD16/CD32) (Thermo Fisher Scientific), a \nuna dilución 1/100 durante 15 min a 4 ºC , para evitar uniones inespecíficas. Posteriormente , las \ncélulas se centrifugaron a 1500 rpm (5 min a 4 ºC) y el pellet resultante se resuspendió en 100 μL \nde PBS (Thermo Fisher Scientific) (+BSA+EDTA) y se añadieron los anticuerpos directos (dilución \n1/50) y los respectivos isotipos (dilución 1/50) (Tabla 2). Las muestras fueron incubadas durante \n30 min a 4 ºC, en oscuridad. Tras la incubación, las células se centrifugaron a 1500 rpm (5 min a 4 \nºC) y después se resuspendieron en 200 μL de PBS/tubo para ser analizadas en el citómetro de \nflujo FACSCalibur ( Becton Dickinson ). El análisis de los resultados obtenidos se llevó a cabo \nusando el software FlowJo (v.10, FlowJo LLC, BD Biosciences). \n4.3. Análisis fenotípico de PBL activados y células Jurkat \nEl estudio del fenotipo antigénico de los PBL activados se realizó antes de la siembra en placa \ny tras haber estado en contacto con los MC, tanto en placa de 24 pocillos durante 48 horas, como \ndespués de experimentar quimiotaxis en cámara Transwell durante 24 y 48 horas . También se \nanalizó el fenotipo basal de las células Jurkat. \n Como en el caso de los monocitos, partimos de, aproximadamente, 1x10 5 de células/tubo \nresuspendidas en 100 μL de PBS ( Thermo Fisher Scientific), suplementado con 0,5 % de BSA y \nEDTA 2mM (Merck KGaA ), que incubamos con el anticuerpo directo no conjugado con ningún \nfluorocromo (anti-CXCR3) (dilución 1/50) ( Tabla 2), durante 30 min a 4 ºC, en oscuridad. Tras la \nincubación, las células se centrifugaron a 1500 rpm (5 min a 4 ºC) . Después se realizó el marcaje \nindirecto, con una segunda incubación, durante 30 min a 4 ºC y en oscuridad, con el anticuerpo \nsecundario conjugado con un fluorocromo (dilución 1/500) y su respectivo isotipo (dilución 1/500) \n(Tabla 2). Tras un lavado y centrifugación a 1500 rpm (5 min a 4 ºC), se realizó un último marcaje, \ndurante 30 min a 4 ºC y en oscuridad, con los anticuerpos directos conjugados con otro \nfluorocromo (dilución 1/50) y sus respectivos isotipos (dilución 1/50) ( Tabla 2). Tras la incubación, \nlas células se centrifugaron a 1500 rpm (5 min a 4 ºC) y se resuspendieron en 200 μL de PBS/tubo \npara ser analizadas en el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson ). Se empleó el \nsoftware FlowJo (v.10, FlowJo LLC, BD Biosciences) para el análisis de los datos. \nEl número de células positivas de cada población celular se calculó empleando la siguiente \nfórmula: \nNúmero de células positivas = \n% 𝐝𝐞 𝐜é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐩𝐨𝐬𝐢𝐭𝐢𝐯𝐚𝐬 𝐱 𝐫𝐞𝐜𝐮𝐞𝐧𝐭𝐨 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐫 𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥\n𝟏𝟎𝟎 \n \n \n \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n68 \n \nTabla 2. Listado de anticuerpos empleados en la caracterización fenotípica de monocitos, células \nTHP-1, PBL activados y células Jurkat. Se muestra el fluorocromo conjugado al anticuerpo, el clon y la \ncasa comercial. \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n69 \n \nFITC: isotiocianato de fluoresceína; APC: aloficocianina; PE: ficoeritrina. Casa comercial: BioLegend (San \nDiego, California, EEUU). \n \n4.4. Determinación de células apoptóticas \nLas células apoptóticas hipodiploides fueron detectadas por citometría de flujo, seg ún un \nprotocolo previamente descrito206. Este procedimiento consistió en el lavado de la s células con el \nbuffer salino PBS (Thermo Fisher Scientific) y, tras una centrifugación a 1500 rpm durante 5 min a \n4 ºC, las células se resuspendieron en 100 μL de PBS (Thermo Fisher Scientific). A este volumen \nse añadieron 900 μL de etanol al 70% (mantenido a -20 ºC) para fijar las células y se realizó una \nincubación durante 5 min en frío (4 ºC). Una vez transcurrido este tiempo, se l avó el exceso de \netanol con PBS (Thermo Fisher Scientific ) y se realizó una centrifugación a 3500 rpm durante 2 \nmin a 4 ºC. A continuación, las células se resuspendieron en 250 μL de PBS (Thermo Fisher \nScientific) y se añadieron 250 μL de una solución de e xtracción del DNA (0,2 M NaHPO 4, 0,1 M \nácido cítrico; pH 7,8) ; se incubaron durante 10 min a 37 ºC. Tras esta incubación, las células \nfueron centrifugadas a 3500 rpm durante 2 min a 4 ºC y el pellet fue resuspendido en 200 μL de \nuna solución preparada con PBS (Thermo Fisher Scientific ) al que se añadió ioduro de propidio \n(IP) (40 μg/mL) y RNAsa (100 μg/mL) (todo de Thermo Fisher Scientific), durante 30 min a 37 ºC y \nen oscuridad, con la finalidad de teñir el ADN. \nA continuación, mediante citometría de flujo se llevó a cabo un análisis cuantitativo de la fase \nsub-G1 del ciclo celular, para detectar células apoptóticas. Se midió la intensidad de fluorescencia \ndel ADN con un detector FL2 del citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). El análisis de \nlos resultados se realizó con el software FlowJo (v.10, FlowJo LLC, BD Biosciences). \n \n5. Inmunocitoquímica y microscopía de fluorescencia \nLa detección de la proteína contráctil α -SMA en preDSC se realizó por inmunocitoquímica y \nmicroscopía de fluorescencia. Las células se sembraron en cámaras con medio de cultivo Opti -\nMEM (Thermo Fisher Scientific) (+/- citoquinas y P4). Tras 48 horas de incubación, las preDSC se \nlavaron con PBS ( Thermo Fisher Scientific ) y se fijaron con PFA al 4% durante 20 min a 4 °C. \nDespués se permeabilizaron con acetona fría durante 10 min. Seguidamente, se realizó el marcaje \nmediante la adición del anticuerpo monoclona l anti-αSMA-Cy3 (Merck KGaA ) y la contratinción \nnuclear con 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) ( BioLegend). Finalmente, las \npreparaciones se examinaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse ( Nikon \nInstruments Europe BV, Ámsterdam, Países Bajos) con ayuda técnica del servicio de microscopía \ndel CIC-CIBM (Centro de Instrumentación Científica, Centro de Investigación Biomédica, Granada, \nEspaña). \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n70 \n \n6. Inmunohistoquímica y microscopía confocal \nPara el análisis histológico de la decidua, partimos de muestras que se habían procesado \nanteriormente en el laboratorio. Dicho procesamiento consistió en el acomodamiento de la \nmuestra en un molde con compuesto O.C.T ( Tissue-Tek O.C.T Compound , Sakura Finetek , \nTorrance, California, EEUU) y congelac ión instantánea tras su inmersión en isopentano (Merck \nKGaA) enfriado con nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su \ncrioseccionamiento. \nPara el análisis de las poblaciones celulares de la decidua mediante microscopía confocal, se \nrealizaron cortes de 10 μm de grosor con un criotomo (Leica CM1510, Leica Microsystems AG , \nWetzlar, Alemania) que se fijaron con PFA al 3,7% durante 7 min a tempe ratura ambiente o en \nacetona fría (Merck KGaA) durante 3 min, en el caso de las muestras en las que se estudiaron \nepítopos sensibles a PFA (CD140b). A continuación, los cortes fueron rehidratados con PBS frío \ndurante 15 min y después se bloquearon con PBS-Tween 20 (0,1%) (Thermo Fisher Scientific ) \nsuplementado con BSA (5%), suero de cabra (5%) y Tritón X -100 (0,2%) (todo de Merck KGaA), \ndurante 45 min a temperatura ambiente. La posterior incubación con los anticuerpos primarios \ncorrespondientes (dilución 1/100) ( Tabla 3) se mantuvo durante toda la noche a 4 °C. Al día \nsiguiente, los cortes se lavaron 3 veces con PBS -Tween 20 (0,1%) ( Thermo Fisher Scientific ) y \ndespués fueron incubados con los anticuerpos secundarios (dilución 1/1000) ( Tabla 3) durante 2 \nhoras a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se realizaron de nuevo 3 lavados con \nPBS-Tween 20 (0,1%) ( Thermo Fisher Scientific ) y los cortes fueron contrateñidos con Hoechst \n33258 ( Merck KGaA ) (dilución 1/200) y sellados con medio de montaje Fl uoroshield ( Merck \nKGaA). Para la adquisición de imágenes se utilizó un microscopio confocal Nikon A1 (Nikon \nInstruments Europe BV ) con ayuda técnica del servicio de microscopía del CIC-CIBM. L as \nimágenes obtenidas fueron procesadas con el software NIS-Elements AR 3.2 ( Nikon Instruments \nEurope BV). \n \n \n \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n71 \n \nTabla 3. Listado de anticuerpos empleados en la caracterización fenotípica de las poblaciones \ncelulares de la decidua por microscopía confocal. Se muestra el fluorocromo conjugado al anticuerpo, el \nclon y la casa comercial. \nFITC: isotiocianato de fluoresceína; Cy3: cianina 3. Casa comercial: BioLegend (San Diego, California, \nEEUU); Merck KGaA (Darmstadt, Alemania); R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, EEUU); Thermo \nFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EEUU). \n \n \n7. Extracción de ácidos nucleicos \n7.1. Extracción de ARN \nPara la extracción de ARN total, las muestras preservadas en TRIzol® (Thermo Fisher \nScientific) a -80 ºC en tubos Eppendorf de polipropileno de 1,5 mL ( sin DNAsas y RNAsas), se \ndescongelaron en frío (4 ºC) y después se mantuvieron durante 5 min a temperatura ambiente. A \ncontinuación, se añadieron sobre las muestras 200 μL de cloroformo ( Scharlab, Barcelona, \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n72 \n \nEspaña) por cada mL de TRIzol® (Thermo Fisher Scientific ), se mezclaron las fases agitando \nsuavemente los tubos y se mantuvieron durante 2 -3 min a temperatura ambiente. Tras una \ncentrifugación a 12500 rpm (15 min a 4 ºC), se obtuvo una fase su perior acuosa donde se \nencuentran los ácidos nucleicos. Dicha fase fue recogida y transferida a un nuevo tubo. \nSeguidamente, se añadieron 500 μL de isopropanol sobre las muestras y se agitaron suavemente \nlos tubos. La solución se mantuvo toda la noche a -20 ºC para favorecer la precipitación de los \nácidos nucleicos. Transcurrido este tiempo, se realizó una centrifugación a 12500 rpm (10 min a 4 \nºC), se descartó el sobrenadante y el pellet obtenido se lavó con 500 μL de etanol al 75% en agua \ntratada con dietilpirocarbonato (DEPC) (Merck KGaA). Las muestras se centrifugaron de nuevo a \n12500 rpm (5 min a 4 ºC). A continuación, se retiró el sobrenadante y se dejó secar el pellet \nmanteniendo los tubos abiertos a temperatura ambiente durante 5 min, para la evaporación de los \nrestos de alcohol. Finalmente, las muestras fueron reconstituidas en 20 μL de agua tratada con \nDEPC (Merck KGaA) y se incubaron durante 10 min a 55-60 ºC. \nLas pureza y conce ntración de las muestras se midió mediante espectrofotometría \n(NanoDrop™ 2000; Thermo Fisher Scientific ). Se mantuvieron a -80 ºC hasta realizar la síntesis \ndel ADN complementario (ADNc). \n7.2. Retrotranscripción \nPara la síntesis de ADNc, las muestras de ARN fueron tratadas previamente con DNAsa I \n(DNAse I RNAse -free; Thermo Fisher Scientific ) para eliminar el ADN genómico. Para ello, se \npartió de diluciones de 1 μg de ARN en 16 μL de agua libre de nucleasas (NFW) ( Promega, \nMadison, Wisconsin, EEUU) y se añadió 1 μL de DNAsa I y 1 μL de tampón de r eacción. Las \nmuestras se incubaron durante 30 min a 37 ºC. A continuación, se añadió 1 μL de EDTA a cada \ntubo y se realizó una nueva incubación a 65 ºC durante 10 min. \nLa retrotranscripción se llevó a cabo empleando el kit Access RT-PCR System (Promega) y se \nusaron los siguientes volúmenes de reacción (Tabla 4): \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n73 \n \nTabla 4. Reactivos empleados en la retrotranscripción. \n \nMezcla de retrotranscripción \nTampón de retrotranscripción 10x 2 μL \nMgCl2 (25 mM) 4 μL \ndNTPs mix (10 mM) 2 μL \nOligo(dT)15 (0,5 μg/μL) 0,5 μL \nRandom Primers (0,5 μg/μL) 0,5 μL \nInhibidor de RNAsas (rRNasin®) 0,5 μL \nRetrotranscriptasa AMV 0,6 μL \nNFW 1,9 μL \nMuestra de ARN (0,5 μg) o NFW 8 μL \nVolumen final de reacción 20 μL \n \nTras preparar la mezcla de la retrotranscripción, la reacción se llevó a cabo en un termociclador \n(2720 Thermal Cycler; Thermo Fisher Scientific ) empleando los parámetros que se muestran a \ncontinuación (Ilustración 13): \n \nIlustración 13. Esquema representativo de los parámetros empleados en la retrotranscripción. \n \nLos tubos que contenían el ADNc se guardaron a -20 ºC hasta realizar la PCR cualitativa o \ncuantitativa. \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n74 \n \n8. PCR \n8.1. PCR cualitativa \n8.1.1. Análisis de ADN complementario \nTras realizar la extracción de ARN y la retrotranscripción, las muestras de ADNc fueron \namplificadas con el kit PCR Master Mix (Promega) . Se usaron los siguientes volúmenes de \nreacción (Tabla 5): \nTabla 5. Reactivos empleados en la PCR cualitativa. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nTras preparar la mezcla d e amplificación, la PCR se llevó a cabo en un termociclador (2720 \nThermal C ycler; Thermo Fisher Scientific ) usando los parámetros detallados en el siguiente \nesquema (Ilustración 14): \n \n \n \n \n \n \n \n \nIlustración 14. Esquema representativo de los parámetros empleados en la PCR cualitativa. \n \nLas secuencias de los oligonucleótidos empleados aparecen detalladas en las siguientes tablas \n(Tablas 6-9): \nMezcla de amplificación del ADNc \nPCR Master Mix 2x 12,5 μL \nOligonucleótido 5’ (10 μM) 0,5 μL \nOligonucleótido 3’ (10 μM) 0,5 μL \nNFW 10,5 μL \nMuestra de ADNc o NFW 1 μL \nVolumen final de reacción 25 μL \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n75 \n \nTabla 6. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar los marcadores de células madre pluripotentes. Se muestra el nombre del \ngen, la secuencia, la Tm (temperatura de “melting” o fusión del ADN ), el número de ciclos empleado, el \nnúmero de pares de bases (pb) del amplicón o producto de PCR y la casa comercial. \nF: oligonucleótido o “primer forward”; R: oligonucleótido o “primer reverse”. Casa comercial: IPBLN: Instituto \nde Parasitología y Biomedicina López-Neyra; IDT: “Integrated DNA Technologies”. \n \n \n \nTabla 7. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análi sis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar los marcadores de diferenciación mesenquimal. Se muestra el nombre del \ngen, la secuencia, la Tm, el número de ciclos empleado, el número de pb del amplicón o producto de PCR y \nla casa comercial. \nAP: fosfatasa alcalina; PPARγ2: “ peroxisome proliferator-activated receptor-gamma 2”. F: oligonucleótido o \n“primer forward”; R: oligonucleótido o “primer reverse”. Casa comercial: IPBLN: Instituto de Parasitología y \nBiomedicina López-Neyra; IDT: “Integrated DNA Technologies”. \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n76 \n \nTabla 8. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar los factores angiogénicos. Se muestra el nombre del gen, la secuencia, la Tm , \nel número de ciclos empleado, el número de pb del amplicón o producto de PCR y la casa comercial. \nANGPT1: angiopoyetina 1; FGF2: factor de crecimiento de fibroblastos 2; GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato \ndeshidrogenasa; HGF: factor de crecimiento de hepatocitos; PGF: factor de crecimiento placentario; \nVEGFA: factor de crecimiento endotelial vascular. F: oligonucleótido o “primer forward”; R: oligonucleótido o \n“primer reverse”. Casa comercial: IPBLN: Instituto de Parasitología y Biomedicina López -Neyra; IDT: \n“Integrated DNA Technologies”. \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n77 \n \nTabla 9. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncualitativa para estudiar citoquinas y quimioquinas. Se muestra el nombre del gen, la secuencia, la Tm, \nel número de ciclos empleado, el número de pb del amplicón o producto de PCR y la casa comercial. \nCCL2: quimioquina 2 con motivo CC; CCL7: quimioquina 7 con motivo CC; CXCL9 (1): quimioquina 9 con \nmotivo CXC (oligonucleótidos empleados en las preDSC y dDSC de 14 días de decidualización; CXCL9 (2): \nquimioquina 9 con motivo CXC (oligonucleótidos empleados en las preDSC y dDSC de 8 dí as de \ndecidualización; en EnSC y eEnSC); CXCL10: quimioquina 10 con motivo CXC ; CXCL11: quimioquina 11 \ncon motivo CXC ; GAPDH: gliceraldehído -3-fosfato deshidrogenasa; IFN -γ: interferón gamma; IL10: \ninterleucina 10; LIF: factor inhibidor de la leucemia; RANKL: ligando de receptor activador para el factor \nnuclear κB; TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa. F: oligonucleótido o “primer forward”; R: oligonucleótido o \n“primer reverse”. Casa comercial: IPBLN: Instituto de Parasitología y Biomedicina López -Neyra; IDT: \n“Integrated DNA Technologies”. \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n78 \n \n8.1.2. Visualización del producto de PCR en gel de agarosa \nLos productos obtenidos de la PCR fueron separados por tamaño mediante electroforesis en \ngel de agarosa al 1,5% (Seakem LE Agarose for gel electrophoresis; Lonza Group, Basilea, Suiza) \na un voltaje de 100 V y amperaje de 400 mA. Dichos productos se visuali zaron mediante tinción \ncon GelRed (GelRed Nucleic Acid Gel Stain; Biotium, Fremont, California, EEUU) en un revelador \nde geles (ChemiDoc MP Imaging System; Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EEUU). En \ncada gel se incluyó un marcador de peso molecular (BenchTop 100bp DNA Ladder; Promega), los \ncontroles positivo y negativo del gen de interés y las muestras a estudiar. \nLas bandas se cuantificaron con el software Adobe Photoshop CS3 ( Adobe Sy stems \nIncorporated; San José, California, EEUU). Los valores de intensidad de banda para cada muestra \nse normalizaron frente a los obtenidos para el gen de expresión constitutiva (“housekeeping \ngene”) GAPDH. Se representaron los datos nor malizados como Fold Change (FC); calculado \ncomo el valor obtenido para dDSC, relativizado frente al valor obtenido para preDSC o como el \nvalor obtenido para PBL activados en contacto con MC de DSC , relativizado frente al valor \nobtenido en el medio Control. \nLos valores de FC inferiores a 1 se representaron con la fórmula NFC (“Negative Fold Change”) \n= -1/FC. \n8.2. PCR cuantitativa \nPara el análisis cuantitativo de la expresión génica, las muestras de ADNc fueron amplificadas \nmediante PCR a tiempo real en placas de 96 pocillos ( MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate; \nThermo Fisher Scientific) usando FastStart Universal SYBR Green Master ( Merck KGaA) con los \nsiguientes volúmenes y parámetros de reacción de qPCR (Tabla 10): \n \nTabla 10. Reactivos empleados en la PCR cuantitativa. \n \nMezcla de amplificación del ADNc \nSYBR Green 2x 12,5 μL \nOligonucleótido 5’ (10 μM) 0,75 μL \nOligonucleótido 3’ (10 μM) 0,75 μL \nNFW 8,5 μL \nMuestra de ADNc (dilución 1/10) o NFW 2,5 μL \nVolumen final de reacción 25 μL \n \nTras preparar la mezcla d e amplificación, la PCR cuantitativa se llevó a cabo en un sistema \nQuantStudio 3 Real -time PCR (Thermo Fisher Scientific) usando los parámetros detallados en el \nsiguiente esquema (Ilustración 15): \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n79 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nIlustración 15. Esquema representativo de los parámetros empleados en la PCR cuantitativa. \n \n \nLas secuencias de los oligonucleótidos empleados aparecen detalladas en la Tabla 11. \nUna vez finalizada la reacción, se obtuvieron valores de CT (“ cycle treshold ”) o ciclo umbral \npara cada muestra. Dichos valores se normalizaron frente a los obtenidos para el gen control de \nexpresión constitutiva (“housekeeping gene”) y se aplicó la fórmula 2-ΔCT, donde ΔCT = CT gen de \ninterés – CT gen control. Los valores resultantes fueron representados como FC; calculado como \nel valor obtenido para dDSC , relativizado frente al valor obtenido para preDSC o como el valor \nobtenido para PBL activados en contacto con los MC de DSC relativizado frente al valor obtenido \nen el medio Control. Los valores de FC inferiores a 1 se representaron con la fórmula NFC = -1/FC \n \n \n \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n80 \n \nTabla 11. Listado de oligonucleótidos utilizados en el análisis transcriptómico mediante PCR \ncuantitativa para estudiar citoquinas y quimioquinas. Se muestra el nombre del gen, la secuencia, la \nTm, el número de pb del amplicón o producto de PCR y la casa comercial. \nCCL5: quimioquina 5 con motivo CC; CCL19: quimioquina 19 con motivo CC; CCL21: quimioquina 21 con \nmotivo CC; CXCL8: quimioquina 8 con motivo CXC; CXCL10: quimioquina 10 con motivo CXC; CXCL11: \nquimioquina 11 con motivo CXC; CXCL12: quimioquina 12 con motivo CXC; CXCL14: quimioquina 14 con \nmotivo CXC; CX3CL1: quimioquina 1 con motivo CX 3C; GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; \nIFN-γ: interferón gamma; IL6: interleucina 6; IL15: interleucina 15; PR: receptor de progesterona ; TNF-α: \nfactor de necrosis tumoral alfa. F: oligonucleótido o “primer forward”; R: oligonucleótido o “primer reverse”. \nCasa comercial: IPBLN: Instituto de Parasitología y Biomedicina López -Neyra; IDT: “Integrated DNA \nTechnologies”. \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n81 \n \n9. Inmunodetección de proteínas por Western Blot \nDiferentes líneas de DSC y EnSC no decidualizadas y decidualizadas (7, 10 y 14 días) fueron \nlavadas con PBS (Thermo Fisher Scientific) y lisadas para la detección de las proteínas PR, PKA y \nel factor de transcripción FOXO1. \nLa detección se llevó a cabo a partir de extractos celulares totales. Para ello, las células (5x105) \nse incubaron durante 30 min a 4 ºC (en hielo) con 100 μL de buffer de lisis (Thermo Fisher \nScientific) compuesto por NaCl 140 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 2M, NP-40 (nonilfenol etoxilado) \nal 1%, NaF 50 mM, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 1 mM, iodoacetamida 10 mM, pirofosfato \nsódico 5 mM, óxido de fenilarsina 50 mM e inhibidores de proteasas y fosfatasas (20x). \nEl sobrenadante se separó por centrifugación a 14000 g (12100 rpm) durante 15 min a 4 ºC. \nLas proteínas del sobrenadante se cuantificaron por el método Bradford (Merck KGaA) y después \nse añadió el tampón de carga, buffer Laemmli 6x (Thermo Fisher Scientific) compuesto por Tris 2 \nM pH 6,8, urea 6 M, β -mercaptoetanol al 6%, azul de bromofenol al 0,003% y SDS (dodecilsulfato \nsódico) al 3%. \n Posteriormente, las proteínas se separaron en geles de SDS -poliacrilamida (SDS-PAGE) (Bio-\nRad) al 10% , en el sistema Mini -PROTEAN Tetra Cell ( Bio-Rad) durante 80 min a un voltaje de \n140 V. A continuación, se transfirieron las proteínas desde el gel a una membrana de difluoruro de \npolivinilideno (PVDF) (Merck KGaA) por transferencia semiseca, empleando el sistema Trans -Blot \nSD (Bio-Rad) durante 50 min a un amperaje de 50 mA. \nLas membranas se bloquearon con una solución de PBS-Tween 20 (0,1%) (Thermo Fisher \nScientific) con un 5% de leche en polvo durante 60 min a temperatura ambiente. Después se \nlavaron con PBS-Tween 20 (0,1%) (Thermo Fisher Scientific) y se incubaron toda la noche a 4 ºC \ncon el anticuerpo correspondiente frente a la proteína a detectar (Tabla 12), el cual se diluyó con \nPBS-Tween 20 (0,1%) (Thermo Fisher Scientific ) con 1% de leche en polvo. Después de esta \nincubación, las membranas se lavaron 3 veces con PBS-Tween 20 (0,1%) (Thermo Fisher \nScientific) durante 5 min. Finalmente, estas se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente \ncon el anticuerpo secundario que está marcado con peroxidasa de rábano (HRP) ( Tabla 12 ) y \npreparado en solución de bloqueo. Después se realizaron 3 lavados con PBS-Tween 20 (0,1%) \n(Thermo Fisher Scientific ) durante 5 min. Las membranas se revelaron por quimioluminiscencia \nempleando el reactivo ECL Select ( Cytiva RPN2235SK; Thermo Fisher Scientific) recogiendo la \nseñal con el sistema ImageQuant LAS-4000 mini (Fujifilm, Tokio, Japón). El análisis de resultados \nse realizó con el software Multicaule V.30 ( Fujifilm). La intensidad de las bandas obtenidas fue \ncuantificada con el software Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Incorporated); los valores de \nintensidad se normalizaron frente a los respectivos controles de carga (α-tubulina y β-actina). \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n82 \n \nTabla 12. Listado de anticuerpos empleados en la inmunodetección de proteínas por Western Blot. \nSe muestra la proteína a detectar, la dilución/concentración a la que se emplea el anticuepo y la casa \ncomercial. \nPKA RIα/β: subunidades reguladoras RI α/β de la proteína quinasa A; PKA C α/β/γ: subunidades catalíticas \nCα/β/γ de la proteína quinasa A; PR -A y PR -B: isoformas A y B del receptor de la progesterona; HRP: \nenzima peroxidasa de rábano. Casa comercial: Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, EEUU); R&D \nSystems (Minneapolis, Minnesota, EEUU); Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). \n \n \n \n \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n83 \n \n10. Inmunodetección de proteínas por ELISA \nLa detección de las proteínas CXCL9, CXCL10 y CXCL11 en el MC obtenido del cultivo de \nEnSC, DSC y eEnSC se llevó a cabo con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima \n(ELISA). Mediante este procedimiento se pudieron detectar cuantitativamente dichos antígenos en \nmuestras obtenidas de 3 donantes diferentes para cada tipo celular (se realizaron triplicados para \ncada muestra). La metodología empleada fue un ELISA tipo sán dwich (Ilustración 16), mediante \nel cual se emplean dos anticuerpos específicos de dos epítopos diferentes presentes en el \nantígeno y el anticuerpo de detección está conjugado a una enzima que cataliza una reacción \ncolorimétrica. Los kits utilizados en los experimentos se detallan a continuación: Human CXCL9 \n(MIG) ELISA Kit (EHCXCL9; Thermo Fisher Scientific ), Human IP -10 (CXCL10) ELISA Kit \n(KAC2361; Thermo Fisher Scientific ) y Human I -TAC (CXCL11) ELISA Kit (EHCXCL11; Thermo \nFisher Scientific). Se siguió e l protocolo especificado por el fabricante en cada caso, el cual se \nexplica a continuación de forma resumida. \nEn primer lugar, se descongelaron alícuotas del MC que previamente había sido centrifugado a \n1500 rpm (5 min a 20 °C) y filtrado por un diámetro de poro de 0,2 μm, para eliminar posibles \nrestos celulares . En los experimentos se usaron las muestras correspondientes sin diluirlas \npreviamente, ya que en este caso realizar diluciones impide la correcta detección de las prot eínas \nobjeto de estudio. \nEn cuanto a los reactivos presentes en cada kit, todos alcanzaron la temperatura ambiente y \nfueron mezclados debidamente antes de su uso. \nUn paso inicial y necesario es la preparación del estándar, de concen tración conocida, que se \nrealizó siguiendo los pasos que se especifican a continuación. Primero fue reconstituido , para \ndespués preparar diluciones seriadas de dicho estándar. Las muestras de proteína purificada se \nañaden a los pocillos en concentraciones decrecientes y con ell o, posteriormente, se obtiene una \ncurva patrón con unos valores de absorbancia que servirán de referencia y permitirán determinar \nla concentración de antígeno presente en las muestras problema. \nEl procedimiento se llevó a cabo en una placa de 96 p ocillos, los cuales ya presentaban el \nanticuerpo de captura unido a la superficie de la placa. Seguidamente , se añadió el volumen \ncorrespondiente de cada muestra, tanto de las diluciones del estándar como de las muestras \ncontrol (Opti-MEM) y problema (MC de preEnSC, MC de dEnSC, MC de preDSC, MC de dDSC, \nMC de preeEnSC y MC de deEnSC). De esta manera el antígeno contenido en la muestra se une \nal anticuerpo de captura. Tras una incubación a t emperatura ambiente, se eliminó el contenido de \nlos pocillos por decantación y se realizaron 4 lavados con la solución de lavado correspondiente. \nAsí permanece solamente el antígeno de interés unido al anticuerpo de captura y se elimina el \nmaterial no unido. Seguidamente , se añadió el anticuerpo de detección que está marca do con \nbiotina y se incubó a temperatura ambiente. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se \neliminó el exceso de anticuerpo me diante decantación y se realizaron 4 lavados. Después se \nañadió a los pocillos la solución que contiene estreptavidina conjugada con HRP y que permite la \ndetección del anticuerpo biotinilado . Se realizó una nueva incubación a temperatura ambiente. El \ncontenido de los pocillos se volvió a eliminar por decantación y se realizaron 4 nuevos lavados. A \ncontinuación, se añadió el sustrato enzimático (TMB: tetrametilbencidina) , de manera que la \nenzima transforma el sustrato sobre el anticuerpo de detección produciéndose un cambio de color \n\n\nMATERIAL Y MÉTODOS \n \n \n84 \n \n(azul). Tras una incubación a temperatura ambiente protegiendo los pocillos de la luz , se a ñadió \nuna solución “stop” que para la reacción , produciéndose un cambio de color de azul a amarillo. \nCon un espectrofotómetro de microplacas Multiskan SkyHigh (Thermo Scientific) se detectó el \nproducto de la reacción enzimática , es decir, se determinó la d ensidad óptica (DO ) de cada \npocillo, leyendo la absorbancia a 450 nm en los siguientes 30 minutos. El software SkanIt 6.1.1. \nRE for Microplate Readers genera una curva estándar; siendo la función logística de cuatro \nparámetros (4 PL) la que proporciona el mejor ajuste de la curva estándar. Con la ecuación \nobtenida se calculó la concentración de proteína en las muestras control y en las muestras \nproblema. \nIlustración 16 . Esquema representativo del ELISA tipo sándwich . Imagen creada con el software \nBioRender. \n \n11. Análisis estadístico \nTodos los experimentos se realizaron por triplicado o por cuadruplicado y los resultados \naparecen representados como la media ± SD (desviación estándar). En todos los casos , se \nemplearon al menos tres líneas de EnSC, DSC, eEnSC y MSC diferentes, tanto no decidualizadas \ncomo decidualizadas. Los medios condicionados también fueron obtenidos a partir del cultivo de , \nal menos , tres líneas celulares distintas. Los estudios de quimiotaxis y fenotipo de linfocitos y \nmonocitos se r ealizaron a partir de la sangre de 10 donantes sanas (3 donantes diferentes en \ncada experimento). \nSe empleó la prueba no paramétrica para dos muestras independientes U de Mann -Whitney, \ncon el objetivo de comparar los efectos de la decidualización en el cambio en la morfología celular, \nla secreción de PRL y la actividad antitumoral. También se empleó para analizar la actividad \ncontráctil de las preDSC. \nSe empleó la prueba paramétrica para dos muestras independientes t de Student con el \nobjetivo de comparar las diferencias en la quimiotaxis y en la expresión génica. Las \ncomparaciones se realizaron mediante la prueba con la corrección de Welch para varianzas \ndesiguales. \nEl análisis estadístico se realizó con el programa GraphPad Prism 6 (GraphPad Software; San \nDiego, California, EEUU). Un p-valor inferior a 0,05 fue interpretado como estadísticamente \nsignificativo (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n\n\n \n \n85 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRESULTADOS \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n86 \n \n1. Células deciduales estromales humanas \n1.1. Características generales de las DSC \nLas células deciduales estromales (preDSC) presentan una morfología alargada, similar a la de \nlos fibroblastos, y tienen la capacidad de decidualizarse in vivo bajo los efectos de la P4 y otras \nhormonas ováricas o del embarazo. Durante este proceso de diferenciación, las DSC \ndecidualizadas (dDSC) adquieren una morfología más redondeada y secretan PRL84,207,208. \nCon el objetivo de comprobar las características de las líneas de DSC establecidas, se analizó \nla morfología de la población celular y se estudió su capacidad para decidualizarse in vitro, como \nrespuesta al tratamiento con P4 y AMPc. L os resultados mostraron que las DSC aisladas estaban \ncompuestas por una población uniforme de células proliferantes que exhibían una morfología \nadherente de tipo fibroblástico. No se detectó PRL en los cultivos sin P4 y AMPc , por lo que se \nconcluyó que estas líneas estaban constituidas por preDSC. No obstante, añadir estos factores \ndecidualizantes al medio de cultivo resultó en un cambio a una morfología má s redondeada y la \nsecreción de PRL, por lo tanto, en la diferenciación a dDSC (Figura 1A). \nPor otra parte, se analizó, por citometría de flujo, el fenotipo antigénico de las preDSC aisladas. \nEl resultado del estudio de un panel de 36 antígenos mostró que más del 95% de células \nexpresaban los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, α -SMA, \nnestina, podoplanina y vimentina. Las células no expresaron CD15, CD19, CD31, CD34, CD45, \nCD62P, citoqueratina y HLA-DR. Los datos obtenidos confirman la pureza del cultivo de preDSC y \nla ausencia de células de origen hematopoyético (Figura 1B) (Tabla 13). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA \nB \n\n\nRESULTADOS \n \n \n87 \n \nFigura 1. Características generales de líneas de preDSC. A) Decidualización de preDSC. Tras 14 días en \ncultivo con P4 y AMPc, las preDSC cambian su morfología fibroblástica a una más redondeada y secretan \nPRL. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de aumento de 4x. Las barras representan el porcentaje \nde células redondeadas tras la cuantificación de áreas representativas (n = 3 por muestra) con ImageJ y la \nsecreción de PRL, por tres líneas de preDSC (media ± SD). B) Análisis del fenotipo antigénico de una línea \nde preDSC por citometría de flujo (citogramas de un experimento representativo). El estudio se realizó con \ntres muestras independientes. (*P < 0,05; **P < 0,01). \n \nTabla 13. Expresión de antígenos, determinada por citometría de flujo, en líneas de preDSC y MSC de \nmédula ósea obtenidas en las mismas condiciones. ND: no determinado; aNegrita: antígenos asociados \na pericitos. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n% Células positivas \nAntígeno MSC (n=7) preDSC (n=10) \nCD9 ND >95 \nCD10 >95 >95 \nCD13a >95 >95 \nCD15 <1 <1 \nCD19 <1 <1 \nCD29 >95 >95 \nCD31 <1 <1 \nCD34 <1 <1 \nCD44a >95 >95 \nCD45 <1 <1 \nCD54 45-69 51-91 \nCD62P <1 <1 \nCD73 >95 >95 \nCD80 ND 0-73 \nCD86 ND 0-79 \nCD90a >95 >95 \nCD105a >95 >95 \nCD106a 0-10 0-21 \nCD140ba ND 67-84 \nCD146a 68-75 67-92 \nCD271a 0-8 10-26 \nAPa ND 72-85 \nα-SMAa >95 >95 \nBAFF <1 52-66 \nCXCL12 ND 12-20 \nCXCL13 <1 20-32 \nCitoqueratina ND <1 \nHLA-DR <1 <1 \nHLA-G <1 7-30 \nMFG-E8a ND 37-57 \nNestinaa >95 70-95 \nOCT3/4 42-52 42-65 \nPodoplanina >95 >95 \nSTRO-1a 7-48 36-63 \nVimentinaa ND >95 \nSUSD2 21-35 32-60 \n\n\nRESULTADOS \n \n \n88 \n \n1.2. DSC como células madre mesenquimales \n1.2.1. Fenotipo antigénico compatible con MSC de médula ósea \nUna vez analizado el fenotipo de las líneas de preDSC y teniendo en cuenta que la decidua \nhumana (del primer trimestre de embarazo) contiene células madre mesenquimales \nmultipotentes209, se buscó determinar si nuestras preDSC estaban relacionadas o derivaban d e \ncélulas madre mesenquimales. Para ello, se comparó el perfil fenotípico de las líneas de preDSC \ncon el de células mesenquimales obtenidas de médula ósea (MSC) 210, realizando un extenso \nanálisis por citometría de flujo. \nDicho estudio confirmó que ambos tipos de células presentan un fenotipo equivalente. Más d el \n95% de las células de las líneas de preDSC y MSC expresaban CD10, CD13, CD29, CD44, CD73, \nCD90, α -SMA, nestina y podoplanina; por otra parte, se vio ausencia de expresión de los \nmarcadores CD15, CD19, CD31, CD34, CD45, CD62P y HLA -DR. Las preDSC expresaron el \nantígeno STRO-1 que es un marcador característico de precursores estromales de médula ósea y \nque relaciona ambos tipos de células, como anteriormente había comprobado nuestro grupo de \ninvestigación99. Es por esto que el perfil de expresión de antígenos era equivalente al observado \nen las líneas de MSC de médula ósea. No obstante, se observó que las MSC no expresaban \nBAFF y CXCL13, los cuales sí fueron expresados por preDSC 211. Las líneas de preDSC también \nfueron positivas para los marcadores de eMSC18 CD140b, CD146 y SUSD2 (Tabla 13). \n1.2.2. Funciones asociadas a MSC. Formación de colonias y diferenciación \nmesenquimal \nTal como se mostró en el anterior apartado , las preDSC presentan un fenotipo compatible con \nel de MSC de médula ósea (Tabla 13). Dicho fenotipo antigénico, junto a la adherencia al plástico \nen condiciones de cultivo estándar y la capacidad de diferenciación in vitro en osteoblastos, \nadipocitos y condrocitos, son propiedades que, en conjunto, se encuentran dentro de los criterios \nmínimos propuestos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) para definir las MSC \nhumanas23. \nEs por esto que se estudió, a continuación, mediante RT-PCR, la expresión en preDSC de los \nsiguientes marcadores de células madre pluripotentes: OCT -4, NANOG y ABCG2 210. Estos \ntambién son marcadores expresados por MSC fetales212. La detección de los transcritos de OCT-4 \nmediante RT -PCR es un reto, ya que fácilmente se inducen artefactos como resultado de la \namplificación de muchos transcritos similares a OCT -4, procedentes de la expresión de \npseudogenes procesados y no procesados. Se emplearon d os “primers forward” específicos de \nOCT-4 (OCT-4FP y OCT -4F), que también amplifican pseudogenes. OCT-4FP y OCT -4F fueron \npositivos en las 4 líneas de preDSC estudiadas. Estas también expresaron NANOG y ABCG2 \n(Figura 2A). Por otra parte, la eficacia de formación de colonias de las líneas de preDSC osciló \nentre un 4 y un 15% (Figura 2B). Además, en adecuadas condiciones de cultivo, las preDSC se \ndiferenciaron en células procedentes de tres linajes mesenquimales distintos: ad ipocitos, \nosteoblastos y condrocitos. Tal como se esperaba, los adipocitos expresaron “peroxisome \nproliferator-activated receptor -gamma 2” (PPARγ2) y la fosfatasa alcalina (AP); los condrocitos \nexpresaron colágeno tipo II y AP; y los osteocitos fueron posi tivos para osteopontina, colágeno \ntipo II y AP. Osteopontina y AP también fueron positivas en líneas de preDSC no diferenciadas \n(Figura 2C). \n\n\nRESULTADOS \n \n \n89 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 2. Características de MSC presentadas por líneas de preDSC. A) Detección por RT -PCR de \nmarcadores de células madre pluripotentes (OCT -4, NANOG, ABCG2) en cuat ro líneas de preDSC. B) \nEficiencia de formación de colonias en tres líneas de preDSC. Las barras representan la media ± SD de tres \ndeterminaciones independientes. C) Diferenciación mesenquimal de una línea de preDSC. PreDSC no \ndiferenciadas, preDSC diferenciadas a osteocitos (ost.), adipocitos (adip.) y condrocitos (cond.). La \ndiferenciación se comprobó con tinción de alizarina (ost.), Oil Red O (adip.) y safranin a O (cond.). Barra de \nescala: 50 μm. Los marcadores moleculares de diferenciación se detectaron mediante RT -PCR: PPARγ2 \n(adip.), colágeno tipo II (cond.), osteopontina y AP (ost.). La β-2 microglobulina (β2MG) se usó como control \nde carga. Para estos experimentos se realizaron 4 réplicas. \n1.2.3. Decidualización de preDSC y MSC \nDebido a la estrecha relación existente entre las preDSC y las MSC de médula ósea y tras \nestudiar el perfil fenotípico , se comparó su capacidad para diferenciarse en respuesta a P 4 y \nAMPc. Para ello, también se analizaron líneas de MSC cultivadas en condiciones de \ndecidualización213. Los resultados obtenidos mostraron que , aunque las MSC cambian su \nmorfología fibroblástica hacia una más redondeada (Figura 3A) y expresan PRL a nivel de ARNm, \nno se detectó secreción de este factor a nivel proteico (Figura 3B). \n \n \n \n \nA B \nA \nC \n\n\nRESULTADOS \n \n \n90 \n \n \n \n \nFigura 3. Análisis comparativo de la decidualización de preDSC y MSC. A) Decidualización de MSC. \nTras 14 días en cu ltivo con P4 y AMPc, las MSC cambian su morfología fibroblástica a una más \nredondeada. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de aumento de 10x. B) Determinación por RT-\nPCR y ELISA de la producción de prolactina por preDSC y MSC tras 14 días de tratamiento con P4 y AMPc. \nSe empleó la β2MG como gen de expresión constitutiva (“housekeeping gen”). Se muestra un experimento \nrepresentativo. En cuanto a la determinación por ELISA de la producción de PRL , l as barras de error \nmuestran la media ± SD de tres experimentos independientes con 3 diferentes líneas celulares. (*P < 0,05). \n1.3. DSC como células perivasculares \n1.3.1. Características de pericitos de las preDSC \nUna vez demostrada la relaci ón existente entre preDSC y MSC de médula ósea, nos \nplanteamos el estudio de las características de células perivasculares en preDSC 208. \nInvestigaciones previas han demostrado la localización perivascular de las MSC, relacionando \ndirectamente estas células con los pericitos 199. Los pericitos son células contráctiles que rodean \nlas células endoteliales microvascula res y que tienen un papel clave en el mantenimiento de la \nhomeostasis vascular. Para llevar a cabo sus funciones, los pericitos producen factores \nangiogénicos y tienen propiedades contráctiles, fagocíti cas, quimiotácticas e \ninmunoreguladoras94,96,97. \n Inicialmente se estudiaron una serie de marcadores de pericitos en preDSC. Concretamente, \nde los 35 antí genos estudiados por citometría de flujo, 14 de ellos eran marcadores de pericitos \n(CD13, CD44, CD90, CD105, CD106, CD140b, CD146, CD271, AP, α -SMA, MFG-E8, Nestina, \nSTRO-1 y Vimentina) 199. El elevado porcentaje de células positivas para marcadores como α -\nSMA, CD140b y CD146 nos ayudaron a identificar nuestras preDSC como pericitos (Tabla 13). \nLas líneas de preDSC estudiadas también mostraron otras características típicas de células \nperivasculares, tales como la expresión de factores angiogénicos y la actividad contráctil. Por un \nlado, las células expresaron los siguientes factores angiogénicos: angiopoyetina -1 (ANGPT1), \nfactor de crecimiento de fib roblastos 2 (FGF2), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor \nde crecimiento placentario (PGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Figura 4A). \nAdemás, por microscopía de fluorescencia se pudo comprobar que l as preDSC expresaban la \nproteína α-SMA, la cual es uno de los marcadores más característicos de pericitos y confiere a las \ncélulas actividad contráctil (Figura 4B). Por otra parte, los ensayos de contracción del colágeno \nmostraron que en presencia de la citoquina proinflamatoria TNF, que se asocia al aborto, las \npreDSC experimentaron contracción; mientras que en presencia de IL -10 y P4, que favorecen el \nB \n\n\nRESULTADOS \n \n \n91 \n \nembarazo, las células no experimentaban contracción y se mantenían en estado relajado (Figura \n4B). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 4. Características de pericitos de líneas de preDSC. A) Detección de factores angiogénicos por \nRT-PCR en líneas de preDSC. La expresión de ANGPT1, FGF2, HGF, PGF y VEGF fue analizada en \ndecidua y en 4 líneas independientes de preDSC. B) La proteína α -SMA se detectó por microscopía de \nfluorescencia con un anticu erpo anti-α-SMA-Cy3 en fibras de estrés de preDSC (color rojo). El núcleo fue \nteñido con DAPI (color azul). El TNF indujo contracción, mientras que IL -10 y P4 indujeron relajación en las \ncélulas, en ensayos de contracción del colágeno. Los datos se muestra n como la variación porcentual en \nvolumen de la matriz de gel de colágeno ± SD en las preDSC tratadas con citoquinas o con P4 , en \ncomparación con las preDSC no tratadas. La fórmula empleada es la siguiente: variación del volumen de gel \n(%) = [(volumen con preDSC tratadas - volumen con preDSC no tratadas)/volumen con preDSC no \ntratadas] x 100. Los valores negativos indican contracción celular, mientras que los positivo s indican \nrelajación. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n1.3.2. Localización perivascular de las preDSC \nSe ha observado que las preDSC humanas se localizan in vivo alrededor de los vasos \nsanguíneos y, bajo el efecto hormonal, dichas células se diferencian y migran hacia el estroma, \ndurante la fase secretora tardía y en el endometrio gestante53. Para determinar la correspondencia \nde nuestras líneas de preDSC con las preDSC perivasculares in vivo, se realizaron los siguientes \nexperimentos en cortes de decidua208,214. \nA \nB \n\n\nRESULTADOS \n \n \n92 \n \nEn estas secciones, las preDSC mostraban una morfología fibroblástica perivascular, mientras \nque se pudo identificar a las dDSC por su morfología redondeada, gran tamaño y también por su \nlocalización en el espacio extravascular (Figura 5A). \nEn cuanto al fenotipo, se observó, por microscopía confocal, que e n su localización \nperivascular, las preDSC expresaban CD10, marcador de las líneas de preDSC , junto con los \nantígenos de MSC/pericitos, tales como α -SMA, nestina, CD140b, CD1 46, SUSD2, MFG -E8 y \nSTRO-1. La expresión de CD10 fue similar tanto en las preDSC perivasculares como en las dDSC \nextravasculares. Sin embargo, se observó menor expresión de los marcadores de MSC/pericitos \nen las dDSC localizadas en la zona extravascular ( Figura 5B). Se detectó α -SMA, un antíge no \naltamente expresado por las líneas de preDSC, principalmente alrededor de los vasos sanguíneos \ny mucho menos intensamente en células extravasculares de las secciones de decidua humana. La \nα-SMA se colocalizó con nestina, CD140b, CD146, SUSD2, MFG-E8 y S TRO-1 ( todos ellos \nmarcadores de pericitos expresados por las líneas preDSC ) en células perivasculares, pero no en \nzonas extravasculares ( Figura 5B). Las células perivasculares también expresaron podoplanina \n(Figura 5C), una proteína detectada en las línea s de preDSC. La podoplanina se colocalizó con \nCD146 y MFG -E8 en las células perivasculares deciduales ( Figura 5C ). Estos resultados \nconfirman que las líneas de preDSC in vitro representan a las preDSC perivasculares y se \nencuentran estrechamente relacionadas con los pericitos. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA \n\n\nRESULTADOS \n \n \n93 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nB \nC \n\n\nRESULTADOS \n \n \n94 \n \nFigura 5. Células perivasculares deciduales. A) Decidua humana crioseccionada y teñida con azul de \ntoluidina; se muestran las preDSC (flechas negras) y las dDSC decidualizadas (flechas roja s). Barras de \nescala: 25 μm. B) Las cé lulas perivasculares α -SMA+ coexpresan (amarillo) CD10, nestina, CD140b, \nCD146, SUSD2, MFG-E8 y STRO-1. Las células α-SMA+ de los vasos, que no coexpresan estos antígenos, \ncorresponden a células musculares lisas. Las células endoteliales son CD34+. Barras de escala: 100 μm. C) \nLas células perivasculares coexpresan (rosa) podoplanina, CD146 y MFG -E8. Barras de escala: 100 μm. \nEste experimento se realizó en cuatro muestras independientes. \n1.4. Clonos de DSC \nCon el objetivo de descartar que las características de pericitos y MSC presentadas por las \npreDSC se debieran a una mezcla de poblaciones celulares, se obtuvieron tres clonos de \ndiferentes línea s de preDSC 208,210. Se observó que en ausencia de P4 y AMPc, estos clonos \npresentaban una morfología fibroblástica y no secretaban PRL. No obstante, en cultivo con dichos \nfactores, los clonos adquirían una morfología re dondeada y secretaban PRL, demostrando su \ncapacidad de decidualizarse (Figura 6 ). Bajo adecuadas condiciones de cultivo, los clonos se \ndiferenciaron a adipocitos, condrocitos y osteoblastos ( Figura 6 ). De esta manera, se pudo \nobservar que el mismo tipo de célula podía experimentar diferenciación decidual y mesenquimal. \nAdemás, los clonos de preDSC presentaron un fenotipo equivalente al de las líneas de preDSC, \ncompatible con el de MSC de médula ósea y expresaron ant ígenos de pericitos (Tabla 14). Estos \nresultados demostraron que tan to las características de las preDSC como las de los pericitos y \nMSC se asocian con el mismo tipo de célula. \n \nTabla 14. Expresión de antígenos por tres clonos de preDSC, determinada por citometría de flujo. \naNegrita: antígenos asociados a pericitos. \n \n \n \n \n \n \n \n% Células positivas \nAntígeno Clon 1 Clon 2 Clon 3 \nCD10 >95 >95 >95 \nCD29 >95 >95 >95 \nCD34 <1 <1 <1 \nCD44a >95 >95 >95 \nCD45 <1 <1 <1 \nCD73 >95 >95 >95 \nCD140ba 20-33 51-65 33-62 \nCD146a 73-90 68-87 >95 \nα-SM actinaa >95 >95 >95 \nHLA-G 7-21 12-30 9-32 \nSUSD2 22-53 37-68 50-63 \n\n\nRESULTADOS \n \n \n95 \n \nFigura 6. Características de clonos de preDSC. Los clonos estudiados presentaron el mismo fenotipo \nantigénico que las líneas de preDSC (se muestran citogramas de la doble expresión de CD10 y CD29). S e \ndecidualizaron en presencia de P4 y AMPc, cambiando su morfología fibroblástica a una más redondeada y \nsecretando PRL. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de aumento de 10 x. Barra de escala: 50 \nμm. Los gráficos de barras muestran el porcentaje de células redondas y la secreción de PR L para cada \nuno de los tres clono s (media ± SD de tres determinaciones independientes por clon) . Los clonos se \ndiferenciaron en osteoblastos, condrocitos y adipocitos. La diferenci ación mesenquimal se determinó con \ntinción de alizarina (osteogénica), tinción Oil Red O (adipogénica) y safranina O (condrogénica). Barra de \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n96 \n \nescala: 50 μm. Estos experimentos se realizaron a partir de 4 réplicas independ ientes. (*P < 0,05; **P < \n0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n1.5. Decidualización de preDSC \nDurante la fase secretora del ciclo endometrial y el embarazo, las células del estroma \nendometrial/decidual abandonan su localización perivascular hacia una zona extravascular, \ncambian su morfología y tamaño, secretan PRL y otros factores como IL-1553,207. Por lo tanto, este \nproceso conocido como decidualización in duce cambios morfológicos, funcionales y de \nlocalización en las preDSC. En base a ello, el siguiente objetivo se centró en el estudio de \nvariaciones inducidas por la decidualización en las características de nuestras líneas de \npreDSC214. \n1.5.1. Comparación del fenotipo de preDSC y dDSC \nAnteriormente habíamos comprobado en los estudios de microscopía confocal que las dDSC, \nque han abandonado su localización alrededor de los vasos sanguíneos, presentan una menor \nexpresión de los marcadores de MSC/pericitos (α-SMA, nestina, CD140b, CD1 46, SUSD2, MFG-\nE8 y STRO -1) que las preDSC ( Figura 5B). Los resultados de los experimentos in vitro fueron \nequivalentes, es decir, nuestras líneas de pre DSC experimentaron los mismos cambios en la \nexpresión de antígenos detectados in vivo. No se obtuvieron diferencias en la expresión de CD10, \nCD29 y CD44 en las dDSC en comparación con las preDSC. No obstante, la expresión de \nCD140b, CD146, SUSD2, α -SMA y nestina sí disminuyó de manera significativa en las dDSC. \nTambién se observó q ue la expresión de la quimioquina con actividad angiogénica CXCL12 215 \naumentó significativamente ( Figuras 7A y 7B). Además, se vio que tiempos más largos de \ndecidualización se relacionaban con un mayor descenso de la intensidad media de fluorescencia \nde la α-SMA (Figura 7C). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA \n\n\nRESULTADOS \n \n \n97 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 7. Fenotipo antigénico de líneas de DSC no decidualizadas (preDSC) y decidualizadas (dDSC). \nA) Histogramas que muestran la expresión de los antígenos CD10, CD29, CD44, CD140b, CD146, SUSD2, \nα-SMA, nestina y la quimioquina CXCL12 en una línea representativa de DSC. B) Las barras representan la \nmedia del porcentaje de células que expresan cada antígeno ± SD. C) Las barras representan la media para \nla i ntensidad de fluorescencia (IMF) correspondiente al marcador α -SMA. Los experimentos se realizaron \ncon 4 muestras diferentes de DSC. Las células decidualizadas fueron tratadas con P4 y AMPc durante 14 \ndías. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). \n1.5.2. Expresión y secreción de citoquinas por preDSC y dDSC \nLas DSC tienen una función muy importante en la regulación del desarrollo normal de un \nembarazo debido a su capacidad inmunoreguladora. Estas células secretan citoquinas \ninmunoreguladoras y quimioquinas que permiten la llegada de leucocitos desde sangre periférica \nhacia la decidua. La localización perivascular de las preDSC favorece el control de la quimiot axis \nde células T, uNK y monocitos. Los leucocitos activ ados también secretan citoquinas que ayudan \na regular el microambiente de la decidua216. \nHasta la fecha, se han realizado estudios en modelo murino que señalan que, durante el \nembarazo, en las DSC se inhibe la expresión de quimioquinas que atraen hacia la decidua células \nT activadas con actividad proabortígena, fenómeno que parece estar relaci onado con la \ndecidualización. Este silenciamiento de quimioquinas en la decidua constituye un mecanismo de \ntolerancia inmunológica materno-fetal81. \nPartiendo de estos resultados previos, analizamos este fenómeno en líneas de preDSC y \ndDSC humanas y comprobamos si existen diferencias en la expresión del ARNm de una serie de \nB \nC \n\n\nRESULTADOS \n \n \n98 \n \ncitoquinas y quimioquinas entre ambos tipos de células. Para ello estudiamos, mediante PCR , la \nexpresión de los siguientes factores: PRL; IL -6; IL -10; IL -15; PR; LIF ; el ligando de receptor \nactivador para el factor nuclear κB (RANKL); las quimioquinas con motivo CC: CCL2, CCL5, \nCCL7, CCL19 y CCL21; las quimioquinas con motivo CXC: CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXL11, \nCXCL12, CXCL14; y la quimioquina con motivo CX3C: CX3CL1. \nPudimos comprobar que en dDSC hay una expresión significativamente mayor que en preDSC \nde los genes relacionados directamente con el proceso de decidualización 208,214,217, como PRL, \nIL-15, PR, CXCL 12 y CXCL14 ; también hay una mayor expresión de IL -10, LIF, RANKL, CCL7, \nCCL19, CXCL8 y CX 3CL1 (Figura 8A). No obstante, en relación a la expresión de quimioquinas \nque atraen células T activadas, los resultados obtenidos indican que preDSC y dDSC no expresan \nCXCL9 y que hay una disminución significativa de la expresión de CXCL10 y CXCL11 en las \ndDSC respecto a las preDSC (Figuras 8A y 8B). Estas quimioquinas regulan la quimiotaxis de \nlinfocitos al actuar como ligando del receptor CXCR3 expresado por células Th1, Tc y células \nNK81. De esta manera , la decidualización de nuestras líneas de DSC inhibe la expresión de \nquimioquinas que atraen hacia la decidua a células T con actividad proabortígena. \n \n \n \n \n \n \nFigura 8: Efecto de la decidualización (14 días) en la expresión de citoquinas por preDSC y dDSC. A) \nFold Change de los niveles de expresión de ARNm para los distintos factores estudiados. Los genes \nestudiados por RT -PCR (convencional) fueron los siguientes: PRL , IL -10, LIF, RANKL, CCL2, CCL7 y \nCXCL9. Los genes estudiados por qPCR fueron los siguientes: IL -6, IL -15, PR, CCL5, CCL19, CCL21, \nCXCL8, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL14 y CX3CL1. En la RT-PCR, los valores de intensidad de banda \nse normalizaron respecto a los obtenidos para el gen de expresión constitutiva GAPDH (“housekeeping \ngene”). Para obtener el Fold Change, los valores de intensidad de banda normalizados para dDSC se \nrelativizaron frente a los de preDSC. En la qPCR, los valores de CT (“cycle treshold”) para cada muestra se \nnormalizaron respecto a los obtenidos para el gen control de expresión constitutiva GAPDH y los resultados \nse expresaron como Fold Change. Los valores de F old Change inferiores a 1 se representaron con la \nfórmula NFC (“Negative Fold Change”) = -1/FC. Las barras representan la media ± SD. Los experimentos se \nrealizaron a partir de 5 muestras independientes. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). B) Se \nmuestra la expresión de CXCL9, CXCL10, CXCL11 y GAPDH por RT -PCR en tres líneas celulares (M1: \nmuestra 1; M2: muestra 2; M3: muestra 3) , tanto en preDSC como en dDSC. Las células decidualizadas \nfueron tratadas con P4 y AMPc durante 14 días. \nA B \n\n\nRESULTADOS \n \n \n99 \n \nLos resultados anteriores se obtuvieron en DSC decidualizadas durante un periodo de tiempo \nde 14 días; no obstante, pensamos en la necesidad de repetir este estudio en células \ndecidualizadas durante menos tiempo, concretamente, 8 días de tratamiento con P4 y AMPc. Esto \nfue conveniente ya que los MC empleados posteriormente en los estudios de migración de células \nsanguíneas fueron de 8 días. Además, nuestro grupo de investigación ha comprobado que es en \nestos MC en los que se obtienen los porcentajes de migració n celular más elevados (datos no \nmostrados) y, en ese caso, no hay un elevado número de células que hayan entrado en apoptosis; \nya que la decidualización prolongada promueve la producción de factores solubles capaces de \ninducir apoptosis en las propias células deciduales o endometriales estromales103. \nTambién es importante destacar que, llegados a este punto, y ya que anteriormente no se \ndetectó expresión del ARNm de la quimioquina CXCL9, pensamos en la necesidad de realizar el \nsiguiente estudio con dos nuevos oligonucleótidos. Los resultados obtenidos ( Figura 9A ) \nmuestran claramente una equivalencia en las tres quimioquinas estudiadas, es decir, CXCL9, \nCXCL10 y CXCL11. Tiene lugar una disminución de la expresión de dichas quimioquinas en las \ndDSC respecto a las preDSC. \nUna vez estudiadas a nivel transcripcional, realizamos un análisis de los niveles de proteína en \nlos MC de preDSC y dDSC ( Figura 9B , 9C y 9D). Se encontró que hay una secreción más \nelevada de CXCL9 por ambos tipos de células que de CXCL10 y CXCL11; de hecho, en el caso \nde esta última quimioquina, lo s niveles de proteína son inferiores a 17 pg/mL en todas las \nmuestras estudiadas. Por otra parte, tal y como habíamos comprobado con el análisis de la \nexpresión del ARNm, en los tres casos tiene lugar un descenso significativo de la secreción \nproteica en las dDSC respecto a las preDSC . De esta manera, se pudo comprobar que la \ndecidualización de nuestras líneas de DSC inhibe la secreción de quimioquinas que atraen hacia \nla decidua a células T con actividad proabortígena. \n \n \nA \n\n\nRESULTADOS \n \n \n100 \n \n \n \nFigura 9: Efecto de la decidualización (8 días) en la expresión de citoquinas por preDSC y dDSC. A) \nSe muestra la expresión de CXCL9, CXCL10, CXCL11 y GAPDH por RT -PCR en tres líneas celulares (M1: \nmuestra 1; M2: muestra 2; M3: muestra 3) , tanto en preDSC ( -) com o en dDSC (+). Las células \ndecidualizadas fueron tratadas con P4 y AMPc durante 8 días. Como gen de expresión constitutiva se usó la \nGAPDH (“housekeeping gene”). Se muestran los niveles (pg/mL) de las quimioquinas CXCL9 (B), CXCL10 \n(C) y CXCL11 (D) secretadas por preDSC y dDSC al MC. Como Control (ausencia de proteína) se empleó el \nmedio de cultivo Opti -MEM. Las barras representan la media ± SD. Los experimentos se llevaron a cabo a \npartir de 4 muestras independientes y se realizaron triplicados de cada una de ellas . (*P < 0,05; ****P < \n0,0001). \n1.5.3. Expresión de factores angiogénicos por preDSC y dDSC \nAnteriormente, habíamos estudiado la expresión positiva en las líneas de preDSC de una serie \nde factores angiogénicos: ANGPT1, FGF2, HGF, PGF y VEGF ( Figura 4A ). A continuación, \npudimos comprobar que l a decidualización no modificó la expresión de los factores angiogénicos \nHGF, FGF2, AN GPT1 o VEGF en las dDSC, aunque la expresión de PGF sí se incrementó \nsignificativamente (Figura 10A y 10B). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA B \nB C D \n\n\nRESULTADOS \n \n \n101 \n \nFigura 10. Efecto de la decidualización en la expresión de factores angiogénicos. A) Se muestra la \nexpresión de los factores angiogénicos PGF, ANGPT1, HGF, FGF2 y VEGF por RT -PCR en una línea de \nDSC, tanto en preDSC como en dDSC. Las células decidualizadas fueron tratadas con P4 y AMPc durante \n14 días. B) Fold Change de los niveles de expresión de ARNm para cada factor. Los valores de intensidad \nde banda se normalizaron respecto a los obtenidos para el gen de e xpresión constitutiva ( “housekeeping \ngene”). Para obtener el Fold Change, los valores de intensidad de banda normalizados para dDSC se \nrelativizaron frente a los de preDSC. Los experimentos se realizaron a partir de 4 muestras independientes. \n(**P < 0,01). \n1.5.4. Efecto antitumoral de preDSC y dDSC \nActualmente hay numerosas investigaciones que aportan datos dispares sobre el efecto \nantitumoral que tienen las MSC. Se ha observado que, dependiendo del tipo de tumor, estas \ncélulas pueden estimular o inhibir el crecimiento de las células tumorales y la invasión a otros \ntejidos218. Por otra parte, hay estudios que señalan que MSC derivadas de la gelatina d e Wharton \n(Wharton’s jelly) del cordón umbilical secretan factores que inducen apoptosis en líneas tumorales \ny tienen propiedades inmunoreguladoras219,220,221. \nEs por esto que buscamos estudiar, mediante citometría de flujo, el efecto del MC de preDSC y \ndel MC de dDSC sobre la apoptosis en diferentes líneas celulares tumorales 214. Las células se \nincubaron con los MC durante 4 días. Se observó que el MC de dDSC inducía la apoptosis de \nmanera significativa (en comparación con el medio Control) en 4 líneas celulares tumorales, tales \ncomo A375 (melanoma), Raji (linfoma de células B), HeLa (adenocarcinoma cervical humano) y \nSKBR3 (adenocarcinoma de mama humano). La línea linfocítica tumoral Jurkat y la línea \nmonocítica tumoral THP -1 no se vieron afectadas. En la línea de carcinoma Cal33 también se \nobservó un aumento de la apoptosis con el MC de dDSC, pero este no fue estadísticamente \nsignificativo en comparación con el valor de apoptosis en el medio C ontrol. Por otra parte, tal \ncomo nuestro grupo había demos trado anteriormente103, el MC de dDSC indujo apoptosis sobre \npreDSC, pero el MC de preDSC no tuvo efecto. En relación al efecto sobre linfocitos, se observó \nque tanto el MC de preDSC como el MC de dDSC protegieron a los PBL en reposo de la \napoptosis espontánea 211. Los PBL activados no experimentaron apoptosis ni previamente a la \nincubación con los MC ni tras la incubación con estos ( Figura 11). En conjunto, estos resultados \nmuestran que los factores secretados por las dDS C inducen apoptosis en las líneas de pre DSC y \nen algunas líneas celulares tumorales; pero no tienen el mismo efecto en PBL, llegando incluso a \nproteger a los PBL en reposo de la apoptosis espontánea. \n \n \n \n \n \n \n \n \nCélulas apoptóticas (%)\npreDSC PBL-R PBL-A Jurkat Raji THP-1 A375 Cal33 HeLa SKBR3\n0\n20\n40\n60\n80\n100 Control\nMC preDSC\nMC dDSC\n****\n**** **\n**\n**\n****\n***\n*\n*\n***\n****\n****\n*\n**\n\n\nRESULTADOS \n \n \n102 \n \nFigura 11. Actividad antitumoral de los factores secretados por preDSC y dDSC. Se muestra el efecto \ndel medio Control (Opti-MEM) y de los medios condicionados de preDSC (MC preDSC) y dDSC (MC dDSC) \nen la apoptosis de PBL en reposo y activados, preDSC y 7 diferentes líneas tumorales (Jurkat, Raji, THP-1, \nA375, Cal33, HeLa y SKBR3). Las barras representan el porcentaje de células apoptóticas (media ± SD de \ncuatro determinaciones). Los experimentos se realizaron a partir de MC de 4 líneas diferentes de DSC. \n(*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n1.6. Actividad quimiotáctica de DSC \nLa decidua humana presenta un microambiente inmunitario único que favorece la implantación \ny el desarrollo del embrión semialogénico. En la decidua, las DSC desempeñan una función muy \nimportante en la tolera ncia inmunológica materno-fetal, a través de la secreción de quimioquinas \nque orquestan la actividad proliferativa y migratoria de las células inmunitarias hacia el tejido \ndecidual. La mayoría de estas quimioquinas son quimioatrayentes de macrófagos y célu las NK. \nEstas células, a su vez, regulan la invasión del trofoblasto y el progreso de la decidualización 12,222. \nSin embargo, en modelo murino se ha observado que las DSC inhiben la expresión de las \nquimioquinas que atraen células Th1 y Tc hacia la decidua 81 y nuestros resultados en células de \norigen humano también lo confirman ( Figura 8 y Figura 9). Es por esto que en la siguiente serie \nde experimentos investigamos el efecto de las DSC en la migración de células T activadas. \n1.6.1. Actividad quimiotáctica de DSC sobre células T obtenidas de sangre \nperiférica \n1.6.1.1. Fenotipo antigénico de PBL activados \nEn primer lugar, se determinó por citometría de flujo el fenotipo de los PBL obtenidos de la \nsangre periférica de diferentes donantes y activados in vitro con PHA y anti -CD28, a los que se \nañadió IL -2 como factor de crecimiento/proliferación. Los resultados muestran que los PBL \npresentan un perfil de linfocitos activados CXCR3+ (>95%) , que incluye células T (>95% CD45+, \n>90% CD3+, CD14 -, CD19 -), con subpobl aciones de células Th1 CD4+ (20 -41%), células Tc \nCD8+ (46-65%) y células NK CD56+ (6-14%) (Figura 12). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA \n\n\nRESULTADOS \n \n \n103 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 12. Perfil fenotípico de PBL activados. A) Análisis por citometría de flujo del fenotipo antigénico de \nPBL activados in vitro con PHA+anti-CD28 y mantenidos durante 6 días con IL -2 (citogramas de un \nexperimento representativo). Se muestra la doble expresión de CD3/CXCR3, CD4/CXCR3, CD8/CXCR3 y \nCD56/CXCR3. B) Expresión de los antígenos CD45, CD14, CD19, CD56, CD3, CD4, CD8 y CXCR3 en PBL \nactivados. Las barras representan la media del porcentaje de células que expresan cada antígeno ± SD. Los \nexperimentos se llevaron a cabo con linfocitos de 6 donantes sanas diferentes. \n1.6.1.2. Quimiotaxis de PBL activados debida a los factores secretados por \nDSC \nA continuación, estudiamos la migración, en cámara Transwell y durante 24 horas, de los PBL \nactivados en respuesta a la exposición a los MC de preDSC y dDSC que contienen los factores \nsecretados por estas células. \nLos resultados obtenidos mostraron que el MC de preDSC incrementa significativamente la \nmigración de PBL activados en comparación con el medio Control (Opti -MEM), pero el MC de \ndDSC inhibe de forma significativa la migración. Además, se observó una migraci ón muy baja de \nlos PBL no activados, siendo inferior a un 10% en todos los medios, y sin diferencias significativas \nentre los MC y el Control (Figura 13A). \nSabiendo que el MC de preDSC incrementa la migración de PBL activados y que las preDSC \nexpresan CX CL9, CXCL10 y CXCL11 ( Figura 9 ); investigamos el efecto del bloqueo de la \nactividad quimiotáctica de las preDSC , con el objetivo de demostrar que efectivamente estas \nquimioquinas son las responsables del efecto quimioatrayente de las preDSC. \nEl bloqueo de la actividad quimiotáctica del MC de preDSC se llevó a cabo usando un \nanticuerpo monoclonal que reconoce el receptor CXCR3 (receptor de quimi oquinas CXCL9, \nCXCL10 y CXCL11). La exposición mantenida de los PBL con el anticuerpo bloqueante a dosis \ncrecientes resultó en una disminución de la migración de los linfocitos T activados y expuesto s al \nMC de preDSC, demostrando así que CXCL9, CXCL10 y CXCL11 son responsables de esta \nactividad quimioatrayente (Figura 13B). \nNo obstante, la menor expresión de CXCL9, CXCL10 y CXCL11 en dDSC no explica la \ninhibición significativa de la migración de PBL activados inducida por el MC de dDSC; ya que el \nefecto de esta disminución de la expresión de quimioquinas por sí sola implicaría una migración \nB \n\n\nRESULTADOS \n \n \n104 \n \nsimilar a la que se obtiene en el medio C ontrol y no significativamente menor, como observamos \nen nuestros resultados (Figuras 13A y 13B). Esta inhibición de la migración, es decir, m enor a la \nobtenida en el medio C ontrol, sugiere, por tanto, que además de inhibir la expresión de las \nquimioquinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11, las dDSC secretan uno o más factores que son \ncapaces de inhibir activamente la migración de linfocitos T activados, es decir, factores inhibidores \nde la quimiotaxis de células T (T cell chemotaxis-inhibiting factors, TCIF). \nA continua ción, buscamos describir la naturaleza y propiedades de dicho factor o factores \ninhibidores de la migración. Para ello, en primer lugar , se sometió el MC de preDSC y de dDSC a \nun tratamiento térmico. Se observó que el calentamiento del MC de dDSC a 60 °C durante 45 \nminutos no afectó a su capacidad de inhibir la actividad migratoria de PBL activados; mientras que \nel calentamiento sí redujo el efecto activador de la migraci ón del MC de preDSC, probablemente \ndebido a la desnaturalización de las proteínas CXCL9, CXCL10 y CXL11 ( Figura 13C ). Este \nresultado indica que el TCIF es termoestable, mientras que los factores que activan la migración \nde células T son termolábiles. \nSeguidamente, para poder definir el tamaño del factor que buscamos, se llevaron a cabo \nexperimentos de diálisis del MC de preDSC y el MC de dDSC. Esta se realizó en membranas que \npermitían el paso de moléculas con un peso molecular menor de 6000 -8000 Da ( MWCO 6000-\n8000 Da). En estos experimentos se observó que la actividad migratoria con el MC de preDSC \ndializado se mantenía, no había diferencias significativas en comparación con el medio no \ndializado. Esto es debido a que el peso molecular de las quimioquinas CXCL9, CXCL10 y \nCXCL11223,224 es superior a 8000 Da. No obstante, la actividad inhibitoria del MC de dDSC \ndializado se perdió , indicando que el peso molecular de TCIF es inferior al MWCO de la \nmembrana de diálisis (Figura 13D). \nPor todo esto, nuestros resultados indican qu e las preDSC secretan las quimioquinas CXCL9, \nCXCL10 y CXCL11 que atraen a los linfocitos T activados. Dichos factores son termolábiles y \ntienen un peso molecular superior a los 8000 Da 223,224. Por su parte las dDSC secretan factores \nque inhiben activamente la migración de linfocitos T activados. Estos factores son termoestables y \npresentan un peso molecular inferior a 6000 Da225. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n105 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA \nB \nC D \n\n\nRESULTADOS \n \n \n106 \n \nFigura 13. Efecto de la decidualización en la actividad quimiotáctica de DSC humanas sobre PBL \nactivados. A) Efecto del medio Control (Opti-MEM) y el MC de preDSC y dDSC en la migración de PBL no \nactivados y activados durante 24 horas en Cámara Transwell. Las barras representan la media del \nporcentaje de migración de PBL ± SD de 10 determinaciones independient es. Las muestras de sangre \nperiférica se obtuvieron de 5 donantes sanas y se emplearon 10 líneas de DSC para obtener los MC. B) \nBloqueo de la actividad quimiotáctica del medio Control y el MC de preDSC y dDSC , y efecto en la \nmigración de PBL activados dura nte 24 horas en Cámara Transwell. Los PBL se incubaron con distintas \ndosis de un anticuerpo monoclonal anti -CXCR3 (1,25 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL). C) Efecto del \ncalentamiento, a 60°C durante 45 minutos, del medio Control y el MC de preDSC y dDSC en la migración de \nPBL activados durante 24 horas en Cámara Transwell. D) Efecto de la diálisis del medio Control y el MC de \npreDSC y dDSC en la migración de PBL activados durante 24 horas en Cámara Transwell. La diálisis se \nllevó a cabo en membranas con un MWCO de 6000-8000 Da. Los medios se dializaron frente a medio Opti-\nMEM (sin FBS) durante 24 horas a 4 °C y en agitación. En los apartados B, C y D las barras representan la \nmedia del porcentaje de migración de PBL ± SD de 3 determinaciones independientes. Las muestras de \nsangre periférica se obtuvieron de 3 donantes sanas y se emplearon 3 líneas de DSC para obtener los MC \nde preDSC y dDSC. El MC de dDSC se obtiene de células decidualizadas durante 8 días en todos los \nexperimentos. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n \n1.6.1.3. Efecto de los MC de DSC sobre la quimiotaxis de las subpoblaciones \nde PBL activados \nTras estudiar el efecto de la decidualización de las DSC en la quimiotaxis de PBL activados, \nanalizamos por PCR y citometría de flujo el perfil fenotípico de las células quimioatraídas. Los \nresultados mostraron que el MC de dDSC disminuye significativamente la expresión de las \ncitoquinas proinflamatorias IFN-γ y TNF-α en PBL activados ( Figuras 14A y 14B). Por otra parte, \nel análisis de las subpoblaciones de linfocitos activados, que han experimentado quimiotaxis tras \nla exposición a los MC, mostró que el efecto activador de la migración del MC de preDSC y el \nefecto inhibidor de la migración del M C de dDSC afectaron a las células Th1 \n(CD3+/CD4+/CXCR3+) y Tc (CD3+/CD8+/CXCR3+), pero no tuvieron un efecto significativo sobre \ncélulas NK activadas (CD56+/CXCR3+) (Figura 14C). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n107 \n \n \n \nFigura 14. Estudio del fenotipo antigénico de los PBL quimioatraídos. A) Efecto de los MC en la \nexpresión de IFN -γ y TNF -α por PBL activados que han experimentado quimiotaxis. Se representa el \nresultado obtenido del estudio por qPCR. Los valores de CT (“cycle treshold”) para cada muestra se \nnormalizaron respecto a los obtenidos para el gen control de expresión constitutiva GAPDH (“housekeeping \ngene”). Los valores normalizados correspondientes a los PBL activados que han migrado en los MC , se \nrelativizaron frente a los valores obtenidos para los PBL activados que han migrado en el medio Control. El \nresultado se expresó como Fold Change. B) Se muestra la expresión de IFN -γ, TNF-α y GAPDH por RT -\nPCR en PBL activados antes de la exposición a los medios (AM: antes de migrar); y en PBL activados que \nhan sido quimioatraídos por el medio Control y el MC de preDSC y dDSC (2 líneas de DSC). C) Efecto \nquimiotáctico de los MC sobre las diferentes subpoblaciones de linfocitos activados. Las barras sombreadas \nrepresentan el número de células positivas pa ra cada marcador antes de la exposición a los medios (AM: \nantes de migrar). Las barras no sombreadas representan el número de células positivas para cada \nmarcador tras la migración. Las subpoblaciones linfocitarias estudiadas son positivas para los siguien tes \nantígenos respectivamente: CD3+ /CXCR3+, CD4+ /CXCR3+, CD8+ /CXCR3+, CD56+ /CXCR3+. En los \napartados A y C, las barras representan la media ± SD de 3 determinaciones independientes. Las muestras \nde sangre periférica se obtuvieron de 3 donantes sanas y se e mplearon 3 líneas de DSC para ob tener los \nMC de preDSC y dDSC. Todos l os experimentos se realizaron por triplicado. Para la obtención del MC de \ndDSC, l as células fueron tratadas con P4 y AMPc durante 8 días. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; \n****P < 0,0001). \nA B \nC \n\n\nRESULTADOS \n \n \n108 \n \n1.6.2. Actividad quimiotáctica de DSC sobre las líneas tumorales Jurkat y \nTHP-1 \nParalelamente, se estudió el efecto de los MC de preDSC y dDSC sobre dos líneas tumorales: \nla línea linfocítica Jurkat (células Th) y la línea monocítica THP -1. El objetivo de dichos \nexperimentos fue comprobar si el efecto activador de la migración del MC de preDSC y el efecto \ninhibidor del MC de dDSC se mantenían, es decir, si eran o no específicos para células T \nactivadas. \nSe observó que el MC de preDSC incrementaba significativamente la migración de células \nTHP-1 (Figura 15B), pero no de células Jurkat (Figura 15A). La menor eficacia migratoria de esta \nlínea linfocítica tumoral en comparación con los PBL activados ( Figura 13A) se explica por la \nmenor expresión del receptor de quimioquinas CXCR3 (Figura 15C). No obstante, el MC de dDSC \ntambién inhibió la migración de células Jurkat (Figura 15A ), mientras que la migración se \nincrementó en la línea THP -1 (Figura 15B ). Esto confirma que la decidualiz ación aumenta la \nsecreción en las DSC de factores quimiotácticos para monocitos. Además, los resultados señalan \nque los factores inhibidores pueden ser específicos de células T activadas. \n \nFigura 15. Efecto quimiotáctico de los MC de preDSC y dDSC en las líneas tumorales Jurkat y THP-1. \nEfecto del medio Control (Opti-MEM) y el MC de preDSC y dDSC en la migración de células Jurkat (A) y de \ncélulas THP-1 (B) durante 24 horas en Cámara Transwell. Las barras representan la media del porcentaje \nde m igración celular ± SD de 5 determinaciones independientes. Se emplearon 5 líneas de DSC para \nA B \nC \n\n\nRESULTADOS \n \n \n109 \n \nobtener los MC de preDSC y dDSC. Los experimentos se realizaron por triplicado . El MC de dDSC se \nobtiene de células decidualizadas durante 8 días. C) Análisis por citometría de flujo del fenotipo antigénico \nde PBL activados y células Jurkat (citogramas de un experimento representativo). Se muestra el \ncorrespondiente isotipo y la doble expresión de CD3/CXCR3. (*P < 0,05; **P < 0,0 1; ***P < 0,001; ****P < \n0,0001). \n \n2. Células endometriales estromales humanas \n2.1. Características generales de las EnSC \nEl segundo tipo de células objeto de estudio en nuestro trabajo son las células endometriales \nestromales o EnSC, obtenidas a partir de sangre menstrual. Se establecieron líneas de EnSC con \nlas que, al igual que con DSC, se realizó una caracterización morfológica de la población y se \nestudió su capacidad de decidualización 213. Como las preDSC , l as preEnSC presentaron una \nmorfología de tipo fibroblástico y crecieron de forma adherente. Tras la decidualización, se apreció \nun cambio hacia una morfología más redondeada en las EnSC decidualizadas (dEnSC), las \ncuales secretaron PRL. No se detectó PRL en los cultivos sin P4 y AMPc (Figura 16A). \nEl análisis del fenotipo antigénico, por citometría de flujo, de preEnSC mostró que más del 95% \nde células expresaban los marcadores CD9, CD10, CD13, CD2 9, CD44, CD73, CD90, α -SMA, \nnestina y podoplanina; por otra parte, se vio ausencia de expresión de los marcadores CD15, \nCD19, CD31, CD34, CD45, CD62P, citoqueratina y HLA -DR (Figura 16B) (Tabla 15). Los datos \nobtenidos confirman la pureza del cultivo de preEnSC y la ausencia de células de origen \nhematopoyético. \n \n \n \n \n \n \n \n \nA \n\n\nRESULTADOS \n \n \n110 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 16. Características generales de líneas de preEnSC. A) Decidualización de preEnSC. Tras 14 \ndías en cultivo con P4 y AMPc, las preEnSC no diferenciadas cambian su morfología fibroblástica a una \nredondeada y secretan PRL. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de aumento de 4x. Las barras \nrepresentan el porcentaje de células redondeadas tras la cuantificación de áreas representativas (n = 3 por \nmuestra) con ImageJ y la secreción de PRL, por tres líneas de preEnSC (media ± SD). B) Análisis del \nfenotipo antigénico de una línea de preEnSC por citometría de flujo (citogramas de un experimento \nrepresentativo). El estudio se realizó en tres muestras independientes. (*P < 0,05; ****P < 0,0001). \nTabla 15. Expresión de antígenos, determinada por citometría de flujo, en líneas de preEnSC y MSC \nde médula ósea obtenidas en las mismas condiciones. ND: no determinado; aNegrita: antígenos \nasociados a pericitos. \n% Células positivas \nAntígeno MSC (n=7) preEnSC (n=10) \nCD9 ND >95 \nCD10 >95 >95 \nCD13a >95 >95 \nCD15 <1 <1 \nCD19 <1 <1 \nCD29 >95 >95 \nCD31 <1 <1 \nCD34 <1 <1 \nCD44a >95 >95 \nCD45 <1 <1 \nCD54 45-69 75-87 \nCD62P <1 <1 \nCD73 >95 >95 \nCD80 ND 5-33 \nCD86 ND 10-22 \nCD90a >95 >95 \nCD105a >95 58-98 \nCD106a 0-10 0-22 \nCD140ba ND 30-92 \nCD146a 68-75 48-95 \nCD271a 0-8 ND \nAPa ND ND \nα-SMAa >95 74-99 \nBAFF <1 72-84 \nCXCL12 ND 30-46 \nCXCL13 <1 18-33 \nCitoqueratina ND <1 \nHLA-DR <1 <1 \nHLA-G <1 0-18 \nB \n\n\nRESULTADOS \n \n \n111 \n \n \n \n \n \n \n \n2.2. Fenotipo antigénico compatible con MSC de médula ósea \nTras analizar el fenotipo de las líneas de preEnSC obtenidas de sangre menstrual y con el \nobjetivo de determinar si estas células derivan también de células madre mesenquimales, nos \ncentramos en comparar el perfil de expresión de marcadores de las líneas d e preEnSC con el de \nMSC (Tabla 15). \nDicho análisis confirmó que ambos tipos de células presentan un fenotipo equiva lente. Más del \n95% de l as células de las líneas de preEn SC y MSC expresaban CD10, CD13, CD29, CD44, \nCD73, CD90 y podoplanina; al igual que las MSC, un elevado porcentaje de preEnSC expresaban \nα-SMA y nestina. Además, se vio ausencia de expresión de los ma rcadores CD15, CD19, CD31, \nCD34, CD45, CD62P y HLA-DR. Las preEnSC expresaron también el antígeno STRO -1 que es \ncaracterístico de precursores estromales de médula ósea. No obstante, aunque en las MSC había \nausencia de expresión de BAFF y CXCL13, las preEnS C sí expresaron estos antígenos. Las \nlíneas de preEnSC fueron positivas para los m arcadores de eMSC CD140b, C D146 y SUSD2 \n(Tabla 15). \n \n3. Diferencias entre DSC y EnSC \n3.1. Marcadores y funciones asociadas a la decidualización \nLas EnSC son equivalentes a las DSC en endometrio no gestante; es decir, son el mismo tipo \nde célula, pero en un contexto fisiológico diferente (EnSC en endometrio no gestante y DSC en \nendometrio gestante). Es previsible que las diferencias presentes en dicho contexto fisiológico \nafecten a su fenotipo y funciones213,216. \nPartiendo de la base de que tanto las líneas de preDSC como de preEnSC pueden \ndiferenciarse in vitro tal como lo hacen in vivo, se comparó su capacidad para decidualizarse en \nrespuesta a l cultivo con P4 y AMPc 213. Los resultados mostraron que ambos tipos de células \ncambian su aspecto fibrobl ástico por una morfología más redondeada; no obstante, el porcentaje \nde células redondeadas es significativamente mayor en DSC decidualizadas (dDSC) ( Figura \n17A). Además, las dDSC secretaron significativamente más PRL que las EnSC decidualizadas \n(dEnSC) (Figura 17B). Otras propiedades asociadas al proceso de decidualización, tales como la \nproducción de IL-15 y la muerte celular por apoptosis, también fueron significativamente mayores \nen las dDSC que en las dEnSC (Figuras 17C y 17D). Incluso, tras la incubación prolongada en el \ntiempo con P4 y AMPc, las dEnSC no alcanzaron el nivel de producción de PRL y de apoptosis \nobservados en las dDSC (Figuras 17B y 17D). \n \nMFG-E8a ND 26-33 \nNestinaa >95 20-95 \nOCT3/4 42-52 ND \nPodoplanina >95 >95 \nSTRO-1a 7-48 14-21 \nVimentinaa ND ND \nSUSD2 21-35 34-79 \n\n\nRESULTADOS \n \n \n112 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 17. Análisis comparativo de la respuesta a la decidualización en EnSC y DSC . A) Cambios \nmorfológicos en preEnSC y preDSC cultivadas con P4 y AMPc durante 7 días. Las barras muestran el \nporcentaje de células redondeadas tras la cuantificación de áreas representativas (n = 3 por muestra) con \nImageJ. B) Evolución temporal de la secreción de PRL por preEnSC y preDSC tras la incubación con P4 y \nAMPc. La producción de PRL por células no decidualizadas fue 0 en todos los puntos temporales (datos no \nmostrados). C) Secreción de IL-15 por preEnSC y preDSC tras 7 días en cultivo con P4 y AMPc y sin dichos \nfactores. D) Inducción de apoptosis en res puesta a la decidualización prolongada durante 28 días. Las \ncélulas apoptóticas sub-G1 se analizaron cada 7 días. Las barras de error muestran la media ± SD de cinco \n(B y D) y tres (A y C) experimentos independientes con diferentes líneas celulares. (*P < 0,05; **P < 0,01; \n***P < 0,001). \n3.2. Expresión de proteínas relacionadas con la decidualización \nLos receptores nucleares de la progesteron a (PR) y la PKA desempeñan una función clave en \nel proceso de decidualización. El receptor de la progesterona tiene dos isoformas (PR-A y PR-B), \nmientras que la PKA es un complejo enzimático formado por dos subunidades reguladoras (R) y \ndos subunidades catalíticas (C); existen tres subunidades C distintas (Cα/β/γ) y cuatro \nsubunidades R (RIα/β y RIIα/β)226. \nEstudios previos muestran que las EnSC expresan las subunidades Cα y Cβ, así como las \ncuatro subunidades reguladoras de la PKA, aunque la expresión de la isoforma RIα es mayor que \nel resto36,227. \nA B \nC D \n\n\nRESULTADOS \n \n \n113 \n \nEn base a ello, se comparó la expresión de PR y PKA entre preEnSC y preDSC 213. Los \nresultados muestran que ambos tipos de células expresan niveles basales similares de las dos \nisoformas de PR y de las subunidades catalítica (Cα/β/γ) y reguladora RIα/β de la P KA. Además, \nla expresión de la subunidad reguladora de la PKA y de la isoforma PR -A aumentó tras la \ndecidualización en ambos tipos celulares. Se observó que dicho incremento de la expresión de la \nPKA RIα/β fue significativamente mayor en las dDSC que en la s dEnSC ( Figura 18A ). Estos \nresultados se confirmaron mediante un análisis de la expresión de la PKA RIα/β en respuesta a la \ndecidualización durante 14 días (Figura 18B). \nPor otra parte, se analizaron las posibles diferencias en las rutas de señalización en respuesta \na la decidualización , mediante el estudio de la expresión del factor de transcripción FOXO1. Los \nresultados mostraron que la incubación con P4 y AMPc indujo la expresión de FOXO1 en las \npreEnSC y preDSC, pero sin diferencias significativas entre ambos tipos celulares (Figura 18A). \n \n \nFigura 18. Expresión de PR, PKA y FOXO1 en respuesta a la decidualización. (A) preEnSC y preDSC \nse incubaron con P4 y AMPc durante 10 días. La expresión de las isoformas de PR, las subunidades de la \nPKA catalítica (Cα/β/γ) y reguladora (RIα/β) , y FOXO1 fue analizada por Western Blot. (B) Se estudió la \nexpresión de PKA RIα/β mediante Western Blot en preEnSC y preDSC tras la incubación durante 7, 10 y 14 \ndías con P4+ AMPc. α -tubulina y β -actina se utilizaron como controles de carga. En los paneles de la \nizquierda se muestra un experimento representativo en cada caso. Los gráficos de barras mues tran la \nexpresión relativa de PR-A (A), PKA RIα/β (A, B) y FOXO1 (A) tras el análisis de la intensidad de banda de \nA \nB \n\n\nRESULTADOS \n \n \n114 \n \ntres experimentos de Western Blot con tres líneas diferentes de EnSC y DSC (paneles de la derecha). \n(*P < 0,05; **P < 0,01). \n3.3. Comparación del fenotipo antigénico de preDSC y preEnSC \nTal como se ha detallado anteriormente, nuestras líneas de preDSC y preEnSC presentan un \nfenotipo antigénico compatible con el de MSC de médula ósea y expresan antígenos de células \nperivasculares. Partiendo de esta base, realizamos un estudio comparativo del fenotipo antigénico \nde las preDSC y las preEnSC (Figura 19), con el objetivo de poder demostrar la estrecha relación \nque existe entre ambos tipos celulares a nivel de su perfil fenotípico. \n Los resultados muestran que no hay diferencias significativas en la expresión de los \nmarcadores de MSC CD10, CD29, CD44, CD73, CD105 y podoplanina. Tampoco encontramos \ndiferencias al comparar la expresión de marcadores de pericitos como CD105, CD140b, CD146, \nSUSD2, MFG-E8, nestina y STRO -1 (Figura 19). Estos resultados confirman que las preDSC y \nlas preEnSC tienen un fenotipo antigénico equivalente y se encuentran en una localización \nperivascular, tanto en el endometrio no gestante (preEnSC) como en el endometrio gestant e \n(preDSC). \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n115 \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n116 \n \n3.4. Expresión y secreción de quimioquinas por DSC y EnSC \nCon el objetivo de seguir realizando un análisis comparativo entre DSC y EnSC, analizamos la \nexpresión y secreción en las EnSC de las quimioquinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11, responsables \nde la atracción de linfocitos activados al endometrio y a la decidua. \nLos resultados obtenidos muestran que, con la decidualización de las preEnSC, tiene lugar una \ndisminución de la expresión del ARNm de CXCL9 y CXCL11; no obstante, la expresión de \nCXCL10 se incrementa en las dEnSC (Figura 20A). \nTras el análisis transcripcional, realizamos un estudio de los niveles de proteína en los MC de \npreEnSC y dEnSC ( Figuras 20B, 20C y 20D). Nuevamente, como en las DSC, se encontró que \nhay una secreción más elevada de CXCL9 que de CXCL10 y CXCL11. Por otra parte, como en las \ndDSC, y tal y como habíamos comprobado con el análisis de la expresión del ARNm, en todas las \nmuestras de dEnSC tiene lugar un descenso significativo de la secreción de CXCL9 respecto a las \npreEnSC. No obstante, al contrario que con las DSC, la decidualización de las preEnSC induce \nuna mayor secreción de CXCL10. En cuanto a CXCL11, encontramos niveles muy bajos \n(inferiores a 3 pg/mL) en DSC y EnSC. Al comparar los niveles de cada quimioquina en el MC de \npreDSC y preEnSC, comprobamos que la secreción proteica es significativamente mayor en las \npreDSC, resultado que confirma la importante actividad quimiotáctica de estas células en su \nlocalización alrededor de los vasos sanguíneos. \n \n \nA \nB C D \n\n\nRESULTADOS \n \n \n117 \n \nFigura 20. Comparación del efecto de la decidualización en la expresión de citoquinas por DSC y \nEnSC. A) Se muestra la expresión de CXCL9, CXCL10, CXCL11 y GAPDH por RT -PCR en tres líneas \ncelulares, tanto en preDSC y preEnSC ( -), como en dDSC y dE nSC (+). Las células decidualizadas fueron \ntratadas con P4 y AMPc durante 8 días. Como gen de expresión constitutiva se usó la GAPDH \n(“housekeeping gene”). Se muestran los niveles (pg/mL) de las quimioquinas CXCL9 (B), CXCL10 (C) y \nCXCL11 (D) secretadas por DSC y EnSC al MC. Como Control (ausencia de proteína) se empleó el medio \nde cultivo Opti-MEM. Las barras representan la media ± SD. Los experimentos se llevaron a cabo a partir de \n4 muestras independientes y se realizaron triplicados de cada una de ellas . (*P < 0,05; ***P < 0,00 1; \n****P < 0,0001). \n3.5. Actividad quimiotáctica de DSC y EnSC sobre células T \nobtenidas de sangre periférica \nLos resultados explicados en el apartado anterior están estrechamente relacionados con la \nquimiotaxis de células sanguíneas, al estar en contacto con los factores secretados por las células \nestromales uterinas. Es por esto que continuamos el análisis comparativo de la ac tividad \nquimiotáctica de las DSC y las EnSC, evaluando la migración de PBL activados en los MC de \nestas células. \nNuestros datos muestran que, al igual que en las preDSC ( Figura 13A), el MC de preEn SC \nincrementa significativamente la migración de PBL activados en comparación con el medio Control \n(Opti-MEM); pero el MC de dEn SC inhibe de forma significativa la migración (Figura 21). Por otra \nparte, la menor secreción de CXCL9, CXCL10 y CXL11 en las preEnSC respecto a las preDSC \n(Figuras 20B, 20C y 20D) está directamente relacionada con la significativamente menor \nmigración linfocitaria observada en el MC de preEnSC al comparar con el MC de preDSC (Figura \n21). \nFigura 21. Comparación de la actividad quimiotáctica de DSC y EnSC sobre PBL activados. Efecto del \nmedio Control (Opti-MEM) y el MC de preDSC, dDSC, preEnSC y dEnSC en la migración de PBL activados \ndurante 24 horas en Cámara Transwell. Las barras representan la media del porcentaje de migración de \nPBL activados ± SD de 10 (DSC) y 6 (EnSC) det erminaciones independientes. En los experimentos con \nDSC, las muestras de sangre periférica se obtuvieron de 5 donantes sanas y se emplearon 10 líneas de \nDSC para obtener los MC. En los experimentos con EnSC, las muestras de sangre periférica se obtuvieron \n\n\nRESULTADOS \n \n \n118 \n \nde 3 donantes sanas y se emplearon 6 líneas de EnSC para obtener los MC. El MC de dDSC y dEnSC se \nobtiene de células decidualizadas durante 8 días en todos los experimentos. (*P < 0,05; ***P < 0,00 1; \n****P < 0,0001). \n \n4. Endometriosis \n4.1. Características generales de las eEnSC \nTras caracterizar fenotípica y funcionalmente las células estromales obtenidas del endometrio y \nla decidua humanas , y realizar un análisis comparativo de ambos tipos celulares, nos \nconcentramos en el estudio de una condición patológica, la endometriosis. \nEl tercer tipo de células que hemos estudiado en nuestro trabajo son las eEnSC, obtenidas a \npartir de endometriomas ováricos. Se establecieron líneas de eEnSC con las que, al igual que en \nlas DSC y las EnSC, se realizó una caracteri zación morfológica de la población celular y se \nestudió la capacidad de estas células para decidualizarse in vitro. \nComo las preDSC y las preEnSC, las preeEnSC presentan una morfología alargada y \nfibroblástica, y crecen de forma adherente ( Figura 22A). Con el fin de estudiar la capacidad de \ndecidualización de las preeEnSC, se trataron las líneas celulares con P4 y AMPc durante 14 días. \nTal y como nuestro grupo de investigación había demostrado anteriormente 204, nuestras líneas de \npreeEnSC, tras el proceso de decidualización, apenas alteraron su morfología fibroblástica, \nobservándose un bajo porcentaje de células redondeadas. Por otra parte, n o se detectó PRL en \nlos cultivos sin P4 y AMPc ; no obstante, al añadir estos factores al medio de cultivo, se induce la \nsecreción de PRL (Figura 22A ), aunque los niveles son más bajos que los observados \nanteriormente en dDSC y dEnSC ( Figuras 1A y 16A). Por lo tanto, los resultados obtenidos \nprueban la menor capacidad de nuestras líneas de preeEnSC para sufrir cam bios de morfología y \nexpresar PRL en respuesta a la decidualización. \nDe nuevo se analizó, por citometría de flujo, el fenotipo antigénico de las preeEnSC aisladas. El \nresultado del estudio de 20 antígenos mostró que más del 95% de células expresaban los \nbiomarcadores propios de MSC CD10, CD29, CD44, CD73 y CD90. Las células no expresaron \nCD31, CD34, CD45 y tampoco citoqueratina. Las líneas de pre eEnSC también expresaron lo s \nmarcadores de eMSC CD140b, CD146 y SUSD2 (Figura 22B) (Tabla 16). Los datos obtenidos \nconfirman la pureza del cultivo de preeEnSC y la ausencia de células de origen hematopoyético. \n \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n119 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 22. Características generales de líneas de preeEnSC. A) Decidualización de preeEnSC. Tras 14 \ndías en cultivo con P4 y AMPc, las pre eEnSC no presentan un cambio significativo de morfología \nfibroblástica a una redondeada, pero sí secretan PRL. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de \naumento de 4x. Las barras representan el porcentaje de células redondeadas tras la cuantificación de áreas \nrepresentativas (n = 3 por muestra) con ImageJ y la secreción de PRL, por tres líneas de preeEnSC (media \n± SD). B) Análisis del fenotipo antigénico de una línea de pre eEnSC por citometría de flujo (citogramas de \nun experimento representativo). El estudio se realizó en tres muestras independientes. (**P < 0,01). \n \n \n \n \n \nB \nA \n\n\nRESULTADOS \n \n \n120 \n \nTabla 16. Expresión de antígenos, determinada por citometría de flujo, en líneas de preeEnSC y MSC \nde médula ósea obtenidas en las mismas condiciones. ND: no determinado; aNegrita: antígenos \nasociados a pericitos. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4.2. Fenotipo compatible con MSC de médula ósea \nLa caracterización fenotípica de las preeEnSC nos permitió evaluar y confirmar la existencia de \nun perfil de expresión de antígenos equivalente a l de MSC de médula ósea ( Tabla 16), al igual \nque en los dos tipos celulares estudiados anteriormente (Tabla 13 y Tabla 15). \nTal y como se ha explicado anteriormente, e l análisis mostró que más de l 95% de las \npreeEnSC expresaban los biomarcadores característicos de MSC. No obstante, la expresión de \nlos marcadores de pericitos CD105, α-SMA y nestina mostró variabilidad entre las distintas \nmuestras estudiadas y fue ligeramente menor que en las MSC; así como también presentó cierto \ngrado de variabilidad la expresión de la podoplanina. Las preeEnSC mostraron una menor \nexpresión del antígeno STRO -1, característico de precursores estromales de médula ósea. \nFinalmente, l as líneas de pre eEnSC también expresaron los m arcadores de eMSC CD140b, \nCD146 y SUSD2, aunque también obtuvimos variabilidad entre las distintas muestras. \n \n \n % Células positivas \nAntígeno MSC (n=7) preeEnSC (n=10) \nCD10 >95 >95 \nCD29 >95 >95 \nCD31 <1 <1 \nCD34 <1 <1 \nCD44a >95 >95 \nCD45 <1 <1 \nCD73 >95 >95 \nCD90a >95 >95 \nCD105a >95 25-99 \nCD140ba ND 0-39 \nCD146a 68-75 30-97 \nSUSD2 21-35 13-85 \nα-SMAa >95 57-99 \nCitoqueratina ND <1 \nHLA-G <1 0-18 \nMFG-E8a ND 1-33 \nNestinaa >95 10-97 \nPodoplanina >95 30-97 \nSTRO-1a 7-48 0-12 \nCXCL12 ND 0-37 \n\n\nRESULTADOS \n \n \n121 \n \n5. Diferencias entre EnSC y eEnSC \n5.1. Marcadores y funciones asociadas a la decidualización \nEl efecto en el fenotipo y funciones celulares que tiene el proceso de decidualización ha sido \nextensamente estudiado en esta tesis, es por esto que decidimos evaluar la capacid ad de \ndecidualización de las preeEnSC y compararla con la de las preEnSC, que nos sirven de control \n(modelo no patológico). \nLos resultados obtenidos muestran que, tras 7 días de tratamiento, las preeEnSC a penas \nalteraron su morfología al visualizarlas al microscopio. Tras cuantificar el número de células \nredondeadas antes y después de la decidualización en ambos tipos celulares, obtenemos un \nporcentaje de células redondeadas significativamente menor en las deEnSC que en las dEnSC \n(Figura 23A ). Por otro lado, se analizó comparativa mente la secreción de PRL al MC . La \nconcentración de PRL fue medida cada 7 días y expresada en ng por cada 10 6 células. Los datos \nponen de manifiesto que las preEnSC son más sensibles al tratamiento con P4 y AMPc que las \npreeEnSC, ya que los niveles de PRL son significativamente más elevados a los 14, 21 y 28 días \nde tratamiento (Figura 23B ). Además, también evalua mos cada 7 días la sensibilidad de las \ndiferentes líneas a la apoptosis inducida por la decidualización y pudimos comprobar que las \npreeEnSC son resistentes al proceso de muerte celular ( Figura 23C ). Este resultado era \nesperable, debido a la mayor expresión de proteínas antiapoptóticas en estas células. \nTodos estos resultados demuestran la menor capacidad de las células estromales procedentes \nde los focos ectópicos de endometriosis para experimentar cambios de morfología, apoptosis y \nsecretar PRL en respue sta a la decidualización . De manera que podemos concluir que las \npreeEnSC son más resistentes a dicho proceso que las preEnSC. \n \n \n \n \n \n \n \nA B \n\n\nRESULTADOS \n \n \n122 \n \n \n \nFigura 23. Análisis comparativo de los efectos de la decidualización en las preEnSC y preeEnSC. A) \nCambios morfológicos en preEnSC y pre eEnSC cultivadas con P4 y AMPc durante 7 días. Las barras \nmuestran el porcentaje de células redondeadas tras la cuantificación de áreas representativas (n = 3 por \nmuestra) con ImageJ. B) Evolución temporal de la secreci ón de PRL por preEnSC y pre eEnSC tras la \nincubación con P4 y AMPc. La producción de PRL por células no decidualizadas fue 0 en todos los puntos \ntemporales (datos no mostrados). C) Inducción de apoptosis en respuesta a la decid ualización prolongada \ndurante 21 días. Las células apoptóticas sub-G1 se analizaron cada 7 días. Las barras de error muestran la \nmedia ± SD de tres experimentos independientes con diferentes líneas celulares. (*P < 0,05; **P < 0,01; \n***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n5.2. Comparación del fenotipo antigénico de preEnSC y preeEnSC \nContinuamos la caracterización de las células procedentes de endometriomas ováricos \nestudiando comparativamente el fenotipo antigénico de estas células en relación a las preEnSC. \n Los resultados muestran ( Figura 24) que no hay diferencias significativas en la expresión de \nlos marcadores de MSC CD10, CD29, CD44, CD73 y α-SMA. No obstante, sí encontramos \ndiferencias al comparar la expresión de algunos marcadores de pericitos. Concretamente, la \nexpresión de CD 140b, SUSD2 y nestina es significativamente más baja en preeEnSC; además, \ntambién se observa una menor expresión de MFG -E8 y STRO -1 en dichas células. La expresión \nde podoplanina también desciende significativamente en las preeEnSC. \nEsto nos indica que en las células procedentes de focos de endometrio ectópico, con las \ncaracterísticas fenotípicas de MSC de médula ósea, se modula a la baja la expresión de algunos \nmarcadores de pericitos y de eMSC (CD140b y SUSD2). \n \nC \n\n\nRESULTADOS \n \n \n123 \n \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n124 \n \n5.3. Expresión y secreción de quimioquinas por EnSC y eEnSC \nTras obtener los resultados mostrados en los apartados anteriores, quisimos comprobar si el \nproceso de decidualización afecta de manera diferente a la expresión y secreción de las \nquimioquinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11 en EnSC y eEnSC . Los resultados obtenidos se \ndetallan a continuación. \nPudimos comprobar que en las preeEnSC, el tratamiento con P4 y AMPc induce una \ndisminución significativa de la expresión génica de CXCL9 y CXCL11; sin embargo , la expresión \nde CXCL10 no experimenta variación en las diferentes muestras (Figura 25A). \nEl análisis d e la concentración de cada proteína en los MC de preeEnSC y deEnSC ( Figuras \n25B, 25C y 25D) mostró que la decidualización induce una significativamente menor secreción de \nCXCL9. En el caso de CXCL10 y CXCL11, no obtuvimos diferencias en la secreción proteica, \nsiendo la concentración muy baja tanto en células no decidualizadas como en células \ndecidualizadas (inferior a 12 pg/mL en el caso de CXCL10 e inferior a 3 pg/mL en el caso de \nCXCL11) (Figuras 25C y 25D). \nAl comparar los niveles de cada quimioquina en el MC de preEnSC y preeEnSC, comprobamos \nque la secreción proteica de CXCL9 y CXCL10 es significativamente mayor en las preeEnSC, \ndebido probablemente a su papel en el reclutamiento de linfocitos al foco inflamatorio. También es \nimportante destacar que la diferencia en la secreción de CXCL9 entre los MC de células no \ndecidualizadas y decidualizadas es mayor en el caso de las EnSC ( Figura 25B ), debido \nprobablemente a la menor capacidad de las eEnSC a sufrir cambios funcionales en respuesta a la \ndecidualización. \n \n \n \nA \n\n\nRESULTADOS \n \n \n125 \n \n \nFigura 25. Comparación del efecto de la decidualización en la expresión de citoquinas por EnSC y \neEnSC. A) Se muestra la expresión de CXCL9, CXCL10, CXCL11 y GAPDH por RT-PCR en tres líneas \ncelulares, tanto en preEnSC y preeEnSC (-), como en dEnSC y deEnSC (+). Las células decidualizadas \nfueron tratadas con P4 y AMPc durante 8 días. Como gen de expresión constitutiva se usó la GAPDH \n(“housekeeping gene”). Se muestran los niveles (pg/mL) de las quimioquinas CXCL9 (B), CXCL10 (C) y \nCXCL11 (D) secretadas por EnSC y eEnSC al MC. Como Control (ausencia de proteína) se empleó el \nmedio de cultivo Opti -MEM. Las barras representan la media ± SD. Los experimentos se llevaron a cabo a \npartir de 4 muestras independientes y se realizaron triplicados de cada una de ellas . (**P < 0,01; \n***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n5.4. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC \n5.4.1. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC sobre PBL activados de \nsangre periférica \nUno de los componentes celulares involucrados en la patogenia de la endometriosis son los \nlinfocitos T, por eso se estudió la quimiotaxis de PBL activados (mayoritariamente Th1 y Tc ) \ndebida a los factores secretados por EnSC y eEnSC. Después de un tiempo de migración de 24 \nhoras, en cámara Transwell (Figura 26A ), se observó una activación de la migración de PBL \nactivados con los MC de preEnSC y preeEnSC en compar ación con el Control (Opti -MEM); no \nobstante, el incremento solo fue signi ficativo con el MC de preEnSC. Por otra parte, se inhibió la \nmigración con los MC de ambo s tipos de líneas celulares decidualizadas en comparación con el \nControl. En el caso de las dEnSC, la decidualización prolongada en el tiempo resulta en una \nmayor capacidad de inhibición de la migración de PBL activados (significativa con MC de 8 y 16 \ndías de decidualización). La inhibición de la migración con los MC de deEnSC solo fue significativa \ncon los correspondientes a los 8 días de decidualización. Además, dicha inhibición con los MC de \ndeEnSC parece ser menor que con los MC de dEnSC y esto se observa más claramente con los \nMC obtenidos a los 16 días de decidualización. Este hecho puede deberse a que las eEnSC son \nmenos efectivas al decidualizarse, es decir, son más resistentes a este proceso y, por lo tanto, \nestarían secretando menos factores responsables de la inhibición de la migración; o a la mayor \nsecreción de CXCL9 en deEnSC que en dEnSC (Figura 25B). \nAl estudiar la quimiotaxis d e PBL durante 48 horas ( Figura 26B), se observó una migración \nmuy baja de los PBL no activados, siendo inferior a un 10% en todos los medios, y sin diferencias \nsignificativas entre los MC y el Control. Por otra parte, la migración de PBL activados aumentó en \ntodos los medios respecto a la quimiotaxis durante 24 horas. De nuevo, se observó una activación \nsignificativa de la migración celular con los MC de preEnSC y preeEnS C en comparación con el \nControl; siendo en el MC de preeEnSC donde se obtiene la migración de PBL activados más \nB C D \n\n\nRESULTADOS \n \n \n126 \n \nelevada de todas las muestras estudiadas (63,36%) y significativamente mayor que la migración \nen el MC de preEnSC. En cuanto a los MC de las células decidualizadas, se observó un descenso \no inhibición de la migración en todos los MC de dEnSC y deEnSC en c omparación con el Control. \nDespués de 48 horas, no se obtuvieron diferencias significativas en la migración de PBL activados \nentre los MC de dEnSC y deEnSC. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 26. Análisis comparativo de la migración de PBL con MC de EnSC y eEnSC. A) Efecto del \nmedio Control (Opti-MEM) y los MC de preEnSC, dEnSC, preeEnSC y deEnSC en la migración, durante 24 \nhoras en Cámara Transwell, de PBL activados . B) Efecto del medio Control (Opti -MEM) y los MC de \npreEnSC, dEnSC, preeEnSC y deEnSC en la migración, durante 48 horas en Cámara Transwell, de PBL no \nactivados y activados. En los apartados A y B las barras representan la media del porcentaje de migración \nde PBL ± SD de 6 determinaciones independientes. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron de 3 \ndonantes sanas y se emplearon 6 líneas de EnSC y eEnSC para obtener los MC. Las líneas celulares se \ndecidualizaron durante 4, 8 y 16 días para recoger los MC de dEnSC y deEnSC. (*P < 0,05; **P < 0,01; \n***P < 0,001; ****P < 0,0001). \nA \nB \n\n\nRESULTADOS \n \n \n127 \n \n5.4.1.1. Efecto de los MC de EnSC y eEnSC sobre la quimiotaxis de las \nsubpoblaciones de PBL activados \nPreviamente al análisis del efecto de los factores secretados por EnSC y eEnSC sobre la \nquimioatracción de las diferentes subpoblaciones de PBL activados, se estudió el fenotipo basal \nde las células tras el periodo de activación y el fenotipo de las células tras permanecer en contacto \ncon los MC de EnSC y eEnSC durante 48 horas. Los antígenos estudiados fueron CXCR3, CD3, \nCD4, CD8 y CD56 . Los resultados obtenidos (datos no mostrados) señalaron que los factores \nsecretados por EnSC y eEnSC no producen cambios significativos en el fenotipo de los PBL \nactivados (Figura 12). \nTeniendo en cuenta este dato y, tras examinar la migración de los PBL activados, se llevó a \ncabo el estudio de las subpoblaciones linfocitarias que habían experimentado quimiotaxis con l os \nMC de EnSC y eEnSC ( Figuras 27A-27E), atendiendo a la expresión de los marcadores \nmencionados anteriormente. Dicho estudio se realizó en células migradas durante 48 horas, ya \nque tras 24 horas de migración no obteníamos un número de células suficiente para poder realizar \nun estudio consiste nte. Además, en este caso se presentan los resultados obtenidos con MC de \ncélulas decidualizadas durante 8 días, ya que los resultados son equivalentes a los obtenidos con \nMC de 4 y 16 días de decidualización. \nEl análisis, por citometría de flujo, de las s ubpoblaciones de PBL activados migrados después \nde la exposición al medio Control (Opti -MEM) y los MC ( Figura 27) mostró un perfil parecido al \nobtenido en los datos de quimiotaxis ( Figura 26). El efecto activador de la migración del MC de \npreEnSC se observ ó sobre células T activadas (CD3+ /CXCR3+), obteniendo diferencias \nsignificativas respecto al Control solamente en la subpoblación de células Tc (CD8+ /CXCR3+) \n(Figura 27D). Por otra parte, la activación de la migración del MC de preeEnSC también se \nobservó sobre células T activadas (CD3+ /CXCR3+) y, en concreto, en la subpoblación de células \nTc (CD8+/CXCR3+) (Figuras 27A, 27B y 27D). En cuanto al efecto inhibidor de la migración de \nlos MC de las células decidualizadas, se obtuvo inhibición de la migración de células T activadas \n(CD3+/CXCR3+) por parte del MC de dEnSC, concretamente de la subpoblación de células Th1 \n(CD4+/CXCR3+) (Figuras 27A, 27B y 27C); mientras que el MC de deEnSC inhibió la lleg ada de \ncélulas Th1 (CD4+/CXCR3+) y Tc (CD8+/CXCR3+) (Figuras 27C y 27D). En cuanto a las células \nNK activadas (CD56+/CXCR3+), no hemos evidenciado activación de la migración con los MC de \npreEnSC (en este caso disminuye) y preeEnSC, pero sí que se observa inhibición de la \nquimiotaxis con los MC de dEnSC y deEnSC ( Figura 27E). Los resultados también señalan que \nhay una quimioatracción significativamente mayor de células T (CD3+ /CXCR3+) y células NK \n(CD56+/CXCR3+) en el MC de preeEnSC que en el MC de preEnSC (Figuras 27B y 27E). \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n128 \n \n \n \nFigura 27. Análisis comparativo del efecto de los MC de EnSC y eEnSC en la quimioatracción de \ndiferentes subpoblaciones de PBL activados. Número de células positivas para el marcador CXCR3 (A), \nCD3 (B), CD4 (C), CD8 (D) y CD56 (E), antes de migrar (AM) y m igradas en el medio Control (Opti-MEM) y \nlos MC de preEnSC, dEnSC, preeEnSC y deEnSC, durante 48 horas en Cámara Transwell. En todos los \ncasos las barras representan el número de células positivas para cada marcador tras la migración ± SD de 6 \ndeterminaciones independientes. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron de 3 donantes sanas y se \nemplearon 6 líneas de EnSC y eEnSC para obtener los MC. Las líneas celulares se decidualizaron durante \n8 días para recoger los MC de dEnSC y deEnSC. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n5.4.2. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC sobre monocitos de sangre \nperiférica \nSiguiendo con el estudio de la inmunopatología de la endometriosis, otro componente celular \nque desempeña un papel muy importante en el desarrollo de la lesión y la inflamación son los \nmacrófagos. El número de macrófagos se encuentra elevado en el fluido peritoneal y en el foco de \nendometrio ectópico. Partiendo de esta base, estudiamos la actividad quimiotáctica de las eE nSC \nque aislamos del quiste de endometriosis sobre monocitos de sangre periférica y la comparamos \ncon la actividad quimiotáctica de las EnSC de mujeres sanas ( Figura 28 y Figura 30). También \nanalizamos la diferenciación o polarización que experimentan los monocitos hacia un fenotipo \ncaracterístico de macrófago M1 o M2, al estar en contacto con los MC de EnSC y eEnSC ( Figura \n29). \nA B C \nD E \n\n\nRESULTADOS \n \n \n129 \n \nEn primer lugar, estudiamos la migración de los monocitos obten idos de sangre periférica que \nes debida a los factores secretados por EnSC y eEnSC. Al analizar la quimiotaxis durante 24 \nhoras, se observó que los valores obtenidos eran muy bajos, por eso se presentan los resultados \nobtenidos tras 48 horas de migración c elular ( Figura 28 ). Tras dicho periodo de incubación en \nCámara Transwell, se observó una activación de la migración con los MC de preEnSC y \npreeEnSC en compar ación con el Control (Opti -MEM); no obstante, el incremento solo fue \nsignificativo con el MC de preeEnSC. Por otra parte, se inhibió la migración con los MC de ambos \ntipos de líneas celulares decidualizadas en comparación con el Control, aunque esta inhibición no \nfue significativa. Además, el MC de preeEnSC parece presentar un mayor efecto activador de la \nmigración que el MC de preEnSC, de manera que atrae a un mayor número de monocitos, aunque \nno se han obtenido diferencias significativas entre ambos MC. De igual manera, la inhibición de la \nmigración con el MC de deEnSC es mayor que con el MC de dEnSC, pero tampoco se han \nobtenido diferencias significativas. \nFigura 28. Análisis comparativo de la migración de monocitos de sangre periférica con MC de EnSC \ny eEnSC. Efecto del medio Control (Opti -MEM) y los MC de preEnSC, dEnSC, preeEnSC y deEnSC en la \nmigración, durante 48 horas en Cámara Transwell, de monocitos . Las barras representan la media del \nporcentaje de migración de monocitos ± SD de 5 determinaciones independientes. Las muestras de sangre \nperiférica se obtuvieron de 3 donantes sanas y se emplea ron 5 líneas de EnSC y eEnSC para obtener los \nMC. Las líneas celulares se decidualizaron durante 8 días para recoger los MC de dEnSC y deEnSC. \n(*P < 0,05; ***P < 0,001). \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nRESULTADOS \n \n \n130 \n \n5.4.2.1. Cambios en el fenotipo antigénico de monocitos de sangre periférica \nen contacto con los MC de EnSC y eEnSC \nTal y como se llevó a cabo el estudio con los PBL activados, en monocitos de sangre periférica \ntambién analizamos el fenotipo basal de las células tras su purificación y el fenotipo tras \npermanecer en contacto con los MC de EnSC y eEnSC durante 48 horas. L os antígenos \nanalizados fueron CD14, CD86, CD163 y CD206. Los resultados obtenidos señalan que los \nfactores secretados por EnSC y eEnSC no producen cambios significativos en la expresión de \nCD14 y CD163 (datos no mostrados) , pero sí en la expresión de CD86 y CD206, tal y como se \nmuestra en las Figuras 29A y 29B. Es importante destacar la expresión significativamente mayor \nde CD86 en los MC de las células decidualizadas al comparar con el medio Control y los MC de \nlas células no decidualizadas; además, es eq uivalente a la obtenida en el fenotipo basal de los \nmonocitos (T0: Tiempo 0). Por otra parte, en cuanto al antígeno CD206, se observa una expresión \nsignificativamente menor en los MC de dEnSC y deEnSC al comparar con el Control y los MC de \npreEnSC y preeEn SC. Además, en el análisis del fenotipo basal, los monocitos no expresan el \nmarcador CD206, pero sí adquieren la expresión de dicho antígeno al estar en contacto con los \nMC de preEnSC y preeEnSC, así como en el Control. \n \nFigura 29. Estudio del fenotipo antigénico de monocitos de sangre periférica en contacto con MC de \nEnSC y eEnSC durante 48 horas. Se muestra el porcentaje de expresión de los marcadores CD86 (A) y \nCD206 (B) en los monocitos antes de la siembra en placa (T0: Tiempo 0 ) y después de estar en contacto \ndurante 48 horas con los diferentes medios: Control (Opti-MEM), MC preEnSC, MC dEnSC, MC preeEnSC y \nMC deEnSC . En todos los apartados, las barras representan la media del porcentaje de expresión \nantigénica ± SD de 4 determinaciones independientes. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron de 3 \ndonantes sanas y se emplearon 4 líneas de EnSC y eEnSC para obtener los MC. Se utilizaron MC de \ncélulas tratadas con P4 y AMPc durante 8 días. (*P < 0,05; **P < 0,01; ****P < 0,0001). \n5.4.2.2. Fenotipo antigénico de los monocitos quimioatraídos por los MC de \nEnSC y eEnSC \nTeniendo en cuenta estos resultados, también se examinó la expresión antigénica de los \nmonocitos quimioatraídos por los MC de EnSC y eEnSC en los experimentos que definen la \nFigura 28 . El análisis se realizó por citometría de flujo y se presentan los resultados como \nporcentaje de expresión de cada marcador (CD14, CD86, CD163, CD206) en las células migradas \n(Figura 30). \nA B \n\n\nRESULTADOS \n \n \n131 \n \nLos resultados muestran que en el Control y en todos los MC hay quimioa tracción de células \nque expresan los marcadores CD14 y CD86, siendo la expresión en ambos casos de entre un \n80%-99% (Figuras 30A y 30B). Los siguientes dos marcadores estudiados (CD163 y CD206) son \ncaracterísticos de un fenotipo M2 antiinflamatorio y se ob servaron diferencias en la atracción de \ncélulas CD163+ y CD206+ entre los MC (Figuras 30C y 30D). En cuanto a las células CD163+, se \nobservó una mayor atracción en los MC de preEnSC y preeEnSC que en el Control, siendo \nsignificativa solamente en el MC de p reeEnSC. No obstante, la migración de células CD163+ es \nsignificativamente menor en los MC de células decidualizadas al comparar con el Control y con los \nMC de células no decidualizadas. Estos resultados son equivalentes a los obtenidos al estudiar el \nmarcador CD206, es decir, hay una alta quimioatracción de células CD206+ en los MC de \npreEnSC y preeEnSC, la cual es significativamente mayor que en el Control. Mientras que estas \ncélulas no migran en los MC de dEnSC y deEnSC. \nEn resumen, cabe destacar que lo s factores secretados por las preeEnSC tienen un mayor \nefecto quimioatrayente sobre los monocitos que los de preEnSC. Además, en dicho MC de \npreeEnSC hay una elevada atracción de monocitos polarizados hacia un fenotipo M2 \n(CD163+/CD206+). Por otra parte, la decidualización de las EnSC y eEnSC resulta en una \ninhibición de la llegada de monocitos, principalmente de aquellos que son CD163+ y/o CD206+. \n \n \n \nFigura 30. Análisis comparativo del fenotipo antigénico de monocitos de sangre periférica que han \nexperimentado quimiotaxis en los MC de EnSC y eEnSC. Expresión del marcador CD14 (A), CD86 (B), \nCD163 (C) y CD206 (D) en monocitos antes de migrar (AM) y migrados en el medio Control (Opti-MEM) y \nlos MC de preEnSC, dEnSC, preeEnSC y deEn SC, durante 48 horas en Cámara Transwell. En todos los \ncasos las barras representan la media del porcentaje de expresión antigénica ± SD de 5 determinaciones \nA B \nC D \n\n\nRESULTADOS \n \n \n132 \n \nindependientes. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron de 3 donantes sanas y se emplearon 5 \nlíneas de EnSC y eEnSC para obtener los MC. Las líneas celulares se decidualizaron durante 8 días para \nrecoger los MC de dEnSC y deEnSC. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n5.4.3. Actividad quimiotáctica de EnSC y eEnSC sobre células tumorales: \nJurkat y THP-1 \nAdemás del análisis realizado con linfocitos y monocitos de sangre periférica, se estudió el \nefecto quimiotáctico de los factores secretados por EnSC y eEnSC sobre dos de las líneas \ntumorales con las que habíamos trabajado anteriormente, es decir, con la línea Jurkat (células Th) \ny la línea THP-1 (monocitos). Se presentan los resultados tras una incubación de 24 horas con los \nMC, ya que en este tiempo el porcentaje de migración celular obtenido nos permitió realizar un \nanálisis comparativo entre los distintos medios. El objetivo de dichos experimentos fue comprobar \nsi también se observaban , sobre líneas celulares tumorales , los efectos activadores e inhibidores \nde la migración de linfocitos y monocitos de sangre periférica , que tienen los MC de EnSC y \neEnSC. Se decidió realizar este análisis con células Jurkat y THP -1, ya que son líneas purificadas \ny la variabilidad en los resultados obtenidos es menor que empleando líneas primarias. \nLos resultados mostraron que, frente a los resultados obtenidos con PBL activados en los que \nse observó una activación de la migración con los MC de preEnSC y preeEnSC ( Figura 26), en el \ncaso de las células Jurkat dichos MC tenían un efecto inhibidor (Figura 31A). No obstante, al igual \nque en los PBL activados ( Figura 26), la quimiotaxis de las células Jurkat se vio inhibida en los \nMC de dEnSC y deEnSC ( Figura 31A). Como se detalló anteriormente, la menor eficacia en la \nquimiotaxis de esta línea linfocítica tumoral Jurkat, en comparación con los PBL activados, al estar \nen contacto con MC de células estromales uterinas no decidualizadas puede explicarse por la \nmenor expresión del receptor de quimioquinas CXCR3 en estas células tumorales (Figura 15C). \nCon el objetivo de comprobar que la inhibición de la migración de las células Jurkat en los MC \nde EnSC y eEnSC no se debía a un posible efecto citotóxico sobre estos linfocitos tumorales, se \npusieron en contacto dichas células con los MC durante 24 horas. Los resultados mostraron que el \nporcentaje de células apoptóticas era inferior a un 5% en todos los MC (datos no mostrados), de \nmanera que los factores secretados por EnSC y eEnSC no tienen un efecto ci totóxico significativo \nsobre las células Jurkat. Este resultado confirma los datos obtenidos anteriormente con MC de \npreDSC y dDSC, los cuales mostraban que las células Jurkat no se veían afectadas en su \nviabilidad al ser incubadas durante 4 días con estos MC (Figura 11). \nLos resultados obtenidos con la línea tumoral THP -1 (Figura 31B) muestran que el proceso de \ndecidualización aumenta la secreción en las EnSC y eEnSC, al igual que en las DSC ( Figura \n15B), de factores quimiotácticos para monocitos (células THP-1); aunque estos MC no mostraron \nun efecto significativo sobre la migración de monocitos purificados de sangre periférica ( Figura \n28). No obstante, la activación de la migración de células THP -1 con el MC de preeEnSC sí fue \nequivalente a la observada en monocitos obtenidos de sangre periférica (Figura 28). \n\n\nRESULTADOS \n \n \n133 \n \n \nFigura 31. Análisis comparativo de la migración de células Jurkat y THP-1 con MC de EnSC y eEnSC. \nEfecto del medio Control (Opti-MEM) y los MC de preEnSC, dEnSC, preeEnSC y deEnSC en la migración, \ndurante 24 horas en Cámara Transwell, de células Jurkat (A) y células THP-1 (B). Las barras representan la \nmedia del porcentaje de migración de ambas líneas celulares ± SD de 5 determinaciones independientes. \nSe emplearon 5 líneas de EnSC y eEnSC para obtener los MC. Las líneas celulares se decidualizaron \ndurante 8 días para recoger los MC de dEnSC y deEnSC. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,00 1; ****P < \n0,0001). \n5.4.3.1. Cambios en el fenotipo antigénico de células THP-1 en contacto con \nlos MC de EnSC y eEnSC \nEn paralelo al estudio realizado con monocitos de sangre periférica, se analizó el fenotipo basal \nde las células THP-1 y el fenotipo tras estar en contacto con los MC de EnSC y eEnSC durante 48 \nhoras. Nuevamente, los antígenos analizados fueron CD14, CD86, CD163 y CD206. Los \nresultados obtenidos muestran que la línea de células THP -1 con la que trabajamos no expresa \nlos antígenos CD163 y CD206; además, los fa ctores secretados por las células estromales no \nproducen cambios en la expresión de estos antígenos, la cual es inferior a un 10% en todos los \ncasos (Figuras 32C y 32D). No obstante, tal como se muestra en la s Figuras 32A y 32B, sí se \nobtienen diferencias en la expresión de CD14 y CD86. Los datos nos permiten comprobar que \nesta línea tumoral THP -1 adquiere la expresión del marcador CD14 al estar en contacto con los \nMC, siendo en todos los casos significativamente mayor que en el Control. Es importante destacar \nque en los MC de células decidualizadas se obtiene una elevada expresión de CD14 y CD86 \n(alrededor de un 90%), la cual es significativamente mayor que la obtenida en el Control y en los \nMC de las células no decidualizadas. Por otra parte, la expresión de ambos antígenos es \nsignificativamente más alta en el MC de preeEnSC que en el MC de preEnSC. \nA B \n\n\nRESULTADOS \n \n \n134 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 32. Estudio del fenotipo antigénico de células THP -1 en contacto con MC de EnSC y eEnSC \ndurante 48 horas. Se muestra el porcentaje de expresión de los marcadores CD14 (A), CD86 (B), CD163 \n(C) y CD206 (D) en las THP-1 antes de la siembra en placa (T0: Tiempo 0) y después de estar en contacto \ndurante 48 horas con los diferentes medios: Control (Opti-MEM), MC preEnSC, MC dEnSC, MC preeEnSC y \nMC deEnSC . En todos los apartados, las barras representan la media del porcentaje de expresión \nantigénica ± SD de 4 determinaciones independientes. S e emplearon 4 líneas de EnSC y eEnSC para \nobtener los MC. Se utilizaron MC de células tratadas con P4 y AMPc durante 8 días. (*P < 0,05; \n***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n5.4.3.2. Fenotipo antigénico de células THP-1 quimioatraídas por los MC de \nEnSC y eEnSC \nPosteriormente, se examinó la expresión antigénica de las células THP-1 que habían \nexperimentado quimiotaxis al estar en contacto con los MC de EnSC y eEnSC durante 48 horas \nen Cámara Transwell. Se presentan los resultados como porcentaje de expresión de los antígenos \nCD14 y CD86 en las células migradas ( Figuras 33A y 33B). En cuanto a CD163 y CD206, no se \nmuestran los resultados porque no hay migración de células positivas para dichos marcadores \n(datos no mostrados). \nA B \nC D \n\n\nRESULTADOS \n \n \n135 \n \nPodemos observar que el medio Control y todos los MC atraen células que expresan CD14 y \nCD86. Los resultados explicados en la Figura 31B mostraban una migración significativamente \nmayor de células THP-1 en el MC de preeEnSC que en el MC de preEnSC, y el análisis fenotípico \nindica que la quimioatracción de células CD14+ y CD86+ es significativamente más elevada en \ndicho MC (Figura 33). Además, también observábamos que en los MC de células decidualizadas \naumenta más la migración de células THP -1 que en los MC de células no decidualizadas (Figura \n31B), y hemos podido comprobar que los factores secretados por dEnSC y deEnSC incrementan \nla migración de células CD14+ y CD86+, comparado con el Control y con los MC de preEnSC y \npreeEnSC (Figura 33). \n \nFigura 33. Aná lisis comparativo del fenotipo antigénico de células THP -1 que han experimentado \nquimiotaxis en los MC de EnSC y eEnSC. Expresión del marcador CD14 (A) y CD86 (B) en células THP-1 \nantes de migrar (AM) y migradas en el medio Control (Opti-MEM) y los MC de preEnSC, dEnSC, preeEnSC \ny deEnSC, durante 48 horas en Cámara Transwell. En todos los casos, las barras representan la media del \nporcentaje de expresión antigénica ± SD de 3 determinaciones independientes. Se emplearon 3 líneas de \nEnSC y eEnSC para obtener los MC. Las líneas celulares se decidualizaron durante 8 días para recoger los \nMC de dEnSC y deEnSC. (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA B \n\n\n \n \n136 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDISCUSIÓN \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n137 \n \nLas MSC forman un conjunto heterogéneo de células estromales que pueden ser aisladas de \nlos tejidos adultos. El gran interés terapéutico en la medicina regenerativa que ha generado el \nestudio de estas células se debe a su capacidad de autorenovación, pluripotencia y a su \ncapacidad para interaccionar con las células inmunitarias , modulando las respuestas innata y \nadaptativa. Las MSC pueden ser aisladas de tejidos adultos (células madre adultas), por eje mplo, \nla piel, el tejido adiposo o la médula ósea 198,228. En la presente investigación , hemos realizado un \nanálisis detallado del fenotipo antigénico y funciones de diferentes tipos de células con potencial \nde célula progenitora mesenquimal; concretamente, las células estromales procedentes de la \ndecidua (DSC) y del endometrio (EnSC , obtenidas de sangre menstrual). A su vez, hemos \nanalizado las características fenotípicas y las propiedades inmunoreguladoras de células \nendometriales de localización ectópica, en pacientes con endometriosis (eEnSC). \nEn diversos estudios de investigación básica y estudios clínicos se han empleado células \nestromales procedentes de sangre menstrual y de decidua. Por ejemplo, Hida et al. utilizaron \ncélulas estromales de sangre menstrual para reparar tejido cardíaco dañado tras diferenciarlas a \ncardiomiocitos229; también se han empleado en estudios clínicos con pacientes de esclerosis \nmúltiple230; por otra parte, las células deciduales se han usado en e studios clínicos para el \ntratamiento de la enfermedad de injerto contra el hospedador, gracias a sus propiedades \ninmunosupresoras231. \nOrigen mesenquimal de las DSC y las EnSC \nLas líneas de preDSC con las que hemos trabajado experimentan, bajo el efecto de los factores \ndecidualizantes (A MPc y P4), una diferenciación equivalente a la que tiene lugar de manera \nfisiológica durante la fase secretora del ciclo endometrial y que se prolonga en el tiempo si se \nproduce la gestación53 (Figura 1A). \nPor otra parte, el fenotipo antigénico de las preDSC es similar y compatible con el de MSC de \nmédula ósea (Figura 1B) (Tabla 13). Dicho fenotipo, junto a la adherencia al plástico del frasco de \ncultivo y la capacidad de diferenciación a células de tres linajes mesenquimales, es decir, a \nadipocitos, osteoblastos y condrocitos ( Figura 2C ), son propiedades que las identifican como \nMSC, según los criterios mínimos establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular \n(ISCT)23. \nOtras características de las MSC son la expresión de marcadores de células progenitoras y la \nclonogenicidad198, las cuales también fueron analizadas en nuestras líneas de preDSC. Los \nresultados mostraron que estas células expresan los marcadores de células multipotentes OCT -4, \nNANOG y ABCG2 (Figura 2A). Además, la eficiencia clonogénica obtenida se encuentra entre un \n4% y un 15% (Figura 2B). \nNuestros resultados confirman que las preDSC estudiadas están estrechamente relacionadas \ncon las MSC, tal y como se resume en la siguiente tabla (Tabla 17). \n \n \n \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n138 \n \nTabla 17. Comparativa entre las propiedades de las preDSC y las MSC. \n \nDe forma equivalente a las líneas de preDSC, las líneas de preEnSC con las que hemos \ntrabajado experimentan, en presencia de AMPc y P4 en el medio de cultivo, una decidualización \nequivalente a la que tiene lugar de manera fisiológica durante la fase secretora del ciclo \nendometrial53 (Figura 16A). Por otra parte, pudimos comprobar que el fenotipo antigénico de las \npreEnSC es similar y compatible con el de MSC de médula ósea (Figura 16B) (Tabla 15). \nSi nos centramos en la relación de preDSC y preEnSC con MSC, nuestros resultados coinciden \ncon los obtenidos por Dimitrov et al . que caracterizaron células estromales con capacidad \nclonogénica procedentes del endometrio y la decidua, las cuales presentaban características \npropias de células madre mesenquimales, en concreto, la capacidad de autorenovación y \ndiferenciación a células de distintos linajes, clonogenicidad y exp resión de marcadores de \nMSC202,209. Nuestros resultados lo confirman al mostrar que ambos precursores estromales tienen \nun fenotipo antigénico compatible con el de MSC ( Tablas 13 y 15) y apoyan la hipótesis de que \nlas MSC de médula ósea son la fuente o el origen de las EnSC y las DSC143,144. \nDicha relación sugiere que las MSC se dirigen, desde médula ósea, bien al endometrio no \ngestante o bien a la decidua, dando lugar en el primer caso a las preEnSC y en el segundo, a las \npreDSC. Esta afirmación se sustenta en el descubrimiento de células endometriales derivadas de \ncélulas madre de una donante de médula ósea, en el útero de la mujer que recibió el trasplante de \nmédula ósea143. \nA pesar de la existencia de estas similitudes, encontramos diferencias en la expresión de \nalgunos antígenos. Por ejemplo, los antígenos BAFF y CXCL13 se expresaban en preDSC y \npreEnSC, pero no en MSC (Tablas 13 y 15). Esta diferencia puede estar asociada a las \ninteracciones que establecen las MSC con las células inmunitarias al llegar al endometrio o la \ndecidua82. La expresión de dichos marcadores a nivel decidual es determinante , ya que CXCL13 \nes una quimioquina que atrae células Treg, las cuales desempeñan un papel clave en la tolerancia \ninmunitaria materno-fetal80,241,242; por su parte, BAFF participa en la modulación de la toler ancia y \nCaracterísticas preDSC MSC Referencias \nFenotipo antigénico Tabla 13 Tabla 13 80,232,233 \nCriterios mínimos ISCT + + 23,232 \nDecidualización PRL (ARNm+, \nproteína+) \nPRL (ARNm+, \nproteína-) 80 \nDiferenciación mesenquimal + + 23,210 \nContractilidad + + 232,234 \nMarcadores de célula madre (stem cell) + + 210,212 \nClonogenicidad + + 210,235 \nResistencia a la apoptosis + + 103,236 \nInteracción con células hematopoyéticas + + 237,238 \nSupervivencia en xenotrasplantes + + 210,239,240 \nLocalización perivascular + + 90,232 \nActividad inmunoreguladora in vivo e in vitro + + 80,82,199,210 \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n139 \n \nla homeostasis de las células B , y a nivel de la decidua parece estar involucrado en la inducción \nde una respuesta tolerogénica Th280,243,244,245. \nTambién encontramos diferencias asociadas al proceso de decidualización, ya que las MSC \nmostraron una baja capacidad de diferenciación y no secretaron PRL ( Figura 3). Debido a ello, \nnuestros resultados sugieren que las MSC adquieren de manera gradual la capacidad de \ndecidualización, desde su origen en médula ósea hasta el tejido endometrial o decidual42. \nPor lo anteriormente descrito, las preDSC y las preEnSC parecen ser MSC endometriales \n(eMSC) por su capacidad clonogénica, autorenovación y multipotencia para diferenciarse en \ncélulas del linaje adipogénico, osteogénico, condrogénico y miogénico. Tal como las preDSC y las \npreEnSC, las eMSC expresan los marcadores CD140b, CD146 y SUSD2; son capaces de \ndecidualizarse y se encuentran en localizaciones perivasculares 18,25,26,246,247,248,249. No obstante, \nestas eMSC fueron aisladas de un endometrio no gestante, al igual que las preEnSC; mientras \nque nuestras líneas de preDSC fueron obtenidas y aisladas de muestras de decidua humana. \nRecientemente, nuestro grupo de investigación ha demostrado, en un modelo murino de aborto \nespontáneo recurrente, que las preDSC humanas tienen efecto terapéutico 210. Esto sugiere que \nlas DSC, como las EnSC, pueden emplearse en terapia celular para tratar enfermedades de \norigen inmunológico, gracias a su capacidad inmunoreguladora in vivo e in vitro 82. La ventaja de \neste tipo de tratamientos frente al uso de MSC de médula ósea radicaría, en parte, a la facilidad \nde obtención (principalmente en el caso de las EnSC) y cultivo de estas células estromales, \naunque se necesitarían más estudios que permitieran dilucidar qué tipo celular es más adecuado. \nDSC como pericitos \nEl análisis de la expresión del marcador de pericitos α -SMA y el estudio de la actividad \ncontráctil de las líneas de preDSC había llevado, anteriormente, a proponer una relación entre las \npreDSC y estas células perivas culares79,101,102. En la presente investigación hemos estudiado un \nmayor número de antígenos para poder definir el fenotipo anti génico de las preDSC. Los \nresultados muestran que de los 36 antígenos analizados por citometría de flujo, 14 se expresaban \nen las preDSC y eran marcadores de pericitos ( Tabla 1 3). Actualmente no se conoce ningún \nmarcador que sea específico de pericitos y p ermita diferenciarlos de otras células; además, la \nexpresión de los marcadores más comunes de estas células varía en función del estado del \ndesarrollo, de la ausencia o presencia de patología, del cultivo in vitro, etc250. No obstante, uno de \nlos antígenos que sí los caracterizan es la α -SMA, proteína responsable de la actividad contráctil \nde muchos tipos celulares 251. Junto a este marcador, hay otros antígenos comúnmente asociados \na pericitos, tales como CD140b250 y CD146252. \nAdemás, al igual que estas células perivasculares 94,95, las líneas de preDSC expresan ARNm \nde diversos factores angiogénicos (ANGPT1, F GF2, HGF, PGF y VEGF) y presentan \ncontractilidad inducida por citoquinas ( Figura 4 ). Haber podido comprobar que las preDSC \npresentan estas propiedades es muy importante , ya que demuestra que estas células desarrollan \nuna función relevante en la angiogénesis, un proceso imprescindible para el éxito y progreso de \nun embarazo253. El antígeno CD146, el cual se asocia a pericitos implicados en la angiogénesis254, \nfue detectado en las líneas de preDSC ( Tabla 13) (Tabla 14) y en preDSC perivasculares in vivo \n(Figuras 5B y 5C). \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n140 \n \n Mediante el análisis de las criosecciones de decidua humana, pudimos comprobar que, al igual \nque los pericitos, las preDSC humanas se encuentran in vivo alrededor de los vasos sanguíneos. \nPero bajo efecto hormonal, estas células se decidualizan y, por lo tanto, se diferencian y se \ndesplazan por todo el estroma en el endometrio gestante ( Figura 5A ). Mediante microscopía \nconfocal, observamos que las células que expresan α-SMA colocalizan con aquellas que expresan \nCD140b, CD146, SUSD2, MFG -E8, nestina y STRO -1 (Figura 5B). Es importante señalar que el \nanálisis, por citometría de flujo , también había confirmado que dichos marcadores de pericitos \neran expresado s por nuestras líneas de preDSC ( Tabla 1 3). Este resultado confirma que las \ncélulas perivasculares eran preDSC y estas, a su vez, estaban estrechamente relacionadas con \nlos pericitos. \nPor su parte, Vento-Tormo et al. identificaron, mediante transcriptómic a de célula única, \ndiferentes tipos celulares en muestras de decidua humana del primer trimestre de embarazo. La \ncomposición celular de la decidua humana incluía células estromales perivasculares que \npresentaban un fenotipo antigénico CD45 -, CD34 -, CD1 40b+, CD146+, SUSD2+, α -SMA+, \nANGPT1+, VEGF-A+ y PRL -217, equivalente al detectado en nuestras líneas de preDSC ( Tabla \n13) (Figura 4A). \nOtra característica de los pericitos es su relación con MSC 199. Muchos de los antígenos, \nincluidos los marcadores de pericitos expresados por las línea s de preDSC, también se expresan \nen MSC ( Tabla 1 3). Además, las eMSC , al igual que nuestras líneas de preDSC, expresan \nCD140b y CD146, y se detectan en localizaciones perivasculares249. \nLos resultados obtenidos, que relacionan las preDSC con los pericitos y las MSC, coinciden \ncon lo que otros investigadores han descubierto. En sus estudios con MSC, Castrechini et al. \npropusieron la existencia de un nicho vascular de MSC en la decidua a término y, en consonancia \ncon ello, nuestros resultados también sugieren que las preDSC de la decidua humana son \npericitos que representan el nicho vascular de las MSC en la decidua255. \nLa localización perivascular de las preDSC favorece su actividad quimiotáctica sobre leucocitos \nde sangre periférica que llegan al endometrio y la decidua, especialmente células N K y \nmonocitos82,110. Además, la actividad contráctil de las preDSC probablemente tenga un efecto en \nla regulación del flujo sanguíneo de los vasos en los cuales se localizan102. \nEs importante señalar que todas las características propias de pericitos fueron presentadas por \nnuestras líneas de preDSC, tal y como se resume en la siguiente tabla (Tabla 18). \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n141 \n \nTabla 18. Comparativa entre las propiedades de las preDSC y los pericitos. \n \nDecidualización de las DSC \nUna vez demostrada la relación fenotípica y funcional de las preDSC con MSC y pericitos, \nestudiamos detalladamente el proceso de decidualización de las preDSC y cómo dicho proceso \nmodifica algunas de las propiedades de MSC/pericitos que presentan estas células. \nComo mencionamos anteriormente, al decidualizar las diferentes líneas de preDSC vimos que \nlas dDSC adquirieron una morfología redondeada y secretaron PRL ( Figura 1A) (Ilustración 17). \nEl estudio in vivo que hemos realizado en cortes de decidua human a de primer trimestre de \nembarazo muestra que las preDSC tienen un aspecto fibroblástico y se encuentran alrededor de \nlos vasos sanguíneos ( Figura 5A). Tanto en el análisis in vivo como en el estudio in vitro por \ncitometría de flujo, hemos podido comproba r que las preDSC expresan el marcador de células \nendometriales estromales, CD10; así como marcadores de MSC/pericitos, es decir, α -SMA, \nnestina, CD140b, CD146, SUSD2, podoplanina y STRO -1 (Tabla 13) (Figura 5B) (Figuras 7A y \n7B). No obstante, durante la de cidualización, las dDSC adquieren una morfología redondeada y \nson capaces de migrar hacia una zona extravascular, es decir, hacia el estroma ( Figura 5A ) \n(Ilustración 17). Además, mediante citometría de flujo, observamos que mantienen la expresión \nde CD10, pero la expresión de α-SMA, nestina, CD140b, CD146 y SUSD2 disminuye (Figuras 7A \ny 7B) (Ilustración 17). Analizamos también la variación de la IMF del antígeno α -SMA a medida \nque aumenta el tiempo de decidualización y comprobamos que esta disminuye signifi cativamente \n(Figura 7C ). Anteriormente , demostramos que la polimerización de la α -SMA en las fibras de \nestrés de la célula es la responsable de la contractilidad y la morfología fibroblástica de las \npreDSC; de manera que la menor expresión de este antígeno en las dDSC puede ser la causa de \nque adquieran una morfología redondeada y de que disminuya su contractilidad celular 79, \nfenómenos determinantes para la implantación del blastocisto232,257. \nNuestros resultados también coinciden con los datos obtenidos por Vento-Tormo et al. en su \nestudio trans criptómico de decidua humana del primer trimestre de embarazo. Como se ha \nmencionado anteriormente, esta investigación mostró que la decidua está formada por diferentes \npoblaciones de células estromales perivasculares y no perivasculares. Las células periv asculares \nno expresaban PRL y tenían un fenotipo antigénico equivalente al de las preDSC (α -SMA+, \nCD140b+, CD146+ y SUSD2+) ; mientras que las células no perivasculares eran equivalentes a \nCaracterísticas preDSC pericitos Referencias \nLocalización perivascular + + 232,250 \nExpresión de marcadores de pericitos + + 199,232,250 \nContractilidad inducida por citoquinas + + 95,102,232 \nExpresión de factores angiogénicos + + 94,232 \nActividad quimiotáctica + + 96,232 \nActividad fagocítica + + 201,256 \nActividad inmunoreguladora + + 84,98 \nRelación con MSC + + 99,199 \nDecidualización + ¿? 84 \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n142 \n \nnuestras dDSC, ya que expresaban PRL, pero la expresión de α-SMA, CD140b, CD146 y SUSD2 \ndisminuyó o fue negativa 217. Por su parte, Suryawanshi et al. también demostraron, en un estudio \ntranscriptómico, que las células estromales decidualizadas expresaban PRL y diferentes genes \nrelacionados con la remodelación de la matriz extracelular258. \nEl hecho de que las preDSC expresen los antígenos CD140b y CD146 puede explicarse por su \nlocalización perivascular, ya que estas moléculas participan en la interacción de las preDSC con \nlas células endoteliales durante la angiogénesis259. No obstante, al decidualizarse y abandonar la \nlocalización perivascular y, p or lo tanto, el contacto con las células endoteliales, la expresión en \ndDSC es menor (Figuras 7A y 7B). También disminuye la expresión en dDSC extravasculares de \nantígenos implicados en la angiogénesis y la homeostasis vascular, tales como, α-SMA, nestina, \nSUSD2, podoplanina y STRO-126,260,261,262. \nNo obstante, cuando posteriormente estudiamos la expresión de otros factores angiogénicos, \ntales como ANGPT1, HGF, FGF2 y VEGF comprobamos que no hay diferencias de expresión \nentre preDSC y dDSC ( Figuras 10A y 10B); e incluso, en otros factores como PGF y CXCL12 la \nexpresión aumenta en dDSC (Figuras 7A, 7B, 10A y 10B). Esto puede deberse a una \ncompensación, en la zona extravascular, de la inhibición de la expresión de algunas moléculas \nrelacionadas con la angiogénesis en el espacio perivascular. Además, por lo que respecta a PGF, \nsu presenci a en el estroma es determinante ya que regula la maduración de células uNK , \nnecesaria para la invasión, crecimiento y desarrollo del trofoblasto; también estimula el \nreclutamiento y activación de monocitos e incrementa la proliferación y supervivencia de \nmacrófagos263. Por su parte, la molécula CXCL12 también está implicada en la invasión del \ntrofoblasto, en el mantenimiento de su homeostasis y en el establecimiento de los mecanismos de \ntolerancia materno-fetal; ya que participa en el reclutamiento de células Th2 y células NK, que se \ndiferencian adquiriendo un fenotipo característico de uNK264. \n \n \nIlustración 17. Esquema representativo de la evolución de la expresión de diferentes marcadores en \nDSC durante el proceso de decidualización. Imagen creada con el software BioRender. \n \nEl crecimiento embrionario va acompañado de una importante remodelación e involución de la \ndecidua y dicha regresión se produce por apoptosis 265,266,267. En este proceso p arecen estar \ninvolucradas citoquinas y otros factores del microambiente materno -fetal. Previamente, nuestro \ngrupo de investigación demostró que, tras la decidualización, las dDSC (pero no las preDSC) \nsecretan factores que inducen la apoptosis de preDSC y d DSC103. Probablemente este resultado \nexplique el adelgazamiento fisiológi co gradual que tiene lugar en la decidua permitiendo así el \ncrecimiento del trofoblasto durante el embarazo 77. Por otra parte, también habíamos comprobado \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n143 \n \nque las DSC son capaces de secretar factores que inhiben la apoptosis espontánea de células T y \ncélulas NK, es decir, favorecen la supervivencia de los linfocitos en la interfaz materno -fetal237. Es \npor esto que las DSC son capaces de atr aer de manera selectiva leucocitos desde el torrente \ncirculatorio a la decidua, pero también de favorecer la supervivencia de las células inmunitarias \nque atraen. En contraste, hemos observado que las dDSC presentan un efecto antitumoral sobre \nalgunas líneas tumorales. \nEl análisis del efecto antitumoral de las preDSC y las dDSC que llevamos a cabo en la presente \ninvestigación mostró que el MC de dDSC induce apoptosis en las líneas celulares tumorales Raji, \nA375, HeLa y SKBR3. En estos casos, el porcentaje de células apoptóticas en el MC de dDSC es \nsignificativamente mayor que el obtenido en el MC de preDSC. No obstante, la apoptosis de las \nlíneas tumorales Jurkat, THP -1 y Cal33 con el MC de dDSC no fue significativamente mayor que \nen el medio Control ( Figura 11 ). De forma semejante, se ha observado que un tipo células \nrelacionadas también con MSC, las “ Wharton’s jelly mesenchymal stem cells ”, secretan factores \nque inducen apoptosis en diversas líneas celulares tumorales 219,220,221. En este contexto, se ha \nvisto, recientemente, en modelo murino y mediante transcriptómica de célula única, la existencia \nde una subpoblación de células DSC con la capacidad de inducir apoptosis en células \ntumorales268. \nLas moléculas proapoptóticas secretadas por las DSC aún no han sido identificadas, es por ello \nque se precisan estudios de proteómica para lle varlo a cabo. No obstante, este efecto antitumoral \nde las DSC tal vez no represente una actividad fisiológica propia de estas células, sino más bien \nsea una consecuencia de otros efectos fisiológicos, como la apoptosis autoinducida de las DSC \nmencionada anteriormente para permitir el crecimiento controlado del trofoblasto77. \nLos resultados que hemos obtenido sugieren un efecto potencial de las DSC en la terapia \nantitumoral. Y, teniendo en cuenta el efecto protector del MC de dDSC en PBL en reposo y \nactivados y su efecto antitumoral, proponemos que las DSC pueden ser útiles en la inmunoterapia \ncontra el cáncer basada en linfocitos activados269. \nEn resumen, durante el proceso de decidualización se modulan algunas características de \npericitos/MSC que presentan las DSC, tales c omo la morfología fibroblástica; la localización \nperivascular; la contractilidad celular; y la expresión de los marcadores CD140b, CD146, SUSD2 y \nα-SMA. No obstante, se conservan o activan procesos como la angiogénesis y la protección \nlinfocitaria, la actividad inmunoreguladora y la secreció n de factores antitumorales ( Tabla 19). \nEstos cambios asociados a la decidualización pueden desempeñar un papel clave en el \nestablecimiento de la tolerancia materno -fetal y demuestran el potencial terapéutico de las DSC, \npara tratar enfermedades inflamatorias y el cáncer. \n \n \n \n \n \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n144 \n \nTabla 19. Características de preDSC y dDSC. \n \nLas propiedades de DSC, MSC y pericitos se asocian a un \nmismo tipo de célula \nPara descartar que las características de DSC, MSC y pericitos detectadas en nuestras líneas \nde preDSC se debieran a una mezcla de diferentes poblaciones celulares, obtuvimos tres clonos \nde tres líneas de preDSC diferentes. En ausencia de P4 y AMPc, estos clonos tenían morfología \nfibroblástica y no secretaban PRL. No obstante, cuando se cultivaron con estos factores, \nadquirieron una m orfología más redondeada y secretaron PRL ( Figura 6 ). Este resultado \ndemuestra que, al igual que nuestras líneas de preDSC iniciales, en ausencia de factores \ndecidualizantes en el medio de cultivo, los tres clonos también estaban formados por preDSC. \nNuestros clonos de preDSC mostraron un fenotipo antigénico equivalente al de las líneas de \npreDSC originales y expresaron antígenos de MSC y pericitos ( Tabla 14). Por otra parte, en \ncondiciones de cultivo adecuadas, los tres clonos se diferenciaron en adipocito s, condrocitos y \nosteoblastos (Figura 6). Estos resultados demuestran que tanto las características de DSC , como \nlas de pericitos y MSC se asocian con el mismo tipo de célula. \nPapel de las DSC en la tolerancia inmunológica materno-fetal \nEl embarazo conlleva un desafío para el sistema inmunitario, el cual tiene que defender al \norganismo de posibles patógenos pero, por otro lado, debe ser capaz de tolerar los aloantígenos \npaternos expresados por los tejidos del feto. En un embarazo normal, diversos mecanismos hacen \nposible el establecimiento de la tolerancia inmunológica materno -fetal para evitar un aborto. Uno \nde ellos es la inhibición de la diferenciación a células Th1 o de la llegada de estas células a la \ndecidua, de manera que se establece un entorn o antiinflamatorio de tipo Th2 64,271,272,273. Estos \nmecanismos tienen lugar durante la etapa antiinflamatoria del embarazo, la cual se asocia al \ncrecimiento fetal. Otras células inmunitarias también contribuyen al establecimiento del \nmicroambiente antiinflamatorio en esta etapa, incluidos los macrófagos, las uNK y las células \nTreg64. \nCaracterísticas preDSC dDSC Referencias \nLocalización Perivascular Extravascular 83,232 \nMorfología Fibroblástica Redondeada 83 \nSecreción de PRL e IL-15 - + 53,83,207,270 \nExpresión de marcadores de MSC/pericitos + 214,232 \nExpresión de factores angiogénicos + +/ PGF 214,232 \nContractilidad + 232 \nActividad fagocítica + 201 \nActividad inmunoreguladora + 78,80,210 \nApoptosis de PBL - -/ 80,103,214 \nApoptosis de DSC - + 103,214 \nActividad antitumoral -/+ + 214 \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n145 \n \nEn modelo murino, Nancy et al. demostraron previamente que la decidualización de las DSC \ninhibe en estas células la expresión de quimioquinas que atraen células Th1 y Tc (CXCL9, \nCXCL10, CXCL11 y CCL5)81. No obstante, debemos mencionar que existen diferencias en cuanto \na la metodología entre este estudio y la investigación que nosotros hemos desarrollado, ya que \nNancy et al. analizaron la expresión de quimioquinas en DSC de origen murino activadas con \ncitoquinas, mientras que en nuestro caso analizamos el efecto directo de la decidualización en \nDSC humanas. \nA pesar de estas diferencias, nuestros datos en DSC humanas confirman lo s resultados \nprevios. En primer lugar, no se detectó expresión de CXCL9 en preDSC y en dDSC \ndecidualizadas durante 14 días ( Figuras 8A y 8B). No obstante, al repetir este estudio con dDSC \ndecidualizadas durante 8 días usando dos nuevos oligonucleótidos que reconocieran la secuencia \nde CXCL9, comprobamos que las DSC realmente expresan CXCL9 y que la decidualización \ninhibe la expresión de esta quimioquina ( Figura 9A ). En segundo lugar, también obtuvimos \ninhibición de la expresión de CXCL10 y CXCL11 con la dec idualización (Figuras 8A, 8B y 9A). Al \nanalizar los niveles de estas quimioquinas en el MC, confirmamos que la decidualización inhibe \nsignificativamente la secreción de CXCL9, CXCL10 y CXCL11 (Figuras 9B, 9C y 9D). \nLas quimioquinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11 son ligandos del receptor CXCR3 274, el cual se \nexpresa en células Th1, Tc y NK 275, y los datos obtenidos confirman que el proceso de \ndecidualización en DSC inhibe la expresión de estas quimioqui nas, que atraen linfocitos activados \na la decidua. A diferencia de Nancy et al. no obtuvimos diferencias en la expresión de CCL5 en \ndDSC al comparar con preDSC (Figura 8A). Esto puede ser debido a que dicha quimioquina está \nimplicada en diversas funciones necesarias durante el establecimiento de un embarazo humano \nnormal; por ejemplo, favorece la invasión del trofoblasto en la decidua 276 y participa en el \nreclutamiento de células Treg durante la decidualización277. Por otra parte, los receptores de CCL5 \nse expresan en diferentes células inmunitarias, como los monocitos, los cuales llegan a la decidua \nen un embarazo normal278,279. \nEn base a lo anteriormente explicado, todo indica que el proceso de decidualización controla la \nactividad quimiotáctica de las DSC. Podemos afirmar esto ya que las preDSC secretan las \nquimioquinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11, las cuales atraen a linfocitos T activados; mientras que \nen las dDSC se inhibe la secreción de dichos factores. La función activadora de la migración del \nMC de preDSC, debida a la presencia de estas quimioquinas, quedó demostrada en los \nexperimentos realizados bloqueando el receptor C XCR3 en PBL activados. Se pudo comprobar \nque el bloqueo de dicho receptor inhibe la migración linfocitaria en este MC (Figura 13B). Por otra \nparte, nuestros resultados sugieren que la inhibición de la secreción de CXCL9, CXCL10 y \nCXCL11 no explica la inhibición significativa de la migración de PBL activados en el MC de dDSC, \nya que dicho descenso de la migración debería darnos un resultado equivalente al obtenido con el \nmedio Control y no ser significativamente menor que este ( Figura 13A ). El descenso de la \nmigración puede implicar la existencia de un mecanismo activo de inhibición de la migración por \nparte de las dDSC. \nUna explicación posible es que las dDSC estarían secretando factores que inducirían la \napoptosis de linfocitos, como se ha observado en algunas líneas tumorales estudiadas \nanteriormente en esta investigación, como las Raji (linfoma de células B) ( Figura 11 ). No \nobstante, hemos comprobado que los factores secretados por las dDSC o bien no tienen efecto \nsobre PBL, o bien los protegen de la a poptosis ( Figura 11 )237. Es por esto que sugerimos la \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n146 \n \nexistencia de factores inhibidores de la quimiotaxis de células T (TCIF) por parte de las dDSC, los \ncuales inhiben activamente la migración de estas células. Aunque en esta tesis no hemos descrito \nla naturaleza de este o estos factores, la investigación realizada sí nos permite conocer algunas \nde sus características. Por ejemplo, hemos visto que los TCIF tienen un peso molecular inferior a \nlos 6-8 kDa (Figura 13D) y son termoestables (Figura 13C). Además, también comprobamos que \nno están asociados a exosomas, ya que la eliminación de los exosomas del MC de dDSC por \nultracentrifugación no parece modificar los efectos de este medio sobre la migración de PBL \nactivados (datos no mostrados). \nEn base a estos resultados proponemos, para futuras investigaciones, detallar las \ncaracterísticas de los TCIF, los cuales parecen estar implicados en el establecimiento de la \ntolerancia inmunológica materno -fetal. En cuanto a la posible natu raleza bioquímica de estos, es \nimportante mencionar que actualmente se conocen algunos factores “antiquimiotácticos” \nproducidos por patógenos (parásitos, bacterias y virus), tales como proteínas de unión a \nquimioquinas (“chemokine binding proteins”, CKBP), que bloquean su actividad 280,281,282,283. Otros \nfactores que inhiben la quimiotaxis leucocitaria son las efrinas; por ejemplo, la efrina-A1, producida \npor el trofoblasto extravelloso invasivo, es capaz d e inhibir la quimiotaxis de células T 284,285. Por \notra parte, se ha descubierto que la proteína soluble TR6/DcR3 (perteneciente a la familia del \nreceptor del factor de necrosis tumoral, TNFR), la cual es expresada por células endometriales y \ndeciduales, también es capaz de inhibir la quimiotaxis de células T 286,287. Otros investigadores han \ndemostrado que el factor, de naturaleza li pídica, PGE 2 secretada por células deciduales y \nmacrófagos, puede (a altas dosis) inhibir la quimiotaxis de macrófagos 288,289. Otro factor de \nnaturaleza lipídica, la esfingosina -1-fosfato (S1P), generada por distintas células inmunitarias, \ntambién inhibe (a altas dosis) el reclutamiento de células T290,291. \nPor ello, los factores detectados en la interfase materno -fetal, algunos de los cuales están \nasociados al proceso de decidualización, podrían estar relacionados con los TCIF. \nEn cuanto al fenotipo de las células inmunitarias quimioatraídas por DSC, hemos comprobado \nque el efecto activador de la migración del MC de preDSC y el efecto inhibidor del MC de dDSC \nafectan a la quimiotaxis de células Th1 y Tc, pero no a las células NK activadas, ya que no se \nobtienen diferencias significativas (Figura 14C). Además, pudimos comprobar que la expresión de \nlas citoquinas proinflamatorias TNF -α e IFN-γ, producidas por células Th1, disminuye en los PBL \nactivados quimioatraídos por dDSC ( Figuras 14A y 14B). Esto demuestra que la decidualización \nno solo inhibe la quimiotaxis de células Th1 y Tc, sino que también inhibe la expresión de \ncitoquinas propias de células Th1 en los linfocitos activados. \nPor otra parte, al realizar los experimentos de migración ce lular en la línea monocítica tumoral \nTHP-1 no obtuvimos inhibición de la migración con el MC de dDSC ( Figura 15B), indicando que \nprobablemente la actividad de los TCIF se restringe a linfocitos T activados. Es por esto que sí \nobservamos una inhibición sign ificativa de la migración de células Jurkat en el MC de dDSC \n(Figura 15A). \nLos factores secretados por las dDSC tienen un efecto activador de la migración de monocitos \ntumorales THP -1. Aunque estos experimentos no se han realizado con monocitos de sangre \nperiférica, los datos obtenidos con la línea THP -1 son indicativos de la presencia de los \nmacrófagos en el entorno decidual. Los macrófagos deciduales tienen un fenotipo similar a M2 y \nsecretan predominantemente citoquinas antiinflamatorias; además, desempe ñan una función \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n147 \n \nimportante en la renovación de tejidos durante la invasión del trofoblasto y el crecimiento \nplacentario64,119,120,121. \nLos resultados que hemos obtenido, analizados en conjunto, confirman la existencia de un \nmecanismo de tolerancia inmunológica materno -fetal asociado a la decidualización de las DSC , \nque controla la llegada de linfocitos T activados a la decidua. Esto se evidencia por la inhibición de \nla secreción en dDSC de CXCL9, CXCL10 y CXCL11, las cuales son quimioquinas que atraen \ncélulas Th1 y Tc; la secreción de uno o varios factores, de bajo peso molecular y termoestables, \nque inhiben la quimiotaxis de linfocitos T activados; y la inhibición de la expresión de TNF-α e IFN-\nγ por los linfocitos quimioatraídos. \nEl mecanismo explicado tendría lugar en un embarazo normal; pero en otras situaciones \npatológicas, como una infección, donde las moléculas inflamatorias inhiben la decidualización43, el \nefecto activador de la quimiotaxis de las preDSC sería predominante, de manera que las células \nTh1 y Tc sí llegarían a la decidua, desencadenando un aborto292 (Ilustración 18). \nEs necesario tener en cuenta que la implantación y la placentación constituyen una etapa \nproinflamatoria. Las preDSC probablemente están relacionadas con esta etapa inflamatoria (en \nnuestros datos secretan CXCL9, CXCL10 y CXCL 11); mientras que las dDSC estarían \nrelacionadas con la etapa intermedia antiinflamatoria, en la que tendría lugar el crecimiento fetal. \nEn la implantación el número de preDSC debe de predominar sobre el número de dDSC; pero en \nla etapa antiinflamatoria, en la que la P4 está muy elevada, la s dDSC predominarían sobre las \npreDSC. \nLa actividad tolerogénica de las DSC puede ser de gran utilidad en la terapéutica de \nenfermedades inflamatorias en humanos. Por ello, la identificación y el aislamiento de los TCIF \npuede ser una línea de investigació n muy prometedora en el tratamiento de enfermedades \nautoinmunes e inflamatorias , mediadas por células Th1 y Tc. Además, tal como hemos indicado \nanteriormente, las MSC tienen una baja capacidad de decidualización en comparación con las \nDSC; por esta razón, el uso terapéutico de las dDSC puede convertirse en una alternativa a las \nMSC de médula ósea. \n \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n148 \n \n \nIlustración 18. Esquema representativo del posible mecanismo de acción de los factores secretados \npor DSC en la decidua humana, en un embarazo normal y en un contexto patológico. Imagen creada \ncon el software BioRender. \n \nDiferencias entre DSC y EnSC \nActualmente sigue existiendo controversia a la hora de identificar y nombrar a las células \nestromales procedentes del endometrio y de la decidua (EnSC y DSC respectivamente). Debido a \nque el endometrio no gestante pasa a denominarse decidua cuando hay emba razo, algunos \ninvestigadores consideran que las EnSC son células precursoras de las DSC. No obstante, el \nhecho de que, tanto in vivo como in vitro, ambos tipos celulares experimenten la decidualización \nsugiere que deben existir precursores endometriales y precursores deciduales 83,84,85,293. Este \nproceso de diferenciación empieza durante la fase secretora del ciclo endometrial y se mantiene \nen el embarazo. Dado que una de las hipótesis de esta tesis considera que podrían existir \ndiferencias fenotípicas y funcionales entre las EnSC y las DSC, a las células precursoras las \ndenominamos preEnSC y preDSC, respectivamente 84. Hay que tener en cuenta que, aunque son \ncélulas equivalentes, se encuentran en distinto contexto fisiológico y funcional. \nEn nuestra investigación hemos tratado de aportar más datos que permitan esclarecer las \ncaracterísticas de estos precursores estromales, realizando un estudio comparativo del fenotipo y \nde la respuesta a la decidualización, entre preDSC y preEnSC. \nEl análisis, por citometría de flujo, de un conjunto de 36 antígenos en preDSC y preEnSC \nmostró que ambos tipos de células tienen un perfil de marcadores equivalente ( Tablas 13 y 15) \n(Figura 19 ). Los datos obtenidos concuerdan con lo que otros investigadores han comprobado \nsobre la expresión de antígenos de pericitos en células endometriales. Por ejemplo, Darzi et al. \nasociaron la expresión de CD140b, CD146 y SUSD2 con células perivasculares en el \nendometrio294 y Wang et al. , en su estudio transcriptómico de célula única, detectaron diferentes \npoblaciones de células perivasculares positivas para α -SMA que expresaban CD140b, CD146 y \nSUSD2295. Únicamente hemos encontrado diferencias en la expresión de CXL12, que es \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n149 \n \nsignificativamente mayor en preEnSC; esto puede deberse a que CXCL12 es una quimioquina \nmodulable, implicada en el cam bio de endometrio a decidua y responsable de la quimioatracción \nde células NK, entre otras células 43. Las preEnSC de sangre menstrual con las que hemos \ntrabajado se obtienen median te un procedimiento no invasivo. No obstante, consideramos \nnecesario destacar que, a pesar de no obtener diferencias fenotípicas entre preEnSC y preDSC, \nestamos comparando células estromales de un tejido (el endometrio) que ha experimentado un \nproceso de d escamación, con células de un tejido que está experimentando crecimiento y \ndesarrollo (la decidua); por lo tanto, se trata de un contexto funcional diferente. Sin embargo, \npodemos asegurar la fiabilidad de los datos obtenidos, ya que nuestro grupo de inves tigación ha \ndemostrado que tampoco existen diferencias fenotípicas, ni en la respuesta a la decidualización, \nentre EnSC obtenidas a partir de sangre menstrual y a partir de biopsia de endometrio 213. Por esta \nrazón, podemos decir que tampoco habría diferencias fenotípicas al comparar las células \nestromales procedentes de los dos tejidos, endometrial y decidual, establecidos. \nTambién existen diferencias asociadas a la decidualización entre estos precursores; de manera \nque las preDSC son más sensibles a este proceso y, en consecuencia, experimentan un mayor \ncambio morfológico y muerte celular por apoptosis, y también secretan más PRL e IL -1542,77,103 \n(Figura 17). \nLa correcta decidualización celular tiene lugar tras la activación de la P KA dependiente de \nAMPc. Teniendo esto en cuenta, en la presente investigación hemos estudiado y comparado la \nexpresión de las subunidades Cα/β/γ y RIα/β en tre preEnSC y preDSC. Los resultados muestran \nque hay una expresión equivalente de estas proteínas en ambos tipos de células. Por un lado, \nvimos que la decidualización no regula la expresión de la PKA Cα/β/γ; no obstante, la expresión \nde la PKA RIα/β sí aumen ta en ambos tipos celulares y dicho aumento es proporcional al tiempo \nde decidualización, siendo significativamente mayor este incremento en las dDSC. Debido a que \nla PKA formada por las subunidades RI es un activador más eficiente de la respuesta dependiente \nde AMPc que la PKA formada por las subunidades RII 296, el incremento de la expresión de RI en \ndDSC explica su mayor capacidad de decidualización (Figura 18). \nAdemás, también estudiamos la expresión del PR como mediador del proceso de \ndecidualización. Los resultados obte nidos señalan que no existen diferencias en la expresión del \nPR entre preEnSC y preDSC. Aunque en las dEnSC y las dDSC aumenta la expresión de la \nisoforma PR -A respecto al nivel basal como consecuencia de la decidualización, no existen \ndiferencias entre am bos tipos de células ( Figura 18A). Esto sugiere que el estadío inicial de la \nseñalización vía P4 no es responsable de la distinta respuesta a la decidualización observada \nentre EnSC y DSC. También se estudió la expresión del factor de transcripción FOXO1, cuya \nexpresión está regulada positivamente en las primeras etapas del proceso de decidualización, y el \ncual participa en la diferenciación de las células endometriales y la regulación de genes \nproapoptóticos297,298,299. Aunque su expresión aumentó tras la decidualizaci ón, no se obtuvieron \ndiferencias significativas entre EnSC y DSC; es por ello que la expresión de dicho factor no parece \nser determinante en las diferencias observadas entre estos dos tipos de células al decidualizarse \n(Figura 18A). \n Ya que el embarazo s upone un desafío para el sistema inmunitario de la madre, los cambios \nfisiológicos y funcionales a nivel endometrial son esenciales para permitir el establecimiento de un \nendometrio gestante. En este contexto, las DSC tienen un papel clave en el mantenimie nto de la \ntolerancia inmunológica materno -fetal42,78,80,81,237. La información de la que disponemos hasta la \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n150 \n \nfecha, y que se ha detallado en los apartados anteriores , sugiere que las preDSC y las preEnSC \nson el mismo tipo de célula, por su fenotipo antigénico, su ubicación perivascular y su relación con \nMSC; no obstante, estas se encuentran en dos contextos fisiológicos distintos. A pesar de ello, sí \nhemos encontrado p equeñas diferencias fenotípicas y funcionales entre ambos tipos de células. \nEsto puede explicarse por el hecho de que las preDSC han permanecido in vivo un periodo más \nlargo que las preEnSC, antes de ser aisladas y de establecerse líneas celulares con ella s. El \nmicroambiente diferente y los factores hormonales, paracrinos y autocrinos, a los que cada una de \nestas células ha estado expuesta, puede ser determinante en las diferencias encontradas 246. \nAdemás, estas diferencia s parecen estar asociadas al proceso de decidualización, al cual las \npreDSC son más sensibles. Este es un proceso complejo y se precisan más estudios que detallen \nel papel de todas las moléculas involucradas y cómo influyen los factores genéticos y \nepigenéticos. \nEn cuanto a la actividad quimiotáctica de las EnSC, hemos comprobado que la decidualización \ninhibe la secreción de la quimioquina CXCL9; no obstante, la secreción de CXCL10 aumenta a \nnivel endometrial (Figuras 20B y 20C). Este resultado concuerda con lo que otros investigadores \nhan descubierto, concretamente que en la fase secretora premenstrual aumenta la producción de \nuna serie de mediadores inflamatorios por parte de las células endometriales decidualizadas, \nentre los que se encuentra CXCL10. Muchos de esos factores median el reclutamiento y la \nactivación de leucocitos, particularmente macrófagos, neutrófilos, células uNK y eosinófilos, que \nliberan enzimas que participan en la destrucción del tejido endometrial durante la menstruación y \ntambién se encargan de la protección frente a posibles infecciones300. \nAl comparar los niveles de secreción de las quimioquinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11 entre \npreDSC y preEnSC hemos encontrado que, en los tres casos, la secreción en pr eDSC es \nsignificativamente más alta ( Figuras 20B, 20C y 20D). Dicho resultado concuerda con el análisis \nde la migración linfocitaria, ya que las preDSC atraen a un mayor número de PBL activados que \nlas preEnSC ( Figura 21 ). El hecho de que las preDSC secret en niveles más altos de las \nquimioquinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11, las cuales atraen a más linfocitos T activados, puede \nestar relacionado con la función que desempeñan estas células inmunitarias en las primeras \netapas de un embarazo, concretamente en el mom ento de la implantación, la invasión del \ntrofoblasto y la placentación , que constituyen un estadío proinflamatorio 64. Además, mediante la \nsecreción de quimioquinas, como CXCL10 (además de CXCL12 y CX3CL1), las DSC participan en \nel reclutamiento de células NK desde sangre periférica hasta el tejido decidual 110. Por otra parte, \ntanto dDSC como dEnSC inhiben la quimiotaxis de PBL activados ( Figura 21 ), lo cual estaría \nrelacionado con la inhibición de la secreción de la quimioquina CXCL9 e n ambos tipos de células \n(Figura 20B) y la probable producción de TCIF. \n En conjunto, nuestros resultados sugieren que el proceso de decidualización a partir de \nprecursores endometriales y deciduales ocurre tanto en el endometrio como en la decidua y es un \nproceso activo durante el embarazo. En base a ello, las preDSC y las pr eEnSC son el mismo tipo \ncelular y están estrechamente relacionadas con las MSC y los pericitos, pero se encuentran en \ndos contextos fisiológicos diferentes, la decidua y el endometrio respectivamente ( Ilustración 19). \nPor esta razón, ambas presentan algunas diferencias fenotípicas y funcionales asociadas al \nproceso de decidualización, siendo las preDSC más sensibles y mostrando una mayor capacidad \nde diferenciación. \n \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n151 \n \nIlustración 19. Esquema representativo de la dec idualización de células endometriales estromales \nprecursoras (preEnSC) a células endometriales estromales decidualizadas (dEnSC) y de la \ndecidualización de células deciduales estromales precursoras (preDSC) a células deciduales \nestromales decidualizadas (dDSC). Imagen creada con el software BioRender. \n \neEnSC y su papel en el establecimiento del foco ectópico de \nendometriosis \nConocer la etiología y el mecanismo de la patogenia de la endometriosis sigue siendo un reto \nhoy día. Aunque se han realizado estudios comparativos entre las células y tejidos \nendometriósicos, y las células y tejidos endometriales sanos, se desconoce cuál es el factor o \nfactores básicos etiológicos que determinan el inicio y el desarrollo de la enfermedad, aunque \nexisten evidencias que sugieren que la endometriosis es una enfermedad multifactorial130,131,301. En \nla investigación llevada a cabo hemos intentado ampliar el conocimiento que se tiene hasta el \nmomento sobre la comunicación intercelular entre las eEnSC y las células del sistema inmunitario, \npara intentar dilucidar cuáles son los mecanismos rela cionados con el proceso inflamatorio que \ncaracteriza a la endometriosis. Los datos de los que disponemos hasta el momento no aclaran si \nes el proceso inflamatorio el que favorece el desarrollo de focos de endometriosis o si es el foco \nde endometriosis el que induce el proceso inflamatorio302. \nEn primer lugar, hemos realizado un análisis comparativo del fenotipo antigénico entre las \ncélulas obtenidas a partir de endometriomas ováricos y las células del tejido endometrial de \nmujeres sanas, y hemos evaluado la diferente respuesta a la decidualización. \nLa resistencia a la P4 es una de las propiedades princ ipales de las células endometriósicas, lo \ncual ha sido corroborado al decidualizar nuestras líneas de eEnSC (Figura 22A). El aumento de la \nproporción ER-β/ER-α en las eEnSC, al comparar con las EnSC, se asocia a la supresión del PR, \nlo que contribuye a su resistencia a la P4158,159. \nAnteriormente mostrábamos que la decidualización induce un cambio morfológico y funcional \nen las DSC y en las EnSC, aunque en estas últimas en menor medida (Figura 1A y Figura 16A). \nAl comparar la respuesta a este proceso entre las EnSC y las eEnSC, se ha observado que las \ncélulas procedentes de focos ectópicos de endometriosis se decidualizan parcialmente, ya que \nconservan en su mayoría la morfo logía fibroblástica, apenas producen PRL y no sufren apoptosis \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n152 \n \ntras la exposición prolongada a AMPc y P4 (Figura 23). La resistencia a la decidualización es una \npropiedad que relaciona a las eEnSC con las MSC (Figura 3). \nLos datos experimentales obtenid os por Klemmt et al . indican que las células estromales \nprocedentes de endometriomas ováricos conservan la capacidad de diferenciarse \nmorfológicamente (aunque estos cambios no empiezan a observarse de forma inmediata, sino \ndurante el día 6 de decidualizaci ón) y de secretar marcadores bioquímicos de decidualización, \ncomo PRL e IGFBP-1, pero a un nivel mucho más bajo que las células del estroma endometrial de \nuna mujer sana 303. Las discrepancias con nuestros datos pueden deberse a la diferente \nmetodología empleada en el cultivo celular. En nuestro caso empleamos el medio de cultivo Opti -\nMEM su plementado con un bajo porcentaje de FBS (3%), asegurándonos de esta manera que \nestamos trabajando con células que mantienen su estado indiferenciado; mientras que en la \ninvestigación citada se emplea medio de cultivo DMEM al 10%. Por otra parte, en dicho estudio \nlas células se decidualizaron únicamente con AMPc, mientras que nosotros empleamos el \nprotocolo estándar de decidualización con AMPc y P429. \nLa resistencia a la apoptosis de las eEnSC permite su supervi vencia en localizaciones \nectópicas. Esta característica se debe, en parte, a la sobreexpresión del gen antiapoptótico Bcl-2 y \ntambién a la expresión alterada del ligando de muerte FasL. Diferentes investigaciones han \ndemostrado que l a susceptibilidad de las células endometriales ectópicas a la apoptosis \nespontánea es significativamente menor que la de las células endometriales eutópicas de mujeres \nsanas154,155,204,304,. \nEn cuanto a la caracterización fenotípica, las eEnSC muestran una expresión de marcadores \nsimilar a las MSC ( Figura 22B) (Tabla 16). Este resultado, común con otras células estromales \nuterinas, concuerda con la teoría sobre el origen de la endometriosis que indica que esta \nenfermedad surge del crecimiento ectópico y aberrante de células mesenquimales de médula \nósea (“homing erróneo”), las cuales desempeñan un papel importante en la fisiopatología de la \nenfermedad. Nuestros resultados coinciden con los datos obtenidos en un estudio que demostró la \npresencia de células estromales con un fenotipo de MSC en el tejido endometrial ectópico de \nmujeres con endometriosis. Dichas células expresaban los marcadores tí picos de MSC CD29, \nCD44, CD90 y CD105, al igual que nuestras líneas de eEnSC305. \nLas EnSC y las eEnSC, con propiedades de MSC, comparten una expresión similar de \nmarcadores de superficie. No obstante, el estudio comparativo del fenotipo antigénico mostró una \nmenor expresión de los marcadores de pericitos CD140b, SUSD2, MFG -E8, nestina y STRO-1 en \nlas preeEnSC que en las preEnSC ( Figura 24 ). Nuestros resultados difieren de los dat os \npresentados recientemente por Chunmei Li et al ., quienes obtuvieron una expresión equivalente \nde marcadores de células perivasculares, como CD140b y SUSD2, entre EnSC y eEnSC. Las \ndiferencias entre ambas investigaciones pueden ser atribuibles al menor t amaño muestral y a la \nvariabilidad en la expresión antigénica entre las distintas muestras de endometrio eutópico, que \nasumen los autores de dicho estudio306. \nEn cuanto a la actividad quimiotáctica de las eEnSC, hemos comprobado que la \ndecidualización inhibe la secreción de la quimioquina CXCL9, tal como ocurre en las DSC y en las \nEnSC. No obstante, la secreción de CXCL10 y CXCL11 no varía con la decidualización ( Figuras \n25B, 25C y 25D). Al comparar los niveles de secreción de las tres quimioquinas estudiadas entre \npreEnSC y preeEnSC hemos encontrado que la secreción de CXCL9 y CXCL10 es \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n153 \n \nsignificativamente más alta en preeEnSC ( Figuras 25B y 25C). Dicho resultado concuerda con el \nanálisis de la migración linfocitaria, ya que las preeEnSC atraen a un mayor número de P BL \nactivados que las preEnSC (tras 48 horas de incubación de los linfocitos con los MC) ( Figura \n26B). El hecho de que las preeEnSC secreten niveles más altos de las quimioquinas CXCL9 y \nCXCL10 puede estar relacionado con la quimioatracción de células NK (c on actividad citotóxica \nreducida) al líquido peritoneal de mujeres con endometriosis130,307. Comprobamos este resultado al \nestudiar el fenotipo antigénico de las poblaciones linfocitarias quimioatraídas al estar en contacto \ncon los factores secretados por preEnSC y preeEnSC, encontrando un incremento significativo del \nnúmero de células CD56+/CXCR3+ migradas en el MC de preeEnSC (Figura 27E). \nEl efecto activador de la migración de preEnSC y preeEnSC también se observó sobre la \nsubpoblación de células Tc (CD8+ /CXCR3+) ( Figura 27D ). En el caso de las preEnSC, este \nresultado se explica porque la presencia de linfocitos T citotóxicos a nivel endometrial es \nespecialmente importante durante la fase proliferativa del ciclo cuando constituyen \naproximadamente el 33% de la población total de leucocitos; se encuentran principalmente \nformando agregados linfoides, pero también dispersos en el est roma endometrial. La capacidad \ncitotóxica de estas células ejerce una función protectora en el endometrio. Aunque dichas células \ntambién están presentes durante la fase secretora en los agregados linfoides ya formados, su \nactividad citotóxica disminuye por que puede producirse la concepción 3,4. Por lo que respecta al \nendometrioma, se ha comprobado que el tejido ectópico contiene linfocitos T CD8+; además, la \nconcentración de células CD8+ en el líquido peritoneal de las pacientes con endometriosis se \nincrementa en comparación con el líquido peritoneal de mujeres sanas185,186. \nPor otra parte, tanto dEnSC como deEnSC inhiben la quimiotaxis de PBL activados ( Figura \n26), lo cual estaría relacionado con la inhibición de la secreción de la quimioquina CXCL9 en \nambos tipos de células (Figura 25B) y la probable producción de TCIF. En cuanto a la quimiotaxis \nde las subpoblaciones de PBL activados, obtuvimos inhibición de la migración de célula s Th1 \n(CD4+/CXCR3+) por parte de las dEnSC ( Figura 27C ); mientras que las deEnSC también \ninhibieron la llegada de células Th1 (CD4+ /CXCR3+) y Tc (CD8+/CXCR3+) (Figuras 27C y 27D). \nEn primer lugar, estos resultados pueden estar relacionados con la baja proporción de células Th1 \na nivel endometrial durante la fase secretora del ciclo, cuando se produce la decidualización. En \ndicho estadío también tiene lugar una elevada reducción del número de linfocitos Treg \nCD4+/CD25+/Foxp3+4,15. Al realizar los experimentos de quimiotaxis con la línea linfocítica \ntumoral Jurkat observamos, de nuevo, una inhibición significativa de la migración en el MC de \ndEnSC y deEnSC (Figura 31A). \nContinuamos con el estudio de la inmunopatología de la endometriosis y nos centramos en \nanalizar el efecto de los factores secretados por EnSC y eEnSC sobre la quimioatracción de \nmonocitos de sangre periférica y tumorales (línea THP -1). Hemos trabajado con monocitos con el \nobjetivo de estudiar su migración ha cia el tejido endometrial de una mujer sana y el tejido \nendometrial ectópico, así como su diferenciación en dichas localizaciones hasta adquirir un \nfenotipo típico de macrófagos. \nLos resultados obtenidos mostraron que las preEnSC y las preeEnSC son capaces de atraer \nmonocitos, aunque las preeEnSC atraen a un mayor número de estas células inmunitarias (Figura \n28). Este resultado se confirmó al repetir los experimentos de migración celular con la línea \nmonocítica tumoral THP -1, de manera que la quimioa tracción de dichas células por el efecto de \nlos factores secretados por las preeEnSC es significativamente mayor que por las preEnSC \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n154 \n \n(Figura 31B ). La explicación fisiológica de los resultados correspondientes a las preEnSC se \nsustenta en el hecho de que du rante la fase proliferativa del ciclo endometrial se incrementa la \nquimioatracción de monocitos desde sangre periférica. Los macrófagos llegan a representar entre \nel 1-2% del total de células del endometrio durante la fase proliferativa, siendo los leucoci tos más \nabundantes durante el proceso de reparación y regeneración del endometrio 12,14. En el contexto \ndel endometrioma, la llegada de monocitos des de sangre periférica determina, en parte, el \nelevado número de macrófagos en el líquido peritoneal y en el tejido ectópico, cuya función es \nfundamental para el desarrollo de la lesión167,169. \nEn cuanto al fenotipo de las células quimioatraídas, podemos decir que hay una elevada \natracción de monocitos polarizados hacia M2 (CD163+ /CD206+) por parte de las preEnSC y las \npreeEnSC (Figura 30). Además, los resultados también sugieren que los factores secretados por \nambos tipos celulares diferencian los monocitos hacia un fenotipo M2 antiinflamatorio ( Figura 29). \nEstos resultados nos llevaron a preguntarnos cuál es el papel de los macrófagos antii nflamatorios \nen el tejido endometrial eutópico y ectópico. Hay que tener en cuenta que una simple clasificación \nde los macrófagos en fenotipos M1 y M2 no explica la elevada diversidad fenotípica de estas \ncélulas en los diferentes tejidos. Gordon et al. sugirieron que la activación de los macrófagos se \nlleva a cabo en diferentes etapas de diferenciación y está determinada por el microambiente \ntisular, compuesto por una combinación de citoquinas y quimioquinas moduladoras. Además, las \npoblaciones de macrófago s residentes en los tejidos pueden cambiar su fenotipo y función, e \nincluso expresar simultáneamente marcadores proinflamatorios y antiinflamatorios 14,308. A lo largo \ndel ciclo, el aumento del número de macrófagos a nivel endometrial ocurre debido a la quimiotaxis \nde monocitos desde sangre periférica y a la proliferación local. Nuestros resultados coinciden con \nlas investigaciones que demuestran que, durante la fase proliferativa, los macrófagos con \nactividad antiinflamatoria están presentes en el endometrio y desempeñan funcione s clave en la \nreparación del tejido, tras la menstruación, y la angiogénesis 14,309. En la endometriosis, el \nestablecimiento de la lesión se caracteriza por el crecimiento del tejido endometrial y la formación \nde vasos sanguíneos, eventos que se ven interrumpidos en ausencia de macrófagos, tal y como \ndemostraron Bacci et al. Los macrófagos en dometriósicos participan en la eliminación, mediante \nfagocitosis, de glóbulos rojos envejecidos y de restos de células endometriales ; además, envían \nseñales tróficas y antiapoptóticas que facilitan la supervivencia de las células endometriales \nectópicas. Estas funciones caracterizan a los macrófagos que han adquirido un fenotipo reparador \nM2. Dicho fenotipo es propio tanto de los macrófagos presentes en el peritoneo, como de los \nmacrófagos infiltrantes en la lesión ectópica, los cuales expresan niveles elev ados de los \nmarcadores CD163 y CD206167,309. \nPor otro lado, tanto dEnSC como deEnSC inhiben la migración de monocitos de sangre \nperiférica, aunque no de forma significativa, ( Figura 28 ) y, particularmente, la de aquellos que \npresentan un fenotipo M2 ( Figura 30). Además, los resultados también sugieren que los factores \nsecretados por ambos tipos de células decidualizadas inhiben la diferenciación de los monocitos \nhacia un fenotipo M2 ( Figura 29). A nivel endometrial, este resultado indicaría que el proceso de \ndecidualización inhibe la llegada de macrófagos antiinflamatorios y, en parte, concuerda con los \ndatos de otros investigadores que demuestran que e n la fase secretora se genera un ambiente \nproinflamatorio, el cual desempeña un papel esencial en la preparación del endometrio para la \nposible implantación del embrión. Respecto a la endometriosis, las deEnSC también inhiben la \nllegada de monocitos diferenciados hacia un fenotipo M2. Teniendo en cuenta que los macrófagos \nM2 favorecen el desarrollo de la enfermedad, los gestágenos utilizados en el tratamiento de la \n\n\nDISCUSIÓN \n \n \n155 \n \nendometriosis desarrollan su actividad terapéutica al inducir decidualización en las eEnSC y, en \nconsecuencia, reducir la presencia de macrófagos M2. \nNo obstante, los resultados obtenidos con monocitos de sangre periférica parecen entrar en \ncontradicción con los obtenidos en la línea monocítica tumoral THP -1. Esto se observa por el \nhecho de qu e la migración de las células THP -1 se incrementa significativamente en los MC de \ndEnSC y deEnSC, al contrario de lo que ocurre en monocitos sanguíneos ( Figura 31B); además, \nlas células quimioatraídas por los factores secretados por EnSC y eEnSC no decidua lizadas y \ndecidualizadas no están polarizadas hacia un fenotipo M2 ( Figura 33 ). Una explicación de los \nresultados obtenidos puede ser que la quimioatracción de las células THP -1 no disminuye en los \nMC de dEnSC y deEnSC porque se trata de una línea tumoral , que no experimenta diferenciación \na un fenotipo M2, tal como sí ocurre en monocitos de sangre periférica. \nEn conjunto, nuestros resultados sugieren que el microambiente de las lesiones \nendometriósicas es altamente complejo y dinámico , y confluyen señales proinflamatorias, \nantiinflamatorias y angiogénicas. En los años recientes se han realizado numerosos estudios para \nintentar explicar la composición del microambiente inmunitario de las lesiones y cómo este \ncontribuye al establecimiento del foco ectópico. En nuestra experiencia hemos podido determinar \nque existe una importante quimioatracción de células NK, células Tc y monocitos polarizados \nhacia un fenotipo M2, por parte de las células endometriales ectópicas, aunque la decidualización \ninhiba la llegada d e estas últimas células. En base al reciente éxito de las terapias \ninmunomoduladoras dirigidas a la inflamación crónica en otras enfermedades inflamatorias, es \nposible que en el futuro se puedan desarrollar estrategias terapéuticas basadas en el bloqueo de \nlas moléculas implicadas en la comunicación intercelular, entre las eEnSC y la s células del \nsistema inmunitario. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n156 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nCONCLUSIONES \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nCONCLUSIONES \n \n \n157 \n \n1. Las preDSC de la decidua humana son MSC que se localizan en el nicho perivascular. \n \n2. La decidualización de las DSC humanas (dDSC) favorece la inhibición de la quimiotaxis de \nlinfocitos T activados con actividad proabortígena a la decidua, constituyendo así un \nmecanismo de tolerancia inmunológica materno-fetal. \n \n3. Las DSC tienen una mayor cap acidad para decidualizarse que las EnSC. Esta diferencia es \ndebida, probablemente, a los distintos contextos fisiol ógicos en los que se encuentran: \nendometrio no gestante (EnSC) y decidua (DSC). \n \n4. Las eEnSC están relacionadas con las MSC. Esto puede explicar el establecimiento de focos \nde endometriosis en localizaciones peritoneales y extraperitoneales. \n \n5. Las eEnSC tienen una mayor capacidad de atracción de linfocitos T y células NK activadas que \nlas EnSC, lo cual podría estar relacionado con la patogenia de la enfermedad. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n158 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nBIBLIOGRAFÍA \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nBIBLIOGRAFÍA \n \n \n159 \n \n1. Salamonsen LA, Hutchison JC, Gargett CE. Cyclical endometrial repair and regeneration. \nDevelopment. 2021;148(17):dev199577. \n2. Gargett CE, Nguyen HPT, Ye L. Endometrial regeneration and endometrial stem/progenitor \ncells. Rev Endocr Metab Disord. 2012;13(4):235-251. \n3. 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