{"paper_id":"30c1464d-420d-4002-a12a-6370b5f59d6e","body_text":"Giorn. It. Ost. Gin. Vol. XXVII - n.  9\nSettembre 2005\nBiologia della cellula endometriosica\nF. MINICI\n1\n, F. TIBERI\n2\n, F. MICELI\n1\n, A. TROPEA\n1\n, M. ORLANDO\n1\n, M.F. GANGALE\n1\n, A. BOMPIANI\n2\n,\nS. CAMPO\n1\n, A. LANZONE\n1\n, R. APA\n1\n,\nL'endometriosi è una malattia ginecologica benigna\nestrogeno-dipendente che colpisce circa il 10% delle\ndonne in età riproduttiva, caratterizzata dalla presenza\ndi tessuto endometriale (ghiandole e stroma) al di fuori\ndella cavità uterina ed associata a dolore pelvico, disme-\nnorrea ed infertilità. Secondo l'ipotesi di Sampson (1)\ncellule endometriali desquamate vengono trasportate\nverso la cavità peritoneale attraverso le tube da una\nmestruazione retrograda. Dopo l'adesione, le cellule\nendometriali proliferano e inducono una risposta\ninfiammatoria nella cavità peritoneale. La discrepanza\ntra il frequente reperimento di cellule mestruali desqua-\nmate in cavità peritoneale che suggeriscono un caratte-\nre para-fisiologico del fenomeno di mestruazione retro-\ngrada e l'effettiva incidenza di endometriosi sintomati-\nca, implica il coinvolgimento di altri fattori predispo-\nnenti nella patogenesi della malattia. Un possibile ruolo\nfavorente è stato suggerito per i seguenti fattori: predi-\nsposizione genetica; alterazioni immunitarie permissive\nper l'impianto ectopico dell'endometrio e/o in grado di\namplificare la risposta infiammatoria peritoneale;\nambiente ormonale favorente la crescita tissutale; alte-\nrazioni anatomiche e/o discinetiche del tratto utero-\ntubarico. Tuttavia nonostante le numerose ricerche cli-\nniche e sperimentali, la patogenesi dell'endometriosi\nrimane ancora controversa, in particolare per quanto\nriguarda la compromissione della fertilità in pazienti\ncon endometriosi lieve e moderata, in assenza quindi di\nalterazioni meccaniche del tratto riproduttivo.\nAlla peculiarità della composizione del fluido peri-\ntoneale e al diverso comportamento biologico dell'en-\ndometrio eutopico delle pazienti con endometriosi, è\nstata fin ora imputata la responsabilità del ridotto out-\ncome riproduttivo di queste pazienti; su tali problema-\ntiche si sono concentrati gli studi con risultati purtrop-\npo ancora controversi. \nLo sviluppo di endometriosi presuppone che stro-\nma ed epitelio endometriale aderiscano, s'impiantino,\nsopravvivano e crescano su superficie ovarica e/o peri-\ntoneo. La possibilità che un tessuto vada incontro a\nquesti fenomeni al di fuori del suo habitat deve neces-\nsariamente trovare la complicità dei fattori favorenti\ngià citati, ma nella fisiopatologia dello sviluppo dell'en-\ndometriosi non va sottovalutato il ruolo rilevante gio-\ncato dall'endometrio eutopico.\nL'endometrio eutopico delle pazienti con endome-\ntriosi è caratterizzato da un'aumentata attività prolife-\nrativa ed angiogenetica (2, 3, 4, 5), e da numerosi cam-\nbiamenti immunologici e funzionali. Tra questi citiamo\nla presenza di anticorpi verso specifici antigeni endo-\nmetriali (6), l'aumentata secrezione di IL-6 da parte\ndelle cellule stromali (7), la marcata infiltrazione leuco-\ncitaria (8) e l'aumentata espressione della monocyte\nchemotactic protein-1 (MCP-1) che potrebbe essere\ncoinvolta nel considerevole reclutamento di monociti e\nmacrofagi nella cavità endometriale (9, 10). Numerose\npeculiarità funzionali, simili a quelle delle cellule endo-\nmetriosiche, caratterizzano l'endometrio eutopico di\ntali pazienti. Le più rappresentative tra queste sono: la\ncapacità di esprimere l'aromatasi, l'enzima che catalizza\nla produzione di estradiolo a partire dall'androgeno\n(11) e l'aumentata espressione di cicloossigenasi\n(COX)-2 con il conseguente incremento nella produzio-\nne di prostaglandine (PGs). Alcuni autori hanno suggeri-\nto che PGs ed estrogeni possano essere coinvolti in una\nsorta di feed-back positivo; infatti, gli estrogeni stimola-\nno l'attività della COX-2 e la PGE2 da essa prodotta a\nsua volta indurrebbe l'espressione dell'aromatasi attra-\nverso un'azione paracrina (12, 13). \nInoltre l'endometrio eutopico mostra una minore\ntendenza all'apoptosi spontanea e una minore suscettibi-\nlità all'apoptosi indotta dai macrofagi attivati (14, 15),\nnonché un differente pattern d'espressione di alcune\nimportanti molecole di superficie quali l'integrina 3\n(molecola di adesione coinvolta nell'impianto) (16) e\nsICAM (implicata nell'attività delle NK) (17).\nLe donne con endometriosi sono caratterizzate dal-\nl'alterazione di alcuni parametri immunologici. Per\nquanto riguarda l'immunità cellulo-mediata, alcuni\nUniversità Cattolica del Sacro Cuore, Roma\n1\nDivisione di Fisiopatologia della Riproduzione Umana, \n2 \nIstituto Scientifico Internazionale Paoli VI\n© Copyright 2005, CIC  Edizioni Internazionali, Roma\n308\n\nautori hanno dimostrato la presenza di un aumentato\nnumero di macrofagi attivati e linfociti a livello perito-\nneale (18, 19); difetti nell'attività delle NK potrebbero\nessere responsabili della mancata clearance di cellule\nendometriali (20). Inoltre anomalie funzionali sono\nanche state riscontrate nella produzione anticorpale dei\nlinfociti B (21, 22) e un incremento del rapporto tra\nlinfociti T helper/ T suppressor è stato descritto da alcu-\nni autori già venti anni fa (5, 23).\nIl fluido peritoneale delle donne con endometriosi\ncontiene un cospicuo numero di macrofagi attivati e di\naltre cellule immuni che secernono vari prodotti locali,\ncome fattori di crescita e citochine. Un ruolo primario è\nstato attribuito a numerose citochine contenute nel flui-\ndo peritoneale come l'interleuchina (IL)-6, l'IL-8 e il\ntumor necrosis factor (TNF)-alfa, prodotte non solo\ndalle cellule immuni, ma anche dalle cellule endometrio-\nsiche degli espianti ectopici, sotto specifici stimoli. Le\ncitochine sono sostanze proteiche che giocano un ruolo\ncentrale nella regolazione di proliferazione, attivazione,\nchemiotassi e morfogenesi cellulare (24). Il fluido perito-\nneale delle pazienti con endometriosi è in grado di com-\npromettere il processo ovulatorio, la funzione spermati-\nca e l'interazione dei gameti, nonché lo sviluppo embrio-\nnale di topo in vitro (25, 26, 27, 28, 29).\nLe cellule endometriosiche degli espianti ectopici\nesprimono pressoché tutte le alterazioni descritte per\nl'endometrio eutopico; tuttavia queste caratteristiche\nrisultano amplificate per l'influenza dei fattori sopra\ndescritti. Le sostanze presenti a livello peritoneale,\ninfatti, inducono nella cellula l'alterata espressione di\nnumerose molecole, tra cui metalloproteinasi e loro\ninibitori (30), e anomalie nell'equilibrio PA/PAI (31),\nun sistema di proteasi  coinvolte nel rimodellamento\ntissutale e nell'invasività. Il tessuto endometriosico\nectopico presenta inoltre un'aumentata attività prolife-\nrativa ed angiogenetica ed un'incrementata attività del-\nl'aromatasi rispetto all'endometrio eutopico, risultante\nin un'estrogenizzazione locale in grado di auto-amplifi-\ncarsi sia per il già descritto meccanismo di feed-back\ncon il sistema prostaglandinico sia grazie alla ridotta\ndegradazione del 17-beta-estradiolo a causa della defi-\nciente espressione della 17-beta- idrossisteroide-dei-\ndrogenasi (32).\nRuolo dell'endometrio eutopico \nnel ridotto outcome riproduttivo\nNumerosi studi suggeriscono un ruolo centrale del-\nl'endometrio eutopico sulla patogenesi dell'infertilità in\npazienti con endometriosi. L'endometrio di donne con\nendometriosi presenta, infatti, una deficitaria presenza\ndi molecole di adesione importanti per l'impianto (15),\nnonché un'aberrante espressione genica e un alterato\npattern proteico relativi ad una serie di fattori coinvolti\nnel cross-talk tra blastocisti ed endometrio durante la\nfinestra dell'impianto come dimostrato da recenti studi\nche si avvalgono di metodiche quali microarray ed analisi\nproteomica (33, 34). \nNel nostro studio abbiamo valutato l'effettiva capa-\ncità di questo tessuto di andare incontro al processo di\ndecidualizzazione. Questo fondamentale processo fa\nparte del complesso meccanismo dell'impianto in cui è\nrichiesta la presenza di un embrione in grado di indurre\nle adeguate modifiche nell'endometrio e di un tessuto\nBiologia della cellula endometriosica\n309\nFig. 1 - Decidualizzazione in vitro basale (BASALE), in presenza\ndi fluido peritoneale di pazienti con endometriosi (FP-E) e di\nfluido peritoneale di controllo (FP-CTR). Le concentrazioni di\nprolattina (PRL) sono espresse come percentuale dei valori\nmisurati al giorno 3 ([PRL]) al giorno 3 = 100%). Significatività\nrispetto al fluido peritoneale di controllo: ** p < 0,01.\nFig. 2 - Decidualizzazione in vitro basale (BASALE), in presenza\ndi fluido peritoneale di pazienti con endometriosi (FP-E) e di\nfluido peritoneale di controllo (FP-CTR) al giorno 3, 6, 9 e 12. Le\nconcentrazione di prolattina (PRL) per ciascun giorno sono\nespresse come percentuale dei valori misurati nella decidualiz-\nzazione basale ([PRL] basale = 100%). Significatività rispetto\nalla decidualizzazione in vitro basale: * p < 0,05; ** p < 0,01.\n\nendometriale pronto a ricevere tali segnali. La decidualiz-\nzazione delle cellule stromali endometriali (ESC) è un\ncomplesso processo differenziativo caratterizzato da\nmodifiche morfologiche e funzionali prevalentemente\nsotto l'influenza del progesterone durante la fase secreti-\nva del ciclo mestruale e di una serie di sostanze che agi-\nscono in maniera autocrina e paracrina sulle cellule pre-\ndeciduali al fine di ottenere il successo dell'impianto. \nIl nostro intento è stato quello di voler comprende-\nre meglio quanta parte della ridotta recettività  endo-\nmetriale sia dovuta effettivamente alle anomalie intrin-\nseche della cellula endometriale e quanta  responsabi-\nlità sia invece a carico dell'ambiente chimico-fisico\ncondizionante. Lo studio si è avvalso pertanto della\npossibilità di riprodurre in vitro un ambiente che possa\nmimare quello intrauterino delle pazienti con endome-\ntriosi, coltivando cellule stromali endometriali  di\npazienti di controllo con fluidi peritoneali di donne\ncon endometriosi. Questo step sperimentale si basa sul\npresupposto che tanto l'endometrio eutopico (all'inter-\nno della cavità uterina) quanto quello ectopico (i foco-\nlai di endometriosi extra-uterini) sono entrambi sotto-\nposti ad un ambiente extracellulare simile; infatti, sia la\ncavità uterina che quella peritoneale sono caratterizzate\ndall'attivazione dei medesimi parametri immunologici\ne dal medesimo ambiente ormonale (iper-estrogeniz-\nzazione). Le cellule stromali sono state decidualizzate\nin vitro in presenza di fluido peritoneale endometriosi-\nco (o di controllo) e la performance di differenziazione\nè stata valutata tramite dosaggio nel medium di coltura\ndi prolattina, importante marker di decidualizzazione.\nI frammenti bioptici necessari al nostro studio sono\nstati prelevati tramite curettage della cavità uterina di\ndonne in fase medio-luteale del ciclo mestruale (XX-\nXXIII giorno dall'ultima mestruazione); si tratta di\ndonne con ciclo regolare sottoposte a laparoscopia\noperativa in assenza di anormalità riconducibili alla\npatologia endometriosica (controlli). \nIn sede operatoria, laparoscopica e laparotomica, è\nstato altresì prelevato il fluido peritoneale di pazienti\ncon endometriosi e di pazienti non affette (controlli);\ntali campioni sono stati centrifugati (10 minuti a 1000\nrpm), aliquotati e conservati a - 80 °C.\nI frammenti bioptici endometriali (tanto endome-\ntriosici che di controllo) sono stati processati fino ad\nottenere la separazione delle cellule stromali da quelle\nepiteliali. Le cellule stromali purificate sono state semi-\nnate in flasks da 25 cm\n2\ne coltivate con terreno DME\ncontenente il 10% di siero fetale bovino ed una solu-\nzione di antibiotici (Penicillina e Streptomicina). Le\npiastre sono state mantenute a 37°C in atmosfera umi-\ndificata ed in presenza di una concentrazione costante\ndi CO\n2 (5%). Dopo la confluenza nella flask T25, al\nfine di ottenerne la decidualizzazione in vitro, le cellule\nstromali sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e\ncoltivate per un periodo di tempo di 12 giorni in pre-\nsenza di estradiolo e progesterone alle concentrazioni\ndi 10\n-8 e 10-7 M rispettivamente, come riportato in let-\nteratura; tali concentrazioni risultano, per entrambi gli\normoni, comprese nei limiti fisiologici riscontrati a\nlivello ematico durante una gravidanza normale. Il ter-\nreno di coltura addizionato di ormoni delle cellule stro-\nmali è stato cambiato ad intervalli regolari di tre giorni,\nraccogliendo e conservando a -20°C il terreno preleva-\nto da ciascun pozzetto. Ogni esperimento ha incluso\npozzetti di controllo (coltivati con medium semplice);\npozzetti con decidualizzazione basale; pozzetti con\ndecidualizzazione in presenza di fluido peritoneale di\ncontrollo al 10% e in presenza di fluido peritoneale\nendometriosico al 10%. La titolazione della prolattina,\nprodotta dalle cellule stromali cresciute in presenza o\nassenza di stimoli ormonali o di fluidi peritoneali, è\nstata ottenuta mediante un kit commerciale immuno-\nenzimatico. La sensibilità del saggio è di 1 ng/ml ed il\ncoefficiente di variazione è al di sotto del 8-5%.\nI risultati del nostro studio dimostrano che il fluido\nperitoneale di pazienti con endometriosi interferisce\ncon il processo di decidualizzazione in vitro dello stro-\nma di pazienti non affette. In particolare abbiamo veri-\nficato che lo stroma decidualizzato in presenza del flui-\ndo peritoneale endometriosico subisce una significati-\nva inibizione nella produzione di prolattina al giorno\n12 di trattamento con estrogeno e progesterone (Fig.\n1). Infatti, rapportando le concentrazioni di prolattina\nmisurate durante l'intero corso dell'esperimento (giorno\n3, 6, 9 e 12) a quelle misurate al giorno 3 di trattamento\n(concentrazione di prolattina al giorno 3 = 100 %), la\nconcentrazione di prolattina cresce progressivamente\nsia nello stroma decidualizzato in condizioni basali sia\nin quello decidualizzato in presenza di fluido perito-\nneale normale, raggiungendo un livello circa 10 volte\nsuperiore a quello misurato al giorno 3; al contrario, in\npresenza di fluido peritoneale endometriosico la con-\ncentrazione di prolattina misurata al giorno 12 di trat-\ntamento è pari a circa 4 volte la concentrazione di pro-\nlattina del giorno 3. Come si osserva nella Figura 2,  al\ngiorno 6, 9 e 12 i livelli di prolattina ottenuti nella deci-\ndualizzazione in presenza di fluido peritoneale endo-\nmetriosico risultano significativamente ridotti rispetto\na quelli ottenuti nella decidualizzazione in presenza di\nfluido peritoneale di controllo (fino ad un massimo del\n50% di riduzione al giorno 12), mentre nessuna diffe-\nrenza statisticamente significativa si osserva compa-\nrando decidualizzazione basale e decidualizzazione\ncon fluido peritoneale di controllo.\nTali dati dimostrano che, a prescindere dalle altera-\nzioni a carico della cellula decidualizzata proveniente\nda donne con endometriosi, l'ambiente in cui questo\nprocesso avviene contribuisce di per sé ad ostacolare il\nprocesso fisiologico di differenziazione endometriale.\nUlteriori approfondimenti nell'analisi del processo\ndi decidualizzazione in vitro dell'endometrio eutopico\nF. Minici e Coll.\n310\n\ndi donne con endometriosi contribuiranno a chiarire\nl'eventuale ruolo di tale processo nell'eziopatogenesi\ndei disturbi della fertilità cui la sindrome spesso è asso-\nciata, con il fine ultimo di contribuire ad un più mirato\napproccio terapeutico.\nIn quest'ottica, il confronto tra il processo di deci-\ndualizzazione di endometrio sano e quello di endome-\ntrio di pazienti affette (alle medesime condizioni di col-\ntura) ci permetterebbe di individuare, tra i fattori coin-\nvolti nell'impianto, quelli eventualmente alterati nel-\nl'endometrio di pazienti con endometriosi, sottoposto\na decidualizzazione in vitro. In particolare sono in\ncorso esperimenti di Real-Time-PCR per valutare l'e-\nspressione genica di alcuni geni regolatori dell'apopto-\nsi, di molecole di adesione, citochine e fattori angioge-\nnetici. \nQuesti fattori, di cui è stata ipotizzata una dis-rego-\nlazione nell'endometrio endometriosico durante la\nfinestra dell'impianto, non sono mai stati studiati nella\ndecidua di pazienti con la sindrome. Lo studio del loro\npattern d'espressione potrà fornirci informazioni pre-\nziose circa possibili alterazioni funzionali dei complessi\nmeccanismi coinvolti nel mantenimento della gravi-\ndanza iniziale. \nBiologia della cellula endometriosica\n311\nBibliografia\n1. SAMPSON J.A.: Peritoneal endometriosis due to the men-\nstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal\ncavity. Am J Obstet Gynaecol 14:422-429, 1927. \n2. WINGFIELD M., MACPHERSON A., HEALY D.L.,\nROGERS P.W.A.: Cell proliferation is increased in the endo-\nmetrium of women with endometriosis. 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