{"paper_id":"1a5a8442-f91d-4805-950a-00ece13feb99","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \n \nO fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose mínima/leve compromete o \nfuso meiótico de oócitos bovinos em metáfase II \n \n \n \n \n \nBruna Talita Gazeto Melo Jianini \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2015 \n\n \nBruna Talita Gazeto Melo Jianini \n \n \n \n \nO fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose mínima/leve compromete o \nfuso meiótico de oócitos bovinos em metáfase II \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2015 \nDissertação apresentada ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto para obtenção do Título de Mestre \nem Ciências Médicas. \n \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia \n \nOrientador (a): Professora Doutora Paula Andrea de \nAlbuquerque Salles Navarro \n\n \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.  \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n \nJianini, Bruna Talita Gazeto Melo.  \n O fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose mínima/leve compromete \no fuso meiótico de oócitos bovinos em metáfase II/Bruna Talita Gazeto Melo Jianini; Ribeirão \nPreto, 2015.  \n 102 p. il: 30cm.  \n Dissertação para título de Mestre apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto da Universidade de São Paulo. Área de concentração: Ginecologia e Obstetrícia.  \n Orientadora: Navarro, Paula Andrea de Albuquerque Salles.  \n 1. Infertilidade feminina. 2. Endometriose mínima e leve. 3. Fluido peritoneal. 4. \nQualidade oocitária. 5. Fuso meiótico.  \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFolha de aprovação \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nBruna Talita Gazeto Melo Jianini \n \nO fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose mínima/leve compromete o fuso \nmeiótico de oócitos bovinos em metáfase II \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAprovada em:  \n \n \nBanca Examinadora \n \nProf. Dr. Fernando Marcos dos Reis \nFaculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais \nAssinatura: ...................................................................................... \n \nProfa. Dra. Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP \nAssinatura: ...................................................................................... \n \nProfa. Dra. Paula Andrea de Albuquerque Salles Navarro \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP \nAssinatura: ...................................................................................... \nDissertação apresentada ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto para obtenção do Título de Mestre \nem Ciências Médicas. \n \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia \n \nOrientador (a): Professora Doutora Paula Andrea de \nAlbuquerque Salles Navarro \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedicatória \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedico este trabalho aos meus pais, Elias e Mara, as pessoas mais importantes da \nminha vida. Obrigada pela confiança e apoio em todas as minhas escolhas e decisões. \nEsta vitória é para vocês.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAgradecimentos \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nAgradeço primeiramente a DEUS, por ter me dado a permissão de chegar até aqui e \npor toda a força concedida na concretização deste sonho. Além disso, agradeço a Ele \npor todas as pessoas que cruzaram meu caminho e que estão aqui citadas, todas \nmuitíssimo importantes e especiais. \n \nAos meus pais, Elias e Mara, por terem sonhado junto comigo. Vocês se sacrificaram, \nse dedicaram, e abdicaram de muitos projetos pessoais para que eu tivesse a \noportunidade de ter uma boa formação profissional, e também pessoal. Eu devo tudo \nque sou a vocês dois, e se hoje sinto orgulho de mim e do lugar onde cheguei, é \nporque sei que vocês vieram segurando a minha mão. Agradeço pela vida que me \nderam, pelo amor, pelo carinho, pela paciência, pelo apoio, pela confiança e por \nserem os melhores pais do mundo. Sem vocês, eu nada seria. Eu amo muito vocês. \n \nAo meu irmão, Guilherme, pela amizade, pelas conversas e pelas privações que \nmuitas vezes teve que passar para que eu pudesse chegar até aqui. Eu amo você. \n \nAos meus avós, Fidel e Aparecida, que sempre ajudaram na minha educação e \ncontribuíram para que eu fosse a pessoa que sou hoje. Obrigada pelo carinho, pela \nconfiança, pelas conversas, pelos conselhos e pelas orações poderosas nos momentos \nmais difíceis. \n \nAo meus padrinhos, Cláudio e Naide, pela hospitalidade durante esses anos e por \nfazerem com que eu me sentisse sempre muito confortável. Obrigada por me \nacolherem, por me apoiarem e por terem me considerado mesmo como uma filha. \nNunca poderei agradecer o suficiente. \n \nAos meus primos queridos, Bruno e Leonardo, por todo carinho, amizade, \ncompanheirismo, cumplicidade e cuidado como se fossemos irmãos. Obrigada pelas \ninfinitas conversas, inúmeros conselhos, incansáveis festas, enfim, por todos os \nmomentos. \n \nAo meu melhor amigo e namorado, Francisco Sergi, que sempre me incentivou e \nconfiou que eu seria capaz. Você sempre esteve ao meu lado, me colocando para cima \ne me fazendo acreditar que posso mais do que imagino. Agradeço pelo amor, carinho, \ndedicação, apoio, incentivo, paciência e atenção que, mesmo distante, foram \nessenciais para que eu concluísse este trabalho. Eu amo você. \n \nÀ minha querida orientadora, Profa. Dra. Paula Navarro, por ter acreditado em mim \ndesde sempre. Obrigada pela oportunidade, pela dedicação, pelos ensinamentos, pela \npaciência, pela atenção, pela amizade e preocupações sempre a mim dedicadas. Nada \n\n \nseria possível sem você. Fica aqui minha imensa gratidão, meu respeito, minha \nadmiração e meu carinho por você. \n \nA meus colegas de pós graduação, Aline, Carlos, Caroline M., Caroline P., Catiele, \nCristiana, Daiane B., Daiana P., Gislaine, Iara, Jacira, Juliana, Liliane, Lisandra, \nLuciene, Marina, Michele, Thalita, Thaís, Valéria, Vanessa e Viviane pelo \nacolhimento e companheirismo nesta jornada. Obrigada por fazerem parte de uma \netapa muito importante e especial da minha vida. Cada uma de vocês tem um lugar \nguardado no meu coração.  \n \nSeparadamente, gostaria de agradecer as minhas amigas e companheiras de projeto \nMichele e Vanessa. Obrigada pela recepção, pelos treinamentos, pelas orientações, \npela ajuda e dedicação neste trabalho, pela amizade, pelas conversas e por todos os \nmomentos de apoio. E também à querida Juliana Meola, por ter sido para mim um \nexemplo de pessoa verdadeira, confiável, generosa, amiga, além de grande \nprofissional. Obrigada pela receptividade, amizade, sinceridade, atenção e carinho \ndesde sempre. \n \nAo meu querido amigo Rafael Zanetti, a primeira pessoa que me incentivou a prestar \no processo seletivo do mestrado. Obrigada pela amizade de sempre, pelo incentivo, \npela sinceridade, pelas conversas, pelos conselhos e pelas risadas, que não foram \npoucas. Serei eternamente grata a você. \n \nÀ minha querida e melhor amiga Mariani Bálsamo, por tudo e mais um pouco. \nAgradeço pelos anos de amizade verdadeira, por estar sempre ao meu lado vibrando \ncom as minhas vitórias, e por tornar minha vida muito mais divertida. Muito mais do \nque uma amiga, uma irmã. \n \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP, pelo suporte oferecido \nà realização deste trabalho. \n \nÀs funcionárias do Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia – Setor de Reprodução \nHumana – FMRP-USP, que, direta ou indiretamente, contribuíram com este projeto. \nEm especial, à Cristiana Padovan, obrigada pela ajuda, pelas conversas, pelo apoio e \nacolhimento.  \nÀs secretárias Ilza e Suelen, por todo auxílio prestado desde o início. \nAo Prof. Dr. Júlio César Rosa e Silva, pela colaboração na coleta dos materias. \nAgradeço também a todos os médicos, enfermeiros, e auxiliares do centro cirúrgico do \nHospital das Clínicas de Ribeirão Preto que ajudaram nesta coleta. \n\n \nAo Laboratório Multiusuário Confocal da FMRP-USP, pela disponibilização do \nmicroscópio para realização das leituras das lâminas. Agradeço em particular, a Bete \nMilani, que proporcionou todo o apoio e ensinamento técnico para a utilização do \nmicroscópio. \nÀ Profa. Dra. Cláudia CP de Paz, pela prestividade, dedicação e paciência durante o \nauxílio estatístico. \nÀ todos os funcionário do Frigorífico Barra Mansa – Sertãozinho e ao Ricardo, pela \najuda e comprometimento com a coleta de ovários bovinos. \nAo órgão de fomento CAPES, pela auxílio financeiro concedido, que permitiu que eu \nme dedicasse, integralmente, ao longo de todo o mestrado, à minha pesquisa. \nA Profa. Dra. Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva e ao Prof. Dr. Fernando Marcos \ndos Reis, pela disponibilidade em participar da banca examinadora e pelas valiosas \ncontribuições para este trabalho. \n \nPor último, mas não menos importante, agradeço à todas as pacientes que \nconcordaram em participar deste trabalho, e que mesmo em um momento de \nsofrimento, tiveram paciência e não se opuseram a oferecer uma contribuição para a \npesquisa. Obrigada pela confiança. \nA todos que torceram por mim e que, de alguma forma, contribuíram para a \nrealização deste trabalho, meu sincero agradecimento. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nResumo \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nJIANINI, B.T.G.M. O fluido peritoneal de mulheres inférteis com endometriose \nmínima/leve compromete o fuso meiótico de oócitos  bovinos em metáfase II. Faculdade \nde Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. \n \nOs mecanismos etiopatogênicos da  infertilidade relacionada à endometriose não estão bem \nelucidados, especialmente em mulheres com estágios iniciais  da doença (mínima e leve), em \nque não são observadas alterações anatômicas expressivas na cavidade pélvica. Questionamos \na possibilidade de haver alterações no microambiente peritoneal de mulheres inférteis com \nendometriose que poderiam afetar a aquisição da competência oocitária e dessa forma, \ncomprometer a fertilidade natural dessas mulheres. Para ser competente, o oócito precisa estar \nmaduro e ter um fuso meiótico morfologicamente normal e funcional, garantindo a fidelidade \nda segregação cromossômica durante as divisões da meiose. Nesse sentido, o objetiv o do \npresente estudo foi comparar o potencial impacto de diferentes concentrações (1% e 10%) de \nfluido peritoneal (FP) de mulheres  férteis sem endometriose e  mulheres inférteis com \nendometriose mínima e leve (EI/II) sobre a integridade do fuso celular e alinhamento \ncromossômico de oócitos bovinos maturados in vitro . Realizou -se um estudo experimental, \nonde amostras de FP foram obtidas d e 12 mulheres (6 mulheres férteis sem endometriose e 6 \nmulheres inférteis com endometriose mínima e leve) submetidas a videolaparoscopia , \nrespectivamente, para realização de laqueadura tubária e investigação de infertilidade. Oócitos \nbovinos imaturos foram  submetidos a maturação in vitro  (MIV) na ausência de FP, na \npresença de 1% e 10% de FP de mulheres férteis sem endometriose e na presença de 1% e \n10% de FP de mulheres inférteis com EI/II. Foram realizados 6 experimentos de MIV e cada \namostra de FP foi utilizada em apenas um experimento. Os oócitos foram fixados, marcados \npor imunofluorescência e então analisados por microscopia confocal.  A porcentagem de \noócitos meioticamente normais foi significantemente maior nos oócitos submetidos a MIV na \nausência de FP (88.46%) e na presença  de 1% (78.57%) e 10% (84.62%) de FP de mulheres \nférteis sem endometriose do que aqueles oócitos submetidos a MIV na presença de 1% \n(62.50%) e 10% (56.25%) de FP de mulheres inférteis com EI/II. Além disso, no grupo \nendometriose, a porcentagem de oócitos meioticamente normais foi significantemente maior \nnos oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62.50%) do que na presença de 10% \n(56.25%) de FP, sugerindo um efeito dose -dependente do FP de mulheres com endometriose \nna ocorrência de danos meióticos oocitários. Demonstrou-se que o FP de mulheres inférteis \ncom EI/II comprometeu a maturação nuclear oocitária durante a MIV, de modo dose -\ndependente, promovendo anormalidades meióticas em oócitos em metáfase II.  Nossos \nresultados contribuem para a compreensão dos mecanismos etiopatogênicos da infertilidade \nrelacionada à EI/II e abrem perspectivas para o estudo de novas abordagens terapêuticas \nvisando melhorar a fertilidade natural destas pacientes. \n \nPalavra-chave: infertilidade feminina ; endometriose mínima e leve; fluido peritoneal; \nqualidade oocitária; fuso meiótico. \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbstract \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nJIANINI, B.T.G.M. Peritoneal fluid from infertile women with minimal/mild \nendometriosis compromises the meiotic spindle of metaphase II bovine oocytes. \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. \n \nThe etiopathogenic mechanisms  of endometriosis -related infertility are not well elucidated, \nespecially in women with early stages of the disease (minimal and mild endometriosis), where \nsignificant anatomical abnormalities  in the pelvic cavity are not observed. We question if \nalterations in the peritoneal microenvironment of infertile women with endometriosis might \naffect oocyte competence acquisition and in this way, compromise the natural fertility in these \nwomen. To be competent, the oocyte must be mature and have a morphologically normal and \nfunctional meiotic spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during the \ndivisions of meiosis. Thus, the aim of the present study was to compare the potencial impact \nof different concentrations (1% and 10%) of peritoneal fluid (PF) from fertile women without \nendometriosis and infertile women with minimal and mild endometriosis  (EI/II) on spindle \nintegrity and chromosomes alignment of bovine oocytes in vitro  matured (IVM). We \nperformed an experimental study , where PF samples were obtained from 12 women (six \nfertile women without endometriosis and six infertile women with minimal and mild \nendometriosis) submitted to laparoscopy , respectively for tubal ligation  and investigation of \ninfertility. Immature bovine  oocytes were submitted to IVM  in the absence of PF, in the \npresence of 1% and 10% PF from fertile women without endometriosis and in the presence of \n1% and 10% PF from infertile women with EI/II. We performed 6 experiments of IVM and \neach PF sample was us ed in only one experiment. The oocytes were fixed, \nimmunofluorescence staining and then, analyzed by confocal microscopy.  The percentage of \nmeiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that underwent IVM in the \nabsence of PF (88.46%) and in the presence of 1% (78.57%) and 10% (84.62%) PF from \nfertile women without endometriosis than for oocytes that underwent IVM in the presence of \n1% (62.50%) and 10% (56.25%) PF from infertile women with EI/II. Furthermore, in the \nendometriosis group, the percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher \nfor oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) than in the presence of 10% \n(56.25%) PF, suggesting a dose -dependent effect of PF from women with endometriosis on  \nthe occurrence of meiotic oocyte damage.  The study have demonstrated that PF  from infertile \nwomen with EI/II compromised the oocyte nuclear maturation during the IVM, in a dose-\ndependent manner , promoting meiotic abnormalities  in metaphase II oocytes.  Our results \ncontribute to a better understanding of the etiopathogenic mechanisms of infertility related to \nEI/II and open perspectives  in the design of new therapeutic approaches to improve the \nnatural fertility of these infertile women. \n \nKey words: female i nfertility; minimal and mild endometriosis; peritoneal fluid; oocyte \nquality; meiotic spindle. \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLista de figuras \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nFigura 1 – Esquema de preparo das diluições a fim de manter a concentração adequada de \nsuplementação ao meio TCM após a adição de fluido peritoneal.............................................41 \n \nFigura 2 – Imagens de microscopia confocal de oócitos bovinos matura dos in vitro na \nausência de fluido peritoneal  (No-FP), na presença de fluido peritoneal de mulheres férteis \nsem endometriose (C -PF) ou de mulheres inférteis com endometriose mínima e leve (EI/II -\nFP). (A) Oócito em metáfase II em visão sagital  (analisável). (B) Oócito em metáfase II em \nvisão polar (não analisável). Verde: fuso marcado com anticorpo anti -β-tubulina e anticorpo \nsecundário conjugado com isotiocianato de fluoresceína; azul: cromosso mos marcados com \nHoechst 33342. Barra de escala  = \n5μm….......................................................................................................................................44 \n \nFigura 3 – Imagens de microscopia confocal de oócitos bovinos maturados in vitro na \nausência de fluido peritoneal  (No-FP), na presença de fluido peritoneal de mulheres férteis \nsem endometriose (C -FP) ou  de mulheres inférteis com endometriose mínima e leve (EI/II -\nFP). (A) Oócito em MII normal mostrando cromossomos alinhados adequadamente na região \ncentral de um fuso meióti co em forma de barril.  (B) Oócito em MII anormal com \ncromossomos desalinhados e fuso normal em forma de barril. ( C) Oócito em MII anormal \ncom cromossomos alinhados e fuso anormal (dimensão longitudinal reduzida). (D) Oócito em \nMII anormal com cromossomos desalinhados e fuso anormal. Verde: fuso marcado com \nanticorpo anti-β-tubulina e anticorpo secundário conjugado com isotiocianato de fluoresceína; \nazul: cromossomos marcados com Hoechst 33342. Barra de escala  = \n5μm…………………………………………………………………………………………...45 \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLista de tabelas \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nTabela 1 – Estágios de maturação nuclear e porcentagem de oócitos em metáfase II normais e \nanormais maturados em meio sem adição de fluido peritoneal (No -FP), e com duas diferentes \nconcentrações de fluido peritoneal de mulheres férteis sem endometriose (C -FP) e com \nendometriose mínima e leve (EI/II-FP)....................................................................................50 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLista de abreviaturas \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \nAP  Ativação partenogenética \nASRM  Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva \nCAT  Catalase  \nCO2  Dióxido de carbono \nCOC  Complexo cumulus-oócito \nCP  Corpúsculo polar \nDNA  Ácido desoxirribonucléioco \nDTT  Ditiotreitol \nEI/II  Endometriose mínima e leve \nEIII/IV  Endometriose moderada e grave \nEO  Estresse oxidativa \nFITC  Fluorocromo isotiocianato \nFIV  Fertilização in vitro \nFMRP  Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nFP  Fluido peritoneal \nFSH  Hormônio folículo estimulante \nGSR  Glutationa redutase \nHIV  Vírus da imunodeficiência humana \nIMC  Índice de massa corpórea \nLH  Hormônio luteinizante \nMgCl2  Cloreto de magnésio \nMI  Metáfase I \nMII  Metáfase II \nMIV  Maturação in vitro \nMTSB XF Fixador tampão estabilizador de microtúbulos \n\n \nNaCl  Cloreto de sódio \nNaN3  Azida sódica \nPBS  Tampão fosfato-salino \nSBE  Sociedade Brasileira de Endometriose e Ginecologia Minimamente Invasiva \nSBF  Soro bovino fetal \nSEM  Média ± erro padrão da média \nTFM  Taxa de fecundidade mensal \nTI  Telófase I \nTNF  Fator de necrose tumoral \nUI  Unidade internacional \nUSP  Universidade de São Paulo \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSumário \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n1. Introdução............................................................................................................................24 \n2. Justificativa..........................................................................................................................31  \n3. Objetivos..............................................................................................................................34 \n4. Materiais e Métodos............................................................................................................36 \n4.1. Seleção de pacientes...........................................................................................................37 \n4.2. Coleta e processamento do fluido peritoneal.....................................................................38 \n4.3. Coleta de oócitos bovinos..................................................................................................38 \n4.4. Maturação in vitro..............................................................................................................39 \n4.5. Fixação dos oócitos............................................................................................................41 \n4.6. Imunofluorescência............................................................................................................41 \n4.7. Classificação oocitária baseada na morfologia do fuso meiótico e no alinhamento \ncromossômico por microscopia confocal..................................................................................42 \n4.8. Análise estatística...............................................................................................................43 \n5. Resultados............................................................................................................................46 \n6. Discussão..............................................................................................................................50 \n7. Conclusões............................................................................................................................56 \n8. Referências Bibliográficas..................................................................................................58 \n \nAnexos......................................................................................................................................64 \nAnexo 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido........................................................65 \nAnexo 2 – Manuscrito...............................................................................................................71 \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1. Introdução \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n  \n\n\n                                                                                                                                                                Introdução 25 \n A endometriose é considerada uma doença ginecológica comum, benigna, estrógeno \ndependente ( MINICI et al., 2008 ), caracterizada pela presença de tecido endometrial \n(glândulas e/ou estroma)  fora da cavidade uterina (GUPTA  et al., 2006; FOURQUET et al., \n2010). O principal local acometido pela doença é a cavidade pélvica, sendo mais comumente \nencontrada nos ovários, trompas de Falópio, fundo do saco de Douglas, intestino e bexiga \n(MACER E TAYLOR, 2012 ; ACIÉN E VELASCO, 2013 ). Alguns sintomas são \ncaracterísticos da endometriose, como  dor pélvica, dismenorréia, dispaneurina, irregularidade \nmenstrual e infertilidade (MINICI  et al.,  2008), entretanto essa  afecção pode apresentar -se, \nincompreensivelmente, de forma assintomática em algumas mulheres (20 -25%) (BULLETTI \net al., 2010). Estudos têm mostrado que os sintomas associados a  endometriose causam um \nimpacto negativo sobre diferentes aspectos  na vida  dessas mulheres  (FOURQUET et al.,  \n2010; MORADI et al., 2014). Além do sofrimento físico caus ado pelos diversos sintomas, a \ndoença causa um impacto profundo e negativo na vida das mulheres, alterando seu \nrendimento profissional, sua relação familiar e afetiva , reduzindo sua qualidade de vida e \nprincipalmente sua auto -estima (LORENÇATTO et al.,  2007). Além disso, em países \ndesenvolvidos, a endometriose está entre as principais causas de hospitalização ginecológica, \ngerando altas taxas de internações hospitalare s e procedimentos cirúrgicos (FOURQUET et \nal., 2010; SPIGOLON  et al.,  2012). Dessa forma, tanto pelo seu impacto físico, social e \nemocional sobre as  mulheres (FOURQUET et al., 2010; MORADI et al., 2014), como pelo \nseu impacto sóci o-econômico devido aos cus tos no  diagnóstico e tratamento, esta doença \npode ser considerada um problema atual de saúde pública (SIGNORILE; BALDI, 2010) e \nmerece maior importância. \n A endometriose é uma doença feminina. E stima-se que a doença esteja presente em \n10-15% das mulheres em idade reprodutiva (AUGOULEA et al., 2012; MACER E TAYLOR, \n2012). De acordo com Associação Brasileira de Endometriose e Ginecologia Minimamente \n\n                                                                                                                                                                Introdução 26 \nInvasiva (SBE), a doença afeta cerca de 176 milhões de mulheres no mundo, sendo 6 milhões \napenas no Brasil (Sociedade Brasileira de Endometriose e Ginecologia Minimamente \nInvasiva). Nos últimos anos, o número de casos de mulheres com a doença vem aumentando \npossivelmente em razão do estilo de vida da mulher moderna  (SOUZA et al.,  2009). \nAtualmente, as mulheres assumiram uma dupla jornada de trabalho, ficando muitas vezes \nexpostas a uma má alimentação e altos níveis de estresse, condições essas que podem \nprejudicar o funcionamento do sistema imunológico deixando -as susceptíveis ao \naparecimento de novas doenças (SOUZA et al.,  2009). Essa nova rotina das mulheres leva \nainda ao adiamento da maternidade e menos filhos, expondo -as a um maior número de ciclos \nmenstruais, o que pode contribuir para o aparecimento da endometriose (ABRÃO et al., 2007; \nSOUZA et al., 2009).  \n A Sociedade American a de Medicina Reprodutiva (ASRM) classifica a endometriose \nem 4 estágios (I-mínima, II-leve, III-moderada e IV-grave), conforme a gravidade da doença. \nEssa classificação leva em conta a localização, extensão e profundidade dos implantes \nendometrióticos; presença e severidade de aderências; e ainda a presença de endometriomas. \nEndometriose mínima e leve (EI/II) são caracterizadas por implantes endometrióticos isolados \ne superficiais, sem a presença de aderência s significativas, enquanto que endometriose \nmoderada e grave (EIII/IV) são caracterizadas por múltiplos implantes endometrióticos \nsuperficiais e profundos, com presença de aderências densas e firmes e presença de \nendometriomas (Revised American Society for  Reproductive Medicine classification of \nendometriosis: 1996, 1997). \n A endometriose têm sido muito associada a infertilidade (GUPTA et al. , 2008 ; \nBULLETTI et al., 2010) e esta condição, segundo um consenso da ASRM, é definida como a \nfalência de um casal em idade reprodutiva de conceber uma gravidez depois de no mínimo 12 \nmeses de coito regular, sem contracepção  (MEDICINE, 2013). A literatura afirma que a taxa \n\n                                                                                                                                                                Introdução 27 \nde fecundidade mensal (TFM) de casais normais varia entre 0,15 a 0,20, enquanto que a TFM \nde casa is com endometriose varia entre 0,02 a 0,10 (BULLETTI  et al.,  2010; MACER  E \nTAYLOR, 2012). Epidemiologicamente, a incidência da endometriose em mulheres inférteis \ngira em torno de 25 -50% e a incidência da infertilidade em mulheres com a doença gira em \ntorno de 30-50% (BULLETTI et al., 2010; MACER E TAYLOR, 2012). \n Apesar de estudos apoiarem o conceito de diminuição de f ecundidade em mulheres \nportadoras de endometriose (GARRIDO et al. , 2002; BULLETTI  et al.,  2010) e muitos \nmecanismos tenham sido propostos para explicar a presença da infertilidade nessas mulheres, \na relação entre a doença  e infertilidade ainda não está clara (GUPTA  et al.,  2008). Nos \nestágios avançados na doença (endometriose moderada e grave), essa relação tem sido \nassociada as  aderências p élvicas severas, que causam uma diversidade de alterações \nanatômicas no trato reprodutivo e dessa forma  podem atrapalhar a captura e transporte do \nóvulo. No entanto, nos estágios iniciais da doença (endometriose mínima e leve), essa relação \nnão é muito visível, uma vez que as  aderências pélvicas não são suficientemente severas para \ncausar alterações anatômicas expressivas (CARVALHO et al., 2012). Diante disso, poderia-se \nconferir maior atenção à endome triose mínima e leve a fim de  desvendar os mecanismos \npelos quais esta poderia comprometer a fecundidade natural, o que propiciaria o \ndesenvolvimento de novas terapias para o tratamento da infertilidade. \n Um estudo canadense  avaliou a probabilidade de  gestação de mulheres inférteis com \nEI/II após a realização da laparosco pia com ou sem tratamento cirúrgico  das lesões  \nendometrióticas e concluiu que aquelas mulheres submetidas a laparoscopia com remoção das \nlesões tiveram uma melhora significativa em sua fertilid ade natural, quando comparadas \nàquelas que foram submetidas apenas a laparosocopia, sem remoção das lesões (MARCOUX \net al.,  1997). Esses achados confrontam com os achados de um estudo italiano que não \nconseguiu demonstrar qualquer benefício significativo da remoção das lesões endometrióticas \n\n                                                                                                                                                                Introdução 28 \nna melhora da fertilidade natural de mulheres inférteis com EI/II ( PARAZZINI et al., 1999). \nNo entanto, apesar de resultados conflitantes entre os estudos, as taxas de fecundidade de \nmulheres inférteis com EI/II continuam sendo menores (0,019 e 0,024) quando comparadas as \nde mulheres férteis normais (0,15 a 0,20) (MARCOUX  et al.,  1997; PARAZZINI  et al.,  \n1999;). Além disso, outro estudo evidenciou que a probabilidade de gestação natural de \nmulheres inférteis com EI/II é significantemente menor quando comparadas a de mulhe res \ninférteis sem causa aparente, durante um período de 3 anos (36% versus 55%, \nrespectivamente), sugerindo que a endometriose mesmo em estágios iniciais, tem relação com \na infertilidade (AKANDE et al., 2004).  \n Até o momento, os mecanismos responsáveis pela diminuição da ferti lidade em \nmulheres com EI/II ainda são muito controversos e cheios de incertezas . No entanto, é \nprovável que os efeitos da doença não sejam apenas devido  a alterações da anatomia pélvica \nnormal, mas decorrentes de um efeito negativo direto sobre o desenvolvimento do folículo, do \noócito, do embrião (BARNHART et al., 2002) e também de defeitos endometriais (BRIZED \net al., 1995; PELLICER et al., 1995; KUMBARK et al., 2008). \n De acordo com um pequeno estudo que avaliou  resultados de fertilização in vitro  \n(FIV) em programas de ovodoação, as taxas de gravidez são semelhantes em mulheres com \nendometriose e mulheres com outra causa de infertilidade submetidas a FIV com oócito de \ndoadoras sem a doença, sugerindo um papel importante da qualidade oocitária na infertilidade \napresentada por essas mulheres (SIMÓN  et al., 1994; GARRIDO et al., 2000; PELLICER et \nal., 2001). \n A qualidade ooc                    m                        maturação \ncitoplasmática e nuclear (FERREIRA  et al.,  2009), sendo que  a última dependente da \npresença de um fuso celular normal. O fuso celular meiótico de oócitos em metáfase II (MII) \né uma estrutura temporária e dinân ima, em forma de barril, composta por microtúbulos \n\n                                                                                                                                                                Introdução 29 \nformados por dímeros de tubulina que se polimerizam e despolimerizam nos diversos estágios \ndo ciclo celular, sendo  relevante para assegurar a segregação cromossômica durante o \nprocesso meiótico ( CHOI et al.,  2007; BARCELOS et al. , 2008, 2009). O  fuso é bastante \nsensível a ações de diversos fatores, entre eles o estresse oxidativo ( EO) (HU  et al., 2001;  \nEICHENLAUB-RITTER et al., 2002; MULLEN  et al., 2004), capaz de causar anomalias \nmeióticas, instabilidade cromossômica , indução de apoptose e comprometimento do \ndesenvolvimento embrionário pré-implantação (NAVARRO et al., 2004, 2006). \n Alguns autores têm associado a endometriose ao EO (AGARWAL et al. , 2003; \nSZCZEPANSKA et al.,  2003; GUPTA  et al.,  2008), estando sua origem possivelmente \nrelacionada a uma r esposta inflamatória aos implantes endometriais ectópicos (M URPHY et \nal., 1998). Esses implantes ectópicos causariam a liberação de citocinas inflamatórias e \nativação de macrófagos, levando a produção de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio. \nO aumento nessa produção, provocaria um maior consumo de antioxida ntes pelo nosso \norganismo na tentativa de manterem os níveis de espécies reativas dentro dos limites \nfisiológicos. No entanto, quando ocorre uma alteração no balanço oxidante/antioxidante do \nnosso organismo, seja por maior produção e/ou inadequação da capa cidade antioxidante, é \nestabelecido o EO (ANDRADE et al., 2010), podendo este estar envolvido na etiopatogênese \nda infertilidade relacionada à endometriose ( CAMPOS PETEAN et al., 2008; GUPTA et al., \n2008; ANDRADE et al., 2010; PRIETO et al., 2012). \n O fluido peritoneal (FP)  é uma solução encontrada  na cavidade vesicouterina ou cul-\nde-sac e banha toda a cavidade pélvica, útero, trompas de Falópio e ovário (BEDAIWY; \nFALCONE, 2003), podendo refletir o status oxidativo deste microambiente. Acredita-se que o \nFP seja o principal fator de contr ole do microambiente peritoneal que influencia o \ndesenvolvimento e progressão da endometriose (HARADA et al., 2001).  Diferentes estudos \navaliando os níveis de constituintes do fluido peritoneal, apontam a existência de alterações \n\n                                                                                                                                                                Introdução 30 \nem mulheres com a doença (GUPTA et al., 2008 ; BEDAIWY; FALCONE, 2003). Segundo \nBulletti et al (2010), mulheres com endometriose possuem um maior volume de FP, com altas \nconcentrações de macrófagos ativados, prostaglandinas, interleucina -1, fator  de necrose \ntumoral (TNF) e proteases (BULLETTI et al., 2010).  Além disso, estudos também \nevidenciam a presença  de EO no FP de mulheres com endometriose (A UGOULEA et al.,  \n2012; GUPTA et al., 2008), inclusive nos estágios  iniciais da doença ( MIER-CABRERA et \nal., 2011).  \n  Estudo de Mansour  et al  (2009, 2010) demonstraram que o FP de mulheres com \nendometriose promove anomalias nos microtúbulos e cromossomos de oócit os maduros de \ncamundongos, e estas foram reduzidas por meio da suplementação no meio de cultivo  com L-\ncarnitina, um antioxidante, sugerindo que substâncias presentes no FP de mulheres com a \ndoença promovem comprometimento da qualidade oocitária e subsequente qualidade \nembrionária, tendo o EO como provável mediador  (MANSOUR et al., 2009, 2010). No \nentanto, Mansour et al (2009, 2010) avaliaram exclusivamente o impacto do FP de mulheres \ncom endometriose sobre os oócitos maduros, não investigando seu potencial impacto sobre a \nfoliculogênese e/ou maturação oocitária (MANSOUR et al., 2009, 2010). \n Considerando que os ovários humanos estão em íntimo contato com o FP, supomos \nque possa haver influência do mesmo sobre os oócitos, não apenas após a ovulação, mas \ntambém durante todo o processo de foliculogênese e/ou maturação oocitária. Até o presente, \nnenhum estudo avaliou o efeito do FP de mulheres inférteis com EI/II durante a \nfoliculogênese, investigando seu papel na maturação e qualidade oocitária.  \n \n \n \n  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2. Justificativa \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n                                                                                                                                                              Justificativa 32 \n A endometriose  é uma doença caracterizada pela presença de tecido endometrial \n(glândulas e/ou estroma)  fora da cavidade uterina (GUPTA  et al., 2006; FOURQUET et al., \n2010). Estima-se que a doença esteja presente em 10-15% das mulheres em idade reprodutiva  \n(AUGOULEA et al., 2012; MACER E TAYLOR , 2012). Entre suas manifestações clínicas \nmais freqüentes , destaca -se a infertilidade, presente em 30 a 50% das suas portadoras \n(BULLETTI et al., 2010; MACER E TAYLOR, 2012).  \n Apesar de muitos mecanismos  terem sido propostos para explicar a presença da \ninfertilidade em mulheres com endometriose, a relação entre a doença  e infertilidade ainda \nnão está clara (GUPTA  et al., 2008), especialmente nos estágios iniciais da doença, em que \nnão são observadas alterações anatômicas expressivas (CARVALHO et al., 2012). \n Alguns autores têm associado a endometriose ao EO (AGARWAL et al.,  2003; \nSZCZEPANSKA et al.,  2003; GUPTA  et al.,  2008), sendo este capaz de causar anomalias \nmeióticas oocitárias (NAVARRO et al., 2004, 2006). Nesse sentido, estudos têm evidenciado \num aumento de marcadores inflamatórios e de EO no FP de mulheres com endometriose \n(AUGOULEA et al.,  2012; GUPTA  et al.,  2008), inclusive nos estágios  iniciais da doença \n(MIER-CABRERA et al., 2011).  \n Questiona-se se a piora da qualidade oocitária seja um dos principais fatores \nrelacionados à infertilidade nestas mulheres (BARCELOS et al., 2009; DA BROI et al., 2014; \nGIORGI et al., 2015). Todavia, diante do número reduzido de oócitos humanos disponíveis \npara a  pesquisa, a experimentação com animais torna -se relevante para a investigação dos \nmecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à endometriose . O modelo \nexperimental bovino neste estudo se justifica pela similaridade no tamanho e morfolog ia dos \novários humano e bovino, por ambas as espécies serem monovulatórias e policíclicas e por ser \num material abundante, barato, e de fácil manipulação (MALHI et al., 2005). \n Embora haja estudos evidenciando um potencial papel deletério do FP de mulheres  \n\n                                                                                                                                                              Justificativa 33 \ncom endometriose sobre a qualidade oocitária de oócitos maduros de camundongos \n(MANSOUR et al., 2009, 2010), não encontramos até o momento nenhum estudo que tenha \navaliado o potencial impacto do FP de mulheres inférteis com EI/II durante a foliculogênese, \ninvestigando seu papel na maturação e qualidade oocitária.   \n O fluido peritoneal (FP)  é uma solução encontrada  na cavidade vesicouterina ou cul-\nde-sac e banha toda a cavidade pélvica, útero, trompas de Falópio e ovário (BEDAIWY; \nFALCONE, 2003), podendo  refletir o status oxidativo deste microambiente.  Considerando \nque os ovários humanos estão em íntimo contato com o FP, supomos que possa haver \ninfluência do mesmo sobre os oócitos, não apenas após a ovulação, mas também durante todo \no processo de foliculogênese e/ou maturação oocitária. \n A observação de maior incidência de anomalias meióticas em oócitos submetidos a \nmaturação in vitro (MIV) com FP de mulheres inférteis com EI/II poderia contribuir com a \nelucidação dos mecanismos envolvidos na etiopatogênes e da infertilidade relacionada a estes \nestágios da doença. \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3. Objetivos \n \n \n \n \n \n \n\n\n                                                                                                                                                         Objetivos 35 \n Comparar o potencial impacto das concentrações 1% e 10 % de fluido peritoneal de \nmulheres férteis sem endometriose e de mulheres inférte is com endometriose mínima/leve  \nsobre o grau de maturidade nuclear e a integridade do fuso celula r e distribuição \ncromossômica de oócitos bovinos maturados in vitro  dentro de cada grupo (controle e \nendometriose mínima/leve). \n Comparar o potencial impacto das concentrações 1% e 10%  de flu ido peritoneal de \nmulheres férteis sem endometriose e de mulheres inférteis com endometriose mínima/leve \nsobre o grau de maturidade nuclear e a integridade do fuso celular e distribuição \ncromossômica de oócitos bovinos maturados in vitro entre os grupos se m fluido peritoneal, \ncontrole e endometriose mínima/leve. \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4. Materiais e métodos \n \n \n \n  \n \n \n \n\n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 37 \n Realizou-se um estudo experimental junto ao Setor de Reprodução Humana do \nDepartamento de Ginecologia e Obstetrícia da  Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \n(FMRP), Universidade de São Paulo (USP). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em \nPesquisa do Hospital das Clínicas, FMRP -USP (protocolo 12201/2008), e pelo Comitê de \nÉtica em Experimentação Animal, FMRP-USP (protocolo 169/2008). \n Entre 2008 e 2010, amostras de FP foram obtidas de mulheres submetidas à  \nvideolaparoscopia no setor de Reprodução Humana, Departamento de Ginecologia e \nObstetrícia, FMRP-USP. Entre 2009 e 2011 foram realizados os experimentos de MIV, e em \nseguida os oócitos foram fixados para subsequente realização da imunofluorescência. \n As pacientes que preencheram os critérios de elegibilidade e manifestaram o desejo de \nparticipar do projeto, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1) \npreviamente à inclusão no estudo. \n \n4.1. Seleção de pacientes \n O grupo endometriose consistiu em mulheres com infertilidade associada \nexclusivamente a presença de EI/II [com ciclo ovulatório normal, presença de permeabilidade \ntubária e parceiros com parâmetros seminais normais (COOPER et al., 2009)]; essas mulheres \nforam submetidas à  videolaparoscopia para investigação da infertilidade , diagnosticadas e \nclassificadas de acordo com os critérios da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva \n(1997), por um cirurgião experiente. O grupo controle consistiu e m mulheres férteis sem \nendometriose; ess as mulheres foram submetidas a videolaparoscopia para a realização de \nlaqueadura tubária. \n Os c ritérios de não elegibilidade  f   m:       ≥ 38     , í   c     massa corpórea \n(IMC) ≥ 30 kg/m², concentração sérica do hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro \ndia do ciclo menstrual ≥ 10 mUI/mL;    v l     c ô  c , presença de hidrossalpinge ou de \n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 38 \ndoenças crônicas (tais como diabetes mellitus  ou qualquer outra  endocrinopatia), doença \ncardiovascular, dislipidemia, lúpus eritematoso sistêmico ou qualquer outra do ença \nreumatológica, infecção pelo vírus  HIV ou qua lquer infecção ativa, tabagismo  e uso de \nvitaminas, medicações hormonais ou antiinflamatórios hormonais  ou não hormonais durante \nos 6 meses anteriores à inclusão neste estudo. Os critérios de não elegibilidade visaram evitar \ncomo fatores de confusão situações relacionadas ao EO e/ou à piora da qualidade oocitária.  \n Não houve diferença significativa entre o s grupos controle e endometriose em relação \na média de idade (30.6 ± 1.43 e 29.0 ±1.31 anos, respectivamente) ou IMC (23.9 ± 0.90 e 24.4 \n± 0.73 kg/m², respectivamente). Os dados foram apresentados em média ± erro padrão da \nmédia (SEM). \n \n4.2. Coleta e processamento do fluido peritoneal \n As a mostras de  FP de cada doadora foram obtidas  durante a realização da \nvideolaparoscopia para investigação de infertilidade ou realização de laqueadura tubária. Cada \namostra foi coletada em tubo estéril individual, sem a presença de meio de cultura, a partir do \nfundo de saco posterior sob visualização  direta para evitar contaminação com sangue  \n(amostras com contaminação sanguínea foram excluídas do estudo) . Em seguida, as amos tras \nforam centrifugadas a 300 g  por 10 minut os para separar as células rema nescentes, e o \nsobrenadante foi estocado a -80ºC, em tubo individual, para uso futuro. \n \n4.3. Coleta dos oócitos bovinos \n Ovários bovinos foram coletados logo após o abate em frigorífico local e transportados \nem um recipiente térmico contendo solução fisiológica  (0,9% NaCl)  a 35 -38,5ºC. No \nlaboratório, os ovários foram borrifados com álcool 70%, lavados em solução fisiológica pré -\naquecida à 38,5ºC  contendo 0,05 g/L de sulfato de estreptomicin a e mantidos nesta mesma \n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 39 \nsolução, em banho-maria, até o final da aspiração dos complexos cumulus-oócito (COCs). Os \nCOCs imaturos foram aspirados de folículos com tamanho entre 2 mm a 8 mm de diâmetro , \nutilizando-se agulhas de 18  mm acopladas a seringas de 10  mL e o conteúdo foi depositado  \nem um cálice cônico esté ril mantido a 38,5ºC. Após o término  da aspiração dos folículos, o \nconteúdo aspirado permaneceu em repouso durante 10 minutos para deposição dos COCs. \n Após a sedimentação, os COCs foram  selecionados sob estereomicroscópio em placas \nde Petri de 100 mm contendo o meio de lavagem Talp Hepes (Invitrogen, Gibco Laboratories \nLife Technologies Inc., Grand Island, NY, USA). Para o cultivo in vitro, somente os COCs \nmorfologicamente saudáveis, ou seja, com citoplasma homogêneo e com pelo menos três \ncamadas de células do cummulus oophurus , foram selecionados (ADONA; LEAL, 2004; \nFERREIRA et al., 2009). \n \n4.4. Maturação in vitro \n O meio de MIV utilizado  foi o TCM -199 contendo sais de Earle e bicarbonato \n(Invitrogen, Gibco  Laboratories Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA), \nsuplementado com 0,4 mM de piruvato de sódio, 0,5 µg/mL de gentamicina, 5 µg/mL de \nFSH, 5 mg/mL de LH, 1 µg/mL de estradiol e 10% de soro bovino fetal  (SBF) (FCS; Gibco) \n(FERREIRA et al., 2009). \n Imediatamente após a seleção, os COCs foram randomicamente divididos em cinco \ndiferentes condições de cultivo: na ausência de FP (No -FP); na  presença de 1% e 10% de \nfluido peritoneal de pacientes controle (C -FP); e na presença de 1% e 10% de fluido \nperitoneal de pacientes com EI/II (EI/II -FP). A fim de manter a concentração adequada de \nsuplementação ao meio TCM após a adição de fluido FP, elim inando-se, assim, o efeito da \ndiluição dos suplementos, optou-se por preparar um TCM 10% mais concentrado, ao qual, de \nacordo com cada diluição, foi adicionado FP e/ou meio TCM puro, conforme esquema \n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 40 \napresentado na figura 1. \n O cultivo foi realizado em gotas de 400 µL de meio (aproximadamente, 20 oócitos por \ngota), a 38,5ºC, 95% de umidade e 5% de CO2 em ar (HASHIMOTO et al., 2002; ADONA; \nLEAL, 2004; FERREIRA et al., 2009) por um período de 22-24 horas, em placas NUNC® de \n4 poços, em um sistema de cultivo sem óleo mineral. \n Foram realizadas seis replicatas, cada uma com os cinco grupos descritos acima (No-\nFP, 1% C-FP, 10% C-FP, 1% EI/II-FP and 10% EI/II-FP) utilizando as duas concentrações de \nFP de pacientes férteis sem endometriose e de pacientes inférteis com EI/II. Cada amostra de \nFP foi utilizada em apenas uma replicata. \n  \n \n \n \n \nFigura 1 – Esquema de preparo das diluições a fim de manter a concentração \nadequada de suplementação ao meio TCM após a adição de fluido peritoneal. \n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 41 \n4.5. Fixação dos oócitos \n Após a MIV, os oócitos foram  desnudados (separados das células do cummulus \noophurus) mecanicamente por pipetagem , em meio tamponado Talp Hepes , utilizando placas \nde vidro escavadas . Ocorrido o desnudamento, os oócitos foram colocados em uma solução \nfixadora MTSB XF, composta por 1X de Tampão Estabilizador (0,1M de Pipes, 5mM de \nMgCl2 e 2,5mM de EGTA), 50% de Óxido de Deutério, 0,01% de Aprotinina de pulmão \nb v   , 1 mM    DTT, 1 μM    T x l, 0,5%    T     -X, 2% de Formaldeído e água de \nMilliQ, aquecida previa mente por 30 minutos em estufa à 38,5 °C, e deixados  por mais 30 \nminutos em estufa à 38,5 °C para estabilização de microtúbulos (LIU; JU; YANG, 1998; \nFERREIRA et al.,  2009). Após isso, os oócitos permaneceram  nesta solução a 4°C até o \nprocessamento da imunofluorescência e confecção das lâminas. \n \n4.6. Imunofluorescência \n Os oócitos  previamente fixados  foram lavados extensivamente e m meio de \nlavagem tampão f osfato (PBS suplementado com 0,02% Na N3, 0,01% Triton X -100, 0,2% \nleite seco sem gordura, 2% soro de cabra, 2% de albumina sé rica bovina e 0,1 M de glicina) e \nbloqueados durante uma noite ( overnight) a 4ºC . Passado esse período , foram incubados \novernight a 4ºC com anticorpo monoclonal murino anti -β-tubulina ( diluição 1:1000). Após \nnova lavagem , os oócitos foram incubados com o anticorpo secundário  anti-IgG de \ncamundongo conjugado  com isotiocianato de fluoresceína (FITC) ( diluição 1:500, Zymed \nLaboratories, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a 38,5ºC por 2h. Os oócitos foram novamente \nsubmetidos a mais uma lavagem e, então, foram marcados com Hoechst 33342 (10 mg/mL), \nem meio de montag em Vectashield (H-1000, Vector, Burlingame, CA, EUA) , à temperatura \nambiente, sobre uma lâmina de vidro coberta por uma lamínula.  \n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 42 \nAs lâminas foram estocadas a 4ºC até a observação em microscópio confocal de alta \nperformance (Confocal Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Mannheim, Alemanha) \nutilizando aumento óptico de 40X e os lasers Diodo 405 UV e HeNe 543. O intervalo máximo \nentre a confecção das lâminas e a leitura das mesmas foram de 10 dias. \n \n4.7. Classificação oocitária baseada na morfologia do fuso meiótico e no alinhamento \ncromossômico por microscopia confocal  \n Os oócitos  foram classificados de acordo com o estágio de maturação nuclear em  que \nse encontravam : metá fase I (MI), telófase I (TI), metáfase II (MII), ou  ativados \npartenogeneticamente (AP – caracterizada pela extrusão espontânea de um segundo CP sem \nter ocorrido ferti lização). Oócitos em MII foram subdivididos em analisáveis e não \nanalisáveis. Oócitos foram considerados analisáveis quand o o fuso meiótico era visualizado \nem uma posição lateral ou sagital  (Figura IA), permitindo uma avaliação global do fuso e do \narranjo cromossômico, e considerados não analisáveis quando o fuso era visualizado em uma \nposição polar (Figura IB) (JU et al., 2005), impedindo uma avaliação global do fuso e apenas \npermitindo uma visão do arranjo cromossômico . Na posição polar, embora os cromossomos \npossam estar alinhados, o fuso oocitário não é observado, e assim, o mesmo pode estar \nanormal (LIU  et al.,  2013; DA BROI  et al. ,2014). D essa forma , para evitar subestimar o \nnúmero de oócitos anormais, os oócitos em posição polar foram excluídos da análise. \n Oócitos considerados como analisáveis  foram ainda classificados como normais \nquando apresentaram fuso meiótico em forma de barril com microtúbulos organizados de um \npolo a outro, cromossomos alinhados na placa metafásica no equador do fuso e presença de \num corpúsculo polar (Figura IIA) (CP); ou considerados como anormais quando apresentaram \nfuso meiótico alterado (dimensão longitudinal r eduzida, microtúbulos desorganizados ou \n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 43 \nausentes) e/ou configuração cromossômica alterada (dispersos ou deslocados do plano da  \nplaca metafásica) (Figura IIB-D).  \n \n4.8. Análise estatística \n Os dados  foram analisados usando modelo lin ear generalizado (PROC G ENMOD) pelo  \nsoftware SAS 2003 (2002–2003, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA). A Distribuição de Poisson \nfoi utilizada para as variáveis de contagem (número total de oócitos fixados, número de oócitos \nem MI, TI, MII e AP) e a distribuição gama para as porc entagens (porcentagem  de oócitos  \nnormais e anormais em MII). Os grupos foram comparados utilizando o Teste X2, com o nível de \nsignificância em P < 0.01. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 44 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 2 – Imagens de microscopia confocal de oócitos bovinos maturados in vitro na \nausência de fluido peritoneal (No -FP), na presença de FP de mulheres férteis sem \nendometriose (C-PF) ou de mulheres inférteis com endometriose mínima e leve (EI/II -FP). \n(A) Oócito em metáfase II em visão sagital (analisável). ( B) Oócito em metáfase II em \nvisão polar (não analisável). Verde: fuso marcado com anticorpo anti -β-tubulina e \nanticorpo secundário conjugado com isotiocianato de fluoresceína; azul: cromossomos \nmarcados com Hoechst 33342. Barra de escala = 5μm. \n \n\n\n                                                                                                                                        Materiais e Métodos 45 \n \nFigura 3  – Imagens de microscopia confocal de oócitos bovinos maturados in vitro na \nausência de fluido peritoneal (No -FP), presença de FP de mulheres férteis sem \nendometriose (C-FP) ou  de mulheres inférteis com endometriose mínima e leve (EI/II-FP). \n(A) Oócito em  MII normal mostrando cromossomos alinhados adequadamente na região \ncentral de um fuso meiótico em forma de barril.  (B) Oócito em MII anormal com \ncromossomos desalinhados e fuso normal em forma de barril. ( C) Oócito em MII anormal \ncom cromossomos alinhados e fuso anormal ( dimensão longitudinal reduzida). (D) Oócito \nem MII anormal com cromossomos desalinhados e fuso anormal. Verde: fuso marcado \ncom anticorpo anti -β-tubulina e anticorpo secundário conjugado com isotiocianato de \nfluoresceína; azul: cromossomos marcados com Hoechst 33342. Barra de escala = 5μm. \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5. Resultados \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n                                                                                                                                                       Resultados 47 \n Um total de 241 oócitos foram visualizados por microscopia confocal [35 oócitos \nestavam em MI (14,52%), 2 em TI (0,83%), 200 em MII (82,99%) e 4 sofreram AP (1,66%) ]. \nDos 200 oócitos em MII, 112 foram considerados analisáveis (visão sagital ou lateral) e 88 \nforam considerados não analisáveis (visão polar) (Tabela I). \n No grupo sem fluido peritoneal (No -FP), um total de 48 oócitos foram avaliados; 41 \n(85,42%) estavam em MII e destes, 26 ( 63,41%) foram considerados analisáveis. Dos oócitos \nem MII analisáveis, 23 (88,46%) foram considerados normais e 3 (11,54%) anormais (Tabela \nI). Dentre os oócitos anormais, 1 (33,33%) apresentou apenas fuso anormal, e 2 (66,67%) \napresentaram tanto fuso anormal como desalinhamento cromossômico. \n No grupo controle com concentração de 1% de FP, um total de 57 oócitos foram \navaliados; 44 (77,19%) estavam em MII e destes, 28 (63,63%) foram considerados \nanalisáveis. Dos oócitos em MII analisáveis, 22 (78,57%) foram cons iderados normais e 6 \n(21,43%) anormais (Tabela I). Dentre os oócitos anormais, 3 (50,00%) apresentaram apenas \nfuso anormal, e 3 (50,00%) apresentaram tanto fuso anormal como desalinhamento \ncromossômico. \n No grupo controle com concentração de 10% de FP, um total de 63 oócitos foram \navaliados; 55 (87,30%) estavam em MII e destes, 26 (47,27%) foram considerados \nanalisáveis. Dos oócitos em MII analisáveis, 22 (84,62%) foram considerados normais e 4 \n(15,38%) anormais (Tabela I). Dentre os oócitos anormais, 3 (75 ,00%) apresentaram apenas \nfuso anormal, e 1 (25,00%) apresentou apenas desalinhamento cromossômico. \n No grupo endometriose com concentração de 1% de FP, um total de 43 oócitos foram \navaliados; 35 (81,40%)  estavam em MII e destes, 16 (45,71%)  foram consid erados \nanalisáveis. Dos oócitos em MII analisáveis, 10 (62,50%) foram considerados normais e 6 \n(37,50%) anormais (Tabela I). Dentre os oócitos anormais, 1 (16,66%) apresentou apenas \n\n                                                                                                                                                       Resultados 48 \nfuso anormal, 1 (16,66%) apresentou apenas desalinhamento cromossômico, e 4 (66,68%) \napresentaram tanto fuso anormal como desalinhamento cromossômico.  \n No grupo endometriose com concentração de 10% de FP, um total de 30 oócitos \nforam avaliados; 25 (83,33%) estavam em MII e destes, 16 (64,00%) foram considerados \nanalisáveis. Dos  MII analisáveis, 9 (56,25%) foram considerados normais e 7 (43,75%) \nanormais (Tabela I). Dentre os oócitos anormais, 1 (14,29%) apresentou apenas fuso anormal, \ne 6 (85,71%) apresentaram tanto fuso anormal como desalinhamento cromossômico. \n A porcentagem de oócitos meioticamente normais foi similar para oócitos submetidos \na MIV na ausência de FP (88,46%) assim como para aqueles oócitos submetidos a MIV na \npresença de 1% (78,57%) e 10% (84,62%) de FP de mulheres férteis (C-FP) (Tabela I). \n A porcentagem de o ócitos meioticamente normais foi significantemente maior para \noócitos submetidos a MIV na ausência de FP (88,46%) e na presença  de 1% (78,57%) e 10% \n(84,62%) de FP de mulheres férteis (C -FP) do que aqueles oócitos submetidos a MIV na \npresença de 1% (62,50% ) e 10% (56,25%) de FP de mulheres inférteis com endometriose \nmínima e leve (EI/II-FP) (Tabela I). \n No grupo controle, a porcentagem de oócitos meioticamente normais foi similar para \noócitos submetidos a MIV na presença de 1% (78,57%) e 10% (84,61%) de FP. \n No grupo endometriose, a porcentagem de oócitos meioticamente normais foi \nsignificantemente maior para oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62,50%) quando \nna presença 10% (56,25%) de FP. \n \n \n \n \n\n                                                                                                                                                                                                                                                                         Resultados 49 \n \n \nGrupo Concentração \nde FP \n(%) \nNúmero total de \noócitos \nvisualizados \n(n) \nMI \nn (%) \nTI \nn (%) \nAP \nn (%) \n \n \nNúmero \ntotal de MII \nn (%) \nMII \n \nAnalisáveis \nn (%) \n \n \nNormal \nn (%) \n \n \nAnormal \nn (%) \n \nNo-FP 0 48 5 (10,42) 1 (2,08) 1 (2,08) 41 (85,42) 26 (63,41) 23 (88,46)a 3 (11,54) \nC-FP 1 57 9 (15,79) 1 (1,75) 3 (5,27) 44 (77,19) 28 (63,63) 22 (78,57)a 6 (21,43) \n 10 63 8 (12,70) 0 0 55 (87,30) 26 (47,27) 22 (84,62)a 4 (15,38) \nEI/II-FP 1 43 8 (18,60) 0 0 35 (81,40) 16 (45,71) 10 (62,50)b 6 (37,50) \n 10 30 5 (16,67) 0 0 25 (83,33) 16 (64,00) 9 (56,25)c 7 (43,75) \nNota: No-PF, oócitos submetidos a MIV em meio sem adição de FP; C -FP, oócitos submetidos a MIV em meio suplementado com FP de mulheres férties \nsem endometriose; EI/II -FP, oócitos submetidos a MIV em meio suplementado com FP de mulheres inférteis com endome triose mínima e leve; \nAnalisáveis, oócitos com fuso fixado em visão sagital ou lateral; MI, metáfase I; TI, telófase I; MII, metáfase II; AP, ativa ção partenogenêtica espontânea \n(extrusão do segundo corpúsculo polar na ausência de fertilização). Dados são resultados de 6 replicatas. Letras diferentes na mesma coluna indicam uma \ndiferença significativa, P < 0.01, usando distribuição de Poisson, gama e o teste qui-quadrado. \n \n \n \nTabela I: Estágios de maturação nuclear e porcentagem de oócitos em metáfase II normais e anormais maturados em meio sem adição de fl uido peritoneal \n(No-FP), e com duas diferentes concentrações de fluido peritoneal de mulheres férteis sem endometriose (C -FP) e m ulheres inférteis com endometriose \nmínima e leve (EI/II-FP). \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. Discussão \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n                                                                                                                                                        Discussão 51 \n A endometriose  é uma doença caracterizada pela presença de tecido endometrial \n(glândulas e/ou estroma)  fora da cavidade uterina (GUPTA  et al., 2006; FOURQUET et al., \n2010). Entre suas manifestações clínicas mais freqüentes, destaca-se a infertilidade, presente \nem 30 a 50% das suas portadoras (BULLETTI et al., 2010; MACER E TAYLOR, 2012). Os \nmecanismos envolvidos na etiopatogênes da infertil idade relacionada a endometriose, \nprincipalmente nos casos de doença mínima e leve, ainda não estão claros (HOLOCH; \nLESSEY, 2010). Alguns estudos têm apoiado o conceito de diminuição de fecundidade em \nmulheres portadores de endometriose (GARRIDO et al.,  2002; BULLETTI  et al. , 2010 ), \nsugerindo um papel importante da qualidade oocitária na infertilidade apresentada por es sas \nmulheres (SIMÓN et al., 1994; GARRIDO et al., 2000; PELLICER et al., 2001). \n Embora haja trabalhos relatando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre a \nqualidade oocitária em oócitos maduros (MANSOUR et al., 2009, 2010), não se encontrou \nnenhum estudo que tenha avaliado o efeito do FP de mulheres inférteis com EI/II  durante a \nfoliculogênese, investigando seu papel na maturação e qualidade oocitária. Assim, o objetivo \ndo nosso estudo foi comparar o potencial impacto das concentrações 1% e 10%  de FP \nprovenientes de mulheres férteis sem endometriose (grupo controle) e de mulheres inférteis \ncom EI/II na maturação e qualidade oocitár ia, analisada pela normalidade do fuso celular e a \ndistribuição cromossômica, durante a MIV de oócitos bovinos. \n Sabe-se que a MIV, por si só, pode promover aumento significativo da ocorrência de \nanormalidades meióticas oocitárias ( LI et al., 2006). Todavia, a mesma metodologia de MIV \nfoi aplicada para os dois diferentes grupos (mulheres férteis sem endometriose e mulheres \ninférteis com EI/II), de modo que as diferenças encontradas são decorrentes de diferenças nos \nconstituintes do FP e não devido ao processo de MIV. \n De acordo com os resultados do nosso estudo, não foi encontrada diferença \nsignificativa no número de oócitos em estágio de MI, TI, AP e MII entre os grupos, o que \n\n                                                                                                                                                        Discussão 52 \ndemonstra não haver comprome timento da maturação nuclear de  oócitos maturados in vitro \nna presença de FP de mulheres inférteis com EI/II.  \n  A porcentagem de oócitos meioticamente normais foi similar para oócitos submetidos \na MIV na ausência de FP e na presença de  FP de mulheres férteis (1% e 10%), sugerindo que \no FP de mulheres férteis nas duas concentrações testadas não compromete a por centagem de \noócitos em metáfase II  com fuso meiót ico e distribuição cromossômica normais.  Este \nresultado era esperado, uma vez qu e durante a seleção das pa cientes, tivemos o cuidado de  \nexcluir fatores possivelmente relacionados ao comprometimento da qualid ade oocitária e/ou \nEO. Estes achados sugerem que as concentrações testadas a priori não são suprafisiológicas. \nConsiderando-se qu e os ovários são banhados pelo FP, mas que os folículos em \ndesenvolvimento não estão em contato íntimo com o fluido durante a foliculogênese, estando \nprotegidos mecanicamente pela túnica albugínea e epitélio germinativo, um dos desafios seria \nencontrar con centrações do FP de mulheres férteis que não comprometessem a maturação \noocitária, bem como sua normalidade, o que pôde ser observado com as duas concentrações \ntestadas (1% e 10%).  \n No entanto, quando os oócitos foram submetidos a MIV na presença de FP  de \nmulheres inférteis com EI/II (1% e 10%), a porcentagem de oócitos meioticamente normais \nfoi significantemente menor do que aqueles submetidos a MIV na ausência de FP e na \npresença de FP de mulheres férteis (1% e 10%), sugerindo que o FP de mulheres inférteis com \nendometriose em estágios inicias pode promover anomalias meióticas nos oócitos durante o \nprocesso de MIV, e assim prejudicar a qualidade oocitária. Em contraste com o grupo \ncontrole, no grupo endometriose, a porcentagem de oócitos meioticamente normais foi \nsignificantemente maior na concentração de 1% de FP quando comparada com a concentração \nde 10% de FP, sugerindo um efeito dose -dependente do FP de mulheres com EI/II sobre a  \nocorrência de danos meióticos oocitários. Uma vez que concentrações menores (abaixo de \n\n                                                                                                                                                        Discussão 53 \n1%) não foram testadas, não é possível garantir que 1% seja a concentração mais baixa  de FP \nde mulheres com EI/II  capaz de comprometer o fuso meiótico e a distribuição cromossômica \ndurante o processo de MIV. \n Nossos resultados corroboram os estudos de Mansour  et al  (2009, 2010), ao \nevidenciarmos o impacto deletério do FP de mulheres com endometriose na promoção de \nanomalias meióticas oocitárias. No entanto, metodologicamente, nosso estudo diferiu do \nestudo de M ansour et al  (2009, 2010) em três aspectos: em nosso trabalho foram incluídas \nsomente pacientes com estágios iniciais  da doença, enquanto que Mansour  et al (2009, 2010) \nnão descreveram o estágio da endometriose presente nas mulheres incluídas em seu s estudos; \ntodas as mulheres com endometriose que fizeram parte do nosso estudo apresentavam \ninfertilidade, enquanto que Mansour et al (2009, 2010) não especificaram se as mulheres com \nendometriose apresentavam infertilidade; e por último nós avaliamos o efeito do FP de \nmulheres com endometriose em oócitos maturados in vitro , enquanto que Mansour et al  \n(2009, 2010) avaliaram seu efeito apenas em oócitos já maduros, não sendo possível avaliar o \nimpacto do FP de mulheres com endometriose sobre o processo de maturação oocitária.  \n Marcadores de EO tem sido observados no FP de mulheres inférteis com endometriose \n(GUPTA et al.,  2008; AUGOULEA et al. , 2012 ), inclusive nos estágio s iniciais da doença \n(MIER-CABRERA et al. , 2011 ). Mansour  et al  (2009, 2010) demonstraram que o FP de \nmulheres com endometriose promove anomalias meióticas oocitárias, e essas foram reduzidas \npor meio da suplementação no meio de cultivo com L -carnitina, um antioxidante, sugeri ndo \nque substâncias presentes no FP de mulheres com a doença promovem um comprometimento \nda qualidade oocitária e subsequente qualidade embrionária, tendo o EO como provável \nmediador (MANSOUR et al., 2009, 2010) . Como previamente apontado, o EO é capaz de \ncausar anomalias meióti cas, instabilidade cromossômica , indução de apoptose e \ncomprometimento do desenvolvimento embr ionário pré -implantação (NAVARRO et al. , \n\n                                                                                                                                                        Discussão 54 \n2004, 2006).  Considerando que os ovários humanos estão  em íntimo contato com o FP , \nsupomos que possa haver influência do mesmo sobre os oócitos,  não apenas após a ovulação, \nmas também durante todo o processo de foliculog ênese e/ou maturação oocitária. Dessa \nforma, hipotetizamos que o mesmo pode refletir o EO presente neste microambiente de \nmulheres inférteis com endometriose, mesmo que em estágios iniciais. \n Reforçando nossa hipótese, um estudo conduzido por nosso grupo, usando modelo \nexperimental bovino, comparou o potencial im pacto do FP de mulheres férteis e  mulheres \ninférteis com e sem EI/II sobre a  expressão de genes relacionados as principais enzimas \nantioxidantes em oócitos maturados in vitro. O estudo mostrou que o FP de mulheres inférteis \ncom EI/II promove uma redução significativa na expressão dos genes GSR e CAT em oócitos \nbovinos, sugerindo um maior consumo dessas enzimas antioxidantes  na tentativa de prevenir \nos danos oocitários durante a MIV (MALVEZZI, 2011). \n O atual estudo trouxe contribuições inéditas  para o esclarecimento da etiopatogênese \nda infertilidade relacionada à endometriose em estágios iniciais, no entanto, contamos com  \nalgumas limitações. Uma delas foi a utilização de oócitos bovinos. Optamos por utilizar este \nmodelo animal devido a similaridade em tamanho e morfologia dos ovários humanos e \nbovinos, e também porque ambas as espécies são mono-ovulatórias e policíclicas. Além disso, \noócitos bovinos são abundantes, apresentam baixo custo e são facilmente manipulados \n(MALHI et al. , 2005). Estudos com modelos animais podem não necessariamente ser \nextrapolados para os seres humanos e estudos com oócitos de mulheres inférteis com EI/II \nmaturados in vivo são importantes para confirmar nossos resultados. No entanto, considerando \no número reduzido de oócitos humanos destinados à pesquisa, e o fato da análise por \nimunofluorescência ser um m étodo invasivo que necessita de fixação da amostra, o uso de \nmodelo animal tornou-se uma importante alternativa neste estudo. Outra limitação foi  devido \naos rigorosos critér ios de seleção de doadores de FP; consequentemente, o estudo teve  um \n\n                                                                                                                                                        Discussão 55 \ntamanho amostral pequeno (6 casos e 6 controles); dessa forma , novas inve stigações \nutilizando uma maior  número de pacientes são necessárias para confirmar nossos resultados. \nCaso os presentes achados sejam confirmados em estudo s com maiores casuísticas , nossos  \ndados poderão contribuir para confimar  que o FP de pacientes com EI/II causa  danos ao fuso \nmeiótico e à distr ibuição cromossômica de oócitos durante a foliculogênese e/ou maturação \noocitária. \n Em resumo, nós evidenciamos pela primeira vez que o FP  de mulheres inférteis com \nEI/II promove um efeito deletério  sobre o fuso meiótico e a distribuição cromossômica  de \noócitos bovinos  em metáfase II,  submetidos à MIV na presença de duas diferentes \nconcentrações (1% e 10%) . Estes achados abrem perspectivas p ara o entendimento dos \nmecanismos patogênicos da infertilidade relacionada à doença em estágios iniciais, sugerindo \nque alterações no microambiente peritoneal de mulheres inférteis com EI/II sejam passíveis \nde comprometer a ma turação e qualidade oocitária.  Um melhor conhecimento  dos \nmecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à endometriose inicial poderão \najudar na concepção de novas abordagens terapêuticas para melhorar a fertilidade n atural \ndestas mulheres. \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7. Conclusões \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n                                                                                                                                                      Conclusões 57 \n As duas concentrações (1% e 10%) de FP de mulheres férteis sem endometriose não \npromoveram atraso ou bloqueio no processo de maturação oocitária em  oócitos bovinos \nsubmetidos a MIV. Tampouco promoveram aumento na porcentagem de a normalidades \nmeióticas nos oócitos em metáfase II. \n As duas concentrações (1% e 10%) de FP de mulheres inférteis com EI/II também não \npromoveram atraso ou bloqueio no processo de maturação oocitária em  oócitos bovinos \nsubmetidos a MIV. Todavia, observou-se um efeito deletério concentração dependente do FP \nde mulheres inférteis com EI/II sobre o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de \noócitos bovinos em MII, submetidos a MIV na presença de FP. Uma vez que concentrações \nmenores (abaixo de 1%) de FP não  foram testadas, n ão é possível garantir que 1% seja a \nconcentração mais baixa de FP de mulheres com EI/II  capaz de comprometer o fuso meiótico \ne a distribuição cromossômica durante o processo de MIV. \n Estes achados sugerem um papel deletério do FP de mulheres inférteis com EI/II sobre \na qualidade oocitária, o que poderia estar envolvido na diminuição da ferti lidade natural de \nmulheres portadoras de infertilidade relacionada à endometriose em estágios inicias. \n Futuros estudos, com maior es casuísticas, que analisem possíveis componentes \nalterados no FP de mulheres inférteis com endometriose, são de grande importância para se \ntentar elucidar potenciais fatores promotores dos danos meióticos oocitários encontrados no \npresente estudo, em decor rência da adição de FP de mulheres com a doença ao meio de \nmaturação. O melhor entendimento dos mecanismos etiopatogênicos da infertili dade \nrelacionada à endometriose em estágios iniciais  poderão ajudar na concepção de novas \nabordagens terapêuticas para melhorar a fertilidade natural destas mulheres inférteis. \n \n \n \n\n \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n8. Referências Bibliográficas \n \n \n \n \n   \n \n \n \n  \n \n \n\n\n                                                                                                                               Referências Bibliográficas 59 \nABRÃO, M.S.; PODGAEC, S.; JUNIOR, J.A.D. Endometriose, a mulher moderna e o Brasil. \nPrática Hospitalar, p. 73-77, 2007. \n \nACÍEN, P.; VELASCO, I. Endometriosis: A disease that remains enigmatic. ISRN \nObstetrics and Ginecology, 2013. \n \nADONA, P.R.; LEAL,  C.L.V. Meiotic inhibition with different cyclin -dependent kinase \ninhibitors in bovine oocytes and its effects on maturation and embryo development. Zygote, \nv. 12, n. 3, p. 197-204, 2004. \n \nAGARWAL, A.; SALEH,  R.A.; BEDAIWY, M.A. Role of reactive oxygen species i n the \npathophysiology of human reproduction. Fertil Steril, v.79, n.4, p. 829-43, 2003. \n \nAKANDE, V.A. et al.  Differences in time to natural conception between women with \nunexplained infertility and infertile women with minor endometriosis. Hum Reprod, v. 19, n. \n1, p. 96-103, 2004. \n \nANDRADE, A.Z. et al. Serum markers of oxidative stress in infertile women with \nendometriosis. Rev Bras Ginecol Obstet, v. 32, n. 6, p. 279-85, 2010. \n \nAUGOULEA, A. et al. Pathogenesis of endometriosis: the role of genetics, inflammation and \noxidative stress. Arch Gynecol Obstet, v. 286, n. 1, p. 99-103, 2012. \n \nBARCELOS, I.D. et al.  Anomalias meióticas de oócitos de pacientes com endometriose \nsubmetidas à estimulação ovariana. Rev Bras Ginecol Obstet, v. 30, n. 8, p. 413-9, 2008. \n \nBARCELOS, I.D. et al. Comparative analysis of the spindle and chromosome configurations \nof in vitro -matured oocytes from patients with endometriosis and from control subjects: a \npilot study. Fertil Steril, v. 92, n. 5, p. 1749-52, 2009. \n \nBARNHART, K.; DUNSMOOR-SU, R.; COUTIFARIS, C. Effect of endometriosis on in \nvitro fertilization. Fertil Steril, v. 77, n. 6, p. 1148-55, 2002. \n \nBEDAIWY, M.A.; FALCONE,  T. Peritoneal fluid environment in endometriosis. \nClinicopathological implications. Minerva Ginecol, v. 55, n. 4,  p. 333-45, 2003.  \n \nBRIZEK, C.L.  et al . Increased incidence of aberrant morphological phenotypes in human \nembryogenesis-an association with endometriosis. J Assist Reprod Genet, v. 12, n. 2, p. 106-\n12, 1995. \n \nBULLETTI, C. et al. Endometriosis and infertility.  J Assist Reprod Genet , v. 27, n. 8, p. \n441-7, 2010. \n \nCAMPOS PETEAN, C. et al. Lipid peroxidation and vitamin E in serum and follicular fluid \nof infertile women with peritoneal endometriosis submitted to controlled ovarian \nhyperstimulation: a pilot study. Fertil Steril, v. 90, n. 6, p. 2080-5, 2008.  \n \nCARVALHO, L.F. et al. Minimal and mild endometriosis negatively impact on pregnancy \noutcome. Rev Assoc Med Bras, v. 58, n. 5, p. 607-14, 2012. \n \n\n                                                                                                                               Referências Bibliográficas 60 \nCHOI, W.J. et al. Oxidative stress and tumor necrosis factor -alpha-induced alterations in \nmethapase II mouse oocyte spindle structure. Fertil Steril, v.88, p. 1220-31, 2007. \n \nCOOPER, T. G. et al. World Health Organization reference values for human semen \ncharacteristics. Human Reproduction Update, v. 00, n. 0, p. 1-15, 2009. \n \nDA BROI, M.G. et al . Follicular fluid from infertile women with mild endometriosis may \ncompromise the meiotic spindles of bovine metaphase II oocytes. Hum Reprod, v. 29, n. 2, \np. 315-23, 2014. \n \nEICHENLAUB-RITTER, U.; SHEN,  Y.; TINNEBERG, H.R. Manipulation of the oocyte: \npossible damage to the spindle apparatus. Reprod Biomed Online , v.  5, n. 2, p. 117 -24, \n2002. \n \nFERREIRA, E.M. et al . Prematuration of bovine oocytes with butyrolactone I reversibly \narrests meiosis without increasing meiotic abnormalities after in vitro maturation. Eur J \nObstet Gynecol Reprod Biol, v. 145, n. 1, p. 76-80, 2009. \n \nFOURQUET, J. et al. Patient´s report on how  endometriosis affects health, work, and daily \nlife. Fertil and Steril, v. 93, n. 7, p. 2424-28, 2010. \n \nGARRIDO, N. et al. Follicular hormonal environment and embryo quality in women with \nendometriosis. Hum Reprod Update, v. 6, n. 1, p. 67-74, 2000. \n \nGARRIDO, N. et al. The endometrium versus embryonic quality in endometriosis -related \ninfertility. Hum Reprod Update, v. 8, n. 1, p. 95-103, 2002. \n \nGIORGI V.S.I. et al. N-acetyl-cysteine and L -carnitine prevent meiotic oocyte damage \ninduced by follicular fluid from infertile women with endometriosis. Reproductive Sciences, \n2015. \n \nGUPTA, S. et al. Role of oxidative stress in endometriosis. Reprod Biomed Online, v. 13, n. \n1, p. 126-34, 2006. \n \nGUPTA, S. et al. Pathogenic mechanisms in endometriosis -associated infertility. Fertil \nSteril, v. 90, n. 2, p. 247-57, 2008. \n \nHARADA, T. et al. Role of cytokines in endometriosis. Fertil Steril, v.76, n.1, 2001. \n \nHASHIMOTO, S. et al. Bovine immature oocytes acquire develop mental competence during \nmeiotic arrest in vitro. Biol Reprod, v. 66, n. 6, p. 1696-701, 2002. \n \nHOLOCH, K.J.; LESSEY, B.A. Endometriosis and infertility. Clin Obstet Gynecol, v. 53, n. \n2, p. 429-38, 2010. \n \nHU, Y. et al. Effects of low O 2 and ageing on spindles and chromosomes in mouse oocytes \nfrom pre-antral follicle culture. Hum Reprod, v. 16, n. 4, p. 737-48, 2001. \n \nJU, J.C. et al. Heat shock reduces developmental competence and alters spindle configuration \nof bovine oocytes. Theriogenology, v. 64, n. 8, p. 1677-89, 2005. \n\n                                                                                                                               Referências Bibliográficas 61 \n \nKUMBAK, B. et al. In vitro fertilization in normoresponder patients with endometriomas: \ncomparison with basal simple ovarian cysts. Gynecol Obstet Invest , v. 65, n. 3, p. 212 -6, \n2008. \n \nLI, Y. et al. Confocal microscopic analysis of the spindle and chromosome configurations of human \noocytes matured in vitro. Fertil Steril, v. 85, n. 4, p. 827-32, 2006. \n \nLORENÇATTO, C. et al. Avaliação de dor e depressão em mulheres com endometriose após \nintervenção multiprofissional em grupo. Revista de Associação Médica Brasileira , v. 53, n. \n5, p. 344-8, 2007. \n \nLIU, L.; JU,  J.C.; YANG,  X. Differential inactivation of maturation -promoting factor and \nmitogen-activated protein kinase following parthenogenetic activation of bovine oocytes. Biol \nReprod, v. 59, n. 3, p. 537-45, 1998. \n \nLIU, F. Et al. The expression and role of oxidative stress markers in the serum and follicular \nfluid of patients with endometriosis. Clin Exp Obstet Gynecol, v. 40, n. 3, p. 372-6, 2013. \n \nMACER, M.L.; TAYLOR, H.S. Endometriosis and infertility: a review of the pathogenesis \nand treatment of endometriosis-associated infertility. Obstet Gynecol Clin N Am , v. 39, n. 4, \np. 535-49, 2012. \n \nMALHI, P.S.; ADAMS, G.P.; SINGH, J. Bovine model for the study of reproductive aging in \nwomen: follicular, luteal, and endocrine characteristics. Biol Reprod , v. 73, n. 1, p.  45 -53, \n2005. \n \nMALVEZZI, H. O fluido peritoneal de mulheres inférteis com e sem e ndometriose \npélvica mínima/leve reduz a expressão dos genes GSR e CAT em oócitos bovinos.  2011. \n129 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas). Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. \n \nMANSOUR, G. et al. L-carnitine supplementation reduces oocyte cytoskeleton damage and \nembryo apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid from patients with endometriosis. \nFertil Steril, v. 91, n. 5, p. 2079-86, 2009. \n \nMANSOUR, G. et al . Endometriosis -induced altera tions in mouse metaphase II oocyte \nmicrotubules and chromosomal alignment: a possible cause of infertility. Fertil Steril, v. 94, \nn. 5, p. 1894-9, 2010. \n \nMARCOUX, S.; MAHEUX, R.; BERUBE, S. Laparoscopic surgery in infertile women with \nminimal or mild endom etriosis. Canadian Collaborative Group on Endometriosis. N Engl J \nMed, v. 337, n. 4, p. 217-22, 1997. \n \nMEDICINE, P. C. O. A. S. F. R. Definitions of infertility and recurrent pregnancy loss: a \ncommittee opinion. Fertil Steril, v. 99, n. 1, p. 63, 2013. \n \nMIER-CABRERA, J. Quantitative and qualitative peritoneal immune profiles, T -cell \napoptosis and oxidative stress -associated characteristics in women with minimal and mild \nendometriosis. BJOG, v. 118, v. 1, p. 6-16, 2011. \n\n                                                                                                                               Referências Bibliográficas 62 \n \nMINICI, F. et al. Endometriosis and  human infertility: a new investigation into the role of \neutopic endometrium. Hum Reprod, v. 23, n. 3, p. 530-7, 2008. \n \nMORADI, M. et al. Impact of endometriosis on women´s lives: a qualitative study. BMC \nWomens Health, v. 14, p. 123, 2014. \n \nMULLEN, S.F. et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human \noocytes, and the relevance to cryopreservation. Hum Reprod, v. 19, n. 5, p. 1148-54, 2004. \n \nMURPHY, A.A. et al. Lysophosphatidyl choline, a chemotactic factor for monocyt es/T-lym- \nphocytes is elevated in endometriosis. J Clin Endocrinol Metab , v.  83, n. 6, p. 2110-13, \n1998. \n \nNAVARRO, P.A.; LIU,  L.; KEEFE, D.L. In vivo effects of arsenite on meiosis, \npreimplantation development, and apoptosis in the mouse. Biol Reprod, v. 70, n. 4, p. 980-5, \n2004. \n \nNAVARRO, P.A. et al.  Arsenite induces aberrations in meiosis that can be prevented by \ncoadministration of N-acetylcysteine in mice. Fertil Steril, v. 85, p. 1187-94, 2006. \n \nPARAZZINI, F. Ablation of lesions or no treatment in minimal -mild endometriosis in \ninfertile women: a randomized trial. Gruppo Italiano per lo Studio dell´Endometriosi. Hum \nReprod, v. 14, n. 5, p. 1332-4, 1999. \n \nPELLICER, A. et al. Exploring the mechanism( s) of endometriosis -related infertility: an \nanalysis of embryo development and implantation in assisted reproduction. Hum Reprod, v. \n10, p. 91-7, 1995. \n \nPELLICER, A. et al. Endometrial quality in infertile women with endometriosis. Ann N Y \nAcad Sci, v. 943, p. 122-30, 2001. \n \nPRIETO, L. et al. Analysis of follicular fluid and serum markers of oxidative stress in women \nwith infertility related to endometriosis. Fertil Steril, v. 98, n. 1, p. 126-30, 2012. \n \nRevised American Society for Reproductive Medicine cl assification of endometriosis: 1996. \nFertil Steril, v. 67, n. 5, p. 817-21, 1997. \n \nSBE. Aspectos preventivos da endometriose . Disponível em \n<http:www.sbendometriose.com.br>. Acesso em: 26 de out. 2015. \n \nSIGNORILE, P.G.; BALDI, A. Endometriosis: new concepts in the pathogenesis. Int J \nBiochem Cell Biol, v. 42, n. 6, p. 778-80, 2010. \n \nSIMÓN, C. et al.  Outcome of patients with endometriosis in assisted reproduction: results \nfrom in-vitro fertilization and oocyte donation. Hum Reprod, v. 9, n. 4, p. 725-9, 1994. \n \nSOUZA, M.; SANCHES, L.C.; GARBELINI, M.C.L. A reprodução assistida aplicada em \ncasos de infertilidade associados à endometriose. Encontro de Bioética do Paraná, 2009. \n \n\n                                                                                                                               Referências Bibliográficas 63 \nSPIGOLON, D.L.; AMARAL, V.F.; BARRA C.M.C.M. Endometriose: impacto econômico e \nsuas perspectivas. Femina, v. 40, n. 3, p. 129-34, 2012. \n \nSZCZEPANSKA, M. et al. Oxidative stress may be a piece in the endometriosis puzzle. \nFertil Steril, v. 79, n. 6, p. 1288-93, 2003. \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAnexos \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n                                                                                                                                                            Anexos 65 \nAnexo 1 – Termos de Consentimento Livre e Esclarecido \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n(Fluido Peritoneal - Grupo Controle – FERTILIDADE COMPROVADA) \n \n1. NOME DA PESQUISA: “Av l              c  l  m  c       fl      folicular e \nperitoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese de anomalias meióticas \n  c                  v lv m      mb        ,    l z     m   l   x    m    l b v   ” \n2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro \n  \n V cê            c  v             c                       l    “Av l              c  l \nimpacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese \nde anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizand o modelo \n x    m    l b v   ” \n Sabemos que o estresse oxidativo (que aparece quando ocorre um desequilíbrio entre as \ndefesas antioxidantes e a produção de espécies reativas) compromete a fertilidade masculina. \nTemos suspeita de que o estresse oxidativo pos sa comprometer também a fertilidade feminina, \nporém até o presente momento encontramos poucos dados sobre este assunto, os quais, muitas \nvezes, são contraditórios. A endometriose é uma causa bastante comum de dificuldade para \nengravidar (denominada inferti lidade) e estuda -se a possibilidade do estresse oxidativo \nparticipar da ocorrência desta freqüente doença, podendo, inclusive, contribuir para a \ninfertilidade associada à mesma. Temos indícios de que o estresse oxidativo possa prejudicar a \nqualidade dos óv ulos, levando à redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam \nprocedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometriose, questiona -se \nse um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar seja a inadequada \nqualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, \nconseqüentemente, gerar uma gestação menos viável. Um estudo usando óvulos de \ncamundongos, publicado recentemente, sugeriu que o fluido peritoneal (líquido contido na \ncavidade pélvica, onde ficam os órgãos internos femininos, a bexiga e a parte baixa do \nintestino) de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade dos óvulos e \nembriões.  \n Assim, a avaliação do efeito do fluido peritoneal de mulheres inférteis com \nendometriose sobre a qualidade dos óvulos e embriões poderia auxiliar a descoberta de alguns \ndos mecanismos envolvidos na causa da infertilidade, o que ajudaria na identificação de \ntratamentos futuros. Contudo, para podermos dizer se o efeito do fluido perito neal de mulheres \n\n                                                                                                                                                            Anexos 66 \ninférteis com endometriose é diferente daquele de de mulheres férteis (que já tiveram filho), \nprecisamos de um grupo tido como controle, ou seja, fluido peritoneal de mulheres férteis \nsubmetidas à laqueadura, no qual você estaria incluída. \n Para estudarmos o possível efeito prejudicial do fluido peritoneal de mulheres com \nendometriose e compará -lo com o que ocorre em mulheres sem a doença, propomos avaliar o \nefeito da adição de fluido peritoneal no cultivo in vitro de óvulos e embriões bovi nos (de \nvacas). Assim, para a realização dessa pesquisa, será necessária a doação de uma amostra de \nfluido peritoneal coletada durante a videolaparoscopia que você será submetida para a \nrealização da ligadura das suas trompas. Este procedimento é rápido e isento de riscos \nadicionais à sua saúde. A coleta de fluido peritoneal durante a realização da sua \nvideolaparoscopia diagnóstica não promoverá aumento do tempo da cirurgia ou do risco \ncirúrgico, sendo, portanto, isenta de efeitos colaterais previsíveis. \n Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de \npaciente do grupo controle, ou seja, cujo fluido peritoneal seja considerado como padrão de \nnormalidade, para fins de comparação com os fluidos das pacientes com endometriose.   Sua \ncolaboração, portanto, no fornecimento de amostra de fluido peritoneal será imprescindível \npara um melhor conhecimento do efeito do fluido peritoneal de pacientes com dificuldade para \nengravidar sem endometriose, sobre os oócitos e embriões (utilizan do um modelo animal para \nesta avaliação, ou seja, utilizando óvulos e embriões de vaca). Estes dados serão comparados \naos de mulheres com dificuldade para engravidar devido à endometriose. Este conhecimento no \nfuturo poderá ser usado no sentido de propicia r um tratamento mais eficaz da infertilidade \nassociada a endometriose. Contudo, ressaltamos que você não terá nenhum tipo de benefício \nimediato participando do presente estudo. \nÉ importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você. Todo \no material obtido será utilizado exclusivamente para cultivo de óvulos e embriões bovinos. \nTambém devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não implicará na \nrealização de nenhum procedimento complementar durante a sua videolaparoscopia.  \n Fui informada de que o fluido peritoneal será coletado durante a minha \nvideolaparoscopia, sem promover aumento dos riscos operatórios. Fui informada também de \nque o fluido peritoneal coletado durante a minha videolaparoscopia será utilizado para cult ivo \nde óvulos e embriões bovinos. Desta forma, autorizo a coleta e utilização do fluido peritoneal \nobtido durante laparoscopia diagnóstica de rotina exclusivamente no presente estudo.  \n \n\n                                                                                                                                                            Anexos 67 \n3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todas as dúvidas com relação ao estudo que,  \nporventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente \nesclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você tem a liberdade de \nretirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que \nisto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento.  Asseguramos o total sigilo em \nrelação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o \ncaráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso \nde que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa \nafetar a sua vontade de continuar dele participando. Asseguramos o compromisso de que você \nserá devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste \nprojeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão \ndos trabalhos da pesquisa. \n \n \nEu, _______________________________ ______________, RG nº:___________ abaixo \nassinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e \naceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras fluido peritonal. \nAutorizo a pesquisadora abaixo mencionada a utilizá -l                   : “Av l         \npotencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na \ngênese de anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando \nm   l   x    m    l b v   ”,         c                  l b               ar o meu \nconsentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga \nqualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. \n \n \nRibeirão Preto _______ / _______ / _________ \n \n \n_______________________________           ___________________________ \nAssinatura- Paciente    Assinatura do Pesquisador \n \n4.  PESQUISADORAS RESPONSÁVEIS: \n  Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP \n  Telefone de contato: 16-3602-2231 \nEndereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar  (Hospital das Clínicas -Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n \n  Bruna Talita Gazeto Melo Jianini  \n  Pós-graduanda do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP \n  Telefone de contato: 16-3637-9673 \nEndereço: Av. Bandeir antes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínica s-Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n \n\n                                                                                                                                                            Anexos 68 \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n(Fluido Peritoneal - GRUPO ENDOMETRIOSE) \n \n1. NOME DA PESQUISA: “Av l              c  l  m  c       fluidos folicular e \nperitoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese de anomalias meióticas \n  c                  v lv m      mb        ,    l z     m   l   x    m    l b v   ” \n2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro \n  \n V cê            c  v             c                       l    “Av l              c  l \nimpacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese \nde anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário , utilizando modelo \n x    m    l b v   ” \n Sabemos que o estresse oxidativo (que aparece quando ocorre um desequilíbrio entre as \ndefesas antioxidantes e a produção de espécies reativas) compromete a fertilidade masculina. \nTemos suspeita de que o estresse ox idativo possa comprometer também a fertilidade feminina, \nporém até o presente momento encontramos poucos dados sobre este assunto, os quais, muitas \nvezes, são contraditórios. A endometriose é uma causa bastante comum de dificuldade para \nengravidar (denomin ada infertilidade) e estuda -se a possibilidade do estresse oxidativo \nparticipar da ocorrência desta freqüente doença, podendo, inclusive, contribuir para a \ninfertilidade associada à mesma. Temos indícios de que o estresse oxidativo possa prejudicar a \nqualidade dos óvulos, levando à redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam \nprocedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometriose, questiona -se \nse um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar seja a ina dequada \nqualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, \nconseqüentemente, gerar uma gestação menos viável. Um estudo usando óvulos de \ncamundongos, publicado recentemente, sugeriu que o fluido peritoneal (líquido cont ido na \ncavidade pélvica, onde ficam os órgãos internos femininos, a bexiga e a parte baixa do \nintestino) de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade dos óvulos e \nembriões.  \n Assim, a avaliação do efeito do fluido peritoneal de mulheres infért eis com \nendometriose sobre a qualidade dos óvulos e embriões poderia auxiliar a descoberta de alguns \ndos mecanismos envolvidos na causa da infertilidade, o que ajudaria na identificação de \ntratamentos futuros. Contudo, ressaltamos que você não terá nenhum tipo de benefício imediato \nparticipando do presente estudo. \n\n                                                                                                                                                            Anexos 69 \n Para estudarmos o possível efeito prejudicial do fluido peritoneal de mulheres com \nendometriose e compará -lo com o que ocorre em mulheres sem a doença, propomos avaliar o \nefeito da adição de flui do peritoneal no cultivo in vitro de óvulos e embriões bovinos (de \nvacas). Assim, para a realização dessa pesquisa, será necessária a doação de uma amostra de \nfluido peritoneal coletada durante a videolaparoscopia que você será submetida. Este \nprocedimento é rápido e isento de riscos adicionais à sua saúde. A coleta de fluido peritoneal \ndurante a realização da sua videolaparoscopia diagnóstica não promoverá aumento do tempo da \ncirurgia ou do risco cirúrgico, sendo, portanto, isenta de efeitos colaterais previsíveis. \n Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de \npaciente do grupo de estudo, ou seja, com endometriose. Sua colaboração, portanto, no \nfornecimento de amostra de fluido peritoneal será imprescindível para um melh or \nconhecimento do efeito do fluido peritoneal de mulheres com endometriose sobre os oócitos e \nembriões (utilizando um modelo animal para esta avaliação, ou seja, utilizando óvulos e \nembriões de vaca, cultivados com o seu fluido peritoneal). Este conhecime nto no futuro poderá \nser usado no sentido de propiciar um tratamento mais eficaz da infertilidade associada a esta \ndoença. Contudo, ressaltamos que você não terá nenhum tipo de benefício imediato \nparticipando do presente estudo. \nÉ importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você. Todo \no material obtido será utilizado exclusivamente para cultivo de óvulos e embriões bovinos. \nTambém devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não implicará na \nrealização de nenhum procedimento complementar durante a sua videolaparoscopia. \n Fui informada de que o fluido peritoneal será coletado durante a minha \nvideolaparoscopia, sem promover aumento dos riscos operatórios. Fui informada também de \nque o fluido peritoneal coletado durante  a minha videolaparoscopia será utilizado para cultivo \nde óvulos e embriões bovinos. Desta forma, autorizo a coleta e utilização do fluido peritoneal \nobtido durante laparoscopia diagnóstica de rotina exclusivamente no presente estudo.  \n \n3. INFORMAÇÕES ADIC IONAIS: Todas as dúvidas com relação ao estudo que, \nporventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente \nesclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você tem a liberdade de \nretirar o seu consentimen to e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que \nisto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento.  Asseguramos o total sigilo em \nrelação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o \ncaráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso \n\n                                                                                                                                                            Anexos 70 \nde que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa \nafetar a sua vontade de continuar dele participando. Asseguramos o compromisso de  que você \nserá devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste \nprojeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão \ndos trabalhos da pesquisa. \n \n \nEu, _______________________________ ______________, RG nº:___________ abaixo \nassinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e \naceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras fluido peritoneal. \nAutorizo a pesquisadora abaixo menciona da a utilizá -l                   : “Av l         \npotencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na \ngênese de anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando \nmodelo experimental bovin  ”,         c                  l b                    m   \nconsentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga \nqualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. \n \n \nRibeirão Preto _______ / _______ / _________ \n \n \n_______________________________           ___________________________ \nAssinatura- Paciente    Assinatura do Pesquisador \n \n \n4. PESQUISADORAS RESPONSÁVEIS: \n  Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP \n  Telefone de contato: 16-3602-2231 \nEndereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas - Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n \n  Bruna Talita Gazeto Melo Jianini  \n  Pós-graduanda do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP \n  Telefone de contato: 16-3637-9673 \nEndereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas - Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n \n \n \n \n\n                                                                                                                                                            Anexos 71 \nAnexo 2 – Manuscrito \n \nPeritoneal fluid from infertile women with minimal/mild endometriosis compromises the \nmeiotic spindle of metaphase II bovine oocytes \n \nB.T.G.M. Jianini1*, V.S.I. Giorgi1, M.G. Da Broi1, C.C.P. de Paz2, J.C.R. e Silva1, R.A. \nFerriani 1,3, P.A.A.S. Navarro 1,3. \n \n1 Human Reproduction Division, Department of Gynecol ogy and Obstetrics, Ribeirão Preto \nSchool of Medicine, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil \n2 Department of Genetics, Ribeirão Preto  School of Medicine , University of São Paulo, \nRibeirão Preto, SP, Brazil \n3 National Institute of Hormones and W m  ’  H  l h, CNP , P     Al g  , RS, B  z l \n \nInstitution: Ribeirão Preto School of Medicine, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, \nBrazil. \n \n \n \n \nCorresponding author: \nBruna Talita Gazeto Melo Jianini \nAvenida Bandeirantes, 3900 - Ribeirao Preto, SP, Brazil \nCEP: 14049-900; Tel: +55 16 3602 2821; Fax: +55 16 3633 1028 \nE-mail: brunagazeto@hotmail.com \n\n                                                                                                                                                            Anexos 72 \nAbstract \nStudy question : What is the potential impact of peritoneal fluid (PF) from infertile women \nwith minimal/mild endometriosis (EI/II) on the oocyte nuclear maturation, evaluated by \nmeiotic spindle and chromosome distribution? \nSummary answer: PF from infertile women with EI/II compromises the meiotic spindle and \nchromosome distribution of in vitro-matured bovine oocytes. \nWhat is known already : Controversial studies have suggested that impaired oocyte quality \nmay be involved in the pathogenesis of endometriosis -related infertility. Furthermore, some \nstudies have demonstrated alterations in the composition of PF from women with \nendometriosis, without specifically evaluating infertile women in early stages of the disease. \nStudy design, size, duration : We performed an experimental study, using a bovine model. \nSamples of PF were obtained between 2008 and 2010 f rom 12 women who underwent \nvideolaparoscopy at our university: 6 infertile women with EI/II and 6 fertile women without \nendometriosis (control group). Between 2009 and 2011, samples of PF were used in six in \nvitro maturation (IVM) experiments, and after th at 241 oocytes were observed and analyzed \nby confocal microscopy. \nParticipants/materials, setting, methods : Immature bovine oocytes underwent IVM in the \nabsence of PF (No -PF) and in the presence of two concentrations (1% and 10%) of PF from \nfertile women in the control group (C-PF) and from infertile women with EI/II (EI/II -PF). Six \nreplicates were performed, each one using PF from a control patient and a patient with EI/II. \nEach PF sample was used in only one experiment. After 22 -24 h of IVM, oocytes were \ndenuded and fixed for subsequent immunofluorescence staining for the visualization of \nmicrotubules and chromosomes by confocal microscopy. \nMain results and the role of chance : The percentage of meiotically normal oocytes was \nsignificantly higher for oocyte s that underwent IVM in the absence of PF (No -PF; 88.46%) \n\n                                                                                                                                                            Anexos 73 \nand in the presence of 1% (78.57%) and 10% (84.61%) C -PF than in oocytes that underwent \nIVM in the presence of 1% (62.50%) and 10% (56.25%) EI/II -PF ( P < 0.01).  In the EI/II \ngroup, the percentage of  meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that \nunderwent IVM in the presence of 1 % PF (62.50%) than in oocytes that underwent IVM in \nthe presence of 10% PF (56.25%) (P < 0.01), suggesting a concentration-dependent effect. \nLimitations, reasons for caution: Due to the strict selection criteria for PF donors, this study \nhad a small sample size (6 controls and 6 cases). In addition, data obtained from studies using \nanimal models may not necessarily be extrapolated to humans; thus, studies  evaluating in \nvivo-matured oocytes from infertile women with EI/II will be important for confirming our \nresults. \nWider implications of the findings : For the first time, we demonstrated that PF from \ninfertile women with EI/II compromises oocyte nuclear mat uration during IVM. The PF is in \nclose contact with the ovaries during the folliculogenesis; therefore, our results contribute to \nthe understanding of the etiopathogenic mechanisms of infertility related to EI/II and open \nperspectives for the study of new approaches in the management of infertility in women with \nmild endometriosis. \nStudy funding/competing interest(s) : This study was supported by the Higher Education \nPersonnel Training Coordination (Capes) , Brazil; the Foundation to Support Education, \nResearch and Care, University Hospital, Ribeirão Preto School of Medicine, University of \nSão Paulo (FAEPA), Brazil; and the National Institute of Science and Technology in \nHormones and Women’s Health. The authors have no conflicts of interest to disclose. \n \n \nKey words: female infertility / minimal and mild endometriosis / peritoneal fluid / oocyte \nquality / meiotic spindle \n\n                                                                                                                                                            Anexos 74 \nIntroduction \n Endometriosis is considered a common benign, estrogen -dependent gynecological \ndisease (Minici et al. , 2008)  characterized by the presence of endometrial tissue (glands \nand/or stroma) outside of the uterine cavity  (Gupta et al., 2006). It is associated with pelvic \npain, dysmenorrhea and infertility (Minici et al. , 2008) , although 20-25% of patients are \nasymptomatic (Bulletti et al., 2010). It is estimated that endometriosis is present in 10-15% of \nwomen of reproductive age, and among them, 30 -50% are infertile ; furthermore, 25-50% of \ninfertile women have the disease (Bulletti et al., 2010; Macer et al., 2012). \n The relationship between endometriosis and infertility is still unclear  (Gupa et al. , \n2008). In advanced stages of the disease (moderate and severe endometriosis), this \nrelationship has been associated with severe pelvic adhesions, which cause a variety of \nanatomical abnormalities in the reproductive tract and thus may impair ovum capture and \ntransport. However, in early stages of the disease (minimal and mild endometriosis), this \nrelationship is not very visible, since the pelvic adhesions are not sufficiently  severe to cause \nanatomical alterations (Carvalho et al. , 2012) . Natural fertility is impaired in women with \nendometriosis, even during early stages of the disease  (Berubé et al. , 1998; Akande  et al. , \n2004). One classic study showed that infertile women wi th minimal or mild endometriosis \nwho underwent surgical treatment by laparoscopy had a significant improvement in natural \nfertility compared with women who underwent diagnostic laparoscopy only  (Marcoux et al., \n1997), suggesting that endometriosis even in early stages, is related to infertility . However, \nthese women continue to have lower cumulative pregnancy rates during the 36 weeks after \nsurgical treatment when compared with fertile couples (37.5% versus 90%, respectively)  \n(Marcoux et al. , 1997 ; Gnoth  et al., 2003) . To date, the mechanisms responsible for the \ndecrease in fertility in women with early stage of disease have not been completely \nelucidated. The effect of endometriosis  not only  could be due to  alterations in the norma l \n\n                                                                                                                                                            Anexos 75 \npelvic anatomy, but also to an effect on the development of the follicle, oocyte and/or embryo \n(Barnhart et al. , 2002)  and also of endometrial defects  (Brizek et al. , 1995 ; Pellicer et al. , \n1995; Kumbak et al., 2008). According to a small study that evaluated the results of in vitro \nfertilization (IVF) in oocyte don ation programs, pregnancy rates  in women with \nendometriosis are similar to those in women with  another cause of infertility undergoing IVF \nwith oocytes from donors without the disease,  suggesting an important role of the  quality of \noocytes on the pathogene sis of  infertility presented by these women  (Simón et al. , 1994; \nGarrido et al., 2000; Pellicer et al., 2001). \n Oocyte quality depends on appropriate cytoplasmic and nuclear maturation  (Ferreira et \nal., 2009), and the latter depends on the presence of a normal cell spindle. The meiotic cell \nspindle of human oocytes in metaphase II (MII) is a temporary and dynamic structure \nconsisting of microtubules, which are relevant to ensuring chromosome segregation during \nthe meiotic process  (Barcelos et al. , 2008, 2 009). The cell spindle of the oocyte is very \nsensitive to many factors, among them oxidative stress (OS)  (Hu et al., 2001;  Eichenlaub-\nRitter et al., 2002; Mullen et al., 2004), which results from a change in the balance of \noxidants/antioxidants (Gupta et a l., 2006)  and is able to cause meiotic abnormalities, \nchromosome instability, induction of apoptosis, and impairment of preimplantation embryo \ndevelopment (Navarro et al., 2004, 2006) ; it may also be involved in the etiopathogenesis of \nendometriosis-related infertility (Campos Petean et al., 2008; Gupta et al., 2008). \n Some authors have associated endometriosis with OS  (Agarwal et al. , 2003; \nSzczepanska et al., 2003; Gupta et al., 2008), suggesting that its etiopathogenesis is possibly \nrelated to an inflammatory response to ectopic endometrial implants (Murphy et al., 1998). PF \nis found in the vesicouterine cavity or cul -de-sac and bathes the whole pelvic cavity, uterus, \nfallopian tubes and ovaries  (Bedaiwy and  Falcone, 2003) , and it may reflect the o xidative \nstatus of the microenvironment. Supporting this, studies have shown an increase in \n\n                                                                                                                                                            Anexos 76 \ninflammatory markers and in the OS in the PF of women with endometriosis  (Augoulea et al., \n2012; Gupta et al., 2008), even in the early stages of the disease (Mier-Cabrera et al., 2011). \n At the time of ovulation, PF has direct contact with the oocyte  (Ma et al., 2010). In \naddition, PF also bathes the ovaries and, when abnormal, may affect the folliculogenesis \nand/or oocyte maturation, compromising oocyte quality. Ho wever, no study to date has \nevaluated the effect of PF from infertile women with EI/II during folliculogenesis or \ninvestigated its role in oocyte maturation and oocyte quality. Thus, the aim of this study was \nto evaluate the cell spindle and the chromosome distribution of in vitro-matured oocytes in the \npresence of different concentrations of PF from infertile women with EI/II and to compare the \nresults with those for a control group consisting of fertile women. \n \nPatient selection \n The endometriosis group consisted of women with infertility associated only with \nminimal and mild endometriosis (with normal ovulatory cycles, presence of tubal patency and \npartners with normal semen parameters) ; these women und erwent videolaparoscopy, and \nendometriosis was diagnosed and classified according to the criteria of the American Society \nfor Reproductive Medicine ( ASRM) (Revised American Society for Reproductive Medicine \nclassification of endometriosis: 1996, 1997)  by an experienced surgeon. The control group \nconsisted of fertile women without endometriosis; these women underwent videolaparoscopy \nfor tubal ligation. \n Exclusion criteria were: age ≥ 38 y    , b  y m        x (BMI) ≥ 30 kg/m2, serum \nfollicle stimulating hormone  (FSH) c  c          ≥ 10 mIU/ml on the third da y of the \nmenstrual cycle, chronic anovulation , presence of hydrosalpinx or  chronic diseases such as \ndiabetes mellitus or another endocrinopathy, cardiovascular disease, dyslipidemia, systemic \nlupus erythematosus or another rheumat ologic disease, HIV infect ion or any active infection, \n\n                                                                                                                                                            Anexos 77 \nsmoking habit and use of vitamins, hormonal medications or hormonal or non -hormonal anti-\ninflammatory agents during th e 6 months prior to inclusion in  this study.  The e xclusion \ncriteria aimed to avoid situations as confounding factors related to OS and/or worsening of \noocyte quality. \n There was no significant difference between control and endometriosis groups \nregarding mean age (30.6 ± 1.43 and 29.0 ±1.31 years, respectively) or body mass index (23.9 \n± 0.90 and 24.4 ± 0.73 kg/m², respectively). Data are presented as mean ± standard error of \nthe mean (SEM).  \n \nCollection and processing of PF samples \n Samples of PF from each donor were obtained during the course of laparoscopy for \ninvestigation of infertility or tubal ligation. Each sample was collected in individual sterile \ntubes, without culture medium, from of the bottom of posterior sac under direct vision to \navoid contamination with blood. Only samples of PF with no blood contamination was used. \nThe PF samples were centrifug ed at 300 g for 10 min to separate remnants of cells, and the \nsupernatant was stored at -80ºC, in individual tubes, for future use. \n \nOocyte collection \n Bovine ovaries were collected soon after slaughter and transported in saline with \nadded streptomycin sul fate at 35 -38.5ºC. In the laboratory, 2 -8 mm follicles were aspirated, \nand only cumulus -oocyte complexes (COCs) with a homogeneous cytoplasm and at least \nthree layers of cumulus oophorus cells were selected  (Adona and Leal, 2004; Ferreira et al., \n2009). \n \nIn vitro maturation \n\n                                                                                                                                                            Anexos 78 \n COCs were cultured in 400 µl droplets of IVM medium (~20 oocytes per droplet) at \n38.5ºC, 95% humidity, 5% CO 2 in air, for 22-24 h (Hashimoto et al., 2002; Adona  and Leal, \n2004; Ferreira et al., 2009) in a culture system without mineral oil. The IVM medium used \nwas TCM-199 containing Earle´s salts and bicarbonate (Invitrogen, Gibco Laboratories Life \nTechnologies Inc., Grand Island, NY, USA), supplemented with 0.4mM sodium pyruvate, 0.5 \nµg/ml gentamicin, 5 µg/ml FSH, 5 mg/ml LH, 1 µg/ml estradiol and 10% fetal calf serum \n(FCS; Gibco) . All culture media and reagents were purchased from Sigma Chemical \nCompany (St Louis, MO, USA), except for those followed by a reference in parentheses. \n  \nFixation and immunofluorescence staining for the visualization of microtubules and \nchromosomes \n After IVM, oocytes were denuded (separated from the cumulus oophorus cells) \nmechanically by pipetting. The oocytes were fixed and left to stand for 30 min at 38.5ºC in a \nmicrotubule-stabilizing buffer  (Liu, Ju and  Yang, 1998; Ferreira  et al. , 2009) . The oocytes \nwere washed extensively and bl ocked overnight at 4ºC in washing medium consisting of \nphosphate buffer saline (PBS) supplemented with 0.02% NaN 3, 0.01% Triton X -100, 0. 2% \nnon-fat dry milk , 2% goat serum , 2% bovine serum albumin and 0.1 M glycine . Then, the \noocytes were incubated overnight at 4ºC with mouse monoclonal anti -β-tubulina antibody \n(1:1000). The oocytes were washed, incubated with fluorescein isothiocyanate -conjugated \nanti-mouse IgG (1:500; Zymed Laboratories, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) at 38.5ºC for 2 \nh. The oocytes  were again submitted to another washing and then stained for DNA with \nHoechst 33342 (10 mg/ml) in Vectashield mounting medium  (H-1000, Vector, Burlingame, \nCA, USA) on a glass slide and sealed. The samples were viewed under a high -performance \nconfocal microscope (Confocal Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Mannheim, Germany) \nusing an optical magnification of 40X and UV lasers (Diode 405 and 543 HeNe). \n\n                                                                                                                                                            Anexos 79 \nOocyte classification based on meiotic spindle morphology and chromosome \nconfiguration \n The oocytes were cl assified in accordance with the nuclear maturation stage: \nmetaphase I (MI), telophase I (TI), metaphase II (MII) or as parthenogenetically activated \n(PA; telophase II or with two polar bodies). Oocytes in MII were subdivided into analyzable \nand non-analyzable. Oocytes were termed analyzable when their spindles were present in a \nlateral or sagittal view (Fig. IA) and termed non-analyzable when their spindles were present \nin a polar view (Fig. IB)  (Ju et al., 2005). In a polar view, although the chromosomes can be \naligned, the oocyte spindle is not observed and so may be abnormal  (Liu et al., 2013; Da Broi \net al., 2014). Thus, to avoid underestimating the number of abnormal oocytes, oocytes in a \npolar view were excluded from analysis (Da Broi et al.,2014; Giorgi et al., 2015). \n Analyzable oocy tes in MII were classified as normal when they exhibited a barrel -\nshaped meiotic spindle with microtubules organized from one pole to the other, chromosomes \naligned on the metaphase plate at the equator of the spindle, and the presence of a polar body \n(Fig. IIA); or classified as abnormal when they exhibited an altered spindle (reduced \nlongitudinal dimension, dispersed or disorganized microtubules or absent) and/or altered \nchromosome configuration (dispersed or displaced from the plane of the metaphase plat e) \n(Fig. IIB-D). Parthenogenetic activation was characterized by the extrusion of a second polar \nbody without any fertilization. \n \nExperimental design \n Immediately after selection, COCs were cultured on plates NUNC® 4 well plates for \n22-24 h under five different conditions: in the absence of PF (No -PF); in the presence of 1% \nand 10% PF from a control patient (C -PF); and in the presence of 1% and 10% PF from a \npatient with minimal and mild endometriosis (EI/II -PF). Six  IVM experiments were \n\n                                                                                                                                                            Anexos 80 \nperformed, each one with five groups (No -PF, 1% C-PF, 10% C -PF, 1% EI/II-PF and 10% \nEI/II-PF) using the two concentrations of PF from a control patient without endometriosis and \nfrom a patient with EI/II. Each PF sample was used in on ly one experiment.  After IVM, the \noocytes were denuded by repeated pipetting in medium consisting of M199 containing Earle \nsalts and bicarbonate (Invitrogen, Gibco Laboratories Life Technologie s Inc., Grand Island, \nNY, USA), fixed and subjected to immunofluorescence staining. \n \nStatistical analysis \n Data were analyzed statistically using a generalized linear model  (PROC GENMOD) \nand SAS 2003  software (2002 –2003, SAS Institute  Inc., Cary, NC, USA). A Poisson \ndistribution was utilized for the numeral variables (total number of viewed oocytes, and \nnumbers of oocytes in MI, TI, MII and PA) and a gamma distribution for the percentages \n(frequency of normal and abnormal oocytes in MII). Groups were compared using the chi -\nsquare test, with the level of significance set at P < 0.05. \n \nResults \n A total of 241 COCs were visualized by confocal microscopy [35 oocytes were in MI \n(14.52%), 2 in TI (0.83%), 200 in MII (82.99%) and 4 underwent PA (1.66%)]. Of the 200 \nMII oocytes, 112 were considered analyzable (i.e. fixed in a sagittal or lateral view) and 88 \nwere considered non-analyzable (i.e. fixed in a polar view) (Table I). \n In the group without peritoneal fluid (No-PF), a total of 48 oocytes were evaluated; 41 \n(85.42%) were in MII, and of these, 26 (63.41%) were considered  analyzable. Of the \nanalyzable oocytes in MII, 23 (88.46%) were normal and 3 (11.54%) abnormal (Table I). \n In the control group with 1% concentration of PF, a total of 57 oocytes were \nevaluated; 44 (77.19%) were in MII, and of these, 28 (63.63%) were consi dered analyzable. \n\n                                                                                                                                                            Anexos 81 \nOf the analyzable oocytes in MII, 22 (78.57%) were normal and 6 (21.43%) abnormal (Table \nI). \n In the control group with 10% concentration of PF, a total of 63 oocytes were \nevaluated; 55 (87.30%) were in MII, and of these, 26 (47.27%) were  considered analyzable. \nAmong the analyzable oocytes in MII, 22 (84.62%) were normal and 4 (15.38%) abnormal \n(Table I).  \n In the endometriosis group with 1% concentration of PF, a total of 43 oocytes were \nevaluated; 35 (81.40%) were in MII, and of these, 1 6 (45.71%) were considered analyzable. \nOf the analyzable oocytes in MII, 10 (62.50%) were normal and 6 (37.50%) abnormal (Table \nI). \n In the endometriosis group with 10% concentration of PF, a total of 30 oocytes were \nevaluated; 25 (83.33%) were in MII, and  of these, 16 (64.00%) were considered analyzable. \nAmong the analyzable oocytes in MII, 9 (56.25%) were normal and 7 (43.75%) abnormal \n(Table I). \n The percentage of meiotically normal oocytes was similar for oocytes that underwent \nIVM in the absence of PF (No-PF; 88.46%) as for those that underwent IVM in the presence \nof 1% (78.57%) and 10% (84.62%) PF from fertile women (C-PF) (Table I). \n The percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that \nunderwent IVM in the absence of PF (No-PF; 88.46%) and in the presence of 1% (78.57%) \nand 10% (84.62%) PF from fertile women (C-PF) than for oocytes that underwent IVM in the \npresence of 1% (62.50%) and 10% (56.25%) PF from infertile women with minimal and mild \nendometriosis (EI/II-PF) (P < 0.01; Table I). \n In the control group, the percentage of meiotically normal oocytes was similar for \noocytes that underwent IVM in the presence of 1% (78.57%) and 10% (84.62%) PF (Table I). \n\n                                                                                                                                                            Anexos 82 \n In the endometriosis group, the percentage of meiotically norm al oocytes was \nsignificantly higher for oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) than in \nthe presence of 10% (56.25%) PF (P < 0.01; Table I). \n \nDiscussion \n This study is the first in the literature to evaluate the effect of PF from infertile women \nwith EI/II on maturation and oocyte quality, analyzed by normal spindle and chromosome \ndistribution, during IVM of bovine oocytes, compared with PF from fertile wom en without \nendometriosis (control group). \n The percentage of meiotically normal oocytes was similar for oocytes that underwent \nIVM in the absence of PF (No-PF) and in the presence of C -PF (1% and 10%), suggesting \nthat PF from fertile women in the two tested concentrations does not affect the maturation or \nthe percentage of mature oocytes with normal spindle and chromosome distribution after \nIVM. This resu lt was expected, since during the selection of patients for the study, we were \ncareful to exclude factors possibly related to oocyte quality impairment and/or OS. There was \nno significant difference between the effects of the two C -PF concentrations tested  (1% and \n10%) when analyzing the percentage of meiotically normal oocytes, suggesting the absence of \na dose-dependent effect. \n However, when the oocytes underwent IVM in the presence of EI/II -PF (1% and \n10%), the percentage of meiotically normal oocytes wa s significant lower than in oocytes that \nunderwent IVM in the the absence of PF (No-PF) and in the presence of C-PF (1% and 10%), \nsuggesting that PF from infertile women with endometriosis in early stages may promote \nmeiotic abnormalities in oocytes during IVM and so impair the oocyte quality. In contrast the \ncontrol group, in the endometriosis group, the percentage of meiotically normal oocytes was \nsignificantly higher for the 1% concentration of PF compared with the 10% concentration of \n\n                                                                                                                                                            Anexos 83 \nPF, suggesting a d ose-dependent effect of EI/II -PF on the occurrence of meiotic oocyte \ndamage. Since lower concentrations (below 1%) were not tested, it is not possible to ensure \nthat 1% is the lowest EI/II -PF concentration able to compromise oocyte spindle and \nchromosome distribution during IVM. \n It is known that the IVM process,  per se , can promote a significant increase in the \noccurrence of oocyte meiotic abnormalities  (Barcelos et al.,  2009). However, this IVM \nmethodology was applied to two different groups , therefore the differences observed are \nprobably due to differences in constituents of the PF (obtained from infertile women with \nEI/II and from fertile women without endometriosis) and not due to the IVM process. \n Mansour et al . (2009, 2010) have shown that PF from women with endometriosis \npromotes meiotic anomalies of the microtubules and chromosomes in mature murine oocytes.  \nOur results corroborate the studies of Mansour et al . (2009, 2010); however, \nmethodologically, our results differed from the study of Mansour et al. (2009, 2010) in three \naspects: in our study only patients with early stages of the disease were included, while \nMansour et al. (2009, 2010) did not describe the stage of endometriosis present in the women \nincluded in their study; all women with endo metriosis who took part in our study had \ninfertility, while Mansour et al . (2009, 2010) did not specify whether the women with \nendometriosis had infertility; and finally, we evaluated the effect of the PF from women with \nendometriosis during in vitro maturation of immature oocytes, whereas Mansour et al. (2009, \n2010) evaluated its effect on in vivo -matured oocytes; thus, it was possible for them to \nevaluate the impact of the PF from women with endometriosis on the oocyte maturation \nprocess. \n Markers of OS have been observed in the PF from infertile women with endometriosis  \n(Gupta et al. , 2008; Augoulea et al. , 2012 ), even from those in early stages of the disease  \n(Mier-Cabrera et al. , 2011 ). Mansour et al . (2009, 2010) demonstrated that oocyte meiotic \n\n                                                                                                                                                            Anexos 84 \nabnormalities in in vivo-matured oocytes caused by PF from women with endometriosis were \nreduced by supplementation of culture medium with L -carnitine, an antioxidant, suggesting \nthat the oocyte meiotic damag e is mediated by OS.  As previously pointed out, OS is able to \ncause meiotic abnormalities, chromosome instability, apoptosis induction, and impairment of \npre-implantation embryo development  (Navarro et al., 2004, 2006). Since human ovaries are \nin close con tact with the PF, not just after ovulation, but also during the oocyte maturation \nprocess (Mansour et al ., 2010), we hypothesized that this may reflect the OS on this \nmicroenvironment and promote the genesis of meiotic oocyte anomalies in infertile women \nwith the disease, and this should be evaluated in future studies. \n Reinforcing our hypothesis, a study conducted by our group, using an experimental \nbovine model, compared the potential impact of the PF from fertile women, infertile women \nwithout endometriosis, and infertile women with EI/II on oocyte expression of genes related \nto the main antioxidant enzymes. The study showed that PF from infertile women with EI/II \nproduced a significant reduction in transcripts from the GSR and CAT genes, suggesting the  \nuse of these antioxidants enzymes in the tentative to prevent oxida tive damage of oocytes \nduring IVM (unpublished data). \n The current study had some limitations. One was the use of bovine oocytes. We chose \nto use this animal model due to the similarity in size and morphology of human and bovine \novaries, because both speci es are mono -ovulatory and polycyclic. Moreover, bovine oocytes \nare plentiful, low cost and easily handled  (Malhi et al., 2005). Studies using animal models \nmay not necessarily be extrapolated to humans, and studies evaluating in vivo -matured \noocytes from i nfertile women with EI/II will be important for confirming our results. \nHowever, considering the small number of human oocytes for  available for research, and the \nfact that i mmunofluorescence analysis  is an invasive method that requires fixing of the \nsample, the use of animal  models has provided a useful alternative for  this study.  Another \n\n                                                                                                                                                            Anexos 85 \nlimitation was due to the strict selection criteria for PF donors; hence, this study had a small \nsample size (6 cases and 6 controls); thus, further investigations using a large cohort of \npatients are needed to confirm these results. If our findings are confirmed in larger studies, \nour data will contribute to confirm that the PF from patients with EI/II causes damage to the \noocyte meiotic spindle and the chromosome distribution. \n In short, we obtained evidence for the first time that the PF from infertile women with \nEI/II promotes a deleterious effect on the meiotic spindle and the chromosome distribution of \nbovine oocytes undergoing IVM in the presence of two different PF concentrations. These \nfindings open perspectives for the understanding of the pathogenic mechanisms of infertility \nrelated to EI/II, suggesting that alterations in the peritoneal microenvironment of infertile \nwomen with endometriosis in its early stages co uld compromise oocyte quality. A better \nunderstanding of the pathological mechanisms of infertility related to early endometriosis may \nhelp in the design of new therapeutic approaches to improve the natural fertility of these \ninfertile women. \n \nAuthor´s roles \n B.T.G.M.J. was responsible for the study design, selection of the patients, acquisition \nof data, methodology, interpretation of data and manuscript writing. V.S.I.G. made substantial \ncontributions to the methodology, acquisition and interpretation o f data. M.G.B. made \nsubstantial contributions to acquisition and interpretation of data and contributed to revising \nthe manuscript. C.C.P.P. contributed to the statistical analysis and interpretation of data. \nJ.C.R.S. contributed to the collection of perit oneal fluid and performed the surgical \nprocedures. R.A.F. contributed to critically revising the manuscript for important intellectual \ncontent. P.A.A.S.N. contributed to the study conception and design , interpretation of data, \ncritically revising the manu script, giving final approval of the version to be published, and \n\n                                                                                                                                                            Anexos 86 \ncoordinating of the project. All authors have approved the final version for the submission of \nthe manuscript. \n \nAcknowledgements \n The authors thank the staff of the Human Reproduction Labora tory, University \nHospital, Department of Gynecology and Obstetrics, Ribeirão Preto Medical School, \nUniversity of São Paulo (FMRP -USP) for collection of PF, and the Multi -User Laboratory of \nConfocal Microscopy, Ribeirão Preto Medical School, University of S ão Paulo (FMRP-USP), \nfor technical support. The authors also thank Helena Malvezzi for her valuable assistance with \nthe IVM experiments. \n \nFunding \n This study was supported by the Coordination for the Improvement of Higher \nEducation Personnel (CAPES ), Brazi l; the Foundation to Support Education, Research and \nCare, University Hospital, Ribeirão Preto School of Medicine, University of São Paulo \n(FAEPA), Brazil; and the National Institute of Hormones and Women ’s Health , CNPq, \nBrazil. \n \nConflict of interest \n The authors have no conflicts of interest to declare. \n \n \nReferences \nRevised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. \nFertil Steril 1997;67: 817-821. \n \n\n                                                                                                                                                            Anexos 87 \nAdona PR, Leal CLV. Meiotic inhibition with different cyclin -dependent kinase inhibitors in \nbovine oocytes and its effects on maturation and embryo development. Zygote 2004;12: 197-\n204. \n \nAgarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology  \nof human reproduction. Fertil Steril 2003;79: 829-843. \n \nAkande VA, Hunt LP, Cahill DJ, Jenkins JM. Differences in time to natural conception \nbetween women with unexplained infertility and infertile women with minor endometriosis. \nHum Reprod 2004;19: 96-103. \n \nAugoulea A, Alexandrou A, Creatsa M, Vrachnis N, Lambrinoudaki I. Pathogenesis of \nendometriosis: the role of genetics, inflammation and oxidative stress. Arch Gynecol Obstet  \n2012;286: 99-103. \n \nBarcelos ID, Vieira RC, Ferreira EM, Araújo MCP, Martins WP, Ferriani RA, Navarro PA.  \nAnomalias meióticas de oócitos de pacientes com endometriose submetidas à estimulação \novariana. Rev Bras Ginecol Obstet 2008;30: 413-419. \n \nBarcelos ID, Vieira RC, Ferreira EM, Martins WP, Ferriani RA, Navarro PA. Comparative \nanalysis of the spindle and chromosome configurations of in vitro -matured oocytes from \npatients with endometriosis and from control subjects: a pilot study. Fertil Steril  2009;92: \n1749-1752. \n \nBarnhart K, Dunsmoor -Su R, Coutifaris C. Effect of e ndometriosis on in vitro fertilization. \nFertil Steril 2002;77: 1148-1155. \n \nBedaiwy MA, Falcone T: Peritoneal fluid environment in endometriosis. Clinicopathological \nimplications. Minerva Ginecol 2003,55: 333-345.  \n \nBrizek CL, Schlaff S, Pellegrini VA, Frank JB, Worrilow KC. Increased incidence of aberrant \nmorphological phenotypes in human embryogenesis -an association with endom etriosis. J \nAssist Reprod Genet 1995;12:106-12.  \n \nBulletti C, Coccia ME, Battistoni S, Borini A. Endometriosis and infertility. J Assist Reprod \nGenet 2010;27: 441-447. \n \nCampos Petean C, Ferriani RA, dos Reis RM, de Moura MD, Jordao AA Jr, Navarro PA. \nLipid peroxidation and vitamin E in serum and follicular fluid of infertile women with \nperitoneal endometriosis submitted to controll ed ovarian hyperstimulation: a pilot study. \nFertil Steril 2008;90: 2080-2085.  \n \nCarvalho LFP, Below A, Abrão MS, Agarwal A. Minimal and mild endometriosis negatively \nimpact on pregnancy outcome. Rev Assoc Med Bras 2012;58: 607-614. \n \nDa Broi MG, Malvezzi H,  Paz, CC, Ferriani RA, Navarro PA . Follicular fluid from infertile \nwomen with mild endometriosis may compromise the meiotic spindles of bovine metaphase II \noocytes. Hum Reprod 2014;29: 315-323. \n \n\n                                                                                                                                                            Anexos 88 \nEichenlaub-Ritter U, Shen Y, Tinneberg HR. Manipulation of th e oocyte: possible damage to \nthe spindle apparatus. Reprod Biomed Online 2002;5: 117-124. \n \nFerreira EM, Vireque AA, Adona PR, Ferriani RA, Navarro PA. Prematuration of bovine \noocytes with butyrolactone I reversibly arrests meiosis without increasing meiotic \nabnormalities after in vitro maturation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;145: 76-80. \n \nGarrido N, Navarro J, Remohi J, Simon C, Pellicer A. Foll icular hormonal environment and \nembryo quality in women with endometriosis. Hum Reprod Update 2000;6: 67-74. \n \nGiorgi VSI, Da Broi MG, Paz CCP, Fe rriani RA, Navarro PA.  (2015) N-acetyl-cysteine and \nL-carnitine prevent meiotic oocyte damage induced by follic ular fluid from infertile women \nwith endometriosis. Reproductive Sciences. In press. \n \nGupta S, Agarwal A, Krajcir N, Alvarez JG. Role of oxidative stress in endometriosis. Reprod \nBiomed Online 2006;13: 126-134. \n \nGupta S, Goldberg JM, Aziz N, Goldberg E, Kr ajcir N, Agarwal A. Pathogenic mechanisms \nin endometriosis-associated infertility. Fertil Steril 2008;90: 247-257. \n \nHashimoto S, Minami N, Takakura R, Imai H. Bovine immature oocytes acquire \ndevelopmental competence during meiotic arrest in vitro. Biol Reprod 2002;66: 1696-1701. \n \nHu Y, Betzendahl I, Cortvrindt R, Smitz J, Eichenlaub -Ritter U. Effects of low O 2 and ageing \non spindles and chromosomes in mouse oocytes from pre -antral follicle culture. Hum Reprod \n2001;16: 737-748.
  \n \nJu JC, Jiang S, Tseng JK,  Parks JE, Yang X. Heat shock reduces developmental competence \nand alters spindle configuration of bovine oocytes. Theriogenology 2005;64: 1677-1689.  \n \nKumbak B, Kahraman S, Karlikaya G, Lacin S, Guney A. In vitro fertilization in \nnormoresponder patients w ith endometriomas: comparison with basal simple ovarian cysts. \nGynecol Obstet Invest 2008;65: 212-216. \n \nLiu L, Ju JC, Yang X. Differential inactivation of maturation -promoting factor and mitogen -\nactivated protein kinase following parthenogenetic activation  of bovine oocytes. Biol Reprod \n1998;59: 537-545. \n \nLiu F, He L, Liu Y, Shi Y, Du H.  The expression and role of oxidative stress markers in the \nserum and follicular fluid of patients with endometriosis. Clin Exp Obstet Gynecol  2013;40: \n372-376. \n \nMa CH, Yan LY, Qiao J, Sha W, Li L, Chen Y, Sun QY. Effects of tumor necrosis factor -\nalpha on porcine oocyte meiosis progression, spindle organization, and chromosome \nalignment. Fertil Steril 2010;93: 920-926. \n \nMacer ML, Taylor HS. Endometriosis and infert ility: a review of the pathogenesis and \ntreatment of endometriosis -associated infertility. Obstet Gynecol Clin N Am  2012; 39: 535-\n549. \n \n\n                                                                                                                                                            Anexos 89 \nMalhi PS, Adams GP, Singh J. Bovine model for the study of reproductive aging in women: \nfollicular, luteal, and endocrine characteristics. Biol Reprod 2005;73: 45-53. \n \nMansour G, Abdelrazik H, Sharma RK, Radwan E, Falcone T, Agarwal A. L -carnitine \nsupplementation reduces oocyte cytoskeleton damage and embryo apoptosis induced by \nincubation in peritoneal fluid from patients with endometriosis. Fertil Steril 2009;91: 2079-\n2086. \n \nMansour G, Sharma RK, Agarwal A, Falcone T. Endometriosis -induced alterations in mouse \nmetaphase II oocyte microtubules and chromosomal alignment: a possible cause of infertility. \nFertil Steril 2010;94: 1894-1899. \n \nMarcoux S, Maheux R, Berube S. Laparoscopic surgery in infertile women with minimal or \nmild endometriosis. Canadian Collaborative Group on Endometriosis. N Engl J Med \n1997;337: 217-222. \n \nMier-Cabrera J, Jiménez-Zamudio L, Garcia-Latorre E, Cruz-Orozco O, Hernández-Guerrero \nC. Quantitative and qualitative peritoneal immune profiles, T -cell apoptosis and oxidative \nstress-associated characteristics in women with minimal and mild endometriosis. BJOG \n2011;118: 6-16. \n \nMinici F, Tiberi F, Tropea A, Orlando M, Gang ale MF, Romani F, Campo S, Bompiani A, \nLanzone A, Apa R. Endometriosis and human infertility: a new investigation into the role of \neutopic endometrium. Hum Reprod 2008;23: 530-537. \n \nMullen SF, Agca Y, Broermann DC, Jenkins CL, Johnson CA, Critser JK. The e ffect of \nosmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to \ncryopreservation. Hum Reprod 2004;19: 1148-1154. \n \nMurphy AA, Santanam N, Morales AJ, Parthasarathy S: Lysophosphatidyl choline, a \nchemotactic factor for monocytes/T -lym- phocytes is elevated in endometriosis. J Clin \nEndocrinol Metab 1998;83: 2110-2113. \n \nNavarro PA, Liu L, Keefe DL. In vivo effects of arsenite on meiosis, preimplantation \ndevelopment, and apoptosis in the mouse. Biol Reprod 2004;70: 980-985. \n \nNavarro PA, Liu L, Ferriani RA, Keefe DL. Arsenite induces aberrations in meiosis that can \nbe prevented by coadministration of N -acetylcysteine in mice. Fertil Steril  2006;85: 1187 -\n1194. \n \nPellicer A, Oliveira N, Ruiz A, Remohi J, Simon C. Exploring the mechanism(s) of \nendometriosis-related infertility: an analysis of embryo development and implantation in \nassisted reproduction. HumReprod 1995;10: 91-97.
  \n \nPellicer A, Navarro J, Bosch E, Gar rido N, Garcia -Velasco JA, Remohi J, Simon C. \nEndometrial quality in infertile women with endometriosis. Ann N Y Acad Sci 2001;943: 122-\n130. \n \nSimón C, Gutierrez A, Vidal A, Santos MJ de los, Tarin JJ, Remohi J, Pellicer A. Outcome of \npatients with endometriosis in assisted reproduction: results from in -vitro fertilization and \n\n                                                                                                                                                            Anexos 90 \noocyte donation. Hum Reprod  1994;9: 725-729. \n \nSzczepanska M, Kozlik J, Skrzypczak J, Mikolajczyk M. Oxidative stress may be a piece in \nthe endometriosis puzzle. Fertil Steril 2003;79: 1288-1293. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n                                                                                                                                                                                                                                                                                   Anexos 91 \n \n \n \n \nGroup PF \nconcentration \n(%) \nTotal number of \nviewed oocytes \n(n) \nMI \nn (%) \nTI \nn (%) \nPA \nn (%) \n \n \nTotal \nnumber of \nMII \nn (%) \nMII \n \nAnalyzable \nn (%) \n \n \nNormal \nn (%) \n \n \nAbnormal \nn (%) \n \nNo-PF 0 48 5 (10.42) 1 (2.08) 1 (2.08) 41 (85.42) 26 (63.41) 23 (88.46)a 3 (11.54) \nC-PF 1 57 9 (15.79) 1 (1.75) 3 (5.27) 44 (77.19) 28 (63.63) 22 (78.57)a 6 (21.43) \n 10 63 8 (12.70) 0 0 55 (87.30) 26 (47.27) 22 (84.62)a 4 (15.38) \nEI/II-PF 1 43 8 (18.60) 0 0 35 (81.40) 16 (45.71) 10 (62.50)b 6 (37.50) \n 10 30 5 (16.67) 0 0 25 (83.33) 16 (64.00) 9 (56.25)c 7 (43.75) \nNote: No-PF, oocytes that underwent IVM in medium containing no added peritoneal fluid; C -PF, oocytes that underwent IVM in medium supplemented \nwith peritoneal fluid from fertile women without endometriosis; EI/II -PF, oocytes that underwent IVM in medium s upplemented with peritoneal fluid from \ninfertile women with minimal and mild endometriosis; Analyzable, oocytes with the spindle fixed in a sagital or lateral view;  MI, methapase I; TI, telophase \nI; MII, metaphase II; PA, spontaneous parthenogenetic activa tion (extrusion of the second polar body in the absence of fertilization). Data are the results of 6 \nreplicates. Different letters in the same column indicate a significant difference, P < 0.01, using Poisson, gamma distribution and the chi-square test. \n \n \n \nTable I : Stages of nuclear maturation and percentages of normal and abnormal MII oocytes matured in medium without PF (No -PF), with different \nconcentrations of PF from fertile women without endometriosis (C-PF) and with minimal and mild endometriosis (EI/II-PF). \n\n                                                                                                                                                            Anexos 92 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigure I: Confocal microscopy images of bovine oocytes matured in vitro in the presence \nof PF from fertile women without endometriosis (C -PF) or with minimal and mild \nendometriosis (EI/II-PF). ( A) Metaphase II oocyte in a sagittal view. ( B) Metaphase II \noocyte in a polar view. Green: spindle stained with an anti- β-tubulin antibody and \nfluorescein isothiocyanate -conjugated secondary antibody; blue: chromosomes stained \nwith Hoechst 33342. Scale b   = 5μm. \n \n \n\n\n                                                                                                                                                            Anexos 93 \n \nFigure II: Confocal microscopy images of bovine oocytes matured in vitro in the presence \nof PF from fertile women without endometriosis (C -PF) or with minimal and mild \nendometriosis (EI/II -PF). ( A) Normal metaphase II oocyte showing properly aligned \nchromosomes in the central region of a normal barrel -shaped spindle.  (B) Abnormal \nmetaphase II oocyte with aligned chromosomes and an abnormal spindle. ( C) Abnormal \nmetaphase II oocyte with misaligned chromosomes and a normal barrel -shaped spindle \n(reduced longitudinal d imension). ( D) Abnormal metaphase II oocyte with misaligned \nchromosomes and an abnormal spindle. Green: spindle stained with an anti- β-tubulin \nantibody and fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibody; blue: chromosomes \nstained with Hoechst 33342. Scale b   = 5μm.","source_license":"CC0","license_restricted":false}