{"paper_id":"0af4ac8a-f7be-4d17-9041-854e9440ae77","body_text":"UNIVERSIDAD DE ALCALÁ \nDEPARTAMENTO DE MEDICINA \nUNIDAD I+D ASOCIADA AL CNB-CSIC \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nPATRONES DE INFILTRACIÓN LEUCOCITARIA Y DE EXPRESIÓN \nTISULAR DE QUIMIOQUINAS, FACTOR DE CRECIMIENTO \nENDOTELIAL VASCULAR Y MEDIADORES DEL METABOLISMO \nOXIDATIVO EN LESIONES INFLAMATORIAS Y NEOPLÁSICAS DEL \nCERVIX \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nTESIS DOCTORAL \nYENDDY NAYGHIT CARRERO CASTILLO \n \n \n \nALCALÁ DE HENARES, 2012 \n \n\n \n \nUNIVERSIDAD DE ALCALÁ \nUNIDAD I+D ASOCIADA AL CNB-CSIC \nDEPARTAMENTO DE MEDICINA \n \n \n \n \n \n \n \n \nPATRONES DE INFILTRACIÓN LEUCOCITARIA Y DE EXPRESIÓN \nTISULAR DE QUIMIOQUINAS, FACTOR DEL CRECIMIENTO \nENDOTELIAL VASCULAR Y MEDIADORES DEL METABOLISMO \nOXIDATIVO EN LESIONES INFLAMATORIAS Y NEOPLÁSICAS DEL \nCERVIX \n \n \n \n \n \n \n \nTESIS DOCTORAL \nYenddy Nayghit Carrero Castillo \n \n \nDIRECTORES DE TESIS \n \nMelchor Álvarez de Mon Soto \nCatedrático de Medicina \nUniversidad de Alcalá \n \nJesús Alberto Mosquera Sulbarán \nCatedrático de Inmunología \nUniversidad de Zulia \n \n \n \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAgradecimientos \n \n\n\n \nAgradecimientos \n \n \nDeseo expresar mi más profundo y sincero agradecimiento: \n \n A Dios Todopoderoso, por guiar mis pasos a lo largo de mi vida \n \n A mi madre, amiga y pilar fundamental en mi vida, quien con su amor, \npaciencia y sabios consejos me permitió culminar otr a etapa de mi vida \nprofesional \n \n A mi Hermano, quien llena de alegría mi vida \n \n A mi familia, quienes con su amor, admiración y apoyo me hacen bonita la \nvida. \n \n A mi querida Universi dad del Zulia Institución donde inicie mi vida \nprofesional, cuna de m i saber y responsable de mi formación a quien deseo \ndedicarle mis logros profesionales, los cuales permitirán formar mejores \nprofesionales compartiendo mi saber. \n \n A La Universidad de Alcalá, España por permitirme participar en el programa \nde Doctorados en conjunto facilitándome cumplir una meta más en mi \nformación profesional. \n \n Mi agradecimiento al Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación \n(FONACIT) adscrito al Ministerio del Poder Popular para la Ciencia y \nTecnología por contribuir a la realización este estudio \n\n \nAgradecimientos \n \n \n Al Dr. Jesús Mosquera , tutor, maestro, jefe sentimental y amigo \nincondicional, gracias, por sus enseñanzas, cariño, tiempo, paciencia y \nvaliosos aportes científic os, por estar siempre dispuesto a orientarme y en la \nrealización de este trabajo. \n \n Al Profesor Dr. Melchor Álvarez de Mo n, a quien le doy mi agradecimiento \npor el apoyo obtenido para el logro de esta importante meta. \n \n \n A Dra. Diana Callejas , Profesora, Jefa y amiga con quien he compartido \ndesde el inicio de este largo camin o, Gracias por ser mi apoyo y ejemplo a \nseguir, y enseñarme que el alumno puede superar al profesor. \n \n Al Personal del LRRV quienes de una u otra forma colaboraron en el \ndesarrollo de mi tesis, con su apoyo, palabras de aliento y días de trabajo, \nquiero extender mi agradecimiento especialmente a Raimy, María Elena, Alin \ny Ángela por ser mis amigas incondicionales \n \n Al Dr. Freddy Alaña, Dra. Elizabeth Acuña, Dra. Chiquinquira Silva, \nmédicos del proyecto, amigos y personas claves en el desarrollo de mi \ninvestigación, quienes que hicieron posible la obtención de las muestras \nnecesarias para asegurar la calidad del trabajo científico \n \n Al personal del Instituto de Investigaciones clínicas Dr. Américo Negrette \npor su cariño y colaboración \n \n A todos mil gracias! \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedicatoria \n \n\n\n Dedicatoria \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nIn memoriam de Cándida Blanco, mi ángel en el cielo \nA mi madre, mi familia y a todas las personas que amo y que son \nuna estrella en mi vida \nLos quiero \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLos hombres de ciencia nacen con muchas preguntas pero no \nmueren sin encontrar grandes respuestas \nY. Carrero \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nÍndice \n \n\n\n Índice \n \nINDICE \n Págs. \nLISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS \nSUMMARY \nI. INTRODUCCIÓN \nI.1 Cáncer 1 \nI.2 Cáncer de Cuello Uterino (CaCu) 5 \nI.3 Lesiones Preinvasivas de Cuello Uterino \n I.3.1 Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) \n7 \n7 \nI.4 Historia \nI.5 Epidemiologia \nI.6 Factores de riesgo asociados al cáncer cervicouterino \n9 \n11 \n13 \nI.6.1 Edad de la primera relación sexual 14 \nI.6.2 Numero de Compañeros Sexuales 14 \nI.6.3 Anticonceptivos orales 14 \nI.6.4 Plasma Seminal 15 \nI.6.5 Condición Socioeconómica y Social 17 \nI.6.6 Tabaco 17 \nI.6.7 Dieta y Factores 18 \nI.6.8 Factor Genético 19 \nI.6.9 Inmunosupresión 19 \nI.6.10 Infecciones de transmisión sexual 20 \nI.7 Virus del Papiloma Humano (VPH) 22 \n I.7.1 Proteínas Virales 23 \nI.7.1.1 Genes E1 23 \nI.7.1.2 Genes E2 4y E 23 \n I.7.2 Oncoproteinas Virales. \n I.7.2.1 Oncoproteína E6 \n I.7.2.2 Oncoproteína E7 \n I.7.3 Insersion Mutacional \nI.8 Clasificación Genómica del VPH \n24 \n24 \n26 \n26 \n28 \nI.9 Diagnóstico de lesiones de Cuello Uterino y VPH 30 \n\n Índice \n \n I.9.1 Métodos Diagnósticos Convencionales \n I.9.1.1 Test de Papanicolau \n I.9.1.2 Colposcopia \nI.9.2 Métodos Diagnósticos Específicos \n I.9.2.1 Southern blot \n I.9.2.2 Hibridación Puntual \n I.9.2.3 Hibridación Invertida \n I.9.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) \n I.9.2.5 PCR Multiplex \n I.9.2.6 Sistema de Captura Hibrida \n I.10 Virus de Papiloma Humano y Cáncer Cervical \n I.10.1 Interacción entre la oncoproteínas E6 y la proteína p53 \n I.10.2 Interacción entre E7 y pRb \n I.10.3 Cooperación entre E6 y E7 en la transformación maligna \n I.10.4 Rol de la integración viral en la transformación maligna \n I.11 Respuesta Inmunitaria en Cuello Uterino \n I.11.1 Respuesta Inmunitaria Celular \n I.11.2 Respuesta Inmunitaria Humoral \n I.12 Inflamación y cáncer \n I.13 Inflamación e Infiltración leucocitaria \n I.14 Citocinas y su participación en la respuesta inmunitaria e \ninflamatoria de Cuello Uterino. \n I.14.1 Interleucina 2 (IL-2) \n I.14.2 Interleucina 10 (IL-10) e Interleucina 12 (IL-12) \n I.14.3 Interferón (IFN) \n I.14.4 Interleucina 4 (IL-4) \n I.14.5 Interleucina 6 (IL-6) \n I.14.6 Factor de Necrosis Tumoral (TNF) \n I.14.7 Factor de Crecimiento Transformante Beta (TGF -β1) \n I.14.8 Factor Estimulador de Colonias Granulocito -Macrófago \n(GM-CSF) \n I.15 Quimioquinas \n I.15.1 Proteína 1 Quimioatrayente de Monocitos (MCP-1) \n I.15.2 Interleucina 8 (IL-8) \n31 \n31 \n32 \n33 \n33 \n33 \n33 \n34 \n35 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n39 \n41 \n41 \n43 \n44 \n46 \n55 \n \n61 \n63 \n65 \n66 \n66 \n66 \n67 \n69 \n \n71 \n73 \n75 \n\n Índice \n \n I.15.3 Proteína Inflamatoria de Macrófago α (MIP1α) \n I.16 Quimioquinas e Inflamación \n I.17 Quimioquinas y Crecimiento Tumoral \n I.18 Quimioquinas e Infiltración Leucocitaria \n I.19 Carcinogénesis y daño celular \n I.19.1 Radicales Libres y daño celular \n I.20 Angiogénesis y Desarrollo Tumoral \n I.20.1 Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) \n I.21 Invasión y Metástasis \n 76 \n 77 \n78 \n80 \n81 \n82 \n 91 \n94 \n96 \nII. HIPOTESIS Y OBJETIVOS 98 \nII.1 Objetivo General 101 \nII.2 Objetivos Específicos 101 \nIII. MATERIALES Y MÉTODOS 102 \nIII.1 Diseño del estudio 103 \nIII.1.1 Tipo de diseño 103 \nIII.1.2 Periodo de estudio 103 \nIII.1.3 Área de estudio 103 \nIII.1.4 Selección y procedencia de la población 104 \nIII.1.5 Población de estudio 104 \nIII.1.6 Criterios de Inclusión 104 \nIII.1.7 Criterios de Exclusión 105 \nIII.1.8 Criterios Bioéticos 105 \n III.1.9 Toma de Muestra \n III.1.9.1 Toma de Muestra para el estudio Histologico y \nDeterminacion de quimiocinas y Factore de Crecimiento Endotelial \nVascular \n106 \n \n \n106 \n III.1.9.2 Estudio Histologico 106 \n III.1.9.3 Estudio Inmuno-histológico 106 \n III.1.9.4 Oxido Nítrico 107 \n III.1.9.5 Toma de muestra para la determinación de VPH 107 \n III.1.10 Procesamiento de las Muestras 107 \n\n Índice \n \n III.1.10.1 Determinación de Interleucina (IL -8), P roteína \nQuimiotáctica de Monocitos (MCP1), Proteína Inflamatoria de Macrófago 1 \nα (MIP1α), Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), e \nInfiltración Leucocitaria por Inmunohistoquimica \n III.1.10.2 Identificación de Anión Superoxido en tejido \n III.1.10.3 Determinación de Proteínas y Oxido Nítrico \n III.1.10.4 Detección y Tipificación del VPH \n III.1.10.4.1 Extracción del ADN. \n III.1.10.4.2 Reacción de Amplificación del ADN \n III.1.10.4.3 Visualización del Producto amplificado \n III.1.10.4.4 Tipificación del VPH \n III.2 Análisis Estadístico \n III.3 Búsqueda Bibliográfica \n \n \n \n107 \n 109 \n111 \n117 \n117 \n118 \n119 \n120 \n121 \n122 \nIV. RESULTADOS 123 \n IV.1 Infiltración Leucocitaria: D eterminación de Linfocitos (CD3), \nneutrofilos (RIIB/CD16) y macrófagos en tejido de cuello uterino de \npacientes con lesiones pre malignas y maligna del cuello uterino, controles \ny tejido inflamatorio \n \n124 \n IV.2 Expresión de MIP-1α, MCP1, IL8 y VEGF en tejido de cuello \nuterino de pacientes con lesiones pre malignas y maligna del cuello \nuterino y controles. \n 128 \n I.V.3 Determinación de anión superoxido en tejido de cuello uterino de \npacientes con lesiones pre malignas y malignas del cuello uterino y \ncontroles \n \n \n \n 143 \nIV.4 Determinación de oxido nítrico en tejido de cuello uterino de \npacientes con lesiones pre malignas y malignas del cuello uterino y \ncontroles \n I.V.5 Determinación genómica de VPH \n \n \n 145 \n \n 146 \nV. DISCUSIÓN 151 \nVI. CONCLUSIONES 165 \nVII. BIBLIOGRAFÍAS 168 \nVIII. ANEXOS 186 \nIX. PUBLICACIONES 193 \n\n \nÍndice de Figuras \n \nINDICE DE FIGURAS \n Págs. \nFig Figura 1. Pérdida del control del crecimiento Normal de la Célula 2 \nFigura 2 Acción antitumoral, Antígenos tumorales, Escape tumoral 3 \nFigura 3. Mecanismo de Acción de los Oncogenes y Genes \nSupresores de Tumores \n4 \nFigura 4 Carcinoma y Zona de transición 7 \nFigura 5 Clasificación de las lesiones preinvasivas de cuello uterino de \n acuerdo a las alteraciones producidas en el epitelio cervical \n9 \nFigura 6 Factores de Riesgo asociados al Cáncer de Cuello Uterino 21 \nFigura 7 Organización del Genoma de VPH 23 \nFigura 8 Dinámica de la infección por VPH en Cuello Uterino 27 \nFigura 9 Mecanismo Oncogénico del Virus del Papiloma Humano (VPH) 40 \nFigura 10 Las alteraciones en los patrones de expresión y \nproducción de citoquinas \n46 \nFigura 11 Proceso Inflamatorio 47 \nFigura 12 Proceso de infiltración leucociaria y la expresión de citocinas 49 \nFigura 13 Organización de tejido normal y carcinoma invasivo 78 \nFigura 14 Síntesis de Oxido Nítrico 87 \nFigura 15 Inflamación y Stress Oxidativo 90 \nFigura 16 Hipoxia, Infiltración Celular y expresión de Factores \nAngiogenicos \n94 \nFigura 17 Fundamento Reacción de Briggs 109 \nFigura 18. Fundamento Método Lowry 112 \nFigura 19. Fundamento Reacción de Griess 114 \nFigura 20 Fórmula para el cálculo de concentración de oxido nítrico. \nFigura 21. Número de células CD3, RIIB/CD16 y macrófagos positivos \nen biopsias con neoplasia intraepitelial cervical (NIC) y controles en \nepitelio y estroma \nFigura 22 Número de células CD3, RIIB/CD16 y macrófagos en biopsias \ncon neoplasia intraepitelial cervical (NIC), controles y tejidos de \npacientes con procesos inflamatorios en epitelio y estroma. \n \nFigura 23 Expresión de células positivas para CD3, MCP-1 e IL-8 en \n117 \n \n \n126 \n \n \n \n127 \n \n \n 131 \n \n\n \nÍndice de Figuras \n \nepitelio y estroma de biopsias con neoplasia intraepitelial cervical (NIC). \n \nFigura 24 Expresión del número total de células CD3, MCP-1, IL-8, \nCD3/MCP-1 y CD3/IL-8 en biopsias con neoplasia intraepitelial cervical \n(NIC) \n \nFigura 25 Inmunofluorescencia de la doble tinción anti CD3 y anti-\nquimiocina en biopsias de pacientes con neoplasia intraepitelial cervical. \n \n Figura 26 Expresión del número total de la infiltración por macrófagos \n(MΦ), MΦ /MCP-1 y MΦ /IL -8 en biopsias con neoplasia intraepitelial \ncervical (NIC) y carcinoma cervical (CC) \n \n Figura 27 Expresión del número total de células MIP-1, CD3/MIP-1 y \nmacrófagos (MΦ)/ MIP -1 en biopsias con neoplasia intraepitelial cervical \n(NIC) \n \nFigura 28 Porcentaje de células mononucleares/quimiocinas durante la \nneoplasia intraepitelial cervical. \n \nFigura 29 Expresión de MCP-1, IL-8, MIP-1 en epitelio y estroma \ndistribuidos en tejidos inflamatorios, lesión y control \n \nFigura 30 Expresión del VEGF en epitelio y estroma cervical de acuerdo \nal tipo de lesión y controles \n \nFigura 31 Expresión de VEGF en epitelio y estroma cervical entre el \ngrupo inflamatorio, lesión y controles \n \nFigura 32 Coexpresión de factor de crecimiento vascular endotelial \n(VEGF) y marcadores de leucocitos en la neoplasia intraepitelial cervical \n(NIC) \n \n Figura 33 Doble marcaje para el factor de crecimiento endotelial \nvascular (VEGF) y CD3 en tejido de cuello uterino de un paciente con \nNIC III \n \nFigura 34 Total de células / número pacientes del grupo control y \npacientes con neoplasia intraepitelial cervical (NIC) \n \nFigura 35 Células anión superoxido en epitelio y estroma cervical \n \nFigura 36 Coloración de Briggs para anión Superóxido en tejido de \npaciente con NIC II \n \nFigura 37 Número de células O2- en epitelio y estroma \n \nFigura 38 Concentración de Nitrito-Nitrato/mg de proteínas en pacientes \ncon lesiones preinvasivas, procesos inflamatorios y control \n \nFigura 39 Pacientes VPH positivos de acuerdo al grado de lesión (NIC) \n \n \n \n132 \n \n \n \n133 \n \n \n134 \n \n \n \n135 \n \n \n \n136 \n \n \n137 \n \n \n138 \n \n \n139 \n \n \n \n140 \n \n \n141 \n \n \n142 \n \n \n143 \n \n144 \n \n \n145 \n \n \n146 \n \n148 \n\n \nÍndice de Figuras \n \n \ny pacientes con inflamación \n \nFigura 40 Expresión de células CD3 en epitelio y estroma de acuerdo a \nla infección por VPH \n \nFigura 41 Expresión de células Quimiocinas: MCP1 (A), IL-8 (B) y \nMIP(C) en epitelio y estroma de acuerdo a la infección por VPH \n \nFigura 42 Expresión de VEGF en epitelio y estroma de acuerdo a la \ninfección por VPH \n \nFigura 43 Expresión de células O2 en epitelio y estroma de acuerdo a la \ninfección por VPH \n \n \n \n \n149 \n \n \n149 \n \n \n150 \n \n \n150 \n \n \n \n\n Índice de Tablas \n \n \nÍNDICE DE TABLAS \n \n Págs \nTabla 1. Clasificación del VPH de acuerdo a las manifestaciones clínicas \ny riesgo según The International Agency for Research on Cancer (IARC). \n \n 30 \n Tabla 2 Principales oxidantes y mecanismo de acción de genotoxicidad 57 \n \nTabla 3 Clasificación y nomenclatura de las citocinas \n \n \n 83 \nTabla 4. Mezcla de reacción PCR. \n \nTabla 5 Virus de Papiloma Humano en pacientes con lesiones \npremalignas de cuello uterino, inflamación y controles \n \nTabla 6 Genotipos de VPH en pacientes con lesiones premalignas \nde cuello uterino, inflamación y controles. \n \n 119 \n \n \n 147 \n \n \n 148 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbreviaturas \n \n\n\nAbreviaturas \n \n \nLISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS \n \n \nVPH: Virus del Papiloma Humano. \nNIC: Neoplasia Intraepitelial Cervical. \nCaCu: Cáncer de Cuello Uterino. \nVEFG Factor de crecimiento endotelial vascular \nMCP-1: Proteína quimiotáctica de monocitos \nMIP1α: Proteína inflamatoria de macrófagos \nNO Oxido Nítrico \niNOS Oxido nítrico sitetasa inducible \nO- Anion superoxido \nF(ab)’2: Molécula compuesta por dos subunidades Fab y la región de la bisagra, con \nenlaces disulfuro intercadena H. \nFITC: Isotiocianato de fluoresceína. \nNaCl: Cloruro de sodio. \nPBS: Buffer fosfato salino. \npRB Proteína retinoblastoma \nE6-AP Proteína asociada a E6 \nH1 Cinasa de la histona H1 \np53 Proteína supresora de tumores \nCD4+: Receptor del complejo mayor de histocompatibilidad clase II. \nCD8+: Receptor del complejo mayor de histocompatibilidad clase I. \nNK: Células asesinas naturales. \nPCR: Reacción en cadena de la polimerasa. \nTBE: Tris borato. \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSummary \n \n\n\n Summary \n \nCarrero C, Yenddy N. PATTERNS OF LEUKOCYTE INFILTRATION AND TISSUE \nEXPRESSION OF CHEMOKINES, VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH \nFACTOR AND MEDIATORS OF OXIDATIVE METABOLISM IN INFLAMMATORY \nAND NEOPLASTIC CÉRVIX. Tesis Doctoral. Universidad Alcalá de Henares.2012. \n \nCervical intraepithelial neoplasia (CIN) is an epithelial lesion that could become an \ninvasive carcinoma in a sequential manner. There are several factors that may \nmodulate the switch from epithelial to extra epithelial neoplasia. Factors such as: \nincreased oxidative metabolism, inflammatory events (leukocyte infiltration, \nchemokine production) and angiogenesis factor as vascular endothelial growth factor \n(VEGF) could have a role in CIN progression. Several studies have performed in \norder to determine the role of those factors in cervical neoplasia in relationship with \nthe in situ or systemic productions. This arise the need to study those factor in situ \nand their relationship with the evolution of CIN. In the present study, the expressions \nof leukocyte infiltration, chemokines (MCP-1, IL-8 y MIP-1), VEGF, superoxide anion \n(O2\n-) and the production of nitric oxide (NO) were analyzed in biopsies from patients \nwith CIN, cervix inflammation and healthy controls. Since, there is a relationship \nbetween human papilloma virus (HPV) infection and CIN; the expression of those \nfactors in CIN will be studied according to the HPV status. Fifty five biopsies from \nCIN patients with different CIN grades, 7 from patients with inflammatory cervix \nalterations and 7 from healthy individuals were analyzed. Expressions of VEGF, \nchemokines and leukocyte infiltration were analyzed by indirect inmunofluorecence \nusing appropriate monoclonal and polyclonal antibodies. The expression of O 2\n- was \ndetermined by histochemical procedures and NO production by ELISA. HPV infection \nand virus typification were determined by PCR and chemiluminescence, respectively. \nIncreased CD3 positive cells (lymphocytes) infiltration was found in CIN related to \nlesion grades. Monocyte/macrophage (MФ) and n eutrophil infiltrations were no \nsignificant increased. This pattern was also observed in samples from patients with \ninflammatory lesions. Regarding to chemokines, increased expressions of MCP -1 \nand IL -8 were found in CIN, no related to lesion grades. MIP -1 remained at \ninflammatory and control values. CD3/MCP -1 or CD3/IL-8 coexpressions were found \nincreased in CIN, but no related to lesion grades. MФ/chemokine or \nneutrophil/chemokine expressions in CIN remained similar to others groups. There \nwas no associa tion to the grade of CIN when chemokine expressions were \n\n Summary \nrepresented as number of positive cells, but, there was association when \nrepresented as percentage of positive cells. In this regard, CD3/MCP -1 and MФ \n/MCP-1 expressions decreased with the CIN evolut ion, however, CD3/IL -8 and MФ \n/IL-8 expressions increased. Expressions of MCP -1, IL -8 and MIP -1 were found \nincreased in patients with inflammatory lesions. Epithelial and stroma VEGF \nexpressions were increased in CIN patients related to the CIN evolution. This factor \nwas also increased in patients with cervix inflammatory lesions. Coexpressions of \nCD3/VEGF and MФ/VEGF were found increased in CIN related to CIN evolution. \nThis pattern was also found when total number of positive cells/number of patient \nanalysis was performed. Expression of O2\n- was found increased in CIN related to CIN \nevolution; however, NO production remained similar to other groups. Expression of \nO2\n- and NO production were found no increased in biopsies from patients with \ninflammatory lesions. Low percentage of HPV infection (17.39%) was found in CIN \npatients. The higher percentage was found in patients with CIN III (60%). High risk \nvirus infection was found in patients with CIN II and CIN III. Values from studied \nparameters in epithelium or stroma were not affected by HPV infection. In conclusion, \nthe in situ expressions of studied factors and their relationship with CIN evolution, \nsuggest that lymphocyte infiltration, increased expressions of chemokines, VEGF \nand oxidative stress could be important factors in the evolution of CIN with further \ncervical carcinoma. Further studies are needed to determine the evolution of those \nfactors from CIN to cervical carcinoma. \n \n \nKey words: cytokines, growth factors, intraepithelial neoplasia, uterine cervix, HPV \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nI.- Introducción \n \n\n\n Introducción \n1 \n \n \nI.1 CÁNCER \n \nEl cáncer se define como un grupo amplio y heterogéneo de enfermedades \ncuyo factor común es un desequilibrio que se produce en la relació n \nproliferación/muerte celular a favor de la acumulación de células, pr ovocado por \nmecanismos genéticos o epigenéticos. Las alteraciones genéticas pueden ser \ncongénitas, adquiridas o ambas, y son producidas por mutaciones de etiología \nmultifactorial en cualquier célula susceptible del organismo, alterando en un inicio el \nfuncionamiento normal de algunos genes involucrados en la proliferación celular, \napoptosis, envejecimiento celular y reparación del ADN y, posteriormente, otros \ngenes relacionados con los procesos de angiogénesis, invasión, motilidad, adhesión \ny metastización, entre otros, cuya expresión cuantitativa y cualitativa confiere a dicha \ncélula características fenotípicas y biológicas de malignidad que se traducen \nmorfológica y evolutivamente por crecimiento y diseminación en sus diferentes \nmodalidades y en grado vari able según particularidades biológicas del tumor, \nanatómicas de su localización y generales del huésped . Estas lesiones genéticas \nproducen la enfermedad cancerosa responsable de la aparición de uno o más \ntumores con evolución y pronóstico variables que, se gún las estadísticas, resulta \nincontrolable y mortal en la mayoría de los casos. (Ferbeyre L y col 2005) \n \nEl cáncer es una enfermedad caracterizada por la proliferación anormal de \ncélulas neoplásica s, en donde existe un crecimiento exacerbado de células \ntransformadas, que proliferan de manera anormal y descontrolada dentro del \norganismo como consecuencia de una serie de alteraciones somáticas del ADN, que \nculmina en la proliferación celular desm edida, en cuestión comprende cambios en la \nsecuencia del ácid o nucleico que son el resultado de errores aleatorios de replicas, \n\n Introducción \n2 \n \nexposición a carcinógenos (como la radiación), o diferencias de los procesos de \nreparación del ADN. (Kasper D, 2005, Monzón G, 2011) \n \n \n \nFigura 1 Pérdida del control del crecimiento Normal de la Célula. Carrero, Y 2012 \n \nEl control de las diferentes funciones celulares está dado por los genes \ncodificados en el ADN, por lo tanto algunas alteraciones en genes que codifican para \nlas proteínas involucradas en el ciclo de proliferación celular pue den inducir una \ncascada de eventos que llevan a la producción del fenotipo cancerígeno. La \ntransformación maligna requiere que ocurran alteraciones en genes específicos que \ncontrolan la proliferación celular, la apoptosis y el mantenimiento de la integrida d del \nADN en la misma célula. Las mutaciones tienen la posibilidad de aparecer de \nmanera esporádica o de heredarse, pueden ser sustituciones de bases, adiciones , \ndeleciones o cambios epigenéticos (Monzón G, 2011) \n\n\n Introducción \n3 \n \n \n \nFigura 2 El sistema inmunitario es capaz de reconocer células transformadas y lisarlas. \nCuando la respuesta es ineficiente ocurre el escape tumoral en donde las células proliferan \nde manera descontrolada produciendo un tumor primario el cual aumenta de tamaño, se \nirriga y produce metástasis. C arrero Y, 2012 Ramírez, Pera y Pena. Malignizacion, Acción \nantitumoral, Antígenos tumorales, Escape tumoral, Diagnostico inmune, Inmunoterapia, \nInmunología Tumoral Capitulo 24. Disponible www.vi.cv.com \n \n \nEl descubrimien to en 1953 de la estructura del ADN y la transmisión de \nalteraciones relacionadas con la carcinogénesis, definitivamente implican cambios \nen el ADN. En las últimas cuatro décadas, se ha dado a conocer información \nsuficiente que sustenta la hipótesis, de que el cáncer es causado por alteraciones en \ngenes específicos (Simpson AJG, 1977). \n \nLas células de los organismos se diferencian y proliferan siguiendo un \nprograma genético que está regulado por estímulos extracelulares. Alteraciones en \neste sistema de regulación constituyen la base genética del cáncer, que se entiende \ncomo una acumulación de mutaciones que afectan a las células somáticas durante \nla vida de un organismo y hacen que estas proliferen de forma incontrolada. \n \nEstos genes han sido identifica dos como pertenecientes a dos clases \nfundamentales: Los oncogenes,que son genes anormales o activados que procede n \n\n\n Introducción \n4 \n \nde la mutación o activación de un gen normal llamado protooncogén y son los \nresponsables de la transformación de una célula normal en una mal igna que \ndesarrollará un determinado tipo de cáncer ,y los genes supresores de tumores \n(Tumor Supresor Genes, TSG), los cuales son genes que reducen la probabilidad de \nque una célula en un organismo multicelular se transforme en una célula \ncancerígena. Los TSG se encuentran en las células normales e inhiben la \nproliferación celular excesiva. Una mutación o una dilección de un gen supresor \ntumoral, aumentará la probabilidad de que se produzca un tumor. De tal manera que \nun gen supresor tumoral alterado, es similar a un oncogén. (Simpson AJG, 1977). \n \nA.- Oncogenes: \n \nB.- Genes Supresores de Tumores \n \n \n \nFigura 3 Mecanismo de Acción de los Oncogenes y Genes Supresores de Tumores. \nCarrero 2012. \n\n\n Introducción \n5 \n \nActualmente es reconocido y aceptado, que el cáncer surge como resul tado \nde una secuencia múltiple de eventos genéticos, los cuales ocurren en poblaciones \nde células pluripotenciales, reconocidas con el nombre de “Stem Cells” ; o células \nmadre. Se conoce que la replicación del ADN, ocurre con una increíble fidelidad en \nla c opia de sus cadenas, donde muy raramente ocurren errores (Simpson AJG, \n1977). \n \nDebido a que la replicación del ADN conlleva pequeñas tasas de error, \npueden ocurrir alteraciones en los genes relacionados con el desarrollo de l cáncer, \nincrementándose el ries go de que una determinada célula, pueda transformarse en \ntumoral y eventualmente desarrollarse hasta formar el cáncer (Simpson AJG, 1977). \n \nTeniendo en cuenta que la replicación del ADN no se lleva a cabo en un \n100% de fidelidad y que el cáncer es ocasiona do por mú ltiples alteraciones en el \nADN; esto im plica que cualquier individuo o persona que viva una larga vida, \ndesarrollará cáncer de un tipo u otro, ya que los errores en la replicación del ADN, \nocurren constantemente y se acumulan con el tiempo. Sin e mbargo, estos errores \nson eventos extraordinariamente raros y una posibilidad de que múltiples eventos \nocurran simultáneamente en una misma célula e s poco frecuente en la vida de una \npersona (Simpson AJG, 1977 ), Sin embargo los diferentes tipos de cáncer difieren \nno solo por su localización sino por los factores de riesgo y conductas propias del \nindividuo que pueden condicionar o favorecer el desarrollo del cáncer \n \nI.2 CANCER DE CUELLO UTERINO (CaCu) \nLa mujer desde su vida intrauterina presenta constantes modificaciones del \nepitelio cervico -vaginal el cual está conformado por epitelio escamoso y epitelio \n\n Introducción \n6 \n \ncilíndrico o columnar; el sitio de unión de estos epitelios es conocido como unión \nescamo-columnar o escamo -cilíndrica. Es en esta unión y en la zona de \ntransformación donde presumiblemente actúan los agentes con potencial \ncarcinogénico dando origen a la metaplasia atípica, lesiones intraepiteliales \ncervicales y carcinomas invasivos (Martínez y col , 2004) .Esta zona de \ntransformación cambia gradualmente según la edad, avanzando cada vez más hacia \nel endocérvix y durante la edad reproductiva esta zona es distal al orificio cervical, la \nmetaplasia, por otra parte, es tan común que se considera un proceso fisiológico \nnormal (Lázaro J, Pardo A, 1998) \n \nEl cáncer cervical se desarrolla en la unión escamocolumnar, es decir, el área \ndel cuello uterino en donde las células escamosas del revestimiento vaginal y la \nporción externa del cuello se unen con las células columnares que tapizan el canal \nendocervical (Oho S , 1999). El CaCu puede originarse bien en el epitelio plano \nestratificado (escamoso) de la exocervix, o bien en el ep itelio glandular del \nendocérvix (Bravo J y col, 2006). Con la edad, los cambios en el pH vaginal \ndesencadenan un proceso de metaplasma escamoso en el que las células \nescamosas comienzan a cubrir las células columnares, lo cual produce un área \ndenominada zona de transformación (Melter M y col, 2000) \n \nEl cáncer in vasivo de cuello uterino por lo general esta precedido de una \nhistoria de diez a vei nte años de cambios celulares pre invasivos q varían desde la \ndisplasia leve hasta el carcinoma in situ . (González M y col, 1992) y corresponde al \nestadio final d e un espectro continuo de alteraciones epiteliales (lesiones \npreinvasivas), en las que un est adio da lugar al siguiente de manera imperceptible . \n\n Introducción \n7 \n \nNo todas las mujeres que presentan las lesiones precursoras desarrollan la forma \ninvasora de esta enfermedad. (Dazulrosado K y col, 2004) \n \n \n \n \nFigura 4 Los cambios en el pH vaginal, procesos inflamatorio s persistentes, infecciones y \ncambios hormonales desencadenan un proceso en el que las células escamosas comienzan \na cubrir las células columnares, lo cual produce un área denominada zona de \ntransformación. Carrero Y, 2011 \n \nI.3 LESIONES PREINASIVAS DE CUELLO UTERINO \nI.3.1 Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) \nLa Neoplasia intraepitelial cervical (NIC), se define como un espectro de \nepitelios escamosos anormales con alteraciones en las estructuraciones y \nmaduración, con buena diferenciación (Displasia l eve) o ausencia total de \ndiferenciación situados en la superficie o rellenando glándulas pero sin invasión \n(carcinoma in situ). (Hargundey S, 1998) \n \nLos diferentes sistemas de clasificación citológica en relación al cáncer de \ncélulas escamosas cervicales; han evolucionado desde los años cincuenta utilizando \nel término de displasia en tres grupos: leve, moderada y severa; según el grado de \nafectación de la capa epitelial por las células atípicas. Con el pasar de los años se \n\n\n Introducción \n8 \n \nobservó una correlación directa entre progresión y el grado histológico, que \nconllevaron al término de Neoplasia Intraepitelial cervical (NIC) para 1 968 y se \ndividió en los grados I, II y III; NIC I correspondía a la displasia leve, NIC II a la \ndisplasia moderada y NIC III a la displasia grave y al Carcinoma in situ (Verdessi A \ny col, 2006) \n \nPosteriormente, se reconocieron alteraciones anatomopatológicas como la \natipia coilocítica o condilomatosa asociada con la infección por virus del papiloma \nhumano y para 1990, se propone la termino logía histopatológica basada en dos \ngrados: NIC de bajo grado, que comprende las anomalías compatibles con atipia \ncoilocítica y las lesiones NIC I , y NIC d e alto grado que comprende NIC II, NIC III y \ncáncer in situ. \n \nRichard, (1960) clasificó la Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) en tres \ngrados: con una buena maduración, mínimas anomalías nucleares y pocas mitosis \nse identifica el NIC I, donde las células indiferenciadas se encuentran en las capas \nepiteliales más profundas (tercio inferior). Pueden ver se cambios citopáticos debidos \na la infección por el VPH en todo el espesor del epitelio. Ahora, el NIC II, s e \ncaracteriza por cambios celulares displásicos restringidos sobre todo a la mitad o los \ndos tercios inferiores del epitelio, con anomalías nuclear es más marcadas que en la \nNIC I, y el NIC III, caracterizado por perdida de la diferenciación y la estratificación, o \nexistir solo en dos terceras partes al grosor total del epitelio, con abundantes mitosis. \nLas anomalías nucleares aparecen en todo el espesor del epitelio. \n \nPosteriormente se introduce el concepto de lesión Intraepitelial escamosa de \nbajo grado (LIEBG), y lesión Intraepitelial escamosa de alto grado (LIEAG), \n\n Introducción \n9 \n \nbasándose en datos citológicos, según la clasificación o sistema Bethesda el término \nalto grado incluye el NIC II y NIC III de la clasific ación de Richard, y el termino bajo \ngrado el NIC I y las alteraciones celulares producidas por papiloma virus (PVH). \n(Verdessi A y col, 2006) \n \n \nFigura 5 Clasificación de las lesiones preinvasivas de cuello uterino de acuerdo a las \nalteraciones producidas en el epitelio cervical. Carrero Y 2012 \n \nI.4.- HISTORIA \nEl cáncer del cuello uterino ha despertado un gran interés desde hace mucho \ntiempo, en la ciudad italiana de Verona en 1842, haciendo un estudio sobre las \nmuertes por cáncer, el profesor Doménico Rigoni -Stern detectó una curiosa \ndiferencia entre las monjas y las mujeres casadas de la localidad. Mientras las \nprimeras tenían mayores tasas de cáncer de mama, las veronesas desposadas \nsufrían con más fr ecuencia el de cuello uterino. A finales del siglo XIX se \ndescribieron cánceres superficiales y asintomáticos durante largo tiempo. A \ncomienzos del siglo XX se comunicó la presencia de áreas de carcinoma superficial \ncarcinomatoso, sin embargo el término má s aceptado fue el de carcinoma in situ \npropuesto por Rubia y descrito en 1910, aunque erróneamente s e atribuye a \n\n\n Introducción \n10 \n \nBroders. De ahí se pensaba que el cáncer no aparece espontáneamente si no que \npor el contrario tiene una historia natural por lo cual había qu e estudiarlo \ndetalladamente, es cuando a Hinselmann se le encarga dicho estudio. Se necesitó \npara ello un aparato de aumento y es la razón del invento del colposcopio en el año \nde 1925. Para entonces se pudieron distinguir dos tipos de lesiones pre malign as \ndenominadas: atípica simple y atípica elevada, posteriormente las lesiones pre \nmalignas han recibido muchas denominaciones como epitelio con atípica simple, \nelevada atípica no cancerosa, epitelio anormal, hiperplasia de células básales y \nanaplastia, hip erplasia de células espinosas y anaplastia. En 1930, otro curioso \nhecho llamó la atención del doctor Richard Shope, de la Universidad de Rockefeller \n(EEUU) en una visita al campo con un amigo cazador, Shope oyó hablar por primera \nvez de las liebres con cue rnos (jackalope, en inglés), una rareza que le puso sobre \nla pista de la relación de este cáncer con un virus. Las astas que adornaban la \ncabeza de algunas liebres eran en realidad enormes verrugas causadas por un \nvirus, tal y como pudo comprobar Shope después de molerlas, filtrarlas en una vajilla \nde porcelana y obtener minúsculas partículas con las que infectó a otros ejemplares \nsanos. Estas liebres sanas también desarrollaron la protuberancia en su cabeza tras \nel contagio y el experimento apuntaló la teo ría vírica. Una idea que no se volvió a \nretomar sino hasta la década de los setenta cuando el Dr. Harold Zur Hausen inicio \nsu investigación a partir de los estudios con liebres, logrando aislar dos cepas del \npapiloma virus humano, de las que hoy se sabe que están implicadas en el 70% de \nlos tumores de cuello del útero. \n \nEn 1961, en el primer congreso internacional sobre citología exfoliativa \ncelebrado en Viena, un grupo de expertos propuso el empleo de los términos \ndisplasia y carcinoma in situ, que pront o desplazaron a los demás. El cáncer del \n\n Introducción \n11 \n \ncérvix tiene una historia natural que inicia con la lesión intraepitelial escamosa de \nbajo grado, pasa por las de alto grado, posteriormente llega al cáncer micro invasor \ny al invasor propiamente dicho y por último la muerte (Villiers EML,1981, Zur \nHausen H, 1982, Zur Hausen H, 1996, Zur Hausen H, 1999). \n \nI.5 EPIDEMIOLOGIA \nEl cáncer de cuello uterino representa una causa frecuente de \nmorbimortalidad en mujeres en edad reproductiva, es el segundo en frecuencia en la \nmujer en todo el mundo con una incidencia global estimada de 480.000 nuevos \ncasos cada año y una mortalidad aproximada de 280.000 muertes anuales, la \nmayoría de los casos (alrededor del 80%) ocurre actualmente en los paí ses en \ndesarrollo, las tasas de este tipo de cáncer, antes de la introducción del cribado, en \nla mayor parte de Europa, América del Norte y Japón, eran muy similares a las que \nse ven actualmente en los países en vías de desarrollo. Sin embargo, todavía , el \ncáncer de cuello uterino es el se gundo en frecuencia en las mujeres entre 15 y 49 \naños en Europa, después del cáncer de mama, siendo el más frecuente en mujeres \nde 15 a 29 años y apareciendo en el 34% de los nuevos casos en mujeres menores \nde 45 años. En el continente americano se estimó una incidencia y mortalidad de \n92.136 y 37.640 casos, de los cuales el 83,9% y 81,2% corresponderían a América \nLatina y el Caribe respectivamente (Parkin D, Bray F 2006; Merle L 2004) \n \nAl analizar las tasas de mortalidad por Cáncer de Cuello Uterino en diferentes \npaíses, se observo que la variación de la mortalidad es notable con tasas que llegan \na ser ocho veces más altas en los países de “alto riesgo” en Latinoamérica, el \nsudeste Asiático y África, respecto con algunas naciones de Europa, Japón y \nAustralia. Así mismo, cuando se comparan las tasas de mortalidad ajustadas de \n\n Introducción \n12 \n \nCanadá y Estados Unidos de América (EUA), con las de los países de América \nLatina (Colombia, Venezuela, Brasil, México, Perú Costa Rica), es evidente que \ndichas tasas de muerte so n más altas en estos últimos años . En Venezuela, el \nCáncer de Cérvix se considera la primera causa de muerte por patología \noncológica, detectándose 3.000 casos nuevos de cáncer de cuello uterino en \nmujeres en edades comprendidas entre 25 y 64 años . Las e stadísticas oficiales \nreportan que para el año 2007, murieron 1571 mujer es por Cáncer de Cuello \nUterino. La incidencia de la enfermedad es de 3720 mujeres/año. Los estados que \npresentaron una mayor tasa de mortalidad para ese mismo año son: Apure (31,03), \nDelta Amacuro (22,66), Cojedes (22,19) y Amazonas (21,18) (MPPS, 2009) \n \nTras una importante mejoría en la supervivencia en la primera mitad del siglo \nXX, no se ha apreciado un progreso importante en este sentido en los últimos años. \nLas tasas de superviven cia por este tipo de cáncer no han mostrado variación \ncuando los datos se comparan por estadios lo que evidencia que se dispone de \ntratamientos adecuados y equivalentes. Parece pues paradójico que, si se han \nestablecido poblaciones, esto no redunde en una mejoría de la supervivencia. Esto \nse debe fundamentalmente a que se mantiene una proporción de mujeres a las que \nse les diagnostica el tumor en estadios tardíos debido a que, o bien son mujeres a \nlas que es difícil llegar en los programas de cribado, o bie n porque han sido \nsometidas a un screening inadecuado o no se han sometido a screening en \nabsoluto. A pesar de que, hasta el momento actual, la principal estrategia en la \nprevención del cáncer de cérvix ha sido la implementación de los programas de \ncribado mediante la utilización de la citología exfoliativa (test de Papanicolaou), é sta \ntiene una baja sensibilidad. (Falcón Vizcaíno 2007) \n \n\n Introducción \n13 \n \nI.6 FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS AL CANCER DE CUELLO UTERINO \n \nLa causa de la aparición del cáncer de cuello uterino ha sido objeto de estudio \npor más de 150 años. La etiología es aún desconocida, aunque se asocia a varios \nfactores de riesgo. Se presenta con mayor frecuencia en mujeres que han \ncomenzado la actividad sexual precozmente, con embarazos a temprana edad \n(Taylor, 2000; González y col , 2000; Murthy y col , 2000). La vida sexual activa \nincrementa la frecuencia de la enfermedad de forma importante, principalmente en \naquellas mujeres que la inician antes de los 12 años (Sawaya y col , 2001).La \npromiscuidad, sin ser sinónimo de cáncer de cérvix, parece ser el factor de riesgo de \nmayor importancia. Aunque numerosos factores han sido sugeridos para explicar la \nrelación entre el riesgo de padecer la enfermedad y los diversos elementos \nasociados con las relaciones sexuales, la transmisión de agentes infecciosos \n(Papiloma Virus, Trichomonas, Gardnerella, Herpes virus tipo II y Chlamydia) \ncontinúa como uno de los más importantes. (Sayedel-Ahl y col, 2002; Mikamo y \ncol, 1999; Mori y col, 2001) \n \nEstudios epidemiológicos han demo strado que la mayor parte de los tipos de \ncáncer en los humanos se origina en forma secundaria al impacto de diversos \nfactores y muy particularmente el cáncer cervical. En los últimos años y con mayor \nfrecuencia este cáncer se comporta como una enfermedad de transmisión sexual, \nteniendo como factores etiopatogénicos y predisponentes: la edad precoz en el \ncomienzo de relaciones sexuales, paridad elevada, i nfecciones vaginales y la \nproducción de radicales libres, entre otros, todos ellos considerados cofactores en la \ngénesis del cáncer cervical (Simpson AJG, 1977). \n \n\n Introducción \n14 \n \nI.6.1 Edad De La Primera Relación Sexual . El inicio temprano de las relaciones \nimplica la aparición de múltiples compañeros sexuales. Se ha demostrado que en la \nadolescencia los tejidos cervicout erinos son más susceptibles a la acción de los \ncarcinógenos, y de hecho, si existe un agente infeccioso relacionado, el tiempo de \nexposición a este será mucho mayor. El riesgo de lesión intraepitelial cuando el \nprimer coito se tiene a los 17 años o menos e s 2,4 veces mayor que cuando este se \ntiene a los 21 años (Bosch F X, 1995). \n \nI.6.2 Número De Compañeros Sexuales . Existe una relación directamente \nproporcional entre el riesgo de lesión intraepitelial y el número de parejas sexuales. \nEsta exposición se ha relacionado básicamente con la probabil idad de exposición al \nVPH (Bosch FX, 2002, Apgar BS, 1999). Las mujeres solteras, viudas o separadas \ntienen más riesgo de infectarse por VPH dado que tienen más compañeros \nsexuales, sea n permanentes u ocasionales (Hart KW, 2001). Torrejón en sus \nestudios ha demostrado la presencia de VPH cervical o vulvar en un 17 -21% de las \nmujeres con una pareja sexual y en 69 -83% de las mujeres con 5 o más parejas \nsexuales (Torrejón R, 2002). \n \nI.6.3 Anticonceptivos orales Ha sido r eportado que el uso de anticonceptivos \norales por más de 5 años es un cofactor que incrementa 4 veces el riesgo de \npadecer cáncer de cérvix en mujeres portadoras de VPH (Skegg DC, 2002) . Otro \nhallazgo de las investigaciones epidemiológicas expone que tras un diagnóstico de \ndisplasia, en aquellas mujeres que consumen anticonceptivos orales, la progresión a \ncarcinoma in situ es más rápida . (Moreno V y col, 2002) Así mismo, al comparar el \nuso de anticonceptivos contra los métodos de barreras, se ha observado que este \núltimo brinda cierta protección contra el cáncer de cérvix por reducir la exposición a \n\n Introducción \n15 \n \nagentes infecciosos, específicamente la combinación de diafragma y crema \nespermicida, esta última constituida por agentes con acción antiviral. (Hilleman MR, \n2002) \n Existen varios mecanismos por los cuales las hormonas sexuales (estrógeno y \nprogesterona) pueden catalogarse como factores que favorecen los efectos \ncelulares de la persistente infección por el VPH. Uno de ellos es que en ausencia de \nhormonas, el receptor para estas es inactivo y se localiza en el núcleo de la célula \nblanco como un gran complejo molecular asociado a muchas proteínas de shock \ntérmico. Cuando la hormona se une a su receptor, se produce un cambio \nconformacional que provoca la di merización del receptor, adquiriendo capacidad de \nunión a secuencias específicas de ADN . (Edward SP y col, 2000 ) Existen regiones \nde regulación de la transcripción del ADN viral que contienen elementos de \nreconocimiento a hormonas 7 y que aum entan el nivel de expresión de dos genes \nvirales el E6 y el E7. (Von Knebel DM y col, 1997) \n Otro mecanismo descrito es su acción sobre determinados genes asociados a \nla regulación del ciclo celular y al programa de muerte celular. Estas hormonas \ninhiben la transactivación transcripcional mediada por p53 de genes involucrados en \nel arresto del ciclo celular y la apoptosis. (Von Knebel DM y col, 1997) \n También los esteroides inhiben la efectiva respuesta inmunológica contra las \nlesiones inducidas por VPH, particularmente a través de la inhibición de la expresión \ndel MHC I y II, moléculas encargadas del reconocimiento y presentación de péptidos \nvirales. (Von Knebel DM y col, 1997) \nI.6.4 Plasma seminal El diagnóstico de neoplasia cervical no es sinónimo de \npromiscuidad femenina porque muchas mujeres que sólo han tenido una pareja \n\n Introducción \n16 \n \nsexual desarrollan la enfermedad, por lo que es interesante considerar la influencia \ndel hombre en la génesis del cáncer uterino. La probabilidad de que las mujeres \nsean portadoras de l VPH y el riesgo de padecer de cáncer de cérvix se ha \nrelacionado con la presencia de ADN viral en el pene o la uretra de su pareja sexual \n(Bosch F X, 2002) . Además las mujeres tienen un riesgo tres veces superior de \npadecer la enfermedad si su compañero ha tenido previas esposas que han \ndesarrollado la enfermedad (Benedet JL y col, 2002). \nSeguido al contacto sexual, los espermatozoides penetran rápidamente a \ntravés del canal endocervical. Gran número de ellos se depositan en los pliegues \nmucosales de las criptas cervicales, y es alta la concentración de éstos cerca de la \nunión escamocolumnar, donde precisamente se desarrollan el mayor número de \nneoplasias. En este sentido, se han realizado estudios sobre la constitución del \nplasma seminal. El plasma semi nal constituye el 90 % del líquido eyaculable y \ncontiene, dentro de sus componentes inmunosupresores que afectan las funciones \nde diferentes células del sistema inmune (SI), y que incluyen linfocitos T, linfocitos B, \ncélulas asesinas naturales (NK), macróf agos, anticuerpos del sistema de \ncomplemento. Experimentalmente se ha comprobado que existe una fracción de alto \npeso molecular responsable de la i nhibición de linfocitos T entre las que se \nencuentran la proteína plasmática asociada a la gestación y la pro teína placentaria, \nambas con propiedades inmunosupresoras, aún a bajas concentraciones. (Hilleman \nMR 2002) \n El plasma seminal desempeña un importante papel fisiológico \ninmunosupresor que es deter minante para la fertilización. E l tracto cérvico -uterino \nnormalmente produce leucocitosis en respuesta a los espermatozoides pero el \nplasma seminal los protege de la destrucción poscoital por parte de las células del \n\n Introducción \n17 \n \nSI. Sin embargo, sólo en presencia de carcinógenos este efecto puede c onstituir un \ncofactor que ace lera o contribuye al desarrollo de neoplasias. Es por ello que se \nconsidera importante en la génesis del cáncer de cuello. (Edward SP y col 2000) \nI.6.5 Condición Socioeconómica Y Cultural . Existen datos controversiales \nrespecto a la asociación entre CaCu y condición económica, social o educativa. Se \nacepta que las mujeres de más bajo nivel social, cultural y educativo, así como las \ninmigrantes extranjeras tienen mayor incidencia de CaCu, pero existen estudios que \nmuestran a las universitarias como las que m ás lo padecen (Hasenyager C, 1999 ). \nExiste la interrogante si esta condición está relacionada con una mayor exposición al \nVPH o la dificultad para acceder a los servicios de detección oportuna (Fernández \nME, 1998, Lorant V, 2002). Benia y Tellecha, en Urug uay, informaron que más del \n60% de las mujeres de 20 a 30 años no acuden a los servicios de tamizaje más por \ntemor y trabas administrativas que a tener que vivir en condiciones que las expone \nmás al virus (Benia W, Tellecha G, 2000). \n \nI.6.6 Tabaco El tabaq uismo se ha asociado con la presencia de carcinomas de \ncélulas escamosas, predominante en el cáncer cérvico uterino, el de pulmón y el de \nlaringe. Se ha propuesto la hipótesis de que los carcinógenos procedentes del \nconsumo del tabaco (nicotina y cotina) al ser trasportados por el sistema circulatorio \ny llegar al epitelio cervical, puedan iniciar o actuar como carcinógenos en las células \nya afectadas por agentes transformantes posiblemente por transmisión sexual como \nel VPH y el Herpes virus tipo II. (Edward SP y col 2000) \nOtro mecanismo atribuido a este factor para explicar su efecto en el cáncer de \ncérvix, es la inducción indirecta de inmunosupresión y la reducción de antioxidantes \nprovenientes de la dieta. \n\n Introducción \n18 \n \n Sin embargo, actualmente se le da una importan cia moderada a este factor \npero se acepta que, junto a otros, aumenta 3 veces el riesgo de padecer la \nenfermedad comparado con las mujeres no fumadoras (Aclaudious NN y col, 2002) \ny se ha reportado que existe una fuerte relación dosis -respuesta. \n(Deacon JM y col, 2000) \nI.6.7 Dieta y factores El estado nutricional puede influir en la progresión de la \ninfección por VPH. El patrón de metilación del ADN VPH in Vitro se ha asociado con \nla actividad transcripcional viral pues la RNA polimeras a, enzima encargada de la \ntranscripción, se une con menos afinidad al ADN metilado. \nSe conoce que los genes metilados (\"imprimiting\" genómico) son inactivos, \nmientras que los metilados o hipometilados pueden ser transcritos para generar un \nproducto proteico. La pérdida del \"impriminting\" en los fenómenos de carcinogénesis \npodrían vincularse con factores fisiológicos, ambientales y dietéticos, que poseen la \ncapacidad de metilar al ADN (Gómez DE, 1998), así el folato, la vitamina B 6, la \nvitamina B12 y la meti onina pueden tener su mecanismo de acción en la prevención \ndel cáncer de cuello uterino a través de su papel en la mutilación. (Sedjo RL, 2002, \nShannon J, 2002). \nSe ha comprobado que durante el embarazo ocurre una cierta depresión de \nlos niveles de folato lo cual se ha relacionado con el aumento de riesgo de aparición \nde la enfermedad en multíparas . La ingestión de comidas ricas en vitamina A y, \nparticularmente, en retinol se asoció con la reducción del riesgo de padecer traumas \nde desgarro del epitelio que pueden producirse durante el parto, y por sus \npropiedades antioxidantes está asociado con la afección en análisis. \n \n\n Introducción \n19 \n \nAlgunos estudios científicos consideran que una dieta baja en antioxidantes, \nácido fólico y vitamina C favorece la persistencia de la infe cción por VPH y la \nevolución de las lesiones de NIC I a NIC II, III y cáncer cervicou terino pero no son \nconcluyentes (León G, Bosques O, 2005). \n \nI.6.8 Factor genético Aunque el VPH es el principal factor de riesgo para el \ndesarrollo de cáncer de cérvix, s ólo pocas mujeres infectadas desarrollan la \nenfermedad. La susceptibilidad genética a la infección por el VPH parece ser \nimportante en determinar el riesgo individual de desarrollo viral del cáncer. \n(Magnusson PK y col, 2000) La habilidad de ciertos haplot ipos de HLA es \npredisponente a aumentar la susceptibilidad a la iniciación y persistencia de la \ninfección por VPH y, por consiguiente, al desarrollo de tumores malignos en el cuello \nuterino. (Van Driel WJ y col, 1999) \n \n1.6.9 Inmunosupresión La respuesta i nmune está considerada como un potente \nmecanismo de resistencia al desarrollo de tumores, desde la fase de iniciación hasta \nel crecimiento y progresión de los mismos. (Van Driel WJ y col, 1999) .La infección \nviral es común en pacientes con supresión/defecto en el SI demostrado por \nlinfopenia, con la relación linfocitos B/ linfocitos T, migración espontánea y \nquimiotaxis de neutrofilos disminuida. (Roseen K y col, 1996) . Un ejemplo evidente \nha sido demostrado en pacientes infectadas con el virus de la inmunod eficiencia \nhumana las cuales muestran un incremento en la incidencia de lesiones \nintraepiteliales escamosas, debido al deterioro de las células y de los mecanismos \nde la respuesta inmune contra la progresión de la enfermedad. Además, el \ncomportamiento de los mecanismos efectores de la respuesta inmune en \nenfermedad. (Jastreboff AM y col, 2002) Además, el comportamiento de los \n\n Introducción \n20 \n \nmecanismos efectores de la respuesta inmune en pacientes con lesiones del cuello \nuterino, varían según el estadio y el tipo de VPH q ue infecta. La regresión de las \nlesiones inducidas por VPH están acompañadas de una reacción característica de \nhipersensibilidad retardada dependiente de linfocitos T auxiliares (Th). \n Se ha informado la existencia de un desbalan ce en el patr ón de citocinas \nproducidas por las células T donde se afecta el patrón Th1 y se detecta disminución \nen los niveles de interferón gamma y un aumento de la interleucina 10 (IL -10), que \nse corresponde con el patrón Th2. Estas alteraciones inducen trastornos e n la \nsecuencia de eventos necesarios para que la respuesta inmune, tanto humoral como \ncelular, sea efectiva. (Clerici M y col, 1998). \nI.6.10 Infecciones de Transmisión Sexual . Se ha demostrado la asociación de \ncáncer de cuello uterino con enfermedades de t ransmisión sexual. En un estudio \nrealizado en tres países se encontró asociación entre infección por VPH y Chlamydia \ntrachomatis en Colombia y España, pero no en Brasil (Muñoz N, 199 6); mientras \nque otros estudios han asociado la infección del serotipo G d e esta bacteria con el \nvirus (Anttila T, 2001 ). Adicionalmente, la coinfección con el virus de la \ninmunodeficiencia humana (VIH) facilita el desarrollo de la neoplasia , con un \naumento del riesgo de cáncer entre las infectadas por el VIH de hasta 3,2 veces el \nriesgo de las mujeres sin VIH (Mandelblatt JS, 1999). \n \nCon el desarrollo de técnicas en biología molecular para detectar la presencia \nde ADN del VPH en muestras citológicas durante la década de los ochenta, se pudo \nestablecer el papel del VPH de alto r iesgo en la etiología del CaCu . Posteriormente, \nestudios epidemiológicos multicentricos conducidos en la década de los noventa, \npermitieron demostrar la asociación causal entre infecciones con VPH y el desarrollo \n\n Introducción \n21 \n \nde CaCu. Con la evidencia científica acumulada, hoy en día, la infección con VPH ha \nsido propuesta como la primera causa necesaria para el desarrollo de CaCu . Sin \nembargo, no todas las mujeres infectadas con VPH desarrollan cáncer invasor, \nexistiendo esta infección con frecuencia en mujere s sanas. Por lo tanto, otros \ncofactores deben ser necesarios para la progresión de la carcinogénesis en el cuello \nuterino. (Ciaran BJ, 2007) \n \n \n \n \n \nFigura 6 El cáncer de Cuello Uterino se relaciona con algunos factores del medio ambiente \ny estilo de vida, además d e la asociación entre las formas invasivas del cáncer \ncervicouterino y algunos virus especialmente el Virus del Papiloma Humano (VPH) como \nuno de los principales agentes responsables de la etiología de esta enfermedad y defectos \ndel sistema inmunitario del huésped. Carrero Y, 2012 \n \n \n \n \n \n \n\n\n Introducción \n22 \n \nI.7 VIRUS DE PAPILOMA HUMANO (VPH) \n \nEl VPH es un miembro del género A de la familia Papovaviridae, es un virus \nsin cubierta que mide de 50 a 55 nanómetros (nm) de diámetro, presentando \ncápsides icosaédricas constituidas po r 72 capsómeros, su genoma es un ácido \ndesoxirribonucleico (ADN) circular de doble hélice, con un peso molecular \naproximado de 5x106 Daltons, correspondiente a 8.000 pares de bases. (Braunwalal \nE y col, 1999) \n \nEl genoma viral está organizado y dispuesto en bloques separados que \nconsisten en regiones de lectura abierta (ORFs, open reading frame). Estas \nregiones han sido designadas como tempranas (E) que codifican para proteínas \nrelacionadas con la replicación (E1), transcripción (E2) y transformación celula r \n(E6 y E7), o tardíos (L) que codifican proteínas de la cápside (L1 y L2); además \nposeen una región denominada región reguladora ascendente (URR) ó región \nlarga de control (LCR), que contiene secuencias de control para la replicación y \nexpresión genética del VPH. (Callejas D, 1997; Rivera R y col , 2002; Crum C, \n1998) \n\n Introducción \n23 \n \n \nFigura 7 Organización del Genoma del VPH. \n \n \nI.7.1 PROTEINAS VIRALES \nI.7.1.1 GENES E1 Y E2 \n \nLos genes E1 y E2 codifican proteínas que regulan, activando o reprimiendo, la \ntrascripción v írica mediante fijación a proteínas celulares. La proteína \ntransmembranosa E5 se fija a la membrana plasmática, así como a las membranas \ndel aparato de Golgi y del retículo endoplásmico, y modula la actividad del factor de \ncrecimiento epitelial (EGF). (Morrison F, 1994) \n \n1.7.1.2 GEN E4 \n \nLa proteína E4 interactúa con los filamentos de la citoqueratina de la célula \nhospedadora destructurándolos, pudiendo provocar la muerte celular. El VPH como \n \nVPH \nOncoproteinas LCR \n\n Introducción \n24 \n \nvirus que es no forma vida independiente requiere de la célula huésped para su \nreplicación penetrando por endocitosis y ubicándose en el citoplasma, \ninterrumpiendo la síntesis de proteínas de la célula (Stein J, 1991; Pascale H y col, \n1999) \n \nI.7.2 ONCOPROTEINAS VIRALES \n \nEl VPH al penetrar a la célula a través de la m embrana plasmática por \nendocitosis, se ubica en el citoplasma interrumpiendo la síntesis de proteínas de las \ncélulas infectadas, siendo capaz de utilizar macromoléculas y energías del \nhospedador, y en el núcleo de las células se une a genes supresores como p53 y Rb \n(inserción mutacional) a través de las proteínas E6 y E7, induciendo cambios \ntransformacionales de tipo neoplásico en la célula infectada capaz de dar inicio a \nuna lesión intraepitelial y origina posteriormente un proceso neoplásico (Muñoz M y \ncol, 1999; Burkhardt A, 1999) . A pesar de que este bien establecido que las \noncoproteínas E6 y E7 codificadas por el virus están involucradas en la \ntransformación celular, l a infección por VPH, no es suficiente por si sola para \ndesarrollar un cáncer. (Kuper H y col, 2000). \n \nI.7.2.1 ONCOPROTEINA E6 \n \nEl gen E6, de aproximadamente 450 a 500 pb, codifica para una proteína de \n150 aminoácidos con un peso molecular de 16 a 18 kDa. La proteína tiene un \npotencial oncogénico débil en algunas líneas celulares y c oopera con E7 para la \nplena capacidad transformante e inmortalizante. E6 se expresa muy tempranamente \ndurante una infección por VPH. Esto le confiere varias funciones que alteran el \n\n Introducción \n25 \n \nambiente celular, como el bloqueo de la apoptósis mediante la degradación de p53, \nla alteración de la transcripción de genes celulares a través de la interacción con \np300 y CBP (coactivadores de p53), e incremento de la vida celular por la sobre \nactivación de la telomerasa. La acción clave de E6 de los VPH de alto riesgo es \ninhibir la función de P53, proteína supresora de tumores, mediante su degradación \npor la vía de la ubiquitina (Hengstermann A y col, 2001; Mantovani F y col, 2001) \nPara ello E6 requiere a la proteína celular asociada a E6 (E6 -AP). Esta proteína \nreemplaza a Mdm2, que en células normales no infectadas es quien degrada a P53. \nEste cambio reduce dramáticamente la vida media de P53 (desde 3 horas hasta 20 \nminutos) y el nivel de proteína en las células de CaCu a menos de la mitad del nivel \npresente en las células n ormales. La mayoría de las proteínas E6 de los VPH de \nbajo riesgo (E6 – BR) no se unen a P53 o lo hacen débilmente y no lo degradan. E6 \ntambién puede retener a P53 en el citoplasma bloqueando su translocación al núcleo \ny así inhibiendo su función independi entemente de su degradación (Mantovani F y \ncol, 1999). En consecuencia E6 inhibe la capacidad de P53 para activar o reprimir la \ntranscripción de sus genes blanco. E6 puede superar la apoptósis dependiente e \nindependiente de P53. Así mismo se ha observado q ue E6 interactúa con Bak, una \nproteína proapoptótica que se expresa en altos niveles en las capas superiores del \nepitelio en diferenciación. El incremento de P53, que se daría por la proliferación \ninducida por el VPH, así como la consecuente inducción de a poptósis, \nprobablemente mataría a una célula infectada por VPH antes de que la replicación \nde este ocurriera. Por tanto la modulación de los niveles de P53 por parte de E6 es \nimportante para una infección productiva. (Krajewski S y col, 1996) \n \n \n \n\n Introducción \n26 \n \nI.7.2.2 ONCOPROTEINA E7 \n \nEl gen E7, de aproximadamente 300 a 320 pb, codifica para una proteína de \naproximadamente 100 aminoácidos con un peso molecular de 10 kDa. E7 tiene la \nmayor capacidad transformante y actúa mediante la unión a proteínas celulares \nsupresoras de tumores de la familia pRB, que a su vez interactúan con factores de \ntranscripción de la familia E2F. La familia pRB controla la replicación celular (Boyer \nSN y col, 1996). La unión de E7 a la forma activa de pRB conduce a la liberación de \nlos factores de transcripción E2F independientemente de la presencia de factores de \ncrecimiento externos, lo que promueve el progreso de la fase S del ciclo celular y por \ntanto la replicación celular. E7 también se asocia con otras proteínas tales como \ndesacetilasas de h istonas, AP1 e inhibidores de los complejos CDK, como p21 y \np27. (Inhibidores de cinasas) Como resultado de la liberación de E2F se expresa \nciclina E, importante para el progreso de la fase S. Estas interacciones inducen \nmúltiples respuestas celulares, incluyendo la estabilización de P53 que normalmente \ncontrarrestaría esta replicación celular, anormalmente estimulada, mediante el \nincremento de la apoptósis. Sin embargo la proteína E6 – AR degrada a P53 y por \ntanto bloquea esta respuesta celular. (Munger K y col, 2001) \n \nI.7.3 INSERSION MUTACIONAL \n \nEl VPH al penetrar a la célula a través de la membrana plasmática por \nendocitosis, se ubica en el citoplasma interrumpiendo la síntesis de proteínas de \nlas células infectadas, siendo capaz de utilizar macromolécul as y energía del \nhospedador, y en el núcleo de las células se une a genes supresores como p53 y \nRb (inserción mutacional) a través de las proteínas E6 y E7, induciendo cambios \n\n Introducción \n27 \n \ntransformacionales de tipo neoplásico en la célula infectada capaz de dar inicio a \nuna lesión intraepitelial y origina posteriormente un proceso neoplásico (Lizano \nM, 2009 ). \n \n En la patogénesis del cáncer del cuel lo uterino, la infección por VPH de alto \nriesgo condiciona la pérdida de las funciones de algunas vías de regulació n celular. \nLas oncoproteínas VPH -E6 y VPH -E7 forman complejos e inactivan funcionalmente \na las proteínas p53 (encargada de la reparación del ADN y la inducción de apoptosis \ncuando fallan los mecanismos de reparación) y Rb (proteína supresora de tumor), \nrespectivamente. Como consecuencia, y al igual que en otras malignidades no \nasociadas a la infección por VPH, las señales de transducción reguladas por estas \nproteínas son afectadas lo que contribuye a la inestabilidad genómica . (Pillai MR y \ncol, 1998; Padovan P y col, 2000) \n \nFigura 8 Dinámica de la infección por VPH en Cuello Uterino. Carrero Y 2012 \n \n \n \n\n\n Introducción \n28 \n \nI.8 CLASIFICACIÓN DEL VIRUS DE PAPILOMA HUMANO (VPH) \n \nEl virus de papiloma humano se divide en dos grandes grupos dependiendo de \nlos tipos de lesiones cancer ígenas que provocan: alto y bajo riesgo. Se denomina \nVPH de bajo riesgo (BR) a aquellos genotipos cuyo riesgo de provocar cáncer es \nbajo, dentro de este grupo se encuentran: 6, 11, 40, 42, 53, 54 y 57. (Shirley E , \n1999; Torrejón R, 2002). Los tipos de V PH de bajo riesgo pueden causar cambios \nleves en el cuello del útero de una mujer. No son perjudiciales y desaparecen con el \ntiempo. Sin embargo pueden presentarse verrugas genitales conocidas como \ncondilomas acuminado, originadas de ciertos tipos como el VPH6 y el VPH11. Estas \nverrugas pueden aparecer varias semanas después del contacto sexual con una \npersona que esté infectada con VPH, o es posible que se tarden varios meses o \naños en aparecer; o, tal vez, que nunca aparezcan. \n \nEl segundo grupo de tipos de VPH genital se conoce como de alto riesgo (AR) \nson los que se encuentran con mayor frecuencia asociados en los casos de cáncer \nde cuello uterino e incluyen el VPH 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58. De estos \ntipos el VPH 16 y el 18 son, sin duda, l os más importantes dado que se encuentran \ncon más frecuencia vinculados al cáncer cervicouterino. Sólo la infección persistente \nde VPH de alto riesgo (aquella que no desaparece durante años) aumenta el riesgo \nde Cáncer de cuello uterino. (Stoler M, 2006; Torrejón R, 2002). \n \nLos tipos de alto riesgo causan formaciones que son generalmente planas y \ncasi invisibles, comparadas con las verrugas causadas por los VPH6 y VPH11. Es \nimportante notar , que la mayoría de las infecciones de virus del P apiloma humano \ndesaparecen por sí solas y no causan Cáncer. (Stoler M, 2006; Correnti M y col, \n\n Introducción \n29 \n \n1997; Giannini SL y col , 1998) Sin embargo los tipos 16, 18, 31, 33 y 35 pueden \nprovocar alteraciones celulares en la vagina y el cuello uterino asociados a lesiones \npremalignas y cancerosas en la mujer (Morrison F, 1994) \n \nObservaciones clínicas han permitido establecer un importante papel del VPH \nen el origen de las lesiones preinvasivas de cuello uterino (Satos S y col, 1998). Se \nha podido demostrar que este virus es el agente desencadenante de más del 95% \nde los cánceres cervicales y de las lesiones cervicales de alto grado. Estudios \ninternacionales sobre cáncer cervical invasivo han establecido que el 92,9% de los \ntumores analizados contenían ADN de VPH y que probablemente me nos del 5% del \ntotal, realmente carecían de ADN vírico. Por lo tanto, la infección por VPH \nrepresenta el paso previo que precede al desarrollo de una neoplasia intraepitelial \ncervical (NIC) (Lacruz C y col, 2003; Holowaty P y col, 1999) , Sin embargo, en un \npequeño grupo de mujeres, el virus no desaparece, y la infección se hace \npersistente .Esto puede llevar al desarrollo de NIC y su progresión de NIC I a NIC \nIII, y luego a carcinoma invasor. El tiempo de evolución de NIC I a carcinoma invasor \nes variable y depende del tipo de cepa infectante, la inmunidad del huésped y la \ncarga viral, generalmente es de 10 a 20 años . (Giannini SL y col, 1998; López A y \ncol 2002) \n \nCuando la mujer es sexualmente activa, aumenta el riesgo de infección con \nVPH-AR. En 80 % de l as mujeres infectadas, la infección es transitoria, no se \ndesarrolla NIC, y el virus desaparece en 6 a 8 meses. Una respuesta de anticuerpos \nneutralizadores contra el VPH -Alto Riesgo parece proteger a estas mujeres del \ndesarrollo de NIC. En el otro 20 % de las mujeres infectadas con VPH -Alto Riesgo, \n\n Introducción \n30 \n \nse desarrolla NIC; pero en la mayoría de éstas, el virus y la lesión también \ndesaparecen (Lopez A y col, 2002) \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nTabla 1 Clasificación del VPH de acuerdo a las manifestaciones clínicas y riesgo según The \nInternational Agency for Research on Cancer (IARC). 2005 \n \n \nI.9 DIAGNOSTICO DE LESIONES DE CUELLO UTERINO Y VPH \n \nEl diagnóstico virológico para la identificación del VPH en lesiones de pacientes \no en muestras biológicas durante el pesquizaje clínico rutinario se dificulta al carecer \nde pruebas serológicas, y a la dificultad de crecimiento del virus en cultivos \ncelulares. El hallazgo clíni co de verrugas o lesión colposcó pica visualizadas por \ncambios citológicos o histopatológicos, virtualmente son las herramientas empleadas \nen el diagnóstico de la infección por VPH al igual que el empleo de la estudios \nmoleculares. (Velásquez-Cruz AD y col, 2002) \n \n \n \n TIPOS DE VIRUS MANIFESTACIONES \nCLINICAS \n \nVPH:1 Verruga plantar \nVPH:2 Verruga vulgar o comun \nVPH: 5- 8 Epidermodisplasia verruciforme \nCLASIFICACION DEL RIESGO \nVPH:6,11,40,42,53,54,66 Bajo Riesgo \nVPH: 16,18,31,33,35,39 Alto Riesgo \n45,51,52,56,58,59,67,69 \n\n Introducción \n31 \n \nI.9.1 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS CONVENCIONALES \n \nI.9.1.1 TEST PAPANICOLAOU \nLa prueba de Papanicolaou fue descrita desde hace más de 50 años, por el \nDr. Papanicolaou, teniendo éxito en la disminución de la incidencia de cáncer \ncervicouterino, a pesar de tener una sensibilidad del 50 al 60%, si se obtienen tres \nmuestras negativas consecutivas existe una probabilidad menor del 1% de la \npaciente presente una anomalía cervical (González E , 2003). \n \nHistóricamente la prueba de elección para el diagnós tico de lesiones \npreinvasivas ha sido la citología cervical, considerado un método efectivo para \nreducir la morbilidad y la mortalidad por este tipo de cáncer. Recientemente, la \nOrganización Mundial de la Salud, ha evaluado como herramientas útiles además de \nla citología de Papanicolau, la citología liquida y la detección del Virus del Papiloma \nHumano (VPH) (Martínez F, 2004). \n \n El diagnóstico citológico identifica la lesión (preneoplásica o neoplásica), que es lo \nque interesa fundamentalmente al médico clínico para la aplicación terapéutica. A su \nvez, este estudio citomorfológico sigue siendo el método más rápido y económico \npara identif icar la presencia de VPH en el tracto genital femenino, pero los falsos \nnegativos son relativamente frecuentes, de ahí que en los casos sospecho sos, o \nincluso en los casos NIC positivos sea recomendable la aplicación de técnicas \ncomplementarias biomoleculares que permiten la identific ación del virus y su \ngenotipo. Es cierto que la mayoría de estas infecciones víricas regres an \nespontáneamente, pero las ventajas de la biotecnología está bien contrastada, ya \nque resulta un excelente compl emento del examen del frotis en pacientes de \n\n Introducción \n32 \n \nriesgo, reduciendo drá sticamente los falsos negativos, m odifica el seguimiento en \ncasos de ASCU S y NIC I (LSIL), pues en los VPH negativos es sólo necesario el \nseguimiento, mientras en los VPH positivos, que da indicada la colposcopia; por \núltimo, se presenta como un buen control de tratamientos, facilitando el diagnóstico \nprecoz de recidivas. (Carreras R, 1997). \n \nI.9.1.2 COLPOSCOPIA \nFue introducida en 1925 por Hinselman, consiste en la exploración del tracto \ngenital inferior empleando un equipo con distintos aumentos, sin preparación y \nluego de la ap licación de acido acético al 5% que permite id entificar y delimitar una \nposible lesión en el cuello uterino, la cual será posteriormente estudiada \nhistológicamente a través de una biopsia. \n \nEl examen se puede realizar en cualquier momento del ciclo, fuera del \nperiodo menstrual siendo el momento ópti mo durante la fase estrogénica cuando el \nmoco cervical es abundante y acuoso y facilita el examen endocervical. \n \nLas principales indicaciones para realizar colposcopia son: \n Cuello uterino de aspecto sospechoso \n Citología que reporte NIC 1, NIC 2 y NIC 3 \n NIC 1 con más de 12 a 18 meses en la citología \n Calidad insatisfactoria persistente en la citología \n Infección por virus de Papiloma Humano \n Acetopositividad en la inspección visual con acido acético \n Resultados positivos en la inspección visual con solución \nyodo- yodurada de lugol (Torné A, 2006). \n\n Introducción \n33 \n \nI.9.2 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS ESPECÍFICOS \n \nEn la actualidad se disponen de métodos con una sensibilidad y especificidad \nsuperiores a las técnicas histológicas clásicas, técnicas inmunohistoquí micas para \ndetección del antígeno y la detección de las partículas víricas por microscopia \nelectrónica (ME) que han sido utilizadas en la detección de la infección viral y que \ncarecen de sensibilidad en la detección de infecciones subclínicas y latentes . \n(Martínez J, 2010). \n \nI.9.2.1 Southern blot : Consiste en la extracción del ADN de muestras en fresco \ndespués de la digestión de proteínas y del ARN. El ADN extraído se cliva con un \ngrupo de enzimas de restricción apropiada y se separa con electrofores is en gel \nde agarosa y posteriormente este gel se transfiere a una membrana para su \nhibridación con una sonda especifica (Tatti S, 2008). \n \nI.9.2.2 Hibridación Puntual: Llamado “dot blotting” consiste en no digerir todo el \nADN extraído de la célula con enzimas de restricción sino exponerlo por separado \nsobre un gel y realizar el método de Southern blot sobre una membrana para luego \nrealizar hibridación y detección. Este método es más rápido se pueden evaluar \nmuchas muestras, no necesita enzimas de restricción ni transferencia. Actualmente \nconfirma resultados de PCR. (García J y col, 2003) \n \nI.9.2.3 Hibridación Invertida: Consiste en la transferencia a un filtro de ADN de \nVPH liberado por el plasmado intermedio de una enzima de restricción en su \nexposición a una sonda de 500 ng de ADN celular radiomarcado. Todas las \nsecuencias de VPH presentes en al ADN celular s e hibridaran con el tipo de VPH \n\n Introducción \n34 \n \ncomplementario presente en la sonda. Existe también la hibridación “sándwich” e in \nsitu entre otras. (García J y col, 2003) \n \nI.9.2.4 Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR): Es un método in Vitro que \npermite amplificar las secuencias de ADN especificas más de un millón de veces en \nunas pocas horas por medio de una reacción enzimática dirigida por un cebador . La \nsíntesis de PCR consiste: el ADN de doble cadena buscado se desnaturaliza para \npermitir que los cebadores lo hibriden. Estos se unen a las secuencias de ADN \ncomplementarias en forma específica. El resultado de PCR es el aumento \nexponencial del AD N buscado en función de la cantidad de ciclos realizados (un \nciclo consiste en la desnaturalización del ADN; fijación del cebador y la extensión \ndel cebador). Si se dispone de la cantidad suficiente de ADN geonómico amplificado \nel diagnostico puede ob servarse sobre el gel después de la electroforesis y tinción \ncon bromuro de etidio. (Villegas V. y col. 2009) \n \nLa mezcla de la reacción consta de una pequeña muestra de ADN que se \nutiliza como molde a partir de un tejido fresco o en parafina, en adicción se necesitan \noligonucleótidos que son los que actúan como cebadores, ADN polimerasa \ntermoestable que se utiliza como sustrato para copiar las cadenas nuevas a partir \ndel molde y un amortiguador que se encarga de estabilizar la reacción. \n \nEl primer ciclo de la reacción, conocido como desnatur alización, consiste en \nsepara las cadenas de a una temperatura de a C, aplicada durante \npocos minutos. Posteriormente se produce el anillamiento hibridación de los \ncebadores con las secuencias complementar ias de , los cebadores sintéticos \n\n Introducción \n35 \n \ndelimitan el sitio ue se busca amplificar y se anillan a temperaturas ue oscilan \nentre y C. \n \nEl último ciclo o de extensión permite al ADN polimerasa sintetizar las nuevas \ncadenas y a medida que avanza el pro ceso se logra amplificar el segmento unas \n107 veces (Villegas V y col, 2009). \n \nI.9.2.5 PCR Multiplex: Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo con el \nfin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Por lo tanto, \nconsiste en combin ar en una reacción única todos pares de cebadores de los \nsistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los \nreactivos de la reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas es obtener la \ninformación de varios loci en una sola reac ción, menor cantidad de molde para el \nanálisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de base de datos \n(Villegas V y col. 2009). \n \nI.9.2.6 Sistema de Captura Hibrida II: Se basa en el principio de hibridación en \nsolución. Utiliza sondas de ARN que se unen o hibridan al ADN buscado. Se \nincluyen dos sondas: sonda B que incluye el panel de los 13 tipos de VPH alto \nriesgo 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 y 68; y el panel A que abarca los tipos \nde bajo riesgo 6,11,42,43 y 44. Este méto do es un inmunoensayo ligado a enzimas \ny asociado con una reacción de fosfatasa alcalina no radiactiva con compuestos \nquimioluminiscentes colocados en microplacas. Las muestras se clasifican como \npositivas si el registro de unidad de luz relativa obtenido con el luminómetro es \nigual o mayor que la media de los valores de los controles positivos realizados \n\n Introducción \n36 \n \npara el análisis. El fabricante recomienda un umbral positivo de 1 pg/ml (alrededor \nde 5.000 copias) para la detección del VPH (García J y col, 2003). \n \nEstos estudios hoy en día nos permiten identificar a las portadoras de los \ntipos de VPH de alto riesgo u oncogénicos para decidir si la paciente mantiene un \ntratamiento conservador, ya que este no siempre erradica el virus y de acu erdo a \nlos conocimientos actuales las pacientes mayores de 30 años con infección \npersistente podrían correr mayor riesgo de cáncer de cuello uterino en comparación \ncon pacientes que presentan infección fluctuante o involutiva. \n \nI.10 VIRUS DE PAPILOMA HUMANO Y CANCER CERVICAL \n \nEl VPH penetra a la capa basal del epitelio exocervical e inicia la replicación \nviral en las células espinosas y el ensamble de los viriones se lleva a cabo en los \nestratos superiores, cuando las células se han diferenciado. Fin almente en las \ncélulas escamosas, los viriones son expulsados y pueden iniciar un nuevo ciclo de \ninfección, una vez dentro de la célula el genoma del VPH puede tomar tres vías: \n \n1. El ADN viral es mantenido intranuclearmente pero extracromosómico con lo c ual \nla replicación se lleva a cabo de manera sincrónica con la duplicación celular, dando \nlugar a una infección latente. \n \n2. Conversión de una forma latente en una infectante por replicación de virus \ncompletos desarrollando lesiones intraepiteliales de bajo grado y acuminadas. \n \n\n Introducción \n37 \n \n3. Integración con el genoma celular e inicio del proceso oncológico (cáncer). (Erazo \nJ, 2007) \n \nLos dos productos genéticos nece sarios para transformar e inmortalizar las \ncélulas epiteliales humanas son los originados de los genes E6 y E7 del VPH. Las \nevidencias que soportan el papel causal de estos oncogenes en el desarrollo de \ntumores son las siguientes: los oncogenes E6/E7 se expresan en forma constante \nen células cancerosas; los mecanismos que regulan la expresión de E6/E7 están \nausentes en las células cancerosas; E6/E7 son capaces de inmortalizar células y \npromover la inestabilidad del genoma de la célula huésped; el bloqueo de la función \nde los genes E6 -E7 lleva a la re -versión del fenotipo mal igno de las células \ncancerosas. Estas oncoproteínas se unen e interactúan respectivamente con las \nproteínas celulares p53 y pRb que son proteínas reguladoras del ciclo celular. (Shah \nKV y col, 1989) \n \nI.10.1 Interacción entre la oncoproteínas E6 y la proteína p53: p53 es un factor \nde transcr ipción celular, es decir, un factor que controla la expresión de genes \nespecíficos. Actúa como un guardiá n del ciclo celular preservan do la fide lidad de la \nreplicación del ADN. Las mutaciones de p51 son la anomalía genética más \ncomúnmente encontrada, en los tumores humanos. Si el ADN celular es dañado, los \nniveles de p53 aumentan y se produce una detención del ciclo celular en GI, \npermitiendo su reparación. Además, p53 induce apoptosis en células con daño \nirreparable del ADN. La oncop roteína E6 del VPH de a lto ries go se une a p53 a \ntravés de una proteína llamada E6-AP, necesaria para la formación del complejo E6-\np53. La formación de este complejo, a través de la activación del mecanismo \nproteolítico de la ubiquitina, produce la de gradación de p53. (Iluibregtse JM y col , \n\n Introducción \n38 \n \n1995) La oncoproteína E6 del VPH de bajo riesgo, no inactiva a p53 porque sólo se \nune a su extremo C -terminal y esta interacción no produce la degradación de p53. \n(Majewski S y col , 1997)\n \nLa de-gradación de p53 impide una adecuada reparación \ndel ADN , lo cual lleva a inestabilidad del genoma, mutaciones, alteraciones \ncromosómicas y formación de tumores. (Androphy EJ y col, 1994; Perry ME y col, \n1993; Zur Hausen H, 1994; Schcffner M y col, 1994; Zur Hausen H, 1996). \n \nI.10.2 Interacción entre E7 y pRb: La proteína del retinoblastoma ( pRb) es una \nfosfoproteína cuya función es regular la entrada de la célula al ciclo de división \ncelular. Durante el ciclo celular la pRb experimenta ciclos de fosforilación y \ndefosforilación. La forma no fosforilada e s la forma activa que sup rime la división \ncelular. Durante la fase tardía de la mitosis, la PRb es desfosforilada, se une al factor \nde transcripción E2F, lo secuestra e impide que este factor transcriba los genes \nnecesarios para que la célula entre a la fa se S del ciclo celular, de modo que la \ncélula se detiene en la fase G1 del ciclo celular (fase de reposo). Durante la fase S, \nG2 y la mitosis temprana, la pRB es fosforilada por enz imas quinasas ciclino -\ndependientes y pasa a su forma inactiva, permi tiendo la labor del factor de \ntranscripción \n \n La oncoproteína E7 se une a pRb en el mismo sitio de unión que el factor de \ntranscripción E2F desplazando a este último de modo que queda libre para activar la \nreplicación y transcripción del ADN. La inacti vación fun cional de, pRB, permite la \nprogresión de la célula a la fase S del ciclo celular (fase de replicación del ADN). La \noncoproteína E7 de los VPH de bajo riesgo interactúa con la pRb con menor afinidad \ny eficacia . (Androphy EJ, 1994; Zur Hausen H, 1 994; Hollingsworth RE y col, \n1994; Huibregtse JM y col, 1994) \n\n Introducción \n39 \n \nI.10.3 Cooperación entre E6 y E7 en la transformación maligna: Los estudios \nexperimentales demuestran que es ne cesaria la acción cooperadora y la ex presión \ncontinúa de los genes E6 y E7 para la inmortalización celular. Se ha especulado que \nE7 produciría las mu taciones y E6 impediría la reparación de estas mutaciones \nmediante la degradación de p53. (Zur Hausen H, 1994) \n \nEn los VPH de alto riesgo, la expresión de E6 y E7 es controlada por factores \ncelulares del huésped (genes), capaces de restringir la transcripción de VPH en \ncélulas normales. Estos genes reguladores podrían ser el blanco principal de \neventos mutagénicos. Los VPH de bajo riesgo, aunque estimulan la prol iferación \ncelular, son aparentemente incapaces de inducir mutacio nes y la progresión tumoral \ndependería más de factores externos no bien conocidos. La conversión maligna con \nestos tipos de VPH es rara y cuando ocurre se producen carcinomas verrugosos, \nlocalmente invasivos, pero sin potencial metastásico. (Zur Hausen H, 1994) \n \nI.10.4 Rol de la integración viral en la transformación maligna: El ADN integrado \nse define como la unión covalente del ADN viral al ADN cromosomal. En contraste, \nel ADN episomal es un ADN circular libre en el núcleo capaz de replicarse y producir \nviriones. La integración del ADN del VPH, se observa principalme nte en carcinomas \ninvasivo. Las lesio nes premalignas por lo general presentan ADN episomal. En \ninfección por VPH 16 y 18 ocurre integración del ADN, no así en infecciones por \nVPH de bajo riesgo 6 y 11.\n \n(Zur Hausen H, 1994; Schcffner M y col, 1994). El sitio \nde int egración del VPH en el genoma del huésped parece ser un fenómeno \naleatorio. En algunos casos, la integración del genoma del VPH ocurre en la \nvecindad de oncogenes conocidos tales como el c-myc (situado en el cromosoma 8). \n\n Introducción \n40 \n \nUna hipótesis atractiva es que la integración del genoma viral en la vecindad de un \noncogén, proporcio naría u n ambiente propicio para la pro liferación celular y \nprogresión de una lesió n preneoplásica a cáncer. Existe especificidad sobre el sitio \nen el cual se rompe el genoma viral para integrarse al genoma celular. La \nintegración por lo general ocurre en la región El - E2 del genoma. Las proteínas El y \nE2 actúan primordialmente reprimie ndo la actividad del promotor que permite la \ntranscripción de los oncogenes E6 y E7. En los c anceres cervicales VPH positivo \ncon integración del ADN, El y E2 dejan de expresarse y sólo E6 y E7 se siguen \nexpresando. (Schcffner M y col, 1994) \n \n \n \n \nFigura 9 Mecanismo Oncogénico del Virus del Papiloma Humano (VPH) Carrero Y, 2012. \n \n \n \n\n\n Introducción \n41 \n \nI.11 RESPUESTA INMUNITARIA EN CUELLO UTERINO \n \n La respuesta inmunitaria está considerada como un mecanismo efector en la \nresistencia a los tumores y está relacionada desde la fas e de iniciación hasta el \ncrecimiento y progresión de éstos. (Janeway CH y col, 2001) Importantes \nevidencias sugieren que el sistema participa en la eliminación de las células \nmalignas que aparecen en el huésped, probablemente, como resultado de \nmutaciones espontáneas, exposición a carcinógenos del medio ambiente y \nactivación viral. Además, tiene una crucial implicación en la progresión de tumores \nya establecidos, son más agresivos, generalmente, en aquellos pacientes que sufren \ninmunodepresión. Numerosos reportes establecen que en la respuesta del huésped \na la infección intervienen tanto los componentes celulares como humorales del \nsistema inmune (Brostoff J y col, 1993) \n \n \nI.11.1 RESPUESTA INMUNITARIA CELULAR \n \n La respuesta inmunitaria celular local d etectada en estas lesiones se \ncaracteriza por un moderado infiltrado y una invertida y disminuida relación Th/Tc \n(CD4/CD8), con capacidad de proliferación disminuida . (Ghim SJ y col, 2001; Satin \nAD y col, 2001) Actualmente se ha detectado un desbalance en el patrón de \ninterleuquinas Th1/Th2, dado por un aumento en las interleuquinas (IL) tipo II (IL -4, \nIL-5, IL -6, IL -10, supresoras de la respuesta inmune celular) y una concomitante \nreducción en las interleuquinas tipo I (IL -2, INF-g) en muestras VPH +26. Diversos \nestudios muestran un incremento en la concentración de IL -10 y una disminución del \nIFN-g, tanto al nive l transcripcional como proteíco. (Tartour E y col, 1998) Estas \nalteraciones traen como consecuencia una pérdida del control sobre det erminados \n\n Introducción \n42 \n \ngenes del VPH 16 y VPH 18 y una desregulación en los mecanismos de \npresentación antigénica, la expresión de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) \nse muestra reducida o ausente. (Clerici M, 1998; Wan g SS, 2002) En esta entidad \nexiste una ausencia parcial o total de células de Langerhans, consideradas como las \npresentadoras de antígenos fundamentales en la respuesta inmune contra el tumor. \n(Hachisuga T y col, 2002) \n \n El infiltrado inflamatorio tumoral relacionado con el carcinoma cervical está \nformado por linfocitos, macrófagos y eosinófilos, estos últimos ocupan el 40 % del \ninfiltrado. Ciertas interleuquinas como la IL5, e indirectamente la IL4, tienen efecto \nen la quimiotaxis de los eosinófilos. Además de la producción de interleuquinas por \nlas células tumorales, los linfocitos T y los macrófagos producen estas interleuquinas \nlo que induce a pensar que el infiltrado de eosinófilos refleja una respuesta Th2 . \n(Fridman WH y col, 1998; Willimien J y col 1999) El IFN-g y la IL -2, propios del \npatrón Th1, son esenciales en la respuesta antitumoral. La IL -2 es el elemento \nfundamental en la cascada de interleuquinas liberadas durante la respuesta inmune. \nAunque muchos linfocitos la producen, son los Th las células productoras por \nexcelencia, en este sentido, la reducción de las células CD4 es significativo, de lo \ncual resulta una disminución de la respuesta citotóxica. (Hildesheim A y col, 1997) \n \n El reconocimiento antigénico de las células con capacidad citotóxica está \nmediado por receptores. En los linfocitos T este receptor recibe el nombre de \"TCR\", \nel cual está formado por un heterodímero de cadenas ab/dg y por 4 cadenas (e, d, g, \ne), que en su conjunto son reconocidos como \"CD3\". Estos receptores se \nencuentran asociados, a su vez, con 2 cadenas \"zeta s \", que son las responsables \nde la transmisión de las señales de activación al interior de la célula. Estas cadenas \n\n Introducción \n43 \n \nzetas también se encuentran presentes en el receptor para antígenos de las células \nasesinas naturales (NK). (Janeway CH y col, 2001) Recientes estudios moleculares \nhan evidenciado una disminuida expresión del dímero formado por la cadena zeta, \ntanto de linfocitos T como células NK, lo que contribuye a la ineficiencia de los \nmecanismos efectores del infiltrado linfocitario presente en las lesi ones de esta \nlocalización. Estos procesos son regulados por factores locales derivados de las \ncélulas tumorales. Al existir un desbalance de interleuquinas en el microambiente de \nestas lesiones, pueden detectarse ciertas afectaciones al nivel transcripcional. (De \nGruijl TD y col, 1999) El infiltrado linfocitario presente en las lesiones de cuello \nuterino refleja una respuesta inmune ineficiente. Aunque se acepta generalmente \nque los linfocitos T desempeñan una función principal en la inmunidad específica \ncontra el tumor, existen evidencias que las células asesinas naturales (NK) \nproporcionan una resistencia temprana contra las infecciones virales, el crecimiento \nde tumores y de metástasis . (Whiteside TL y col, 1994) Los estudios en pacientes \ncon cáncer de cérvix muestran que las funciones NK están deterioradas en todos los \nestadios y que, una vez infectadas las células por el VPH, se vuelven resistentes a la \nlisis por las NK. (Sheu BC y col, 1994) \n \nI.11.2 RESPUESTA INMUNITARIA HUMORAL \n \nEn cuanto a la respuest a humoral, ha sido encontrada variabilidad en los \ntítulos de anticuerpos, independientemente de los altos valores de inmunocomplejos \ncirculantes, sobre todo en aquellas pacientes en estadios más avanzados. En \nestadios tempranos de la enfermedad, se muestra n altos niveles de IgG contra las \nproteínas oncogénicas E6 y E7 del VPH , como resultado de mayor estimulación \nantigénica, con una relación IgG1/IgG2 disminuida, reflejo del desbalance Th1/Th2. \n(Matsumoto K y col, 1999) En los tumores avanzados, los títulos más elevados son \n\n Introducción \n44 \n \nlos de IgA e IgM, que disminuyen proporcionalmente mientras avanza la \nenfermedad, quizás por el deterioro del sistema inmune. (Bocha-Zavaleta L y col, \n1997; Baay MF y col 1997) \n \nI.12 INFLAMACION Y CANCER \n \nDesde el siglo XIX, se ha establ ecido, con base en distintas observaciones, una \nrelación estrecha entre el cáncer y la inflamación esto debido a que la inflamación, \ncomo parte de la reacción inmunitaria innata contra microorganismos puede dañar \nel DNA, inducir proliferación celular y modular la apoptosis, mecanismos importantes \nen la aparición y progresión del proceso tumoral, regulados por citocinas y \nquimiocinas (Pananá y col., 2009). \n \nLa inflamación es un proceso fisiológico encaminado a la eliminación de \npatógenos dañinos y a la rest auración de la estructura y funciones tisulares. Es un \nproceso multifactorial desencadenado por infecciones bacterianas, víricas entre \notros factores (Tracey, 2002). \n \n Las infecciones no solamente causan necrosis y muerte celular sino que \ninducen directamente a las células hospederas a una división apresurada. En \nmuchas circunstancias esta influencia directa de los agentes infecciosos en la \nproliferación celular, depende de las deficiencias del sistema inmune en el \nhospedero. Varias investigaciones han demostrado que los huéspedes \ninmunocomprometidos, quienes sufren una mayor incidencia de cáncer (Penn I, \n1988). Varias infecciones también han demostrado que la pérdida de la habilidad del \nsistema inmunológico por reconocer antígenos superficiales d e tipo humoral \n\n Introducción \n45 \n \nexpresados en las células transformadas, es un factor permisivo y favorable a la \ncarcinogénesis. Se sabe también que varios agentes virales y también varios \nagentes químicos causan inmunosupresión. La destrucción del sistema de vigilancia \ninmunológica es al parecer el mecanismo más efectivo para explicar, la forma como \nestos agentes son capaces de inducir malignidad. (Schwartz RN, 1975) \n \n La respuesta inmunitaria en el cuello uterino es de marcada relevancia no solo \npor su significado como mecanismo de defensa anti -infeccioso sino por su \nimplicación en la reproducción por su impacto en la fisiología del epitelio cervical y \nen la tolerancia a los espermatozoides. Se ha planteado que las anomalías en la \nregulación del compartimento linfocitario T con especial énfasis en el equilibrio entre \nlas subpoblaciones Th1, Th2 y Th17 puedan participar en la patogenia del paso de \nNeoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) a cáncer extraepitelial. La producción in situ \nde citocinas reviste mayor importan cia que la sistémica y puede determinar \ndiferentes efectos. Así encontramos que de acuerdo al perfil de citocinas es posible \nobtener efectos proinflamatorios, inflamatorios y quimiotácticos. (Giannini SL y col, \n1998) \n\n Introducción \n46 \n \n \nFigura 10 Las alteraciones en los pa trones de expresión y producción de citoquinas Th1 y \nTh2 se implican en la progresión de la displasia y en el desarrollo del tumor. El sistema \ninmunitario posee la capacidad de reconocer a las células que expresan antígenos \nrelacionados con agentes infe cciosos o implicados en el proceso de transformación \nneoplásica \n \n \n \nI.13 INFLAMACIÓN E INFILTRACIÓN LEUCOCITARIA: \n \nLa relación funcional entre inflamación y cáncer no es nueva. En 1863, \nVirchow planteo que el cáncer tiene su origen en los sitios de inflam ación crónica, \nbasado en la hipótesis de que algunas clases de moléculas irritantes en el sitio de \nlesión son causa de inflamación aumentando la proliferación celular. Aunque no está \nclaro que solo la proliferación de células sea causa de cáncer, al manten erse dicha \nproliferación en un ambiente rico en células inflamatorias, factores de crecimiento, \nactividad estromal, y agentes que promueven daños en el ADN, se puede potenciar \nel riesgo neoplásico. (Devorak H, 1986) \n\n\n Introducción \n47 \n \nHoy en día está claramente establecido que la proliferación celular por sí sola no \nconstituye la causa principal para la aparición del cáncer. Sin embargo, la \nproliferación celular sostenida en un ambiente rico en células inflamatorias, factores \nde crecimiento, activación del estroma y de los ag entes que promueven el daño al \nADN, ciertamente potencian o elevan el riesgo de originar la aparición de las \nneoplasias. \n \n \n \nFigura 11 El proceso inflamatorio se inicia tras una infección o injuria en el tejido, se \nproduce migración de leucoitos, activació n de células y expresión de mediadores químicos. \nCarrero Y, 2012. \n \n \nEl proceso inflamatorio puede cursar como una reacción aguda o como una \ncondición crónica, y esto está determinado por la persistencia o eliminación del \nfactor desencadenante. Si este factor deja de actuar la inflamación puede resolverse \ncon la remoción del exudado y de los detritos celulares que son fagocitados por \nmacrófagos, restituyéndose la normalidad en la zona afectada. (Espinosa J, 2006) \n \nLa migración de leucocitos desde el torrente circulatorio hasta un tejido \ndeterminado es un proceso muy regulado en el que participan de forma orquestada \n\n\n Introducción \n48 \n \nmuchas proteínas: selectinas, integrinas, moléculas de adhesión, quimiocinas, \ncitoquinas, metaloproteasas, entre otras (Pello y col., 2006). \n \nDurante la lesión del tejido asociado a una herida, la célula se esfuerza en \nproliferar mientras que el tejido se regenera; la proliferación e inflamación \ndisminuyen una vez que el agente que lo provocó es controlado o la reparación del \ndaño se completa. Por e l contrario, las células en proliferación que tienen un daño \nsostenido del ADN que genera mutaciones o cambios genéticos (células iniciadas) \ncontinúan proliferando en el microambiente rico en células inflamatorias, factores de \ncrecimiento, aparición de onc ogenes e inhibición de factores supresores del tumor \nque estimulan su proliferación aberrante y desarrollan un tumor en estas células \n(Croce, 2008). \n \nSi persiste el estímulo agresor, se transforma el proceso en una condición \ncrónica. Los focos de inflamaci ón crónica contienen mayor número de macrófagos \nm1 y 2 y linfocitos y menos leucocitos neutrófilos que los de inflamación aguda y \ngeneralmente se comprueba activación y proliferación de fibroblastos que sintetizan \ncolágeno, sino se resuelve la inflamación crónica pueden producirse lesiones que \nvan desde NIC I a NIC III y posteriormente generar un carcinoma invasivo. \n\n Introducción \n49 \n \n \n \nFigura 12 Ante un daño tisular se inicia el proceso de infiltración leucociaria y la expresión \nde citocinas, las cuales modularan o instal aran un proceso inflamatorio persistente En el \npredominio de uno u otro efecto de esta acción ambivalente del sistema inmunitario \ninflamatorio existen diversos factores hasta la actualidad no bien caracterizados. Pero es \nclaro que la producción de citoqui nas, factores de crecimiento y la inducción de \nangiogénesis por las células inmunitarias pueden favorecer la progresión tumoral. Carrero Y, \n2012 \n \n \n \nEn una descripción general, la inflamación resulta de la interacción de \ncomponentes plasmáticos y celulares que originan cambios del flujo sanguíneo local, \nmovilización de leucocitos, activación de células del tejido conectivo y formación de \nuna serie de sustancias de diverso origen y estructura molecular que actúan como \nmensajeros moduladores (mediadores químic os de la inflamación). (Cohen SM y \ncol, 1991) \n \n\n\n Introducción \n50 \n \n En cuanto a las manifestaciones vasculares, dos son los principales cambios \nobservables: cambios del calibre de los vasos y del flujo sanguíneo y cambios de la \npermeabilidad de los vasos. Puede observarse un a vasoconstricción transitoria \nbreve, seguida de dilatación mantenida de las arteriolas que producen marcado \naumento del flujo sanguíneo (hiperemia). Al aumentar la presión de perfusión, \naumenta la cantidad de líquido que sale de los capilares, produciendo un edema \nlocalizado. (Cohen SM y col, 1991) \n \nNormalmente la pared endotelial de los capilares y vénulas forma una barrera \nsemipermeable que permite el libre movimiento de agua y de moléculas pequeñas \ndisueltas en ellas, pero restringe el paso de macromolé culas como las proteínas \nplasmáticas (ultrafiltración), cuando a la vasodilatación e hiperemia se agrega este \ncambio a la permeabilidad se está frente a las transición desde una respuesta \nfisiológica a una patológica, y el liquido rico en proteínas que fil tra no se reconoce \ncomo trasudado sino que se denomina exudado. (Cohen SM y col, 1991) \n \nSe produce ultrafiltración a través de las zonas de unión intercelulares, la \npermeabilidad puede aumentar cuando el agente agresor produce lesión directa de \nla pared va scular. En tal caso la lesión puede afectar indiscriminadamente a todo \ntipo de vasos (arteriolas, capilares, vénulas), esta es una respuesta activa al efecto \nde mensajeros químicos específicos que actúan sobre estas células. (Cohen SM y \ncol, 1991) \n \nEn la c irculación normal los leucocitos, como los eritrocitos, circulan \nsuspendidos en el plasma sanguíneo en un flujo laminar central, sin contacto directo \ncon la superficie endotelial de los vasos, la dilatación local de las vénulas \n\n Introducción \n51 \n \npostcapilares y el aumento d e la filtración capilar disminuyen la velocidad de la \ncirculación y producen un flujo turbulento. Esto induce la marginación de los \nleucocitos ue se desplazan arrastrados por la circulación “rodando” sobre el \nendotelio, este proceso suele denominarse “rol ling” favorecido por la presencia en la \nsuperficie de la membrana citoplasmática de los leucocitos y de las células \nendoteliales de proteínas llamadas selectinas que producen una débil adhesión \nfrenando la velocidad del rolling de los leucocitos. (Cohen SM y col, 1991) \n \nSi en este rodar a lo largo de la pared vascular, los receptores de los \nleucocitos captan la señal de una sustancia quimiotáctica, se activan induciendo un \naumento de la afinidad de otro tipo de proteínas de adhesión de los leucocitos \nllamadas integrinas, que se fijan firmemente a los ligandos del endotelio deteniendo \nel desplazamiento de los leucocitos, en este momento los vasos dan una imagen \nde estar tapizados por una capa de leucocitos adheridos lo que se ha designado \n“pavimentación leucocitaria” de los vasos. (Cohen SM y col, 1991) \n \nLos factores quimiotácticos son moléculas solubles que, difundiendo \npasivamente desde su sitio de producción, activan la adhesividad de las integrinas, \nestimulan la motricidad de los leucocitos e inducen su m igración, orientada en el \nsentido de la gradiente creciente de concentración de las moléculas quimiotácticas. \n(Cohen SM y col, 1991) \n \nUna vez adosados a la superficie endotelial, siguiendo las señales \ndireccionales proporcionadas por los factores quimiotác ticos y usando las integrinas \npara su fijación y tracción, los leucocitos se desplazan y atraviesan la pared de los \ncapilares y vénulas postcapilares, extendiendo seudópodos a través de las uniones \n\n Introducción \n52 \n \nintercelulares del endotelio vascular (diapédesis). Fina lmente cruzan la membrana \nbasal ingresando al intersticio y concentrándose en esa zona (infiltración \nleucocitaria). (Cohen SM y col, 1991) \n \nLa infiltración del linfocito está a menudo presente en las lesiones cervicales, \nreflejando posiblemente una inmunor espuesta en curso (pero ineficaz) al tumor, los \nlinfocitos B son los linfocitos predominantes que infiltran en las lesiones cervicales \npre-malignas, se encargan de la inmunorespuesta del anfitrión a la infección activa \ndel papilomavirus (VPH). Aunque las células B se detectan con menor frecuencia en \ntumores cervicales, sigue habiendo un número elevado de células terminales \nidentificadas en plasma que expresan la inmunoglobulina tumor -especifica (Ig). La \nespecificidad del antígeno y la significación funciona l de la respuesta del anticuerpo \na los tumores cervicales es desconocida. (O' Brien PM y col, 2001) \n \nLas células tumorales producen varias citocinas y quimiocinas que atraen una \ndiversa población de leucocitos, por ejemplo neutrófilos, células dendríticas, \nmacrófagos, eosinófilos, linfocitos, y otras células los cuales son capaces de \nproducir una variedad de citocinas, mediadores citotóxicos incluyendo especies \nreactivas del oxigeno, serina y cisteína proteasas, MMPs, agentes perforantes de \nmembranas, media dores solubles de células asesinas, factor de necrosis tumoral -\nalfa, interleucinas e interferones \n \nEl número y tipo de leucocitos presentes en la infiltración se relaciona con las \ncitocinas producidas por las células del tumor y por las estromales localiz adas en el \nsitio del tumor. En tumores de mama, cervicales, y pancreáticos, así como \nsarcomas y gliomas se producen citocinas que son mediadores importantes de \n\n Introducción \n53 \n \nmacrófagos e infiltración de linfocitos en cáncer ovárico. (Balkwill, F y col, 2001; \nBottazzi, B y col, 2983) Las citocinas son importantes para la infiltración de las \ncélulas de T CD8+ y macrófagos. (Negus RPM y col, 1997) \n \nLos neutrófilos son las primeras células en llegar a los sitios de infección, \ndonde pueden expresar quimiocinas y proteasas que pueden alternadamente \nreclutar las células inmunes no específicas y específicas. Los neutrófilos pueden \ntambién liberar los gránulos tóxicos contra las células vecinas, sugiriendo también su \npotencial actividad anti -tumoral. Sin embargo, se ha demostra do en varios modelos \ndel trasplante de neoplasia que los neutrófilos asociados al tumor pueden estimular \nla angiogénesis vía la producción de factores proangiogenicos, incluyendo VEGF, IL-\n8, y ciertas proteasas tales como MMPs y elastasas, así como también pueden \nfacilitar la metástasis. (Halliwell B y col, 2003) \n \n Los monocitos/macrófagos son los principales componentes de los infiltrados \ninflamatorios en tumores en este entorno, suelen desplegar un fenotipo M2, con \npropiedades pro -tumorales que promueven la angiog énesis, el remodelado de la \nmatriz y la supresión de la inmunidad adaptativa. Los macrófagos asociados a \ntumores (TAM, del inglés tumor -associated macrophages) se originan a partir de \nmonocitos circulantes. Su reclutamiento y supervivencia in situ está propiciada por la \nproducción de citocinas y quimioc inas que interactúan con sus receptores (Balkwill \ny Mantovani, 2001). \n \nLos linfocitos también pertenece n a la población de leucocitos que se \nencuentran en el cáncer. Los linfocitos T activados pued en contribuir a la patogenia \nde la enfermedad neoplásica por liberación de proteasas, factores angiogénicos, y \n\n Introducción \n54 \n \nquimiocinas de la clase CC y CXC. La infiltración de linfocitos a menudo está \npresente en las lesiones cervicales, reflejand o posiblemente una re spuesta activa \npero ineficaz contra el tumor (Balkwill, 2011). \n \nLa infiltración leucocitaria como consecuencia de la producción de estas \ncitocinas, puede modular la diseminación del cáncer, bien sea promoviéndolo (daño \noxidativo del ADN) o bien sea inhibié ndolo (Natural Killer, Linfocitos T Citotóxicos) . \nEstas células infiltrantes y las células intrínsecas del cuello pueden ser el origen de \nun metabolismo oxidativo aumentado, que puede modular el crecimiento tumoral . \n(Negus RPM y col, 1997) \n \nEl infiltrado i nflamatorio tumoral relacionado con el carcinoma cervical está \nformado por linfocitos, macrófagos y eosinófilos, estos últimos ocupan el 40 % del \ninfiltrado. Ciertas interleuquinas como la IL5, e indirectamente la IL4, tienen efecto \nen la quimiotaxis de lo s eosinófilos. Además de la producción de interleuquinas por \nlas células tumorales, los linfocitos T y los macrófagos producen estas interleuquinas \nlo que induce a pensar que el infiltrado de eosinófilos refleja una respuesta Th2 . \n(Negus RPM y col, 1997) \n \nEs evidente que las células inflamatorias tienen potencial efecto en el \ndesarrollo del tumor. En los procesos neoplásicos tempranos, estas células son \npromotores de tumores produciendo un aumento del crecimiento tumoral, facilitando \nla inestabilidad genómica y promoviendo la angiogénesis \n \n \n\n Introducción \n55 \n \n1.14 CITOCINAS Y SU PARTICIPACION EN LA RESPUESTA INMUNITARIA E \nINFLAMATORIA EN CUELLO UTERINO \n \n La respuesta inmunitaria e inflamatoria o el crecimiento y diferenciación de \ndiversos tipos celulares, están mediados por s ustancias proteicas producidas por \ndiversos tipos de células que c onstituyen el grupo de las citoqu inas, las cuales se \ncaracterizan por actuar sobre diversos tejidos y producir múltiples efectos biológicos \n(Abbas A, 2000, Aguzzi , 2005, Gosain, 2005). \n \nLas Citoquinas son moléculas de bajo peso molecular, normalmente entre 15 -\n30 KDa, constituidas por 120-180 aminoácidos con funciones muy variadas pero que \npredominan aquellas orientadas a regular los distintos componentes celulares de la \nrespuesta inmunitar ia. Aunque en general están producidas po r leucocitos, \ndeterminadas citoqu inas pueden también ser secretadas por otros muchos tipos \ncelulares. \nLa expresión de la mayoría de las citoqu inas está estrictamente regulada. En \ngeneral, no se detecta una producci ón constitutiva significativa de estas moléculas, \nsiendo necesaria la activación cel ular para que se produzcan citoqu inas en \ncantidades suficientes para ejercer sus efectos bio lógicos. La mayoría de las \ncitoquinas son secretadas al espacio extracelular, mu chas de ellas en forma \nglicosilada que incremen ta su estabilidad y solubilidad (Abbas A, 2000). Las \nquimiocinas se producen tanto por las células estromales (fibroblastos, células \nendoteliales y leucocitos infiltrantes) y por el propio tumor. En el microam biente \ntumoral las quimiocinas son reguladores esenciales de los niveles de tumor e \ninfiltración de leucocitos. La expresión de las quimiocinas, por lo tanto, es una \n\n Introducción \n56 \n \nventaja potencial de las células tumorales y puede dotarlos de mayor capacidad para \nproliferar y diseminarse (Allavena y col, 2005). \n \nEl equilibrio en la producción de citocinas en cualquier tumor es crítico y se \nrelaciona con el tipo y grado inflamatorio; la producción abundante de citocinas pro -\ninflamatorias puede conducir a un nivel de inf lamación que estimule la angiogénesis \nfavoreciendo el crecimiento neoplásico. Así mismo, los altos niveles de monocitos \ny/o la infiltración del neutrófilos, en respuesta a un equilibrio alterado de las citocinas \nanti-inflamatorias se pueden asociar con la regresión de la citotoxicidad y la \nangiogénesis del tumor. (Coussen L, 2002) \n \nLas citocinas producidas por las células tumorales son generalmente \nangiogénicas. La angiogénesis promueve el crecimiento y la supervivencia del \ntumor e influencia la migración de la célula y la metástasis del cáncer. La infiltración \nde leucocitos circulantes al tumor es facilitada obviamente por actividad angiogénica, \npero puede ocurrir también la extravasación y la migración en el tejido fino \ncircundante. (Balkwill F, 2003; Balkwill F, 2004) \nLas citoqu inas ejercen un efecto autocrino cuando se unen a receptores \npresentes en la propia célula productora. También pueden tener un efecto paracrino, \nactuando sobre diferentes tipos celulares que se encuentran en su vecindad. En \nalgunos casos pueden liberarse a la circulación sanguínea o linfática, ejerciendo su \nefecto en otros órganos y tejidos, actuando así como las hormonas , de forma \nendocrina. \nDos importantes caracter ísticas funcionales de las citoqu inas son su \npleiotropismo, de tal manera que una misma citoqu ina es capaz de ejercer efectos \n\n Introducción \n57 \n \nbiológicos diferentes al actuar sobre distintos tipos celulares, y su redundancia, es \ndecir, que varias citocinas pueden contribuir al desarrollo de la misma función en un \ndeterminado tipo celular (Aguzzi, 2005,Hunter C, 2005). \nUna consecuencia de estas propiedades es que, en a usencia de una \ndeterminada citoquina, sus funciones pueden ser reemplazadas total o parcialmente \npor otras. Muchas de estas caracte rísticas biológicas de las citoqu inas se pueden \nexplicar por la estructura y amplia distribución celular de sus recepto res (Hunter C, \n2005). \nLas acciones de las citoquinas se engloban dentro de un sistema o red \nfuncional, donde el efecto de una molécula está estrechamente regulado, positiva o \nnegativamente, por otras moléculas del sistema . Así, la secreción de una citoqu ina \npuede estar inducida, potenciada o inhibi da por otra citoqu ina que, a su vez, puede \nincrementar o inhibir la expresión de sus receptores (Hunter C, 2005). \n \nCitoquinas Nomenclatura \nFactores transformadores de \nla diferenciación celular \nEGF,PDGF,FGF acido y básico, \nNGF,NT3,BDNF,CNTF,TGF alfa y beta,OSM y HGF \nInterleucinas IL1,IL2,IL3,1L4,IL5,IL6,IL7,IL8,IL9,IL10,IL11,IL12-23 \nFactores Estimuladores de \ncolonias \nGM-CSF,G-CSF,M-CSF, SCF, EPO,LIF \nFactores de Necrosis Tumoral TNF alfa y beta \nInterferones IFNs alfa, gamma,beta \nQuimioquinas IP10,ELR,SDF1,IL8,GRO alfa y beta, NAP-2,MIG, \nENA-78,GCP-2 \n MIP1alfa y beta, RANTES,CPP1,2,3,4 \n \nTabla 2 Clasificación y nomenclatura de las citocinas \n\n Introducción \n58 \n \nLa respuesta inmunitaria del hospedador ante la infección por VPH ha sido \npoco estudiada. Las células Natural Killer (NK) y macrófagos están presentes en la \nmayoría de lesiones, sin embargo células de cáncer cervical y líneas celulares VPH \npositivas son resistentes a las NK. (Moss RB y col, 2004) El inicio de la inmunidad \nespecífica está mediada por una combinación de mecanismos humorales y \ncelulares; En la respuesta celular ocurre la activación de los linfocitos T \n(colaboradores CD4+ y cito tóxicos CD8+) a través de las CPA, que provocan su \ndiferenciación (Torres J , 1996) . Los linfocitos TCD4+, se han clasificado en dos \nsubtipos denominados Th1 y Th2, los cuales pueden ser diferenciados a través de \nun panel de expresión de mediadores solubles como son las citocinas. Así, las \ncélulas Th1 expresan IFN - , IL-2 y TNF- , mientras que las células Th2 expresan IL -\n4, IL -5, IL -6, IL -10 e IL -13 responsables del control de la inmunidad humoral o \nproducción de anticuerpos. Según indica el denominado parad igma Th1/Th2, las \ncitocinas participan además como un mecanismo de regulación, interactuando entre \nsí, de manera que el IFN - inhibe la proliferación de células Th2 y la IL -10 inhibe la \nproliferación de células Th1. La hipótesis predice que una respuesta do minante de \ntipo Th1 o Th2 conlleva a una adecuada respuesta del organismo a determinados \nagentes externos, igualmente en ocasiones, un desequilibrio en el balance entre Th1 \ny Th2 favorece el desarrollo o mantenimiento de algunas enfermedades. (Torres J, \n1996; Cannistra S y col, 1996) \n \nLas células Treg y las células Th17 representan dos estirpes CD4+ \nadicionales identificadas, mientras que Th9 y Th22 son un subconjunto de células \nque han sido descritas más recientemente. Se ha establecido que las citocinas \nproducidas por el perfil Treg actúan como supresoras de la respuesta inmunitaria y \ndiversos trabajos describen las células T reguladoras como potentes inhibidores de \n\n Introducción \n59 \n \nla respuesta inmun itaria antitumoral y que están asociada s con un mal pronóstico \npara mu chos tipos de cáncer . (Josefowicz S y col, 2009; Park H y col, 2007; \nVeldhoeny M y col, 2008; Trifari S y col, 2009) \n \nLos linfocitos TCD8+ participan en la respuesta inmunitaria mediada por \ncélulas y tienen como función reconocer antígenos citosóli cos sintetizados \nendógenamente asociados a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad \n(MHC) clase I en cualquier célula nucleada. La total diferenciación de los linfocitos \nTCD8+ requiere la producción de citocinas por células TCD4+ y/o la expresió n de \nmoléculas coestimuladoras. (Morrison M, 1994; Abbas A y col, 1999) \n \nAnte la presencia viral se activan mecanismos de respuesta inmunitaria \nprovocando la activación de los linfocitos T (CD4+ y CD8+) a través de las células \npresentadoras de antígenos, e sta activación induce a una diferenciación de estos \nlinfocitos hacia una respuesta celular tipo Th1 secretando IL -2, TNF - e IFN - que \ndeterminan una respuesta inmunitaria celular o tipo Th2 que secretan IL -4, IL-5, IL- \n6, IL -10, controlando la inmunidad hum oral o producción de anticuerpos. \n(Zinkernagel RM, 1996) Estas citocinas actúan como señales intercelulares, \ncapaces de regular la respuesta inflamatoria .Es importante señalar que un agente \nviral es capaz de provocar la generación de un perfil individual de secreción de \ncitocinas mientras que otros pueden ser insensibles al control mediado por las \nmismas. (Zinkernagel RM, 1996; Alcami A y col, 2000) \n \nDiversos estudios realizados en mujeres con VPH demostraron la expresión \nde RNAm en la mucosa cervical de citocinas involucradas en la regulación de la \ninmunidad mediada por células. Así mismo se ha evidenciado un patrón de \n\n Introducción \n60 \n \nsecreción tipo Th1 a través de la expresión de IFN - e IL-2, lo que demuestra que la \nrespuesta Th1 está asociada con la presencia del VPH e n tejido cervical. (Abbas A \ny col, 1999) Contrariamente, los estudios del Scott demostraron que la progresión a \ncáncer estaba asociada a una respuesta inmunoregulatoria tipo Th2 donde el \nestudio de biopsias cervicales por técnicas de inmunohistoquímica det ectaron la \nexpresión de IL-4 e IL-6, demostrando la presencia significativamente elevada deIL-4 \nen lesiones premalignas (LIE) de alto grado. (Scott M y col,1999) Estudios en los \ncuales se analizó el RNAm de células productores de IL -4 en biopsias de cuello \nuterino de pacientes, que abarcaron el espectro de, citología normal a cáncer \ninvasor asociado a infección por VPH, encontraron que la proporción de tejidos que \nexpresaron el RNAm de IL -4 aumentó con el grado de la lesión. La probabilidad que \nse detecte el RNAm de esta citocina in situ se encontró significativamente asociada \na la aparición de cáncer cervical (Fernández G y col, 2000) \n \nVarios argumentos sugieren que dentro de las citocinas tipo Th2 que juegan \nun papel importante en la génesis del cáncer cer vical y sus lesiones precursoras, se \nencuentra la IL -6. En tal sentido Moela y col, estudiaron la expresión del RNAm de \nesta citocina en muestras citológicamente normales de pacientes con LIE de bajo, \nLIE de alto grado y con CaCu. Se encontró en todas las muestras con lesión \npremaligna o CaCu asociado a algún genotipo de VPH, la expresión local de IL -6 \nasociada al grado de lesión. (Moela E y col, 2000) Estos resultados apoyan la \nhipótesis de que IL -6 puede tener un papel importante en la evolución de una le sión \npremaligna a maligna ante la infección por VPH. Otros estudios han asociado niveles \nelevados de IL -6 con severidad de lesiones a nivel de cuello uterino, asociado a \nVPH-16. Para ello Tjiong y col estudiaron el nivel de IL -6 en suero y en lavados \ncervicovaginales de pacientes sin lesiones y con lesiones premalignas y malignas \n\n Introducción \n61 \n \npor el método de ELISA. Se encontraron niveles de IL -6 significativamente elevados \na nivel local de las pacientes con carcinoma de cuello uterino comparado con las \npacientes con NIC y controles; lo que sugiere un aumento progresivo del nivel de IL -\n6 a medida que evolucionan las lesiones de cuello uterino hacia la malignidad. \n(Tjiong MY y col, 2001) Estudios han demostrado que los linfocitos T específicos de \nVPH en el microambiente cervical, juegan un papel importante en la historia natural \nde la neoplasia intraepitelial cervical (NIC). Se demostró a través de estudios \ninmunohistoquímicos que el TNF- se expresa constitutivamente en los queratinocitos \nbasales de cérvix normales, pero no en las muestras de NIC de bajo y alto grado, en \nlas cuales se sobre expresa dicha citocina, caso contrario ocurre en los pacientes \ninfectados por VPH. Esto parece corresponderse con una relación entre las citocinas \nestudiadas y la evolución de las lesiones en cérvix. (Mott P, 1996). \n \nPara obtener un mejor entendimiento del rol de las citocinas en el desarrollo \nde las neoplasias cervicales Tjiong y col, en el año 2001, analizaron la presencia de \nIL-12, IL -10 y TNF - en lavados cervicovaginales de pacientes con NIC, cáncer \ncervical y pacientes sanas. Para ello se estudió el RNA mensajero de dichas \ncitocinas y factores de crecimiento en exudado de cuello uterino, encontrándose \nniveles significativos elevados en pacientes con cáncer cervical en comparación con \nlas que presentaron NIC y los controles. (Tjiong MY y col, 2001) \n \nI.14.1 INTERLEUCINA 2 (IL-2) \n \nLa IL-2, es una glicoproteína que induce la proliferación de los linfocitos T de \nmanera autocrina y favorece la expansión clonal de las células que han sido \nimpactadas por el antígeno. Conduce a las células de la fase G1 a la fase de síntesis \n\n Introducción \n62 \n \n(S), permitiendo la producción de IL -2 y la expresión sobre la membrana celular del \nreceptor especifico. También actúa de manera paracrina, ejerciendo su acción sobre \ncélulas vecinas. Es producida por los linfocitos Th1 (TCD4+) y en menor cantidad \npor las células TCD8+, NK y macrófagos (Mott P, 1996). Las acciones de la IL -2 se \nejercen sobre los linfocitos T, como principal factor de crecimiento autocrino, lo cual \nconduce a una expansión de la respuesta inmunitaria cuya magnitud puede ser \nestimada por determinación de sus niveles. También posee actividad para inducir la \nsíntesis de IFN- y linfotoxinas y es capaz de programarlos hacia la apoptosis. Actúa \ncomo factor de crecimi ento y diferenciación para las células NK, linfocitos B, puede \nactivar a los macrófagos y neutrófilos. Sobre los linfocitos B estimula la síntesis y \nsecreción de anticuerpos pero no induce cambios en el isotipo secretado. Las \ncélulas NK, son estimuladas cu ando existen altos niveles de IL -2 capaces de unirse \na receptores de tipo, lo que induce la producción de IFN - y potencia la acción \ncitolítica de estas células generando las llamadas células LAK (lymphokine activated \nkiller cells) (Mott P, 1996). La acción de la IL-2 sobre las células T está mediada por \nla unión a proteínas receptoras de IL -2, hay dos proteínas de superficie en las \ncélulas T que se unen a la IL -2, la primera IL-2 es un polipéptido que aparece tras la \nactivación de las células T, la unión de la IL-2 a las células que expresan únicamente \nIL-2 no produce ninguna respuesta biológica detectable, la segunda proteína \nligadora de la IL -2 es la IL -2 , la afinidad de la unión de la IL -2 a este receptor es \nmayor que al IL -2 . IL-2R se expresa de manera coordinada con un péptido llamado \ncadena común (c) y forma un complejo llamado IL -2Rc (Filella X y col, 1999) . Ha \nsido descrito que los niveles de IL -2 y su receptor, en procesos tumorales pueden \nencontrarse elevados. Al aumentar la IL -2, se eleva el núme ro de linfocitos, células \nNK, LAK y aumenta el nivel de TNF - sérico. Análisis de resultados de estudios \nclínicos realizados por Ung y col, revelan que existe una asociación positiva entre el \n\n Introducción \n63 \n \nreceptor de IL -2 y la neoplasia cervical en paciente con lesiones preneoplasicas \n(Ung A y col, 1999). \n \n1.14.2 INTERLEUCINA 10 (IL-10) E INTERLEUCINA12 (IL12) \n \nLa IL -10 es producida por los linfocitos Th2, los timocitos fetales activados, \nmacrófagos, linfocitos B normales y los queratinocitos. La IL -10 posee acciones \npleiotrópicas, tiene efecto inmunosupresor y en otros casos estimulador. Tiene \nacción reguladora de la actividad de los linfocitos Th1, inhibiendo la producción de \nINF e IL-2, sin embargo en la actualidad se estima que la activación sería un efecto \nindirecto, dado que la activación primaria se ejercería sobre los macrófagos \npreviniendo la producción de IL -12. La IL -10 puede regular la expresión de \nmoléculas del MHC clase II y es un potente inmunosupresor de la actividad de los \nmacrófagos. Sobre estas células es capaz de suprimir la producción de PGE2 \n(prostaglandina E2), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IL-6, IL-12) y de moléculas \nde adhesión (ICAM -1 y B7). También favorece la expresión de CD64, hecho que \npermite un aumento en la actividad de citotoxici dad dependiente de anticuerpos \n(ADCC) ejercida por los macrófagos. Dado que la IL -10 favorece la proliferación de \nlos linfocitos B y la secreción de IgA, IgG1 e IgG3 tendría fundamental importancia \nen el desarrollo de la respuesta inmunitaria humoral (Filella X y col, 1999). Estudios \nrealizados por Mota y col, evaluaron la detección de IL-10 encontrándose ausente en \nel epitelio normal, pero se expresó en lesiones de bajo y alto grado. (Al-Saleh W y \ncol, 1998). Los estudios de Al-saleh demostraron que la progresión a cáncer estaba \nasociada a una respuesta inmunoregulatoria tipo Th2 (Al-Saleh W y col, 1998) . \nApoyando lo descrito por este autor, existen resultados de diversos estudios que \navalan la hipótesis una secreción preferencial de citocinas de tipo Th2 que modulan \n\n Introducción \n64 \n \nnegativamente la respuesta inmunitaria celular, y favorece así el desarrollo del tumor \n(Atilla L y col, 1996; Al-Saleh W y col, 1998). \n \nLa IL -10 es ampliamente conocida como una citocina inmunoreguladora en \nvirtud de su capacidad para inhibir l a presentación antigénica dependiente de \nmacrófago, proliferación de células T y el patrón de células Th1. Sin embargo hay un \nestudio que ha cambiado la percepción de la IL -10 sólo como citocina \ninmunosupresora. Como parte de una investigación en la cual s e estudió la \npotenciación de la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+ ante la presencia del \nVPH en células tumorales, se encontró que la IL -10 era capaz de incrementar la \nproducción de citocinas Th1 e incrementar el potencial citotóxico de las célu las T \nCD8+ ante la presencia del VPH (Satin P y col, 2000). Un estudio determinó el perfil \nde citocinas en secreciones del tracto genital de adolescentes femeninas infectadas \ncon el VIH, VPH y otros patógenos trasmitidos por vía sexual, y evidenció que en \npacientes VIH -positivas los niveles de IL -10 e IL -12 se encontraron elevados, en \ncomparación con las VIH-negativas, mientras que la concentración de IL -12 no varió \nsignificativamente. La coinfección de VIH y VPH llevó a un aumento de IL -10; \nmientras que la coinfección de VIH con VPH u otros microorganismos de transmisión \nsexual llevó a un incremento de los niveles de IL-12. Se pudo evidenciar la influencia \nque tiene la infección por VIH con otros patógenos, ya que influyen en la \nconcentración local de algun as citocinas inmunoreguladoras (Crowley-Nowic P y \ncol, 2000). \n \nPara obtener un mejor entendimiento del papel de las citocinas en el \ndesarrollo de las neoplasias cervicales, estudios previos analizaron la presencia de \nIL-12, IL -10 y TNF - en lavados cervico vaginales de pacientes con NIC, CaCu y \n\n Introducción \n65 \n \npacientes sanas, encontrándose niveles significativamente elevados de IL -10 en \npacientes con cáncer cervical al compararlos con las que presentaron diferentes \ngrados de NIC y tejido sano (Giannini, S y col, 1998 ). Se ha observado que la \npresencia de IL-10 se incrementa en paralelo con la severidad de la displasia con un \nmáximo nivel en lesiones intraepiteliales escamosa de alto grado (Giannini, S y col, \n1998). \n \n1.14.3 INTERFERON (IFN) \n \nLa familia de los interferones ag rupa una serie de citoquinas con \nactividad antiviral secretadas por las células en respuesta a diferentes estímulos, \npotencian la respuesta Th1 y fueron las primeras citoquinas usadas \nterapéuticamente. Se agrupan en dos grandes categorías en función de su \nsecuencia de proteínas, población productora y uso de receptores: interferones tipo I \n ue incluye IF β , IF ω, IF ϰ, IF ε , interferones tipo II que únicamente incluye el \nIFNγ y de tipo III el IF λ con tres isoformas (Aguzzi A, 2005, Smith P L, 2005). \n \nEl IFN- producido por leucocitos tiene efecto antiproliferativo sobre células in \nvitro, eleva el potencial lítico de las células NK y aumenta la expresión de MHC clase \nI. El IFN - activa macrófagos y células NK, regula positivamente la expresión de \nmoléculas MHC clase I, lo que ayudaría a estimularla inmunidad antitumoral (Alcami \nA y col, 2000). \n \n \n \n \n\n Introducción \n66 \n \n1.14.4 INTERLEUCINA 4 (IL4) \n \nLa IL -4 es una glicoproteína producida por los linfocitos T colaboradores \n(Th2), células cebadas y las células del estroma de la médul a ósea. La IL -4 se \ncaracteriza porque promueve la multiplicación de linfocitos B en reposo y forma \nparte, lo mismo que la IL-5 e IL-6 de las citocinas del patrón Th2. La IL-4 actúa sobre \nactividades biológicas de los macrófagos y pueden inhibir la producci ón de TNF - . \nAsí mismo antagoniza la activación de los macrófagos por el IFN Cuando esta \ncitocina se añade a cultivos de LT activados, deprime la síntesis de IL -2 y de IFN \n(Motta F y col, 1999). \n \nI.14.5 INTERLEUCINA 6 (IL6) \n \nLa IL -6 fue conocida inicialmen te como el Factor que estimula la \ndiferenciación de los linfocitos B para que inicien la producción de inmunoglobulinas \n(BCDF). Para que la IL -6 estimule la diferenciación de los LB se necesita que otras \ncitocinas IL-2, -4 y -5 hayan estimulado previamente su multiplicación. Esta citocina \nha sido asociada con el crecimiento de tumores y es el principal regulador de los \ngenes que codifican para la síntesis de las proteínas en fase aguda. De este modo la \nIL-6 participa en la inducción de las reacciones inflam atorias que se necesitan para \ncontrolar las infecciones (Motta y col, 1999). \n \nI.14.6 FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TNF) \n \nEl TNF es una citocina pro -inflamatoria que comparte muchas de las \nactividades biológicas con la IL -1 e IL -6. Esta citocina a pesar de no ser producida \n\n Introducción \n67 \n \npor linfocitos T (CD4+ o CD8+) sino por los macrófagos principalmente, actúa como \nun modulador de las respuestas de los linfocitos T y B. El TNF se ha visto vinculado \na procesos inflamatorios de tipo premalignos y malignos. Esta citocina con stituye la \nprincipal respuesta ante una agresión por endotoxinas bacterianas y es responsable \nde todas las alteraciones bioquímicas y los síntomas que expresan los pacientes con \nshock endotóxico, lo cual significa que tiene un espectro muy amplio de activ idades \nbiológicas. En líneas generales el TNF actúa como modulador de las respuestas de \nlos linfocitos T y B. (Motta y col, 1999) \n \nLos linfocitos TCD8+ participan en la respuesta inmunitaria mediada por \ncélulas y tienen como función reconocer antígenos cit osólicos sintetizados \nendógenamente asociados a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad \n(MHC) clase I en cualquier célula nucleada. La diferenciación total de los linfocitos \nTCD8+ requiere la producción de citocinas por células TCD4+ y/o la expresión de \nmoléculas coestimuladoras (Filella X y col, 1999; Abbas A y col, 1999) . En la \nmayoría de los casos, el control local de la infección por VPH se realiza por la \neficiente respuesta del sistema inmunitario. Sin embargo, en las lesiones de alto \ngrado, y de carcinoma in situ e invasor, tienen lugar diversas alteraciones en los \nsistemas de presentación antigénica celular, así como falla en el sistema de \nrespuesta de linfocitos T CD4+ y CD8+, que impide la regresión o el control de estas \nlesiones (Torres J, 1996). \n \nI.14.7 FACTOR DE CRECIMIENTO TRANSFORMANTE BETA 1 (TGF -β1) \n \nEs una proteína homodimérica de aproximadamente unos 28 Kd, la cual debe \nser activada por proteasas extracelulares. Tanto las células T activadas por el \n\n Introducción \n68 \n \nantígeno como los fagocitos mononucleares activ ados por lipopolisacaridos (LPS) \nsecretan un TGF -1 biológicamente activo. Esta molécula es reconocida por su \ncapacidad de inhibir proliferación celular en la fase G1 del ciclo celular. Esta \ninhibición es realizada mediante la inducción de inhibidores de ci nasa dependientes \nde ciclinas como p27, que evita la formación de las proteínas Rb a factores de \ntrascripción como E2F, necesarias para la progresión a la fase de síntesis de ADN. \n(Zinkernagel, R, 1996). \n \nEl TGF se caracteriza por su papel antagónico en mu chas de las respuestas \nde los linfocitos, inhibe la proliferación de las células T frente mitógenos \npoliclonales, inhibe la maduración de los CTL y macrófagos, actúa sobre leucocitos \npolimorfonucleares y células endoteliales, contrarrestando de nuevo los efectos de \nlas citoquinas proinflamatorias, en este sentido es una anticitoquina y puede actuar \ncomo señal de interrupción de las respuestas inmunitaria e inflamatoria \n(Zinkernagel, R, 1996). El TGF no tiene una acción completamente intrínseca, sino \nsirve como un mecanismo para el acoplamiento de las células a su entorno, de tal \nmanera que las células tienen la capacidad para responder apropiadamente a los \ncambios en su medio ambiente o cambios en su estado de diferenciación. Esto \nsignifica que la multifun cionalidad del TGF está acompañada por un aumento de su \nexpresión por la activación de sus receptores, por su vía de traducción de señales \nque induce y por la regulación del ciclo celular, todo esto puede aumentar o inhibir \nlas actividades de las diferente s poblaciones celulares. Estudios demostraron en \nmodelos murinos tanto in vitro como in vivo, la estimulación de la IL -10 por parte del \nTGF -1, un incremento en la respuesta Th2 y una disminución del tipo Th1, estas \nevidencias apoyan la idea de que los tum ores son capaces de producir TGF -1 y, en \n\n Introducción \n69 \n \nconsecuencia inducir el desarrollo de mecanismo de escape de la vigilancia \ninmunitaria (Peralta-Zaragoza O y col, 2001) \n \nI.14.8 FACTOR ESTIMULADOR DE COLONIAS GRANULOCITO MACRÓFAGO \n(GM-CSF) \n \n El GM-CSF es producido por linfocitos T activados y por otras células como \nfibroblastos, células endoteliales y monocitos. Es un polipéptido con varios posibles \nlugares de glicosilación. Induce la proliferación de los progenitores de granulocitos y \nmacrófagos, produciéndose en respuesta a estímulos específicos en situaciones que \nrequieren una elevada producción de éstas células. También puede actuar sobre \ngranulocitos y macrófagos maduros El GM-CSF, también promueve la proliferación \nde células madres que aún no se han diferenciado en células sanguíneas (plaquetas \ny progenitores de hematíes), reemplazando a la IL-3. Por otro lado el GM-CSF activa \nleucocitos maduros, imita algunas de las reacciones del IFN - como activador de \nmacrófagos aunque es menos potente. El GM -CSF es capaz de inducir l a síntesis y \nliberación de citoqu inas, como la IL -1 y TNF - por monocitos. Puede estimular la \nproliferación de un número de líneas de células tumorales que incluyen el sarcoma \nosteogénico, carcinomas y adenocarcinoma. Su incremento ha s ido reportado en \npacientes con cáncer de pulmón y en la leucemia mieloide aguda. Su mecanismo de \nacción probablemente sea a nivel local, en los sitios donde es secretado, de este \nmodo el GM -CSF producido por las células T y macrófagos puede intervenir \nprincipalmente en la activación de leucocitos maduros en los lugares donde se lleva \na cabo la respuesta inmunitaria inflamatoria . Por ser un mediador se ha asociado a \nla angiogénesis inducida por macrófagos. La mayoría de los factores angiogénicos y \ncitoquinas son producidos por macrófagos, los cuales incluyen factores de \n\n Introducción \n70 \n \ncrecimiento derivado de las plaquetas, y entre ellos el factor GM -CSF (Bussoolino \nF, 1989, Pascale H, 1999, Pascale H, 2004). \n \nDentro de la extensa familia de citocinas conocidas existe un g rupo de \npequeñas moléculas de estructura sencilla que poseen la capacidad de inducir la \nmigración selectiva de distintos tipos de células inmunitarias, por lo que se han \nrecibido el nombre de quimiocinas. Esta habilidad quimiotáctica fue descubierta por \nprimera vez al identificar que ciertas citocinas eran capaces de inducir la migración \ndireccional de los leucocitos bajo la influencia de una serie de estímulos. Una vez \nsecretadas las quimiocinas se unen a las proteínas de la matriz extracelular del \ntejido donde se han sintetizado, permaneciendo mayoritariamente inmovilizadas y \nsin pasar al torrente sanguíneo, acumulándose y creando un gradiente de \nconcentración que indica la dirección de la migración al lugar donde la célula es \nrequerida, posteriormente se comprobó que también participaban en la migración y \nreclutamiento de otros tipos celulares, incluyendo las tumorales. (García J, 2006) \n \nSe ha demostrado tanto in vivo como in vitro como las células malignas \nneoplásicas expresan de forma especificas uno o más receptores de quimiocinas \nque responde a un gradiente de concentración de sus respectivos ligandos, \nmovilizando la célula tumoral hacia órganos específicos e iniciando la migración \nmetastásica del tumor; cada vez son más los tumores en donde se ha log rado \nestablecer esta relación entre la expresión quimiocinas/receptor y la movilización de \nlas células malignas hacia los lugares metastásicos preferidos. (García J, 2006) \n \n \n \n\n Introducción \n71 \n \nI.15 QUIMIOQUINAS \n \n Las quimioquinas son un conjunto de citoquinas de baj o peso molecular (8 -11 \nkD) con función quimiotáctica producidas por varios tipos celulares (monocitos, \nmacrófagos, linfocitos T, fibroblastos y células endoteliales). Son potentes \nquimioatrayente de los leucocitos y sus funciones proinflamatorias son \nindependiente de la respuesta inmune adaptativa (Barbieri y col, 2009). \n \n El sistema de quimioqu inas ha evolucionado con los vertebrados y hay cerca \nde 50 genes humanos que codifican los ligandos de quimio quinas, con más de 20 \ngenes humanos correspondientes receptores de quimioquinas . Su acción se lleva a \ncabo a través de la interacción con sus receptores específicos, un subgrupo de \nreceptores de transmembrana acoplados a la proteína G, son producidas por u na \ngran variedad de células en respuesta a estímulos exógenos o endógenos (Balkwil \nF, 2011). \n \n Las quimioquinas se dividen en cuatro subgrupo diferentes, CXC, CC, CX3C o \nC, dependiendo de la posición del residuo de cisteína conservado, y el receptor de la \nnomenclatura sigue esencialmente el de las quimiocinas, es decir, las quimiocinas \nCC se unen a los receptores de quimiocinas CC, CXC ligandos se unen a CXC \nreceptores (Balkwill F, 2011). \n \n El subgrupo CC (caracterizados estructuralmente por cuatro cisteínas) cuenta \ncon 28 miembros, llamados CCL1-28 que se unen por lo menos a 10 \nreceptores (CCR1-10). Las quimioquinas CC atraen monocitos, células T, cél ulas \ndendríticas, eosinófilos y basófilos. Las q uimiocinas CC son representativ as \n\n Introducción \n72 \n \nde CCL2 (también llamada proteína quimiotáctica de monocitos, MCP -1), CCL3 \ny CCL4 (proteína inflamatoria de macrófagos MIP-1α y MIP-1β), CCL5 (RANTES) y \nCCL11 (eotaxina) (Barbieri y col., 2009). \n \nEl CXC (grupo en el que un aminoácido está presente entre las dos primeras \ncisteínas), incluye 21 ligandos (CXCL1-21) en su mayoría codificados en el \ncromosoma 4 humano . Las q uimiocinas CXC son capaces de vincular al menos \na 7 receptores (CXCR1-7) y mediar en la quimiotaxis de neutrófilos (Barbieri y col., \n2009). \n \nLas quimioquinas CX3C (tres aminoácidos entre las dos primeras cisteínas) \nson hasta la fecha representadas por un solo péptido, a saber \nCX3CL1/fractalkine, que está codificada en el cromosoma 16 humano , se une al \nreceptor CX3CR1 y regula el tráfico a adhesión de células T (Zlotnik A y col, 2000). \n \nEl grupo C de quimioquinas (que contiene sólo dos cisteínas) consta de dos \nmoléculas (XCL) es decir, XCL1/lymphotactin y XCL2/SCM-1 β, tanto vinculantes \ncomo el receptor de XCR1. Linfotactina, codificado en el cromosoma 1 \nhumano, atrae a los linfocitos, pero no a los monocitos o neutrófilos (Barbieri y col., \n2009). \n \nOtra clasificación, aunque menos estricta, es la que divide las quimioqu inas en \ndos subgrupos funcionales ; las inflamatorias y las homeostáticas (Zlotnik A y col, \n2000). Según Sallusto y colaboradores, las quimioquinas inflamatoria s promueven \nla infiltración de leucocitos a los sitios de inflamación y su expresión es inducible, \nprincipalmente, por citocinas proinflamato rias. Mientras que las quimiocinas \n\n Introducción \n73 \n \nhomeostáticas se expresan constitutivamente y regula n la migración dirigida de los \nleucocitos en los procesos de la hematopoyesis y desarrollo de los órganos linfoides. \n(Sallusto F y col, 2000) \n \nEn relación a los tumores, se ha visto que son las quimioquinas inflamatorias las \nque se encuentran más frecuentemente producidas por las células tumorales \n(Zlotnik A y col., 2000). \n \nAlgunos estudios encontraron que las quimiocinas controlan una variedad de \nactividades biológicas, tales como producción y deposición del colágeno, activación \nde las enzimas que digieren la matriz, estimulación de células e n crecimiento, la \ninhibición de la apoptosis y la prom oción de la neo angiogénesis. (Allavena P y col, \n2005). \n \nSe ha encontr ado que un grupo de quimioqu inas como la MCP-1 actúa de \nforma selectiva sobre poblaciones de monocitos, macrófagos, linfocitos T y basófilos, \nmediante unión a receptores específicos Se piensa que la capacidad de MCP-1 de \nactivar la quimiotaxis sobre estos tipos celulares está relacionada con la inflamación \ncrónica, por otro lado el RANTES, IL -8 parecen desempeñar papeles importantes en \nla mediación de procesos inmu nitarios e inflamatorios en distintas localizaciones. \n(Balentien E y col, 1991) \n \nI.15.1 PROTEINA-1 QUIMIOATRAYENTE DE MONOCITOS (MCP-1) \n \nConocida como MC F (“monocyte chemotactic and activating factor”) o CCL2 \nes el miembro mejor estudiado de la subfamilia β o uimo uinas CC. Tras su \n\n Introducción \n74 \n \nclonación y secuenciación se apreció una gran homología con el gen JE del ratón \nque resultó ser el homólogo d el MCP -1 humano. Existe un solo gen que codifica \npara una proteína monomérica de 76 aa, secretada en dos formas de 9 y 13 kDa, \nambas c on idéntica actividad in vitro . MCP -1 actúa de forma selectiva sobre \npoblaciones de monocitos, macrófagos, linfocitos T y basófilos, mediante unión a \nreceptores específicos. Se piensa que la capacidad de MCP -1 de activar la \nquimiotaxis sobre estos tipos celulares está relacionada con la inflamación crónica. \n(Domínguez F, 2003) \n \nEstudios utilizando un modelo de ratón por Muller y col sugieren que el patrón \nde metástasis en el cáncer de mama es producido en parte por las interacciones \nespecíficas entre la quimiocina CXCR4 y su ligando SDF -1/CXCL12; la actividad \nmetástasis de las células de este tipo de cáncer a los órganos bla nco (médula ósea, \nhígado, pulmón y los ganglios linfáticos) puede ser neutralizada por anticuerpos anti -\nCXCR4. La participación de CXCR4 en las metástasis no solo se limita al cáncer de \nmama, ya que también se expresa en diferentes líneas celulares tumor ales \n(linfomas, carcinoma de próstata, leucemia mieloide crónica, entre otros). (Muller A, \n2001) \n \nDe igual forma un estudio reciente se investigó como el MCP -1 es el \nmediador de la inflamación sistémica de la hipoxia alveolar. Los experimentos \ndemostraron como la hipoxia alveolar (respiración del O 2 del 10%, en 60 minuto) \nprodujo un aumento rápido (5min) en la concentración del plasma MCP -1 de ratas \nintactas conscientes, pero no en los alveolos de ratas macrófa go-agotadas, de igual \nforma la degranulación ocurrió en ratas intactas hipóxicas, pero no en las ratas \nmacrófago agotadas. Pudiendo determinar que MCP-1 es un agente dominante en la \niniciación de la inflamación sistémica de la hipoxia alveolar. (Abroun S, 2008) \n\n Introducción \n75 \n \nLa presencia de la proteína 1 quimioatr ayente de monocitos (MCP-1 o CCL2) \nha sido demostrada en diversas patologías tanto de naturaleza no maligna \n(arteriosesclerosis, artritis reumatoide, nefropatía diabética, nefropatía lúpica, \nenfermedad intersticial pulmonar, y encefalomielitis experimental autoinmune), como \nmalignas (esófago, páncreas, mama, y ovario), donde su expresión se relaciona \ndirectamente con el grado de infiltración de macrófagos y con la severidad de la \nenfermedad. (Tesch G, 2008; Barbado J y col, 2009; Monti P y col, 2003; Harti D \ny col, 2005; Klaes R y col, 2001) \n \nLa proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1 o CCL2) es esencial para \nel reclutamiento de monocitos, tiene actividad angiogénica y causa también \nproliferación de las células musculares lisas, su receptor es conoci do como CCR2. \nMCP-1 también puede ser quimioatrayente para linfocitos T, basófilos, células NK, y \ncélulas progenitoras. (Tesch G, 2008; Barbado J y col, 2009) \n \nI.15.2 INTERLEUCINA 8 (IL-8) \n \nSu función principal es la atracción de neutrófilos y se produce e n monocitos, \nlinfocitos T, células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos y neutrófilos. Su \nestructura es de 72 aminoácidos y existe una variante de 77 aminoácidos \ndenominada IL8 endotelial debido a que se sintetiza en estas células y su función \nespecífica es atraer neutrófilos que se fijen al endotelio para el inicio de la \ndiapédesis. Además puede atraer linfocitos T, queratinocitos, basófilos, y posee \nactividad angiogénica. (Shaun L, 1999; Coussens L, 2002) \n \n\n Introducción \n76 \n \nAlgunas células tumorales no solo reg ulan la expresión de citocinas que \ncontribuyen con el reclutamiento de células inflamatorias, sino que también usan \nestos factores para promover el creci miento y progresión, algunas de estas \ncitocinas son CXCL1, CXCL2, CXCL3 e IL-8/CXCL8. (Coussens L, 2002) \n \nLa IL -8 inicialmente fue descubierta como un factor quimiotáctico de \nleucocitos, pero recientemente se descubrió que contribuye con la progresión del \ncáncer, posee funciones mitogénicas y angiogénicas. Ha sido detectado en varios \ntejidos de cáncer huma no y su expresión está regulada por varios factores del \nmicroambiente tumoral como la hipoxia, acidosis y oxido nítrico. (Xie K, 2001) \n \nI.15.3 PROTEÍNA INFLAMATORIA DE MACRÓFAGO 1 α (MIP1α) \n \n La proteína inflamatoria de macrófago 1α (MIP -1α) (CCL3), es una proteína \ninflamatoria que actúan sobre macrófagos expresadas en tejidos inflamados por \ncélulas residentes e inflamatorias en respuesta a citocinas proinflamatorias o al \ncontacto con agentes patogénicos . Esta proteína pertenece al grupo CC, el cual se \ncaracteriza por su función proinflamatoria y por producir sus efectos a través de \ncombinaciones diversas de cinco receptores diferentes, localizados en las células T \nactivada, células dendríticas inmaduras y otro tipo de células mononucleares. Esta \nfamilia de quimiocinas promueve la inflamación crónica y respuesta inmune \nadquirida (Lezama P, 2006). \n \nMIP- 1α es una proteína quimiostatica para monocitos, neutrofilo s y células \nT CD8 (Jiménez V y col, 2007), posee una mayor afinidad por los receptores CCR1, \nCCR3 y CCR5 . Se ha demostrado que se expresa en las células de Langerhans y, \n\n Introducción \n77 \n \nque atrae tanto a los CD4 e n reposo y activad os y células CD8 in vitro, lo que \nsugiere un posible papel en el reclutamiento de células inmunes (Mohamadzadeh y \ncol, 1996). \n \nEs un mediador importante de reclutamiento de leucocitos y la activación en una \nvariedad de estados inflamator ios, incluida la infección También tiene la propiedad \nde ser un inhibidor de la proliferación de células madre hematopoyéticas. Otros \nblancos celulares de MIP -1α son las células dendríticas, células NK, basófilos \n(débilmente), y eosinófilos (Zeng X y col, 2003). \n \nI.16 QUIMIOQUINAS E INFLAMACIÓN \n \nLas quimioquinas o citocinas quimiotácticas, son pequeñas proteínas ligadas a \nla hepari na, que direccionan el movimiento de los leucocitos circulantes hacia los \nsitios de inflamación o lesión, por lo cual son consideradas citocinas \nproinflamatorias. Estas son producidas en el transcurso de la respuesta inmunitaria o \ninflamatoria y sirve para movilizar las defensas del organismo, destacando las \nsubfamilias C, CC, CXC, y CX3C. En su mayoría pueden ser secretados por \nmacrófagos activados, aunque con estimulación adecuada también por otras células \nhematopoyéticas. Una infección o daño tisular ind uce la expresión de quimiocinas y \nmoléculas de adhesión que causan a su vez la migración y acumulación de \nleucocitos y monocitos en el foco inflamatorio (Lezama P, 2006). \n \nUna vez que los leucocitos pen etran a los tejidos, las quimioqu inas estimulan la \nmigración de las células hacia un gradien te de concentración de quimioci nas \ncrecientes. Estas interacciones determinan la entrada y acumulación de los \n\n Introducción \n78 \n \nleucocitos en el sitio extravascular de la infección para con trolar y detener la \ninfección, pero en det erminadas ocasiones también puede actuar como factores \npatogénico ya que las quimiocinas también puede ser secretadas por las misma \ncélulas cancerígenas a nivel del foco primario y secundario en este caso actúa de \nforma autocrina/ paracrina participando d irectamente en la proliferación tumoral \ncomo factores de crecimientos y de forma indirecta potenciando la angiog énesis \ntumoral. \n \n \n \nFigura 13 a.- Tejido normal el cual está altamente organizado b.-Carcinoma Invasivo, se \npierde la organización. En la neo plasia asociada a la angiogénesis y linfoangiogenesis se \nproduce un caos en la organización de vasos linfáticos y sanguíneos, donde las células \nneoplásicas interactúan con otros tipos de células y modifican la matriz extracelular. \nCouseens L, 2002. \n \nI.17 QUIMIOQUINAS Y CRECIMIENTO TUMORAL \n \n Desde su descubr imiento, el campo de las quimioqu inas fue fuertemente \nrelacionado con la biología del cáncer. Esta conexión se ilustra por la identificación \n\n\n Introducción \n79 \n \nde proteína quimiotáctica de monocitos -1 (CCL2), en sobrenad antes de cultivo de \nlíneas celulares tumorales (Bottazzi B, 1983) . Milliken y colaboradores, en 2002, \nmediante el análisis del líquido ascítico de cáncer de ovario y células ascitis \nidentificaron la expresión de CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL22, en con junto \ncon sus receptores (a saber, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, y CCR8), a nivel \nde ARNm y proteína. Sin embargo, aún no se ha aclarado completamente una \ncorrelación definida entre este patrón de expresión y los recuentos de células totales \nen la ascitis o la etapa de la enfermedad. (Milliken D y col, 2002) \n \n El papel de las quimioqu inas en la biología tumoral ha sido estudiado \nfuertemente en la última década y se ha analizado la regulación en la atracción de \nleucocitos en el tumor para la promoción de l a supervivencia, proliferación y difusión \nde la célula tumoral (Allavena P y col, 2005). \n \n Las principales funciones biológicas derivadas de la interacción ligando-receptor \ndurante el desarrollo tumoral que han sido descritas son: \n \n Control de la migración selectiva de células tumorales \n Control del crecimiento y proliferación tumoral \n Control de la infiltración leucocitaria tumoral \n Regulación de la angiogénesis \n Estimulación de la adhesión e invasión tumoral \n Manipulación de la respuesta inmune tumoral. (Balkwill F, 2003). \n \n \n \n\n Introducción \n80 \n \nI.18. QUIMIOQUINAS E INFILTRACIÓN LEUCOCITARIA \n \nEn el microambiente tumoral las quimioquinas son reguladores esenciales de los \nniveles de infiltración de leucocitos en el tumor. La capacidad de las quimiocinas \npara mejorar la motilidad de los leucocitos, células endoteliales, y células tumorales \nes un factor clave para determinar el establecimiento y progresión del cáncer \n(Zlotnik A, 2006). La expresión de las quimiocinas, por lo tanto, es una ventaja \npotencial de las células tumoral es y puede dotarlos de mayor capacidad para \nproliferar y diseminarse (Allavena P y col, 2005). \n \nEsta habilidad quimiostática fue descubierta por primera vez al identificar que \nciertas quimioqu inas eran capaces de inducir la migración direccional de los \nleucocitos bajo la influencia de una serie de estímulos proinflamatorios (Butcher, \n2000). Son varios los estudios que han logrado relacionar la presenci a de una \nextensa red de quimioqu inas en el microambiente tumoral producida por la células \nneoplásicas y es tromales con la atracción de linfocitos T que poseen receptores de \nquimioquinas (Levinson y col, 2004). \n \nAlgunos estudios e videnciaron que la presencia de macrófagos y linfocitos en \ntumores sólidos está relaci onada a la producción de quimioqu inas por el tu mor y su \nmicroambiente, como las quimioquinas CC en el cáncer de mama y cérvix (Negus R \ny col, 1997). \n \nLas quimioqu inas CXC atraen neutrófilos y linfocitos, mientras que las \nquimioquinas pertenecientes a la familia CC atraen principalmente monocitos, pero \ntambién pueden atraer a los linfocitos, basófilos y eosinófilos y las familias CX3C y C \n\n Introducción \n81 \n \nactúan sobre monocitos / linfocitos y linfocitos, respectivamente (Allavena P y col, \n2005). \n \nQuimioquinas como CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5 se han observado aumentadas \nen diversos tumores epiteliales y su expresión se correlaciona con mayor infiltración \nde células inflamatorias, que dependiendo de su tipo e intensidad de producción \natraen linfocitos o macrófagos de manera diferente (Fushimi T y col, 2000). Varios \nestudios han indicado que CCL2 de la subfamilia CC, es el principal responsable \npara el reclutamiento de monocitos en el sitio del tumor (Gazzaniga S y col, 2006). \n \n Koizumi y colaboradores indicaron que l as quimioquinas CCL9, CCL2, CCL3, y \nCCL5 inducen la invasión de células cancerosas a través de metaloproteinasas de la \nmatriz producidos por la infiltración de IMC y TAM en el tejido canceroso. (Koizumi \nK y col, 2007) \n \nI.19 CARCINOGENESIS Y DAÑO CELULAR: \n \n Se ha demostrado que los errores en la replicación ocurren por una variedad de \nmecanismos, diferentes a los propios procesos endógenos que ocurren en las \ncélulas. Dentro de los tipos y mecanismos bioquímicos de la carcinogénesis \nimplicados en el daño del ADN tenemos: \n \n \n1.- Daño oxidativo \n2.- Depuración y depiriminación \n3.- Alquilación inapropiada \n4.- Interacción del óxido nítrico con el ADN \n\n Introducción \n82 \n \n5.- Formación exocíclica aductiva \n6.- Defectos en la reparación de las bases mal apareadas (Cohen SM, 1977) \n \nI.19.1 RADICALES LIBRES Y DAÑO CELULAR \n \nSe ha descrito que una lesión celular puede iniciarse durante la reoxigenación \ndebido al aumento de radicales libres del oxígeno por parte de las células \nparenquimatosas, las células endoteliales y los leucocitos infiltrantes (Kuper H y col, \n2000). Se pueden producir aniones superoxido en el tejido reperfundido como \nresultado de una reducción incompleta del oxígeno por las mitocondrias lesionadas o \nbien debido a la acción de oxidasas procedentes de los leucocitos, células \nendoteliales o células parenquimatosas . Los mecanismos de defensa antioxidantes \ntambién pueden estar comprometidos por la isquemia, favoreciendo la acumulación \nde radicales libres. El papel de estos aniones en algunas patologías del aparato \nreproductor femenino está siendo estudiado. Se conoce que pueden afe ctar una \ngran variedad de funciones del aparato reproductor femenino y en grandes \nconcentraciones, pueden desencadenar procesos patológicos. Una lesión celular \npuede iniciarse durante la reoxigenación debido al aumento de radicales libres del \noxígeno por p arte de las células parenquimatosas, las células endoteliales y los \nleucocitos infiltrantes (Larsen WJ, 1993). \n \nLas especies de radicales libres son inestables y altamente reactivas, llegan a \nser estables adquiriendo electrones de los ácidos nucleicos, lí pidos, proteínas, \ncarbohidratos o cualquier molécula próxima causando una serie de reacciones en \ncadena dando por resultado el daño celular (Amaya H y col, 1997) .Se conocen dos \n\n Introducción \n83 \n \ntipos importantes de especies de radicales libres: especies reactivas del oxíg eno \n(ROS) y especies del nitrógeno (RNOS.). \n Las especies reactivas del oxigeno (ROS) causan un extenso daño oxidativo a \nlas bases y al azúcar (desoxirribosa) del ADN. De la acción de estas sustancias se \nobtienen modificaciones del ADN. \n \n Desde el punto de vista genotoxico especies reactivas del nitrógeno revisten gran \nimportancia, ya que su genotoxicidad ha sido plenamente demostrada. Las \nsustancias RNOS, tienen por lo general la propiedad de deaminar las bases del \nADN, que contiene grupos ami noexocíclicos (Zimmermann FK , 1977; Victorin K, \n1994) \n \nSustancia o Compuesto químico Mecanismo de acción \nSuperóxido (O2.-) Causa transiciones de citosina a timina \n Peróxido de hidrógeno (H2O2.-) Causa transiciones dobles CC (citosina) a \nTT (timina) \n Radical oxidrilo (OH.-) Causa transiciones d obles CC (citosina) a \nTT (timina) \nÁcido hipocloroso (HOCl) Causa transversión G - T guanina timina \nOxígeno simple Causa transversión G - T guanina timina \n \nTabla 3 Principales oxidantes y mecanismo de acción de genotoxicidad \n \n \n Los radicales libres de oxigeno más importantes son el anión Superóxido \n(O2), el agua oxigenada (H2O2), el oxidrilo (OH) y las especies del nitrógeno (NO). \nEl más frecuente es el anión superóxido que es extremadamente peligroso porque \ndestruye el oxido nítrico provocando la hipertensión. El primero que hablo de \nradicales libres fue el doctor Hartman, premio Novel en 1995, la biología de los \n\n Introducción \n84 \n \nradicales libres es una rama relativamente nueva que se ocupa de las interaccion es \nentre materias vivientes y radicales libres, el efecto de los radicales libres es similar \nal de las radiaciones, porque el efecto de estas se debe a un 80% a los radicales \nlibres. (Valdez J y col, 1994) \n \nSe pueden producir aniones superoxido (O2-) en el tejido reperfundido como \nresultado de una reducción incompleta del oxígeno por las mitocondrias lesionadas o \nbien debido a la acción de oxidasas procedentes de los leucocitos, células \nendoteliales o células parenquimatosas (Rak J y col, 1996) Los mecani smos de \ndefensa antioxidantes también pueden estar comprometidos por la isquemia, \nfavoreciendo la acumulación de radicales libres. Las moléculas de O2.-, formadas \ndurante el proceso respiratorio y liberadas dentro de los fagolisosomas o liberadas al \nmedio extracelular, pueden reaccionar con el H2 para formar peróxido; H2O2, \nsustancia mucho más oxidante que el O2- y a su vez capaz de reaccionar con el \nóxido nítrico (NO.). Estas sustancias fuertemente oxidantes, pueden reaccionar con \nmetales de transición, ta les como, el hierro férrico (Fe3+++) y el cobre bivalente \ncuproso (Cu2++), los cuales pueden estar ligados al ADN. Si estos metales son \noxidados se forman radicales ferrilos y perferrilos , los cuales son capaces de \nproducir daños extensos al ADN de las células de mamíferos. (Simic MG, 1994) \n \nLas especies reactivas del oxígeno pueden incrementar todavía más la \ntransición de permeabilidad mitocondrial, que impide la generación de energía por \nparte de la mitocondria y la recuperación del ATP celular, causando muerte celular. \n(Day Y. y col, 2005; Hanahan, 1996) La lesión isquémica se acompaña de la \nproducción de citocinas y el aumento en la expresión de moléculas de adhesión por \nparte de las células parenquimatosas y endoteliales hipóxicas. Estos agentes dan \nlugar al reclutamiento de leucocitos polimorfonucleares circulantes hacia el tejido \n\n Introducción \n85 \n \nreperfundido; la inflamación subsiguiente produce una lesión adicional. (Valdez J y \ncol, 2000) \n Un importante mecanismo de lesión a la membrana es la lesión inducida por \nradicales libres, en particular por especies de oxígeno activado. Contribuye a \nprocesos tan variados como la lesión química y por radiación, la toxicidad por \noxígeno y otros gases, el envejecimiento celular, la muerte microbiana por células \nfagocíticas, la l esión inflamatoria, la destrucción tumoral por macrófagos y otros. \n(Giatroman A y col, 1998; Campbell SC y col, 1998) \n \n Los radicales libres son especies químicas que tienen un único electrón no \napareado en una órbita externa. En ese estado, el radical es extremadamente \nreactivo e inestable y reacciona con sustancias químicas inorgánicas u orgánicas \n(lípidos, carbohidratos, proteínas) en especial con moléculas claves de la membrana \ny con ácidos nucleicos. Además los radicales libres inician reacciones \nautocatalíticas, por lo que las moléculas con las que reaccionan se convierten ellas \nmismas en radicales libres para propagar la cadena de lesión. \n \nLas células han desarrollado múltiples mecanismos para eliminar los radicales \nlibres y de esta manera minimizar l a lesión. Los radicales libres son inestables de \nmanera inherente y habitualmente desaparecen de forma espontánea. Por ejemplo \nel superoxido es inestable y desaparece espontáneamente en oxígeno y peróxido \nde hidrógeno en presencia de agua. No obstante, ex isten diversos sistemas \nenzimáticos y no enzimáticos que contribuyen a la inactivación de las reacciones de \nradicales libres, entre ellos se encuentran: antioxidantes y enzimas como la catalasa \ny glutatión peroxidasa. (Amaya H y col, 1997) \n \n\n Introducción \n86 \n \nLos tres tipo s principales de ROS son: anión superoxido, peróxido de \nhidrógeno y oxidrilo. El superoxido se forma cuando los electrones se escapan de la \ncadena de transporte del electrón. La dismutación del superoxido da lugar a la \nformación del peróxido de hidrógeno. El ion del oxidrilo es altamente reactivo y \npuede modificar las purinas y pirimidinas dando como resultado el daño del ADN . \n(Johson DA y col, 1998) \n \n ROS ha estado implicado en más de 100 enfermedades. Tienen un papel \nfisiológico y patológico en la zona reproductiva femenina. Numerosos estudios en \nhumanos y animales han demostrado la presencia del ROS en la zona reproductiva \nfemenina: ovario, trompas de Falopio y embriones, además está implicado en la \nmodulación de numerosas funciones reproductivas y fisiológicas tales como \nmaduración del oocito, esteroidogénesis y lúteolisis . (Tanaka H y col, 2005; Lefer \nAM, 1993) \n \n Los radicales libres tiene n una semivida muy breve ya que es bloqueado por la \nsupéroxido dismutasa o SOD que acelera 10 mil veces la velocidad con la que el O2 \nse transforma en H2O2. \n \nExisten dos formas de SOD: la celular a base de cobre y zinc y la nuclear a base \nde manganeso, y el oxido nítrico (NO) un gas incoloro escasamente soluble en agua \ncon un electrón no apareado en su capa d e valencia externa, lo que lo convierte en \nuna molécula paramagnética con naturaleza de radical libre que participa en \nprocesos fisiológicos y patológicos. (Muller WA, 2002) \n \n\n Introducción \n87 \n \nEn la síntesis del NO una molécula de L -arginina es transportada al interior de l a \ncélula endotelial por un transportador específico, generándose una molécula de L -\ncitrulina y una molécula de NO, todo esto es catalizado por la enzima sintasa del \nNO. (Coleman JW, 2001) \n \n \nFigura 14 Síntesis de Oxido Nítrico. Carrero Y, 2012 \n \n \nPara la síntesis del NO además del sustrato L -arginina, se requiere de la \npresencia de carmodulina y cuatro cofactores: mononucleotido de flavina (FMN), \ndinucleotido de Flavina adenina (FAD), tetrahidrobiopterina (THB) y dinucleotido \nfosfato de nicotinamida adenin a (NADPH), esta reacción puede ser inhibida por \nderivados estructurales de la L -arginina, como la N -monometil-L-arginina (L-NMMA) \ny metilester de N-nitro-L-arginina (L-NAME) entre otros. (Lamontagne D y col, 1992) \n \nEl óxido nítrico es producido en las cél ulas por tres isoformas de la óxido nítrico \nsintasa: \n \n\n\n Introducción \n88 \n \n1. Dos isoformas constitutivas (cNOS) ambas dependientes de calcio: la isoforma \nendotelial (eNOS), también conocida como tipo III (NOS3) y la isoforma neuronal \n(nNOS), también denominada tipo I (NOS1). Dichas isoformas median la producción \nde NO en cantidades bajas y fisiológicas, para actuar como señalizador molecular. \n \n2. Una forma inducible (iNOS), independiente de calcio, también denominada de \ntipo II (NOS2), cuya expresión puede ser inducida en dife rentes tipos de células, \ntales como macrófagos, hepatocitos, neutrófilos, músculo liso y endotelio; dicha \ninducción se produce como respuesta a diferentes estímulos inmunológicos tales \ncomo: el interferón gamma (IFN -δ), el factor de necrosis tumoral alfa ( TNF-α) y el \nlipopolisacárido bacteriano (LPS). Esta isoforma cataliza la producción de gran \ncantidad de NO, que puede ser tóxico en ciertas circunstancias o para ciertos grupos \ncelulares. \n \n Las tres isoformas de la NOS contienen un dominio carboxi -terminal homólogo \nal citocromo P450, con una flavina como grupo prostético, y un dominio amino \nterminal con un grupo heme como grupo prostético. Estos dominios terminales están \nconectados por un tercer dominio, que es a fin a calmodulina. (Lamontagne D y col, \n1992) \n \n La unión de la calmodulina a la NOS parece ser el \"interruptor molecular\" que \npermite el flujo de electrones desde el dominio reductasa hacia el grupo heme, \npermitiendo la transformación del O2 y L -arginina en NO y L -citrulina. Las isoformas \nconstitutivas NOS1 (nNOS) y en la NOS3 (eNOS) se encuentran inactivas hasta que \naumenta el calcio intracelular. Por ejemplo, en las células endoteliales, la ACh, la \nbradiquinina, el ADP o el estrés de roce son capaces de iniciar la señal que \n\n Introducción \n89 \n \nincrementa el calci o celular, el cual regula la unión de calmodulina a su dominio, \niniciando la síntesis de NO. Cuando la calmodulina se une a la enzima, los \nelectrones donados por el NAPDH fluyen desde el dominio reductasa hacia el \ndominio oxigenasa y son aceptados por el c itocromo C y otros aceptores de \nelectrones. (Lamontagne D y col, 1992) \n \nEn contraste, en la isoforma inducible (NOS2, o independiente de calcio), la \ncalmodulina permanece fuertemente unida, aún a bajas concentraciones de calcio, \nactuando esencialmente como una subunidad mas. En este caso, los electrones \ndonados por el NADPH son transportados por el FAD y por FMN hacia el grupo \nheme. En estas condiciones, la iNOS cataliza la producción de una mezcla de \naniones superóxido (O2 -) y de NO en altas cantidades, pr oduciendo peroxinitritos \n(ONOO-), con capacidad para producir citotóxicidad. En ausencia de THB, la NOS \ngenera H2O2, O2- y NO. (Lamontagne D y col, 1992) \n \nDebido a su naturaleza gaseosa el NO tiene propiedades diferentes a \ncualquier otro neurotransmisor, esta entidad química no puede ser almacenada en el \ninterior de vesículas para ser posteriormente exocitadas, en consecuencia cuando \nuna célula produce NO, este escapa a través de una membrana celular difundiendo \na las proximidades. Esa misma propiedad al atravesar las membranas permite al NO \nafectar a otras celular sin necesidad de receptores de otras superficies. \n(Lamontagne D y col, 1992) . El NO debido a que tiene una vida media de \nsegundos, es capaz de combinarse con rapidez a otros radicales libres una v ez \nliberado y ejerce sus efectos, se descompone para producir dos metabolitos \nestables, los radicales de nitrato y nitrito en una reacción catalizada con metales de \ntransición, incluyendo al hierro. (Lamontagne D y col, 1992) \n\n Introducción \n90 \n \nLa reacción con los radicales libres tienden a perpetuarse hasta el infinito, en \nausencia de antioxidantes, hoy en día los radicales libres no se consideran \nsolamente los responsables del en ranciamiento de las g rasas sino que se \nconsideran origen de la inflamación y la cardiopatía isquémica. Es útil recordar que \nuna dieta hipercalórica aumenta la producción de radicales libres, mientras que una \ndieta hipocalórica la reduce. (Muller WA, 2002) \n \nEl desequilibrio entre la producción de radicales libres y la defensa \nantioxidante conducen al estrés oxidativo que se acompaña de una gran variedad de \ncambios bioquímicos y fisiológicos que pueden llevar a insuficiencia funcional y \nmuerte celular (apoptosis). (Pérez R, 2004) \n \nEntre estos cambios bioquímicos y fisiológicos se encuentran: el aumento de \nla producción de enzimas que cataliza la biotransformación de radicales libres, el \naumento de citocinas especialmente el factor de crecimiento endotelial vascular \n(VEGF), todos considerados factores angiogénicos, ya que tienen la capacidad de \nestimular la angiogénesis intratumoral. (Pérez R, 2004) \n \nFigura 15 La inflamación crónica persistente, Aumento del Stress oxidativo y la hipoxia \nestimulan la expresión de factores angiogénicos que permiten la irrigación y crecimiento del \ntumor. Carrero Y, 2006. \n\n\n Introducción \n91 \n \nI.20 ANGIOGENESIS Y DESARROLLO TUMORAL \n \nLa angiogénesis es un proceso importante y esencial para la inflamación \ncrónica y la fibrosis, para el crecimiento tumoral y para la formación de una \ncirculación colateral, se han realizado muchos trabajos dirigidos a descubrir los \nmecanismos que regulan la formación de nuevos vasos sanguíneos . (Folkman J \ny col, 1996) \n \nEl término angiogénesis, significa literalmente formación de nuevos vasos \nsanguíneos, durante este proceso se distinguen la vasculogénesis que ocurre \npara establecer el patrón vascular del adulto y la formación de nuevos capilares a \npartir de otros ya existentes. Cuando se ha completado el crecimiento vascular, la \nangiogénesis se convierte en un proceso patológico que acompaña y favorece \nenfermedades neoplásicas y no neoplásicas. (Sánchez Y, 2001) \nLa angiogénesis ocurre como un proceso fisiológico en el endometrio, durante \nel ciclo reproductivo de la mujer fértil, en el ovario, durante el crecimiento de la red \ncapilar folicular y en la formación de la pla centa. Es fundamental para la actividad \nreproductiva y la reparación de los tejidos . (Larsen WJ, 1993; Barillari G y col, \n1998) \nLa velocidad del crecimiento tumoral depende de otros factores además de \nla cinética celular, donde el más importante es la irr igación. Los tumores no \npueden crecer más de 1 a 2 mm de diámetro o grosor, salvo que estén \nvascularizados. Es probable de que la zona de 1 a 2 mm. represente la distancia \nmáxima de difusión del oxígeno y los elementos nutritivos a partir de los vasos \nsanguíneos. Más allá de estos límites el tumor no puede seguir creciendo sin \n\n Introducción \n92 \n \nrecibir vascularización, ya que la hipoxia provocaría apoptósis a través de la \nactivación de p53 (Rak J, 1996) . Dai y cols encontraron que la expresión del \nVEGF en tumores cervicales con un diámetro mayor a los 4 mm fue del 72,7% \nmientras que en los tumores que presentaban un menor diámetro se expreso el \n51,7%. (Dai Y. y col, 2005) \n \nLa neovascularización tiene un efecto doble en el crecimiento tumoral. Por \nuna parte aporta elementos nutritivos y oxígeno y por otra parte las células \nendoteliales recién formadas estimulan el crecimiento de las células tumorales \nadyacentes mediante la secreción de ciertos polipéptidos, como factores de \ncrecimiento de tipo insulínico, PDGF,GM-CSF e IL-1. (Rak J, 1996). \nLa angiogénesis no solo es necesaria para mantener el crecimiento del tumor, \nsino también para que este pueda matastatizar. Sin acceso a la vascularización, las \ncélulas tumorales no pueden viajar a otras localizaciones (Barillari G y col, 1998) \nEstudios recientes sugieren que las células tumorales no solo producen \nfactores angiogénicos sino que también inducen moléculas antiangiogénicas, de \nesta forma el crecimiento del tumor está controlado por un equilibrio entre los \nfactores estimulantes e inhibidores de la angiogénesis (Barillari G y col, 1998) \n \nDatos experimentales y clínicos indican que cuando inician su crecimiento, \nlos tumores humanos no inducen angiogénesis. Persisten in situ durante meses o \naños hasta desarrollar irrigación y en un momento determinado, probablemente a \ncausa de la acumulación de mutaciones, algunas células de este pequeño tumor \ncambian a un fenotipo angiogénico. La base molecular de este cambio \nangiogénico no se conoce por completo pero podría implicar un aumento de l a \n\n Introducción \n93 \n \nproducción de factores angiogénicos o una pérdida de los inhibidores de la \nangiogénesis (Hanahan D y col, 1996) \n \nExisten muchos factores de crecimiento que poseen poder angiogénico, la \nmayoría de las pruebas indican que el VEGF y las angiopoyetinas son l as que \ndesempeñan un papel especial en la vasculogénesis y la angiogénesis. Estos \nfactores son secretados por muchas células mesenquimatosas y del estroma pero \nsus receptores están en gran parte circunscritos al endotelio y contribuyen al \ndesarrollo de los vasos durante la angiogénesis. \n \nAproximadamente 12 proteínas angiogénicas son reconocidas en la \nactualidad. Las más comúnmente identificadas en los tumores son el factor de \ncrecimiento básico de fibroblastos (BFGF) y VEGF (Barillari G y col, 1998; \nGiatromanolaki A y col 1998) \nEl factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) posee 2 variedades ácidas y \nbásicas, ambas pueden por estimulación paracrina incrementa la síntesis de factores \nangiogénicos por los macrófagos del tejido conectivo o estimulan la proli feración de \nlas células endoteliales .(Campbell SC y col 1998; A Kaya B y col, 2005) El FGF al \nigual que otros factores de crecimiento tumoral, al aumentar el índice de actividad \nmitótica, facilitan la proliferación de las células tumorales y endoteliales v asculares \nen las áreas más vascularizadas del tumor.(A Kaya B y col, 2005) \n El proceso de angiogénesis es determinado por el balance entre factores \nestimuladores e inhibidores, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), \nconstituye uno de los fact ores proangiogénicos esenciales en el control de la \nangiogénesis tumoral. Este factor ha sido estudiado en la progresión de diversos \n\n Introducción \n94 \n \ntumores malignos, como el tumor maligno del tracto gastrointestinal en el cual no se \nconoce bien la asociación entre el VEG F y la proliferación celular, así mismo se \nexpresa abundantemente en tumores de origen epitelial y asociado con otros \nestados clínicos como isquemia del miocardio, derrame pleural y enfermedades \nretinianas, en las cuales su elevación es estimulada por la isquemia tisular. En los \ntejidos neoplásicos su síntesis es promovida por las propias células tumorales \n(Campbell SC y col 1998; A Kaya B y col, 2005; Zetter BR, 1998; Obermair A y \ncol, 1998; Johson DA y col, 1998) \n \nFigura 16 La hipoxia y la infiltración celular estimulan la expresión de factores angiogénicos. \nLa angiogénesis no solo es necesaria para mantener el crecimiento del tumor, sino también \npara que este pueda hacer metástasis. Sin acceso a la vascularización, las células \ntumorales no pueden viajar a otras localizaciones. Carrero y col, 2006. \n \n \nI.20.1 FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) \n \nEl VEGF es una glicoproteína homodimérica de 34 -46 kDa producida por \nvarios tipos de células en respuesta a diversos estímulos. Actúa sobre las células \n\n\n Introducción \n95 \n \nendoteliales vasculares uniéndose a receptores transmembrana específicos. El \nVEGF tiene cuatro actividades biológicas principales que contribuyen todas ellas a la \ninducción de la angiogénesis y que han sido estudiadas exhaustivamente, dentro de \nestas se p ueden mencionar: crecimiento y proliferación de células endoteliales \nvasculares, migración de células endoteliales vasculares, supervivencia de células \nendoteliales inmaduras mediante la prevención de la apoptósis y aumento de la \npermeabilidad vascular de los capilares. (Gombos Z y col, 2005) \n \nAlgunos estudios encontraron que el VEGF se encuentra implicado en la \nregulación del proceso de angiogénesis y la proliferación celular del tumor maligno \ndel tracto gastrointestinal , así mismo Wang y cols sugirie ron que una sobre \nexpresión del VEGF es esencial para la microangiogénesis del carcinoma de células \nescamosas de laringe. (Wang Z y col, 2004) \nLos vasos sanguíneos son un componente importante del estroma tumoral y \npor lo tanto la angiogénesis es un facto r predictivo del pronóstico en muchas \nneoplasias humanas, por lo que se considera existe una correlación importante \nentre el número y la densidad de los vasos sanguíneos con los estados \nmetastásicos, tamaño del tumor, tipo histológico y por consiguiente g rado de \nmalignidad tumoral (Lantieri LA y col, 1998) \nVázquez y col observaron un incremento en la expresión del VEGF durante \nla progresión del cáncer cervical cuando detectaron en el citoplasma de las \ncélulas tumorales así como en las células epiteliales normales y pre -malignas de \ncuello uterino la expresión del VEGF y encontraron que la proteína se expresó en \n84% de las muestras con cérvix normal, en 91% de las lesiones intraepiteliales de \nbajo grado y en 97% de los carcinomas cervicales (Vázquez K y col , 2005), así \n\n Introducción \n96 \n \nmismo los hallazgos de Gombos y cols sugieren que el VEGF juega un rol \nimportante en la angiogénesis, ellos examinaron la densidad de los vasos \nlinfáticos peritumorales y lo correlacionaron con la expresión del factor de \ncrecimiento endotelia l vascular (VEGF) en células escamosas de carcinoma de \ncuello uterino y encontraron una diferencia significativa cuando lo compararon con \ncuello uterino sano (Gombos Z y col , 2005) . Así mismo Mitsuhashi y cols \nencontraron diferencias significativas al com parar la concentración sérica del \nVEGF en pacientes con carcinoma cervical con respecto al grupo control de \nmujeres sanas. (Mitsuhashi A y col, 2005) \n \nLa expresión del VEGF es estimulada por algunas citocinas y factores de \ncrecimiento (TGFβ, P GF, TGFα ) y especialmente por la hipoxia celular la cual se \nha asociado con la angiogénesis desde hace mucho tiempo (Dvorak HF, 1995) \n \nLa hipoxia en los tejidos estimula la producción de sustancias angiogénicas \ncomo el VEGF y la eritropoyetina. Algunos estudios han d emostrado que la \neritropoyetina promueve la angiogénesis cuando se une a su receptor en células \nendoteliales de cuello uterino, igualmente se han correlacionado células escamosas \nde cáncer de cérvix con hipoxia y abundante vascularización, encontrándose q ue el \nVEGF expresado en epitelio hiperplásico promueve la angiogénesis en células \nescamosas de carcinoma de cuello uterino (Tanaka H y col, 2005) \n \nI.21 INVASION Y METASTASIS \n \nLa última capacidad que debe adquirir la célula tumoral es la de salir del sitio \nde origen, migrar y establecerse en otros sitios para generar un nuevo tumor. El neo \nprimario tiene una población de células heterogéneas con distintas alteraciones \n\n Introducción \n97 \n \ngenéticas que permiten superar la inhibición del crecimiento dado por uniones \nintercelulares, diseminarse y colonizar órganos distantes. En el tumor primario las \nuniones intercelulares son reducidas debido a la pérdida de cadherina E55, proteína \nimportante para el mantenimiento de la unión entre células. La adquisición de \nalteraciones en el gen que codifica esta proteína es un punto clave para transición \nde la célula epitelial a fenotipo mesenquimal, lo que la capacita para desanclarse e \ninvadir el vaso sanguíneo y hacer metástasis. Por último para que las células \ntumorales puedan escapar de una masa primaria, entren en los vasos sanguíneos o \nlinfáticos y produzcan un crecimiento secundario en un sitio distante, deben \ncumplirse los siguientes pasos: expansión clonal y angiogénesis, invasión y \nadhesión a la membrana basal, diseminación hacia la mat riz extracelular, \nextravasación, interacción con células linfoides del huésped, depósito metastásico, \nangiogénesis y crecimiento. (Hess KR, 1996) \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nII.- Hipótesis y \nObjetivos \n \n\n\n Hipótesis y Objetivos \n99 \n \nHIPOTESIS Y OBJETIVOS \n \nEl cáncer de cuello uterino (CaCu) es un problema de salud pública mundial , \nse descubren aproximadamente 15 mil nuevos casos anualmente y de 4 a 5 mil de \néstos constituyen la causa de muerte en las pacientes. Lo cual ubica al CaCU como \nel segundo tipo de cánc er en las mujeres , el 15% de las neoplasias, después del \ncáncer de mama . Supone la primera causa de mortalidad por cáncer ginecológico. \nDesafortunadamente, la mayor incidencia y mortalidad de esta enfermedad, se \npresenta en los países en vías de desarrollo donde los programas de detección \nprecoz no han sido exitosos \n \nEstudios epidemiológicos han demostrado que la mayor parte de los tipos de \ncáncer en los humanos se origina en forma secundaria al impacto de factores \ncancerígenos. En particular el cáncer cervical, se ha descrito en los últimos años que \nse comporta como una enfermedad de transmisión sexual, teniendo como factores \npredisponentes y etiopatogénicos: la edad precoz en el comienzo de relaciones \nsexuales, paridad elevada, infecciones vaginales ( VPH y VHS2), y la producción de \nradicales libres, entre otros todos considerados cofactores en la génesis del cáncer \ncervical. \n \nAsí mismo, observaciones clínicas han permitido establecer un importante \npapel del VPH en el origen de las lesiones preinvasivas d e cuello uterino. Se ha \npodido demostrar que este virus es el agente desencadenante de más del 95% de \nlos cánceres cervicales y de las lesiones cervicales de alto grado . Está bien \nestablecido que las oncoproteínas E6 y E7 codificadas por el virus están \ninvolucradas en la transformación celular y que la infección por sí misma no es \n\n Hipótesis y Objetivos \n100 \n \nsuficiente para desarrollar un cáncer. Existen factores ambientales y propios del \nhuésped involucrados en los procesos de transformación celular. Por lo que en este \ncontexto, se ha planteado que una respuesta inmunitaria anormal con alteración en \nlos procesos de regulación pudieran ser los responsables de la mayoría de las \nlesiones neoplásicas a nivel del cuello uterino. Se ha destacado la participación de \nciertas citocinas que ac túan como señales intracelulares y que regulan la respuesta \ninflamatoria, las cuales son secretadas después de una estimulación antigénica. \nEs importante señalar que el proceso de transformación celular a nivel de cérvix \nse asocia con un proceso inflamator io el cual desempeña un papel importante \ndurante la progresión tumoral. La evidencia clínica sugiere un efecto dual de las \ncélulas inflamatorias, ya sea en la producción de mediadores e inhibidores de la \ninfiltración leucocitaria y/o daño vascular y de cé lulas residentes tisulares , así como \nla estimulación a la expresión de factores de crecimiento y aumento del estrés \noxidativo, por lo que el estudio de esta cascada de eventos podría proporcionar un \nmejor entendimiento de los procesos de malignizacion en cuello uterino. La \nrespuesta inmunitaria humoral y celular es clave y de no resolverse la condición, el \nproceso inflamatorio se hace persistente, lo que facilita la transformación celular y \nfutura malignizacion del tumor. \nDe acuerdo con estos planteamien tos nos propusimos investigar en cuello \nuterino la respuesta inmunitaria local asociada a la a la infección por e VPH Y \ntransformación displásica . Análisis de la posible asociación de patrones y de \nexpresión de citocinas expresadas en el sit io de la lesi ón epitelial displásica en sus \ndiferentes estadios. Se analizará comparativamente el patrón de infiltración celular \nleucocitaria y de producción de citoquinas en mujeres con cervicitis sin evidencia de \nlesión displásica si como mujeres sanas. \n\n Hipótesis y Objetivos \n101 \n \n \n Objetivo General \nEstablecer los patrones de infiltración de células del sistema inmunitario -\ninflamatorio, de expresión de quimiocinas implicadas en su regulación, de su estado \nmetabólico y capacidad de secretar VEGF en tejido de cuello uterino en diferentes \nfases de malignizacion y en estados inflamatorios sin alteración neoplásica del \nfenotipo celular. \n \n Objetivos Específicos \n En muestras de tejido cervical de mujeres con diferentes grados de displasias \no inflamación sin evidencia de transformación neoplásica, así como un grupo control \nnormal se estudiaran los siguientes parámetros: \n \n1.-Determinar la expresión de CCL3/MIP1α, CXCL8/IL-8, CCL2/MCP-1 y VEGF \n \n2.- Detectar la Infiltración de leucocitos (monocitos/macrófagos, neutrófilos y \nlinfocitos) \n \n3.- Determinar células productoras de anión superoxido y Oxido Nítrico (NO) \n \n 4.- Determinar la inf ección por VPH mediante la Reacción en Cadena de la \nPolimerasa (PCR) y genotificación por Captura de Híbridos (HC2) \n \n5.- Estudiar la significación clínica e histológica de los hallazgos con los diferentes \nestadios de la neoplasia o lesión inflamatoria cerv ical y la presencia o ausencia de \nVPH. \n\n \n \n \n \nIII.-Materiales y \nMétodos \n \n\n\n Materiales y Métodos \n103 \n \nIII.1 DISEÑO DEL ESTUDIO \n \nIII.1.1 TIPO DE DISEÑO. \n \nEl presente estudio fue de tipo descriptivo, prospectivo, inferencial, transversal y \ntranslacional. \n \nIII.1.2 PERIODO DE ESTUDIO. \n \nEsta investigación fue realiza da durante el periodo compren dido entre el año \n2006 al 2011. \n \nIII.1.3 ÁREA DE ESTUDIO. \n \n Este estudio cubre el área de la inmunopatologia del cáncer del cuello \nuterino. El estudio para la detección del ADN del VPH utilizando la técnica de la \nReacción en Ca dena de la P olimerasa (PCR) e Hibrido de C aptura (HCII) , fue \nrealizado en las instalaciones del Laboratorio Regional de Referencia Virológica en \nla Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela. El \nEstudio histopatológico se real izó en la Cátedra de Anatomía Patológica de la \nFacultad de Medicina y el Laboratorio de Anatomía Patológica de la Policlínica \nMaracaibo; el estudio de producción de anión superoxido y la determinación \ninmunohistoquímica de las c itoquinas y factores de crec imiento estudiados fue \nrealizado en conjunto con la Sección de Inmunología y Biología Celular del Instituto \nde Investigaciones Clínicas “ r. mérico egr ette” y el Laboratorio Regional de \nReferencia Virológica. \n\n Materiales y Métodos \n104 \n \nIII.1.4 SELECCIÓN Y PROCEDENCIA DE LA POBLACIÓN. \n \n Durante el periodo comprendido entre en ero del 2006 y Marzo del 2010 s e \nestudió una población de 4 80 mujeres que asistieron a diversas jornadas de \npesquisa de cáncer de cuello uterino y VPH realizadas en los ambulatorios San \nJacinto (ASJ), Los Olivos (AO), Servicios Médicos de LUZ (SMO), Hospital Noriega \nTrigo (NT), Ambulatorio La Victoria(AV), hospital Adolfo Pons (AP), Salud Maracaibo \n(SM) Consulta privada (POO) y anexo Femenino de la Cárcel Nacional de Sabaneta \n(AF) estado Zulia -Venezuela, de las cuales s e encontraron 55 pacientes que \npresentaron lesiones pre -invasivas a nivel del cuello uterino (45 NICI, 5 NICII, 5 \nNICIII). Además como se seleccionaron 7 mujeres que presentaban procesos \ninflamatorios (endocervicitis crónica e infl amatorio severo) y 7 mujeres sin lesiones \nvisibles de cuello uterino, las cuales representaron los controles sanos. \n \nIII.1.5 POBLACIÓN EN ESTUDIO \n \n Las características de las mujeres incluidas en este estudio se relacionan con \nlos criterios de inclusión y exclusión seleccionados. \nIII.1.6 CRITERIOS DE INCLUSIÓN. \n1) Alteración colposcópica con evidencia histológica de displasia en el \nepitelio cervical (para el grupo con Neoplasia Intraepitelial) \n2) Alteración colposcópica sin evidencia histológica de displasia e n el \nepitelio cervical (para el grupo enfermedad inflamatoria) \n3) Ser o haber sido sexualmente activas. \n4) Cualquier raza e historia de paridad. \n5) Edad mayor de 16 y no haber tenido la menopausia \n\n Materiales y Métodos \n105 \n \nIII.1.7 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN \n1) Mujeres embarazadas \n2) Normalidad del epitelio cervical (Solo controles sanos) \n3) Infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) \n4) Tratamiento hormonal o anti -inflamatorio o anti -infeccioso local y/o \nsistémico por patología genital en los tres meses previos. \n5) Tratamiento previo por infección con VPH. \n6) Padecer enfermedades autoinmunes. \n7) Padecer insuficiencia renal, hepática, cardiaca y/o respiratoria grave. \n8) Tratamiento con fármacos inmunosupresores o antineoplásicos. Las \nmujeres controles se caracterizaban por ser sexualmente activas y \npresentar un estado de salud normal y sin evidencia de alteraciones en \nla colposcopia. \n \nIII.1.8 CRITERIOS BIOÉTICOS \n \n A todas las pacientes se les realizó una historia clínica y exploración física \nprevio al consentimiento informado para participar en el proyecto, por medio de la \ncual se obtuvieron datos sociodemográficos, clínicos y ginecológicos. \n \nSe tomaron en cuenta las pautas establecidas por la Asociación Médica \nMundial (AMM) a través de la promulgación de la Declaración de Helsinki como \nuna propuesta de pr incipios éticos para investigación médica en seres humanos, \nasí mismo el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina de la Universidad del \nZulia y Bioética y Bioseguridad del Fondo N acional de Ciencia y Tecnología \n(FONACIT) aprobó el presente protocolo propuesto por el Laboratorio Regional de \n\n Materiales y Métodos \n106 \n \nReferencia Virológica y la Cátedra de Gineco -obstetricia. (Universidad del Zulia. \nMaracaibo, Venezuela) \n \nIII.1.9 TOMA DE MUESTRA \nIII.1.9.1 TOMA DE MUESTRA PARA EL ESTUDIO HIST OQUIMICO Y LA \nDETERMINACION DE INFILTRA CION LEUCOCITARIA, QUIMIOCINAS Y \nFACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR \n \nEl examen físico ginecológico fue realizado por el médico gineco -obstetra \nel cual incluyó inspección de genitales externos y colocación del especulo para \nvisualizar el cuello ut erino. Aquellas pacientes a las cuales se les detectó alguna \natipia celular previa visualización colposcópica, se realizaron 3 biopsias: \nIII.9.1.2 PARA EL ESTUDIO HISTOLÓGICO \nUtilizando una pinza de Schumacher para biopsia uterina, se tomó un \nfragmento de tejido de la alteración tisular , colocándolo en formalina al 10%, e \nincluyéndolo en parafina para la realización de cortes de μ los cuales fueron \nteñidos posteriormente con hematoxilina – eosina para identificar cambio y realizar \nel diagnostico histopatológico. \nIII.9.1.3 PARA EL ESTUDIO INMUNO-HISTOLÓGICO \nOtro fragmento d e tejido se utilizó para la determinación de MIP1, MCP1, \nVEGF, infiltración leucocitaria y anión superóxido por técnicas inmunohistologicas \ne histoquímicas. Estos fragmentos fueron incluídos en el componente OCT (Tissue \nTek; Miles Inc Diagnostic, Kankakee, II, USA) congelados con hielo seco y acetona \npara ser almacenados a -70º C hasta su procesamiento. De igual forma fueron \n\n Materiales y Métodos \n107 \n \ntratados los tejidos tomados a la poblacion control. \n \nIII.9.1.4 PARA LA DETERMINACION DE OXIDO NITRICO \nSe tomó un tercer fragmento al f resco para la determinación de oxido n ítrico y \nproteínas, el cual se coloco en un tubo eppendorf sin ningún aditivo y fue \nalmacenado a -20º C hasta su procesamiento. De igual forma fueron tratados los \ntejidos tomados a la poblacion control. \nIII.9.1.5 TOMA DE MUESTRA PARA EL DIAGNOSTICO DE VPH \nPara el diagnóstico molecular del VPH se tomó una muestra de la zona de \ntransición escamocolumnar, en los pacientes como en los controles utilizando para \nello una torunda de alginato la cual fue colocado en un tubo esteril para ser \nposteriormente trasladado al Laboratorio Regional de Referencia Virológica. Estas \nse guardáron a -20° C hasta su procesamiento. \n \nIII.1.10 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS \n \nIII.1.10.1 DETERMINACIÓN INMUNOHISTOLOGICA DE LA INTERLEUCINA (IL8), \nLA PROTEINA QUIMIOTACTICA DE MONOCITOS (MCP1), LA PROTEÍNA \nINFLAMATORIA DE MACRÓFAGO 1 α (MIP1α), EL FACTOR DE CRECIMIENTO \nENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) Y LA INFILTRACIÓN LEUCOCITARA \n \n \nEn este estudio se incluyeron dobles tinciones para evidenciar infiltración \nleucocitaria y la expresión de Interleucina 8 (IL -8), Proteína Quimiotáctica de \n\n Materiales y Métodos \n108 \n \nMonocitos (MCP1), Proteína Inflamatoria de Macrófago 1 α (MIP1α), Factor de \nCrecimiento Endotelial Vascular (VEGF) en biopsias de cuello uterino. \n \nDe las biopsias congel adas se realizaron doce cortes de μ por cada tejido \nutilizando un criostato ( Shandon®, Pittsburg, Pennsylvania, USA ). Posteriormente \nse fijaron en acetona fría durante 5 minutos y se lavaron por 2 minutos con Buffe r \nfosfato salino pH 7.2 (PBS). S e incubaron durante una hora con el anticuerpo \nmonoclonal primario correspondiente: anti RIII/C16 b humano para neutrófilos, Anti \nCD3 humano para linfocitos y Anti macrophage para macrófagos humanos (R&D \nsystems) previa dilución de los mismos 1:100. Posteriormente los cortes se lavaron \ncon PBS pH 7.2. La localización del primer anticuerpo se dete rmino con un segundo \nanticuerpo anti IgG de ratón marcado con FITC (Rat anti Mouse F (ab´)2 FITC \nAccurate Chemicals) el cual se incubo por una hora y se lavo con PBS transcurrido \nel tiempo de incubación. \n \nSeguidamente se realizo una segunda tinción para e videnciar la expresión de \nIL8 (Biotinylated anti human CXCL8/IL8), MCP-1 (Biotinylated anti human \nCCL2/MCP1), Proteína Inflamatoria de Macrófago 1 α (MIP1α) usando un anticuerpo \nbiotilinado anti human CCL3/MIP -1α y del Factor de Cr ecimiento Endotelial \nVascular. (B iotinylated anti human VEGF antibody) todos obtenidos de R&D \nsystems. S e realizo incubación por una hora, se lavo con PBS y se le s agregó \nStreptavidina marcada con Ficoeritrina . Después de media hora de incubación se \nlavo con PBS. Culminado el procedimiento se le agregó p-fenilenediamina (PPD) en \nsolución de glicerol -PBS para evitar la pérdida de fluore scencia y se le coloco una \nlamina cubre objeto sellando los bordes. Las muestras se observaron en un \nmicroscopio con sistema de epifluoresencia (Axiskop, Zeiss, Alemania). Se contaron \n\n Materiales y Métodos \n109 \n \nnúmero de células por campos de 400 X El control negativo estará repre sentado \npor un anticuerpo monoclonal del mismo isotipo contra un antígeno no rel evante en \nel tejido a estudiar en lugar del anticuerpo primario. \n \nIII.1.10.2 IDENTIFICACIÓN DEL ANIÓN SUPÉROXIDO EN TEJIDO. \n \nSe hicieron cortes de tejido de 10 µ y se fijar on con acetona fría, para la \nidentificación del anión superóxido. La determinación tisular del anión superoxido se \nrealizo de acuerdo al método de Briggs & Cols (Briggs y cols.1996, Briggs y cols \n2004) \n \nFundamento del método para determinar anión superóxido (Briggs y Cols). \n \nSe basa en la oxidación de la diaminobencidina y del manganeso (Mn ++), en \npresencia de NADPH oxidasa para catalizar la conversión de anion superóxido en \nperóxido de hidrogeno y manganeso (Mn +++), el anion superóxido intracelular se \nhace evidente al formarse un precipitado de color negro. \n \n \n \n Figura 17 Fundamento de la reacción de Briggs. Carrero y cols, 2012 \n \nPara lo cual se preparo una disolución de d iaminobencidina (DAB) 75.76mg \nen 2ml de agua destilada, luego se preparo el Buffer T ris Base 0.05M al mezclar \n4.17ml de acido c lorhídrico (HCl) 2N llevar a 50 ml con agua destilada y 7.18ml de \nTris llevar a 25ml con agua destilada, mezclar y llevar a 125ml con agua destilada, \n\n\n Materiales y Métodos \n110 \n \ndiluir 1:10 para obtener una concentración de 0.05M. Posteriorm ente se preparo la \nsolución de reacción donde se mezclan todos los reactivos prepa rados previamente, \nademás, del c loruro de níquel (NiCl2) al 8%, azida s ódica (NaN3) al 10% y Cloruro \nde manganeso (MnCl2) 0.5M, y por último se preparo el control negativo qu e lleva \ntodos los reactivos a excepción del cloruro de manganeso a pH 7.6. \n \nProcedimiento experimental. \n \n1. Para la identificación del anión s uperóxido se hac ieron cortes de 10 u de \nbiopsias de cuello uterino. \n2. Dejar secar a temperatura ambiente. \n3. Luego, ne utralizar con azida s ódica (NaN3) al 0,1% por 10 minutos a \ntemperatura ambiente. \n4. Posteriormente sumergir los cortes en la solución de reacción.(proteger de la \nluz) \n5. .Después incubar a 37ºC por 1 hora. \n6. Transcurrida la hora lavar con buffer fosfato salino (PBS). \n7. Fijar con buffer formalina al 10% por 10 minutos. \n8. Lavar con buffer fosfato salino (PBS). \n9. Contratatinción con verde de metilo por 30 minutos. \n10. Lavar 3 veces con agua de chorro o agua destilada. \n11. Dejar escurrir y secar bien. \n12. Luego montar con Permount. \n13. Contar el número de células por campo de 400X en varios campos y sacar el \npromedio. \n \n\n Materiales y Métodos \n111 \n \nIII.1.10.3 DETERMINACION DE PROTEINAS Y OXIDO NITRICO \n \nLa determinación de proteínas y oxido nítrico se realizo a partir de biopsias de \ncuello uterino sin ningún aditivo las cuales se homogenizaron y procesaron \nsiguiendo el protocolo a continuación descrito: \n \n1. Descongelar la muestra y colocarla en el fondo de un tubo Eppendorf de 1,5cc. \n2. Agregarle 0,5cc de buffer fosfato salino (PBS) frío a Ph 7,4. \n3. Homogenizar. \n4. Centrifugar en centrifuga para Eppendorf por 20 minutos a toda velocidad. \n5. Tomar el sobrenadante y colocarlo en otro tubo Eppendorf, de allí se tomaron 2 \nalícuotas: una para determinación de proteínas y otra para oxido nítrico. \n \nDETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE LOWRY \nFundamento \nEs un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. En el cual \nse añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la \nintensidad de color de la solución resultante proporcional a la concentrac ión de \nproteínas, según la ley de Lambert-Beer. \n \nEste método consta de dos etapas: \n1. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos \ncon los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídico. Estos complejos Cu 2+-proteína \ntienen un c olor azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura \ntridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a \n\n Materiales y Métodos \n112 \n \nparticipar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina \nen forma de su complejo con tartrato. \n2. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los \ngrupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, \nactuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del rea ctivo de \nFolin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser \nreducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso \n \n \nFigura 18 Fundamento Método Lowry. Carrero Y, 2012 \n \n \nPreparación de Reactivos: \n \n­ Estándar de Albúmina 1mg/ml. \n \nSolución A: \n \n­ Solución (X): Mezclar 0.5grs de sulfato de cobre pentahidratado (SO 4Cu5H2O) \nal 0.5%, con 1gr de citrato de sodio (Na 3C6H5O7) al 1%, llevar a 100ml con agua \ndestilada. \n\n\n Materiales y Métodos \n113 \n \n­ Solución (Y): Mezclar 10grs de carbonato de sodi o (CO3Na2), al 2% con 2grs \nde hidróxido de sodio (NaOH), 0.1N, llevar a 500ml con agua destilada. \nPosteriormente mezclar (X+Y) en relación 1:50 .Las soluciones deben prepararse \n15 minutos antes de agregarlas y mezclarlas inmediatamente, así mismo es \nimportante señalar que esta solución no debe tener más de un mes de preparada. \n \nSolución B: \n­ Mezclar el folin en una relación 1:1 con agua destilada. Debe prepararse 45 \nminutos antes de agregar, agitar inmediatamente. \n \nPreparación de la Curva Estándar: \n \nProcedimiento: \n \n1. Numerar del 1 al 8 tubos de plástico de 10 ml . \n2. Pipetear las cantidades de agua, solución patrón de albúmina (1mg/ml), \nsolución A y solución B señaladas en la tabla. \n3. Marcar 2 tubos blancos (B), y agregar 200ul de agua destilada, 1ul de \nsolución A y 100 de solución B a ambos. \n4. El resto de los tubos se le agregan diferentes cantidades de agua y albúmina \nsin variar los volúmenes de solución A y solución B. \n5. Leer la absorbancia en el colorímetro a 570nm, posteriormente multiplicar las \nabsorbancias por el factor de dilución respectivo. \n6. Representar las absorbancias de los tubos estándares frente a los mg de \nproteínas previamente calculados y determinar la concentración de proteínas en las \n\n Materiales y Métodos \n114 \n \nmuestras al interpolar sus absorbancias con las concentraciones de los estándares \nexpresando el resultado en mg/ml. \n \nSeguidamente se procedió a la determinación de oxido nítrico utilizando el ¨Kit¨ \nBioassay Systems QuantiChrom Nitric Oxide Assay (DINO -250), para la valoración \nde oxido nítrico en suero y tejido de cu ello uterino. Este ¨kit¨ se basa en la medición \ndel oxido nítrico producido a nivel endógeno, mediante reducción de nitrato a nitrito \nusando el método de Griess. (Griess, 1879) Se aplica para la determinación de \noxido nítrico en plasma, suero, orina, tej ido, células y alimentos. Así como, para la \ninvestigación de drogas o en farmacología para conocer los efectos de las drogas en \nel metabolismo del NO. \n \n FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN DE GRIESS. \n \n El fundamento del método se basa en que en un medio a pH fisiol ógico, 2 \nmoléculas de NO reaccionan con 1 molécula de O 2, generando 1 molécula de nitrito \ny 1 molécula de nitrato . Cada molécula de nitrito presente en la muestra reacciona \ncon una amina y se produce su diazotización. El producto se acopla para producir un \nazocromógeno de color púrpura que posee un pico de absorbancia de 540 nm . \n \nFigura 19 Fundamento Reacción de Griess. Carrero Y, 2012 \n\n\n Materiales y Métodos \n115 \n \nPreparación de los reactivos. \n \nLos reactivos requeridos se prepararon siguiendo las instrucciones de \nQuantichrom Nitric Oxide Assay Kit (DINO -250), para la determinación de los \nmetabolitos Nitrato/Nitrito. \n1. Se preparo una disolución de sulfato de zinc (ZnSO4) 20x \n2. Luego se preparo una disolución de hidróxido de s odio (NaOH) 30x a 1x \nllevando 367ul de NaOH a 10.633 ul con agua destilada, \n3. Consecutivamente se preparo el buffer de a ctivación mezclando 25ml 3x en \n50ml de agua destilada, \n4. La pre-mezcla para los estándares, se preparo a l mezclar 30ul del estándar \nde nitrito (1.0mM), llevar a 600ul con agua destilada. \nDesproteinización: \n La desproteinización es requerida para suero, plasma y otras muestras \nproteínicas. \nAñadir a las prote ínas del sobrenadante 80 ul de s ulfato de z inc (ZnSO4) y \ncentrifugar por 5 minutos a 1400 rpm. \n \n Luego, transferir el sobrenadante a un tub o limpio que contenga 120 ul de \nhidróxido de s odio (NaOH), si ocurre de nuevo precipitación transferir 210 ul de \nsobrenadante y agregar 70 ul de buffer glicina. Si la solución permanece clara en \nestos pasos no se requiere desproteinización, transferir dire ctamente 210 ul de \nmuestra y 70 ul de buffer glicina. \n \n \n \n\n Materiales y Métodos \n116 \n \nActivación del cadmio (Cd) : \n \nLa cantidad de gránulos de cadmio usado es de tres por muestra. Los gránulos de \nCd se transfieren a un tubo centrífuga de 50 ml y se lava n tres veces con agua. \nLuego se remueve el residuo de agua con una pipeta. \n \nPosteriormente, se agregan 200 ul de b uffer de activación diluido a los gránulos y \nse incuban 5 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido dicho tiempo se lavan \ntres veces con agua, el cadmio activado debe ser usado dentro de 20 minutos. \nPasado dicho tiempo se lavan con HCl 0,1 N por 5 minutos, luego se lavan tres \nveces con agua destilada y para reactivar se utiliza el mismo procedimiento de \nactivación. \n \nUna vez incubadas las muestras por 15 min. a temperatura ambiente con los \ngránulos de cadmio , se transfieren por duplicado , 100 ul de las muestras a una \nplaca de microtitulación de 96 pozos. Seguidamente se agregan 50 ul del reactivo A \ny 50 ul del reactivo B incubándose por 5 min. a temperatura ambiente . Las \ndensidades ópticas se determinaron a 540 nm mediante el equipo Micro Elisa \nOrganon Tecnica Microwell System Modelo 530 y los resultados se expresaron en \nUmol/ L. \n \nCálculos: \n \nLas concentraciones de oxido nítrico se obtienen al restar la densidad óptica del \nblanco a la densidad óptica de la muestra dividido por el ¨s lope¨ que se determina \n\n Materiales y Métodos \n117 \n \npor regresión lineal de los estándares y multiplicado por el factor de dilución. La \nconcentración de NO de las muestras es calculado de la siguiente manera: \n \n \n \n \nDonde: \nOD sample: Densidad óptica de la muestra. \nOD blank: Densidad óptica del blanco. \nn: Factor de dilución. \n \nFigura 20 . Fórmula para el cálculo de concentración de oxido nítrico. Quantichrom Nitric \nOxide Assay Kit \n \n \nIII.1.10.4 DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH MEDIANTE IDENTIFICACIÓN \nGEONÓMICA: \n \nIII.1.10.4.1 EXTRACCIÓN DEL ADN. \n \nPara la extracción del ADN viral se utilizó el ¨kit¨ VPH Promega. DNA \nPurification (Promega BioSystems.USA) mediante el sigu iente procedimiento: se \nañadió 1,5 ml de solución salina f isiológica al hisopo donde se encuentra la muestra \ny se mezcló en el vórtex por 1 min, el c ontenido se trasvasó a un tubo Eppendorf de \n1,5 ml limpio y estéril y se centrifugó durante 10 min en una microcentrifuga a 14.000 \nrpm. Se incluyó con cada serie de mues tras un control negativo, constituido por 1 ml \nde buffer salino y se procesó igual que el resto de las muestras. Luego se descartó \n\n\n Materiales y Métodos \n118 \n \nel sobrenadante con una pipeta dejando aproximadamente 40 ul de pellet y se le \nagregó a cada tubo 600 ul de solución de lisis y 12 ul de proteinasa k, se mezcló e \nincubó en baño de maría a 56 oC por 3 horas. \n \nFinalizada esta incubación se le agregó a cada tubo 3 ul de una soluciónde \nARNasa, mezclando 25 veces por inversión e incubando durante 30 min a 37 oC. \nPosteriormente s e l e agregó a cada tubo 200 ul de solución de precipitación de \nproteínas y se mezcló por 20 segundos en vórtex hasta homogenizar el contenido, \ncolocándolos posteriormente en hielo por 5 min, y luego se centrifugó cada tubo por \n3 min a 14000 rpm. Seguido de es to se transfirió el sobrenadante a tubos limpios y \nse le agregó 600 ul de isopropanol como agente precipitante, mezclando cada tubo \n50 veces por inversión y centrifugándolos por un minuto a 14000 rpm, se descartó el \nsobrenadante por inversión, y se le ag regó 600 ul de etanol al 70% mezclándolos \npor inversión y centrifugándolos por un minuto a 14000 rpm. Nuevamente se \ndescartó el sobrenadante por inversión y se dejó secar el pellet por 15 minutos a \ntemperatura ambiente y luego unos minutos en estufa a 37 oC. Una vez que los \ntubos estuvieron completamente secos se les agrego 100 ul de solución de \nhidratación o agua de PCR, se dejaron los tubos a temperatura ambiente toda la \nnoche y luego se guardaron a -20 oC hasta su procesamiento. \n \nIII.1.10.4.2.- REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN DEL ADN \n \n En esta etapa se utilizó la técnica de PCR donde se amplificó un fragmento de \nunos 450 pb dentro de la región L1 del marco abi erto de lectura (ORF) del virus del \nVPH. \n \n\n Materiales y Métodos \n119 \n \nPara la reacción de PCR se incubaron 10 ul de ADN con los siguientes \nreactivos: \n \nMEZCLA DE REACCIÓN CANTIDAD \n ntp’ s (1 mM) 0.4 ul \nPrimer MY09 1.0 ul \nPrimer MY011 1.0 ul \nBeta – Globina 0.8 ul \nBuffer 10X 6.25 ul \nMgcl2 (50mM) 6.0 ul \nTaq. Polimerasa (5 U/ul 0.5 ul \nH2O 24.85 ul \n \nTabla 4 Mezcla de Reacción PCR. Protocolo L.R.R.V, 2006 \n \nUna vez obtenida la mezcla final se colocaron lo s tubos en el termociclador \n(Gene amp PCR systems 2400 de Applied biosystems ) donde se llevo a cabo la \nPCR en 40 ciclos programados de la siguiente manera: \n1.- Etapa inicial de desnaturalización: 94 OC x 2 minutos, seguida de 40 ciclos \n2.- Etapa de desnaturalización: 94 OC x 1 minuto. \n3.- Etapa de anillamiento: 55 OC x 1.5minutos. \n4.- Etapa de extensión: 72 OC x 2 minutos. \n5.- Etapa de extensión final: 72 OC x 10 minutos. \n \nII.1.10.4.3 VISUALIZACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO. \n \nUna vez amplificado el material extraído se procedió a tomar 10 ul del \nmismo y se mezclaron con 2 µl de solución de carga conformada por azul de \nbromotimol. Este procedimiento se realizó sobre la superf icie de un papel \nparafinado y luego fue cargado en un gel de agarosa al 2 % el cual fue teñido \n\n Materiales y Métodos \n120 \n \ncon bromuro de etidio que presentaba una concentración de 10mg/ml se utilizaron \n(0,6 µL), se usó el marcador de peso molecular Weight Marker VIII (Boehringer \nMannheim) (0,5 µL), la corrida se realizó con el buffer Tris -Borato-Edta (TBE1X), \nutilizando un equipo de electroforesis Power PAC 3000 de BioR, se programó el \nregulador de voltaje a 100 voltios, 500 amperes con un tiempo de 60 min. \n \nEl revelado se realiz ó al colocar el gel en el Trans -iluminador (modelo \nUVTM-25) mediante luz ultra -violeta (U.V). Los geles fueron fotografiados para \ndeterminar la presencia de infección por VPH. Se observó solo una banda \ncorrespondiente al control interno de 1200 pares de b ases (pb) en los casos \nnegativos, en los casos positivos al VPH, además de la banda del control interno \nse observó otra banda de 450 pb correspondiente al ADN del virus, y la ausencia \nde bandas en las muestras inhibidas. \n \nIII.1.10.4.4 TIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO \n \nSe utilizó la prueba, DNA test de Captura de Híbrido 2 (DIGENE). Es una \nprueba in vitro de hibridación de ácido nucleico con amplificación de señal que utiliza \nla detección cualitativa por quimioluminiscencia de 18 tipos de ADN del VPH. Las \nmuestras que contienen el ADN objetivo se hibrida con un cóctel de sonda de ARN \nespecifico para VPH . Los híbridos ADN: ARN resultantes se capturan en la \nsuperficie de un pocillo de microplaca cubierto con anticuerpos específicos para \nhíbridos ADN: ARN. Los híbridos inmovilizados se hacen reaccionar con anticuerpos \nconjugados de fosfatasa alcalina específicos para híbridos ADN: ARN, y se detectan \ncon un sustrato quimioluminiscente. Varias moléculas de fosfatasa alcalina se \nconjugan con cada anticuer po. Varios anticuerpos conjugados se unen a cada \n\n Materiales y Métodos \n121 \n \nhíbrido capturado y el resultado es una amplificación considerable de señal. A \nmedida que el sustrato se divide por la acción de la fos fatasa alcalina, la luz se \nemite y se mide como unidades de luz relati va en un luminómetro. La intensidad de \nluz emitida denota la presencia o ausencia del ADN objetivo en la muestra. \n \nUna medida de unidades de luz relativa igual o mayor al valor de corte (CO) \nindica la presencia de las secuencias de ADN de VPH en la muestra. Una medida de \nunidades de luz relativa menor al valor de corte indica la ausencia de las secuencias \nespecíficas del ADN de VPH o niveles de ADN de VPH por debajo del límite de \ndetección del ensayo. \n \nEsta prueba puede identificar entre dos grupos de ADN de VPH: los tipos de \nVPH de bajo riesgo 6/ 11/42/ 43/ 44; y los tipos de VPH con riesgo intermedio/ alto \n16/ 18/ 31/ 33/ 35/ 39/ 45/ 51/ 52/ 56/ 58/ 59/ 68, pero no determina el tipo de VPH \nespecifico presente. \n \nIII.2 ANÁLISIS ESTADÍSTICO \n \nSe empleó el p rograma Prisma de la compañía Graphpad para realizar el \nanálisis estadístico de los datos obtenidos luego del procesamiento de las muestras. \nSe contó el número células positivas por campo de 400X de biopsias de cuello \nuterino (15 campos aprox). Las célula s positivas se contaron tanto en el estroma \ncomo en el epitelio y se obtuvo el promedio de células observadas por campo. Los \nresultados se presentan como promedio + 1 desviación estándar. El análisis \nestadístico se realizó comparando el promedio de célula s pos itivas para anión \nSuperóxido, quimiocinas, VEGF y células infiltrantes entre los grupos de sujetos \n\n Materiales y Métodos \n122 \n \nestudiados (casos vs. controles. Los análisis comparativos se realizaron usando \n OV más post test de Bonferroni o la T de “strudent” no pareada, de acuerdo a \nlos grupos analizar. Se consideran significativos los valores de p 0.05 \n \nIII.3. BÚSQUEDA BIBLIOGRÁFICA. \n \nLa principal fuente de información ha sido la base de datos Medline, accesible \nen la siguiente dirección http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubm ed. Se trata de la base \nmás completa, fiable y rigurosa de que se dispone en biomedicina, de gran cobertura \ny bien estructurada. La búsqueda se realizó mediante la introducción de palabras \nclaves en inglés, seleccionando los artículos de las revistas de mayor impacto dentro \ndel tema que nos ocupa. En algunos casos se realizó introduciendo el nombre del \nprimer autor firmante de artículos de gran impacto relacionados con el tema en \nestudio, revisando sus publicaciones hasta la actualidad. \n \n \n \n \n \n. \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nIV.- RESULTADOS \n \n\n\n Resultados \n124 \n \n \nIV.1 INFILTRACION LEUCOCITARIA: DETERMINACION DE LINFOCITOS (CD3), \nNEUTROFILOS (RIIB/CD16) Y MACROFAGOS EN TEJIDO DE CUELLO \nUTERINO DE PACIENTES CON NEOPLASIA INTRAEPITELIAL DEL CUELLO \nUTERINO, CONTROLES Y TEJIDO INFLAMATORIO \n \nEl estudio Inmunohisto lógico permitió evidenciar la infiltración de linfocitos \n(CD3), neutrófilos (RIIIB/CD16b) y macrófagos tanto en epitelio como en el estroma \ndel tejido uterino relacionado con el tipo de lesión que presentaban las pacientes. \n \n La figura 21 muestra el núme ro de células CD3 , RIIIB/CD16 y macrófagos \npositivos en epitelio y estroma de pacientes con lesiones intraepiteliales y controles. \nEs importante señalar que el número de linfocitos se incremento a medida que \navanzaba el grado de lesión (A y B), encontrándose diferencia significativa (p<0.001) \nentre NIC III con respecto al grupo control y NIC I tanto en epitelio como en estroma \ncervical. Las figuras C y D muestran el nú mero de neutrófilos (RIIB/C16b) tanto en \nepitelio como estroma cervical. A nivel del epit elio el grupo control (0.57±0.53), NIC I \n(0.65±0.61), NICII (1.25±0.5) y NICIII (0.16±0.40), sin diferencias significativas y a \nnivel de estroma no se observaron células positivas en los grados de lesión NIC II y \nNICIII. El número de macrófagos distribuidos tanto en epitelio como estroma cervical \nde acuerdo al grado de lesión se observan en las figuras E y F , en ambos casos el \nnúmero de células en los diferentes tipos de lesión no fue estadísticamente \nsignificativo. \n \nDe igual forma se comparo en epitelio y estroma cervical el número de células \nCD3, RIIB/CD16 y macrófagos positivos en los pacientes controles, inflamatorios y \n\n Resultados \n125 \n \ncon lesión (Figura 22). El numero de CD3 en epitelio mostró una diferencia \nsignificativa (p<0.0106) al comparar el grupo de pacientes con inflamación (16.49 ± \n5.14) vs Control (6.85± 6.79). Los pacientes con lesión preinvasiva (16.49± 10.99) no \nmostraron diferencia significativa con los otros grupos (A). A nivel de estroma no se \nencontró diferencia significativa entre el grupo de pa cientes con inflamación (11.57± \n8.82) con respecto al grupo control (4.71± 1.89) y el grupo con lesión intraepitelial \n(15.81± 12.56) (B). E l número de neutrófilos tanto en epitelio como en estroma \ncervical (Figuras C y D) en pacientes con inflamación vs. Control y paciente s con \nlesión, no mostró diferencias significativas en el número de células positivas para \nRIIIB/CD16b en cada uno de estos grupos \n \nEn los pacientes con inflamación el n úmero de macrófagos en epitelio \ncervical (2.07±1.4) no presento dife rencias significativas en relación a los pacientes \ncon lesión intraepitelial (1.81±1.21) y el grupo control (1.87±1.06) (E). De igual forma \nen el estroma cervical el grupo inflamatorio (2.35±2.1) vs. (2.2±1.19) y (1.57±0.97) \nde los grupos con lesión y con trol respectivamente no presento significancia \nestadística. (F) \n \n. \n \n \n \n \n \n \n\n Resultados \n126 \n \n0\n10\n20\n30\n40\n50\n*\n Control NIC I NIC II NIC III\n* p<0.001 vs. control y NIC IA Numero de células CD3 en\nepitelio x campo 400X\n0\n10\n20\n30\n40\n50\n60\n Control NIC I NIC II NIC III\n* p<0.001 vs. control y NIC I\n*\nB Numero de células CD3 en\nestroma x campo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n Control NIC I NIC II NIC III\nC Número de Neutrófilos en\nepitelio x campo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n Control NIC I NIC II NIC III\nD\n \nNúmero de Neutrófilos en\nestroma x campo 400X\n0\n1\n2\n3\n4\n Control NIC I NIC II NICIII\nE Número de M en epitelio\n x campo 400X\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n Control NIC I NIC II NIC III\nF Número de M en estroma\n x campo 400X\n \nFigura 21. Número de células positivas para CD3, RIIB/CD16 y macrófagos en biopsias con \nneoplasia intraepitelial cervical (NIC) y controles en epitelio y e stroma. Se observa \nincremento progresivo de células CD3 positivas a medida que aumenta el grado de lesión \nintraepitelial (A y B). Los neutrofilos en epitelio no mostraron diferencia significativ a al \ncomparar los grupos (C). En estroma no se encontraron c élulas positivas en las pacientes \ncon NIC II y NIC III (D). En epitelio y estroma el número de macrófagos en los diferentes \ntipos de lesión y controles no fue estadísticamente significativo. (E y F) \n \n \n \n \n\n Resultados \n127 \n \n \n0\n10\n20\n30\nInflamatorio Lesión Control\nNúmero de celulas CD3 positivas en estroma\n x campo 400 X\n0\n10\n20\n30\n* p < 0,0106 Inflamatorio vs Control\n*\nInflamatorio Lesión Control\nNumero de celulas CD3 positivas en epitelio\nx campo 400 X\n0.0\n0.1\n0.2\n0.3\n0.4\n0.5\n0.6\n0.7\nInflamatorio Lesión Control\nNumero de celulas RIIIB/CD16 positivas\n en estroma xcampo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\nInflamatorio Lesión Control\nNúmero de células positivas RIIIB/C16b\nen epitelio xcampo 400X\n0\n1\n2\n3\n4\n5\nInflamatorio Lesión Control\nNúmero de Macrofagos positivos en\nestroma x campo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n2.5\nInflamatorio Lesión Control\nNúmero de Macrofagos en epitelio\n x campo 400 X\nA B\nC D\nE F \nFigura 22 . N úmero de células CD3, RIIB/CD16 y macrófagos en biopsias con neoplasia \nintraepitelial cervical (NIC), controles y tejidos de pacientes con procesos inflamatorios en \nepitelio y estroma. Se observo diferencia signicativa en epitelio (p<0.0106) al compara r el \ngrupo de tejdos inflamatorios vs control (A). En estroma el número de células CD3 positivas \ntanto en el grupo lesión como en los co ntroles e inflamatorio no mostró significancia \nestadística (B). El n úmero de células RIIB/CD16 en biopsias con neoplasi a intraepitelial \ncervical, controles y pacientes con procesos inflamatorios, no mostró diferencia signicativa \ncuando se compararon los grupos tanto en epitelio (C) como en estroma (D). Los \nmacrófagos no mostraron significancia ni en epitelio (E) como en estroma (F) \n \n\n Resultados \n128 \n \n \nIV.2 EXPRESIÓN DE MIP-1α, MCP1, IL8 Y VEGF EN TEJIDO DE CUELLO \nUTERINO DE PACIENTES CON LESION INTRAEPITELIAL DEL CUELLO \nUTERINO Y CONTROLES. \n \nLa figura 23 muestra u n incremento en la expresión de CD3 ta nto en epitelio \ncomo en estroma en relación con la progresión de la neoplasia intraepitelial cervical. \nSe encontró una diferencia significativa p<0,01NICIII vs control y NIC I (A y D). Los \nvalores de la expresión de MCP -1 e IL -8 se encontraron aumentados y no se \nasociaron con la progresión de las neoplasias en e pitelio y estroma. (B, C, E y F) \nCuando se analizo la coexpresión de quimiocinas y el tipo de leucocitos se encontró \nincrementado el número de CD3/MCP-1 y CD3/IL-8 en los NIC (Figura 24 C y E). Se \nencontró un bajo número de células CD3 que expresaran MCP -1 o IL -8 en los \ncontroles (Figura 24). El porcentaje de CD3/MCP -1 se redujo en la neoplasia \nintraepitelial cervical, mientras que CD3/IL -8 aumentó en las neoplasias intraepitelial \ncervical (Figura24). La figura 25 muestra la inmunofluorescencia de la coexpresión \nde CD3/quimioquinas. L a figura 26 muestra que no hubo un aumento significativo \nde los macrófagos expresando MCP -1 o IL -8 en los NICs . La quimiocina MIP -1 se \nexpreso de manera similar tanto en las lesiones intraepiteliales como en los \ncontroles y no se observo un aumento significativo de leucocitos expresando MIP-1. \n(Figura 27). La figura 28 muestra el p orcentaje de cé lulas \nmononucleares/quimiocinas durante la neoplasia int raepitelial cervical. El porcentaje \nde cél ulas CD3/MCP 1 y macrófago/MCP1 se observaron disminuidas durante la \nevolución de los NICs (A), sin emb argo la expresión de CD3/IL-8 se incrementó \ndurante las n eoplasias. (B). La expresión de MCP -1, IL -8 y MIP-1 en epitelio y \nestroma distribuidos en tejidos inflamatorios, lesión intraepitelial y control se muestra \nen la figura 29. L a expresión de MCP1 tanto en epitelio (A) como en estroma (B) \n\n Resultados \n129 \n \nmostro diferencia significativa entre el grupo control vs inflamatorio y lesión \nintraepitelial. La IL-8 en epitelio (C) no mostro significancia, mientras que en estroma \n(D) se encontró diferencias entre el grupo infl amatorio y lesión intraepitelial. La \nexpresión de MIP -1 se mostro significativamente aumentada en epitelio (E) y \nestroma (F) de los pacientes con inflamación. \n \n La figura 30 muestra la expresión del VEGF en epitelio cervical de acuerdo al tipo \nde lesión y en el control (A). Se encontró diferencias significativas (p<0.001) entre \nNIC I y el grupo control, (p<0.001) y entre NICII y NICIIII (p<0.001) con respecto a \nNICI y el control. E l número de células que expresaron VEGF se incremento a \nmedida que aumentaba el grado de lesión. La expresión del VEGF en estroma (B) \nse comporto de manera similar que en epitelio con aumento de acuerdo al grado \nlesión, sin embrago en el grupo control ninguna célula expreso el factor. \n \n Cuando se analizo la expresión de VEGF en epitelio cervical entre el grupo \ninflamatorio vs. pacientes con lesión no resulto significativo, a diferencia del grupo \ncontrol vs el gr upo inflamatorio con una diferencia significativa p<0.04 (Figura 31 \nA). La figura 31B muestra la expresión del VEGF en estroma cervical , el cual fue \nsignificativo cuando se estudio el grupo inflamatorio vs. pacientes con lesión \n(p<0.0105), no se incluyo el análisis con respecto al grupo control ya que ningún \npaciente expreso VEGF. \n \nLa Figura 32 muestra la coexpresión de factor de crecimiento vascular \nendotelial (VEGF) y marcadores de leucocitos en la neoplas ia intraepitelial cervical . \nSe observa aumento en el número de células CD3/VEGF (A y B).Los macrófagos \n(Mφ) / VEGF se observaron aumentados en el epitelio y el estroma de las muestras \n\n Resultados \n130 \n \ncervicales (C y D). Sólo un bajo número de células CD3/VEG positivas se encontró \nen el epitelio del grupo control . Tanto e n epitelio como en estroma los linfocitos \ncomo los macrófagos expresando VEGF aumentaron en relación a la evolución del \nNIC. La figura 33 muestra al microscopio en campo de inmunofluorescencia la \ncoexpresión de CD3 con VEGF. \n \nEl total de células para mar cadores leucocitarios y VEGF en relación al \nnúmero de pacientes y a los controles se muestran en la Figura 34 donde s e \nobserva un aumento gradual de acuerdo a la evolución de la enfermedad del total de \ncélulas VEGF, células C 3/VEGF, macrófagos (Mφ) / VEGF, y las células no -CD3 o \nMφ / VEGF positivo en el epitelio ( ) y en el estroma (B) \n \n \n \n \n\n Resultados \n131 \n \n \n \n \nFigura 23 Expresión de células positivas para CD3, MCP -1 e IL -8 en epitelio y estroma de \nbiopsias con neoplasia intraepitelial cervi cal (NIC). Se observa incremento progresivo d e \ncélulas CD3 positivas (A y D). Se aprecia incremento de MCP -1 en los NIC (B y E). La \nexpresión de IL-8 se observo aumentada tanto en NIC I como NIC II (C y F). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n0\n10\n20\n30\n40\n50\n*\n Control NIC I NIC II NIC III\n* p<0.001 vs. control y NIC IA Numero de células CD3 en\nepitelio x campo 400X\n0\n1\n2\n3\n4\n* * *\n*p < 0.01 vs. controlB\nControl NIC I NIC II NIC III\nNúmero de celulas MCP-1 positivas\nen epitelio x campo 400X\n0\n2\n4\n6\n* *\n* p < 0.05 vs. control\nC\nControl NIC I NIC II NIC III\nNúmero de celulas IL-8 positivas en\n epitelio x campo 400 X\n0\n10\n20\n30\n40\n50\n60\n Control NIC I NICII NICIII\n* p<0.001 vs. control y NIC I\n*\nD Numero de células CD3 en\nestroma x campo 400X\n0\n1\n2\n3\n4\n* * *\n*p < 0.01 vs.controlE\nControl NIC I NIC II NIC III\nNúmero de celulas MCP-1 positivas\nen estroma x campo 400X\n0\n2\n4\n6\n8\n10\n* *\n* p < 0.05 vs. control\nControl NIC I NIC II NIC III\nF\nNúmero de celulas IL-8 positivas en\n estroma x campo 400 X\n\n Resultados \n132 \n \n \n0\n50\n100\n150\nControl CIN I CIN II CIN III CC\n*** p < 0.01 vs. control, CIN I and CINII\np < 0.05 vs. control and CIN I\n***\nA Number of CD3 positive\ncells per x400 field\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n*\n* p < 0.01 vs. control\nControl NIC I NIC II NIC III\nC Número de celulas MCP-1/CD3\n positivas x campo 400X\n0\n5\n10\n15\n20\n Control NIC I NIC II NIC III\n* *\n* p < 0.05 vs. controlD Número de células IL-8 positivas\nx campo 400X\n0\n1\n2\n3\n Control NIC I NIC II NIC III\n* *\n*p < 0.05 vs. controlE Número de células IL-8/CD3\n positivas x campo 400X\n0\n2\n4\n6\n8\n* * *\n*p < 0.01 vs. controlB\nControl NIC I NIC II NIC III\nNúmero de celulas MCP-1 positivas\n x campo 400X\n \n \n \nFigura 24. Expresión del número total de células CD3, MCP-1, IL-8, CD3/MCP-1 y CD3/IL-8 \nen biopsias con neoplasia intraepitelial cervical (NIC). Se observa incremento progresivo de \ncélulas CD3 positivas (A). Las células MCP-1 incrementaron en los NICs (B) y solo s e \nencontraron incrementadas las células CD3/MCP -1 en NIC I (C). Se aprecio incremento en \ncélulas positivas para IL-8 en NIC I, II (D), encontrándose incremento de células CD3/IL-8 en \nlos mismos estadios (E). \n \n \n \n \n \n \n \n*p<0.01vs control, NIC I, NICII y \nNICIII \n**P<0.05 vs control y NICI \nControl NICI NICII NICIII \nNúmero de células CD3 \nx campo 400X \n\n Resultados \n133 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n. \n \nFigura 25 Inmunofluorescencia de la doble tinción anti CD3 y anti-quimiocina en biopsias de \npacientes con neoplasia intraepitelial cervical. La flecha en A indica células positivas para \nCD3 que a su vez son positivas para MCP -1 en B (flecha). La flecha en C indica célula \npositiva para CD3 que a su vez es positiva para IL-8 en D (flecha). Aumento original 400X. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n Resultados \n134 \n \n0\n2\n4\n6\n8\nControl NIC I NICII NICIII\nA\nNúmero total de M \n x campo 400 X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\nControl NIC I NIC II NICIII\nB Número de células MCP-1/M \npositivas x campo 400X\n \n \n \n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\nControl NICI NIC II NICIII\nC Número de célulasIL-8/M \npositivas x campo 400X\n \n \nFigura 26 Expresión del número total de la infiltración por macrófagos (MΦ), MΦ /MCP-1 y \nMΦ /IL -8 en biopsias con neoplasia intraepitelial cervical (NIC). En general el número de \ncélulas con fenotipo de macrófago expresando MIP-1 no fue significati vo en los estadios \nestudiados (B y C). \n \n \n \n \n\n Resultados \n135 \n \n0\n2\n4\n6\n8\nControl NICI NIC II NIC IIIA Número de células MIP-1\n positivas x campo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n2.5\nControl NICI NICII NICIII\nB Número de células MIP-1/CD3\npositivas x campo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n Control NICI NICII NIC III\nC Número de células MIP-2/M\npositivas x campo 400X\n \n \nFigura 27. Expresión del número total de células MIP -1, CD3/MIP -1 y macrófagos (MΦ)/ \nMIP-1 en biopsias con neoplasia intraepitelial cervical (NIC). No se encontró aumento \nsignificativo de la expresión de MIP-1 en ninguno de los estadios estudiados. \n \n \n \n \n \n\n Resultados \n136 \n \n0\n20\n40\n60\nLinfocitos\nMonocito-macrofago\nControl NIC I NIC II NIC III\nA Porcentaje de celulas MCP-1 positivas\n0\n20\n40\n60 Linfocitos\nMonocitos-macrofagos\nControl NIC I NIC II NIC III\nB Porcentaje de celulas IL-8 positivas\n \nFigura 28 Porcentaje de células mononucleares/quimiocinas durante la neoplasia \nintraepitelial cervical. El porcentaje de células CD3/MCP1 y macrófago/MCP1 se observaron \ndisminuidas durante los NICs (A), sin embrago el CD3/ IL-8 se incrementó dura nte las \nneoplasias. (B) \n \n \n \n \n \n\n Resultados \n137 \n \nInflamatorio Lesión Control\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n*\n* p<0.001 control vs Inflamatorio y lesiónNumero de células MCP1\n positivas en epitelio x campo 400X Inflamatorio Lesión Control\n0\n1\n2\n3\n4\n *\n* p<0.001 Control vs Inflamatorio y lesión\nNumero de células MCP1\n positivas en estroma x campo 400X\nInflamatorio Lesión Control\n0\n1\n2\n3\nNumero de células IL-8\n positivas en epitelio x campo 400X Inflamatorio Lesión Control\n0\n2\n4\n6\n8\n*\np<0.01 Inflamatorio Vs lesion\nNumero de células IL-8\n positivas en estroma x campo 400X\nInflamatorio Lesión Control\n0\n1\n2\n3\n4\n5 *\n* p<0.001 Inflamatorio vs lesion y controlNumero de células MIP-1\n positivas en estroma x campo 400X Inflamatorio Lesión Control\n0\n1\n2\n3\n4\n5 *\n* p<0.001 Inflamatorio vs lesion y controlNumero de células MIP-1\n positivas en estroma x campo 400X\nA B\nC D\nE F\n \n \nFigura 29 Expresión de MCP -1, IL -8, MIP -1 en epitelio y estroma distribuidos en tejidos \ninflamatorios, lesión intraepitelial y control. La expresión de MCP1 tanto en epitelio (A) como \nen estroma (B) mostro diferencia significativa entre el grupo control vs inflamatorio y lesión \nintraepitelial. La IL-8 en epitelio (C) no mostro significancia, mientras que en estroma (D) se \nencontró diferencias entre el grupo inflamatorio y lesión. La expresión de MIP -1 mostro \naumento significativo en epitelio (E) y estroma (F) de los pacientes con lesión inflamatoria. \n\n Resultados \n138 \n \n0\n2\n4\n6\n8\n10\n Control NIC I NICII NIC III\n*\n** **\n* p<0.001 vs. control\n p<0.001 vs. control y NIC I**A Numero de células VEGF\n positivas en epitelio x campo 400X\n0\n1\n2\n3\n4\n5\n*\n*\n* p<0.001 vs NIC I\n\nB\n Control NIC I NICII NIC III\nNumero de células VEGF\n positivas en estroma x campo 400X\n \nFigura 30 Expresión del VEGF en epitelio y estroma cervical de acuerdo al tipo de lesión y \nen controles. Se encontró diferen cias significativas en epitelio (A) entre NIC I vs el grupo \ncontrol, (p<0.001), NICII y NICIII con respecto al grupo NICI y control (p<0.001). El número \nde células que expresaron VEGF se incremento a medida que aumentaba el grado de \nlesión. La expresi ón del VEGF en estroma (B) se comporto de manera similar que en \nepitelio con aumento de acuerdo al grado lesión, sin embrago en el grupo control ninguna \ncélula expreso el factor. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n Resultados \n139 \n \n0\n1\n2\n3\n4\n5\n6\nA\nInflamatorio Lesión Control\nNumero de Celulas VEGF en epitelio positivas\nx campo 400X\n* p<0.04 control vs inflamatorio\n**p<0.01 control vs lesión\n*\n**\n \n \n \n \n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n\nInflamatorio Lesion Control\nNumero de celulas VEGF en estroma\n x campo 400 X\nB\n \n \n \nFigura 31 Expresión de VEGF en epitelio y estroma cervical entre el grupo inflamatorio, \nlesión intraepitelial y controles. Se observa diferencia entre grupo control vs el grupo \ninflamatorio con una diferencia significativa de p<0.04 y entre el grupo co ntrol vs lesión \n(p<0.01) (A).La figura B muestra la expresión del VEGF en estroma cervical, la cual fue \nsignificativa cuando se comparó el grupo inflamatorio vs. pacientes con lesión intraepitelial \n(p<0.0105). \n \n \n \n\n Resultados \n140 \n \n0\n1\n2\n3\n4 * *\n Control NIC I NICII NIC III\n* p<0.001 vs. control y NIC IA\nNumbero de células CD3/VEGF\nen epitelio x campo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n2.5\n Control NIC I NIC II NIC III\n\n* *\n* p<0.001 vs. NIC IB Numbero de células CD3/VEGF\nen estroma x campo 400X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n Control NICI NIC II NIC III\n\n* **\n* p<0.05 vs. NIC I\n** p<0.01 vs. NIC IC Numbero de células\n M  /VEGF en epitelio x campo 400 X\n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n Control NIC I NIC II NIC III\n*\n* p<0.05 vs. NIC I\n \nD Numbero de células\n M  /VEGF en estroma x campo 400 X\n \n \nFigura 32 Coexpresión de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y marcadores de \nleucocitos en la neoplasia intraepitelial cervical (NIC).Se observa aumento en el número de \ncélulas C 3/VEGF ( y B).Los macrófagos (Mφ) / VEGF se observaron aumentados en el \nepitelio y el estroma de las muestras cervicales (C y D). Sólo un bajo número de células \nCD3/VEG positivas se encontró en el epitelio del grupo control. Tanto en epitelio como en \nestroma los linfocitos como los macrófagos expresando VEGF aumentaron en relació n a la \nevolución del NIC. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n Resultados \n141 \n \n \n \n \n \nFigura 33. Doble marcaje para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y CD3 en \ntejido de cuello uterino de un paciente con NIC III. Se muestra una célula CD3-positiva en el \npanel A (flecha), la cua l también fue positiva para el VEGF en el Panel B (flecha). \nEp:Epitelio Est:Estroma \n\n\n Resultados \n142 \n \n0.0\n0.2\n0.4\n0.6\n0.8\n1.0\n1\n3\n5\n7\n9\nTotal de células VEGF\nCélulas CD3/VEGF\nCélulas M/VEGF\nCélulas negativas para CD3, M\ny VEGF\nControl NIC I NIC II NIC IIIA\nTotal de número de células/ número de pacientes\nestudiados en epitelio cervical\n0.0\n0.2\n0.4\n0.6\n0.8\n1.0\n1\n2\n3\n4\nTotal células VEGF\nCélulas CD3/VEGF\nCélulas M/VEGF\nCélulas negativas para CD3,\n M y VEGF\nControl NIC I NICII NIC IIIB Total de número de células/ número de pacientes\nestudiados en estroma cervical\n \nFigura 34. Total de células / número pacientes del grupo control y pacientes con neoplasia \nintraepitelial cervical (NIC) Se observa un aumen to del total de células VEGF, CD3/VEGF, \nmacrófagos (Mφ) / VEGF, y las células no -C 3 o Mφ / VEGF positivas en el epitelio ( ) y en \nel estroma (B) en relación con la evolución de la enfermedad \n \n \n \n\n Resultados \n143 \n \nIV.3 DETERMINACION DE LA EXPRESIÓN DE ANION SUPEROXIDO ENTEJIDO \nDE CUELLO UTERINO DE PACIENTES CON LESION INTRAEPITELIAL DEL \nCUELLO UTERINO y CONTROLES \nAl total de pacientes incluidas en el estudio se les determino la expresión \ntisular del anión superoxido (O2-) (Figura 35). Las figuras A y B muestran el número \nde células anión superoxido positivas en el epitelio y estroma cervical, cabe destacar \nque el número de células aumento conforme aumentaba el grado de lesión, \nencontrándose diferencias significativas (p<0.001) entre NICIII vs. el grupo control y \nNIC I tanto en epitelio como en estr oma y diferencias (p<0.001) entre NICII y el \ngrupo control en estroma cervical. La figura 36 muestra la imagen microscópica de la \nreacción para determinar anión superoxido. No se encontró diferencia significativa \ncuando se comparo el grupo inflamatorio vs . La lesión intraepitelial y el control en \nepitelio y estroma cervical (Figura 37) \n \n0\n20\n40\n60\n80 *\n Control NIC I NIC II NIC III\n* p<0.001 vs. control y NIC IA Número de células O 2\n- en epitelio\n x campo X400\n0\n10\n20\n30\n40\n* p<0.001 vs. control\n Control NIC I NIC II NIC III\n** p<0.001 vs. control y NIC I\n*\n**\nB Número de células O 2\n- en estroma\n x campo X400\n \n \n \nFigura 35 Células anión superoxido positivas en epitelio y estroma cervical. El número de \ncélulas aumento conforme aumentaba el grado de lesión. \n \n \n\n Resultados \n144 \n \n \n \n \nFigura 36 Expresión de anión superoxido en tejido cervical de un paciente con NIC II. La \nflecha en cruz señala célula positiva en epitelio (EP) y las flechas simples célula en estroma \n(St). \n \n \n \n \n \n\n\n Resultados \n145 \n \n0\n10\n20\n30\n40\nA\nNumero de celulas o 2- positivas en epitelio\n x campo400X\nInflamatorio Lesión Control\n \n0\n5\n10\n15\n20\n25\nB\nNumero de celulas positivas O 2- en\n estroma x campo 400X\nInflamatorio Lesión Control\n \nFigura 37 Número de células O2- en epitelio (A) y estroma (B) en tejido de cuello uterino de \npacientes con inflamación, lesión intraepitelial y control. \n \n \nIV.4 DETERMINACION DE OXIDO NITRICO ENTEJIDO DE CUELLO UTERINO \nDE PACIENTES CON LESION DEL CUELLO UTERINO y CONTROLES \n \nLa figura 38 muestra la concentración de nitrito/nitratos/ mg de proteínas en \nlos diferentes espectros de lesión donde no se observaron diferencias significativas \n(A). No se aprecio diferencia significativa al comparar los valore s entre los pacientes \ncon inflamación, con lesión intraepitelial y los controles (B). \n \n\n Resultados \n146 \n \n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\n2.0\n Control NIC I NIC II NIC III\nA\nNitrito-nitrato (M / mg proteína)\n \n0.0\n0.5\n1.0\n1.5\nB Nitrito-nitrato (M / mg proteína)\nInflamatorio Lesion Control\n \n \nFigura 3 8 Concentración de Nitrito -Nitrato/mg de proteínas en pacientes con lesiones \npreinvasivas, procesos inflamatorios y control. No se observo diferencias significativas en la \nconcentración de NO en los diferentes NICs (A). No se aprecio diferencia significativa al \ncomparar los valores entre los pacientes con inflamación, con lesión intraepitelial y los \ncontroles (B). \n \n \n \nIV.5 DETERMINACION GENOMICA DE VPH \n \nDel total de pacientes incluidas en el estudio 12 (17.39%) resultaron positivas \npara infección por VPH, los resultados obtenidos a través del análisis de las biopsias \nindicaron que el mayor porcentaje de infecc ión por este virus se manifestó en las \npacientes con un grado de lesión tipo NIC III 3/5 (60%) observándose una diferencia \nsignificativa (p<0,004) con respecto a NICI. (Tabla 5, Figura 39). \n\n Resultados \n147 \n \nDe las 12 muestras positivas por PCR, se genotipificaron 10 (83.3% ) por \nhibrido de captura resultando un 60% de genotipos de alto riesgo oncogénico, es \nimportante señalar que los genotipos de alto riego se encontraron en pacientes con \nlesiones tipo NIC II Y NICIII, mientras que en las pacientes NIC I e inflamatorio \nprevalecieron los genotipos de bajo riesgo. (Tabla 6) \n \n La figura 40 muestra la expresión de CD3 en epitelio y estroma de acuerdo a \nla positividad o negatividad para la infección por VPH. No se encontraron diferencias \nsignificativas entre los grupos VPH+ en epitelio (16±12) y estroma (18±8) y VPH -en \nepitelio (15±12) y estroma (17±11) . De la misma forma e l patrón de expresión de \nquimioquinas, VEGF y O2\n- no mostro significancia estadística cuando se compraron \nlos grupos VPH positivos y negativos tanto en epite lio como en estroma. \n(Figura 41- 43) \n \n \n Controles Inflamatorio NIC I NIC II NIC III Total \nVPH Neg. 7 6 39 3 2 57 \nVPH post 0 1 6 2 3 12 \nTotal 7 7 45 5 5 69 \n \n \nTabla 5 Infección por el virus de papiloma humano en pacientes con lesiones \nintraepiteliales de cuello uterino, inflamación y controles \n \n \n\n Resultados \n148 \n \n \n \nFigura 39 Pacientes VPH positivos de acuerdo al grado de lesión (NIC) y pacientes con \ninflamación. Diferencia significativa (p<0,04) cuando se comparó el grupo de NIC III vs. \nNIC I. Los demás grupos sin diferencia significativa. Los controles no fueron positivos para \nVPH. \n \n \n \n \n \n \n Controles Pacientes \nVPH/Total de pacientes 0/7 12/69 \nTipificación/Total VPH 0 10/12. \nTipos de VPH Inflamatorio (n=1:Bajo Riesgo ) \nNICI (n=4: 3 Bajo riesgo, \n1: Alto riesgo ) \n \n NICII (n=2: Alto riesgo) \n NICIII (n=3: Alto Riesgo ) \n \n Tabla 6 Genotipos de VPH en pacientes con lesiones intraepiteliales de cuello uterino, \ninflamación y controles. \n \n \n \n \n0\n10\n20\n30\n40\n50\n60\n70\n1\nGrupo\n% de Positividad VPH\nNIC I\nNICII \nNICIII\nINFLAMATORIO\nNICI \n6/39 \nNICII \n2/5 \nNICIII \n3/5 \n* \nInflamatorio \n1/7 \n\n Resultados \n149 \n \n0\n10\n20\n30\n Epitelio Estroma\nVPH-\nVPH +\nNúmero de células CD3\n x campo 400X\n \n \n \nFigura 40 Expresión de células CD3 en epitelio y estroma de acuerdo a la infección por \nVPH. No se observaron diferencias significativas cuando se compararon los grupos positivos \ny negativos. \n \n \n \n0\n1\n2\n3\n4\n5 VPH -\nVPH +\n Epitelio EstromaA\nNúmero de células MCP-1 positivas\n en estroma x campo 400X\n0\n2\n4\n6\n8 VPH-\nVPH+\n Epitelio EstromaB Número de células IL-8\npositivas x campo 400 X\n0\n1\n2\n3\n4\nVPH-\nVPH+\n Epitelio EstromaC\nNúmero de células MIP-1\npositivas x campo 400 X\n \n \n Figura 41 Células expresando quimioqu inas: MCP-1 (A), IL -8 (B) y MIP -1(C) en epitelio y \nestroma de acuerdo a la infección por VPH . No se observaron diferencias significativas \ncuando se compararon los grupos positivos y negativos. \n\n Resultados \n150 \n \n0\n1\n2\n3\n4\n5\nEpitelio Estroma\nVPH -\nVPH +\nNúmero de células VEGF positivas\n x campo 400X\n \n \nFigura 42 Expresión de VEGF en epitelio y estroma de acuerdo a la infección por VPH . No \nse observaron diferencias significativas cuando se compararon los grupos positivos y \nnegativos. \n \n \n \n \n0\n10\n20\n30\n40\n Epitelio Estroma\nVPH -\nVPH +\nNúmero de células O2\n-\n positivas x campo 400X\n \n \n \nFigura 43 Expresión de células O2 en epitelio y estroma de acuerdo a la infección por VPH . \nNo se observaron diferencias significativas cuando se compararon los grupos positivos y \nnegativos. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nV.- Discusión \n\n\n Discusión \n152 \n \nEl Cáncer de cuello uterino representa la segunda causa de muerte por \ncáncer en mujeres en todo el mundo. Numerosas evidencias sugieren que la \nrespuesta inmunitaria mediada por células es esencial para controlar tanto la \ninfección por VPH como las neoplas ias relacionadas con el virus (Heintzelman D, \n2000). Así mismo se han involucrado otros factores como la producción de citocinas \npor las células tumorales, las cuales son generalmente angiogénicas. \n \nLa angiogénesis promueve el crecimiento y la supervivenci a del tumor e \ninfluencia la migración de la célula y la metástasis del cáncer. El papel de la \ncitocinas es la atracción de células inmunitarias al sitio del tumor. La migración de \nleucocitos circulantes al tumor es facilitada obviamente por dicha activ idad \nangiogenica, pero puede ocurrir también la extravasación y la migración en el tejido \nfino circundante. La infiltración leucocitaria como consecuencia de la producción de \nestas citocinas, puede modular la diseminación del cáncer, bien sea promoviénd olo \n(daño oxidativo del ADN) o bien sea inhibiéndolo (Natural Killer, Linfocitos T \nCitotóxicos) (Hashisuga T, 2001; Castle P 2004). Estas células infiltrantes y las \ncélulas intrínsecas del cuello pueden ser el origen de un metabolismo oxidativo \naumentado, que puede modular el crecimiento tumoral (Regus NP, 1997) \n \n Para comprender el proceso de malignizacion deben tomarse en cuenta \nnumerosos factores que ocurren de manera conjunta y en una secuencia de eventos \na lo largo del proceso inflamatorio y una vez que se inicia el proceso de \ntransformación celular a nivel de cuello uterino tales como el infiltrado de leucocitos \nel cual está asociado al stress oxidativo y que se relaciona con la producción de \nfactores proangiogenicos. \n \n\n Discusión \n153 \n \nEn el presente estudio se demostró un aumento en la infiltración de linfocitos \n(CD3) en muestras cervicales de pacientes con diferentes grados de neoplasia y \npacientes con inflamación cuando se compararon con el control. La presencia de las \ncélulas CD3 positivas pareciera estar asocia da a la severidad de las lesiones \ncervicales sugiriendo que pudiesen tener un papel en la evolución de las displasias. \nNo se observaron diferencias significativas en el número de neutrófilos y \nmacrófagos infiltrantes en pacientes con diferentes grados de neoplasia y pacientes \ncon inflamación cuando se compararon con el control a pesar que los pacientes con \nprocesos inflamatorios mostraron un ligero incremento en el número de células. \nFernández y col indican que los neutrofilos circulantes poseen activid ad antitumoral \ny juegan un papel importante en la respuesta inmunitaria. Mediadores solubles \ncirculantes se incrementan por las células tumorales como el oxido nítrico (NO) el \ncual interfiere en la capacidad migratoria de los neutrofilos (Fernández y col, 2007), \npor otra parte Heintzelman y col señalan en su estudio que la distribución de \nneutrofilos en biopsias cervicales es del 25 al 40% del infiltrado en pacientes con \ninflamación. (Heintzelman D, 2000). \n \nCoussens en el 2002 refiere que los macrófagos po tencian el proceso \nneoplásico y que junto a los neutrofilos, eosinófilos y linfocitos T activados \ncontribuyen a la malignizacion al igual que las proteasas, quimiocinas y factores \nproangiogenicos (Coussen L y 2002), otros estudios como los de León y cols \nseñalan que el infiltrado inflamatorio tumoral relacionado con el carcinoma cervical \nestá formado por linfocitos, macrófagos y eosinófilos. (Leon y cols, 2004) \n \n Un papel causal se atribuyó reciente mente a la inflamación en el desarrollo \nde enfermedades malignas. Los diferentes mediadores inflamatorios que están \ninvolucrados en estas enfermedades incluyen células, citocinas y quimio cinas. \n\n Discusión \n154 \n \nEs por ello que muchos investigadores han estudiado la participación y el papel de \nMCP-1, IL-8 y MIP en las mismas (Soria G, 2002; Tjiong 1999; Nguyen 2005; \nMarkowska 2007; Tavares-Murta 2008; Takayuki 2000, Pellegrino, 2002). En este \nsentido, se evaluaron muestras de exocervix del tejido cervical abarcando todos los \nespectros desde tejido normal a lesión intraepitelial de alto grado para determinar la \nexpresión de las quimiocinas. Un i ncremento en la expresi ón de MCP -1 e IL -8 se \nobservó en el NIC I y fueron mínimamente expresadas por los tejidos normales, pero \naltamente expresado por las cél ulas en los tejidos pa tológicos, lo que indica que la \nexpresión de MCP-1 e IL -8 aumenta en el cur so de la transformación maligna y \nsugiriere que la s dos quimiocinas juegan un papel importante en el desarrollo del \ncáncer de cuello uterino y / o progresión. Nuestros resultados difieren de estudios \nanteriores donde se observó la falta de expresión de MCP -1 en el NIC y el \ncarcinoma invasor de cuello uterino, lo que sugiere que la desregulación de la \nexpresión de l gen MCP -1 puede representar un paso importante en la \ncarcinogénesis vinculada al VPH , lo que pe rmite el escape de células positivas de \nla respuesta inmune local (Kleine-Lowinski K 1999, Kleine -Lowinski K 2003; \nRiethdorf S 1998 ).El 50% de los pacientes con NIC (II y III) fueron positivos para \ninfección por VPH, lo que sugiere que la MCP -1 no estaba relacionada con la \nrespuesta inmune local para la eliminación de células infectadas con VPH . En este \ncontexto, la expresión de MCP -1 no fue aco mpañada por la infiltración, ni aumento \nde monocitos / macróf agos. La expresión de MCP -1 encontrada en este estudio \npodría estar relacionada con la progresión de la neoplasia int raepitelial cervical. Las \nquimiocinas podrían tener un papel como promotores o supresores tumorales, \ndependiendo del contexto. Un ejemplo de esto es la MCP-1, una quimioquina que \natrae y activa las células mononucleares (Daly, 2003; Mukaida 1998) . En algunos \nlugares, se estimula la actividad antitumoral, si n embargo, las cé lulas tumorales \n\n Discusión \n155 \n \nsecretan MCP-1 lo que sugiere que tiene efectos promot ores de crecimiento \n(Zijlmans 2006; Conti 2004). El incremento en la expresión de MCP -1 en varios \ntipos de cáncer se ha relacionado con la progresión del tumor, presumiblemente \nmediante la promoción de la angiogénesis y la producción de factores de crecimiento \n(Koide 2004; Ueno 2000; Amann 1998; Conti 2004; Takayuki, 2000). Un \nIncremento en la expresió n de IL -8 se encuentra en la Neoplasia cervical, lo que \nsugiere que esta quimiocina juega un rol en la progresión tumoral, el aumento de la \nproducción local de IL-8 en NIC y el carcinoma de cuello uterino se han informado \nanteriormente (Tavares-Murta 2008; Tjiong 1999; Broker 2005) \n \n Además de la actividad quimiotáctica, tanto la IL-8 como MCP-1 puede tener un \npapel importante en el crecimiento del tumor de cuello uterino y cáncer a través de la \nangiogénesis (Cheng 2011; Jiro Fujimoto 2000; Koide 2004; Ueno, 2000). En este \nsentido, se encontró aumento de expresión del factor de crecimien to endotelial \nvascular en el NIC (Carrero 2009). Además, una cor relación significativa entre los \nrecuentos de microvasos y de IL -8 en el cáncer de cue llo uterino también ha sido \nreportado (Jiro Fujimoto 2000). Puesto que las expresiones de MCP-1 e IL-8 se \nobservaron en el NIC en este estudio, la presencia de las cito cinas en los diferentes \ngrados de NIC, podrían estar involucrados en la angiogénesis. \n \n La proteína Inflamatoria de macrófagos-1α se identifico por primera vez en base \na su p ropiedades proinflamatorias (Wolpe, 1988). En consecuencia, la \ndesregulación de MIP-1 se asocia con la susceptibilidad a la infección y alteración \nde las enfermedades humanas (Maurer, 2004). Hallazgos anteriores han sugerido \nun papel de MIP -1 en la propagación de las células tumorales a los ganglios \nlinfáticos y en la defensa del huésped contra el tumor , en el carcinoma oral de \n\n Discusión \n156 \n \ncélulas escamosas (Silva, 2007 ). Sin embargo, en este estudio los valores de la \nexpresión de MIP-1α no resultaron significativos , lo que sugiere la f alta de \nparticipación de esta quimiocina en las neoplasias del cuello uterino. \n \n La infiltración de leucocitos mononucleares se observó aumentada y \nrelacionada con el g rado de NIC. Estos le ucocitos representan probablemente las \ncélulas CD8 +, ya que se ha reportado una mayor cantidad de las células CD8 + en \nel estroma del cáncer cervical en compa ración con diferentes grados de NIC \n(Bedoya 2012). Los linfocitos se increm entaron tanto en el ep itelio como en el \nestroma de los tejidos patológicos, sin embargo, la infiltración de monocitos -\nmacrófagos se mantuvo similar a los tejidos sanos. Las expr esiones de quimiocinas \nestudiadas no estaban relacionadas con la infiltración de leucocitos, sin emba rgo, la \ninfiltración de linfocitos posiblemente se debió a la acción de quimiocinas en el tejido \ntumoral. De hecho, MCP-1 e IL -8 son capaces de inducir la quimiotaxis de los \nlinfocitos (Daly, 2003; Mukaida 1998). MCP-1 se ha detectado acompañada de alta \nexpresión de CD40 y CD40 ligando en células de carcinoma cervical, lo que sugiere \nque son atraída s células T en el tejido tumora l, a través de interacciones CD40L -\nCD40 durante la expresión de MCP-1 (Altenburg 1999). Un aumento en el número \nde CD3 del cuel lo uterino se ha asociado a la regresión espontánea de la NIC \n(Kojima 2011). Además de la actividad quimiotáctica de monocitos, MCP -1 atrae \ncélulas T de memoria, y en conjunto, estos mecanismos podría n estar relacionados \ncon aumento del número de cé lulas CD3 positivos en el NIC . Por otra parte, MCP -1 \npodría alterar el patrón inmunológ ico en los tejidos patológicos, en este sentido \nexiste evidencia reciente en ratones modificados genéticamente, que indican que la \nMCP-1 tiene efectos sobre las células T he lper, estimulando la polarización Th2 \n(Daly,2003). \n\n Discusión \n157 \n \n Como un resultado esperado, el aumento de expresión de MCP -1 no fue \nacompañada por el aumento de la infiltració n de monocitos y macrófagos, no se \ntiene ninguna explicación para este hallazgo, sin e mbargo, resultados similares han \nsido reportados previamente en varias situaciones. En este contexto, la falta de \ninfiltración de monocitos y macrófagos puede ser detectada en áreas de tejid o \nalrededor de las lesiones NIC, a pesar de que MCP -1 se encontró altamente \nexpresado (Kleine-Lowinski 1999). Nuestros resultados mostraron en las lesiones \naumentó la expresión de MCP -1, sin la infiltración de monocitos significativa, lo que \nsugiere una posible pérdida de gradiente quimiotáctico por la sobreproducción de \nquimiocinas de las células de los tejidos y / o monocitos y macrófagos. Además, la \nfalta de la migración de leucocitos a los tejidos que expresan MCP -1 se ha \ninformado en el tejido adiposo, en la resistencia s istémica a la insulina, la edad y \ncondición de hipoxia en un modelo transgénico, la falta de respuesta de los \nmonocitos a producción local de MCP -1 (Shallo H et al 2003; Ki rk 2008; Negus, \n1998; Rutledge, 1995). \n \n Desde entonces, los leucocitos mononuclear es fueron positivos para la \nexpresión de MCP-1 e IL-8 por lo que se podría esperar un posible papel de estas \ncélulas en la producción total de quimiocinas en el tejido. A pesar de que se observo \nun aumento del número de MCP -1/CD3, el porcentaje de estas células se redujo \ndurante el NIC , lo que sugiere que un mayor porcentaje de células productoras de \nquimiocinas no estaban relacionadas con los leucocitos mononucleares. Se observo \nun patrón diferente en la expresión de IL -8/CD3, el porcentaje de estas células se \nincrementó durante NIC , lo q ue sugiere una producción activa de IL -8 por la \ninfiltración de linfocitos en la lesión \n \n\n Discusión \n158 \n \nMediante la doble tinción por inmunohistoquimica se pudo evidenciar el \nnúmero y tipo de células que expresaron VEGF, encontrándose diferencias \nsignificativas en el nú mero de linfocitos que expresaron el factor y menor proporción \nel número de macrófagos, manteniéndose el patrón de expresión aumentado en \npacientes con NICIII. Co ussens indica que el reclutamiento de macrófagos en el \nsitio de la lesión está asociado con la angiogénesis y que en conjunción con un \ndesbalance entre los factores proangiogenicos y la expresión del factor por otras \ncélulas infiltrantes juegan un papel importante en la formación de nuevos vasos \nsanguíneos y una posterior metástasis. (Coussens L, 2002) \n \n La incidencia de la infección por VP H en este estudio fue baja Este porcentaje \ncoincide con otros estudios que informan 5% y 20% de la población en general con \nel ADN del VPH detectable en muestras de cuello uterino (Critchlow 1995) y que, \nen la mayoría de los casos, la infección por VPH es transitorio y puede o no estar \nasociados con NIC (von Knebel Doeberitz 1990; Bedoya, 2012). La baja incidencia \nobservada en los pacientes de nuestra población también está de acuerdo con otros \nestudios en el país, que han informado de una incidencia de 9,9% a 12,5% en la \npoblación occidental de Venezuela (Muñoz 2003; Mendoza 2000) . Sin embargo, la \nmayor frecuencia de alto riesgo de infección por VPH se observó en pacientes con \nNIC II y NIC III (50%), lo que sugiere una asociación de esta infección con estadios \navanzados de la evolución de l a NIC. La producción de quimioc inas tuvo valores \nsimilares en los pacientes positivos de VPH-negativas y VPH+, lo que sugiere que la \ninfección por el virus no era resp onsable de los hallazgos observados en el curso de \nlas lesiones premalig nas del útero. Sin embargo, la a sociación de la infección por \nVPH y la producción de quimioquinas in vitro se ha informado (de Kleine-Lowinski, \n2003; Riethdorf, 1998) , en este sentido, disminución de la expresión de MCP -1 \n\n Discusión \n159 \n \ndespués de la infección de VPH en las células epiteliales del cuello uterino y la \nepidermis (Kleine-Lowinski, 2003) y carcinoma de cuello uterino (Riethdorf, 1998) \nha sido encontrado. \n \n La expresión del VEGF se ha re lacionado con el grado de neoplasia \nintraepitelial cervical, así como también con la infección por Virus de Papiloma \nHumano, Branca en su estudio concluye que la expresión del VEGF es un marcador \nimportante en la carcinogénesis cervical, mostrando un aumen to de acuerdo al \ngrado de lesión y relacionado con los genotipos de alto riesgo de VPH, estudios \nacerca de la inducción del VEGF en células VPH+ demostraron que este evento es \nindependiente del lazo autocrino EGFR -TGFa. Además, en experimentos de \ntransfección se demostró por primera vez que la oncoproteína E6 (VPH -16) activa el \npromotor del gen del VEGF independientemente de su efecto inhibidor sobre p53. \nEn nuestro estudio un 17.39% del total de pacientes resultaron positivas a infección \npor VPH con un pre dominio de genotipos de alto riego en las pacientes con NIC II y \nIII, aunque no fue significativa la positividad de VPH con los parámetros observados, \nespecialmente VEGF se evidencio un leve incremento en las pacientes infectadas . \n(Branca F y col, 2005) \n \nAl determinar anión superóxido en muestras de biopsias de cuello uterino, \nobservamos que a medida que progresaba el grado de lesión cervical en las \npacientes se incrementaba el número de células anión superóxido positivas tanto en \nepitelio como en estroma. Ramos Gisela y Cols en el 2004 (158), encontraron en \ntodas las biopsias, independiente del grado de lesión el mismo patrón que indica la \npresencia de anión superóxido, el cual es indicativo de estrés oxidativo local, esto \n\n Discusión \n160 \n \nsugiere que aun en ausencia de est rés oxidativo sistémico en el epitelio cervical se \nestá generando Eros. \n \nEn base a los resultados obtenidos se puede inferir que las células anión \nsuperóxido positivas tanto en epitelio como estroma en pacientes con diferentes \ngrados de lesión, tenían un estrés oxidativo aumentado al ser comparadas con los \ncontroles. De igual forma Navarro y Cols (2005), Ahmed Aydin y Cols (2006), Muzib \nHassanal Rasheed y Cols (2007), A. Katsabeki. Katsafli y Cols (2007), y Syed Sultan \nBeevi y Cols (2006), demostraron un incremento del estrés oxidativo en diferentes \ncanceres como: cáncer de colon y recto, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y \ncáncer cervical, al comparar el grupo de p acientes con inflamación vs. grupo con \nlesión y el control se encontraron diferencias sig nificativas en el número de células \nanión superoxido tanto en pacientes con inflamación como con lesión con respecto \na los controles. Poka y col en el 2000 quienes señalan que los granulocitos en \npacientes con cáncer ginecológico inducen la producción de anion superoxido a \nmedida que aumenta el estadio de la enfermedad. \n \n Las células presentes en el infiltrado se han vinculado con el aumento del \nstress oxidativo especialmente el oxido nítrico y el aniòn supéroxido, estudios \ndemuestran que los neutrofilos presentes en pacientes con cáncer ginecológico \ninfluyen directamente en la producción de aniòn superoxido y que junto con el NO \nactúan directamente en la capacidad de adherencia de los leucocitos. \n \nEl papel del oxido nítrico en la biología del cáncer no es conocido \nampliamente, diversos estudios señalan que es importante en los procesos de \nneovascularización esenciales en el desarrollo de tumores sólidos y en el \n\n Discusión \n161 \n \nestablecimiento de metástasis, se ha vinculado con el factor de crecimiento \nendotelial vascular (VEGF) factor esencial en la angiogénesis y desarrollo tumoral \ntal como lo reporta Rank y cols en el 2002 quienes señalaron que el VEGF induce la \nproliferación celular por la vía del NO. \n \nDiversos investigadores han estudiado la presencia d e la enzima oxido nítrico \nsintetasa en tumores ginecológicos y de mama, encontrándose una correlación \npositiva entre su actividad y el grado de diferenciación tumoral, así mismo la \nexistencia de altas concentraciones de oxido nítrico (NO) en lavados \nbroncoalveolares de pacientes con cáncer pulmonar. (Pedraza, D y col, 2002) el \naumento de iNOs en pacientes con carcinoma escamoso bucal y pacientes con \ncáncer de pulmón en quienes se ha encontrado un metabolismo oxidativo \naumentado al compararlos con un grup o sano, de igual forma el NO juega un papel \nimportante en las patologías inflamatorias del tracto gastrointestinal. Balestera y cols \nen 1999 señalan que existe una relación entre el stress oxidativo y el daño celular \npor radicales libres y el cáncer de cuello uterino. \n \nLa relación entre las cifras de nitritos (NO 2–)/nitratos (NO 3–) y los niveles de \nóxido nítrico en sangre se han descrito en diferentes estudios (Kelm M y col, 1999; \nMackenzie IM y col, 2001) Dichos substratos serían metabolitos estables de l NO \nsusceptibles de ser detectados en la sangre y se elevarían en los casos de sepsis o \ninflamación al igual que sucede con el óxido nítrico. (Kafte J y col, 1997) \n \nAsí mismo se incluyo un grupo de pacientes que presentaban diversos \nprocesos inflamatorio s a nivel de cuello, dicho grupo se comparo tanto con los \ncontroles como los pacientes con lesiones preinvasivas (NIC I, II,III), a pesar de que \n\n Discusión \n162 \n \nlos hallazgos no fueron estadísticamente significativos, es notable que en los \npacientes con procesos inflam atorios existen mayores concentraciones de NO al \ncompararlos con el grupo control y los pacientes con lesión. Esto puede explicarse \nya que dentro de los procesos involucrados en la denominada cascada inflamatoria, \nrelacionada con el síndrome de respuesta s istémica a la inflamación (SRSI), en los \nfenómenos de infección, daño y sepsis, también se ha implicado al óxido nítrico. La \ninfección provocaría un daño endotelial que originaría la formación de óxido nítrico y \nsus derivados (nitritos y nitratos) que cau sarían vasodilatación , además es \nreconocido desde hace mucho tiempo que la inflamación crónica fue considerada \ncomo un factor de riesgo para varios canceres en el humano, planteando la hipótesis \nde que el NO y sus derivados producidos en cantidad abundant e en tejidos \ninflamados, son capaces de causar daño directo e indirecto al material genético \n(Kelm M, 2002). Beevi y cols establecen que la inflamación crónica a nivel cervical \nproducida por virus o bacterias, especialmente el VPH es uno de los factores \npredominantes en la etiopatogé nesis del cáncer cervical. La inflamación crónica \nresulta de la activación del sistema monocito/macrófago produciendo niveles \nelevados de ROS, igualmente existen evidencias de un prominente infiltrado de \ncélulas en biopsias c ervicales de pacientes con cáncer, sin embargo no existe una \ncorrelación entre los niveles de ROS y el grado de inflamación. Así mismo \ndemostraron en su estudio que las concentraciones de NO se incrementaron en la \ncirculación en pacientes con cáncer cerv ical, demostrando el rol critico del NO y sus \nderivados en la patogénesis del cáncer cervical. Un incremento en los productos del \nNO pueden atribuirse a la generación excesiva de NO, probablemente debido a una \nregulación positiva de iNOS por citocinas proi nflamatorias producidas durante la \ninteracción de macrófagos con células tumorales. \n \n\n Discusión \n163 \n \nPor otra parte, Smita K. Naidu y Cols (2007) realizaron un estudio en el cual \ndeterminaron la concentración de MDA y NO en pacientes en estadios I,II,III y IV de \nCáncer cervical encontrando significancia estadística cuando se comparo con el \ngrupo control, estableciendo que a medida que avanzaba el cáncer mayor era la \nconcentración de NO, cabe destacar que cuando se comparo el grupo control con \nlos pacientes en estadio I la diferencia no fue muy marcada, hecho similar a nuestro \nestudio \n \n Recientemente se ha propuesto que el NO juega un rol critico en la patogénesis \ndel tumor, angiogénesis y metástasis. Lo cual es avalado por Cavallo y Col en el \n2007, señalando que la sint etasa del NO y las ciclooxigenasas están asociadas al \ncrecimiento y progresión de tumores malignos, actuando como mediadores de la \ninflamación, inductores de angiogénesis y promotores en la proliferación del cáncer. \n \n Estudios realizados por Sibylle Loib l y Cols (2004), Elsa Rada y Cols (2003), \nValmore J. Bermudez Pirela y Cols (2000), Taborda M. José (2000), demostraron \nniveles incrementados de nitritos / nitratos en muestras de suero y tejidos en \npacientes con diversas patologías. En el estudio se det erminaron los niveles de NO \nen tejido, los resultados demuestran un incremento en las concentraciones de NO \nde las pacientes a medida que aumentaba el grado de lesión sin embrago en las \npacientes NICIII se observó un descenso, esto quizás pueda deberse a l número \nreducido de pacientes con NIC III presentes en el estudio, cabe destacar la \nimportancia de la determinación in situ puesto que un aumento de NO en suero no \npuede atribuirse a la lesión a nivel de cuello sino que por el contrario puede deberse \na un proceso inflamatorio u otra patología que aumente el NO a nivel sistémico. Se \nencontró un ligero aumento de NO en pacientes controles esto puede deberse a que \n\n Discusión \n164 \n \nel estrés oxidativo desempeña un papel en los procesos fisiológicos múltiples del \naparato repro ductivo de la mujer. La implicación del NO en la regulación de la \nfunción endometrial y ovárica, la etiopatogénesis de la endometriosis, y del \nmantenimiento de la quietud uterina, así como la iniciación de trabajo y maduración \nde la cérvix en el parto se d iscute. Además el NO es un neurotransmisor vasoactivo \nque se encuentra en cantidad abundante en las terminaciones nerviosas del plexo \nvaginal. (Maeda T, Mas M, 2007) \n \n Alteraciones en el sistema ROS y el metabolismo oxidativo aumentado \ninducen la producci ón de sustancias angiogénicas, especialmente el VEGF el cual \npuede activarse por la vía del NOS. Tanaka y col señalan que la hipoxia y el \nmetabolismo oxidativo aumentado en células de carcinoma de cuello uterino se \ncorrelaciona con una abundante vascularidad, ya que el VEGF se expresa a nivel de \nepitelio promoviendo la angiogénesis. Soufla y col en su estudio indican que la \nexpresión VEGF se correlaciona con la transformación maligna a nivel de cuello, \ndicho factor se expreso en mayor cantidad en paciente s con un grado de lesión \navanzado, resultados similares al presente estudio en donde se encontraron \ndiferencias significativas cuando se estudio la expresión de VEGF en pacientes con \nlesiones preinvasivas, inflamatorias y controles, observándose una may or expresión \nen pacientes con NICIII. Se ha descrito que la expresión autocrina del VEGF y la \nactivación de su receptor pueden ser importantes en el inicio del cáncer de cérvix \npues se ha identificado en carcinomas cervicales y en más de 50% de NICIII. (Van \nTrappen S, 2003) \n \n \n\n Conclusiones \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nVI.- CONCLUSIONES \n \n\n\n Conclusiones \n166 \n \n \n En nuestro trabajo de investigación sobre el patrón de infiltración leucocitaria \nde epitelio y estroma uterino y de la expresión tisular de quimioquinas, factor de \ncrecimiento endotelial vascular y metabolitos oxidativos en pacientes con displasia \nepitelial , con cervicitis sin alteración displásica y controles sanos se concluye que: \n \n1.- La progresión en el grado de displasia epitelial se asocia a una mayor y selectiva \ninfiltración de linfocitos sin modificaciones en la estirpe monocitaria y la reducción de \nlos polimorfonucleares \n \n2.- La progresión en el grado de displasia epitelial se asocia a una modificación \nfuncional de los linfocitos T infiltrantes con disminución de la producción de MCP1, \naumento de IL -8, que por el contrario se mantiene estable en la población \nmonocitaria que es minoritaria. Sin embargo, la producción de MIP por los linfocitos \nT no varía entre los diferentes estadios evolutivos de la enfermedad. \n \n3.- La progresión en el grado de displasia de las células epiteliales se asocia a un \nincremento en la producción de VEGF por los linfocitos T y monocitos infiltrantes del \ntejido así como por células epiteliales y estromales. \n \n4.- La producción de anión superoxido en el epitel io y estroma cervical aumenta con \nel mayor grado de displasia epitelial, sin modificación del NO en estas. \n \n5.- Las mujeres con cervicitis sin evidencia de displasia epitelial presentan un \ninfiltrado leucocitario de predominio de linfocitos T activados co n expresión de \n\n Conclusiones \n167 \n \ncitocinas. La presencia de VPH no determino un patrón funcional específico de \nalteración en el infiltrado leucocitario cervical. \n \n Por lo tanto, la displasia epitelial uterina se asocia a una marca da alteración \ndel sistema inmunita rio a nivel local cuyas características se asocian al grado de \nmalignidad. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nVII.- bibliografía \n \n\n\n Bibliografía \n169 \n \n \n \n1. A Kaya, B Poyraz, G Celik, A \nCiledag, BE Gulbay, H Savas I \nSavas. El factor de crecimiento \nendotelial vascular en l os \nderrames pleurales benignos y \nmalignos Arch Bronconeumol . \n2005;41: 376 – 379. \n \n2. Abroun, S. Chemokines in \nhomeostasis and cancers. \nYakteh Medical Journal BMC \nCancer. 2008;10(3): 155-156. \n \n3. Acladious NN, Sutton C, Mandal \nD, Hopkins R, Zaklama M, \nKitchner H . 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El cáncer de cuello uterin o está \níntimamente relacionado con la infección previa por VPH y es el cáncer que ocupa el primer lugar en \nfrecuencia en Venezuela. Queremos determinar la frecuencia de la infección por VPH y hacer \nprevención precoz del cáncer de cuello uterino en las pacientes infectadas. \nEs por ello que se propone realizar un estudio clínico durante un período de 3 años en mujeres que \nacudan a la consulta de Ginecología de diferentes centros de salud de la ciudad de Maracaibo \nEstado Zulia, Venezuela para establecer el diagnóstico y la frecuencia de la infección genital por \nVPH (detección del ADN del virus) por los métodos moleculares de reacción en cadena de la \npolimerasa (PCR) para establecer diagnóstico de infección genital por este virus); de acuerdo a la \ndisponibilidad de reactivos y consumibles en el país y sin compromiso definitivo de reporte de \nresultados en todos los casos y para todas las prueba, así como también la determinación de \ncitoquinas y factores de crecimiento en muestras de biopsias de las pacientes bajo estudio. \nEl examen ginecológico y la toma de muestras para la detección de VPH se harán en las consultas \nde ginecología. Las muestras serán enviadas para su procesamiento al Laboratorio Regional de \nReferencia Virológica y Cátedra de Anatomía Patológica de la Facultad de Medicina Universidad del \nZulia. Los resultados de los exámenes serán manejados con confidencialida d y en caso de que se \ndemuestre infección(es), los médicos investigadores responsables del estudio, Drs: Diana Callejas, \nFreddy Alaña. José Nuñez (microbiólogos, profesores de la Facultad de Medicina) ofrecerán a las \npacientes opciones de tratamiento apro piado que será responsabilidad de los ginecólogos del \npresente proyecto que forman parten de este estudio. \n \n2- DESCRIPCIÓN DEL ESTUDIO: \n \n Historia Clínica \n \nEn la primera visita al Servicio de Ginecología respectivo, se realizará una encuesta médica con \nformato de historia clínica para recolectar datos personales, familiares, epidemiológicos y clínicos \n(anexo). La información contenida en esta historia clínica sólo será manejada por los investigadores \nresponsables para ser usada exclusivamente en esta inv estigación. Luego se procederá al examen \nginecológico que incluye la toma de muestras de cuello uterino y la colposocopía (la colposcopía es \nun método clínico de ayuda diagnóstica para evaluar con lentes de amplificación, el cuello uterino de \npacientes con citologías anormales). \n \n Toma de Muestras \n \nCuello uterino (hisopados exocervicales y endocervicales) \nLas muestras serán tomadas con: espátula de Ayre, aplicadores de algodón o citobrush por el \nginecólogo en el momento la evaluación de la paciente y orie ntada a la detección de VPH mediante \nlas técnicas de biología molecular llámese PCR y para el estudio citológico con la coloración de \nPapanicolaou. Esta toma de muestras no implica riesgo alguno para la paciente. \n \nBiopsias \nSólo cuando el caso lo amerite, y en caso de una lesión previa visualización colposcopica, el \nginecólogo tomará una biopsia del cuello uterino previo consentimiento de la paciente. Las citologías \ny biopsias serán procesadas en el Dpto. de Anatomía Patológica de la Universidad del Zulia y los \nresultados serán enviados de vuelta al Servicio de Ginecología respectivo. \n \nNOTA: las muestras de biopsia de cuello uterino serán utilizadas para investigar el perfil de \nexpresión de citoquinas y factores de crecimiento en el cérvix uterino de pa cientes con displasia del \ntejido cervical y su relación con la infección por VPH. sólo si usted consiente la utilización de ese \nmaterial biológico a los fines anteriormente señalados. \n\n Anexos \n191 \n \n \n3- FASES DEL ESTUDIO \n \nSi acepta participar en este estudio, será eval uada desde los puntos de vista ginecológico y \nmicrobiológico, a los fines de diagnosticar y llevar un control estricto de la infección por VPH y de \ntratar oportunamente cualquier alteración que se produzca en el cuello del útero. \nFase 1: En la primera vis ita, se hace recopilación de los datos clínicos y recolección de las primeras \nmuestras por hisopado cervical. Procesamiento de las mismas en cuanto al análisis citológico, \ndetección y tipificación de VPH Toda paciente cuyo resultado de la Citología, Colpos copía y Pruebas \nde Laboratorio sea positivo para infección por VPH u otra infección de transmisión sexual será \ncandidata para realización de biopsia de cuello uterino y el tratamiento pertinente en cualquiera de las \nfases del estudio. El tratamiento será e fectuado por los médicos ginecólogos del Servicio de \nGinecología respectivo. Toda paciente que resulte sin infección o sin alteración del cuello uterino, \npasará directamente a la Fase 3 del estudio (nueva consulta ginecológica en 1 año). \n \nFase 2: previo resultado de la colposcopia con diagnostico de algún tipo de lesión, será tomada una \nbiopsia la cual también será utilizada para el estudio por inmunofluorescencia indirecta en el epitélio y \nestroma cervical de áreas con displasia (grados I, II y III) est ratificadas por la infección por VPH, y en \nepitelio y estroma normal de mujeres controles sanas del mismo rango de edad de los siguientes \nparámetros: \n1) Presencia de células con expresión de citoquinas proinflamatorias como el TNF-α IF -γ, IL -\n6, IL-2 y su receptor (IL-2R). \n2) Presencia de células con expresión de citoquinas con actividad anti -inflamatorias: IL-4, IL10 \ny TGF- . \n3) Presencia de células expresando GM-CSF y VEGF. \n \n4- Toda paciente participante estará continuamente informada del curso de la investig ación, de los \nresultados de los exámenes y de los tratamientos. Si tiene cualquier duda durante cualquier fase del \nestudio, queja o molestia, tiene derecho a contactar y ser atendida por los responsables del estudio. \n5- Toda paciente está en su derecho de negarse a participar o abandonar el estudio en cualquiera de \nsus fases sin que ello conlleve represalias o pérdida de algún beneficio. \n6- Este estudio no comprende pruebas con fármacos o procedimientos quirúrgicos a menos que el \ncaso y la condición de en fermedad lo amerite, en cuyo caso se le informará oportunamente y \ndependerá del Servicio de Ginecología \n7- Los beneficios esperados como resultado de la investigación, consisten en el diagnóstico oportuno \ny veraz de diagnostico de cáncer de cuello uterino y en particular del VPH así como la detección de \ncitoquinas y factores de crecimiento y el tratamiento según el caso. \n8- No se usará ningún resultado de exámenes o imágenes sin su consentimiento expreso y en todo \ncaso se protegerá su identidad. \n9- Todos los datos, especialmente los publicados al término de la investigación, mantendrán el \ncompromiso de confidencialidad y sin causar identificación o daño personal. \n \n---------------------------------------------------------------------------------------------------------- \n \n \n \nSEGUNDA PARTE: DECLARACIÓN DE LA PARTICIPANTE VOLUNTARIA \n \nDeclaro haber comprendido el propósito y los términos de mi participación en el proyecto de \ninvestigación: CARACTERIZACION DE LA RESPUESTA INMUNITARIA- INFLAMATORIA EN EL \nCUELLO UTERINO EN PACIENTES CON DISPLASIAS DE CERVIX. \n el cual consiste en un estudio clínico que servirá para establecer el diagnóstico y la frecuencia de la \ninfección genital por VPH así como la detección de citoquinas y factores de crecimiento. Declaro \nentender también que mi participación es voluntaria y que en cualquier momento de la investigación, \npuedo retirarme de la misma si así lo deseo, sin que mi decisión conlleve a represalias o a la pérdida \nde cualquier beneficio como producto de la investigación. \nAsí lo declaro y firmo en Maracaibo. Venezuela a los _____ días del mes de _____________ del año \n20_____ \nFirma o huella dactilar de la Participante \nFirma o huella del Testigo: \n \n\n Anexos \n192 \n \n \nTERCERA PARTE: DECLARACIÓN DE LOS INVESTIGADORES \nLuego de haber explicado det alladamente a la Sra. _________________________, la naturaleza del \nprotocolo de investigación mencionado, certifico mediante la presente que, a mi leal saber, la \nparticipante que firma este formulario de CONSENTIMIENTO comprende los requerimientos, riesgos \ny beneficios de su participación. Este CONSENTIMIENTO establece un común acuerdo con la \npersona participante, con el tiempo previo que sea necesario para que esta última pueda ampliar su \nconsulta y comprenderla, de manera que pueda tomar conscientemente la decisión de participar en la \ninvestigación. \nDr. Diana Callejas M/ Dr. Freddy Alaña \nUniversidad del Zulia Facultad de Medicina \n Laboratorio Regional Referencia Virológica \nInstituto Investigaciones Clínicas Dr. Américo Negrette. \nAvenida 18 Sector Paraíso Maracaibo- Edo Zulia \nSe entrega 1 copia para la participante. Se deja en archivo 1 copia para los investigadores---------------\n------------------------------------------------------------------------------------ \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nIX.-PUBLICACIONES \n \n\n\n Publicaciones \n194 \n \nOriginal Article 2012 : Sometido arbitraje Clinical Ovarian Cancer & Others \nGynecological Malignancies \n \nINCREASED CHEMOKINE EXPRESSION AND LYMPHOCYTE INFILTRATION IN \nHUMAN CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA AND CERVICAL CANCER. \n \nYenddy Carrero MSc .1, Diana Callejas PhD. 1, Melchor Alvarez -Mon. MD, PhD 2, \nJesús Mosquera MD 3. \n \n1Regional Laboratory of Virological Reference, Faculty of Medicine, Zulia University, \nMaracaibo, Venezuela; 2Department o f Immune System Diseases and Oncology, \nHospital Universitario Príncipe de Asturias, Universidad de Alcalá, Madrid, Spain. \n3Institute of Clinical Investigation ‘‘ r. merico egrette,’’ Faculty of Medicine, Zulia \nUniversity, Maracaibo, Venezuela \n \nRunning title: Cervical neoplasia and chemokines \n \nSource of support: This manuscript was supported by FONACIT (S1 -2002000531) \nand Mision Ciencias (2007001088). \n \nFinancial disclosures and conflicts of interest: There are no financial \ndisclosures from any authors. The manuscript has no conflict of interest. \n \nCondense Abstract \nThis study shows increased expression of MCP -1, IL -8 and lymphocytes in cervix \nfrom patients with cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma. \n \nABSTRACT \nBACKGROUND: Chemokines pl ay a role in tumor -inflammation and angiogenesis \nthat could be involved in tumor progression. M onocyte chemoattractant protein -1 \n(MCP-1), Interleukin-8 (IL -8) and macrophage inflammatory protein s (MIP) have \nbeen identified in tumor tissues of patients wi th different neoplasias. Therefore, t he \naim of the current study was to investigate the expression of MCP -1, IL-8 and MIP -\n1α, mononuclear leukocyte infiltration and leukocyte/chemokine expression in \ncervical tissues from patients with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical \ncarcinoma (CC), and their relationship with human papillomavirus (HPV) infeccion. \nMETHODS: Indirect immunofluorescence was used to study the expression of MCP -\n1, IL -8, MIP -1α and leukocyte infiltration in cervical samples from 55 patients with \nCIN, 4 patients with CC and 7 normal controls. HPV -DNA and HPV types were \nidentified by the hybrid capture 2 HPV DNA test. RESULTS: Increased expression of \nMCP-1 was observed in CIN not related to degree of neoplasia. IL -8 was observed \nincreased in CIN and CC. Increment of lymphocytes and coexpression of CD3/MCP -\n1 and CD3/IL -8 were found in CIN and CC. M IP-1α remained similar to control \nvalues. The incidence of HPV infection was 16% in patients with CIN and 100% in \npatients with CC. No significant differences were observed in the chemokine values \nfrom HPV -positive or HPV -negative patients. CONCLUSIONS: The in creased \nexpression of MCP -1 and IL -8 in cervical neoplasia may lead to tumor progression \nand the presence of those molecules is most likely not related to the HPV infection. \n \n \nKey words: lymphocytes, chemokines, cervical intraepithelial neoplasia, cervica l \ncarcinoma","source_license":"CC0","license_restricted":false}